JPH04500159A - 血小板因子４の変種の遺伝子のクローニングおよび表現、およびその免疫応答性変改組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板因子４の変種の遺伝子のクローニングおよび表現、およびその免疫応答性 変改組成物記　述 産業上の利用分野 本発明は遺伝子工学の分野に属する発明である。一層具体的にいえば、本発明は 人の血小板因子４の変種の遺伝子（ＰＦ４νａｒｌ）のクローニング、表現およ び微生物学的生産方法に関する。本発明はまたＰＦ４νａｒｌを含有する組成物 に関し、さらにまた、該組成物を使用して哺乳動物の免疫応答性を変改する（ｍ ｏｄｕｌａ、ｔｅ）方法に関する。 従来の技術 血小板は循環する血液細胞であり、そしてこれは、血管の傷害の際にそれに応答 して作用し、これによって血液が凝固する（通常の血液凝固作用）。血小板のα −粒子は数種の重要な蛋の生長因子（ＰＤＧＦ）　、結合組織活性化ベブｆ　Ｆ 　（ＣＴＡＰ−ｍ　）、形質転換生長因子−β（ＴＧＦ−β）があげられる。単 核白血球から導かれた白血球増加作用を有する走行性因子（ＭＤＮＣＦ　）およ びｒ−ＩＰＩＯはＰＦ４およびＣＴＡＰ−Ｉ［１と共に、人の蓋白質であって、 これらは同義遺伝子類の構成員である。これらの蛋白質では、アミノ酸の配列に 実質的相同性が認められ、たとえば、これらの蛋白質は４個のシスティン残基を 含んでいる。該システィン残基は前記成熟蛍白質（ｓａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉ ｎ）中で２個のジスルフィド結合を形成する。 これらの因子の生物学的作用は未だよく判っていないけれども、最も重要な作用 は次の４種の作用（３）−（イ）であると思われる。 （ａ）Ｄ　Ｎ　Ａ合成および細胞分裂を誘起し、すなわち、潜在的な細胞分裂誘 起剤として作用する。Φ）結合組織の細胞の種々の代謝活性を刺戟する作用を有 する。該代謝の例には、たとえば、グルコース移送（運搬）、グリコリシス、プ ロスタグランジンＥ２および環式ＡＭＰの生成、ヒアルウロン酸およびグリコサ ミノグリカンの合成、およびプラスミノーゲンアクチベータの形成があげられる 。（Ｃ）免疫系の細胞を炎症発生場所に誘引し、その機能を刺戟する作用を存す る。（ロ）硫酸化されたグリコサミノグリカン（これは細胞の表面、ならびに結 合組織およびマスト細胞の重要な成分である）に高度の親和性を以て結合する能 力を有する。 作用、抗ヘパリン作用、免疫性調整作用およｑ走化性があげられる。ＰＦ４は、 単球症および好中球増加症のだめの潜在的な化学走性剤であることが報告されて いるＣデウエル等（１９８１年）：　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡＪ　７８　：　４５８４）　、　ＰＦ４がセロトニンと結合する ことも公知であり〔ヘームストラ、Ｖ、Ｌ。 （１９８３年）　：　ｒＴｈｒｏａ＋ｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ　２９　＝　３ ２３）、コラゲナーゼを阻害することも知られている〔ヒチーバーパー、Ｊｌ等 （１９７８年）　：　ｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　１９９　：９９１Ｌさらにまた、 動物における免疫抑制を取除くことも知られており〔カフツ、１、Ｒ，等（１９ ８６年）　：　’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　 ８３：３４９１）、また、或種の腫瘍の生長を阻止する作用も知られている〔テ ィラー、Ｓ、およびフォークマン、Ｊ、（１９８２年）：ｒＮａｔｕｒｅｊ２９ ７：３０７）、ＰＦ４は牛、ラットおよび人の血液から単離でき、そして精製操 作によって均質精製物が得られる〔ウー、ｖ、ｙ、等（１９７７年）　：　ｒＰ ｒｅｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｇ　７　：４７９；トイ、Ｔ１等（１９８７年）　： 　ｒＭｏｌ、ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｒｏｌ、１７：８９８；レビン、Ｓ、Ｐ、お よびウオール、Ｈ、（１９７６年）：ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　」２５ １　：　３２４）、そのアミノ酸配列および物理化学的性質も研究された〔ワル ツ、Ｄ、　Ａ、等（１９７７年）　：　ｒＴｈｒｏｍ、　Ｒｅｓ、　Ｊ　１１　 ：　８９３等〕０人の赤血白血細胞＆！（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ　ｃ ｅｌｌ　１ｉｎｅ）に由来するｃＤＮＡにおけるＤＮＡ配列がボンクウズ、Ｍｌ 等によって研究された（１９８７年；ｒＢｌｏｏｄ、１６９：２１９）、この配 列は３０個のアミノ酸からなるリーグ配列（ｌｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ） の全長をエンコードする。 該リーグ配列の前部には発端メチオニン残基が存在し、後部には、７０個のアミ ノ酸からなる成熟蛋白質を含むコード領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）が存 在する。 グゾー、Ｃ９等の論文（１９８７年；　ｒＮｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｇ　１５ （１）：３８０）には、人のＰＦ４遺伝子中のＥｃｏｌｌＩの多形（ｐｏｌｙｗ ｏｒｐｈｉｓｍ）に関する研究結果が記載されている。これは１０ｋｂの位置に 不変バンドを有し、５ｋｂまたは３．１　ｋｂの位置に多形バンドを有する。し かしながら、天然産のＰＦ４遺伝子または蛋白質の変種については、その研究結 果は今まで全く開示されていない。 初期の研究では、血小板から得られたＰＦ４が使用された。さらに、従来のＰＦ ４の単離方法には、野生型（ｍｕｄ　ｔｙｐｅ）の変種の蛋白質を大量生成させ るには不適当な方法であった。１１′ローン、Ａ、Ｄ、等の論文［１９８６年： 　ｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｊ　２６３０ω：　８７１０−８７１５ ）にはＰＦ４の細菌学的表現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が記載されている。しか しながら１ｆｆＰＦ　４は融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎｌ）ｒｏｔｅｉｎ）として 生成したものであって、ＰＦ４を自然形態（ｎａｔｉνｅｆｏｒ１１）で単離す る方法は全く開示されていない。 米国特許第４．７０２，９０８号明細書には、ＰＦ４を含有する組成物が開示さ れており、さらにまた、該組成物を用いて免疫性の変改または調料を行うことか らなる治療法が開示されている。該明細書には、ＰＦ４の種々の免疫学的作用が 記載されているが、これらの実験で使用されたＰＦ４は、血小板のりリーセート （ｒｅｌｅａｓａｔｅ）から単離され、そしてアフィニティクロマトグラフィに よって精製されたＰＦ４であった。前記のアフィニティクロマトグラフィでは、 吸収剤としてヘパリンーアガローゼが使用された。 本発明の目的の１つは、新たに発見された天然産の蛋白質であるＰＦ４の変種を 、組換えＤＮＡ技術Ｃｒｅｃｏａｒｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｔｅｃｈｎｏ−１ｏ ｇｙ　）によって製造する手段を提供することである。該手段はＵ−る。該合成 遺伝子は、組換えホスト中におけるＰＦ４νａｒｌの表現のために使用されるも のである。さらにまた、変改されたコリシンＥｌｔｌ造遺伝子の領域に融合した ＰＦ　４　ｖａｒｌ遺伝子を含む表現ベクトル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃ ｔｏｒｓ）も使用される。 本発明の別の目的は、免疫抑制を阻止するために、また、免疫抑制を伴う病気に かかった患者に免疫応答性を回復させるために、さらにまた、抗原の作用を受け た患者に通常みられる免疫応答性をさらに高めるために、ＰＦ４νａｒｌを使用 を包含する治療手段を提供することである。 発明の開示 本発明は、血小板因子４の変種をエンコードする、単離されクローニングされた 組換えまたは合成核酸配列を提供するものである。この遺伝子の特徴は、第２図 および第３図に記載のＰＦ４　ｖａｒｌコード配列（ＰＦ　４　ｖａｒｌ　ｃｏ ｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を有することである０本発明はまた、この配列に よってエンコードされた蛋白質の合成および遺伝子操作のために使用される装置 や器具をも提供する。 さらにまた本発明は、ＰＦ４νａｒｌ蛋白質をエンコードするｍ換えまたは合成 核酸配列、およびその生物学的誘導体に関する。 本発明はまた、細胞の形質転換のために、使用できる前記の核酸配列を担持する 組換えベクターに関する。さらにまた本発明は、形質転換細胞によって作られた 組換え蛋白質に関する。 また本発明は、哺乳動物の免疫応答性を変改するのに有効な量のＰＦ４νａｒｌ を活性成分として含有することを特徴とする、免疫性変改作用を有する組成物に 関する。本発明はまた、治療上の必要に応じて哺乳動物の免疫応答性を変改する 方法において、該哺乳動物の免疫応答性の変改のために有効な量をＰＦ　４　ｖ ａｒｌを該哺乳動物に投与することを特徴とする方法に関する。 さらにまた本発明は、血小板因子４の変種１の細菌学的製造方法において、 （ａ）前記の表現ベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を培養し、 （ｂ）培養された形質変換体（ｔｒａｎｓｆｏｒａ＋ａｎｔｓ）を破断（ｄｉｓ ｒｕｐｔｊｎｇ）し、 （Ｃ）前記の融合蛋白質を他の細胞蛋白質から分離して精製し、（ｄ）前記の融 合蛋白質をそれの特定の切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ）において切断 し、そして （ｅ）前記の工程（（至）の切断生成物から血小板因子４の変種１を回収するこ とを特徴とする製造方法に関する。 図面の簡単な説明 第１図は、ＰＦ４νａｒｌ遺伝子を検知するプローブを形成するために使用され る４個のＤＮＡオリゴマの配列を示す図面である。 ここに示されたアミノ酸配列はＣＴＡＰ−ＩＩＩの一部を構成する配列であり、 ＊印は、ＣＴＡＰ−Ｉ［［のアミノ酸の配列に合わせるために、人のＰＦ４のｅ ＤＮＡの配列から変えた塩基を表わす。さらに、前記の４個のＤＮＡのオリゴマ の接続部を通る線が示されている。 第２図は、ＰＦ　４　ｖａｒｌの表現のために作られた合成りＮＡの配列を示す 図面である。２個の［１ｉｃｏＲＩの結合鎖（ｌｉｎｋｅｒ）の配列に結合した 完全なコード配列を作るために使用される１２個のオリゴヌクレオチドが、囲４ 配列の上に矢印で示されている。 第３−１図、第３−２図および第３−３図（一括して第３図と称する）は、天然 物である人のＰＦ　４　ｖａｒｌ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片の一部の配列状態 を示す図面である０図中の数字は、３２０１対の塩基対（ｂｐ）からなる“完全 な断片”の全長を基準とする位置表示番号である。イントロンの配列は下側に示 されている。 アミノ酸の配列はＤＮＡの下側に示されている。矢印は、ＰＦ４νａｒ１のリー ダー配列のための切断部位（推定）を示す。下線の付いたアミノ酸残基は、成熟 した（処理された）ＰＦ４の配列とは別のものである。 第４図は、人のＰＦ４をＰＦ４νａｒｌと比較した図面である。矢印はイントロ ンの位置を示す。 第５図は、第２図記載の合成遺伝子を含む表現ベクターを作る際に使用されるプ ラスミドｐＮＰ　６　ｄｅｌｔａＥｃｏＲＩの制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ ｎ　５ｉｔｅ）および官能基を示す地図である。 発明の実施能様 本発明は、充分な凝血促進作用、抗ヘパリン作用、免疫性変改作用および化学定 性を有するＰＦ　４　ｖａｒｌ蛋白質をエンコードするＤＮＡを提供するもので ある。該蛋白質は、人の組織がら採取して精製でき、または組換え操作によって 製造でき、そして充分な量の純粋な該蛋白質を、診断および治療のために使用で きる。 本発明方法によれば、ＰＦ　４　ｖａｒｌを融合蛋白質の形で製造できる。この 融合蛋白質中の蛋白質の一部は、生物学的に不活性なコリシンＥ１断片からなる 。該断片は融合部位（ｆｕｓｉｏｎ　５ｉｔｅ）の中に選択切断部位を存し、し たがって所望蛋白質が容易に切断、分離できる。このような蛋白質は細菌学的表 現ベクターを用いて製造できる。この製造過程では、適当な翻訳可能ターミネー タを有するＰＦ　４　ｖａｒｌ遺伝子がベクター中に挿入される。該ベクタ・− は、コリシン表現コントロール配列を有し、さらにまた、コリシン構造遺伝子の 部分を、該コリシン構造の遺伝子のカルボキシ末端部の近傍の適当な制限部位に 有する。ＰＦ４はグリコサミノグリカン（特にヘパリン）に対して高度の親和性 を示すものであるから、遊離状態のＰＦ４νａｒｌの収得のために、アフィニテ ィクロマトグラフィ操作においてヘパリンや硫酸コンドロイチンが有利に使用で きる。 本明細書に使用された用語「血小板因子４」は、ポンクズ等の論文（１９８７年 ）に記載の成熟蛋白質に実質的に相当する７０個のアミノ酸からなり、そして特 に、ＰＦ４に伴う生物学的活性として、前記の免疫性刺戟作用、化学走性、およ びヘパリン中和作用のいずれかを有する蛋白質を意味する用語である。 ここに使用された用語’ＰＦ　４　ｖａｒｌ蛋白質」は、第４図中の第１行目に 記載の配列（残基１−７０個）を有する成熟形態（ｅ＋ａｔｕｒｅ　ｆｏｒｖ） の人の蛍白質を意味し、しかして該用語はすべての供給源からの該蛋白質を包含 して意味し、その例には天然産の該蛋白質、組換え該蛋白質、および化学合成さ れた該蛋白質があげられる。用語ｒＰＦ４νａｒｌのブレカーサ」または「ブレ カーサの形のＰＦ４νａｒｌ　Ｊは第３図および第４図に記載のリーダー配列を 包含して意味する用語である６用語ｒＰＦ４シａｒｌ遺伝子」は、ＰＦ　４　ｖ ａｒｌの蛋白質をエンコードする核酸配列として定義され、そしてこれは、サイ レント突然変異を示す核酸配列をも包含するが、この場合には、前記アミノ酸に 対応するアミノ酸が同様に残存するものでなければならない。好ましい実施例と して、人のゲノム遺伝子のクローニングが行われたけれども、遺伝子の供給源は 決して特定の哺乳動物のみに限定されるものではない。該遺伝子の好ましい例に は人の遺伝子があげられる。 用語「操作自在に詰合せる」（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）は、成分の通 常の機能が発揮されるように該成分を配列することを包含する近位配列を意味す る。たとえば、コード配列に操作自在に結合されたコントロール配列またはプロ モータの場合には、該コード配列の表現が可能である。 用語「コントロール配列」は、所望のコード配列に適切にリゲートされたときに 、これらの配列に適合したホストの中で表現を行い得るような１またはそれ以上 のＤＮＡ配列を意味する。 二のようなコントロール配列は原核生物ホスト中の１以上のプロモータを包含し 、そして任意的に、転写終止信号を包含する。 表現を行うために必要な、またはそのために有用な種々の因子もまた識別できる 。ここで使用されているように、簡単にいえば用語「フントロール配列Ｊは、使 用される或特定のホストの中で表現を行うのに必要なりＮＡ配列を意味する用語 である。 用語「表現ベクター」は、該ベクターに担持された組換え遺伝子によってエンコ ードされた蛍白質を合成し得るプラスミド、コスミドまたはファージを包含して 意味する用語である。このようなベクターは、所望蛋白質の表現のために適した ホスト細胞の染色体中に個別的に複製され、あるいはその中に入って一体化され 得るものである。 用語「細胞」、「細胞培養物（液）」、「組換えホスト細胞」および「ホスト細 胞」は本明細書中でしばしば使用されるが、これらの用語は互いに類似の意味を 有する。すなわちこれらの用語は、直接使用された細胞およびその後代（子孫） の細胞を包含して意味する。周知のごとく、後代の細胞が親細胞と全く同一であ るとは限らない。なぜならば突然変異が生じたり環境上の変化が生ずることがあ り得るからである。しかしながらこれらの後代の細胞は、その先代である形質転 換細胞が有する特性と同様な特性を有するものである限り、これらは前記用語の 定義の中に入るものとする。本発明の場合には、前記特性として、組換えＰＦ　 ４　ｖａｒｌを生成する能力を有することがあげられる。 用語「精製された」または「純粋な」は、自然の状態では通常随伴する不純物を 含まないものを意味する用語である。たとえば、「純粋なＰＦ　４　ｖａｒｌ、 　Ｊは、人の組織中に存在するときはその環境下で通常随伴するような、他種物 質を、実質的に含有しないＰＦ４νａｒｌを意味する。ただし、「純粋なＰＦ４ νａｒｌ　Ｊは、それに共有結合で結合したグリコシド残基のごときものを勿論 含んでいてもよい。 翻訳段階のときに配列中に挿入されたアミノ酸に対して除去、付加または変換作 業を行うことによって一次構造自体を変改する操作は、当該変種の蛍白質の前記 生物学的活性（特に、ＰＦ４ｖａｒｌの低いヘパリン結合力）をそこなうことな 〈実施できる。 このような１換反応または他の変化の結果として次の特性を有する蛋白質が得ら れ、すなわち、’ＰＦ　４　ｖａｒｌのアミノ酸配列と実質的に均等なアミノ酸 配列を有する蛋白質」の定義の中に入るアミノ酸配列を有する蛋白質が得られる 。 一般の蛋白質全体の場合と同様に、ＰＦ４νａｒｌの蛋白質の正確な化学構造は 種々の因子に左右されて種々変化する。イオン化し得るアミノ基およびカルボキ シル基が分子中に存在するから、該蛋白質は酸性塩、塩基性塩または中性物質の 形で得られる。 適当な環境条件下に１かれた場合にその活性を保っている前記蛋白質のすべての 製剤が、ＰＦ　４　ｖａｒｌの定義の中に入る。さらに、−次アミ７／酸配列は 、糖類を用いる誘導体形成操作（グリコジル化操作）により増大でき、または、 リビド、ホスフェートまたはアセチル基のごとき補充分子の加入によって増大で き、しかして該増大は一般に、Ｉｉ類を用いる複合化操作によって達成される。 また、−次アミノ酸構造を集合させて錯体を形成させることも可能である。前記 の増大操作は、たとえば生産用ホスト（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｏｓｔ）の翻訳 後処理系において実施できる。あるいは、このような変改操作を試験管内操作と して行うことも可能である。さらにまた、結合鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸 化または還元操作もしくは他の誘導体形成操作によって変性できる。前記活性を 破壊しない前記の変改操作によって、前記蛋白質の構造（配列）が前記定義から 外れたものになることはない。 用語「免疫性の変改」は、細胞活性抑圧作用を存する薬剤を哺乳動物に投与した ために起る抑圧された免疫応答性を、本来の応答性に戻し、あるいは該薬剤の免 疫抑制作用を阻害し、あるいは通常の免疫応答性をさらに強めることを意味する 。 遺伝子の回復（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ） 図面に示されたＰＦ　４　ｖａｒｌのエンコード配列を形成させる方法は次のご とく行われた。ＰＦ４およびＣＴＡＰ−１［［のコード配列を検知するように構 成された合成りＮＡプローブを使用して、人のＤＮＡ全体の中の若干の配列（こ れらは互いに類似した配列である）の同定を行った。このプローブは、ＰＦ４遺 伝子の配列と大体同様であるが、次の点が異なっていた。すなわち、ＣＴＡＰ− Ｉ［［のアミノ酸の配列へのコドン整合のためにごく僅かの変改を行った。前記 の２種の蛋白質では類似点が非常に多いから、その結果得られた７８個の塩基の 配列は、４２個の連続状のヌクｊ／オチドを有し、そしてこれはＰＦ４遺伝子に 完全に整合すると考えられる（イントロンが存在しない場合）。 放射能標識付のＤＮＡプロ〜ブを、人のゲノムＤＮＡの制限酵素消化物のニトロ セルロースプロット（ｂｌｏｔｓ）中に交雑させ、若干のバンドを検出した。　 ＥｃｏＲｉの消化物は、約３ｋｂおよび約１０ｋｂの長さの２個の断片に対応す る特に強い交雑信号を示した。Ｍ１３クローニングベクター中の３２０１個の塩 基対を有するＥｃｏＲＩ断片（人の白血球ゲノムライブラリから単離されたもの ）の配列分析によって、ＰＦ４の変種の存在が確認された。 前記のＰＦ４νａｒｌは、第３図に記載のごとく、３個のエクソン（６ｘｏｎｓ ）と２個のイントロンからなる。第１イントロンはその長さが３２８ｂｐであり 、そし７てこれは、活性化された血小板から単離されたＰＦ４蛋白質の公知構造 によって定義される成熟コード配列の発端部から、先導型ペプチド（エキソノ１ ；アミノ酸残、ＩＩ’　−３４’　）を分けるものである。エキソン１でエンコ ードされた３４個のアミノ酸からなる疎水性のリーダー配列は、その配列状態が ＰＦ４のリーダー配列と７０％似ているが、その相異点は、４個のアルギニン残 基を含有する親水性のアミノ末端区域を有することである。 第２イントロンの長さは１２８ｂｐであり、そして第２イントロンはエキソン２ （アミノ酸残基１−４１）をエキソン３（アミノ酸残基４２−７０）から分ける 。エキソン２は４２個のアミノ酸セグメントをツー　ドするが、これは、アミノ 末端基を有しかつジサルファイドを有するコア部を有する成熟ＰＦ４配列中の対 応セグメントと全く同一である（同一性１００％）、エキソン３は、２８個の残 基を有しかつカルボキシル末端基を有する区域をコードするが、該区域は、ヘパ リン結合性および細胞走化性を有する区域に相当する。この区域は、ＰＦ４の場 合と異なる３個のアミノ酸を含む（第４図参照）。 ＰＦ４νａｒｌ蛋白質をエンコードする合成遺伝子を、公知の化学合成技術を用 いて合成し、次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）表現ベクターを用いてクローニ ングを行ったが、その詳細は後記実施例中に記載されている。 蛋白質の表現 クローニングされたゲノム、ｃＤＮＡまたは合成りＮＡの配列は適当な表現系に おいて表現（発現）できる。ここに開示されたＤＮＡ遺伝子配列の場合には、遺 伝子の処理や回復のための前記の工程（ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）を繰返す必要はな く、周知の化学合成方法に従って合成操作を行うのが有利である。 米国特許出願第１４３．７３１号明細書（出願口１９８８年１月１４日）には、 本発明者のうちの一人が完成した先行発明が開示されており、すなわち、クロー ニングされたＰＦ４遺伝子を、組換えＤＮＡ技術を用いて表現する方法が開示さ れている。該方法は、ホスト細菌中でＰＦ４を直接に表現することを包含する（ すなわちこの場合には、他のペプチド配列への融合は行われない）。 ＣＴＡＰ−［Ｉ［の表現のために使用される表現系（ＰＣ？英文公報第一０８５ １０１０６７号）と同様なコリシンＥ１表現系と用いた場合には、充分な量（ｓ ｉｇｎｉｆｉｃａｒ＋ｔ　１ｅｖｅｌｓ）のＰＦ４は得られなかった。 これは全く予想外の、意外なことであった。なぜならば、ＣＴＡＰ−ｍはＰＦ４ にかなりよく似ており、すなわち、ヌクレチド配列中に同一の部分が約７５％存 在し、かつ、アミノ酸配列中に同一の部分が約６５％存在するからである。した がって本発明の−具体例では、前記米国特許出願明細書に記載の遺伝子融合体に 類似の構造の融合遺伝子が、ＰＦ４νａｒｌ遺伝子の反復的表現のために使用さ れる。 融合遺伝子構造体は適当な発現ベクターと結合させ、すなわち、融合遺伝子の５ ′−末端基を、転写開始調整用配列に結合させ、３′−末端基を翻訳終止配列に 結合させる。 適当なホスト内に導入すべきプラスミドＤＮＡを製造した後に、該ホストに形質 転換操作およびクローニング操作を行う０個々のクローンは、効果的な表現のた めに適宜選択され、すなわち、所望生成物であるＰＦ４νａｒ１等の製造のため の予備試験によって選択される。本明細書では、用語’ＰＦ　４　ｖａｒｌの製 造」は、ＰＦ４νａｒｌ融合蛋白質の表現のレベルが１０％以上（細胞棗白譬全 量基！１りになることを意味する。スクリーニングは、ニトロセルロースまたは 他の適当な物質のフィルタに移されたホスト細胞のコロニーのウェスタンプロッ ト（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ）を用いて有利に実施できる（生成物中の抗体 の検出）、あるいは、ゲルの電気泳動装置を用いて試料を分析することによって 直接的な比較を迅速に行うことができ、これによって、どのクローンが最も効果 的に表現するかを知ることができる１表現の度合は、蛋白質の着色度の比較（視 覚による比較）、オートラジオグラフィまたは生成物のバンドのウエスタンブロ ッチング操作により測定できる。一般に上記のスクリーニング操作だけで充分で あるが、もし所望ならば、一層正確な定量的試験法である免疫学的検定法または 酵素検定法を行ってもよい。 蛋白質の精製 本発明の好ましい具体例では、切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）コリシンＥ１ 蛋白質とＰＦ４νａｒｌとの融合体を、ＤＮＡインサートがエンツー　ドする。 該具体例では、コリシンＥ１遺伝子が、疎水性セグメント（約３０個のアミノ酸 ）を有する蛋白質をエンコードする。該蛋白質は、融合蛋白質を他の細胞成分か ら単離し精製することを促進するような物理化学的特性を有するものである。前 記の疎水性セグメントは、高い塩分濃度（たとえばＩＭ−塩酸グアジニウム）の 存在下に融合蛋白質中の汚染物（すなわち別種の蛋白質）を選択的に抽出する作 用を有し、これによって、コリシンＥ　１−ＰＦ　４　ｖａｒｌ融合蛋白質が５ ０％より高い純度で得られる。 融合蛋白質を部分的に精製した後に、該融合蓋白質に化学反応または酵素反応を 行って該蛋白質をその融合部に沿って切断し、ＰＦ　４　ｖａｒｌを単離する。 たとえば、既述の２種の蛍白質がメチオニン残基を介して融合されている場合に は、該融合蛍白質は臭化シアノゲンで処理できる。 蛋白質の特性 第４図は、人のＰＦ４とＰＦ　４　ｖａｒｌとのアミノ酸配列を比較した図面で ある。これらの配列はその類似性が最大限に表現されるように示されている。矢 印はイントロンの位置を示す、前記の２種の蛋白質の最大の相異点はリーダー配 列の中の残基１゛−３４゛であって、すなわち、ＰＦ４νａｒｌでは該配列の中 央部に３−コドンインサートが存在する。この区域は一般に疎水性であり、しか してこれは分泌蛋白質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の特性である 。しかしながらＰＦ　４　ｖａｒｌはＰＦ４とは配列が異なり、特に残基６と残 基１７との間の区域が明瞭に異なっていて、そこには３個の追加Ａｒｇ残基が存 在するので比較的大なる正電荷がある。 ＰＦ４と比較し７た場合、ＰＦ　４　ｖａｒｌは成熟蛋白質配列中の３個のアミ ノ酸が異なっている。すなわち、Ｐｒｏｓｓ→Ｌｅｕ　、　Ｌｙｓａ＊→Ｇｌｕ 　、　Ｌｅｕ＊ｙ→旧Ｓという変化に伴う相異点がある。この変化はすべて、Ｐ Ｆ４νａｒｌのカルボキシ末端区域において認められ、そして該変化がＰＦ４ν ａｒｌの構造および官能性に重大な影響を与えていると考えられる。たとえば、 ＰＦ４νａｒｌのカルボキシ末端区域の正電荷の量は比較的少なく　（Ｌｙｓ、 、→Ｇｌｕ）、そのためにヘパリン結合力が小さい、このことは、当該組換え蛋 白質にベバリンアフィニティクロマトグラフィを行うことによって確認できる。 十発明号は哉特定の学説に束１！されることを望すない者であるけれども、ＰＰ ４νａｒｌはヘパリン親和性が低いので、細胞結合特異性も変化し、そして血管 の内皮および細胞外のマトリックスへの吸着性が低いのであろうと考えられる。 Ｐｒｏ５Ｂ−＋Ｌｅｕの変化はまた、蛋白質の二次的構造に影響を与えることも ある０人および牛のＰＰ４が互いに実質的に同一の三次元的構造を存すると仮定 した場合には、人のＰＦＪ中のカルボキシ末端型らせん構造の部分はＰｒｏ□の 部位から始まる。プロリンはらせん遮断体であり、したがってＰｒｏｓｓ→Ｌｅ ｕの変化によってらせん構造はアミノ末端型末端部への方向に向かって一層長く のびるようになる。また、らせんがβ−シートの第３ストランドに結合する位置 ５５−５７の屈曲状態が変化する。 Ｌｅｕ　、、→Ｈｉｓの変化もまた、カルボキシ末端型らせん構造の特性を著し く変化させる。前記らせんとβ−シートの疎水面との間に存在するＬｅｕ　ｈ　 ？は、疎水性残基に包囲されてその中に埋没する。一方、この位置に存在するヒ スチジン（特に、プロトネートされたヒスチジン）は、シートに対するらせん構 造のバッキングを弱化させるであろう、ＰＦ　ｄ　ｖａｒｌ中の置換基によって 、そのカルボキシ末端型らせん構造がＣＴＡＰ−ＩＩＩのらせん構造に多少似た 形成のものになり、すなわち該らせんには、４個のリジンのうちの３個だけが該 らせんの一面上に存在する。なぜならば、それに対応するＰＰ４の位置６４およ び位置６５の間にグルタミンが挿入されたからである。その結果、塩基性残基（ リジン）が、Ｌｅｕ６ｙ　ｃｐｐ　４　）または旧Ｓｉｔ　（ＰＰ４ｖａｒｌ） に対応する位置にシフトする。ＰＰ４νａｒｌおよびＣＴＡＰ−ＩＩＩの両者の ヘパリン結合力は、人や牛のＰＰ４のヘパリン結合力よりも弱い。 治療用組成物 精製されたＰＰ４νａｒｌ蛋白質は一般に、薬学的に許容され得る常用担体を用 いて製剤化でき、すなわち組成物が製造できる。 この組成物は非経口的に哺乳動物に投与でき、そしてこれはたとえば免疫系の刺 戟のために使用できる。適当な担体の例には、人の血清アルブミンと等張の緩衝 剤含有等張液〔マック出版社発行「レミングトンズ、ファーマシュウテイカル、 サイエンシズ」　（第１７版）参照〕があげられる。 免疫性の変改のためにＰＦ　４　ｖａｒｌを投与する場合の好適な投与方法は、 静脈注射を行うことである。個々の治療用投与の場合のＰＰ４νａｒｌの有効濃 度（投与量）は免疫性抑圧の程度、哺乳動物の体重および投与計画に応じて種々 変わり、さらにまた、ＰＦ　４　ｖａｒｌによって無力化すべき免疫性抑制物質 の存在量および潜在的抑制力にも依存して種々変わるであろう。ＰＰ４νａｒｌ の最低有効投与量は、ＰＰ４νａｒｌを段階的に希釈して作成した複数の製剤試 料を用いる常用試験によって決定できる。 人の病気の治療の場合のＰＰ４νａｒｌの好適な投与量（濃度）は、１回の治療 当たり約５ｕｇ−１０■／ｋｇであり、マウスの場合には、該動物１匹当たり約 ０．１−２５ｕｇである。この投与量基準は広く設定されている。なぜなりば個 々の場合の投与量は破投与哺乳動物の状態に応じて種々変わり、さらにまた、哺 乳動物の種類によって種々変わるからである。たとえばＰＦ　４　ｖａｒｌ製剤 をワクチン助剤として使用する場合には、ワクチン接種（νａｃｃｉｎａｔｉｏ ｎ）の前または後に、あるいはそれと同時に、１回投与することが必要であろう 。これを免疫抑制の解放のために使用する場合において、免疫抑制状態がひどい ときまたは抑制状態が反復して生じるときには、治療すなわち投与をさらに１回 またはそれ以上にわたって、適当な間隔を置いて行うことが必要であろう。 ＰＰ４νａｒｌを局所的に投与することも可能であり、たとえば創傷の治癒の促 進のために、これを常用局所製剤（たとえばクリーム剤、ペースト、ゲル、噴霧 剤、軟膏）の形で所望場所に投与できる。該製剤に使用される担体は公知であり 、その例にはワセリン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ミリスチニ／酸イ ソプロピル、ポリビニルアルコール等があげられる。あるいは、精製されたＰＦ 　４　ｖａｒｌ蛋白質を徐放性製剤（すなわち放出制御製剤）の形で投与するこ とも可能である。このような製剤の例には、ＰＰ４νａｒｌを皮膚に、制御され た速度に放出できるような方法で含有する伴創膏型製剤や皮膚貼付剤があげられ る。放出制御の機構は、拡散、浸透圧、溶解、侵蝕またはイオントホレシスを利 用したものであってよい、ＰＰ４νａｒｌを含有する局所製剤は少量の添加剤を 含んでいてもよく、その例には皮膚軟化剤、安定剤、界面活性剤、皮膚浸透性変 改剤および顔料があげられる。製剤中のＰＦ　４　ｖａｒｌの濃度は、治療すべ き皮膚の面積および設定投与量に応じて適宜調節できる。一般に該濃度は０．０ ００１−１重量％（投与製剤の重量基準）である、投与量は一般に、所望の薬学 的効果たとえば化学走性の発現によって創傷が充分に治癒できるような量である べきである。 次に本発明の実施例を詳細に記載する。これらの実施例には、ＰＰ４νａｒｌの 性状、コリシンＥ１断片とＰＦ　４　ｖａｒｌとから構成された融合蛋白質の性 状、および天然産ＰＦ４νａｒｌおよび細菌学的方法で合成したＰＰ４νａｒｌ の精製方法が具体的に示されている。さらにまた、ＰＦ　４　ｖａｒｌの免疫性 刺戟作用も記載されている。 実施例 交雑プローブの形成 公知のＰＰ４のｍｌ？ＮＡの配列および（ＣＴＡＰ−ＩＩＩのアミノ酸配列の逆 町然虞Ｊμｍ組【を１１１どして、両方の蛋白質のための遺伝−子を検知するに 通した卯＾−ス、ワーブを作置した。このプローブはＰＰ４遺伝子の配列に似て いるが、次の点が異なっており、すなわち、ＣＴＡＰ−１［１のアミノ酸配列に コドンを整合させるために僅かに変化させた点が異なっていた。前記の２種の蛋 白質には同一構造の部分が多く存在するので、その結果として、７８の塩基の配 列は４２のヌクレオチドを有し、該ヌクレオチドはＰＰ４の遺伝子に完全に整合 すると考えられる。（当該区域内にイントロンが存在しないと仮定した場合）。 第１図に記載のオリゴヌクレオチドを次の方法で合成した。使用された装置は、 市販の「アプライド、バイオシステム３８０Ａシンセサイザ」であり、この合成 は０−メチルホスホルアミダイト化学分野の技術ヲ用いて行った。試薬はすべて 、ベックマン、インスルメンツ社から購入して使用した。前記の交雑プローブは 次の方法によって生成させ、すなわち、４個のオリゴヌクレオチドをリゲートし 、これを後記のＭ１３＠ｐ１９ベクターのＥｃｏＲ１部位およびＨｉｎｄＩ１１ 部位にクローニングすることによって前記プローブを生成させた。 放射能の標識付は 放射能の標識を付けたプローブ・を次の方法によって作成した。 ＤＮＡポリ、−ラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）の大断片を使用し、３：Ｐ−標識付 ヌクレオシドミ燐酸の存在下に、Ｍｌ　３−一本鎖鋳型の挿入ブ１ツープ配万１ １に相補的なズ１−モンＶを合成ｊまた。５倍過剰１のＭ１３プライマ（ＧＧＧ ＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴ）を前記鋳型（２ｕｇ／ｕｆｆｉ）と共に５５ ゛Ｃにおいて５分間保温し、次いで室温に冷却し、トリ、２．−１１ＣＩ　（ｐ ｈ７．５）　ｌ０ＭＭ、ＮａＣ１５０ｍＭ、’ｇｃ１ｚ　１０　ＭＦＩ、ジ＋オ ’：）、　レイ）−ル１　ｄ、ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ＃ヨびｄＴＴＰ各３０ｕＭ 、〔ア／Ｌｚ７７　”Ｐ　：ｌ　ｄＣＴＰ　（８００Ｃｉ／　ミ’Ｊモ／Ｌ／； 　ニュー、インクランド、ニューフレア社製の市販品）３ｕＦＩ、およびクレノ ウーボリメラービ（ベセスダ、リサーチ、ラボラトリ社製の市販品）０．１単位 ／ｕＩ！、を含む液の中で６０分間保温（培養）した。 二本鎖構造体を一部含有する鋳型を其後に旧ｎｄｌｌで切断した。 得られた一本鎖ブローブを、５％−ポリアクリルアミド／７Ｍ−尿素ゲルを用い る電気泳動操作によって精製した。該プローブの放射能の強さは約１０’ｃｐｍ ／ｕｇであった。 分析およびスクリーニング（サザンハイブリダイゼーション分析およびゲノミッ クライブラリのスクリーニング）前記のプローブと、ニトロセルロースフィルタ 上にブロンドされた（すなわち、斑点状に散布された）人のゲノムの消化物［マ ニアチス、Ｔ１等（１９８２年）：［モレキュラー、クローニング」、コールド ′、スプリング、ハーバ−にューヨーク）〕とを、緩衝液〔アマジノ、Ｒ，Ｍ、 （１９８６年）　：［ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、Ｊ１５２　：３０４−３０７ ）中で交雑した。該緩衝液はホルムアミド２０％、ポリエチレングリコール１０ ％、ＮａｚＰＯｔ　（ｐＨ７，２）０、２５　Ｍ、　ＮａＣｌ　０．２５　Ｍ、 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）　７％およびＥＤＴＡ　ｌ　ｍＡを含有する ものであった。前記操作は４２°Ｃにおいて一晩中行った。濾液を、０．　Ｉ　 Ｘ５ＳＣ（塩化ナトリウム０．１５Ｍおよびクエン酸ナトリウム０．０１．５　 Ｍ）およびＳＯ３（ドブ・シル硫酸ナトリウム）０．１％を含む液の中で４０° Ｃにおいて洗浄した。若干のハンドが検出された。前記のＥｃｏＲＩ消化物は、 長さ約３ｋｂおよび１０ｋｂの２つのセグメントにそれぞれ対応する特に強い２ 本のハイブリ交雑信号を示した。 ＥＭＢＬ−ラムダ−ベクターに担持された人の白血球１ゲノムライブラリからの 約３００．０００個のプラーク（クローンチック、ラボラトリ社製の試料）をニ トロセルロース上にプロットし、そして、前記のサザン分析の場合と同一の条件 下に前記プローブと交雑した。ボジチブブラークを採取し、再びスクリーニング を行うことによって、純粋なりローンが得られた。 ＤＮＡ配列の分析 ボジチブクローンから単離されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した。 プローブに交雑した３、　２　ｋｂバンドをＭ１３ベクター中にサブクローンし 、（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）　、ジデオキシヌクレオチド法〔メッシ゛ング、Ｊｌ 等（１９Ｂ１年）　：　ｒＮｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ　９　：　３０ ９−３２１〕によって配列の分析を行った。プロモータ区域、コード区域および イントロン区域を両方のストランドから配列させた（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）　＊ 核酸および蛋白質の配列に関するデータをコンピュータで分析する操作を、バイ オネット、ナショナル、コンピュータ、リリース社の分子生物学用プログラムを 利用して行った。 遺伝子の構成 前記のＰＦ４νａｒｌのための合成遺伝子はＤＮＡの２４３対の塩基対からなる 。これは２個の主サブ断片（ｍａｊｎ　ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔｓ）（主サブ断 片Ｉおよび■と称する）から構成され、しかして主サブ断片Ｉは８個のオリゴヌ クレオチドから構成され、主サブ断片■は４個のオリゴヌクレオチドから構成さ れる。これらの１２個のオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト化学分野の 技術に従って公知装置「アプライド、バイオシステム、ＤＮＡ、シンセサイザｊ を用いて合成された。 前記の１２の合成オリゴヌクレオチドを精製し、キャラクタライズし、そしてリ ゲートして、断片Ｉおよび■を生成させた（第２図）、これらの操作の詳細は次 の文節で述べる。 オリゴヌクレオチドの精製およびキャラクタリゼーション操作１、精製 ポリアクリルアミドのゲル（１２％）を、尿素７Ｍ、トリス−＝ボレー）９０ｄ および２　ＩＬＩＭ−ＥＤＴＡ覆衝液を用いて調製した。 ２ｃｍ以上の巾をもつ歯部を有するくし形の区域を含むサンプルウェル（ｓａｓ ＋ｐｌｅ　１ｖｅｌｌ）を形成した。該ゲルを３時間放置した後に、これに予（ ｉ！電気泳動操作を３０分間またはそれ以下の時間行った。等容量の１　５Ａｚ ｂ。ユニットの未精製オリゴヌクレオチド試料と７Ｍ−尿素とを、１０ｄ−）リ ス−）ＩＣ！緩衝液（ｐＨ７，５）と混合した。前記ＤＮＡ試料を前記ゲルに添 加した。オリゴヌクレオチドの移動率の検出のために、壁部の一部に染料混合物 〔フロムフェノールブルー０．１７％、キシレンシア５ノール０．２７％および トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　１０ｍＭを含有する混合物〕を添加した。電 気泳動操作を４００−６００ボルトの電圧下に、行い、そして該操作を、ブロム フェノールブルーがゲルの末端部から３０ＣＩ１以内の場合に移動するまで続け た０両方のプレートを除去し、ゲルをプラスチック包材で包み、短波長のＵＶ光 線の照射下に前記ＤＮＡを観察した。安全カミソリの刃を用いて所望バンドを注 意深く切取った。ゲルの一部をエッペンドルフ管に入れ、ガラス棒で破砕した。 次いで液管にＴＥ　（トリス−１１Ｃ１１０１ｔｌ’ｌおよびＥＤＴＡ　ｌ　＋ ｍＡを含有；　ｐＨ７，５）　０．５　ｙｄを添加し、該管を一晩中回転させて ＤＮＡを抽出した０次いで該管に遠心分離操作を１５．００Ｏｒｐｍの回転速度 で１０分間行い、上澄液を回収した。ＤＮＡ試料をＴＥで希釈しく希釈度＝１０ 倍）、これを「Ｃ１Ｂ　５ｅｐ−ＰａｋコラムＪ　（１００％アセトニトリル１ ０ｄおよびＨｚ０２０Ｉｉを用いて調製）に供給し、脱塩処理を行った。ＤＮＡ の回収率は大体５０−８０％であった。溶離物（ｅｌｕａｔｅ）に親液性化処理 を行い、次いで再びＨ，００，５−中に懸濁させた。 ２、末端標識付け、ゲルの電気泳動、およびオートラジオグラフィ １０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）の前記試料を親液性化した。乾燥した。 試料を、濃度１０ｘｉ７）濃厚キナーゼ緩衝液〔トリス−１１ｃＩ（ｐ！４７． ６　）　７００ｍＭ、ＭｇＣ１ｚ　ｌ　ＯＯ＋Ｍ、ＫＣＩ　１ｍＭ、ジチオスレ イトール５０ｍＡを含有する液〕１ｕ１、）ｌｚ０５ｕｆ、および１ユニット以 上の活性を有するＴ４キナーゼ溶液１ｕｊ２からなる液に溶解した。試料を３７ °Ｃにおいて３０分間培養した。前記の染料混合物５ｕｆｆｉを添加した後に、 試料をポリアクリルアミドゲル（２０％；厚み０．４　ｍ、長さ１５ｃｍ）に添 加し、’ｔｉ泳動操作を行った。この操作は、ブロムフェノールブルーがゲルの 底部に移動するまで行った。次いでオートラジオグラフィ操作を行ったが、これ は、前記ゲルをＸ線フィルム上に１０−３０分間Ｎ！露することからなるもので あった。 ３、オリゴヌクレオチドのリゲーションオリゴヌクレオチドのりゲーションのた めの反応混合物は、トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　５０ｍＭ、ＭｇＣｈ　１ ０ｍＭ、ジチオスレイト−ＪＩｚ２０ｍＭ、ＡＴＰ　ＬＭ、ＤＩＩＩＡ（５’末 端基の濃度）１００ピコモルおよびＴ４リガーゼ１００ユニットからなり、その 全容積は１００ｕｆｆであった１反応混合物を１６−２１°Ｃにおいて一晩中培 養した。 リゲーション反応の停止のために、ＥＤＴＡを３倍過剰量添加してＭｇＺ−をキ レート化させる操作を行った。尿素および染料混合物を添加した後に試料を加熱 して熱変性させ、次いでゲル電気泳動によって分析した。 第２図に、合成遺伝子の形成のために使用された１２のオリゴヌクレオチドが示 されている。オリゴヌクレオチド１−８は断片Ｉを構成し、オリゴヌクレオチド ９−１２は断片■を構成する。これらの２種の断片は試験管の中で組立てられ（ アセンブリング操作）、そして後記のごとくＭ１３ベクター中にクローンされ、 これによって当該ＤＮＡ配列が確認された。 Ｍ２Ｓ−クローニングベクタの調製 Ｍ１３の２本鎖レプリカ型（ｉｌＦ）　ＤＮＡを次の方法によって調製した。Ｍ ２Ｓに感染した大腸菌Ｊ）１１０１細胞を２ｘ−ＹＴ肉汁に接種し、３７°Ｃに おいて一晩中培養した。次いで遠心分離操作によって細胞を集め、洗浄し、緩衝 液に再び懸濁させ、リゾチームおよびトリトン−Ｘ〜１００を用いて分解しく１ ｙｓｅｄ）、其後にリボヌクレアーゼで処理した。細胞の残層を除去し、ＣｓＣ １−エチジウムブロマイド平衡遠心分離操作を行うことによってＲＦ　−ＤＮＡ を精製した。ｎ−ブタノールを用いる抽出操作を行うことによって前記のエチジ ウムブロマイドを除去した。 ＲＦ　−ＤＮＡに透析操作を行い、次いで、エタノールを用いる沈澱形成操作に よってａ縮した。 形質転換システム コンビ−テント細胞の調製 大腸菌を２ｘ−ＹＴ肉汁中で、００６６０の値が０．６−０．７になるまで培養 した。遠心分離操作によって細胞を集め、５０ｍＭ−ＣａＣ１ｚ（培養時の容積 の半分の容積）の中に再懸濁し、氷上において２０分間維持した。細胞を集め、 そして１／１０容量のＣａＣ１□中に再懸濁した。 形質転換 エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉで予じめ消化してお゛いたＭ　 １３−ＲＦ−ＤＮＡをｐｐ４ｖａｒ　１の断片Ｉおよび■とリゲートし、前記の コンビ−テント３Ｍ１０１細胞と混合し、氷上で２０−４０分間保持した。この 混合物に４６°Ｃにおいて２分間にわたって熱ショックを与え、ＩＰＴＧ、　Ｂ ｌｕｏ−ｇａｌ軟質寒天（４６°Ｃ）、および生長中の新鮮なＪ？１１０１細胞 と混合した。混合物をＹＴ寒天板上に置き、３７°Ｃにおいて一晩中培養した。 自然の状態のＭ２Ｓによって形質転換された前記ＪＭＩＯＩ細胞は、β−ガラク トシダーゼを合成し、青色のプラークを形成した。一方、ＰＦ４ｖａｒ　１の断 片を含むＭ２Ｓによって形質転換された細胞はβ−ガラクトシダーゼを生成せず 、そして無色のプラークを形成した。 ニトロセルロースフィルタを用いる交雑操作ＰＦ４νａｒｌ遺伝子配列の存在を 検知するために、前記の組換えファージにスクリーニング操作を次のごとく行っ た。ファージの培養物をニトロセルロースフィルタ上に斑点状にプロットした。 このプロント操作は、ＢＲＬ社（すなわち、ベセスダ、リサーチ、ラボラトリズ 社）から市販されている「９６−ウユルーハイプリドントーマニホルド」を用い て行った。プロットされたファージを分解しくＩｙｓｅｄ）　、ＤＮＡを変性し かつ固定した。この固定操作は、前記フィルタを次の溶液の各々でそれぞれ１回 づつ攪拌下に洗浄することによって行った。使用された溶液は０．５Ｍ−ＮａＯ Ｈ；０．５Ｍ　）リス（ｐ）１７．４　）　；および２ｘｓｓｃ（ＮａＣＩｏ、 　３　Ｍおよびクエン酸ナトリウム３０ｍＭからなるもの；ｐＨ７）であった。 次いでフィルタを９５％エタノール中で酒単に洗浄し、空気中で乾燥し、予備交 雑操作を３時間行い、次いで交雑操作を室温において３２Ｐ−標識付オリゴヌク レオチドの存在下に一晩中行った。交雑処理が行われたフィルタを、ＳＤＳを０ ．１％含有する５ＳＰＥ（Ｉ　Ｘ　”）で２回洗浄し、各回の洗浄は２５°Ｃに おいて１５分間行い、次いで乾燥し、オートラジオグラフ操作を行った０次いで フィルタを再び洗浄し、オリゴヌクレオチド５　’　−ＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴ ＣＴＡＧＡＣＣＴＧ−３’で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。 前記のオリゴヌクレオチドは、ＰＦ４νａｒｌのサブ断片（Ｉ）メントとＰＦ　 ４　ｖａｒｌのサブ断片（Ｉ［）の接合部に相当するオリゴヌクレオチドである 。 Ｃｏ１Ｅ　１プラスミドの単離 下記の実験は、ＰＦ４ｖａｒ　１の製造のために使用される大腸菌の表現ベクタ ーの形成のために使用される中間プラスミドであるｐＮＰ６の製造に関するもの である。　ｐＮＰ６の製造方法の詳細はウエィレーおよびジョンソンの論文（１ ９８５年；　’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、、１　Ｂ　２　＝　８３８９−８３９３）に記載されている 。 菌株名ＪＣ４１１（Ｃｏｌ　ＥＬ　−、Ｄ　３０　）の菌をＭ９培ｆ（ｉｆ中の 成分の量ｅＮＨ４Ｃ１１ｇ　：ＮａｔＨＰＯａ　・ＨｚＯ６ｇ　；ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ　：ＮａＣ１５ｇ；カサミノ酸（ＣａｓａＩＩｌｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）　３ 　ｇ　；　１０％ＭｇＳＯ４１Ｗ１；さらに、オートクレーブ処理後に２０％グ ルコース１０ｐｄ　ｉ　ｌ　Ｍ　ＣａＣＩｇ　０．５　ｄｌを添加）６０ｆ中に 入れ、発酵装置を用いて３７°Ｃにおいて培養し、この操作を、細胞濃度が約５ ×１０’ＣＦυ／ｄになるまで続けた。クロラムフェニコールを添加し、その最 終濃度は１１００ｕ／ｄであり、培養を３７℃においてさらに６時間続けた。シ ャーベル社製の連続流遠心分Ｍ装置を用いて細胞を回収した。得られたベレット １０ｇ（ｉ潤時重１）を、ＥＤＴＡ５０ａ＋Ｍおよびサクロース１５％を含む５ ０１１Ｍ−トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０）　１８０ｄ中に懸濁させた。次 いでリゾチーム〇、　１４　ｇを添加し、この混合物を室温において１０分間放 置した。次いで１０％５ＤＳ１５ｄおよび５Ｍ−酢酸カリウム２０ｄを添加した 。該混合物を氷上で３０分培養し、其後に、ツルポール遠心分離装置および５５ −１４−ロータを用いて遠心分離操作を１２．０００ｒｐ＋ｍの回転速度で３０ 分間行った。上澄液に膵リボヌクレアーゼＡを４■添加し、該混合物を３７°Ｃ において１時間培養した。試料に抽出操作を、０．１Ｍ−トリス（ｐＨ８，０） を飽和させた等容量のフェノールを用いて２回行った０次いで、１／１０の容量 （試料の容量基準）の３．０Ｍ−酢酸ナトリウムおよび２．５容量の冷エタノー ルを添加し、−２０℃の温度において培養操作を一晩中行うことによってＤＮＡ を沈澱させた。生じた沈澱は、ＨＢ−４−ロータを備えたツルポール遠心分離装 置（冷却装置を有する）において７　、０００ｒｍｐの回転速度で遠心分離操作 を行うことによって回収した。得られたべＬ’７）を、ＮａＣ１０，３Ｍおよび ＥＤＴＡ　５　ＲＩＭを含む１０＋ｅＭ−トリスーＨＣｌ　緩衝液（ｐＨ７，５ ）　（ＮＥ緩衝液）５０ｉｆに熔解した。この試料を其後：こ、寸法５Ｘ！００ ９１！の’Ｂｉｏ　−Ｇｅｌ　Ａ、　５コラムＪＣ米国カリホルニア州リンチモ ンドのビオ−ラッド、ラボラトリズ社製のコラム）に供給した。平衡化操作はＮ Ｅ緩衝液を用いて行った。 ＮＥ緩衝液を用いてＤＮＡを溶離した。２０ｄの両分を６０−７時の流速で集め た。ＤＮＡの溶離は、ギルフォード２６００ＵＶ−シＩＳスペクトルフォトメー タを用いて波長２６０ｎｍの光線に対する各両分の吸光度を測定することによっ て監視した。ホス）　ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは、空の容器（νｏｉｄ　 ｖｏｌｕｏ＋ｅ）に−緒に回収された。　ＤＮＡを含む両分を容器に入れ、エタ ノールを用いて沈澱させた。冷却装置を備えたツルポール遠心分離装置において ＨＢ−４０−夕を用いて遠心分離操作を８．００Ｏｒｐｍの回転速度で４０分間 行うことによって前記沈澱を集め、そしてこれを、ＮａＣ１０，２Ｍを含有する １０ｍＭ−）リス−ＨＣｌ　ｉｆ衝液（ｐ）１７．８　）５ｆｆｉｉ！中に再び 溶解した。 ＤＮＡ試料をＲＰＣ−５コラム（寸法０．９Ｘ９０ｃｍ）中に、３０°Ｃにおい て加圧下に充填した。ＤｌｌＩＡの溶離操作を、１０ｍＭ−）リス−）ＩＣ＋Ｃ ｌ液（ｐ）１７．８　）液中のＮａＣｌ０．６−０．７　Ｍの直線勾配（全容量 １ｆｆ）を利用して行った。画分２．５１！！１を０．８　ｍ／分の流速で集め た。ＤＮＡの溶離の監視のために、電導度測定装置（ラジオメ〜り（コペンハー ゲン）〕を用いて回収試料の電導度を測定した。また、直立型のアガローススラ ブゲル（０，２５Ｘ　１４　Ｘ　１５．５ＣＩ）を用いるアガロースゲル電気泳 動操作を行った。すなわち、ＥＤＴＡ　１　ｍＭおよび酢酸ナトリウム５１を含 有する４０ｍＭ−トリスペース緩衝液（ＴＡＢ緩衝液、　ｐｉ（８，２）中で作 成した１％アガロースゲルに前記試料を供給し、５　Ｖ　／　ｃｖの定常電圧を 印加して電気泳動操作を３時間行った。スーパーコイル構造のＤＮＡ　ｂよび切 目のある環状ＤＮＡをそれぞれ含有する複数の両分を別々に貯槽に入れ、冷エタ ノールを用いて沈澱させた。得られたＣｏ１６１のＤＮＡ分子の沈澱を、ＴＥＮ 緩衝液１．Ｏｄおよび０．６ｄ！にそれぞれ溶解した。 プラスミドｐＢＲ３２２の単離 既述のＣｏ１Ｅ１プラスミドの単離操作と同様な操作を行うことによって、大腸 菌［菌株名２９４　（ｐＢＲ３２２））からプラスミドｐＢＲ３２２を単離した 。 Ｃｏ１Ｅ　Ｉ　ＤＮＡの切断断片の調製切目のついた環状Ｃｏ１Ｅ１−ＤＮＡ　 （０，７ｕｇ／ｕｊｌり試料２００ｄ２を０．３Ｍ−酢酸ナトリウム２．８　ｄ と混合した。このＤＮＡ溶液をオムニミキサ〔デュポン、インストルメンツ社（ 米国コネクチカノト州ニュートン）〕のマイクロホモジナイザセルに入れ、ＤＮ Ａに剪断力をかける操作を３８．５００ｒｍｐの回転速度で２０分間行った。剪 断操作の実施中は温度を０℃に保った。切断されたＤＮＡをエタノールで沈澱さ せ、ＴＥＮ　１１衝液に再び溶解し、子牛の腸から採取されたホスファターゼ（ ＣＡＴ　ｉベーリンガ、マンハイム社（米国インディアナ州インディアナポリス ）〕で処理した。ＣＩＴによる処理は、反応混合物５００ｕｊ！を２組用いて行 った。各反応混合物は、蒸留水３８０ｕｆ、ＬＭ−）リス−）ＩＣ！緩衝液（ｐ Ｈ８，０）５０ｔ＋ｆ！、１０ｍＭ−硫酸亜鉛５ｕｆおよびＣＩＴ　（ＩＯＵ／ ｕ＃）５μを含有するものであった。培養操作を３７°Ｃにおいて３０分間行っ た後に、Ｃｌ７５μを追加し、培養操作を３７°Ｃにおいてさらに３０分間行っ た。反応混合物に抽出操作を、等容量の緩衝液飽和フェノールを用いて２回行い 、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。ＤＮＡ断片を含む不均質集団（ｐｏｐｕｌ ａｔｉｏｎ）をさらに精製し、そして、サクロース勾配速度遠心分離操作による 分級（ｓｉｚｅ）を行って、所望生成物を分離した。サクロースの不連続勾配は 、遠心分離管中のＥＤＴＡ１＋Ｍを含有する０、３Ｍ−酢酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ７，０）の中に、２０％、１５％、１０％および５％のサクロースをそれぞ れ含む容積３．４−の層を順次配列することによって形成させた。 遠心分離に使用されたロータは、５Ｗ４０ロータ（ベックマン社）であった、ｌ 　００　ｕｊ！　（０，２５ｕｇ／ｕ　ｆｆ１）のＤＮＡ試料をサクロース勾配 上に層状に配置し、Ｌ８−７０ベックマン超遠心分離器を用いてｌＯｏＣにおい て３５．００Ｏｒｐｍの回転速度で遠心分離管中Ｙを２０時間行った。複数の画 分（各画分の容量０．５ｄ）を集め、エタノールで沈澱させた。沈澱をＴＥＮ緩 衝液５０ｕ１に再び溶解し、アガロースゲル電気泳動操作によって分析した。バ タテリオファージＤＮＡを旧ｎｄＩ［Ｉエンドヌクレアーゼで処理することによ って生成させたＤＮＡ断片を、「分子量標準」（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　−ｗｅｉ ｇｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄｓ）として使用した。前記のラムダ／Ｈｉｎｄｎ［反 応混合物は、蒸留水２７ｕｊ！、旧ｎｄＩ［［緩衝液（５Ｘ）１．Ｏｕｆ、ラム ダＤＮＡ　（０，７ｕｇ／　ｕ　ｊ２　）　１　ｕ　ｌおよびＨ３ｎｄＩＩ［溶 液（２Ｕ／ｕｊり２ｕｊ２を含有するものであった。 切断されたＣｏＬＥ　１−ＤＮＡ断片（平均２，０００ｂｐ　）を含むサクロー ス勾配分画画分を容器に入れ、エタノールで沈澱させ、次いでＴＥＮ緩衝液に再 び溶解した。 ｐＢＲ３２２中の切断Ｃｏ１Ｅ　１断片のクローニングプラスミドｐＢＩ？　３ ２２をＰｓｔ　Ｉで切断して複数の直線状分子を生成させた。反応混合物は蒸留 水５２０ｕｒ、Ｐｓｔ　Ｉｌｌ衝液（５ｘ）２００ｕｉ！、ｐＢｌｌ　３２２Ｄ ＮＡ溶液（０，２５ｕｇ／　ｕ　ＩＩ　）２００ｕｆｆおよびＰｓｔ　Ｉ　（１ ２０／ｕｊｌり　８０ｕｊ！を含有するものであった。反応混合物を３７°Ｃに おいて４時間培養した。 ＥＤＴＡを２０ｍＭ以下添加することによって反応を停止し、等容量のフェノー ルを用いて抽出操作を行った。　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、次いでＴＥＮ 緩衝液に再び溶解した。 蒸留水５ｕＩ！、、５００１１＋Ｍ−カコジル酸カリウム２０ｕｌ、１０ｍＦ＋ −塩化コバルト１０ｕｊ２．１＋ａＭ−ＤＴＴ　１０　ｕ　１．１０鱈−ｄＣＴ Ｐ２　ｕ　ｆ、！ＨｄＧＴＰ　（；　ｓ−、イングランド、−ユークレア、コー ポレーション社）２０ｕｊ２、ＤＮＡ　（０，０４ｕｇ／　ｕ　ｉ！　）２５ｕ ｉ！およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ［１２Ｕ／ｕ １；ベセスダ、リサーチ、ラボラトリーズ社（米国メリーランド州ゲイサーズバ ーグ））５ｕｊ！を含有する反応混合物中で線状ｐＢＲ３２２分子にポリ（ｄＧ ）ホモ重合体型伸長体（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）を付加させた。 ＤＮＡの全量が２．０　ｕｇであり、かつ、ヌクレオチドトリホスフェートがｄ ＣＴＰであることを除いて前記の場合と同様な反応混合物の中で、Ｃｏ１２１切 断断片にポリ（ｄｃ）ホモ重合体型伸長体を付加させた。これらの反応は３７° Ｃにおいてそれぞれ２分間および３分間行い、ＥＤＴＡを２０ｍＭ以下添加して 反応を停止し、フェノールを用いて抽出操作を行った。Ｃｏ１Ｅ１　（ポリ（ｄ ｃ）　）断片を蒸留水１１５ｕｆに再び溶解し、そして、０．５　Ｍ　−ＮａＣ １４０ｕＩ！、５０ｓ＋Ｍ−ＥＤＴＡ　（ｐｉ（７，２５）　４０　ｕ　Ｉ！お よび線状ｐａＲ３２２−〔ポリ（ｄＧ）　）　ＤＮＡ溶液（０，１ｕｇ／ｕｊ２ ）３ｕｆを添加することによって、Ｃｏ１Ｅ１　（ポリ（ｄｃ）　）断片を線状 ｐＢＲ３２２−％、（＃　ＩＪ　ｃｄＧ）３分子に結合させた（アニーリング操 作）。 ごのアニーリング混合物を７０″Ｃの温室において１５分間保温１．２次いで５ 時間を要１１．て４ｏ″Ｃに冷却した。該混合物を一晩中４５°Ｃに保ち、其後 に室温に冷却した。 大腸菌２９４の形質転換を行うために、■、−肉汁中で一晩生長させた培養物を 新鮮なし一肉汁培地で１：１００の比率で希釈し、３７°Ｃにおいてふりまぜな がら培養操作を行い、該操作を、ＯＤｉ。。が０．６になるまで続けた。この時 点において、培養物３５細に遠心分離操作を４°Ｃにおいて６．　ＯＯＯｒｐｍ ＋の回転速度で１２０分間行った。生じたベレフトを０．０５Ｍ　−ＣａＣ１， ２Ｏｄ中に再び懸濁させた。細胞を氷上で１５分間培養し、次いで遠心分離操作 を４．０００ｒｐ−の回転速度で１０分間行って細胞を集めた。細胞を０．０５ Ｍ　ＣａＣＩｚ　４ｊｌｉ！中に再び懸濁させた。　ＭｇＣｌ。 １０１およびＣａＣ１ｚ　ｉ　ＯｍＭを含有する１０ｍＭ−）リス−１１ｃＩ（ ｐＨ７，５）　１５０ｕｊ！および前記アニーリング混合物５０ｕｆｆｉを添加 することによって調製したＤＮＡ溶液２００ｕｆを、上記細胞と混合した。この 混合物を０°Ｃにおいて２５分間培養し、次いで５０°Ｃにおいて１０秒間培養 し、其後に室温において１０分間培養した。この時点においてＬ−肉汁１４−を 添加し、培養物を３７°Ｃにおいて３０分間ふりまぜた。次いで培養液にテトラ サイクリン溶液（１，２５■／ｄ）４８０ｕｆを添加し、培養をさらに３０分間 続けた。Ｌ−肉汁２５ｄ、寒天１．５％およびテトラサイクリン２５ｕｇ／−を 含有する新たに作られた寒天板に、前記の培養液１００ｕｆを供給して平板培養 を行った。 テトラサイクリン耐性（Ｔｃ’　）を有する形質転換体についてさらに試験を行 い、アンピシリン敏怒性（Ａｐ’　）を調べた。該試験は、アンピシリン２５ｕ ｇ／ａｄ！を含有する寒天板を用いて平板培養することを包含するものであった 。 コリシンの自炊生成のために、ＴｃＩ’　６．ｓ転質転換体のコロニーにスクリ ーニングを行った。単純コロニーをＬ−寒天平板上に斑点状に分布させ（ｓｐｏ ｔｔｅｄ）　、３７　”Ｃにおいて一晩中培養した。コロニーをクロロホルムの 蒸気に暴露してこれを殺滅し、寒天０．７％および大腸菌に−１２、ＣＬ１４２ の培養物（−晩培養したもの）　０．１　ｄを含有するし一肉汁５ｄに前記コロ ニーを供給した。寒天が硬化した後に、該平板を３７℃において一晩中培養した 。コロニーの周囲に生長阻止帯域が生じたが１、これをコリシン産生物（ｃｏｌ ｉｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）　（Ｃｏｌｄ）として記録した。 前記のＴｃ’　−Ａｐ’−Ｃｏｌ＋形質変換体のコロニーに対し、組換えプラス ミドの存在を調べるためにスクリーニングを行った。 この目的のために、アガロースゲル電気泳動操作によって少量の浄化リゼート（ Ｉｙｓａｔｅ）を分析した。プラスミドの寸法は次の方法で測定した。すなわち 、８種のプラスミドの標準試料〔その寸法は１．３６Ｘ１０’ダルトンから３５ ．８Ｘ　１０’ダルトンまでの範囲にわたる；マルシナ、Ｆ、Ｌ、等（１９７８ 年）：ｒＰｌａｓｍｉｄ　Ｊ　１　：　４１７−４２０）を使用し７て、ｉ＋ｔ ｉ泳動の際のアガロースゲル上のＤＮＡの移動距離を測定し、標準試料と比較す ることによって、プラスミドの寸法を測定した。組換えプラスミドの制限酵素（ エンドヌクレアーゼ）断片寸法の測定形質転換クローンを２１培養液中で生長さ せた。浄化されたりセードを、既述の方法によって調製した。上澄液を膵ＲＮａ ｓｅ　Ａで処理しく　１００ｕｇ／ｄｉ　；　３７°Ｃ；３０分間）、次いでフ ェノ−＝ルを用いて抽出操作を行った。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、其後に ＴＥＮ緩衝液に再び溶解した。 制限酵素は、ベセスダ、リサーチ、ラボラトリ社（ＢＲＬ）製の市販製剤であっ た。ＢＩ？Ｌ社によって設定された条件下にＤＮＡをＰｓｔ　Ｉ　、　ＥｃｏＲ Ｉ　、　Ｓｍａ　ＩおよびＳａｃ　ＩＩで消化した。試料を１％アガロースゲル 上に置き、電気泳動操作を定常電圧５Ｖ／ＣＩ＋の印加下に４時間行った。制限 断片の分子量を、旧ｎｄｌｌｌおよびＨａｅ　ｉｌｌで消化されたバクテリオフ ァージラムダＤＮＡの４１準泳動パターンとの比較によって測定した。 組換えプラスミドのｐＢＲ３２２の部分のＰｓｔ　Ｉ部位内の断片状挿入体の寸 法を調べるために、Ｐｓｔ　Ｉを用いて制限分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａ ｎａｌｙｓｉｓ）を行った。第４図は、形質転換クローンのうちの１つの組換え プラスミド（ｐＮＰ６と称する）の制限地図（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａｐ ）である、前記の形質転換クローンの試料（Ｎｌ”　６−２９４と称する）を１ ９８３年８月２４日にＡＴＣＣに寄託した。 この試料は、ＡＴＣＣにおいて受託番号第３９４１８号が付された。寄託はブタ ペスト条約の規定に従って行われ試料は該規定に従って保管され、かつ該規定の もとで他人のアクセスも可能である。 大腸菌［菌株名ＮＰ６−２９４　（ｐＮＰ６）：ｌを培養し、プラスミドＩＩＩ ＩＡをさらに精製し、た。すなわち、ＤＮＡ　５００ｕｇをＴＥＮ緩衝液３．９ ｉで調整し、ＣｓＣｌ３．・３５ｇおよびユチジウムブロマイドストンク溶液（ ５ｍｇ／ｄ）　０．１　ｄを添加した。この混合物を硝酸セルロースの管に入れ 、５Ｗ５０．１−ロータ（ベックマン）を用いて遠心分離操作を１０゛Ｃにおい て３６．００Ｏｒｐｍの回転速度で４０時間行った。プラスミドＤＮＡバンドを 波長の長いＵＶ光純の照射下に検知し、注射器によって液管を横側から刺通して 該試料を取出した。ＤＮＡ試料に抽出操作を、ブタノールを用いて５回行い次い で、ＴＥＮ　ｌ衝液１００容量（×３）を用いて４℃において２４時間にわたっ て透析操作を行った。其後にＤＮＡを、エタノール２．５容量および３Ｍ−酢酸 ナトリウム１／１０容量の添加によって沈澱させた。 誘導体であるｐＮＰ６ｄｅｌ　ｔａＲＩの製造プラスミドｐＮＰ６は２つのＥｃ ａｌｉｌ制限部位を含み、その１つはコリシンＥ１遺伝子のカルボキシ末端区域 に存在し、他の１つは本来のｐＢＲ３２２ベクターのテトラサイクリン耐性遺伝 子の近傍に存在する。第２番目の部位を欠如したｐＮＰ６誘導体を次の方法によ って作成した。ｐＮＰ６を制限反応条件下にＥｃｏＲｌで消化した。 線状分子が生じた（前記の２つの部位のうちの１つの部位のみが切断された）　 、　ｐＮＰ６の線状分子をアガロ−＝スゲルミ気泳動繰作によって精製し、次い でＤＮＡポリメラーゼＩおよびデオキシリボヌクレオチド三燐酸と反応させて一 本鎖の末端部を充填した。その結果生じた分子を、Ｔ４リガーゼを用いるプラン トエンド（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）リゲーション反応によって環化させ、そしてこ れを、既述の大腸菌２９４の形質転換操作のために使用した。 コＩＩシン生成性形質転換体は既述の方法によって選択された。 個々のクローンからＤＮＡを、＠離し、１ｆｆＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した。 これは、コリシン遺伝子内に１つのインタフ）　ＥｃｏＲＩ部位を含むものであ ることが判った。前記の１つのＥｅｏＲ１部位の位置は、制限酵素エンドヌクレ アーゼを用いるマツピングによって確認された。 ｐＮＰ６−Ｃａｌ（５０４）　−ＰＦ　４の製造合成の野生型ＰＦ４遺伝子（Ｐ Ｆ　４　ｖａｒｌの場合と同様な方法で作成されそして第４図中に記載の蛋白質 のためのコードを有する）ｅＭ１３配列ベクター（ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ　ｖｅｃ ｔｏｒ）から除去し・これをクロニニング操イ乍によって、プラスミドｐＮＰ６ ｄｅｌｔａＲＴの１つのＥｃｏＲ１部位に入れた。この組換え［ｌｌＪ＾プラス ミドは大形蛋白Ｉｔ（アミノ酸５７４個）を生成させる能力を有し、すなわち、 ＰＦ４蛋白質（アミノ酸７０個）とコリシン遺伝子中の残基１−５０４との融合 によって前記大形蛋白質を生成させる能力を有する。このプラスミドを含む細胞 を培養液中で生長させ、次いでマイトマイシンＣで処理して前記の融合蛋白質の 合成反応を誘起させた。 ｐＮＰ６−Ｃｏｌ　（１５０）　−ＰＦ　４　ｖａｒｌの製造ｐＮＰ６ｄｅｌ　 ｔａＲＩ中には３つのＥｅｏＲＶ制限部位が存在し、そのうちの２つの部位はコ リシンＥ１構造遺伝子の中に存在し、他の１つはテトラサイタリン遺伝子の中に 存在する（第５図）、部分的なＥｃｏＲＶ消化が行われるような条件下の操作に よってプラスミドｐＮＰ６−Ｃｏｌ（５０４）　−ＰＦ　４から約１０００塩基 対のＤＮＡを除去した。形質転換体はＴａ２のために選択されるから、所望の形 質転換体は、コリう・ン遺伝子から除去されたＥｃｏＲＶ断片を有する形質転換 体のみである。その結果として得られるプラスミドは、ＥｃｏＲ１部位のＰＦ４ コード配列の前のコリシンの１５０個のアミノ酸のみのためにコードするもので ある。該プラスミドは１個のメヂオニン残基を有し７、該残基を介してコリシン セグメントとＰＦ４とが結合する。ＰＦ４蛋白質への前記コリシンセグメントの 融合の結果として、前記の回収、精製操作の効率が一層高くなるであろう。 ＰＦ４νａｒｌをエンコードする合成遺伝子を含むＥｃｏＲＩ制限断片を、サブ クローニング操作によってＥｃｏＲＩ消化−ｐＮＰ６−Ｃｏ（１５０）−ＰＦｄ 中に入れた。該プラスミドで形質転換された大腸菌の細胞を培地内で生孫させ、 マイトマイシンＣで処理して融合蛋白質の合成反応を誘起させた。 プラスミドｐＮＰ６−　Ｃｏｌ　（１５０）　−ＰＦ　４　ｖａｒｌを含有する 大腸菌２９４の細胞を大量（１２１以上）の培地内で、再現性のある培養方法に よって培養し、マイトマイシンＣによって合成反応を誘起し、Ｃｏｌ　（１５０ ）　−ＰＦ　４シａｒｌメジウム融合体を生成させた。 生成率は、全細胞蛋白質の約２０％であった。 ＰＦ　４　ｖａｒｌの精製 塩酸グアニジン（Ｇｎ）ＩｃＩ）　Ｉ　Ｍまたはトリス２５ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ ０ｍＡおよびグルコ−ス５０ａ＋Ｍを含むｐＨ８，０の液（ＴＥＧ）の中で誘導 細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓ）の音波処理によって、ｐＮＰ６−Ｃａｌ（ １５０）　−ＰＦ４νａｒｌから蛋白質抽出物を調製した。融合蛋白質は不溶性 画分中に見出された。７Ｍ＝尿素または６　Ｍ　−ＧｎＨＣＩ中でＰＦ４νａｒ １融合蛋白質の可溶化処理を行った後に、該蛋白質の試料に透析操作をｆ留水の 存在下に充分に行った。これはＣＮＢｒ切断反応の準備操作であった。透析操作 の際に融合蛋白質が沈澱したが、これを遠心分離操作によって集めた。該沈澱を 凍結乾燥し、次いで７０％蟻酸に溶解し、其後に１００ないし１０００倍過剰モ ル量のＣＮＢｒと室温において１８時間反応させた。 前記のＣＮＢｒ反応の反応混合物を凍結乾燥し、藤留水中に再び懸濁させ、次い で再度凍結乾燥した。この蛋白質混合物を、６ＭのＧｎ）ＩＣＩ　を含有するｐ Ｈ８，２の０．０５Ｍ−）リス緩衝液に溶解した。ジチオスレイトールまたはβ −メルカプトエタノールのごとき還元剤を、最終濃度が約０．１　Ｍになるよう に混合物に添加し、該混合物を２０−３７℃の温度において１−４時間培養した 。その結果得られた溶液に透析操作を、還元剤を含まないことを除いて前記緩衝 液と同様な緩衝液の存在下に行った。この蛋白質溶液のＰＦ４νａｒ１！度を約 ０．２■／ｄに調整し、そして、酸化されたグルタチオニンと還元されたグルタ チニンとの２＝１混合物が１１１１Ｍの最終濃度で存在するように調整した。蛋 白質復元（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）反応を室温において１０−２０時間実施し、す なわち前記の時間にわたって透析を、０．５ＭのＮａ１ｌを含む１）８８．２の ０．０５Ｍ−１−リス緩衝液１．０−５０容量を用いて行った。前記条件下の反 応の結果、ＰＦ４νａｒｌの８０％より多くのものが正当なジサルファイド結合 を形成し、かつ本来の立体配座（ｃｏｎｆｏｒａ＋ａｔｉｏｎ）に復元された。 ヘバリンアフィニティクロマトグラフィ前記の復元混合物に其後に蒸留水の存在 下に透析操作を行い、次いで凍結乾燥した。蛋白質を其後に、ＧｎＨＣＩまたは ＮａＣ１または硫酸コンドロイチン中に高濃度に溶解し〔〉１０■／ｄ（蛋白’ Ｊｔ））、そしてヘパリンアフィニティクロマトグラフィの直前に、イオン強度 が０．２−０．４になるように希釈した。クロマトグラフィ用コラムは、市販の ヘパリンアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて作成した。ヘパリンの代りに他 のグリコサミノグリカン、たとえば硫酸コンドロイチンを用いることも可能であ る。 すなわち、ここに使用された用語「ヘパリン」は、その類似化合物をも包含して 意味する用語である。 蛋白質を低イオン強度の緩衝液（ｐＨ６，５）中に入れ、コラムに供給した。コ ラムにおける溶離操作は、ＮａＣｌの線状匂配を利用して行われた。天然の組換 えＰＦ４νａｒｌはＮａＣ１濃度度が約０．８４Ｍのときに溶離し、一方、人の 血小板から単離されたＰＦ４はＮａＣｌ濃度が１．３Ｍのときに溶離した。未復 原ＰＦ　４　ｖａｒｌまたは不正確に復元されたＰＦ　４　ｖａｒｌは、前記の 場合よりかなり低いＮａＣ１濃度（一般に０．３−０．４　Ｍまたはそれ以下の 濃度）において溶離した。均質生成物を得るための精製操作は、逆相１（Ｐ　Ｌ 　ＣをビグツクＣ−４コラムにおいて、アセトニトリル勾配をもつ溶離系（０， ３０％）を用いてｐＨ２−３において実施された。 前記の方法によって作られた組換えＰＦ４νａｒｌは、人のＰＦ４から区別でき るものであり、たとえば、アミノ酸組成、ヘパリン結合性および免疫学的刺戟性 等によって特徴づけられるものであった。 血小板、培養細胞または組織から得られたＰＦ　４　ｖａｒｌの精製ＰＦ４νａ ｒｌの原料である細胞や組織の性状については未だ充分に研究されていないが、 哺乳動物系供給源から得られた前記蛋白質は、活性化血小板からの抽出操作によ って精製でき、あるいは、培養細胞また組織に均質化操作を行うことによって精 製できる。しかしてこれらの操作では、適度のイオン強度を有する中性緩衝液が 使用でき〔たとえば、５０＋ｗＭ−）リスまたは０、５　Ｍ　＝ＮａＣ１（ｐＨ ６，５−８，５）が使用でき〕、および／または、血小板濃縮物または分裂細胞 （ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ）に酸−エタノール抽出が実施できる（たと えば、０．０５　Ｍ−）ＩｃＩ中にエタノールを５０−７０％含有する液が使用 できる）、其後にＰＦ４νａｒ１は、既述の方法に従ってヘバリンアフィニティ クロマトグラフィおよびＨＰＬＣ操作を行うことによって精製でき、すなわち、 組換えによって作られた蛋白質が精製できる。 ＰＦ４νａｒｌの免疫性刺戟作用 最初に、免疫抑制に関する実験を行った。静脈注射によってマウスに、コンカナ バリンＡ（Ｃｏｎ　Ａ）のごとき免疫抑制剤を羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）と共 に投与し、プラーク生成状顎評価試験によって、５ＲＢＣによる抗体形成量低下 の度合を測定した。この抑制は、Ｃｏｎ　Ａによって誘起されたサプレッサー表 現型のＴ細胞（Ｔ−ｃｅｌｌ）の増殖がその原因であると思われる。サプレッサ ーＴ細胞は、抗体形成性Ｂ細胞の機能を抑制し得る抗原特異性細胞、または他の Ｔ細胞のザブセットである。ＰＦ４νａｒｌは、活性化された末梢性サプレッサ ーＴ細胞に結合することによって、免疫応答性を回復する作用を有するものであ ると思われる。 マウスの免疫抑制状態を解放することに関するＰＦ４νａｒｌ、ＰＦ４およびＣ ＴＡＰ−ＩＩＩの効力を調べるために、服量反応実験を行った。この実験では、 免疫抑制剤として異型型リンパ節細胞（ＬＮＧ）またはＣｏｎ　Ａを使用した。 １群当り３匹のマウスに５ＲＢＣと、ＬＮＣまたはＣｏｎ　Ａとを静脈注射した 。対照動物であるマウスには５ＲＢＣのみを注射した。５日後に、マウスの牌臓 内の抗５ＲＢＣ性の抗体形成性細胞の数を調べた。細胞数の調査は、カニンガム のプラーク形成細胞評価試験法〔ミシエルおよびシルギ、「セレクテソド、メソ ツズ、イン、セルラー、イムノロジー」第ｍ版、第６９頁−第７７頁、１９８０ 年〕に従って行った。ＬＮＣまたはＣｏｎ　Ａを注射したマウスでは一般に、５ ＲＢＣのみを注射したマウスに比して、プラーク形成細胞の数において３０−５ ０％の減少が認められ、すなわち、該細胞の生成を抑制する効果が認められた） 。 第１表は、種々の程度の免疫抑制がなされている動物に対するＰＦ４νａｒｌ、 ＰＦ４、同族型血小板蛋白質、ＣＴＡＰ−Ｉ［［の免疫性刺戟作用に関する一連 の動物実験の結果を示した表である。これらの動物実験の結果から次の結論が得 られ、すなわち、前記のｉＸｔ′験条件下ではＰＦ４νδｒ１およびＰＦ４の両 者は免疫抑制状態を解放し得るが、ＣＴＡＰ−ＩＩＩは抑制解放性を実質的に有 しない。免疫抑制の度合が低下するにつれて、ＰＦ４の相対的な免疫性刺戟作用 が低下する傾向がある。一方、ＰＦ　４　ｖａｒｌは高度の免疫抑制状態に対し ては比較的低い免疫性刺戟作用を示すけれども、これは、比較的軽度の免疫抑制 状態に対して非常に顕著な免疫性刺戟作用を示す。免疫性刺戟作用に関するｐｐ 　４　ｖａｒｌとＰＦ４との前記の差異は、主としてヘパリン結合性の差異によ るものであると思われる。少なくとも或種の条件下ではＰＦ４νａｒｌは一層大 なる潜在的効力を有すると思われる。なぜならば、これはへ）くリンに対する親 和性が低（、したがって血管の内皮に結合する傾向が低く、そのために生体内の 利用可能性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）がかなり大であるからである。 星−１，−一一一表 実験的にマウス内に誘起した免疫抑制状態に対するｈＰＦ４、ｈＰＦ４ｖａｒｌ およびＣＴＡＰ−ＩＩＩの免疫性刺戟作用第１表に記載の実験では、マウス（Ｃ Ｂ６Ｆ１）に静脈注射（ｉν）によって前記の種々の化合物または食塩水を投与 し、その１時間後に、コンカナバリンＡまたは食塩水を投与した。１日後に、各 マウスに羊の赤血球細胞を５Ｘ１０’個注射（ｉｐ）　シた。５日後に、各マウ スの牌臓を除去し、抗５ＲＢＣ抗体形成性細胞の数を、カニンガムのスライド技 術によってかぞえた。実験結果は、一群当り３匹のマウスの測定値の幾何平均値 として表示した。 当業者には明らかなように、本発明に関する前記の種々の態様は種々の変化が可 能であり、これらの態様変化はすべて、請求の範囲内に記載の本発明の範囲に入 るものであることが理解されるべきである。 １０’　２０’　３０’＋　６ ＫＳＳＡＡＲ５ＲＬＴ　ＲＡＴＲＱＥＭＬＦＬ　ＡＬＬＬＬＰＶＶＶＡ　ＦＡＲ ＡＥＡＥＥＤＧ簀簀薫Ｊｋ賛　肴　曽　曽餐簀　簀　臀　肴ＭＳＳＡＡ−−−Ｇ Ｆ　ＣＡＳＲＰＧＬＬＦＬ　Ｃ，ＬＬＬＬＰＬＶＶＡ　ＦＡＳＡＥＡＥＥＤＧ１ ６　２６　３６　壷　１４６ ＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴ　５ＱＶＲＰＲＨＩＴＳ　ＬＥＶＩＫＡＧＰ）（ＣＰＴＡ ＱＬＩＡＴＬＫＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴ　５ＱＶＲＰＲＨＩＴＳ　ＬＥＶＩＫＡＧ Ｐ）ＩＣＰＴＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲＫＩＣＬＤＬＱ　ＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫ　 ＬＬＥＳ国際調査報告 ｌＨ１＃４＋Ｉｊｌａ＋Ａ＾ｔｅ−、＋ｌｌ　６＋〜＋　ＰＣτ／υＳ　９０． ’ＯＣニ二〇・・Ｃ−１・・Ｃ−ζム＝む−１−・リ　？：Ｔ／ＵＳ　９（”／ Ｉ）ＯＤＯ国際調査報告 ：　εＰ−Ａ−０３２４５５６２９−０７−８９Ｎｏｎｅ■ １　゛

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板因子４の変種をエンコードする、単離されクローニングされた組換え または合成核酸配列。
2. ２．第２図に記載のヌクレオチド１５−２２４および第３図に記載のヌクレオチ ド１４０２−１７３５によって表わされるＰＦ４ｖａｒ１コード配列によって特 徴づけられる、血小板因子４の変種をエンコードする請求の範囲第１項に記載の 核酸配列。
3. ３．プレカーサの形のＰＦ４ｖａｒ１をエンコードする核酸をさらに包含する請 求の範囲第１項に記載の核酸配列。
4. ４．表現のためにコントロール配列に操作自在に結合される請求の範囲第１項に 記載の核酸配列。
5. ５．前記のコントロール配列がコリシンＥ１プロモータからのものである請求の 範囲第４項に記載の核酸配列。
6. ６．翻訳読みとり過程において第２核酸配列とリゲートされて融合遺伝子を形成 する請求の範囲第１項に記載の核酸配列。
7. ７．前記の第２核酸配列がコリシンＥ１構造遺伝子に曲来するものである請求の 範囲第６項に記載の核酸配列。
8. ８．請求の範囲第４項に記載の核酸配列を含むプラスミド表現ベクター。
9. ９．請求の範囲第６項に記載の核酸配列を含むプラスミド表現ベクター。
10. １０．ｐＮＰ６−Ｃｏ１（１５０）−ＰＦ４ｖａｒ１である請求の範囲第９項に 記載のプラスミド表現ベクター。
11. １１．請求の範囲第８項に記載のプラスミド表現ベクターの存在下に形質転換さ れた絹換えホスト細胞。
12. １２．請求の範囲第９項に記載のプラスミド表現ベクターの存在下に形質転換さ れた組換えホスト細胞。
13. １３．大腸菌である請求の範囲第１１項に記載の組換えホスト細胞。
14. １４．大腸菌である請求の範囲第１２項に記載の組換えホスト細胞。
15. １５．血小板因子４の変種１の細菌学的製造方法において、（ａ）請求の範囲第 １４項に記載の大腸菌の形質転換体を培養し、（ｂ）前記の形質転換体を破断し 、 （ｃ）他の細胞蛋白質を除去して融合蛋白質を精製し、（ｄ）前記の融合蛋白質 を特定の切断部位で切断し、そして（ｅ）前記の工程（ｄ）の切断生成物から前 記の血小板因子４の変種を回収することを特徴とする製造方法。
16. １６．前記の血小板因子４の変種をヘパリン−アフィニティクロマトグラフィに よって精製することを包含する請求の範囲第１５項に記載の製造方法。
17. １７．請求の範囲第１５項に記載の製造方法によって製造された血小板因子４の 変種１。
18. １８．血小板因子４の変種１の核酸配列によってエンコードされた実質的に純粋 な単離蛋白質。
19. １９．請求の範囲第３項に記載の核酸配列によってエンコードされた実質的に純 粋な単離蛋白質。
20. ２０．第４図に記載の成熟ＰＦ４ｖａｒ１のアミノ酸配列によって特徴づけられ る請求の範囲第１８項に記載の単離蛋白質。
21. ２１．免疫応答性の変改のために有効な量の血小板因子４の変種１と、薬学的に 許容され得る担体とを含有することを特徴とする、哺乳動物の免疫応答性変改組 成物。
22. ２２．前記の量が、抗原剤に対する人類等の哺乳動物の免疫応答性の増大のため に有効な量である請求の範囲第２１項に記載の組成物。
23. ２３．前記の量が、前記の哺乳動物に或薬剤または抗原が与えられることによっ て生ずる免疫応答性の抑制の防止のために有効か量である請求の範囲第２０項に 記載の組成物。
24. ２４．治療時の必要に応じて哺乳動物の免疫応答性を変改する方法において、該 哺乳動物の免疫抑制を阻止するのに有効な量の血小板因子４の変種１を、案学的 に許容され得る担体中に含有してなる組成物を、該哺乳動物に非経口的に投与す ることを特徴とする、免疫応答性を変改する方法。
25. ２５．免疫抑制作用を有する薬剤を哺乳動物が摂取することによって起る該哺乳 動物の免疫抑制を阻止するのに充分な量の血小板因子４の変種１を、前記哺乳動 物に投与することを包含する請求の範囲第２４項に記載の方法。