WO2001036629A1 - Transferverbindungen, ihre herstellung und ihre verwendung - Google Patents

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WO2001036629A1
WO2001036629A1 PCT/EP2000/011482 EP0011482W WO0136629A1 WO 2001036629 A1 WO2001036629 A1 WO 2001036629A1 EP 0011482 W EP0011482 W EP 0011482W WO 0136629 A1 WO0136629 A1 WO 0136629A1
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cell
transfer protein
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Johannes Gerdes
Thomas Scholzen
Claudia Wohlenberg
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Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
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Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to compounds which are capable of bringing associated compounds into a cell.
  • the present invention relates to a transfer compound comprising the carboxy terminal fragment of the Ki-67 protein.
  • this application comprises vectors which contain the sequence coding for the transfer compound, transfer compounds and pharmaceutical compositions comprising these transfer compounds and / or vectors. Processes for their production and the use of these transfer compounds are also claimed. Corresponding methods for the treatment or prevention of diseases by gene therapy with the aid of these transfer compounds are within the scope of the invention.
  • Protein targeting is a fundamental biological process that is controlled by highly coordinated mechanisms.
  • protein export or protein secretion takes place on specific reaction paths, for which characterized signal sequences are used to direct the proteins into the subcellular compartments involved, such as the endoplasmic reticulum, Golgi complex and vesicles.
  • Signal sequences are also used for intracellular transfer.
  • nuclear localization sequences are described for the transfer of proteins into the cell nucleus, which direct large proteins that cannot get into the nucleus through diffusion through the nuclear pores into the cell nucleus.
  • the uptake of proteins into a cell is also complexly regulated.
  • only the receptor-mediated endocytosis should be mentioned here, which serves to import specific proteins by binding to receptors on the cell membrane and then enclosing them in vesicles.
  • This process serves on the one hand to supply cells with metabolites necessary for metabolism, and on the other hand to break down proteins.
  • Receptor-mediated endocytosis also mediates cellular responses to many mediators such as peptide hormones or growth factors. After all, this process is used by viruses and toxins to get into cells.
  • substances preferably proteins, nucleic acids, non-peptide molecules such as oligosaccharides, lipids or drugs or marker molecules, into cells. Since many of the substances mentioned cannot pass through the cell membrane, various methods are used for the introduction or intracellular production of these substances.
  • viral protein as a fusion protein introduces various polypeptides into target line populations can (WO 97/05265).
  • viral proteins can trigger pleiotropic effects, preferably in mammalian cells, cell assemblies or the whole organism.
  • the EIA protein of the adenoviruses and the T antigen of Simian Virus 40 (SV40) trigger a multitude of processes in the cells. These include, for example, the initiation of DNA synthesis and the activation of various enzymes, such as dihydrofolate reductase, thymidine kinase and DNA polymerase (Nevins, JR Adenovirus E1A: Transcription regulation and alteration of cell growth control, in Doerfler, W and Böhm, P., The molecular repertoire of Adenovirus III: Biology and pathogenesis, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1995).
  • various enzymes such as dihydrofolate reductase, thymidine kinase and DNA polymerase (Nevins, JR Adenovirus E1A: Transcription regulation and alteration of cell growth control, in Doerfler, W and Böhm, P., The molecular repertoire of Adenovirus III: Biology and
  • the present invention is therefore based on the object of providing a transfer vehicle for connections in order to overcome these disadvantages.
  • the transfer compounds can be used in gene therapy.
  • the transfer vehicle according to the invention is from a mammal, preferably of human origin.
  • the present object is achieved according to the invention by a carboxy-terminal fragment of the human Ki-67 protein.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector which codes for this fragment. Furthermore, a transfer protein is described which has the carboxy-terminal fragment of the Ki-67 protein.
  • the transfer protein according to the invention can be the carboxy-terminal fragment of the Ki-67 protein of humans, mice, rats or other species.
  • the invention relates to methods for producing transfer connections and for producing vectors which code for these transfer connections.
  • Another aspect is a method for transferring compounds into a target group, selected from cell lines, cells in vitro, tumor cells, tissue, etc., with the aid of the above-mentioned transfer protein according to the invention or a vector which contains the sequence coding for a transfer protein according to the invention.
  • the present invention includes the use of the above.
  • Compounds for the transfer of associated compounds as well as methods for the therapy and prevention of diseases, in particular the use in gene therapy.
  • a pharmaceutical composition containing the transfer protein according to the invention alone or in association with another compound is also provided, as well as a method for its production.
  • Figure 1 Representation of the nucleotide sequence of the Kon21 DNA insert. The numbering of the base pairs and the restriction sites used for cloning are indicated above the nucleotide sequence. The amino acid sequence of the derived Kon21 protein is shown below the nucleotide sequence.
  • Bold Nucleotides are part of the restriction sites used. Underlined nucleotides have been introduced into the construct by the deoxyoligonucleotide primers used. For a better overview, only one of the two DNA strands was given in the 5 '-3' direction.
  • FIG. 1 Microscopic images of cells 6 hours (a-d), 10 hours (e-h) and 24 hours (i-1) after
  • FIG 4 Microscopic images of cells 5 minutes (a-d) and 1 hour (e-h) after the addition of the high salt lysate, see Example 2.
  • the cells in the left half of the image were stained with MIB-21 (a, c, e, g).
  • the right half of the picture shows the same cells stained with propidium iodide (b, d, f, h).
  • the upper half of the picture shows cells after 5 minutes (a-d)
  • the lower half of the picture shows cells after 1 hour of incubation with the high salt lysate (e-h).
  • the fragment according to the invention namely the carboxy-terminal region of the Ki-67 protein, encompasses the region of amino acids from 3037 to 3256 of the Ki-67 protein, as deposited in Swiss Prot under Accession No. P46013, or fragments of the region as described by the natural variation of the genome are present.
  • the fragment can also only parts of the above Include fragments or homologs thereof as long as the function as transfer protein is retained.
  • Homolog here means that there is at least 80% homology in the amino acid residues which are essential for the function of the carboxy-terminal region as a transfer compound.
  • the human Ki-67 protein is expressed in all nuclei of proliferating cells in all active phases of the cell cycle, ie in Gl, S, G2 and mitosis, but not in resting phase GO cells (Gerdes et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation -associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki -67 J. Immuno 1.13: 1710-15, 1984).
  • the cDNA of the human Ki-67 and the murine equivalent are known and do not show any significant homologies with other proteins (Schlüter et al.
  • the cell proliferation-associated antigen of antibody Ki -67 a very large, ubiqui tous nuclear protein wi th numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle -maintaining proteins J.
  • the murine Ki -67 cell proliferation antigen accumulates in the nucleolar and heterochro atic regions of interphase cells ant at the periphery of the mi totic chromosomes in a process essential for cell cycle progression J. Cell Sei. 109: 143-153, 1996).
  • the human Ki-67 protein has several NLS and is physiologically only detectable in the cell nucleus, except in mitosis. Only after the microinjection of antibodies could it be shown that the Ki-67 protein is formed in the cytoplasm and is transferred very quickly, presumably in supramolecular complexes, to the cell nucleus (Heyden et al.
  • KON-21 A carboxy-terminal fragment of the human Ki-67 protein, called KON-21 ( Figure 1), transiently expressed in CHO-Kl (Chinese Hamster Ovarian-Kl, ATTC No. CRL 9618) cell line cells showed a completely unexpected immunocytological distribution pattern of the produced polypeptide.
  • the KON-21 was strongly cytoplasmic in 5-20% of the cells, as with control proteins.
  • the KON-21 was also detectable in 100% of the cell nuclei. It could be shown that the Kon-21 peptide is first produced in 5-20% of the cells in the cytoplasm and, because it contains an NLS, is quickly transferred into the cell nucleus of these producer cells (Example 1 and Figure 3).
  • the KON-21 is passed on to neighboring, non-transfected cells and localized in these recipient cells in the cell nucleus.
  • This intercellular transfer of the KON-21 probably does not follow any of the conventional protein export or protein import routes described above, since the KON-21 lacks classic signal sequences for these processes.
  • the intracellular transfer into the cell nuclei is presumably via the Ran-GTP-Importin-alpha system (Goerlich D. Transport into and out of the cell nucleus EMBO J. Vol. 17: 2721-27 1998) with the help of the NLS of the KON-21 accomplished.
  • the invention also includes methods for the treatment but also for the prevention of diseases.
  • the Kon21-DNA construct was produced using standard molecular biological techniques. For this, cDNA of the HeLa S3 cell line was amplified by means of PCR. The restriction sites for the subsequent cloning into a plasmid vector, as well as the sequence motifs necessary for the efficient translation of the mRNA, were introduced by using deoxyoligonucleotide primers which carried additional nucleotide sequences at their 5 'ends
  • the Kon21-DNA consuct was initially in the cloning vector pBluescript SK from Stratagene
  • Figure 1 shows the complete nucleotide sequence of the DNA insert and the encoded amino acid sequence of the expression product.
  • Figure 2 shows the structure of the Kon21 expression construct. Examples
  • the Kon21 protein is passed on to all cells in a culture.
  • CHO cells were transiently transfected with the construct pCEP4-Kon21 and analyzed at different times. For this purpose, the slides covered with cells were rinsed in PBS / 10% FCS, air-dried for about 6 hours and then fixed in chloroform / acetone. This was followed by immunofluorescence staining with the monoclonal antibody MIB-21, which specifically recognizes the KON-21 protein. The binding of the antibody MIB-21 was then detected using an Alexa488 conjugated goat anti-mouse antibody (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). For better orientation, the DNA of the cells was additionally counterstained with propidium iodide. To control the staining, CHO cells were also transfected with the expression vector pCEP4.
  • the KON-21 protein is taken up by all cells of a culture.
  • 500,000 CHO cells were transiently transfected with the construct pCEP4-Kon21. As a control, 500,000 CHO cells were also transfected with the expression vector pCEP4. After 24 hours incubation in the incubator, the cells were harvested, sedimented and the cell sediment was frozen at -70 ° C. After thawing, the cell sediment was resuspended in 500 ⁇ l ice-cold high-salt buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 0.1 M EDTA, 0.5 mM DTT, 5% glycerol) and after 5 minutes incubation at 0 ° C sedimented again.
  • 500 ⁇ l ice-cold high-salt buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 0.1 M EDTA, 0.5 mM DTT, 5% glycerol
  • the supernatant was added to CHO cells in 15 ml of culture medium and the cells were analyzed at different times.
  • the slides covered with the cells were rinsed in PBS / 10% FCS, air-dried for about 6 hours and then fixed in chloroform / acetone. ' This was followed by immunofluorescence staining with the monoclonal antibody MIB-21, which specifically recognizes the KON-21 protein.
  • the binding of the antibody MIB-21 was then detected using an Alexa488 conjugated Goat anti-mouse antibody (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA).
  • the DNA of the cells was additionally counterstained with propidium iodide.

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Abstract

The invention relates to the use of a carboxy-terminal fragment of the Ki-67 protein or of an active part, fragment or homologue thereof as a compound that can be used for intracellular transfer and for the introduction in and the release by the cells. The invention further relates to transfer compounds that contain the above-mentioned Ki-67 protein and to the vectors encoding the same. The invention also relates to corresponding pharmaceutical compositions and to the use of the transfer protein as an excipient or active agent in the treatment of diseases.

Description

Transferverbindungen., ihre Herstellung und ihre Verwendung
BESCHREIBUNG
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die in der Lage sind assoziierte Verbindungen in eine Zelle zu bringen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Transferverbindung die das carboxyterminale Fragment des Ki-67 Proteins umfasst . Des weiteren umfasst diese Anmeldung Vektoren, die die für die Transferverbindung kodierende Sequenz enthalten, Transferverbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend diese Transferverbindungen und/oder Vektoren. Weiterhin werden Verfahren zu deren Herstellung, sowie die Verwendung dieser Transferverbindungen beansprucht. Entsprechende Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen durch Gentherapie unter Zuhilfenahme dieser Transferverbindungen liegen im Rahmen der Erfindung.
Stand der Technik
Die Zielsteuerung von Proteinen (protein targeting) ist ein biologischer Prozess von fundamentaler Bedeutung, der durch hochgradig koordinierte Mechanismen gesteuert wird.
So geschieht der Proteinexport bzw. die Proteinsekretion auf spezifischen Reaktionswegen, für die charakterisierte Signalsequenzen genutzt werden, um die Proteine in die beteiligten subzellulären Kompartimente, wie endoplasmatisches Retikulum, Golgi -Komplex und Vesikel, zu leiten. Auch für den intrazellulären Transfer werden Signalsequenzen verwendet. So sind z.B. für den Transfer von Proteinen in den Zellkern Kernlokalisationssequenzen (NLS) beschrieben, die große Proteine, die nicht durch Diffusion in den Kern gelangen können, durch die Kernporen in den Zellkern dirigieren. Die Aufnahme von Proteinen in eine Zelle ist ebenfalls komplex reguliert. Exemplarisch sei hier nur die rezeptorvermittelte Endozytose erwähnt, die dem Import spezifischer Proteine durch Bindung an Rezeptoren auf der Zellmembran und anschließendem Einschluss in Vesikel dient. Dieser Prozess dient zum einen zur Versorgung von Zellen mit stoffwechselnotwendigen Metaboliten, zum anderen zum Abbau von Proteinen. Ferner vermittelt die rezeptorvermittelte Endozytose die zellulären Antworten auf viele Mediatoren, wie z.B. Peptidhormone oder Wachstumsfaktoren. Schließlich wird dieser Prozess von Viren und Toxinen genutzt, um in Zellen zu gelangen.
Für viele Anwendungsbereiche in der biomedizinischen Forschung, Diagnostik und Therapie ist es wünschenswert, Stoffe, bevorzugt Proteine, Nukleinsäuren, Nicht- Peptidmoleküle wie Oligosaccharide, Lipide oder Arzneimittel oder Markermoleküle, in Zellen einzuschleusen. Da viele der genannten Stoffe die Zellmembran nicht passieren können, werden verschiedene Methoden für das Einschleusen respektive die intrazelluläre Produktion dieser Substanzen angewandt.
Neben mechanischen Methoden, wie z.B. der Mikroinjektion, sind dem Fachmann zu diesem Zwecke z.B. molekularbiologische Expressionstechniken wohlbekannt. Die letztgenannten Methoden sind jedoch nur wenig effizient; in der Regel gelingt die Expression in nur 2-20 % der Zellen, was z.B. eine in vivo Applikation sehr problematisch macht. Dieser Nachteil konnte kürzlich durch den Einsatz eines Strukturproteins (VP22) des Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1) aufgehoben werden. Nach klassischer Transfektion mit Expressionsvektoren zeigte sich, dass im Gegensatz zu einem anderen HSV-1 Protein, das (erwartungsgemäß) nur in 2-5% der Zellen nachgewiesen werden konnte, das VP22 dagegen in 100% der Zellen nachgewiesen werden konnte ( PCT Anmeldung No. WO 97/05265) . Es wurde ferner gezeigt, dass dieses virale Protein als Fusionsprotein verschiedene Polypeptide in Zielzeil -Populationen einschleusen kann ( WO 97/05265) . Dem Fachmann ist jedoch wohl bekannt, dass virale Proteine bevorzugt in Säugetierzellen, Zellverbänden bzw. dem Gesamtorganismus, pleiotrope Effekte auslösen können.
So lösen das EIA-Protein der Adenoviren sowie das T-Antigen des Simian Virus 40 (SV40) in den Zellen eine Vielzahl von Prozessen aus. Dazu zählen beispielsweise die Initiation der DNA-Synthese sowie die Aktivierung verschiedener Enzyme, wie der Dihydrofolat-Reduktase, der Thymidin-Kinase und der DNA- Polymerase (Nevins, J.R. Adenovirus E1A: Transcription regulation and alteration of cell growth control , in Doerfler, W. und Böhm, P., The molecular repertoire of Adenovirus III: Biology and pathogenesis, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1995) . Ein weiteres Beispiel sind die pleiotropen Eigenschaften der Strukturproteine der Reoviren (Yue,Z. und Shatkin, A. J. , Enzymatic and control functions of Reovirus structural proteins, in Tyler,K.L. und Oldstone, .B .A. , Reoviruses I: Structure, Proteins, and Genetics, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1998) .
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Transfervehikel für Verbindungen zur Verfügung zu stellen, um diese Nachteile zu überwinden. Die Transferverbindungen sind in der Gentherapie verwendbar.
Das erfindungsgemäße Transfervehikel ist aus einem Säugetier, bevorzugt humanen Ursprungs .
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein carboxyterminales Fragment des humanen Ki-67 Proteins gelöst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der für dieses Fragment kodiert. Weiterhin wird ein Transferprotein beschrieben, das das carboxyterminale Fragment des Ki-67 Proteins aufweist.
Das erfindungsgemäße Transferprotein kann dabei das carboxyterminale Fragment des Ki-67 Proteins des Menschen, der Maus, der Ratte oder einer anderen Spezies sein.
Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Transferverbindungen und zur Herstellung von Vektoren, die für diese Transferverbindungen kodieren.
Ein weiterer Aspekt ist ein Verfahren zum Transfer von Verbindungen in eine Zielgruppe, ausgewählt aus Zelllinien, Zellen in vitro, Tumorzellen, Gewebe usw. , mit Hilfe des oben genannten, erfindungsgemäßen Transferproteins oder einem Vektor der die Sequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Transferprotein enthält.
Weiterhin schließt die vorliegende Erfindung die Verwendung der o.g. Verbindungen für den Transfer von assoziierten Verbindungen ein, sowie Verfahren zur Therapie und Vorbeugung von Erkrankungen, insbesondere die Verwendung in der Gentherapie .
Auch wird eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Transferprotein allein oder assoziiert mit einer weiteren Verbindung bereitgestellt, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Beschreibung der Abbildungen:
Abbildung 1: Darstellung der Nukleotidsequenz des Kon21-DNA- Inserts. Oberhalb der Nukleotidsequenz sind die Nummerierung der Basenpaare sowie die zur Klonierung verwendeten Restriktionsschnittstellen angegeben. Unterhalb der Nukleotidsequenz ist die Aminosäuresequenz des abgeleiteten Kon21-Proteins dargestellt. In Fettdruck wiedergegebene Nukleotide sind Bestandteil der verwendeten Restriktionsschnittstellen. Unterstrichene Nukleotide sind durch die verwendeten Desoxyoligonukleotid-Primer in das Konstrukt eingeführt worden. Zur besseren Übersicht wurde nur einer der beiden DNA-Stränge in 5 ' -3 ' -Richtung angegeben.
Abbildung 2:Karte des verwendeten Vektors, pCEP4-Kon21
Abbildung 3 : Mikroskopische Aufnahmen von Zellen 6 Stunden (a-d) , 10 Stunden (e-h) und 24 Stunden (i-1) nach
Transfektion, Versuchsbedingungen, siehe Beispiel 1. Färbung mit MIB-21 (a, e, i, c, g, k) sowie die Gegenfärbung mit
Propidiumjodid (b, f, j, d, h, 1) . Die Zellen in der linken
Bildhälfte wurden mit pCEP4-Kon21 (a, b, e, f, i, j) und die
Zellen in der rechten Bildhälfte mit pCEP4 (c, d, g, h, k, 1) transfiziert .
Abbildung 4 : Mikroskopische Aufnahmen von Zellen 5 Minuten (a-d) und 1 Stunde (e-h) nach Zugabe des Hochsalzlysates, siehe Beispiel 2. Die Zellen in der linken Bildhälfte wurden mit MIB-21 gefärbt (a, c, e, g) . Die rechte Bildhälfte zeigt dieselben Zellen in der Gegenfärbung mit Propidiumjodid (b, d, f , h) . Die obere Bildhälfte zeigt Zellen nach 5 Minuten (a-d) , die untere Bildhälfte Zellen nach 1 Stunde Inkubation mit dem Hochsalzlysat (e-h) . Zellen nach Zugabe von Hochsalzlysat aus pCEP4-Kon21 transfizierten Zellen (a, b, e, f) bzw. Hochsalzlysat aus pCEP4 transfizierten Zellen (c, d, 9, h) .
Ausführliche Darstellung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Fragment, nämlich der carboxyterminale Bereich des Ki-67 Proteins umfasst den Bereich der Aminosäuren von 3037 bis 3256 des Ki-67 Proteins, wie in Swiss Prot unter der Accession Nr. P46013 hinterlegt, bzw. Fragmente des Bereichs, wie sie durch die natürliche Variation des Genoms vorhanden sind. Das Fragment kann auch nur Teile des o.g. Fragments oder Homologe davon umfassen, solange die Funktion als Transferprotein erhalten bleibt.
Homolog bedeutet hier, das mindestens eine 80 %ige Homologie in den Aminosäureresten besteht, die für die Funktion des carboxyterminalen Bereiches als Transferverbindung essentiell sind.
Das humane Ki-67 Protein wird in allen Kernen von proliferierenden Zellen in allen aktiven Phasen des Zellzyklus, d.h. in Gl, S, G2 und Mitose exprimiert, nicht jedoch in Ruhephase- GO-Zellen ( Gerdes et al . Cell cycle analysis of a cell proliferation -associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki -67 J. Immuno 1 . 133 : 1710-15, 1984) . Die cDNA des humanen Ki-67 und des murinen Äquivalents sind bekannt und weisen keinerlei signifikante Homologien mit anderen Proteinen auf (Schlüter et al . The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki -67 : a very large, ubiqui tous nuclear protein wi th numerous repeated elements , representing a new kind of cell cycle -maintaining proteins J. Cell Biol . 123 : 513 - 522, 1993, Starborg et al . The murine Ki -67 cell proliferation antigen accumulates in the nucleolar and heterochro atic regions of interphase cells ant at the periphery of the mi totic chromosomes in a process essential for cell cycle progression J. Cell Sei . 109 : 143 - 153, 1996) . Das humane Ki-67 Protein besitzt mehrere NLS und ist physiologischerweise, außer in der Mitose, nur im Zellkern nachweisbar. Erst nach Mikroinjektion von Antikörpern konnte gezeigt werden, dass das Ki-67 Protein im Zytoplasma gebildet wird und sehr rasch, vermutlich in supramolekularen Komplexen in den Zellkern transferiert wird (Heyden et al . Cytoplasmic observation of the Ki -67 protein and immunofluorescence staining of i ts transport to the nucleus Eur. J. Cell Biol . Vol . 42 : 33 , 1996) . Ein Transfer aus dem Kern heraus oder gar aus der Zelle heraus wurde bislang nicht beobachtet oder beschrieben. Um so überraschender war unser Befund, den wir bei der Untersuchung zur Funktion von Partialstrukturen des Ki-67 Proteins, erhielten.
Ein in CHO-Kl (Chinese Hamster Ovarian-Kl, ATTC Nr. CRL 9618)- Zelllinien-Zellen transient exprimiertes, carboxyterminales Fragment des humanen Ki-67 Proteins, KON-21 genannt (Abbildung 1) , zeigte ein völlig unerwartetes immunzytologisches Verteilungsmuster des produzierten Polypeptids. In 5-20% der Zellen war das KON-21, wie bei Kontroll-Proteinen, erwartungsgemäß stark zytoplasmatisch exprimiert . Darüber hinaus war das KON-21 aber auch noch in 100% der Zellkerne nachweisbar. Es konnte gezeigt werden, dass das Kon-21 Peptid zunächst in 5-20% der Zellen im Zytoplasma produziert wird und, da es eine NLS enthält, rasch in den Zellkern dieser Produzentenzellen transferiert wird (Beispiel 1 und Abbildung 3) . Darüber hinaus wird das KON-21 an benachbarte, nicht transfizierte Zellen weitergegeben und in diesen Rezipienten- Zellen im Zellkern lokalisiert. Dieser interzelluläre Transfer des KON-21 folgt vermutlich keinem der oben beschriebenen konventionellen Protein-Export- oder Protein-Import-Wege, da dem KON-21 klassische Signalsequenzen für diese Prozesse fehlen. Der intrazelluläre Transfer in die Zellkerne wird vermutlicht über das Ran-GTP-Importin-alpha System ( Goerlich D. Transport into and out of the cell nucleus EMBO J. Vol . 17 : 2721 -27 1998) mit Hilfe der NLS des KON-21 bewerkstelligt.
Experimente mit Konstrukten, die für ein Fusionsprotein mit dem KON-21 Protein kodieren, zeigten, dass diese Fusionsproteine effizient exprimiert und interzellulär transferiert werden.
In Experimenten, in denen das KON-21 in Zellextrakten dem Kulturmedium von Zielzellen beigemischt wurde, wurde das KON- 21 allein oder in Verbindung mit einem Fusionsprotein hoch effizient und sehr rasch in die Ziel-Zellen transferiert (Beispiel 2 und Abbildung 4) . Dieser Aspekt ermöglicht des weiteren den Transfer von nicht-peptidylen Stoffen, die nicht intrazellulär exprimiert werden können.
Diese oben genannten Aspekte erlauben die Verwendung dieser Transferverbindungen in der Gentherapie von Erkrankungen wie Krebs, Allergie, Autoimmunerkrankungen usw. D.h. die Erfindung schließt auch Verfahren zur Behandlung aber auch zur Vorbeugung von Erkrankungen mit ein.
Das Kon21-DNA-Konstrukt wurde mit Hilfe von molekularbiologischen Standardtechniken hergestellt. Dazu wurde cDNA der Zelllinie HeLa S3 mittels PCR amplifiziert . Die Restriktionsschnittstellen für die nachfolgende Klonierung in einen Plasmidvektor, sowie die zur effizienten Translation der mRNA notwendigen Sequenzmotive wurden durch Verwendung von Desoxyoligonukleotid-primern eingeführt, die zusätzliche Nukleotidsequenzen an ihren 5 ' -Enden trugen
(siehe Abbildung 1) . Das Kon21-DNA-Kons rukt wurde zunächst in den Klonierungsvektor pBluescript SK der Firma Stratagene
(La Jolla, CA, USA) kloniert . Nach Sequenzierung der Insert- DNA ergaben sich zwei Abweichungen zu der bereits publizierten DNA-Sequenz der Ki-67-cDNA (Schlüter et al . supra) . Die Sequenzanalyse mehrerer unabhängiger Klone bestätigte die Richtigkeit der erhaltenen Sequenzen. Zur Expression wurde die Insert-DNA mittels der
Restriktionsenzyme HindiII und Notl aus dem Klonierungsvektor geschnitten und in den eukaryotischen Expressionsvektor pCEP4 der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA) kloniert. Abbildung 1 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz des DNA-Inserts und die davon kodierte Aminosäuresequenz des Expressionsprodukts. Abbildung 2 gibt schematisch die Struktur des Kon21-Expressionskonstruktes wieder. Beispiele
Beispiel 1
Das Kon21-Protein wird nach Transfektion an alle Zellen einer Kultur weitergegeben.
CHO-Zellen wurden mit dem Konstrukt pCEP4-Kon21 transient transfiziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert. Dazu wurden die mit den Zellen bewachsenen Objektträger in PBS / 10% FCS gespült, für ca. 6 Stunden luftgetrocknet und dann in Chloroform / Aceton fixiert . Es folgte eine Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper MIB- 21, der spezifisch das KON-21-Protein erkennt. Die Bindung des Antikörpers MIB-21 wurde anschließend mittels eines Alexa488 konjugierten Goat-Anti-Maus-Antikörpers (Firma Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) nachgewiesen. Zur besseren Orientierung wurde die DNA der Zellen zusätzlich mit Propidiumjodid gegengefärbt. Zur Kontrolle der Färbung wurden außerdem CHO-Zellen mit dem Expressionsvektor pCEP4 transfiziert . Mikroskopische Aufnahmen von Zellen 6 Stunden (a-d) , 10 Stunden (e-h) und 24 Stunden (i-1) nach Transfektion. Die Färbung erfolgte mit MIB-21 (a, e, i, c, g, k) sowie die Gegenfärbung mit Propidiumjodid (b, f, j, d, h, 1) . Die Zellen in der linken Bildhälfte wurden mit pCEP4-Kon21 (a, b, e, f, i, j) und die Zellen in der rechten Bildhälfte mit pCEP4 (c, d, g, h, k, 1) transfiziert . Während nach 6 Stunden nur einige Kerne pCEP4-Kon21 transfizierter Zellen eine Anfärbung mit MIB-21 zeigen, nimmt die Färbung nach 10 Stunden zu, bis nach 24 Stunden alle Zellkerne mit MIB-21 angefärbt werden. Zellen, die zur Kontrolle mit pCEP4 transfiziert wurden zeigen dagegen über den gesamten Zeitraum nur eine sehr schwache unspezifische Hintergrundfärbung. Beispiel 2
Nach Zugabe in das Kulturmedium wird das KON-21-Protein von allen Zellen einer Kultur aufgenommen.
Rund 500.000 CHO-Zellen wurden mit dem Konstrukt pCEP4-Kon21 transient transfiziert . Zur Kontrolle wurden ebenfalls 500.000 CHO-Zellen mit dem Expressionsvektor pCEP4 transfiziert . Nach 24 Stunden Inkubation im Brutschrank wurden die Zellen geerntet, sedimentiert und das Zellsediment bei -70°C eingefroren. Nach dem Auftauen wurde das Zellsediment in 500 μl eiskaltem Hochsalzpuffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 400 mM NaCl, 0,1 M EDTA, 0 , 5 mM DTT, 5% Glyzerin) resuspendiert und nach 5 Minuten Inkubation bei 0°C erneut sedimentiert. Der Überstand wurde zu CHO-Zellen in 15 ml Kulturmedium gegeben und die Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert. Dazu wurden die mit den Zellen bewachsenen Objektträger in PBS / 10% FCS gespült, für ca. 6 Stunden luftgetrocknet und dann in Chloroform / Aceton fixiert.' Es folgte eine Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper MIB- 21, der spezifisch das KON-21-Protein erkennt. Die Bindung des Antikörpers MIB-21 wurde anschließend mittels eines Alexa488 konjugierten Goat -Anti-Maus-Antikörpers (Firma Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) nachgewiesen. Zur besseren Orientierung wurde die DNA der Zellen zusätzlich mit Propidiumjodid gegengefärbt. Mikroskopische Aufnahmen von Zellen 5 Minuten (a-d) und 1 Stunde (e-h) nach Zugabe des Hochsalzlysates . Die Zellen in der linken Bildhälfte wurden mit MIB-21 gefärbt (a, c, e, g) . Die rechte Bildhälfte zeigt dieselben Zellen in der Gegenfärbung mit Propidiumjodid (b, d, f , h) . Die obere Bildhälfte zeigt Zellen nach 5 Minuten (a-d) , die untere Bildhälfte Zellen nach 1 Stunde Inkubation mit dem Hochsalzlysat (e-h) . Zellen nach Zugabe von Hochsalzlysat aus pCEP4-Kon21 transfizierten Zellen (a, b, e, f) bzw. Hochsalzlysat aus pCEP4 transfizierten Zellen (c, d, g, h) . Nach Zugabe von Hochsalzlysat aus pCEP4-Kon21 transfizierten Zellen ist schon nach 5 Minuten eine schwache Anfärbung der Zellkerne mit MIB-21 zu erkennen. Nach einer Stunde zeigen alle Zellkerne eine starke Anfärbung mit MIB-21. Zellen, die mit Hochsalzlysat aus pCEP4 transfizierten Zellen inkubiert wurden, zeigen dagegen nur eine sehr schwache unspezifische Hintergrundfärbung .

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Verwendung eines carboxyterminalen Fragments des Ki-67 Proteins oder eines aktiven Teils, Fragments oder Homologs davon als eine Verbindung, die für den Transfer in Zellen und die Aufnahme durch und Abgabe aus Zellen geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das carboxyterminale Fragment die Aminosäuren 3037 bis 3256 der Sequenz des Ki-67 Proteins, wie es in Swiss Prot unter der Acc. Nr. P46013 dargestellt ist, oder homologe Sequenzen davon enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das carboxyterminale Fragment, der aktive Teil , ein Fragment oder Homologe davon mit einer zweiten oder mehreren Komponente (n) , deren Transfer in die Zielzelle gewünscht wird, verbunden ist .
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die weitere (n) Komponente (n) Peptide oder Nicht-Peptide sind.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 4, wobei die Transferverbindung, assoziiert mit einer oder mehreren weiteren Verbindung (en) , einer Zielpopulation an Zellen hinzugegeben wird und diese von der Zielpopulation aufgenommen wird.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Transferverbindung, assoziiert mit einer oder mehreren weiteren Verbindung (en) , aus einer Zelle, die diese Verbindung enthält und gegebenenfalls produziert, auf eine andere Zelle transferiert und von dieser aufgenommen wird.
7. Transferprotein, umfassend das carboxyterminale Ende des Ki-67 Proteins, den aktiven Teil, ein Fragment oder ein Homolog davon, in Verbindung mit einer oder mehreren weiteren Komponente (n) , die transferiert werden soll (en) .
8. Transferprotein gemäß Anspruch 7, wobei die weitere Komponente/weiteren Komponenten Peptide und nicht - Peptide umfasst .
9. Transferprotein gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei das Transferprotein von einer ersten Zelle hergestellt wird und von einer anderen Zelle aufgenommen wird, die aber nicht selbst dieses Transferprotein produziert .
10. Transferprotein gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei das Transferprotein rekombinant hergestellt wird.
11. Nukleinsäure oder Homologe davon, die das in den Ansprüchen 7 bis 9 genannte Transferprotein kodiert.
12. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11, der die Expression eines Transferprotein gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 erlaubt.
13. Expressionsvektor gemäß Anspruch 12 mit dem eine erste Zelle transfiziert oder transformiert wird und dessen Produkt dann auf eine zweite/weiteren Zelle (n) übertragen wird.
14. Eu- oder prokaryotische Wirtszelle, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 12 oder 13, eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 und die das Transferprotein gemäß Ansprüche 7 bis 10 herstellt.
15. Verwendung des carboxyterminalen Endes des Ki-67 Proteins oder des Transferproteins gemäß den Ansprüchen 7 bis 10 als ein Träger für Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das carboxyterminale Ende des Ki-67 Proteins gemäß den Ansprüchen 7 bis 10 als Träger und Transferpartner für andere pharmazeutisch wirksame Wirkstoffe.
17. Verwendung des carboxyterminalen Endes des Ki-67 Proteins gemäß Anspruch 7 bis 10 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Gentherapie.
18. Verfahren für den Transfer einer Verbindung auf eine Zellpopulation als Zielpopulation, umfassend die Schritte :
a) Einbringen des Expressionsvektors gemäß Anspruch 12 oder 13 in eine Wirtszelle, b) Expression des durch den Vektor kodierten Transferproteins gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10 in der Wirtszelle und ausscheiden desselben und c) Übergang des Transferproteins auf eine andere Zellpopulation .
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das Einbringen des Expressionsvektors in die Wirtszelle durch Transformation, Transfektion oder Mikroinjektion erfolgt .
20. Verfahren für den Transfer von Verbindungen in Zellen in vitro, wobei das Transferprotein in die Umgebung der Zielzelle gebracht wird.
21. Verfahren für den Transfer von Verbindungen in Zellen, umfassend die Schritte:
a) Rekombinante Expression des Transferproteins gemäß den Ansprüchen 7 bis 10 mit Hilfe eines Expressionsvektors gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 und b) Zusammengeben der Zielzellen und des in Schritt a.) hergestellten Transferproteins in vitro, so dass die Zielzellen dieses aufnehmen.
22. Verfahren zur Behandlung, Vorbeugung und Therapie von Krankheiten, wobei mittels Transferprotein gemäß den Ansprüchen 7 bis 10 oder mit Hilfe des Expressionsvektors gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 assoziierte Verbindungen in Zellen eingebracht werden.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Krankheiten Krebs, Allergie, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, rheumatische Erkrankungen sind.
24. Verwendung des Transferproteins gemäß den Ansprüchen 7 bis 10 oder des Expressionsvektors gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 in der Gentherapie.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997005265A1 (en) * 1995-07-28 1997-02-13 Marie Curie Cancer Care Transport proteins and their uses
WO1999061607A2 (de) * 1998-05-22 1999-12-02 Forschungszentrum Borstel Zentrum für Medizin und Biowissenschaften Antisense-oligonukleotide zur behandlung von proliferierenden zellen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997005265A1 (en) * 1995-07-28 1997-02-13 Marie Curie Cancer Care Transport proteins and their uses
WO1999061607A2 (de) * 1998-05-22 1999-12-02 Forschungszentrum Borstel Zentrum für Medizin und Biowissenschaften Antisense-oligonukleotide zur behandlung von proliferierenden zellen

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"PRODUCT CATALOG 1999", INVITROGEN, Carlsbad, CA, US, pages 1 - 236, XP002164868 *
DUCHROW MICHAEL ET AL: "Cell proliferation-associated nuclear antigen defined by antibody Ki-67: A new kind of cell cycle-maintaining proteins.", ARCHIVUM IMMUNOLOGIAE ET THERAPIAE EXPERIMENTALIS, vol. 43, no. 2, 1995, pages 117 - 121, XP000867383, ISSN: 0004-069X *
SCHLUETER C ET AL: "THE CELL PROLIFERATION-ASSOCIATED ANTIGEN OF ANTIBODY KI-67: A VERY LARGE, UBIQUITOUS NUCLEAR PROTEIN WITH NUMEROUS REPEATED ELEMENTS, REPRESENTING A NEW KIND OF CELL CYCLE-MAINTAINING PROTEINS", JOURNAL OF CELL BIOLOGY,US,ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, NEW YORK, US, vol. 123, no. 3, November 1993 (1993-11-01), pages 513 - 522, XP000867381, ISSN: 0021-9525 *
SCHOLZEN T ET AL: "Evidence for a role of the Ki-67 repeats in guiding the Ki-67 protein to the nucleoli and the perichromosomal layer.", EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 75, no. SUPPL. 48, 1998, 22nd Annual Meeting of the Deutsche Gesellschaft fuer Zellbiologie;Saarbruecken, Germany; March 15-19, 1998, pages 52, XP000992640, ISSN: 0171-9335 *
SHAYAN P ET AL: "The proliferation-associated nuclear protein Ki-67 in the bovine system: Partial characterisation and its application for determination of the proliferation of Theileria-infected bovine cells.", PARASITOLOGY RESEARCH, vol. 85, no. 8-9, August 1999 (1999-08-01), pages 613 - 620, XP000992638, ISSN: 0932-0113 *

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