JP3796780B2 - 新規免疫抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性ヒトインターロイキン２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤に関する。
本免疫抑制剤は、インターロイキン２（以下、ＩＬ−２と称する）の生物活性を効果的に阻害する作用を有しており、ＩＬ−２の過剰産生が原因となっている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効である。
【０００２】
【従来の技術】
臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制できるかにかかってきている。拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカプトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果が弱いことなどにより、移植臓器の拒絶反応を抑制することができず、移植臓器の生着率の著しい向上はみられなかった。
【０００３】
その後、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６の登場により、生着率は格段の向上をみられるようになった。しかしながら、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６には重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用の制限が与儀なくされてきており、より安全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。
【０００４】
さて、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握ると考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あるいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２などにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与していることが示されている。
【０００５】
また、自己免疫疾患は生体内での免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することにより発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−２を中心とする免疫系因子の過剰産生、あるいはそれらの因子に対する過剰反応がその一因となっていると考えられている。従って、ＩＬ−２の作用を選択的、かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるものと考えられるようになった。
【０００６】
実際、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害する活性を有する抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体を、マウスにおける心移植や（J. Exp. Med.、１６２巻、３５８頁、１９８５年）、サルにおける腎臓移植の際に投与すると拒絶反応が抑制されること（Transplantation、４７巻、５５頁、１９８９年）が報告され、更にその後、ヒトの腎臓移植患者での臨床試験において抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体の有効性が確認された（N. Engl. J. Med.、３２２巻、１１７５頁、１９９０年；Transplantation、５１巻、１０７頁、１９９１年）。
【０００７】
しかし、この臨床試験においては、投与した抗体がマウス由来の蛋白であるため、投与した抗体に対する免疫反応が生じ、抗体に対する抗体の産生が確認された。従って、抗体投与を繰り返し行うと更に強い免疫反応が惹起され、アレルギーが発症する可能性が高い。また、投与した抗体と抗体に対する抗体とが複合体を形成することにより分解を受けやすくなり、抗体の効果が激減する可能性も高く、副作用、及び効果の両面から、抗体の頻回投与は難しいと考えられている。しかし、少なくともＩＬ−２の作用を選択的に抑制することで、効果的な免疫抑制を行うことができることが強く示唆されていることから、副作用が少なく、かつ効果的にＩＬ−２の作用を抑制できる薬剤は、有効な免疫抑制剤となるものと考えられ、開発が望まれている。
【０００８】
さて、ＩＬ−２は、細胞表面上に発現するＩＬ−２レセプターに結合して機能が発現する。ＩＬ−２レセプターは、α鎖、β鎖、γ鎖の３つの分子より構成されることが知られており。各鎖の遺伝子を導入したトランスフェクタントを用いた実験により、α鎖とβ鎖とγ鎖をすべて発現する細胞にはＩＬ−２がｋｄ＝１０-11Ｍで、α鎖とβ鎖を発現する細胞にはｋｄ＝１０-10Ｍで、β鎖とγ鎖を発現する細胞にはＫｄ＝１０-9Ｍで、α鎖のみ、あるいはα鎖とγ鎖を発現する細胞にはｋｄ＝１０-8Ｍでそれぞれ結合し、β鎖のみ、あるいはγ鎖のみ発現する細胞にはＩＬ−２は殆ど結合しないことが明らかとなった（Cell、73巻、５頁、１９９３年）。
【０００９】
ＩＬ−２レセプターα鎖分子は、細胞膜貫通領域と細胞内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液中に存在することが知られ、ヒト成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者等で高値となることが知られている（Jpn. J. Cancer Res.、７９巻、５９３頁、１９８８年）。この可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、ＩＬ−２に結合する活性を有し、ＩＬ−２の活性を阻害する活性を有していることがリコンビナント体を用いた実験で明らかとなった（Immunol. Let.、１９巻、２９９頁、１９８８年）。可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、元来ヒトの生体内に存在する分子であることから、ヒトに投与した場合抗体が産生される可能性は少なく、安全な薬剤と考えられ、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が免疫抑制剤として応用できる可能性が示唆されたが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子のＩＬ−２活性阻害能は極めて弱いことから、実際にヒトに応用することは困難であり、現在まで臨床応用されていない。
【００１０】
一方、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及びＩＬ−２レセプターγ鎖分子も、細胞膜貫通領域と細胞内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液中に存在することが知られ、特定の疾患で高い値となることが明らかとなっているが（特開平６−２０１６９３、特願平６−３０１８３７）、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、リコンビナント体を用いた実験により、それぞれＩＬ−２に結合する活性は殆ど有しておらず、ＩＬ−２活性の阻害能も有していないことが明らかとなり、免疫抑制剤として応用することはできないと考えられていた。
従って、ヒトに投与した場合、免疫反応を惹起しない、副作用が少なく安全で、かつ効果的にＩＬ−２の作用を抑制できる薬剤は現在まで知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＩＬ−２の作用を効果的に抑制する活性を有し、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患の治療に対して有効であり、かつ副作用がなく頻回投与が可能な免疫抑制剤を提供することである。
【００１２】
【課題を解決する為の手段】
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子がヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成することを世界で初めて見いだした。そして可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を混合すると、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子単独のＩＬ−２活性阻害能に比較して、約５０倍の阻害能を有することを見いだし、本願発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤である。本発明に従えば、ＩＬ−２の作用を効果的に阻害し、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患の治療に対して有効で、かつ副作用がなく頻回投与が可能な免疫抑制剤が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明に使用される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、それぞれの分子をコードするｃＤＮＡを適当なベクタープラスミドに挿入し、適当な宿主に導入して形質転換させたとき、この形質転換株によって生産され培地中に分泌されるような性質を有するものをいう。
具体的には、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ｇｌｕ）から数えて少なくとも２２０番目（Ｖａｌ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ａｌａ）から数えて少なくとも２１３番目（Ａｓｐ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ｌｅｕ）から数えて少なくとも２２８番目（Ｔｈｒ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、それぞれのレセプター分子の、疎水性の高い細胞膜貫通領域、及び細胞内領域を除去することにより水溶性を著しく向上させていることを特徴としている。それぞれの分子のアミノ酸配列は配列表の１、２、及び３に記載されている。
【００１５】
本願発明の免疫抑制剤に含有される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、以下のような方法により製造することができる。すなわち、適当なプロモーター配列の下流に、発現可能となるように、それぞれの蛋白分子をコードする遺伝子を配置し、宿主細胞内で増殖できるベクターＤＮＡに組み込み、Ｌ細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞に導入して形質転換、又はエシェリヒア属微生物等に導入し、その形質転換細胞、又は形質導入したエシェリヒア属微生物を培養することにより製造することができる。具体的な製造方法を以下に記す。
【００１６】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、特開昭６２−２４６５９８号明細書記載の方法等により製造することができる。以下にその方法につき説明する。
プラスミドｐＫＣＲＴａｃ２（Nature、３１１巻、６３１頁、１９８４年）のＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡのＡａｔII制限酵素部位に５’端をリン酸化した第１図に示す合成ＤＮＡ（ａ）を挿入することにより、ＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡのスレオニン（Ｎ末端より２１１番目）に相当するコドン（ＡＣＧ）のすぐ後に終止コドンＴＧＡを配置する。そしてＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの下流に開始コドンＡＴＧ、シグナルペプチドをコードする遺伝子、そして可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを配置することによりｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳが構築できる（第１図参照）。
この場合、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを調製するために、適当なプライマーＤＮＡを作成し、ＰＣＲ法により調製しても差し支えないし、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター以外のプロモーターを用いても構わない。また、発現可能である限り、如何なる発現ベクターを用いても構わない。
【００１７】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換するには、以下に示す通常よく用いられる形質転換法がある。宿主細胞がＬ細胞の場合、ＤＮＡをリン酸カルシウム沈澱として感染させる方法、マイクロインジェクション法、赤血球細胞若しくははリボソームにプラスミドを包括して挿入する方法、リボフォスファチジルコリンのような試薬による細胞の処理法、又はウィルスベクターを用いる方法などがある。形質転換する宿主細胞としては、Ｌ細胞以外にも、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウスＢａｌｂ３Ｔ３細胞や、ハムスターＣＨＯ細胞などを用いることができる。
【００１８】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を組み込んで形質転換したマウス細胞より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白を製造する方法は一般的に行われている付着細胞の培養方法に従えばよい。即ち、３７℃、５％炭酸ガス通気中、組織培養フラスコを使用し培養することができる。培地は通常組織培養で用いられている合成培地でよい。例えば、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地などがある。これらの培地を実際使用する場合は、１０％ウシ胎児血清アルブミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ3を添加することが望ましい。
【００１９】
当該マウスＬ細胞を用い培養することによって生産される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白量は経時的に変化する。効率よく可溶性ヒトＩＬ−２レセプター蛋白を生産するには以下の方法に従って行えば良い。即ち、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍｇ／ｍｌＮａＨＣＯ3含有）を用い、細胞密度１Ｘ１０5／ｍｌで培養を開始し、４〜５日後に細胞がコンフルエントになったら培養上清を回収し、さらに新鮮培地を添加し、３〜４日培養を続行する。培養終了後、培地を回収して可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白の生産量を定量すると、前半及び後半の培養でほぼ同量の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白が生産されている。
【００２０】
この様にして得られた当該マウスＬ細胞の培養上清より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、ヒトＩＬ−２を固定化したカラム、例えばヒトＩＬ−２セファローズ４Ｂ、又は抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体であるＭ−Ａ２５１（ファーミンジェン社製）セファローズ４Ｂを用いたアフィニテイクロマトグラフィーで精製することができる。更に高純度に分離精製するには、ＯＤＳカラム（Octa decyl silane)を用いた逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて行えばよい。このようにして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖は、分子量が約４２Ｋｄの蛋白である。
【００２１】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子は、特開平３−６７５８８明細書記載の方法等に準じて製造することができる。以下にその方法につき説明する。
ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬ−２Ｒβ３０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１頁、１９８９年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、β鎖の全コード配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得る。ＢｓｓＨII末端をブラント化した後、１．９ＫｂｃＤＮＡをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン社製）のＳｍａＩ制限部位に挿入する。次に、このｐブルースクリプトＳＫ−β１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａＩで消化して、細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除く。次に終止コドン（ＴＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む１２塩基長の合成リンカー（ニューイングランドバイオラブ社製、＃１０６０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＳｔｙＩ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤＮＡにライゲーションする。ＮｈｅＩで消化して過剰のリンカーを除いた後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂プラスミドＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．βが構築できる。
【００２２】
このｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．βをＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤＮＡ断片を単離する。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化物に導入し発現ラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−ＳｏＩ．βが構築できる（第２図参照）。
【００２３】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換するには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞がエシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合と同様の方法により作製することができる。
【００２４】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を製造する方法は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体であるＴＵ２７（ベクトンディッキンソン社製）セファローズ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。更に高純度に分離精製するには、逆相ＨＰＬＣを用いて行えばよい。
このようにして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子は、分子量が約３７ｋｄの蛋白である。
【００２５】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、特開平４−１０４９４７明細書記載の方法等に準じて製造することができる。以下にその方法につき説明する。
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型として、プライマーとして、ＸｈｏＩ制限酵素サイトを含む５’側センスプライマー（5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGAAGCCAT-3', 29mer）とＨｉｎｄIII制限酵素サイトと、ｓｔｏｐコドンを含む３’側アンチセンスプライマー（5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3', 29mer）を用いてＰＣＲを行うことにより、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。得られた遺伝子をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断後、同じくＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社製）に組み込み、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断する。その後、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したＢＣＭＧｎｅｏベクターに組み込む（J. Exp. Med.、１６９巻、１３頁、１９８９年）。このようにして可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を有する発現ベクターが構築できる（第３図参照）。
【００２６】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換するには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞がエシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合と同様の方法により作製することができる。
【００２７】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を製造する方法は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体であるＴＵＧｈ４（Int. Immunol.、６巻、１２７３頁、１９９４年）セファローズ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。更に高純度に分離精製するには、逆相ＨＰＬＣを用いて行えばよい。
このようにして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、分子量が約４５ｋｄの蛋白である。
【００２８】
次に、以上のようにして製造した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成しうることを説明する。
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を125Ｉにより標識し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をヒトＩＬ−２存在下、あるいは非存在下で混合した。その後、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対する抗体であるＴＵＧｈ４を固相化したセファローズ４Ｂと反応させ、セファローズ４Ｂに結合した放射活性、すなわち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の量を測定した。その結果、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、及びヒトＩＬ−２がすべて存在したときに限り、セファローズ４Ｂに結合した放射活性が有意に高値となった。すなわち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−２存在下で初めて四者の複合体を形成しうることが確認された。
【００２９】
次に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤が、ＩＬ−２依存性の反応を特異的に抑制することを説明する。
【００３０】
本発明者らは、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２のＩＬ−２依存性増殖、及びＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）刺激ヒト末梢血リンパ球のＩＬ−２依存性増殖の、本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤による抑制効果について検討した。何れの系においても、本願発明の薬剤を共存させることにより著しくＩＬ−２依存性の増殖が阻害された。本実験系においては、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の何れか一つでも欠けると、阻害効果が激減することから、三種の物質が全て必要不可欠であることが確認された。これまで、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子はそれぞれ単独では殆どＩＬ−２依存性反応の阻害能を有さないことが知られていたが、本願発明者らは、それらの分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成すること、更に、それらの分子を有効成分とする薬剤がヒトＩＬ−２の作用を抑制することを初めて明らかとし、本願発明を完成することができた。
【００３１】
本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤は、ＩＬ−２の過剰産生、又はＩＬ−２に対し過剰反応を起こすことが原因となっている疾患、例えば臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に対して有効であり、かつ副作用がなく、頻回投与が可能な免疫抑制剤として有用である。
【００３２】
本発明の免疫抑制剤は、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列を有する物質に限定されるものではなく、ＩＬ−２存在下で複合体を形成する活性を有する物質である限り本発明に含まれる。例えば、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列の一部を変換、削除、又は他のアミノ酸を付加した物質等はすべて本発明に含まれる。また、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列を有する物質をポリエチレングリコール等で修飾された物質も本発明に含まれる。
【００３３】
本発明の免疫抑制剤は、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をそれぞれ０．１重量％〜９９．９重量％含有すればよい。従って、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をそれぞれそのまま投与してもよいし、通常製剤用担体と混合して調製した製剤の形でも投与できる。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水、ブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤、保存剤、あるいは安定化剤を含有させてもよい。また、これらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有してもよい。
【００３４】
本発明に係わる免疫抑制剤の投与方法としては、経口、注射、直腸内など何れの方法を用いても構わないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、通常、１回０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回投与すればよい。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。尚、本発明の技術的範囲は実施例に限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の調製）
まず、ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡをＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターを含むベクターｐＫＣＲＨ２に組み込んだプラスミドPＫＣＲ・Ｔａｃ−２・Ａ（Ｎａｔｕｒｅ，３１１巻、６３１頁１９８４年）６μｇを制限酵素ＡａｔIIで部分分解し、約６．５キロベース（ｋｂ）の直鎖状プラスミドの断片をアガロ−スゲル電気泳動により分離回収した。回収された該断片は１μｇであった。該断片を制限酵素ＢａｍＨＩで分解し、アガロース電気泳動により０．３５μｇの５．４Ｋｂ断片と０．０７μｇの１．１ｋｂ断片を分離回収した。5'-GAGATCTCACGT-3'の配列をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステム社製３８０Ａ型）により合成し、逆相ＨＰＬＣにて精製後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’側をリン酸化した。５．４ｋｂ断片および１．１ｋｂ断片各々０．０４ピコモルと上記１２個の配列をもつオリゴヌクレオチド０．１６ピコモルを１０μｌの反応液中で１５℃、１時間、その後１００μｌに希釈し、さらに１５℃にて１２時間Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼにより結合させた。
【００３７】
次に、この反応液１０μｌを用い常法によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換せしめ、約２５０個のアンピシリン抵抗性株を得た。この中から任意に１２個を選び、そのプラスミドＤＮＡを抽出し、▲１▼プラスミドの大きさが約６．５ｋｂであること、▲２▼制限酵素ＡａｔII 切断部分が一つになっていること、３１２個のオリゴヌクレオチドに由来する制限酵素ＢｇｌII切断部位がもとの制限酵素ＡａｔII切断部位に存在すること、の３点を満足するプラスミドで形質転換された形質転換株を５株得た。該形質転換株中のプラスミドの塩基配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,７４巻，５４６３頁、１９７７年）により調べ、ｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳの塩基配列をもつことを確認した（図１）。
【００３８】
更に、この様にして得た形質転換株からｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳプラスミドを塩化セシウム平衡遠心法によりマウスＬ細胞（ｔｋ-変異株）にトランスフェクションした。
すなわち１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イ−グル培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌに懸濁したＬ細胞１Ｘ１０5個をファルコン３００３シャ−レに入れ、３７℃、５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて２０時間培養した。その後、同培地１０ｍｌにて培地交換し、同条件で４時間培養した。
【００３９】
培養後、Ａ液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）０．５ｍｌと、Ｂ液（２ＭＣａＣｌ2、１０μｇｐＫＣＲＩＲ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳ、１μｇｐＢＲ３２２、ｈｅｒｐｅｓＴｋ）０．５ｍｌを添加し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて１２時間培養した。ＴＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＫＣｌ、５．６ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で洗浄し、２．５％グリセロ−ル含有ＴＢＳ溶液にて３分間処理した。処理後直ちにＴＢＳで洗浄し、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ１０ｍｌを加え、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日間培養した。その後、ＨＡＴ培地（１３．６ｍｇ／ｌヒポキサチン、３．８８ｍｇ／ｌチミジン、０．１７６ｍｇ／ｌアミノプテリンおよび１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ）１０ｍｌに培地交換し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日間培養した。この培地交換を以後２日毎に行った。
【００４０】
１４日目にはシャーレ当り１２個のコロニーが出現した。この様にして出現した各コロニーを９６穴マイクロプレートに移し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて培養し、コンフルエントになったらさらに２日間培養した。各コロニーの培養上清中の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を以下に述べる方法により同定した。その結果ＢＴＭＬＥＳＳ−Ｑを得た。
【００４１】
多数のヒトＩＬ−２レセプターα鎖を膜表面に表現しているＡＴＬ由来細胞株ＭＴ−１細胞はモノクローナル抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体（抗Ｔａｃ抗体）と補体で処理すると殺すことができる。そこで可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子含有標本と抗体とを反応させ、この後ＭＴ−１細胞を加えさらに補体で処理する。もしこの標本中に可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が存在すれば抗体と結合し、ＭＴ−１細胞と反応する抗体が減少し、その結果ＭＴ−１細胞は補体で処しても死ななくなる。この原理によりごく微量（約０．１ｎｇ）の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を同定することができる。具体的な可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の同定方法は、まず９６穴Ｕ底マイクロプレ−ト中で標品１０μｌまたはこれを１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したもの１０μｌと、同培地に溶解した１．６ｎｇ抗Ｔａｃ抗体溶液１０μｌをよく混合し、０℃で３０分間放置する。そして上記培地に懸濁した５Ｘ１０5個／ｍｌのＭＴ−１細胞２０μｌを加え、混合後０℃で３０分間放置する。８００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を捨て補体（ウサギ新生児血清を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１５倍希釈したもの）２０μｌを加え、混合後３７℃で３０分間放置する。そして０．５％トリパンブル−含有ＰＢＳ溶液２０μｌを加え、２００細胞中の死細胞数を計測する方法である。
【００４２】
この様にして産生した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は−２０℃にて凍結保存することができ、また限外濾過（例えばセントリコン１０）により濃縮してもその性状は変わらない。さらにヒトＩＬ−２カラムに結合させることができる。即ち、セントリコン１０にて１０倍濃縮した標品１００μｌをヒトＩＬ−２セファローズ４Ｂ（リコンビナントヒトＩＬ−２を２００μｇ含有）カラムに吸着せしめ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出すると可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が溶出されてくるため、この溶出画分を直ちに１Ｍトリスベースにて中和する。かくして得られた可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子はＭＴ−１細胞の抗Ｔａｃ抗体と補体による殺作用効果を阻害した。また、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討したところ、分子量約４２Ｋｄであった。
【００４３】
（実施例２、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子の調製）
ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬ−２Ｒβ３０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１頁、１９８９年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、β鎖の全コード配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得た。ＢｓｓＨII末端をブラント化した後、１．９ＫｂｃＤＮＡをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン社製）のＳｍａＩ制限部位に挿入した。
【００４４】
次に、このｐブルースクリプトＳＫ−β１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａＩで消化して、細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除き、終止コドン（ＴＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む１２塩基長の合成リンカー（ニューイングランドバイオラブ社製、＃１０６０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＳｔｙＩ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤＮＡにライゲーションした。ＮｈｅＩで消化して過剰のリンカーを除いた後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂プラスミドＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｐブルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．βを構築した。
【００４５】
このｐブルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．βをＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤＮＡ断片を単離した。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断物に導入し、発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．βを構築した（図２）。
【００４６】
プラスミドのトランスフェクションは、プロトプラスト法により行った。すなわち、ＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．βを含む菌をプロトプラストに変換して、マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３と、ポリエチレングリコール＃２０００（和光純薬社製）を用いて融合した。次に、１Ｘ１０5個のプロトプラスト融合ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４ウェルプレートに接種した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および７５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で２５日間培養した。そして、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、トランスフェクトした細胞の培養上清中の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子の濃度を測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡには、モノクロナール抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖抗体である、ＴＵ１１、及びＴＵ２７（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４２巻、６１頁、１９９１年）を用いて以下の方法により行った。
尚、ＴＵ１１は通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐー１３２３３である。又、ＴＵ２７は通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰー２５１０である。
【００４７】
９６ウェル平底プレート（タイターテック社製）に、１０μｇ／ｍｌの濃度に５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）により調製したＴＵ１１抗体溶液を一ウェル当たり５０μｌ加え４℃一晩コーテイングした。ＴＵ１１抗体を除去後、室温１時間、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでインキュベートすることによりブロッッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、トランスフェクタントの培養上清５０μｌをウェルに入れ、室温１時間インキュベートした。洗浄後、１μｇ／ｍｌのビチオン化ＴＵ２７抗体溶液５０μｌをウェルに加え、室温１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌのアルカリフォスファターゼ結合アビヂン（ベクター製）を加えた。室温１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのｐーニトロフェニルホスフェートを加え１５分間後に各ウェルの４０５nmにおける吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ法で最も高い吸収度を与えたウェルから、限定希釈法によりクローニングし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を高産生するクローンを得た。
【００４８】
本クローンを１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭにより培養し、コンフルエントとなった時点で、２％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへと交換し、更に３日間培養した。その培養上清５リットルを、あらかじめ作製しておいたＴＵ２７抗体結合セファロースカラム（ビーズ１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）にかけ、ＰＢＳにて洗浄後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出した。溶出液をＰＢＳに対して４℃にて一晩透析し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を得た。約４リットルから約４００μｇの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度と分子量を確認したところ、約３７ｋｄの単一バンドであった。
【００４９】
（実施例３、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の調製）
内部にＸｈｏＩサイトを有するオリゴマー5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGAAGCCAT-3'と内部にＨｉｎｄIIIサイトを有するオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3'をＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム社製）により合成した。両オリゴマーをプライマーとし、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型としてサーマルサイクラーを用い、TaqポリメラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、合成７２℃、２０サイクル）を行った。約０、７ｋｂの増幅されたバンドを回収して、ＸｈｏＩ（宝酒造社製）とＨｉｎｄIII（宝酒造社製）により切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社製）をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIにて切断し回収したフラグメントとライゲーションした。更に、ＸｈｏＩとＮｏｔＩ（宝酒造社製）により切断後、あらかじめＸｈｏＩとＮｏｔＩにて切断し回収したＢＣＭＧＳＮｅｏベクター（実験医学別冊、遺伝子工学ハンドブック、２９７頁、１９９１年）にライゲーションし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子ｃＤＮＡを挿入したベクターを構築した（図３）。
【００５０】
次に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞へ該ベクターの導入をリン酸カルシウム沈殿法（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、Current Protcols in Molecular Biology、９章、１９８７年）により行った。
まず、１Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに懸濁したＮＩＨ３Ｔ３細胞液を、１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）１枚当たり１０ｍｌ入れ、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃、一晩培養した。培養上清を捨て、新たに１０％ウシ胎児血清（バイオセル社製）を含むＤ−ＭＥＭ（日研生物医学社製）を９ｍｌ加え、更にＣＯ2インキュベーターにて３７℃、２時間培養した。上述の方法により調製したベクターＤＮＡ３０μｇを１３５０μｌの水に溶解し、２．５Ｍの塩化カルシウムを１５０μｌ加え、１．５ｍｌの２８０ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭリン酸一水素二ナトリウムを含む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．０５）を入れたチューブに滴下した。直ちに混合後、室温にて２０分間放置し沈殿を形成させた。次にパスツールピペットにより沈殿を懸濁し、細胞を培養しているシャーレに１枚当たり１ｍｌずつ添加した。４時間培養した後、培養上清を捨て、１０％グリセロールを含むＤ−ＭＥＭを２ｍｌ加えて室温３分間放置した。ＰＢＳを５ｍｌ加えて希釈し、ＰＢＳにて２回洗浄後、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭを１０ｍｌ加えて、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて３日間培養した。
【００５１】
その後、培地を３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコＢＲＬ社製）、及び１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに換え培養を継続し、形成されたコロニーをそれぞれ分離しクローンを得た。
それぞれのクローンを培養し、約１ｘ１０6個の細胞よりアイソジェン（ニッポンジーン社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを調製して、ドットブロット装置（バイオラッド社製）を用いてナイロン膜（ミクロンセパレーション社製）にブロットした。ブロットした膜を５０％ホルムアミド、５倍デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、５倍ＳＳＰＥ液に浸し、あらかじめランダムプライマーラベリングキット（宝酒造社製）により32Ｐ標識した、上述のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領域に相当する０．７ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを加えて、４２℃にて一晩反応させた。２倍のＳＳＣ溶液で２回洗浄し、更に０．１％ＳＤＳを含む２倍のＳＳＣ溶液で１回洗浄後、バイオイメージアナライザー（富士フィルム社製）にて、32Ｐ標識したＤＮＡフラグメントの結合量を計測し、結合量の高いクローン、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｍＲＮＡの発現量の高いクローンを得た。
【００５２】
このようにして得られた可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞からの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の調製は以下のようにして行った。まず、該細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにより培養し、コンフルエントとなった時点で、２％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへと交換し、更に３日間培養した。その培養上清５リットルを、あらかじめ作製しておいたＴＵＧｈ４抗体（Int. Immunol.、６巻、１２７３頁、１９９４年）結合セファロースカラム（ビーズ１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）にかけ、ＰＢＳにて洗浄後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出した。溶出液をＰＢＳに対して４℃にて一晩透析し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を得た。約４リットルから約５００μｇの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度と分子量を確認したところ、約４５ｋｄの単一バンドであった。
【００５３】
（実施例４、ヒトＩＬ−２存在下における可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子複合体形成の確認）
【００５４】
▲１▼可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の125Ｉ標識
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の125Ｉ標識は、ボルトンハンター法により行った。０．１Ｍほう酸バッファー（ｐＨ８．５）に対して透析した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子（１００μｇ／ｍｌ）溶液２０μｌをボルトンハンター試薬（１８．５ＭＢｑ、デュポン社製）に加え、氷中１５分間反応させた。更に、０．２Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．５）を４７５μｌ加え、氷中５分間反応させた。125Ｉ標識体の分離は、０．５％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで平衡化しておいたＧ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて行った。作製した125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の比放射活性は、３０，０００ｃｐｍ／ｎｇであった。
【００５５】
▲２▼ヒトＩＬ−２存在下における可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子複合体形成の確認
５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子溶液（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子溶液（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子溶液（１７０，０００ｃｐｍ）、及び５０μｌのヒトＩＬ−２溶液（１００μｇ／ｍｌ）とを混合し、室温にて１時間反応させた。反応終了後、約５０μｌのＡＧ１４抗体（特願平６−８２８３６、本抗体産生ハイブリドーマは、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４８として微工研に寄託されている）結合セファロースビーズを加えて、室温にて４時間反応させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液にてセファロースビーズを遠心洗浄し、セファロースビーズに結合した放射活性をγカウンター（パッカード社製）により測定した。
【００５６】
その結果、図４に示すように、ヒトＩＬ−２と可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子と可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体結合セファロースビーズに結合したが、ヒトＩＬ−２、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖の分子何れか一つでも欠けた場合には、125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体結合セファロースビーズに結合しなかった。このことより、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−２存在下でのみ、四者の複合体を形成することが初めて明らかとなった。
【００５７】
（実施例５、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のヒトＩＬ−２活性阻害能の検定）
【００５８】
（１）マウスＴ細胞株、ＣＴＬＬ−２のヒトＩＬ−２依存性増殖の阻害
９６穴平底プレート（コーニング社製）に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター溶液１００μｌ（それぞれの最終濃度は１２．５μｇ／ｍｌ）と、１０％ＦＣＳ、及び５Ｘ１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩにより３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液５０μｌを混合し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて３０分間反応させた。その後、同培地により８Ｘ１０4個／ｍｌに調製したＣＴＬＬ−２細胞液５０μｌを加え、３７℃にて２０時間培養した。培養後同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度に調製した3Ｈ−チミジン溶液（デュポン社製）を５０μｌ加え、３７℃にて４時間反応させた。反応終了後、細胞をハーベストし、細胞に取り込まれた放射活性をβカウンター（マトリックス９６、パッカード社製）により測定した。
【００５９】
その結果、図５に示すように、何れの可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加えた場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであったが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩＬ−２活性が著しく阻害された。
【００６０】
（２）ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのヒトＩＬ−２依存性増殖の阻害
ヘパリン加採血したヒト血液より、フィコールパック（ファルマシア社製）によりＰＢＬを分離した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＰＢＬを５Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に調製し（５０ｍｌ）、ＰＨＡ（ギブコＢＲＬ社製）を加え、３７℃にて２４時間培養した。更に、最終濃度で１，０００ユニット／ｍｌの濃度となるように、ヒトリコンビナントＩＬ−２を加えて、３７℃にて５日間培養した。細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄後、同培地にて６時間培養した。
【００６１】
このようにして調製したＰＨＡ刺激ＰＢＬを、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、４Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に調製し、細胞液５０μｌ（２Ｘ１０4個）に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター溶液を１００μｌ加え（それぞれの最終濃度は１２．５μｇ／ｍｌ）、３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、同培地にて３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２を５０μｌ加え、３７℃にて２日間培養した。その後、同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度に調製した3Ｈ−チミジン溶液（デュポン社製）を５０μｌ加え、３７℃にて６時間反応させた。反応終了後、細胞をハーベストし、細胞に取り込まれた放射活性（3Ｈ−チミジン量）を、βカウンター（マトリックス９６、パッカード社製）にて測定した。
【００６２】
その結果、図６に示すように、何れの可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加えた場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであったが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩＬ−２活性が著しく阻害された。
これらの結果より、本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤は、免疫抑制剤として有用であることが示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤は、ＩＬ−２と複合体を形成し、ＩＬ−２の作用を抑制する活性を有しており、ＩＬ−２の過剰産生、あるいはＩＬ−２に対し過剰反応を起こすことが原因となっている疾患、例えば臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に対して有効であり、かつ副作用がなく、頻回投与が可能な薬剤として有用である。
【００６４】
【配列表】
【００６５】
【００６６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳの構築工程を示す図面である。
【図２】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．βの構築工程を示す図面である。
【図３】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドＢＣＭＧＳＮｅｏ（ｓｏｌＩＬ２Ｒγ）の構築工程を示す図面である。
【図４】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ＩＬ−２存在下で複合体を形成することを示す図面である。
【図５】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
【図６】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのＩＬ−２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性ヒトインターロイキン２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤に関する。
本免疫抑制剤は、インターロイキン２（以下、ＩＬ−２と称する）の生物活性を効果的に阻害する作用を有しており、ＩＬ−２の過剰産生が原因となっている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効である。
【０００２】
【従来の技術】
臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制できるかにかかってきている。拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカプトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果が弱いことなどにより、移植臓器の拒絶反応を抑制することができず、移植臓器の生着率の著しい向上はみられなかった。
【０００３】
その後、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６の登場により、生着率は格段の向上をみられるようになった。しかしながら、サイクロスポリンＡやＦＫ５０６には重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用の制限が与儀なくされてきており、より安全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。
【０００４】
さて、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握ると考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あるいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２などにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与していることが示されている。
【０００５】
また、自己免疫疾患は生体内での免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することにより発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−２を中心とする免疫系因子の過剰産生、あるいはそれらの因子に対する過剰反応がその一因となっていると考えられている。従って、ＩＬ−２の作用を選択的、かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるものと考えられるようになった。
【０００６】
実際、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害する活性を有する抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体を、マウスにおける心移植や（J. Exp. Med.、１６２巻、３５８頁、１９８５年）、サルにおける腎臓移植の際に投与すると拒絶反応が抑制されること（Transplantation、４７巻、５５頁、１９８９年）が報告され、更にその後、ヒトの腎臓移植患者での臨床試験において抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体の有効性が確認された（N. Engl. J. Med.、３２２巻、１１７５頁、１９９０年；Transplantation、５１巻、１０７頁、１９９１年）。
【０００７】
しかし、この臨床試験においては、投与した抗体がマウス由来の蛋白であるため、投与した抗体に対する免疫反応が生じ、抗体に対する抗体の産生が確認された。従って、抗体投与を繰り返し行うと更に強い免疫反応が惹起され、アレルギーが発症する可能性が高い。また、投与した抗体と抗体に対する抗体とが複合体を形成することにより分解を受けやすくなり、抗体の効果が激減する可能性も高く、副作用、及び効果の両面から、抗体の頻回投与は難しいと考えられている。しかし、少なくともＩＬ−２の作用を選択的に抑制することで、効果的な免疫抑制を行うことができることが強く示唆されていることから、副作用が少なく、かつ効果的にＩＬ−２の作用を抑制できる薬剤は、有効な免疫抑制剤となるものと考えられ、開発が望まれている。
【０００８】
さて、ＩＬ−２は、細胞表面上に発現するＩＬ−２レセプターに結合して機能が発現する。ＩＬ−２レセプターは、α鎖、β鎖、γ鎖の３つの分子より構成されることが知られており。各鎖の遺伝子を導入したトランスフェクタントを用いた実験により、α鎖とβ鎖とγ鎖をすべて発現する細胞にはＩＬ−２がｋｄ＝１０-11Ｍで、α鎖とβ鎖を発現する細胞にはｋｄ＝１０-10Ｍで、β鎖とγ鎖を発現する細胞にはＫｄ＝１０-9Ｍで、α鎖のみ、あるいはα鎖とγ鎖を発現する細胞にはｋｄ＝１０-8Ｍでそれぞれ結合し、β鎖のみ、あるいはγ鎖のみ発現する細胞にはＩＬ−２は殆ど結合しないことが明らかとなった（Cell、73巻、５頁、１９９３年）。
【０００９】
ＩＬ−２レセプターα鎖分子は、細胞膜貫通領域と細胞内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液中に存在することが知られ、ヒト成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者等で高値となることが知られている（Jpn. J. Cancer Res.、７９巻、５９３頁、１９８８年）。この可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、ＩＬ−２に結合する活性を有し、ＩＬ−２の活性を阻害する活性を有していることがリコンビナント体を用いた実験で明らかとなった（Immunol. Let.、１９巻、２９９頁、１９８８年）。可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、元来ヒトの生体内に存在する分子であることから、ヒトに投与した場合抗体が産生される可能性は少なく、安全な薬剤と考えられ、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が免疫抑制剤として応用できる可能性が示唆されたが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子のＩＬ−２活性阻害能は極めて弱いことから、実際にヒトに応用することは困難であり、現在まで臨床応用されていない。
【００１０】
一方、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及びＩＬ−２レセプターγ鎖分子も、細胞膜貫通領域と細胞内領域を欠落した可溶体として、ヒト体液中に存在することが知られ、特定の疾患で高い値となることが明らかとなっているが（特開平６−２０１６９３、特願平６−３０１８３７）、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、リコンビナント体を用いた実験により、それぞれＩＬ−２に結合する活性は殆ど有しておらず、ＩＬ−２活性の阻害能も有していないことが明らかとなり、免疫抑制剤として応用することはできないと考えられていた。
従って、ヒトに投与した場合、免疫反応を惹起しない、副作用が少なく安全で、かつ効果的にＩＬ−２の作用を抑制できる薬剤は現在まで知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＩＬ−２の作用を効果的に抑制する活性を有し、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患の治療に対して有効であり、かつ副作用がなく頻回投与が可能な免疫抑制剤を提供することである。
【００１２】
【課題を解決する為の手段】
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子がヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成することを世界で初めて見いだした。そして可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を混合すると、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子単独のＩＬ−２活性阻害能に比較して、約５０倍の阻害能を有することを見いだし、本願発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤である。本発明に従えば、ＩＬ−２の作用を効果的に阻害し、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患の治療に対して有効で、かつ副作用がなく頻回投与が可能な免疫抑制剤が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明に使用される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、それぞれの分子をコードするｃＤＮＡを適当なベクタープラスミドに挿入し、適当な宿主に導入して形質転換させたとき、この形質転換株によって生産され培地中に分泌されるような性質を有するものをいう。
具体的には、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ｇｌｕ）から数えて少なくとも２２０番目（Ｖａｌ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ａｌａ）から数えて少なくとも２１３番目（Ａｓｐ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の場合には、Ｎ末端アミノ酸（Ｌｅｕ）から数えて少なくとも２２８番目（Ｔｈｒ）以降のポリペプチド部分が欠失した細胞膜外領域をいい、それぞれのレセプター分子の、疎水性の高い細胞膜貫通領域、及び細胞内領域を除去することにより水溶性を著しく向上させていることを特徴としている。それぞれの分子のアミノ酸配列は配列表の１、２、及び３に記載されている。
【００１５】
本願発明の免疫抑制剤に含有される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、以下のような方法により製造することができる。すなわち、適当なプロモーター配列の下流に、発現可能となるように、それぞれの蛋白分子をコードする遺伝子を配置し、宿主細胞内で増殖できるベクターＤＮＡに組み込み、Ｌ細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞に導入して形質転換、又はエシェリヒア属微生物等に導入し、その形質転換細胞、又は形質導入したエシェリヒア属微生物を培養することにより製造することができる。具体的な製造方法を以下に記す。
【００１６】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、特開昭６２−２４６５９８号明細書記載の方法等により製造することができる。以下にその方法につき説明する。
プラスミドｐＫＣＲＴａｃ２（Nature、３１１巻、６３１頁、１９８４年）のＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡのＡａｔII制限酵素部位に５’端をリン酸化した第１図に示す合成ＤＮＡ（ａ）を挿入することにより、ＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡのスレオニン（Ｎ末端より２１１番目）に相当するコドン（ＡＣＧ）のすぐ後に終止コドンＴＧＡを配置する。そしてＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの下流に開始コドンＡＴＧ、シグナルペプチドをコードする遺伝子、そして可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを配置することによりｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳが構築できる（第１図参照）。
この場合、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを調製するために、適当なプライマーＤＮＡを作成し、ＰＣＲ法により調製しても差し支えないし、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター以外のプロモーターを用いても構わない。また、発現可能である限り、如何なる発現ベクターを用いても構わない。
【００１７】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換するには、以下に示す通常よく用いられる形質転換法がある。宿主細胞がＬ細胞の場合、ＤＮＡをリン酸カルシウム沈澱として感染させる方法、マイクロインジェクション法、赤血球細胞若しくははリボソームにプラスミドを包括して挿入する方法、リボフォスファチジルコリンのような試薬による細胞の処理法、又はウィルスベクターを用いる方法などがある。形質転換する宿主細胞としては、Ｌ細胞以外にも、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウスＢａｌｂ３Ｔ３細胞や、ハムスターＣＨＯ細胞などを用いることができる。
【００１８】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を組み込んで形質転換したマウス細胞より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白を製造する方法は一般的に行われている付着細胞の培養方法に従えばよい。即ち、３７℃、５％炭酸ガス通気中、組織培養フラスコを使用し培養することができる。培地は通常組織培養で用いられている合成培地でよい。例えば、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地などがある。これらの培地を実際使用する場合は、１０％ウシ胎児血清アルブミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ3を添加することが望ましい。
【００１９】
当該マウスＬ細胞を用い培養することによって生産される可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白量は経時的に変化する。効率よく可溶性ヒトＩＬ−２レセプター蛋白を生産するには以下の方法に従って行えば良い。即ち、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍｇ／ｍｌＮａＨＣＯ3含有）を用い、細胞密度１Ｘ１０5／ｍｌで培養を開始し、４〜５日後に細胞がコンフルエントになったら培養上清を回収し、さらに新鮮培地を添加し、３〜４日培養を続行する。培養終了後、培地を回収して可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白の生産量を定量すると、前半及び後半の培養でほぼ同量の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白が生産されている。
【００２０】
この様にして得られた当該マウスＬ細胞の培養上清より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は、ヒトＩＬ−２を固定化したカラム、例えばヒトＩＬ−２セファローズ４Ｂ、又は抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体であるＭ−Ａ２５１（ファーミンジェン社製）セファローズ４Ｂを用いたアフィニテイクロマトグラフィーで精製することができる。更に高純度に分離精製するには、ＯＤＳカラム（Octa decyl silane)を用いた逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて行えばよい。このようにして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターα鎖蛋白分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖は、分子量が約４２Ｋｄの蛋白である。
【００２１】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子は、特開平３−６７５８８明細書記載の方法等に準じて製造することができる。以下にその方法につき説明する。
ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬ−２Ｒβ３０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１頁、１９８９年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、β鎖の全コード配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得る。ＢｓｓＨII末端をブラント化した後、１．９ＫｂｃＤＮＡをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン社製）のＳｍａＩ制限部位に挿入する。次に、このｐブルースクリプトＳＫ−β１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａＩで消化して、細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除く。次に終止コドン（ＴＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む１２塩基長の合成リンカー（ニューイングランドバイオラブ社製、＃１０６０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＳｔｙＩ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤＮＡにライゲーションする。ＮｈｅＩで消化して過剰のリンカーを除いた後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂プラスミドＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．βが構築できる。
【００２２】
このｐブルースクリプトＳＸ−ＳｏＩ．βをＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤＮＡ断片を単離する。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化物に導入し発現ラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−ＳｏＩ．βが構築できる（第２図参照）。
【００２３】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換するには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞がエシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合と同様の方法により作製することができる。
【００２４】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を製造する方法は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体であるＴＵ２７（ベクトンディッキンソン社製）セファローズ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。更に高純度に分離精製するには、逆相ＨＰＬＣを用いて行えばよい。
このようにして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子は、分子量が約３７ｋｄの蛋白である。
【００２５】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、特開平４−１０４９４７明細書記載の方法等に準じて製造することができる。以下にその方法につき説明する。
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型として、プライマーとして、ＸｈｏＩ制限酵素サイトを含む５’側センスプライマー（5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGAAGCCAT-3', 29mer）とＨｉｎｄIII制限酵素サイトと、ｓｔｏｐコドンを含む３’側アンチセンスプライマー（5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3', 29mer）を用いてＰＣＲを行うことにより、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。得られた遺伝子をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断後、同じくＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社製）に組み込み、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断する。その後、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したＢＣＭＧｎｅｏベクターに組み込む（J. Exp. Med.、１６９巻、１３頁、１９８９年）。このようにして可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を有する発現ベクターが構築できる（第３図参照）。
【００２６】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換するには、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を有するベクターＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する方法と同様に行うことができる。また、宿主細胞がエシェリヒア属微生物の場合にも、上述の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖遺伝子を含む発現ベクターの場合と同様の方法により作製することができる。
【００２７】
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖遺伝子を組み込んで形質転換したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞より可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を製造する方法は、上述のように一般的に行われている付着細胞の培養方法に従えばよい。培養上清から可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体を固定化したカラム、例えば抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体であるＴＵＧｈ４（Int. Immunol.、６巻、１２７３頁、１９９４年）セファローズ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。更に高純度に分離精製するには、逆相ＨＰＬＣを用いて行えばよい。
このようにして得られた細胞膜、及び細胞内領域を欠いたヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、分子量が約４５ｋｄの蛋白である。
【００２８】
次に、以上のようにして製造した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成しうることを説明する。
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を125Ｉにより標識し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をヒトＩＬ−２存在下、あるいは非存在下で混合した。その後、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対する抗体であるＴＵＧｈ４を固相化したセファローズ４Ｂと反応させ、セファローズ４Ｂに結合した放射活性、すなわち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の量を測定した。その結果、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、及びヒトＩＬ−２がすべて存在したときに限り、セファローズ４Ｂに結合した放射活性が有意に高値となった。すなわち、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−２存在下で初めて四者の複合体を形成しうることが確認された。
【００２９】
次に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤が、ＩＬ−２依存性の反応を特異的に抑制することを説明する。
【００３０】
本発明者らは、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２のＩＬ−２依存性増殖、及びＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）刺激ヒト末梢血リンパ球のＩＬ−２依存性増殖の、本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤による抑制効果について検討した。何れの系においても、本願発明の薬剤を共存させることにより著しくＩＬ−２依存性の増殖が阻害された。本実験系においては、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の何れか一つでも欠けると、阻害効果が激減することから、三種の物質が全て必要不可欠であることが確認された。これまで、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子はそれぞれ単独では殆どＩＬ−２依存性反応の阻害能を有さないことが知られていたが、本願発明者らは、それらの分子が、ヒトＩＬ−２存在下で複合体を形成すること、更に、それらの分子を有効成分とする薬剤がヒトＩＬ−２の作用を抑制することを初めて明らかとし、本願発明を完成することができた。
【００３１】
本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤は、ＩＬ−２の過剰産生、又はＩＬ−２に対し過剰反応を起こすことが原因となっている疾患、例えば臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に対して有効であり、かつ副作用がなく、頻回投与が可能な免疫抑制剤として有用である。
【００３２】
本発明の免疫抑制剤は、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列を有する物質に限定されるものではなく、ＩＬ−２存在下で複合体を形成する活性を有する物質である限り本発明に含まれる。例えば、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列の一部を変換、削除、又は他のアミノ酸を付加した物質等はすべて本発明に含まれる。また、配列番号１、２、３記載のアミノ酸配列を有する物質をポリエチレングリコール等で修飾された物質も本発明に含まれる。
【００３３】
本発明の免疫抑制剤は、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をそれぞれ０．１重量％〜９９．９重量％含有すればよい。従って、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をそれぞれそのまま投与してもよいし、通常製剤用担体と混合して調製した製剤の形でも投与できる。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水、ブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤、保存剤、あるいは安定化剤を含有させてもよい。また、これらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有してもよい。
【００３４】
本発明に係わる免疫抑制剤の投与方法としては、経口、注射、直腸内など何れの方法を用いても構わないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、通常、１回０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回投与すればよい。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。尚、本発明の技術的範囲は実施例に限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の調製）
まず、ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡをＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターを含むベクターｐＫＣＲＨ２に組み込んだプラスミドPＫＣＲ・Ｔａｃ−２・Ａ（Ｎａｔｕｒｅ，３１１巻、６３１頁１９８４年）６μｇを制限酵素ＡａｔIIで部分分解し、約６．５キロベース（ｋｂ）の直鎖状プラスミドの断片をアガロ−スゲル電気泳動により分離回収した。回収された該断片は１μｇであった。該断片を制限酵素ＢａｍＨＩで分解し、アガロース電気泳動により０．３５μｇの５．４Ｋｂ断片と０．０７μｇの１．１ｋｂ断片を分離回収した。5'-GAGATCTCACGT-3'の配列をもつオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステム社製３８０Ａ型）により合成し、逆相ＨＰＬＣにて精製後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’側をリン酸化した。５．４ｋｂ断片および１．１ｋｂ断片各々０．０４ピコモルと上記１２個の配列をもつオリゴヌクレオチド０．１６ピコモルを１０μｌの反応液中で１５℃、１時間、その後１００μｌに希釈し、さらに１５℃にて１２時間Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼにより結合させた。
【００３７】
次に、この反応液１０μｌを用い常法によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換せしめ、約２５０個のアンピシリン抵抗性株を得た。この中から任意に１２個を選び、そのプラスミドＤＮＡを抽出し、▲１▼プラスミドの大きさが約６．５ｋｂであること、▲２▼制限酵素ＡａｔII 切断部分が一つになっていること、３１２個のオリゴヌクレオチドに由来する制限酵素ＢｇｌII切断部位がもとの制限酵素ＡａｔII切断部位に存在すること、の３点を満足するプラスミドで形質転換された形質転換株を５株得た。該形質転換株中のプラスミドの塩基配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,７４巻，５４６３頁、１９７７年）により調べ、ｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳの塩基配列をもつことを確認した（図１）。
【００３８】
更に、この様にして得た形質転換株からｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳプラスミドを塩化セシウム平衡遠心法によりマウスＬ細胞（ｔｋ-変異株）にトランスフェクションした。
すなわち１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イ−グル培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌに懸濁したＬ細胞１Ｘ１０5個をファルコン３００３シャ−レに入れ、３７℃、５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて２０時間培養した。その後、同培地１０ｍｌにて培地交換し、同条件で４時間培養した。
【００３９】
培養後、Ａ液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）０．５ｍｌと、Ｂ液（２ＭＣａＣｌ2、１０μｇｐＫＣＲＩＲ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳ、１μｇｐＢＲ３２２、ｈｅｒｐｅｓＴｋ）０．５ｍｌを添加し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて１２時間培養した。ＴＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＫＣｌ、５．６ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で洗浄し、２．５％グリセロ−ル含有ＴＢＳ溶液にて３分間処理した。処理後直ちにＴＢＳで洗浄し、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ１０ｍｌを加え、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日間培養した。その後、ＨＡＴ培地（１３．６ｍｇ／ｌヒポキサチン、３．８８ｍｇ／ｌチミジン、０．１７６ｍｇ／ｌアミノプテリンおよび１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ）１０ｍｌに培地交換し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて２日間培養した。この培地交換を以後２日毎に行った。
【００４０】
１４日目にはシャーレ当り１２個のコロニーが出現した。この様にして出現した各コロニーを９６穴マイクロプレートに移し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター内にて培養し、コンフルエントになったらさらに２日間培養した。各コロニーの培養上清中の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を以下に述べる方法により同定した。その結果ＢＴＭＬＥＳＳ−Ｑを得た。
【００４１】
多数のヒトＩＬ−２レセプターα鎖を膜表面に表現しているＡＴＬ由来細胞株ＭＴ−１細胞はモノクローナル抗ヒトＩＬ−２レセプターα鎖抗体（抗Ｔａｃ抗体）と補体で処理すると殺すことができる。そこで可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子含有標本と抗体とを反応させ、この後ＭＴ−１細胞を加えさらに補体で処理する。もしこの標本中に可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が存在すれば抗体と結合し、ＭＴ−１細胞と反応する抗体が減少し、その結果ＭＴ−１細胞は補体で処しても死ななくなる。この原理によりごく微量（約０．１ｎｇ）の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子を同定することができる。具体的な可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の同定方法は、まず９６穴Ｕ底マイクロプレ−ト中で標品１０μｌまたはこれを１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したもの１０μｌと、同培地に溶解した１．６ｎｇ抗Ｔａｃ抗体溶液１０μｌをよく混合し、０℃で３０分間放置する。そして上記培地に懸濁した５Ｘ１０5個／ｍｌのＭＴ−１細胞２０μｌを加え、混合後０℃で３０分間放置する。８００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を捨て補体（ウサギ新生児血清を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１５倍希釈したもの）２０μｌを加え、混合後３７℃で３０分間放置する。そして０．５％トリパンブル−含有ＰＢＳ溶液２０μｌを加え、２００細胞中の死細胞数を計測する方法である。
【００４２】
この様にして産生した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は−２０℃にて凍結保存することができ、また限外濾過（例えばセントリコン１０）により濃縮してもその性状は変わらない。さらにヒトＩＬ−２カラムに結合させることができる。即ち、セントリコン１０にて１０倍濃縮した標品１００μｌをヒトＩＬ−２セファローズ４Ｂ（リコンビナントヒトＩＬ−２を２００μｇ含有）カラムに吸着せしめ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出すると可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が溶出されてくるため、この溶出画分を直ちに１Ｍトリスベースにて中和する。かくして得られた可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子はＭＴ−１細胞の抗Ｔａｃ抗体と補体による殺作用効果を阻害した。また、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討したところ、分子量約４２Ｋｄであった。
【００４３】
（実施例２、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子の調製）
ＣＤＭ８ベクター中２．３ｋｂのヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＬ−２Ｒβ３０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、５５１頁、１９８９年）をＢｓｓＨII及びＳｍａＩで消化し、β鎖の全コード配列を含む１．９ＫｂｃＤＮＡ断片を得た。ＢｓｓＨII末端をブラント化した後、１．９ＫｂｃＤＮＡをｐブルースクリプトＳＫベクター（ストラタジーン社製）のＳｍａＩ制限部位に挿入した。
【００４４】
次に、このｐブルースクリプトＳＫ−β１．９プラスミドをＳｔｙＩ及びＳｍａＩで消化して、細胞質内及び膜内領域ｃＤＮＡを除き、終止コドン（ＴＡＧ）及びＮｈｅＩ認識配列を含む１２塩基長の合成リンカー（ニューイングランドバイオラブ社製、＃１０６０）をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＳｔｙＩ／ＳｍａＩ消化したプラスミドＤＮＡにライゲーションした。ＮｈｅＩで消化して過剰のリンカーを除いた後、この両端がＮｈｅＩサイトの開裂プラスミドＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｐブルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．βを構築した。
【００４５】
このｐブルースクリプトＳＸ−Ｓｏｌ．βをＳａＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、生成した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖遺伝子を含む０．８ＫｂのｃＤＮＡ断片を単離した。このｃＤＮＡ断片をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むＢＣＭＧＮｅｏベクター（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻、１３頁、１９８９）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断物に導入し、発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．βを構築した（図２）。
【００４６】
プラスミドのトランスフェクションは、プロトプラスト法により行った。すなわち、ＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．βを含む菌をプロトプラストに変換して、マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３と、ポリエチレングリコール＃２０００（和光純薬社製）を用いて融合した。次に、１Ｘ１０5個のプロトプラスト融合ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４ウェルプレートに接種した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および７５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で２５日間培養した。そして、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、トランスフェクトした細胞の培養上清中の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子の濃度を測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡには、モノクロナール抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖抗体である、ＴＵ１１、及びＴＵ２７（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４２巻、６１頁、１９９１年）を用いて以下の方法により行った。
尚、ＴＵ１１は通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐー１３２３３である。又、ＴＵ２７は通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰー２５１０である。
【００４７】
９６ウェル平底プレート（タイターテック社製）に、１０μｇ／ｍｌの濃度に５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）により調製したＴＵ１１抗体溶液を一ウェル当たり５０μｌ加え４℃一晩コーテイングした。ＴＵ１１抗体を除去後、室温１時間、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでインキュベートすることによりブロッッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、トランスフェクタントの培養上清５０μｌをウェルに入れ、室温１時間インキュベートした。洗浄後、１μｇ／ｍｌのビチオン化ＴＵ２７抗体溶液５０μｌをウェルに加え、室温１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌのアルカリフォスファターゼ結合アビヂン（ベクター製）を加えた。室温１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのｐーニトロフェニルホスフェートを加え１５分間後に各ウェルの４０５nmにおける吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ法で最も高い吸収度を与えたウェルから、限定希釈法によりクローニングし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を高産生するクローンを得た。
【００４８】
本クローンを１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭにより培養し、コンフルエントとなった時点で、２％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへと交換し、更に３日間培養した。その培養上清５リットルを、あらかじめ作製しておいたＴＵ２７抗体結合セファロースカラム（ビーズ１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）にかけ、ＰＢＳにて洗浄後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出した。溶出液をＰＢＳに対して４℃にて一晩透析し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子を得た。約４リットルから約４００μｇの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度と分子量を確認したところ、約３７ｋｄの単一バンドであった。
【００４９】
（実施例３、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の調製）
内部にＸｈｏＩサイトを有するオリゴマー5'-GAAGAGCTCGAGCGCCATGTTGAAGCCAT-3'と内部にＨｉｎｄIIIサイトを有するオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3'をＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム社製）により合成した。両オリゴマーをプライマーとし、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型としてサーマルサイクラーを用い、TaqポリメラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、合成７２℃、２０サイクル）を行った。約０、７ｋｂの増幅されたバンドを回収して、ＸｈｏＩ（宝酒造社製）とＨｉｎｄIII（宝酒造社製）により切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社製）をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIにて切断し回収したフラグメントとライゲーションした。更に、ＸｈｏＩとＮｏｔＩ（宝酒造社製）により切断後、あらかじめＸｈｏＩとＮｏｔＩにて切断し回収したＢＣＭＧＳＮｅｏベクター（実験医学別冊、遺伝子工学ハンドブック、２９７頁、１９９１年）にライゲーションし、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子ｃＤＮＡを挿入したベクターを構築した（図３）。
【００５０】
次に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞へ該ベクターの導入をリン酸カルシウム沈殿法（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、Current Protcols in Molecular Biology、９章、１９８７年）により行った。
まず、１Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに懸濁したＮＩＨ３Ｔ３細胞液を、１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）１枚当たり１０ｍｌ入れ、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃、一晩培養した。培養上清を捨て、新たに１０％ウシ胎児血清（バイオセル社製）を含むＤ−ＭＥＭ（日研生物医学社製）を９ｍｌ加え、更にＣＯ2インキュベーターにて３７℃、２時間培養した。上述の方法により調製したベクターＤＮＡ３０μｇを１３５０μｌの水に溶解し、２．５Ｍの塩化カルシウムを１５０μｌ加え、１．５ｍｌの２８０ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭリン酸一水素二ナトリウムを含む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．０５）を入れたチューブに滴下した。直ちに混合後、室温にて２０分間放置し沈殿を形成させた。次にパスツールピペットにより沈殿を懸濁し、細胞を培養しているシャーレに１枚当たり１ｍｌずつ添加した。４時間培養した後、培養上清を捨て、１０％グリセロールを含むＤ−ＭＥＭを２ｍｌ加えて室温３分間放置した。ＰＢＳを５ｍｌ加えて希釈し、ＰＢＳにて２回洗浄後、１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭを１０ｍｌ加えて、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて３日間培養した。
【００５１】
その後、培地を３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコＢＲＬ社製）、及び１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに換え培養を継続し、形成されたコロニーをそれぞれ分離しクローンを得た。
それぞれのクローンを培養し、約１ｘ１０6個の細胞よりアイソジェン（ニッポンジーン社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを調製して、ドットブロット装置（バイオラッド社製）を用いてナイロン膜（ミクロンセパレーション社製）にブロットした。ブロットした膜を５０％ホルムアミド、５倍デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、５倍ＳＳＰＥ液に浸し、あらかじめランダムプライマーラベリングキット（宝酒造社製）により32Ｐ標識した、上述のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領域に相当する０．７ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを加えて、４２℃にて一晩反応させた。２倍のＳＳＣ溶液で２回洗浄し、更に０．１％ＳＤＳを含む２倍のＳＳＣ溶液で１回洗浄後、バイオイメージアナライザー（富士フィルム社製）にて、32Ｐ標識したＤＮＡフラグメントの結合量を計測し、結合量の高いクローン、すなわち可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｍＲＮＡの発現量の高いクローンを得た。
【００５２】
このようにして得られた可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞からの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の調製は以下のようにして行った。まず、該細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにより培養し、コンフルエントとなった時点で、２％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭへと交換し、更に３日間培養した。その培養上清５リットルを、あらかじめ作製しておいたＴＵＧｈ４抗体（Int. Immunol.、６巻、１２７３頁、１９９４年）結合セファロースカラム（ビーズ１ｍｌ当たり抗体２ｍｇ結合）にかけ、ＰＢＳにて洗浄後、３ＭＮａＳＣＮにより溶出した。溶出液をＰＢＳに対して４℃にて一晩透析し、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を得た。約４リットルから約５００μｇの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製度と分子量を確認したところ、約４５ｋｄの単一バンドであった。
【００５３】
（実施例４、ヒトＩＬ−２存在下における可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子複合体形成の確認）
【００５４】
▲１▼可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の125Ｉ標識
可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の125Ｉ標識は、ボルトンハンター法により行った。０．１Ｍほう酸バッファー（ｐＨ８．５）に対して透析した可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子（１００μｇ／ｍｌ）溶液２０μｌをボルトンハンター試薬（１８．５ＭＢｑ、デュポン社製）に加え、氷中１５分間反応させた。更に、０．２Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．５）を４７５μｌ加え、氷中５分間反応させた。125Ｉ標識体の分離は、０．５％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで平衡化しておいたＧ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて行った。作製した125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子の比放射活性は、３０，０００ｃｐｍ／ｎｇであった。
【００５５】
▲２▼ヒトＩＬ−２存在下における可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子複合体形成の確認
５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子溶液（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子溶液（５０μｇ／ｍｌ）、５０μｌの125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子溶液（１７０，０００ｃｐｍ）、及び５０μｌのヒトＩＬ−２溶液（１００μｇ／ｍｌ）とを混合し、室温にて１時間反応させた。反応終了後、約５０μｌのＡＧ１４抗体（特願平６−８２８３６、本抗体産生ハイブリドーマは、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４８として微工研に寄託されている）結合セファロースビーズを加えて、室温にて４時間反応させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液にてセファロースビーズを遠心洗浄し、セファロースビーズに結合した放射活性をγカウンター（パッカード社製）により測定した。
【００５６】
その結果、図４に示すように、ヒトＩＬ−２と可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子と可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子が抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体結合セファロースビーズに結合したが、ヒトＩＬ−２、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖の分子何れか一つでも欠けた場合には、125Ｉ標識可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子は抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体結合セファロースビーズに結合しなかった。このことより、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ヒトＩＬ−２存在下でのみ、四者の複合体を形成することが初めて明らかとなった。
【００５７】
（実施例５、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子のヒトＩＬ−２活性阻害能の検定）
【００５８】
（１）マウスＴ細胞株、ＣＴＬＬ−２のヒトＩＬ−２依存性増殖の阻害
９６穴平底プレート（コーニング社製）に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター溶液１００μｌ（それぞれの最終濃度は１２．５μｇ／ｍｌ）と、１０％ＦＣＳ、及び５Ｘ１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩにより３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液５０μｌを混合し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて３０分間反応させた。その後、同培地により８Ｘ１０4個／ｍｌに調製したＣＴＬＬ−２細胞液５０μｌを加え、３７℃にて２０時間培養した。培養後同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度に調製した3Ｈ−チミジン溶液（デュポン社製）を５０μｌ加え、３７℃にて４時間反応させた。反応終了後、細胞をハーベストし、細胞に取り込まれた放射活性をβカウンター（マトリックス９６、パッカード社製）により測定した。
【００５９】
その結果、図５に示すように、何れの可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加えた場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであったが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩＬ−２活性が著しく阻害された。
【００６０】
（２）ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのヒトＩＬ−２依存性増殖の阻害
ヘパリン加採血したヒト血液より、フィコールパック（ファルマシア社製）によりＰＢＬを分離した。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＰＢＬを５Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に調製し（５０ｍｌ）、ＰＨＡ（ギブコＢＲＬ社製）を加え、３７℃にて２４時間培養した。更に、最終濃度で１，０００ユニット／ｍｌの濃度となるように、ヒトリコンビナントＩＬ−２を加えて、３７℃にて５日間培養した。細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄後、同培地にて６時間培養した。
【００６１】
このようにして調製したＰＨＡ刺激ＰＢＬを、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、４Ｘ１０5個／ｍｌの濃度に調製し、細胞液５０μｌ（２Ｘ１０4個）に、可溶性ヒトＩＬ−２レセプター溶液を１００μｌ加え（それぞれの最終濃度は１２．５μｇ／ｍｌ）、３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、同培地にて３．１３ｕ／ｍｌの濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２を５０μｌ加え、３７℃にて２日間培養した。その後、同培地にて２０μＣｉ／ｍｌの濃度に調製した3Ｈ−チミジン溶液（デュポン社製）を５０μｌ加え、３７℃にて６時間反応させた。反応終了後、細胞をハーベストし、細胞に取り込まれた放射活性（3Ｈ−チミジン量）を、βカウンター（マトリックス９６、パッカード社製）にて測定した。
【００６２】
その結果、図６に示すように、何れの可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を単独、あるいは２種の可溶性ヒトＩＬ−２レセプター分子を組み合わせて加えた場合のヒトＩＬ−２活性の阻害能は極弱いものであったが、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をすべて加えた場合には、ヒトＩＬ−２活性が著しく阻害された。
これらの結果より、本願発明の可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする薬剤は、免疫抑制剤として有用であることが示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤は、ＩＬ−２と複合体を形成し、ＩＬ−２の作用を抑制する活性を有しており、ＩＬ−２の過剰産生、あるいはＩＬ−２に対し過剰反応を起こすことが原因となっている疾患、例えば臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に対して有効であり、かつ副作用がなく、頻回投与が可能な薬剤として有用である。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドｐＫＣＲＩＬ２Ｒ ＢＴＭＬＥＳＳの構築工程を示す図面である。
【図２】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドＢＣＭＧＮｅｏ−Ｓｏｌ．βの構築工程を示す図面である。
【図３】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドＢＣＭＧＳＮｅｏ（ｓｏｌＩＬ２Ｒγ）の構築工程を示す図面である。
【図４】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ＩＬ−２存在下で複合体を形成することを示す図面である。
【図５】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
【図６】 可溶性ヒトＩＬ−２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子、可溶性ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が、ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのＩＬ−２依存性増殖を阻害することを示す図面である。
Claims (4)
- 可溶性ヒトインターロイキン２レセプターα鎖分子、可溶性ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖分子及び可溶性ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖分子を有効成分とする免疫抑制剤。
- 可溶性ヒトインターロイキン２レセプターα鎖分子が、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の免疫抑制剤。
- 可溶性ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖分子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の免疫抑制剤。
- 可溶性ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖分子が、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の免疫抑制剤。
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