JPH09124501A - 新規免疫抑制剤 - Google Patents
新規免疫抑制剤Info
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- JPH09124501A JPH09124501A JP7278773A JP27877395A JPH09124501A JP H09124501 A JPH09124501 A JP H09124501A JP 7278773 A JP7278773 A JP 7278773A JP 27877395 A JP27877395 A JP 27877395A JP H09124501 A JPH09124501 A JP H09124501A
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- JP
- Japan
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- soluble human
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＩＬ−２の過剰産生による疾患、例えば臓器
移植時の拒絶反応や自己免疫疾患の治療に有効な免疫療
法剤を提供する。 【解決手段】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫
抑制剤は、ＩＬ−２の作用を強力に抑制する活性がある
ので、ＩＬ−２の過剰産生により引き起こされる自己免
疫疾患等の治療に対して有効である。
移植時の拒絶反応や自己免疫疾患の治療に有効な免疫療
法剤を提供する。 【解決手段】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫
抑制剤は、ＩＬ−２の作用を強力に抑制する活性がある
ので、ＩＬ−２の過剰産生により引き起こされる自己免
疫疾患等の治療に対して有効である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、可溶性ヒトインタ
ーロイキン２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトインター
ロイキン２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトインター
ロイキン２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑
制剤に関する。本免疫抑制剤は、インターロイキン２
（以下、ＩＬ−２と称する）の生物活性を効果的に阻害
する作用を有しており、ＩＬ−２の過剰産生が原因とな
っている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾
患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効
である。
ーロイキン２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトインター
ロイキン２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトインター
ロイキン２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑
制剤に関する。本免疫抑制剤は、インターロイキン２
（以下、ＩＬ−２と称する）の生物活性を効果的に阻害
する作用を有しており、ＩＬ−２の過剰産生が原因とな
っている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾
患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効
である。
【０００２】
【従来の技術】臓器移植の外科的技術が著しく向上した
現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をい
かにして抑制できるかにかかってきている。拒絶反応
は、生体が移植片を異物として認識し、それを排除する
ために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。
そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、ア
ザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカプトプリ
ンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与
が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは
効果が弱いことなどにより、移植臓器の拒絶反応を抑制
することができず、移植臓器の生着率の著しい向上はみ
られなかった。
現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をい
かにして抑制できるかにかかってきている。拒絶反応
は、生体が移植片を異物として認識し、それを排除する
ために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。
そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、ア
ザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカプトプリ
ンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与
が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは
効果が弱いことなどにより、移植臓器の拒絶反応を抑制
することができず、移植臓器の生着率の著しい向上はみ
られなかった。
【０００３】その後、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６
の登場により、生着率は格段の向上をみられるようにな
った。しかしながら、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６
には重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用
の制限が与儀なくされてきており、より安全で、かつ効
果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。
の登場により、生着率は格段の向上をみられるようにな
った。しかしながら、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６
には重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用
の制限が与儀なくされてきており、より安全で、かつ効
果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。
【０００４】さて、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産
生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細
胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働
きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓
器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握る
と考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あ
るいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２な
どにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与している
ことが示されている。
生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細
胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働
きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓
器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握る
と考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あ
るいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２な
どにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与している
ことが示されている。
【０００５】また、自己免疫疾患は生体内での免疫系の
バランスがくずれ、生体自身を攻撃することにより発症
すると考えられており、その中でも特にＩＬ−２を中心
とする免疫系因子の過剰産生、あるいはそれらの因子に
対する過剰反応がその一因となっていると考えられてい
る。従って、ＩＬ−２の作用を選択的、かつ効果的に抑
制することができれば、臓器移植時の拒絶反応の予防
や、自己免疫疾患の治療が可能となるものと考えられる
ようになった。
バランスがくずれ、生体自身を攻撃することにより発症
すると考えられており、その中でも特にＩＬ−２を中心
とする免疫系因子の過剰産生、あるいはそれらの因子に
対する過剰反応がその一因となっていると考えられてい
る。従って、ＩＬ−２の作用を選択的、かつ効果的に抑
制することができれば、臓器移植時の拒絶反応の予防
や、自己免疫疾患の治療が可能となるものと考えられる
ようになった。
【０００６】実際、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの
結合を阻害する活性を有する抗ＩＬ−２レセプターα鎖
抗体を、マウスにおける心移植や（J. Exp. Med.、１６
２巻、３５８頁、１９８５年）、サルにおける腎臓移植
の際に投与すると拒絶反応が抑制されること（Transpla
ntation、４７巻、５５頁、１９８９年）が報告され、
更にその後、ヒトの腎臓移植患者での臨床試験において
抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体の有効性が確認された
（N. Engl. J. Med.、３２２巻、１１７５頁、１９９０
年；Transplantation、５１巻、１０７頁、１９９１
年）。
結合を阻害する活性を有する抗ＩＬ−２レセプターα鎖
抗体を、マウスにおける心移植や（J. Exp. Med.、１６
２巻、３５８頁、１９８５年）、サルにおける腎臓移植
の際に投与すると拒絶反応が抑制されること（Transpla
ntation、４７巻、５５頁、１９８９年）が報告され、
更にその後、ヒトの腎臓移植患者での臨床試験において
抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体の有効性が確認された
（N. Engl. J. Med.、３２２巻、１１７５頁、１９９０
年；Transplantation、５１巻、１０７頁、１９９１
年）。
【０００７】しかし、この臨床試験においては、投与し
た抗体がマウス由来の蛋白であるため、投与した抗体に
対する免疫反応が生じ、抗体に対する抗体の産生が確認
された。従って、抗体投与を繰り返し行うと更に強い免
疫反応が惹起され、アレルギーが発症する可能性が高
い。また、投与した抗体と抗体に対する抗体とが複合体
を形成することにより分解を受けやすくなり、抗体の効
果が激減する可能性も高く、副作用、及び効果の両面か
ら、抗体の頻回投与は難しいと考えられている。しか
し、少なくともＩＬ−２の作用を選択的に抑制すること
で、効果的な免疫抑制を行うことができることが強く示
唆されていることから、副作用が少なく、かつ効果的に
ＩＬ−２の作用を抑制できる薬剤は、有効な免疫抑制剤
となるものと考えられ、開発が望まれている。
た抗体がマウス由来の蛋白であるため、投与した抗体に
対する免疫反応が生じ、抗体に対する抗体の産生が確認
された。従って、抗体投与を繰り返し行うと更に強い免
疫反応が惹起され、アレルギーが発症する可能性が高
い。また、投与した抗体と抗体に対する抗体とが複合体
を形成することにより分解を受けやすくなり、抗体の効
果が激減する可能性も高く、副作用、及び効果の両面か
ら、抗体の頻回投与は難しいと考えられている。しか
し、少なくともＩＬ−２の作用を選択的に抑制すること
で、効果的な免疫抑制を行うことができることが強く示
唆されていることから、副作用が少なく、かつ効果的に
ＩＬ−２の作用を抑制できる薬剤は、有効な免疫抑制剤
となるものと考えられ、開発が望まれている。
【０００８】さて、ＩＬ−２は、細胞表面上に発現する
ＩＬ−２レセプターに結合して機能が発現する。ＩＬ−
２レセプターは、α鎖、β鎖、γ鎖の３つの分子より構
成されることが知られており。各鎖の遺伝子を導入した
トランスフェクタントを用いた実験により、α鎖とβ鎖
とγ鎖をすべて発現する細胞にはＩＬ−２がｋｄ＝１０
-11Ｍで、α鎖とβ鎖を発現する細胞にはｋｄ＝１０-10
Ｍで、β鎖とγ鎖を発現する細胞にはＫｄ＝１０-9Ｍ
で、α鎖のみ、あるいはα鎖とγ鎖を発現する細胞には
ｋｄ＝１０-8Ｍでそれぞれ結合し、β鎖のみ、あるいは
γ鎖のみ発現する細胞にはＩＬ−２は殆ど結合しないこ
とが明らかとなった（Cell、73巻、５頁、１９９３
年）。
ＩＬ−２レセプターに結合して機能が発現する。ＩＬ−
２レセプターは、α鎖、β鎖、γ鎖の３つの分子より構
成されることが知られており。各鎖の遺伝子を導入した
トランスフェクタントを用いた実験により、α鎖とβ鎖
とγ鎖をすべて発現する細胞にはＩＬ−２がｋｄ＝１０
-11Ｍで、α鎖とβ鎖を発現する細胞にはｋｄ＝１０-10
Ｍで、β鎖とγ鎖を発現する細胞にはＫｄ＝１０-9Ｍ
で、α鎖のみ、あるいはα鎖とγ鎖を発現する細胞には
ｋｄ＝１０-8Ｍでそれぞれ結合し、β鎖のみ、あるいは
γ鎖のみ発現する細胞にはＩＬ−２は殆ど結合しないこ
とが明らかとなった（Cell、73巻、５頁、１９９３
年）。
【０００９】ＩＬ−２レセプターα鎖分子は、細胞膜貫
通領域と細胞内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液
中に存在することが知られ、ヒト成人Ｔ細胞白血病（Ａ
ＴＬ）患者等で高値となることが知られている（Jpn.
J. Cancer Res.、７９巻、５９３頁、１９８８年）。こ
の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、ＩＬ−２
に結合する活性を有し、ＩＬ−２の活性を阻害する活性
を有していることがリコンビナント体を用いた実験で明
らかとなった（Immunol. Let.、１９巻、２９９頁、１
９８８年）。可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
は、元来ヒトの生体内に存在する分子であることから、
ヒトに投与した場合抗体が産生される可能性は少なく、
安全な薬剤と考えられ、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖分子が免疫抑制剤として応用できる可能性が示唆さ
れたが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子のＩＬ
−２活性阻害能は極めて弱いことから、実際にヒトに応
用することは困難であり、現在まで臨床応用されていな
い。
通領域と細胞内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液
中に存在することが知られ、ヒト成人Ｔ細胞白血病（Ａ
ＴＬ）患者等で高値となることが知られている（Jpn.
J. Cancer Res.、７９巻、５９３頁、１９８８年）。こ
の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、ＩＬ−２
に結合する活性を有し、ＩＬ−２の活性を阻害する活性
を有していることがリコンビナント体を用いた実験で明
らかとなった（Immunol. Let.、１９巻、２９９頁、１
９８８年）。可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
は、元来ヒトの生体内に存在する分子であることから、
ヒトに投与した場合抗体が産生される可能性は少なく、
安全な薬剤と考えられ、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖分子が免疫抑制剤として応用できる可能性が示唆さ
れたが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子のＩＬ
−２活性阻害能は極めて弱いことから、実際にヒトに応
用することは困難であり、現在まで臨床応用されていな
い。
【００１０】一方、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び
ＩＬ−２レセプターγ鎖分子も、細胞膜貫通領域と細胞
内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液中に存在する
ことが知られ、特定の疾患で高い値となることが明らか
となっているが（特開平６−２０１６９３、特願平６−
３０１８３７）、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分
子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、リ
コンビナント体を用いた実験により、それぞれＩＬ−２
に結合する活性は殆ど有しておらず、ＩＬ−２活性の阻
害能も有していないことが明らかとなり、免疫抑制剤と
して応用することはできないと考えられていた。従っ
て、ヒトに投与した場合、免疫反応を惹起しない、副作
用が少なく安全で、かつ効果的にＩＬ−２の作用を抑制
できる薬剤は現在まで知られていない。
ＩＬ−２レセプターγ鎖分子も、細胞膜貫通領域と細胞
内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液中に存在する
ことが知られ、特定の疾患で高い値となることが明らか
となっているが（特開平６−２０１６９３、特願平６−
３０１８３７）、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分
子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、リ
コンビナント体を用いた実験により、それぞれＩＬ−２
に結合する活性は殆ど有しておらず、ＩＬ−２活性の阻
害能も有していないことが明らかとなり、免疫抑制剤と
して応用することはできないと考えられていた。従っ
て、ヒトに投与した場合、免疫反応を惹起しない、副作
用が少なく安全で、かつ効果的にＩＬ−２の作用を抑制
できる薬剤は現在まで知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＩＬ
−２の作用を効果的に抑制する活性を有し、臓器移植時
の拒絶反応の防止や自己免疫疾患の治療に対して有効で
あり、かつ副作用がなく頻回投与が可能な免疫抑制剤を
提供することである。
−２の作用を効果的に抑制する活性を有し、臓器移植時
の拒絶反応の防止や自己免疫疾患の治療に対して有効で
あり、かつ副作用がなく頻回投与が可能な免疫抑制剤を
提供することである。
【００１２】
【課題を解決する為の手段】本願発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプ
ターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
がヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成することを世界で
初めて見いだした。そして可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及
び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を混合する
と、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子単独のＩＬ
−２活性阻害能に比較して、約５０倍の阻害能を有する
ことを見いだし、本願発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶
性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免
疫抑制剤である。本発明に従えば、ＩＬ−２の作用を効
果的に阻害し、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫
疾患の治療に対して有効で、かつ副作用がなく頻回投与
が可能な免疫抑制剤が提供される。
を解決するために鋭意研究を行った結果、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプ
ターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
がヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成することを世界で
初めて見いだした。そして可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及
び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を混合する
と、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子単独のＩＬ
−２活性阻害能に比較して、約５０倍の阻害能を有する
ことを見いだし、本願発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶
性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免
疫抑制剤である。本発明に従えば、ＩＬ−２の作用を効
果的に阻害し、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫
疾患の治療に対して有効で、かつ副作用がなく頻回投与
が可能な免疫抑制剤が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
【００１４】本発明に使用される可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、
それぞれの分子をコードするｃＤＮＡを適当なベクター
プラスミドに挿入し、適当な宿主に導入して形質転換さ
せたとき、この形質転換株によって生産され培地中に分
泌されるような性質を有するものをいう。具体的には、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の場合には、Ｎ
末端アミノ酸（Ｇｌｕ）から数えて少なくとも２２０番
目（Ｖａｌ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜
外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子
の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ａｌａ）から数えて少な
くとも２１３番目（Ａｓｐ）以降のポリペプチド部分が
欠失した細胞膜外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ｌｅｕ）
から数えて少なくとも２２８番目（Ｔｈｒ）以降のポリ
ペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、それぞれ
のレセプター分子の、疎水性の高い細胞膜貫通領域、及
び細胞内領域を除去することにより水溶性を著しく向上
させていることを特徴としている。それぞれの分子のア
ミノ酸配列は配列表の１、２、及び３に記載されてい
る。
セプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、
それぞれの分子をコードするｃＤＮＡを適当なベクター
プラスミドに挿入し、適当な宿主に導入して形質転換さ
せたとき、この形質転換株によって生産され培地中に分
泌されるような性質を有するものをいう。具体的には、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の場合には、Ｎ
末端アミノ酸（Ｇｌｕ）から数えて少なくとも２２０番
目（Ｖａｌ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜
外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子
の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ａｌａ）から数えて少な
くとも２１３番目（Ａｓｐ）以降のポリペプチド部分が
欠失した細胞膜外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ｌｅｕ）
から数えて少なくとも２２８番目（Ｔｈｒ）以降のポリ
ペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、それぞれ
のレセプター分子の、疎水性の高い細胞膜貫通領域、及
び細胞内領域を除去することにより水溶性を著しく向上
させていることを特徴としている。それぞれの分子のア
ミノ酸配列は配列表の１、２、及び３に記載されてい
る。
【００１５】本願発明の免疫抑制剤に含有される可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子は、以下のような方法により製造することが
できる。すなわち、適当なプロモーター配列の下流に、
発現可能となるように、それぞれの蛋白分子をコードす
る遺伝子を配置し、宿主細胞内で増殖できるベクターＤ
ＮＡに組み込み、Ｌ細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細
胞に導入して形質転換、又はエシェリヒア属微生物等に
導入し、その形質転換細胞、又は形質導入したエシェリ
ヒア属微生物を培養することにより製造することができ
る。具体的な製造方法を以下に記す。
ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子は、以下のような方法により製造することが
できる。すなわち、適当なプロモーター配列の下流に、
発現可能となるように、それぞれの蛋白分子をコードす
る遺伝子を配置し、宿主細胞内で増殖できるベクターＤ
ＮＡに組み込み、Ｌ細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細
胞に導入して形質転換、又はエシェリヒア属微生物等に
導入し、その形質転換細胞、又は形質導入したエシェリ
ヒア属微生物を培養することにより製造することができ
る。具体的な製造方法を以下に記す。
【００１６】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
は、特開昭６２−２４６５９８号明細書記載の方法等に
より製造することができる。以下にその方法につき説明
する。プラスミドｐＫＣＲＴａｃ２（Nature、３１１
巻、６３１頁、１９８４年）のＩＬ−２レセプターα鎖
ｃＤＮＡのＡａｔII制限酵素部位に５’端をリン酸化し
た第１図に示す合成ＤＮＡ（ａ）を挿入することによ
り、ＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡのスレオニン（Ｎ
末端より２１１番目）に相当するコドン（ＡＣＧ）のす
ぐ後に終止コドンＴＧＡを配置する。そしてＳＶ４０初
期遺伝子プロモーターの下流に開始コドンＡＴＧ、シグ
ナルペプチドをコードする遺伝子、そして可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを配置することによりｐ
ＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳが構築できる（第１図
参照）。この場合、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
ｃＤＮＡを調製するために、適当なプライマーＤＮＡを
作成し、ＰＣＲ法により調製しても差し支えないし、Ｓ
Ｖ４０初期遺伝子プロモーター以外のプロモーターを用
いても構わない。また、発現可能である限り、如何なる
発現ベクターを用いても構わない。
は、特開昭６２−２４６５９８号明細書記載の方法等に
より製造することができる。以下にその方法につき説明
する。プラスミドｐＫＣＲＴａｃ２（Nature、３１１
巻、６３１頁、１９８４年）のＩＬ−２レセプターα鎖
ｃＤＮＡのＡａｔII制限酵素部位に５’端をリン酸化し
た第１図に示す合成ＤＮＡ（ａ）を挿入することによ
り、ＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡのスレオニン（Ｎ
末端より２１１番目）に相当するコドン（ＡＣＧ）のす
ぐ後に終止コドンＴＧＡを配置する。そしてＳＶ４０初
期遺伝子プロモーターの下流に開始コドンＡＴＧ、シグ
ナルペプチドをコードする遺伝子、そして可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを配置することによりｐ
ＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳが構築できる（第１図
参照）。この場合、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
ｃＤＮＡを調製するために、適当なプライマーＤＮＡを
作成し、ＰＣＲ法により調製しても差し支えないし、Ｓ
Ｖ４０初期遺伝子プロモーター以外のプロモーターを用
いても構わない。また、発現可能である限り、如何なる
発現ベクターを用いても構わない。
【００１７】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子
を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換す
るには、以下に示す通常よく用いられる形質転換法があ
る。宿主細胞がＬ細胞の場合、ＤＮＡをリン酸カルシウ
ム沈澱として感染させる方法、マイクロインジェクショ
ン法、赤血球細胞若しくははリボソームにプラスミドを
包括して挿入する方法、リボフォスファチジルコリンの
ような試薬による細胞の処理法、又はウィルスベクター
を用いる方法などがある。形質転換する宿主細胞として
は、Ｌ細胞以外にも、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウス
Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞や、ハムスターＣＨＯ細胞などを用
いることができる。
を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換す
るには、以下に示す通常よく用いられる形質転換法があ
る。宿主細胞がＬ細胞の場合、ＤＮＡをリン酸カルシウ
ム沈澱として感染させる方法、マイクロインジェクショ
ン法、赤血球細胞若しくははリボソームにプラスミドを
包括して挿入する方法、リボフォスファチジルコリンの
ような試薬による細胞の処理法、又はウィルスベクター
を用いる方法などがある。形質転換する宿主細胞として
は、Ｌ細胞以外にも、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウス
Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞や、ハムスターＣＨＯ細胞などを用
いることができる。
【００１８】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子
を組み込んで形質転換したマウス細胞より可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖蛋白を製造する方法は一般的に行
われている付着細胞の培養方法に従えばよい。即ち、３
７℃、５％炭酸ガス通気中、組織培養フラスコを使用し
培養することができる。培地は通常組織培養で用いられ
ている合成培地でよい。例えば、ダルベッコ改良イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地などがあ
る。これらの培地を実際使用する場合は、１０％ウシ胎
児血清アルブミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍｇ／ｍｌの
ＮａＨＣＯ3を添加することが望ましい。
を組み込んで形質転換したマウス細胞より可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖蛋白を製造する方法は一般的に行
われている付着細胞の培養方法に従えばよい。即ち、３
７℃、５％炭酸ガス通気中、組織培養フラスコを使用し
培養することができる。培地は通常組織培養で用いられ
ている合成培地でよい。例えば、ダルベッコ改良イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地などがあ
る。これらの培地を実際使用する場合は、１０％ウシ胎
児血清アルブミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍｇ／ｍｌの
ＮａＨＣＯ3を添加することが望ましい。
【００１９】当該マウスＬ細胞を用い培養することによ
って生産される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白
量は経時的に変化する。効率よく可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプター蛋白を生産するには以下の方法に従って行えば
良い。即ち、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（１０
０単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシン、２ｍｇ／ｍｌＮａＨＣＯ3含有）を用い、細
胞密度１Ｘ１０5／ｍｌで培養を開始し、４〜５日後に
細胞がコンフルエントになったら培養上清を回収し、さ
らに新鮮培地を添加し、３〜４日培養を続行する。培養
終了後、培地を回収して可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖蛋白の生産量を定量すると、前半及び後半の培養で
ほぼ同量の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白が生
産されている。
って生産される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白
量は経時的に変化する。効率よく可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプター蛋白を生産するには以下の方法に従って行えば
良い。即ち、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（１０
０単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシン、２ｍｇ／ｍｌＮａＨＣＯ3含有）を用い、細
胞密度１Ｘ１０5／ｍｌで培養を開始し、４〜５日後に
細胞がコンフルエントになったら培養上清を回収し、さ
らに新鮮培地を添加し、３〜４日培養を続行する。培養
終了後、培地を回収して可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖蛋白の生産量を定量すると、前半及び後半の培養で
ほぼ同量の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白が生
産されている。
【００２０】この様にして得られた当該マウスＬ細胞の
培養上清より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
は、ヒトＩＬ−２を固定化したカラム、例えばヒトＩＬ
−２セファローズ４Ｂ、又は抗ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レ
セプターα鎖抗体であるＭ−Ａ２５１（ファーミンジェ
ン社製）セファローズ４Ｂを用いたアフィニテイクロマ
トグラフィーで精製することができる。更に高純度に分
離精製するには、ＯＤＳカラム（Octa decyl silane)を
用いた逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を
用いて行えばよい。このようにして得られた細胞膜、及
び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白
分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖は、
分子量が約４２Ｋｄの蛋白である。
培養上清より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
は、ヒトＩＬ−２を固定化したカラム、例えばヒトＩＬ
−２セファローズ４Ｂ、又は抗ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レ
セプターα鎖抗体であるＭ−Ａ２５１（ファーミンジェ
ン社製）セファローズ４Ｂを用いたアフィニテイクロマ
トグラフィーで精製することができる。更に高純度に分
離精製するには、ＯＤＳカラム（Octa decyl silane)を
用いた逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を
用いて行えばよい。このようにして得られた細胞膜、及
び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白
分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖は、
分子量が約４２Ｋｄの蛋白である。
【００２１】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子
は、特開平３−６７５８８明細書記載の方法等に準じて
製造することができる。以下にその方法につき説明す
る。ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬ−２Ｒβ３
０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１頁、１９８９
年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、β鎖の全コー
ド配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得る。ＢｓｓＨ
II末端をブラント化した後、１．９ＫｂｃＤＮＡをｐブ
ルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン社製）の
ＳｍａＩ制限部位に挿入する。次に、このｐブルースク
リプトＳＫ−β１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａ
Ｉで消化して、細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除く。
次に終止コドン（ＴＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む
１２塩基長の合成リンカー（ニューイングランドバイオ
ラブ社製、＃１０６０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いてＳｔｙＩ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤ
ＮＡにライゲーションする。ＮｈｅＩで消化して過剰の
リンカーを除いた後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂
プラスミドＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲ
ーションし、ｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．βが構
築できる。
は、特開平３−６７５８８明細書記載の方法等に準じて
製造することができる。以下にその方法につき説明す
る。ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬ−２Ｒβ３
０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１頁、１９８９
年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、β鎖の全コー
ド配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得る。ＢｓｓＨ
II末端をブラント化した後、１．９ＫｂｃＤＮＡをｐブ
ルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン社製）の
ＳｍａＩ制限部位に挿入する。次に、このｐブルースク
リプトＳＫ−β１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａ
Ｉで消化して、細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除く。
次に終止コドン（ＴＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む
１２塩基長の合成リンカー（ニューイングランドバイオ
ラブ社製、＃１０６０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いてＳｔｙＩ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤ
ＮＡにライゲーションする。ＮｈｅＩで消化して過剰の
リンカーを除いた後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂
プラスミドＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲ
ーションし、ｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．βが構
築できる。
【００２２】このｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．β
をＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤ
ＮＡ断片を単離する。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性
遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／Ｎ
ｏｔＩ消化物に導入し発現ラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓ
ｏＩ．βが構築できる（第２図参照）。
をＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤ
ＮＡ断片を単離する。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性
遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／Ｎ
ｏｔＩ消化物に導入し発現ラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓ
ｏＩ．βが構築できる（第２図参照）。
【００２３】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子
を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換す
るには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝
子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換
する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞が
エシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合
と同様の方法により作製することができる。
を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換す
るには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝
子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換
する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞が
エシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合
と同様の方法により作製することができる。
【００２４】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子
を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を製造する方法
は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養
方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターβ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖抗
体を固定化したカラム、例えば抗ＩＬ−２レセプターβ
鎖抗体であるＴＵ２７（ベクトンディッキンソン社製）
セファローズ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーで精製することができる。更に高純度に分離精製
するには、逆相ＨＰＬＣを用いて行えばよい。このよう
にして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターβ鎖分子は、分子量が約３７ｋｄの蛋白で
ある。
を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を製造する方法
は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養
方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターβ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖抗
体を固定化したカラム、例えば抗ＩＬ−２レセプターβ
鎖抗体であるＴＵ２７（ベクトンディッキンソン社製）
セファローズ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーで精製することができる。更に高純度に分離精製
するには、逆相ＨＰＬＣを用いて行えばよい。このよう
にして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターβ鎖分子は、分子量が約３７ｋｄの蛋白で
ある。
【００２５】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
は、特開平４−１０４９４７明細書記載の方法等に準じ
て製造することができる。以下にその方法につき説明す
る。ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを含むプラス
ミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型とし
て、プライマーとして、ＸｈｏＩ制限酵素サイトを含む
５’側センスプライマー（5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGA
AGCCAT-3', 29mer）とＨｉｎｄIII制限酵素サイトと、
ｓｔｏｐコドンを含む３’側アンチセンスプライマー
（5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3',29mer）を用
いてＰＣＲを行うことにより、可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。得
られた遺伝子をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断後、同じ
くＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔII（ストラタジーン社製）に組み込み、ＸｈｏＩ
とＮｏｔＩで切断する。その後、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで
切断したＢＣＭＧｎｅｏベクターに組み込む（J. Exp.M
ed.、１６９巻、１３頁、１９８９年）。このようにし
て可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を有する発
現ベクターが構築できる（第３図参照）。
は、特開平４−１０４９４７明細書記載の方法等に準じ
て製造することができる。以下にその方法につき説明す
る。ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを含むプラス
ミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型とし
て、プライマーとして、ＸｈｏＩ制限酵素サイトを含む
５’側センスプライマー（5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGA
AGCCAT-3', 29mer）とＨｉｎｄIII制限酵素サイトと、
ｓｔｏｐコドンを含む３’側アンチセンスプライマー
（5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3',29mer）を用
いてＰＣＲを行うことにより、可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。得
られた遺伝子をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断後、同じ
くＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔII（ストラタジーン社製）に組み込み、ＸｈｏＩ
とＮｏｔＩで切断する。その後、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで
切断したＢＣＭＧｎｅｏベクターに組み込む（J. Exp.M
ed.、１６９巻、１３頁、１９８９年）。このようにし
て可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を有する発
現ベクターが構築できる（第３図参照）。
【００２６】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子
を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換す
るには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝
子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換
する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞が
エシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合
と同様の方法により作製することができる。
を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換す
るには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝
子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換
する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞が
エシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合
と同様の方法により作製することができる。
【００２７】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子
を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を製造する方法
は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養
方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗
体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖抗体であるＴＵＧｈ４（Int. Immunol.、６巻、
１２７３頁、１９９４年）セファローズ４Ｂを用いたア
フィニティークロマトグラフィーで精製することができ
る。更に高純度に分離精製するには、逆相ＨＰＬＣを用
いて行えばよい。このようにして得られた細胞膜、及び
細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、
すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、分
子量が約４５ｋｄの蛋白である。
を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を製造する方法
は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養
方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗
体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖抗体であるＴＵＧｈ４（Int. Immunol.、６巻、
１２７３頁、１９９４年）セファローズ４Ｂを用いたア
フィニティークロマトグラフィーで精製することができ
る。更に高純度に分離精製するには、逆相ＨＰＬＣを用
いて行えばよい。このようにして得られた細胞膜、及び
細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、
すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、分
子量が約４５ｋｄの蛋白である。
【００２８】次に、以上のようにして製造した可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成しうる
ことを説明する。可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子を125Ｉにより標識し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分
子をヒトＩＬ−２存在下、あるいは非存在下で混合し
た。その後、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対する
抗体であるＴＵＧｈ４を固相化したセファローズ４Ｂと
反応させ、セファローズ４Ｂに結合した放射活性、すな
わち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の量を測
定した。その結果、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、及びヒ
トＩＬ−２がすべて存在したときに限り、セファローズ
４Ｂに結合した放射活性が有意に高値となった。すなわ
ち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−２存在下で初めて
四者の複合体を形成しうることが確認された。
トＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成しうる
ことを説明する。可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子を125Ｉにより標識し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分
子をヒトＩＬ−２存在下、あるいは非存在下で混合し
た。その後、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対する
抗体であるＴＵＧｈ４を固相化したセファローズ４Ｂと
反応させ、セファローズ４Ｂに結合した放射活性、すな
わち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の量を測
定した。その結果、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、及びヒ
トＩＬ−２がすべて存在したときに限り、セファローズ
４Ｂに結合した放射活性が有意に高値となった。すなわ
ち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−２存在下で初めて
四者の複合体を形成しうることが確認された。
【００２９】次に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする
薬剤が、ＩＬ−２依存性の反応を特異的に抑制すること
を説明する。
分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする
薬剤が、ＩＬ−２依存性の反応を特異的に抑制すること
を説明する。
【００３０】本発明者らは、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２のＩＬ−２依存性増殖、及びＰＨＡ（フィトヘマグル
チニン）刺激ヒト末梢血リンパ球のＩＬ−２依存性増殖
の、本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶
性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬
剤による抑制効果について検討した。何れの系において
も、本願発明の薬剤を共存させることにより著しくＩＬ
−２依存性の増殖が阻害された。本実験系においては、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子の何れか一つでも欠けると、阻害効果
が激減することから、三種の物質が全て必要不可欠であ
ることが確認された。これまで、可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子はそ
れぞれ単独では殆どＩＬ−２依存性反応の阻害能を有さ
ないことが知られていたが、本願発明者らは、それらの
分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成すること、
更に、それらの分子を有効成分とする薬剤がヒトＩＬ−
２の作用を抑制することを初めて明らかとし、本願発明
を完成することができた。
２のＩＬ−２依存性増殖、及びＰＨＡ（フィトヘマグル
チニン）刺激ヒト末梢血リンパ球のＩＬ−２依存性増殖
の、本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分
子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶
性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬
剤による抑制効果について検討した。何れの系において
も、本願発明の薬剤を共存させることにより著しくＩＬ
−２依存性の増殖が阻害された。本実験系においては、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子の何れか一つでも欠けると、阻害効果
が激減することから、三種の物質が全て必要不可欠であ
ることが確認された。これまで、可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子はそ
れぞれ単独では殆どＩＬ−２依存性反応の阻害能を有さ
ないことが知られていたが、本願発明者らは、それらの
分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成すること、
更に、それらの分子を有効成分とする薬剤がヒトＩＬ−
２の作用を抑制することを初めて明らかとし、本願発明
を完成することができた。
【００３１】本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
α鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及
び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分と
する薬剤は、ＩＬ−２の過剰産生、又はＩＬ−２に対し
過剰反応を起こすことが原因となっている疾患、例えば
臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に対し
て有効であり、かつ副作用がなく、頻回投与が可能な免
疫抑制剤として有用である。
α鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及
び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分と
する薬剤は、ＩＬ−２の過剰産生、又はＩＬ−２に対し
過剰反応を起こすことが原因となっている疾患、例えば
臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に対し
て有効であり、かつ副作用がなく、頻回投与が可能な免
疫抑制剤として有用である。
【００３２】本発明の免疫抑制剤は、配列番号１、２、
３記載のアミノ酸配列を有する物質に限定されるもので
はなく、ＩＬ−２存在下で複合体を形成する活性を有す
る物質である限り本発明に含まれる。例えば、配列番号
１、２、３記載のアミノ酸配列の一部を変換、削除、又
は他のアミノ酸を付加した物質等はすべて本発明に含ま
れる。また、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列を
有する物質をポリエチレングリコール等で修飾された物
質も本発明に含まれる。
３記載のアミノ酸配列を有する物質に限定されるもので
はなく、ＩＬ−２存在下で複合体を形成する活性を有す
る物質である限り本発明に含まれる。例えば、配列番号
１、２、３記載のアミノ酸配列の一部を変換、削除、又
は他のアミノ酸を付加した物質等はすべて本発明に含ま
れる。また、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列を
有する物質をポリエチレングリコール等で修飾された物
質も本発明に含まれる。
【００３３】本発明の免疫抑制剤は、可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
β鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
をそれぞれ０．１重量％〜９９．９重量％含有すればよ
い。従って、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子をそれぞれそのまま投与
してもよいし、通常製剤用担体と混合して調製した製剤
の形でも投与できる。製剤用担体としては、製剤分野に
おいて常用され、かつ本発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分
子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合
しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明の
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子を水に溶解させて調製されるが、必要
に応じて生理食塩水、ブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また、緩衝剤、保存剤、あるいは安定化剤を含有さ
せてもよい。また、これらの製剤は、治療上価値のある
他の成分を含有してもよい。
２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
β鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
をそれぞれ０．１重量％〜９９．９重量％含有すればよ
い。従って、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子をそれぞれそのまま投与
してもよいし、通常製剤用担体と混合して調製した製剤
の形でも投与できる。製剤用担体としては、製剤分野に
おいて常用され、かつ本発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分
子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合
しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明の
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子を水に溶解させて調製されるが、必要
に応じて生理食塩水、ブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また、緩衝剤、保存剤、あるいは安定化剤を含有さ
せてもよい。また、これらの製剤は、治療上価値のある
他の成分を含有してもよい。
【００３４】本発明に係わる免疫抑制剤の投与方法とし
ては、経口、注射、直腸内など何れの方法を用いても構
わないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投与
方法、患者の症状、年齢等により異なるが、通常、１回
０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．０１〜１
０ｍｇを１日当たり１〜３回投与すればよい。
ては、経口、注射、直腸内など何れの方法を用いても構
わないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投与
方法、患者の症状、年齢等により異なるが、通常、１回
０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．０１〜１
０ｍｇを１日当たり１〜３回投与すればよい。
【００３５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明する。尚、本発明の技術的範囲は実施例に限定され
るものではない。
説明する。尚、本発明の技術的範囲は実施例に限定され
るものではない。
【００３６】（実施例１、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子の調製）まず、ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
ｃＤＮＡをＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターを含むベ
クターｐＫＣＲＨ２に組み込んだプラスミドPＫＣＲ・
Ｔａｃ−２・Ａ（Ｎａｔｕｒｅ，３１１巻、６３１頁１
９８４年）６μｇを制限酵素ＡａｔIIで部分分解し、約
６．５キロベース（ｋｂ）の直鎖状プラスミドの断片を
アガロ−スゲル電気泳動により分離回収した。回収され
た該断片は１μｇであった。該断片を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで分解し、アガロース電気泳動により０．３５μｇの
５．４Ｋｂ断片と０．０７μｇの１．１ｋｂ断片を分離
回収した。5'-GAGATCTCACGT-3'の配列をもつオリゴヌク
レオチドをＤＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシス
テム社製３８０Ａ型）により合成し、逆相ＨＰＬＣにて
精製後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’側を
リン酸化した。５．４ｋｂ断片および１．１ｋｂ断片各
々０．０４ピコモルと上記１２個の配列をもつオリゴヌ
クレオチド０．１６ピコモルを１０μｌの反応液中で１
５℃、１時間、その後１００μｌに希釈し、さらに１５
℃にて１２時間Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼにより結合させた。
ーα鎖分子の調製）まず、ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
ｃＤＮＡをＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターを含むベ
クターｐＫＣＲＨ２に組み込んだプラスミドPＫＣＲ・
Ｔａｃ−２・Ａ（Ｎａｔｕｒｅ，３１１巻、６３１頁１
９８４年）６μｇを制限酵素ＡａｔIIで部分分解し、約
６．５キロベース（ｋｂ）の直鎖状プラスミドの断片を
アガロ−スゲル電気泳動により分離回収した。回収され
た該断片は１μｇであった。該断片を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで分解し、アガロース電気泳動により０．３５μｇの
５．４Ｋｂ断片と０．０７μｇの１．１ｋｂ断片を分離
回収した。5'-GAGATCTCACGT-3'の配列をもつオリゴヌク
レオチドをＤＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシス
テム社製３８０Ａ型）により合成し、逆相ＨＰＬＣにて
精製後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’側を
リン酸化した。５．４ｋｂ断片および１．１ｋｂ断片各
々０．０４ピコモルと上記１２個の配列をもつオリゴヌ
クレオチド０．１６ピコモルを１０μｌの反応液中で１
５℃、１時間、その後１００μｌに希釈し、さらに１５
℃にて１２時間Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼにより結合させた。
【００３７】次に、この反応液１０μｌを用い常法によ
りエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換せしめ、約
２５０個のアンピシリン抵抗性株を得た。この中から任
意に１２個を選び、そのプラスミドＤＮＡを抽出し、
プラスミドの大きさが約６．５ｋｂであること、制限
酵素ＡａｔII 切断部分が一つになっていること、３１
２個のオリゴヌクレオチドに由来する制限酵素ＢｇｌII
切断部位がもとの制限酵素ＡａｔII切断部位に存在する
こと、の３点を満足するプラスミドで形質転換された形
質転換株を５株得た。該形質転換株中のプラスミドの塩
基配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,７４巻，５４６３頁、１９７７年）に
より調べ、ｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳの塩基配
列をもつことを確認した（図１）。
りエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換せしめ、約
２５０個のアンピシリン抵抗性株を得た。この中から任
意に１２個を選び、そのプラスミドＤＮＡを抽出し、
プラスミドの大きさが約６．５ｋｂであること、制限
酵素ＡａｔII 切断部分が一つになっていること、３１
２個のオリゴヌクレオチドに由来する制限酵素ＢｇｌII
切断部位がもとの制限酵素ＡａｔII切断部位に存在する
こと、の３点を満足するプラスミドで形質転換された形
質転換株を５株得た。該形質転換株中のプラスミドの塩
基配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,７４巻，５４６３頁、１９７７年）に
より調べ、ｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳの塩基配
列をもつことを確認した（図１）。
【００３８】更に、この様にして得た形質転換株からｐ
ＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳプラスミドを塩化セシ
ウム平衡遠心法によりマウスＬ細胞（ｔｋ-変異株）に
トランスフェクションした。すなわち１０％牛胎児血清
含有ダルベッコ変法イ−グル培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌ
に懸濁したＬ細胞１Ｘ１０5個をファルコン３００３シ
ャ−レに入れ、３７℃、５％炭酸ガスインキュベ−タ−
内にて２０時間培養した。その後、同培地１０ｍｌにて
培地交換し、同条件で４時間培養した。
ＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳプラスミドを塩化セシ
ウム平衡遠心法によりマウスＬ細胞（ｔｋ-変異株）に
トランスフェクションした。すなわち１０％牛胎児血清
含有ダルベッコ変法イ−グル培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌ
に懸濁したＬ細胞１Ｘ１０5個をファルコン３００３シ
ャ−レに入れ、３７℃、５％炭酸ガスインキュベ−タ−
内にて２０時間培養した。その後、同培地１０ｍｌにて
培地交換し、同条件で４時間培養した。
【００３９】培養後、Ａ液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２８
０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．２）０．５ｍｌと、Ｂ液（２ＭＣａＣｌ2、１
０μｇｐＫＣＲＩＲ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳ、１μｇｐＢ
Ｒ３２２、ｈｅｒｐｅｓＴｋ）０．５ｍｌを添加し、３
７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて１２時間培
養した。ＴＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＫＣ
ｌ、５．６ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、２５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液ｐＨ７．５）で洗浄し、２．５％グリセロ−ル含有
ＴＢＳ溶液にて３分間処理した。処理後直ちにＴＢＳで
洗浄し、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ１０ｍｌを加
え、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日
間培養した。その後、ＨＡＴ培地（１３．６ｍｇ／ｌヒ
ポキサチン、３．８８ｍｇ／ｌチミジン、０．１７６ｍ
ｇ／ｌアミノプテリンおよび１０％牛胎児血清含有ＤＭ
ＥＭ）１０ｍｌに培地交換し、３７℃で５％炭酸ガスイ
ンキュベーター内にて２日間培養した。この培地交換を
以後２日毎に行った。
０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．２）０．５ｍｌと、Ｂ液（２ＭＣａＣｌ2、１
０μｇｐＫＣＲＩＲ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳ、１μｇｐＢ
Ｒ３２２、ｈｅｒｐｅｓＴｋ）０．５ｍｌを添加し、３
７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて１２時間培
養した。ＴＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＫＣ
ｌ、５．６ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、２５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液ｐＨ７．５）で洗浄し、２．５％グリセロ−ル含有
ＴＢＳ溶液にて３分間処理した。処理後直ちにＴＢＳで
洗浄し、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ１０ｍｌを加
え、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日
間培養した。その後、ＨＡＴ培地（１３．６ｍｇ／ｌヒ
ポキサチン、３．８８ｍｇ／ｌチミジン、０．１７６ｍ
ｇ／ｌアミノプテリンおよび１０％牛胎児血清含有ＤＭ
ＥＭ）１０ｍｌに培地交換し、３７℃で５％炭酸ガスイ
ンキュベーター内にて２日間培養した。この培地交換を
以後２日毎に行った。
【００４０】１４日目にはシャーレ当り１２個のコロニ
ーが出現した。この様にして出現した各コロニーを９６
穴マイクロプレートに移し、３７℃で５％炭酸ガスイン
キュベーター内にて培養し、コンフルエントになったら
さらに２日間培養した。各コロニーの培養上清中の可溶
性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を以下に述べる方法
により同定した。その結果ＢＴＭＬＥＳＳ−Ｑを得た。
ーが出現した。この様にして出現した各コロニーを９６
穴マイクロプレートに移し、３７℃で５％炭酸ガスイン
キュベーター内にて培養し、コンフルエントになったら
さらに２日間培養した。各コロニーの培養上清中の可溶
性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を以下に述べる方法
により同定した。その結果ＢＴＭＬＥＳＳ−Ｑを得た。
【００４１】多数のヒトＩＬ−２レセプターα鎖を膜表
面に表現しているＡＴＬ由来細胞株ＭＴ−１細胞はモノ
クローナル抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体（抗Ｔａ
ｃ抗体）と補体で処理すると殺すことができる。そこで
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子含有標本と抗体
とを反応させ、この後ＭＴ−１細胞を加えさらに補体で
処理する。もしこの標本中に可溶性ヒトＩＬ−２レセプ
ターα鎖分子が存在すれば抗体と結合し、ＭＴ−１細胞
と反応する抗体が減少し、その結果ＭＴ−１細胞は補体
で処しても死ななくなる。この原理によりごく微量（約
０．１ｎｇ）の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
を同定することができる。具体的な可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターα鎖分子の同定方法は、まず９６穴Ｕ底マイ
クロプレ−ト中で標品１０μｌまたはこれを１０％牛胎
児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したもの１０μ
ｌと、同培地に溶解した１．６ｎｇ抗Ｔａｃ抗体溶液１
０μｌをよく混合し、０℃で３０分間放置する。そして
上記培地に懸濁した５Ｘ１０5個／ｍｌのＭＴ−１細胞
２０μｌを加え、混合後０℃で３０分間放置する。８０
０ｒｐｍ５分間遠心し、上清を捨て補体（ウサギ新生児
血清を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１
５倍希釈したもの）２０μｌを加え、混合後３７℃で３
０分間放置する。そして０．５％トリパンブル−含有Ｐ
ＢＳ溶液２０μｌを加え、２００細胞中の死細胞数を計
測する方法である。
面に表現しているＡＴＬ由来細胞株ＭＴ−１細胞はモノ
クローナル抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体（抗Ｔａ
ｃ抗体）と補体で処理すると殺すことができる。そこで
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子含有標本と抗体
とを反応させ、この後ＭＴ−１細胞を加えさらに補体で
処理する。もしこの標本中に可溶性ヒトＩＬ−２レセプ
ターα鎖分子が存在すれば抗体と結合し、ＭＴ−１細胞
と反応する抗体が減少し、その結果ＭＴ−１細胞は補体
で処しても死ななくなる。この原理によりごく微量（約
０．１ｎｇ）の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
を同定することができる。具体的な可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターα鎖分子の同定方法は、まず９６穴Ｕ底マイ
クロプレ−ト中で標品１０μｌまたはこれを１０％牛胎
児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したもの１０μ
ｌと、同培地に溶解した１．６ｎｇ抗Ｔａｃ抗体溶液１
０μｌをよく混合し、０℃で３０分間放置する。そして
上記培地に懸濁した５Ｘ１０5個／ｍｌのＭＴ−１細胞
２０μｌを加え、混合後０℃で３０分間放置する。８０
０ｒｐｍ５分間遠心し、上清を捨て補体（ウサギ新生児
血清を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１
５倍希釈したもの）２０μｌを加え、混合後３７℃で３
０分間放置する。そして０．５％トリパンブル−含有Ｐ
ＢＳ溶液２０μｌを加え、２００細胞中の死細胞数を計
測する方法である。
【００４２】この様にして産生した可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターα鎖分子は−２０℃にて凍結保存することが
でき、また限外濾過（例えばセントリコン１０）により
濃縮してもその性状は変わらない。さらにヒトＩＬ−２
カラムに結合させることができる。即ち、セントリコン
１０にて１０倍濃縮した標品１００μｌをヒトＩＬ−２
セファローズ４Ｂ（リコンビナントヒトＩＬ−２を２０
０μｇ含有）カラムに吸着せしめ、０．１Ｍクエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出すると可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターα鎖分子が溶出されてくるため、こ
の溶出画分を直ちに１Ｍトリスベースにて中和する。か
くして得られた可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
はＭＴ−１細胞の抗Ｔａｃ抗体と補体による殺作用効果
を阻害した。また、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
分子の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討したとこ
ろ、分子量約４２Ｋｄであった。
レセプターα鎖分子は−２０℃にて凍結保存することが
でき、また限外濾過（例えばセントリコン１０）により
濃縮してもその性状は変わらない。さらにヒトＩＬ−２
カラムに結合させることができる。即ち、セントリコン
１０にて１０倍濃縮した標品１００μｌをヒトＩＬ−２
セファローズ４Ｂ（リコンビナントヒトＩＬ−２を２０
０μｇ含有）カラムに吸着せしめ、０．１Ｍクエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出すると可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターα鎖分子が溶出されてくるため、こ
の溶出画分を直ちに１Ｍトリスベースにて中和する。か
くして得られた可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
はＭＴ−１細胞の抗Ｔａｃ抗体と補体による殺作用効果
を阻害した。また、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖
分子の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討したとこ
ろ、分子量約４２Ｋｄであった。
【００４３】（実施例２、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖分子の調製）ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒ
トＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＩＬ−２Ｒβ３０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１
頁、１９８９年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、
β鎖の全コード配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得
た。ＢｓｓＨII末端をブラント化した後、１．９Ｋｂｃ
ＤＮＡをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジ
ーン社製）のＳｍａＩ制限部位に挿入した。
ーβ鎖分子の調製）ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒ
トＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＩＬ−２Ｒβ３０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１
頁、１９８９年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、
β鎖の全コード配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得
た。ＢｓｓＨII末端をブラント化した後、１．９Ｋｂｃ
ＤＮＡをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジ
ーン社製）のＳｍａＩ制限部位に挿入した。
【００４４】次に、このｐブルースクリプトＳＫ−β
１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａＩで消化して、
細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除き、終止コドン（Ｔ
ＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む１２塩基長の合成リ
ンカー（ニューイングランドバイオラブ社製、＃１０６
０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＳｔｙ
Ｉ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤＮＡにライゲーショ
ンした。ＮｈｅＩで消化して過剰のリンカーを除いた
後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂プラスミドＤＮＡ
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｐブ
ルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．βを構築した。
１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａＩで消化して、
細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除き、終止コドン（Ｔ
ＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む１２塩基長の合成リ
ンカー（ニューイングランドバイオラブ社製、＃１０６
０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＳｔｙ
Ｉ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤＮＡにライゲーショ
ンした。ＮｈｅＩで消化して過剰のリンカーを除いた
後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂プラスミドＤＮＡ
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｐブ
ルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．βを構築した。
【００４５】このｐブルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．β
をＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤ
ＮＡ断片を単離した。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性
遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／Ｎ
ｏｔＩ切断物に導入し、発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ
−Ｓｏｌ．βを構築した（図２）。
をＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤ
ＮＡ断片を単離した。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性
遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／Ｎ
ｏｔＩ切断物に導入し、発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ
−Ｓｏｌ．βを構築した（図２）。
【００４６】プラスミドのトランスフェクションは、プ
ロトプラスト法により行った。すなわち、ＢＣＭＧＮｅ
ｏ−Ｓｏｌ．βを含む菌をプロトプラストに変換して、
マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３と、ポリエチレングリ
コール＃２０００（和光純薬社製）を用いて融合した。
次に、１Ｘ１０5個のプロトプラスト融合ＮＩＨ３Ｔ３
細胞を２４ウェルプレートに接種した。１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）および７５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（シ
グマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で２５日間培
養した。そして、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ト
ランスフェクトした細胞の培養上清中の可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターβ鎖分子の濃度を測定した。サンドイッ
チＥＬＩＳＡには、モノクロナール抗ヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖抗体である、ＴＵ１１、及びＴＵ２７（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４２巻、６１頁、
１９９１年）を用いて以下の方法により行った。尚、Ｔ
Ｕ１１は通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研
究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐー１３
２３３である。又、ＴＵ２７は通商産業省・工業技術院
・生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号
はＦＥＲＭ ＢＰー２５１０である。
ロトプラスト法により行った。すなわち、ＢＣＭＧＮｅ
ｏ−Ｓｏｌ．βを含む菌をプロトプラストに変換して、
マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３と、ポリエチレングリ
コール＃２０００（和光純薬社製）を用いて融合した。
次に、１Ｘ１０5個のプロトプラスト融合ＮＩＨ３Ｔ３
細胞を２４ウェルプレートに接種した。１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）および７５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（シ
グマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で２５日間培
養した。そして、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ト
ランスフェクトした細胞の培養上清中の可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターβ鎖分子の濃度を測定した。サンドイッ
チＥＬＩＳＡには、モノクロナール抗ヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖抗体である、ＴＵ１１、及びＴＵ２７（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４２巻、６１頁、
１９９１年）を用いて以下の方法により行った。尚、Ｔ
Ｕ１１は通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研
究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐー１３
２３３である。又、ＴＵ２７は通商産業省・工業技術院
・生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号
はＦＥＲＭ ＢＰー２５１０である。
【００４７】９６ウェル平底プレート（タイターテック
社製）に、１０μｇ／ｍｌの濃度に５０ｍＭ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）により調製したＴＵ１１抗体溶液を一ウ
ェル当たり５０μｌ加え４℃一晩コーテイングした。Ｔ
Ｕ１１抗体を除去後、室温１時間、０．５％ウシ血清ア
ルブミンを含むＰＢＳでインキュベートすることにより
ブロッッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで洗浄後、トランスフェクタントの培養上清５０
μｌをウェルに入れ、室温１時間インキュベートした。
洗浄後、１μｇ／ｍｌのビチオン化ＴＵ２７抗体溶液５
０μｌをウェルに加え、室温１時間インキュベートし
た。洗浄後、５０μｌのアルカリフォスファターゼ結合
アビヂン（ベクター製）を加えた。室温１時間のインキ
ュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのｐー
ニトロフェニルホスフェートを加え１５分間後に各ウェ
ルの４０５nmにおける吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ法
で最も高い吸収度を与えたウェルから、限定希釈法によ
りクローニングし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子を高産生するクローンを得た。
社製）に、１０μｇ／ｍｌの濃度に５０ｍＭ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）により調製したＴＵ１１抗体溶液を一ウ
ェル当たり５０μｌ加え４℃一晩コーテイングした。Ｔ
Ｕ１１抗体を除去後、室温１時間、０．５％ウシ血清ア
ルブミンを含むＰＢＳでインキュベートすることにより
ブロッッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで洗浄後、トランスフェクタントの培養上清５０
μｌをウェルに入れ、室温１時間インキュベートした。
洗浄後、１μｇ／ｍｌのビチオン化ＴＵ２７抗体溶液５
０μｌをウェルに加え、室温１時間インキュベートし
た。洗浄後、５０μｌのアルカリフォスファターゼ結合
アビヂン（ベクター製）を加えた。室温１時間のインキ
ュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのｐー
ニトロフェニルホスフェートを加え１５分間後に各ウェ
ルの４０５nmにおける吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ法
で最も高い吸収度を与えたウェルから、限定希釈法によ
りクローニングし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
分子を高産生するクローンを得た。
【００４８】本クローンを１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ
により培養し、コンフルエントとなった時点で、２％ウ
シ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへと交換し、更に３日間培
養した。その培養上清５リットルを、あらかじめ作製し
ておいたＴＵ２７抗体結合セファロースカラム（ビーズ
１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）にかけ、ＰＢＳにて洗浄
後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出した。溶出液をＰＢＳに
対して４℃にて一晩透析し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプ
ターβ鎖分子を得た。約４リットルから約４００μｇの
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子が得られ、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにて精製度と分子量を確認したところ、約
３７ｋｄの単一バンドであった。
により培養し、コンフルエントとなった時点で、２％ウ
シ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへと交換し、更に３日間培
養した。その培養上清５リットルを、あらかじめ作製し
ておいたＴＵ２７抗体結合セファロースカラム（ビーズ
１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）にかけ、ＰＢＳにて洗浄
後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出した。溶出液をＰＢＳに
対して４℃にて一晩透析し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプ
ターβ鎖分子を得た。約４リットルから約４００μｇの
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子が得られ、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにて精製度と分子量を確認したところ、約
３７ｋｄの単一バンドであった。
【００４９】（実施例３、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子の調製）内部にＸｈｏＩサイトを有するオリ
ゴマー5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGAAGCCAT-3'と内部に
ＨｉｎｄIIIサイトを有するオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTA
TTATGAAGTATTGCTCC-3'をＤＮＡ合成機（アプライドバイ
オシステム社製）により合成した。両オリゴマーをプラ
イマーとし、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のｃＤＮ
Ａを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大
腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００として寄託されてい
る）を鋳型としてサーマルサイクラーを用い、Taqポリ
メラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、
合成７２℃、２０サイクル）を行った。約０、７ｋｂの
増幅されたバンドを回収して、ＸｈｏＩ（宝酒造社製）
とＨｉｎｄIII（宝酒造社製）により切断後、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社製）をＸｈｏＩと
ＨｉｎｄIIIにて切断し回収したフラグメントとライゲ
ーションした。更に、ＸｈｏＩとＮｏｔＩ（宝酒造社
製）により切断後、あらかじめＸｈｏＩとＮｏｔＩにて
切断し回収したＢＣＭＧＳＮｅｏベクター（実験医学別
冊、遺伝子工学ハンドブック、２９７頁、１９９１年）
にライゲーションし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子ｃＤＮＡを挿入したベクターを構築した（図
３）。
ーγ鎖分子の調製）内部にＸｈｏＩサイトを有するオリ
ゴマー5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGAAGCCAT-3'と内部に
ＨｉｎｄIIIサイトを有するオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTA
TTATGAAGTATTGCTCC-3'をＤＮＡ合成機（アプライドバイ
オシステム社製）により合成した。両オリゴマーをプラ
イマーとし、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のｃＤＮ
Ａを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大
腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００として寄託されてい
る）を鋳型としてサーマルサイクラーを用い、Taqポリ
メラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、
合成７２℃、２０サイクル）を行った。約０、７ｋｂの
増幅されたバンドを回収して、ＸｈｏＩ（宝酒造社製）
とＨｉｎｄIII（宝酒造社製）により切断後、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社製）をＸｈｏＩと
ＨｉｎｄIIIにて切断し回収したフラグメントとライゲ
ーションした。更に、ＸｈｏＩとＮｏｔＩ（宝酒造社
製）により切断後、あらかじめＸｈｏＩとＮｏｔＩにて
切断し回収したＢＣＭＧＳＮｅｏベクター（実験医学別
冊、遺伝子工学ハンドブック、２９７頁、１９９１年）
にライゲーションし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子ｃＤＮＡを挿入したベクターを構築した（図
３）。
【００５０】次に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞へ該ベクターの導
入をリン酸カルシウム沈殿法（Greene Publishing Asso
ciates and Wiley-Interscience、Current Protcols in
Molecular Biology、９章、１９８７年）により行っ
た。まず、１Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に、１０％ウシ胎
児血清を含むＤ−ＭＥＭに懸濁したＮＩＨ３Ｔ３細胞液
を、１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）１枚当たり
１０ｍｌ入れ、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃、一
晩培養した。培養上清を捨て、新たに１０％ウシ胎児血
清（バイオセル社製）を含むＤ−ＭＥＭ（日研生物医学
社製）を９ｍｌ加え、更にＣＯ2インキュベーターにて
３７℃、２時間培養した。上述の方法により調製したベ
クターＤＮＡ３０μｇを１３５０μｌの水に溶解し、
２．５Ｍの塩化カルシウムを１５０μｌ加え、１．５ｍ
ｌの２８０ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭリン酸一水
素二ナトリウムを含む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．
０５）を入れたチューブに滴下した。直ちに混合後、室
温にて２０分間放置し沈殿を形成させた。次にパスツー
ルピペットにより沈殿を懸濁し、細胞を培養しているシ
ャーレに１枚当たり１ｍｌずつ添加した。４時間培養し
た後、培養上清を捨て、１０％グリセロールを含むＤ−
ＭＥＭを２ｍｌ加えて室温３分間放置した。ＰＢＳを５
ｍｌ加えて希釈し、ＰＢＳにて２回洗浄後、１０％ウシ
胎児血清を含むＤ−ＭＥＭを１０ｍｌ加えて、３７℃の
ＣＯ2インキュベーターにて３日間培養した。
入をリン酸カルシウム沈殿法（Greene Publishing Asso
ciates and Wiley-Interscience、Current Protcols in
Molecular Biology、９章、１９８７年）により行っ
た。まず、１Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に、１０％ウシ胎
児血清を含むＤ−ＭＥＭに懸濁したＮＩＨ３Ｔ３細胞液
を、１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）１枚当たり
１０ｍｌ入れ、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃、一
晩培養した。培養上清を捨て、新たに１０％ウシ胎児血
清（バイオセル社製）を含むＤ−ＭＥＭ（日研生物医学
社製）を９ｍｌ加え、更にＣＯ2インキュベーターにて
３７℃、２時間培養した。上述の方法により調製したベ
クターＤＮＡ３０μｇを１３５０μｌの水に溶解し、
２．５Ｍの塩化カルシウムを１５０μｌ加え、１．５ｍ
ｌの２８０ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭリン酸一水
素二ナトリウムを含む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．
０５）を入れたチューブに滴下した。直ちに混合後、室
温にて２０分間放置し沈殿を形成させた。次にパスツー
ルピペットにより沈殿を懸濁し、細胞を培養しているシ
ャーレに１枚当たり１ｍｌずつ添加した。４時間培養し
た後、培養上清を捨て、１０％グリセロールを含むＤ−
ＭＥＭを２ｍｌ加えて室温３分間放置した。ＰＢＳを５
ｍｌ加えて希釈し、ＰＢＳにて２回洗浄後、１０％ウシ
胎児血清を含むＤ−ＭＥＭを１０ｍｌ加えて、３７℃の
ＣＯ2インキュベーターにて３日間培養した。
【００５１】その後、培地を３００μｇ／ｍｌのＧ４１
８（ギブコＢＲＬ社製）、及び１０％ウシ胎児血清を含
むＤ−ＭＥＭに換え培養を継続し、形成されたコロニー
をそれぞれ分離しクローンを得た。それぞれのクローン
を培養し、約１ｘ１０6個の細胞よりアイソジェン（ニ
ッポンジーン社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを調製し
て、ドットブロット装置（バイオラッド社製）を用いて
ナイロン膜（ミクロンセパレーション社製）にブロット
した。ブロットした膜を５０％ホルムアミド、５倍デン
ハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、５倍ＳＳＰＥ液に浸し、
あらかじめランダムプライマーラベリングキット（宝酒
造社製）により32Ｐ標識した、上述のヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子の細胞外領域に相当する０．７ｋｂのｃ
ＤＮＡフラグメントを加えて、４２℃にて一晩反応させ
た。２倍のＳＳＣ溶液で２回洗浄し、更に０．１％ＳＤ
Ｓを含む２倍のＳＳＣ溶液で１回洗浄後、バイオイメー
ジアナライザー（富士フィルム社製）にて、32Ｐ標識し
たＤＮＡフラグメントの結合量を計測し、結合量の高い
クローン、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖
ｍＲＮＡの発現量の高いクローンを得た。
８（ギブコＢＲＬ社製）、及び１０％ウシ胎児血清を含
むＤ−ＭＥＭに換え培養を継続し、形成されたコロニー
をそれぞれ分離しクローンを得た。それぞれのクローン
を培養し、約１ｘ１０6個の細胞よりアイソジェン（ニ
ッポンジーン社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを調製し
て、ドットブロット装置（バイオラッド社製）を用いて
ナイロン膜（ミクロンセパレーション社製）にブロット
した。ブロットした膜を５０％ホルムアミド、５倍デン
ハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、５倍ＳＳＰＥ液に浸し、
あらかじめランダムプライマーラベリングキット（宝酒
造社製）により32Ｐ標識した、上述のヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子の細胞外領域に相当する０．７ｋｂのｃ
ＤＮＡフラグメントを加えて、４２℃にて一晩反応させ
た。２倍のＳＳＣ溶液で２回洗浄し、更に０．１％ＳＤ
Ｓを含む２倍のＳＳＣ溶液で１回洗浄後、バイオイメー
ジアナライザー（富士フィルム社製）にて、32Ｐ標識し
たＤＮＡフラグメントの結合量を計測し、結合量の高い
クローン、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖
ｍＲＮＡの発現量の高いクローンを得た。
【００５２】このようにして得られた可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞
からの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の調製は
以下のようにして行った。まず、該細胞を１０％ウシ胎
児血清を含むＤ−ＭＥＭにより培養し、コンフルエント
となった時点で、２％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへ
と交換し、更に３日間培養した。その培養上清５リット
ルを、あらかじめ作製しておいたＴＵＧｈ４抗体（Int.
Immunol.、６巻、１２７３頁、１９９４年）結合セフ
ァロースカラム（ビーズ１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）
にかけ、ＰＢＳにて洗浄後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出
した。溶出液をＰＢＳに対して４℃にて一晩透析し、可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を得た。約４リッ
トルから約５００μｇの可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度と分子
量を確認したところ、約４５ｋｄの単一バンドであっ
た。
２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞
からの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の調製は
以下のようにして行った。まず、該細胞を１０％ウシ胎
児血清を含むＤ−ＭＥＭにより培養し、コンフルエント
となった時点で、２％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへ
と交換し、更に３日間培養した。その培養上清５リット
ルを、あらかじめ作製しておいたＴＵＧｈ４抗体（Int.
Immunol.、６巻、１２７３頁、１９９４年）結合セフ
ァロースカラム（ビーズ１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）
にかけ、ＰＢＳにて洗浄後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出
した。溶出液をＰＢＳに対して４℃にて一晩透析し、可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を得た。約４リッ
トルから約５００μｇの可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度と分子
量を確認したところ、約４５ｋｄの単一バンドであっ
た。
【００５３】（実施例４、ヒトＩＬ−２存在下における
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子複合体形成の確認）
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子複合体形成の確認）
【００５４】可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
の125Ｉ標識 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の125Ｉ標識
は、ボルトンハンター法により行った。０．１Ｍほう酸
バッファー（ｐＨ８．５）に対して透析した可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターα鎖分子（１００μｇ／ｍｌ）溶液
２０μｌをボルトンハンター試薬（１８．５ＭＢｑ、デ
ュポン社製）に加え、氷中１５分間反応させた。更に、
０．２Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．５）を４７５μｌ加
え、氷中５分間反応させた。125Ｉ標識体の分離は、
０．５％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢ
Ｓで平衡化しておいたＧ−２５カラム（ファルマシア社
製）を用いて行った。作製した125Ｉ標識可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖分子の比放射活性は、３０，００
０ｃｐｍ／ｎｇであった。
の125Ｉ標識 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の125Ｉ標識
は、ボルトンハンター法により行った。０．１Ｍほう酸
バッファー（ｐＨ８．５）に対して透析した可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターα鎖分子（１００μｇ／ｍｌ）溶液
２０μｌをボルトンハンター試薬（１８．５ＭＢｑ、デ
ュポン社製）に加え、氷中１５分間反応させた。更に、
０．２Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．５）を４７５μｌ加
え、氷中５分間反応させた。125Ｉ標識体の分離は、
０．５％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢ
Ｓで平衡化しておいたＧ−２５カラム（ファルマシア社
製）を用いて行った。作製した125Ｉ標識可溶性ヒトＩ
Ｌ−２レセプターα鎖分子の比放射活性は、３０，００
０ｃｐｍ／ｎｇであった。
【００５５】ヒトＩＬ−２存在下における可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子複合体形成の確認 ５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子溶液
（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子溶液（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの
125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子溶液
（１７０，０００ｃｐｍ）、及び５０μｌのヒトＩＬ−
２溶液（１００μｇ／ｍｌ）とを混合し、室温にて１時
間反応させた。反応終了後、約５０μｌのＡＧ１４抗体
（特願平６−８２８３６、本抗体産生ハイブリドーマ
は、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４８として微工研に寄託され
ている）結合セファロースビーズを加えて、室温にて４
時間反応させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ溶液にてセファロースビーズを遠心洗浄し、
セファロースビーズに結合した放射活性をγカウンター
（パッカード社製）により測定した。
ＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子複合体形成の確認 ５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子溶液
（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子溶液（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの
125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子溶液
（１７０，０００ｃｐｍ）、及び５０μｌのヒトＩＬ−
２溶液（１００μｇ／ｍｌ）とを混合し、室温にて１時
間反応させた。反応終了後、約５０μｌのＡＧ１４抗体
（特願平６−８２８３６、本抗体産生ハイブリドーマ
は、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４８として微工研に寄託され
ている）結合セファロースビーズを加えて、室温にて４
時間反応させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ溶液にてセファロースビーズを遠心洗浄し、
セファロースビーズに結合した放射活性をγカウンター
（パッカード社製）により測定した。
【００５６】その結果、図４に示すように、ヒトＩＬ−
２と可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子と可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合に
は、125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
が抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体結合セファロース
ビーズに結合したが、ヒトＩＬ−２、可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖の分子何れか一つでも欠けた場合には、125Ｉ標識
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は抗ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖抗体結合セファロースビーズに結合し
なかった。このことより、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−
２存在下でのみ、四者の複合体を形成することが初めて
明らかとなった。
２と可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子と可溶性ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合に
は、125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子
が抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体結合セファロース
ビーズに結合したが、ヒトＩＬ−２、可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖の分子何れか一つでも欠けた場合には、125Ｉ標識
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は抗ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖抗体結合セファロースビーズに結合し
なかった。このことより、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−
２存在下でのみ、四者の複合体を形成することが初めて
明らかとなった。
【００５７】（実施例５、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、
及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のヒトＩＬ
−２活性阻害能の検定）
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、
及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のヒトＩＬ
−２活性阻害能の検定）
【００５８】（１）マウスＴ細胞株、ＣＴＬＬ−２のヒ
トＩＬ−２依存性増殖の阻害 ９６穴平底プレート（コーニング社製）に、可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプター溶液１００μｌ（それぞれの最終濃
度は１２．５μｇ／ｍｌ）と、１０％ＦＣＳ、及び５Ｘ
１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩによ
り３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコンビナン
トＩＬ−２溶液５０μｌを混合し、３７℃のＣＯ2イン
キュベーターにて３０分間反応させた。その後、同培地
により８Ｘ１０4個／ｍｌに調製したＣＴＬＬ−２細胞
液５０μｌを加え、３７℃にて２０時間培養した。培養
後同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度に調製した3Ｈ−
チミジン溶液（デュポン社製）を５０μｌ加え、３７℃
にて４時間反応させた。反応終了後、細胞をハーベスト
し、細胞に取り込まれた放射活性をβカウンター（マト
リックス９６、パッカード社製）により測定した。
トＩＬ−２依存性増殖の阻害 ９６穴平底プレート（コーニング社製）に、可溶性ヒト
ＩＬ−２レセプター溶液１００μｌ（それぞれの最終濃
度は１２．５μｇ／ｍｌ）と、１０％ＦＣＳ、及び５Ｘ
１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩによ
り３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコンビナン
トＩＬ−２溶液５０μｌを混合し、３７℃のＣＯ2イン
キュベーターにて３０分間反応させた。その後、同培地
により８Ｘ１０4個／ｍｌに調製したＣＴＬＬ−２細胞
液５０μｌを加え、３７℃にて２０時間培養した。培養
後同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度に調製した3Ｈ−
チミジン溶液（デュポン社製）を５０μｌ加え、３７℃
にて４時間反応させた。反応終了後、細胞をハーベスト
し、細胞に取り込まれた放射活性をβカウンター（マト
リックス９６、パッカード社製）により測定した。
【００５９】その結果、図５に示すように、何れの可溶
性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の
可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加え
た場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであっ
たが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩ
Ｌ−２活性が著しく阻害された。
性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の
可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加え
た場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであっ
たが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩ
Ｌ−２活性が著しく阻害された。
【００６０】（２）ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのヒトＩＬ−
２依存性増殖の阻害 ヘパリン加採血したヒト血液より、フィコールパック
（ファルマシア社製）によりＰＢＬを分離した。１０％
ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＰＢＬを５Ｘ
１０5個／ｍｌの濃度に調製し（５０ｍｌ）、ＰＨＡ
（ギブコＢＲＬ社製）を加え、３７℃にて２４時間培養
した。更に、最終濃度で１，０００ユニット／ｍｌの濃
度となるように、ヒトリコンビナントＩＬ−２を加え
て、３７℃にて５日間培養した。細胞を１０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄後、同培地にて６時
間培養した。
２依存性増殖の阻害 ヘパリン加採血したヒト血液より、フィコールパック
（ファルマシア社製）によりＰＢＬを分離した。１０％
ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＰＢＬを５Ｘ
１０5個／ｍｌの濃度に調製し（５０ｍｌ）、ＰＨＡ
（ギブコＢＲＬ社製）を加え、３７℃にて２４時間培養
した。更に、最終濃度で１，０００ユニット／ｍｌの濃
度となるように、ヒトリコンビナントＩＬ−２を加え
て、３７℃にて５日間培養した。細胞を１０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄後、同培地にて６時
間培養した。
【００６１】このようにして調製したＰＨＡ刺激ＰＢＬ
を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、４
Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に調製し、細胞液５０μｌ（２
Ｘ１０4個）に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター溶液を
１００μｌ加え（それぞれの最終濃度は１２．５μｇ／
ｍｌ）、３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、
同培地にて３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコ
ンビナントＩＬ−２を５０μｌ加え、３７℃にて２日間
培養した。その後、同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度
に調製した3Ｈ−チミジン溶液（デュポン社製）を５０
μｌ加え、３７℃にて６時間反応させた。反応終了後、
細胞をハーベストし、細胞に取り込まれた放射活性（3
Ｈ−チミジン量）を、βカウンター（マトリックス９
６、パッカード社製）にて測定した。
を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、４
Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に調製し、細胞液５０μｌ（２
Ｘ１０4個）に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター溶液を
１００μｌ加え（それぞれの最終濃度は１２．５μｇ／
ｍｌ）、３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、
同培地にて３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコ
ンビナントＩＬ−２を５０μｌ加え、３７℃にて２日間
培養した。その後、同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度
に調製した3Ｈ−チミジン溶液（デュポン社製）を５０
μｌ加え、３７℃にて６時間反応させた。反応終了後、
細胞をハーベストし、細胞に取り込まれた放射活性（3
Ｈ−チミジン量）を、βカウンター（マトリックス９
６、パッカード社製）にて測定した。
【００６２】その結果、図６に示すように、何れの可溶
性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の
可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加え
た場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであっ
たが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩＬ
−２活性が著しく阻害された。これらの結果より、本願
発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤は、免疫
抑制剤として有用であることが示された。
性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の
可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加え
た場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであっ
たが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２
レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩＬ
−２活性が著しく阻害された。これらの結果より、本願
発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性
ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤は、免疫
抑制剤として有用であることが示された。
【００６３】
【発明の効果】本発明の、可溶性ヒトＩＬ−２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、
及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分
とする免疫抑制剤は、ＩＬ−２と複合体を形成し、ＩＬ
−２の作用を抑制する活性を有しており、ＩＬ−２の過
剰産生、あるいはＩＬ−２に対し過剰反応を起こすこと
が原因となっている疾患、例えば臓器移植時の拒絶反応
や、自己免疫疾患等の治療に対して有効であり、かつ副
作用がなく、頻回投与が可能な薬剤として有用である。
ーα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、
及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分
とする免疫抑制剤は、ＩＬ−２と複合体を形成し、ＩＬ
−２の作用を抑制する活性を有しており、ＩＬ−２の過
剰産生、あるいはＩＬ−２に対し過剰反応を起こすこと
が原因となっている疾患、例えば臓器移植時の拒絶反応
や、自己免疫疾患等の治療に対して有効であり、かつ副
作用がなく、頻回投与が可能な薬剤として有用である。
【００６４】
配列番号：１ 配列の長さ：２１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys 1 5 10 15 Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg 20 25 30 Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly 35 40 45 Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Glu Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln 65 70 75 80 Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp 85 90 95 Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn 100 105 110 Glu Ala Thr Glu Arg Ile Thr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr 115 120 125 Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu 130 135 140 Ser Var Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln 145 150 155 160 Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu 165 170 175 Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys 180 185 190 Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr 195 200 205 Met Glu Thr 210
【００６５】配列番号：１ 配列の長さ：２１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala 1 5 10 15 Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser 20 25 30 Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys 35 40 45 Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln 85 90 95 Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu 100 105 110 Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile 115 120 125 Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg 130 135 140 Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu 145 150 155 160 Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr 165 170 175 Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr 180 185 190 Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala 195 200 205 Ala Leu Gly Ser 210
【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：２２８ 配列の型：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala 1 5 10 15 Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr 20 25 30 Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met 35 40 45 Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr 50 55 60 Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys 65 70 75 80 Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln 85 90 95 Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn 115 120 125 Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser 130 135 140 Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys 145 150 155 160 Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr 165 170 175 Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp 180 185 190 Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu 195 200 205 Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp 210 215 220 Gly Ser Asn Thr 225
【図１】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡ
を含有する発現プラスミドｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬ
ＥＳＳの構築工程を示す図面である。
を含有する発現プラスミドｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬ
ＥＳＳの構築工程を示す図面である。
【図２】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡ
を含有する発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．β
の構築工程を示す図面である。
を含有する発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．β
の構築工程を示す図面である。
【図３】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡ
を含有する発現プラスミドＢＣＭＧＳＮｅｏ（ｓｏｌＩ
Ｌ２Ｒγ）の構築工程を示す図面である。
を含有する発現プラスミドＢＣＭＧＳＮｅｏ（ｓｏｌＩ
Ｌ２Ｒγ）の構築工程を示す図面である。
【図４】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子が、ＩＬ−２存在下で複合体を
形成することを示す図面である。
溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子が、ＩＬ−２存在下で複合体を
形成することを示す図面である。
【図５】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子が、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−
２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子が、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−
２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
【図６】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可
溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子が、ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのＩ
Ｌ−２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子が、ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのＩ
Ｌ−２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
Claims (4)
- 【請求項１】 可溶性ヒトインターロイキン２レセプタ
ーα鎖分子、可溶性ヒトインターロイキン２レセプター
β鎖分子及び可溶性ヒトインターロイキン２レセプター
γ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤。 - 【請求項２】 可溶性ヒトインターロイキン２レセプタ
ーα鎖分子が、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
を有するものである請求項１記載の免疫抑制剤。 - 【請求項３】 可溶性ヒトインターロイキン２レセプタ
ーβ鎖分子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
を有するものである請求項１記載の免疫抑制剤。 - 【請求項４】 可溶性ヒトインターロイキン２レセプタ
ーγ鎖分子が、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列
を有するものである請求項１記載の免疫抑制剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27877395A JP3796780B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 新規免疫抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27877395A JP3796780B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 新規免疫抑制剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09124501A true JPH09124501A (ja) | 1997-05-13 |
| JP3796780B2 JP3796780B2 (ja) | 2006-07-12 |
Family
ID=17601989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27877395A Expired - Fee Related JP3796780B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 新規免疫抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3796780B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011506307A (ja) * | 2007-12-07 | 2011-03-03 | ハンコック ファーム．カンパニー インコーポレーティッド | 桑黄キノコ菌糸体抽出物を有効成分として含む移植片拒絶抑制用組成物 |
| JP2011506308A (ja) * | 2007-12-07 | 2011-03-03 | ハンコック ファーム．カンパニー インコーポレーティッド | 冬虫夏草菌糸体抽出物を有効成分として含む移植片拒絶抑制用組成物 |
-
1995
- 1995-10-26 JP JP27877395A patent/JP3796780B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011506307A (ja) * | 2007-12-07 | 2011-03-03 | ハンコック ファーム．カンパニー インコーポレーティッド | 桑黄キノコ菌糸体抽出物を有効成分として含む移植片拒絶抑制用組成物 |
| JP2011506308A (ja) * | 2007-12-07 | 2011-03-03 | ハンコック ファーム．カンパニー インコーポレーティッド | 冬虫夏草菌糸体抽出物を有効成分として含む移植片拒絶抑制用組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3796780B2 (ja) | 2006-07-12 |
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