DK175810B1 - Interleukin-1 receptor - Google Patents

Description

DK 175810 B1

Den foreliggende opfindelse angår lnterleukin-1 Reæptor (IL-1R).

Interleukin-1a og lnterleukin-1 β (IL-1 nr. on II -ΐβ) er fjernt hesleanterle polypeptidhormoner, der spiller en central rolle ved reguleringen af immun- og inflammatoriske responser. Disse to proteiner blev oprindeligt begge klassificeret som IL-1 5 på grundlag af en fælles lymfocytaktiveringsfaktor (LAF) aktivitet og en fælles hoved-cellekilde, aktiverede makrofager. De samlede informationer fra undersøgelser, hvor der blev anvendt rensede naturlige og rekombinante IL-1 molekyler, har gjort det klart, at IL-1a og IL-1 β hver især medierer de fleste, om ikke alle, af det brede spektrum af aktiviteter, der tidligere blev tilskrevet IL-1. Grundlaget for dette næsten identiske 10 spektrum af biologiske aktiviteter antages at være en enkelt klasse plasmamembran IL-1 receptorer, der binder både IL-1 α og IL-1 β.

Der er tidligere blevet publiceret nogle få foreløbige rapporter vedrørende eksistensen af en IL-1 plasmamembranreceptor. Hidtil har strukturel karakterisering af lnterleukin-1 receptoren været begrænset til bestemmelser af molekylvægten af dette 15 protein ved gelfiltrering, ved SDS-PAGE analyse af covalente komplekser dannet ved kemisk tværbinding mellem receptoren og 125I-IL-1 molekyler og ved immunpræcipi-tering af mærkede overfladeproteiner.

Dover et al. (j. Exp. Med. 162:501,1985) og Dover et al. (Proc. Natl. A-cad. Sci. USA 83:1060,1986) beskriver kemiske tværbindingsundersøgelser, der viser 20 et tilsyneladende 79.5 kilodalton (kDa) plasmamembranprotein på LBRM-33-1A5 murine T-lymfomaceller og et overfladeprotein på 78 kDa på en murin fibroblastcellelinie, der bandt 1251-mærket human lnterleukin-1 β. Kilian et al. (J. Immunol. 136:4509, 1986) rapporterede, at murin 125l-IL-1a, der binder til murine thymomaceller, kunne blive blokeret med human IL-1a og IL-Ιβ. Dover et al. (Nature 324:266,1986) rappor-! 25 terede kompetitive bindingsundersøgelser, der viste, at IL-1 α og IL-1 β bandt til de samme celleoverfladereceptorer på LBRM-33-1 A5 celler, humane dermale fibrobla-ster, murine BALB-3T3 celler samt ARH77, en human B-lymfoblastoidcellelinie. Receptorerne i de forskellige cellelinier udviste lignende, men ikke identiske bindingskarakteristika. Det blev påvist, at IL-1 receptorerne på porcine synoviale fibroblaster (Bird 30 et al., Nature 324:263,1986) og humane dermale fibroblaster (Chin et al., J. Exp. Med.

165:70,1987) giver en hovedart i størrelsesområdet Mr 97.000-100.000, når de tværbindes med mærket IL-7, hvilket lader formode, at et protein med Mr 80.000 var ansvarligt for binding af IL-1.1 modsætning hertil udviste IL-1 receptorer, der på denne måde blev karakteriseret på humane B-celler (Matsushima et al., J. Immunol.

35 136:4496,1986), en tilsyneladende molekylvægt på 60.000.

I DK 175810 B1 I

I I

I Bron og MacDonald, FEBS Letters 219:365 (1987) beskriver immun- I

præcipitering af murin IL-1 receptor fra overfldemærkede EL-4 celler under anvendel- I

I se af et polyklonalt kaninantiserum rettet mod IL-1. Dette arbejde viser, at den murine

I receptor er et glycoprotein med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 82.000 dalton. I

I 5 Radiomærket IL-1 er blevet anvendt i kemiske tværbindingsunder- I

I søgelser og til påvisning af receptor i detergentekstrakter af celler. Resultaterne af I

disse ovenfor anførte forsøg lader formode, at et protein med Mr 60.000 eller 80.000 I

I er ansvarligt for binding af IL-1. Tværbindingen af radiomærket IL-1 til celler har også

I ført til den lejlighedsvise påvisning af proteiner, som adskiller sig fra hovedarten med I

I 10 Mr 80.000, hvilket lader formode, at IL-1 bindingsmolekylet kan forekomme i membra-

nen som del af et multi-underenhedsreceptorkompleks. I

I Til undersøgelse af strukturen og de biologiske egenskaber af IL-1 re- I

I ceptorer og den rolle, IL-1 receptorer spiller for responserne af forskellige cellepopula- I

I tioner over for IL-1 stimulering, eller den effektive anvendelse af IL-1 receptorer til te- I

15 rapi, diagnose eller analyse, er der brug for homogene IL-1 receptorsammensætnin-

ger. Sådanne sammensætninger er teoretisk tilgængelige via oprensning af solubilise- I

I rede receptorer, der udtrykkes af dyrkede celler, eller ved kloning og ekspression af I

I gener, der indkoder receptorerne. Hidtil har flere forhindringer imidlertid stået i vejen I

I for opnåelsen af disse mål. I

20 Selv i cellelinier, der vides at udtrykke påviselige niveauer af IL-1 recep- I

tor, ér IL-1 receptoren til stede som en meget lille komponent af de samlede cellepro- I

I teiner. Desuden kendte man ingen cellelinier, der konstitutivt og kontinuert udtrykte I

I høje niveauer af IL-1 receptorer. For eksempel udtrykker den murine EL-4 6.1 celleli- I

nie påviselige niveauer af IL-1 receptor, men niveauet af IL-1 receptorekspression har I

I 25 en tendens til at nedbrydes med tiden, hvilket i høj grad komplicerer arbejdet met at I

opnå tilstrækkelige mængder af receptor til tilvejebringelse af et anvendeligt ud- I

gangsmateriale til oprensning. Således blev der tilvejebragt en fremgangsmåde til I

fortløbende udvælgelse af celler til opnåelse af acceptable niveauer af IL-1 recepto- I

rekspression under an-vendélse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). I

I 30 Yderligere problemer opstår, når man forsøger at klone mammale gener, I

I der indkoder IL-1 receptor. Selvom der kan opnås en proteinsammensætning med I

I tilstrækkelig renhed til at tillade N-terminal proteinsekvensbestemmelse, tillader dege- I

nereringen af den genetiske kode typisk ikke, at en egnet probe defineres uden om- I

fattende yderligere forsøg. Det kan kræve mange iterative forsøg at definere en probe I

35 med den fornødne specificitet til identificering af en hybridiserende sekvens i et cDNA- I

bibliotek. For at omgå dette problem blev der udtænkt en hidtil ukendt direkte recepto- I

DK 175810 B1 3 rekspressionskloningsteknik til undgåelse af behovet for gentagen screening under anvendelse af forskellige probér af ukendt specificitet. Denne teknik, som aldria tidligere er blevet anvendt, tillader direkte visualisering af receptorekspression efter trans-fektion af en mammal cellelinie med en højekspressionsvektor indeholdende en 5 cDNA-klon, der indkoder receptoren.

Rensede IL-1 receptorsammensaetninger vil være nyttige i diagnostiske assays for IL-1 eller IL-1 receptor og ligeledes til opnåelse af antistoffer mod IL-1 receptor til anvendelse i diagnose og terapi. Desuden kan rensede IL-1 receptorsammensætninger anvendes direkte i terapi til binding eller fjernelse af IL-1, hvorved der 10 tilvejebringes en metode til regulering af immunaktiviteterne eller de inflammatoriske aktiviteter af dette cytokin.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer i det væsentlige homogene proteinsammensætninger, der omfatter human IL-1 receptor.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også sammensætninger til 15 anvendelse ved terapi af IL-1 receptor eller til tilvejebringelse af antistoffer mod IL-1 receptorer omfattende virksomme mængder af opløselige native eller rekombinante receptorproteiner fremstillet ved en egnet fremgangsmåde. En egnet fremgangsmåde til resning af IL-1 receptor omfatter tilsætning af en prøve omfattende IL-1 receptor til en affinitetsmatrix omfattende et IL-1 molekyle bundet til en uopløselig bærer og elue-20 ring af bundet IL-1 receptor fra affinitetsmatrixen. Den delvist rensede IL-1 receptor kan renses yderligere ved overførsel til en lectinaffinitetskolonne og efterfølgende elu-ering af IL-1 receptoren fra lectinaffinitetskolonnen. Den delvist rensede IL-1 receptor kan derefter behandles ved revers fase højtryksvæskekromatografi og elueres som en enkelt absorbanstop ved 280 nm, der når den analyseredes ved hjælp af SDS-PAGE ! 25 og sølvfarvning, optrådte som et enkelt bånd. Som anført ovenfor havde den native murine IL-1 receptor en tilsyneladende molekylvægt på ca. 82.000 dalton ifølge bestemmelse ved SDS-PAGE. Egnede DNA-sekvenser til udøvelse af den foreliggende fremgangsmåde består i det væsentlige af en enkelt åben læseramme nukleotidse-kvens, der indkoder en mammal lnterleukin-1 receptor (IL-1 R) eller en underenhed 30 deraf. Sådanne DNA-sekvenser udvælges fortrinsvis blandt (a) cDNA-kloner med en nukleotidsekvens afledt af kodningsområdet for et nativt IL-1 R gen, (b) DNA-sekvenser, som er i stand til at hybridisere til cDNA-kloneme af (a) under moderat strenge betingelser og som indkoder biologisk aktive IL-1 R molekyler, og (c) DNA-sekvenser, der er degenereret som resultat af den genetiske kode for de under a) og 35 (b) definerede DNA-sekvenser og indkoder biologisk aktive IL-1 R molekyler. Egnede rekombinante ekspressionsvektorer omfatter de ovenfor definerede DNA-sekvenser,

I DK 175810 B1 I

I 4 I

I rekombinante IL-1R molekyler fremstillet under anvendelse af de rekombinante eks- I

I pressionsvektorer, samt fremgangsmåder til fremstilling af de rekombinante IL-1 R I

I molekyler under anvendelse af ekspressionsvektoreme. I

I De opløselige rekombinante receptormolekyler omfatter afkortede proteiner, hvori om- I

I 5 rådeme af receptormolekylet, der ikke er nødvendige for IL-1 binding, er blevet ude- · I

I ladt. Disse og andre aspekter af opfindelsen vil fremgå af den efterfølgende detaljere- H

I de beskrivelse og tegningen. H

I Fig. 1 er et restriktionskort over cDNA-konstruktioner omfattende kod- H

I ningsområderne for de murine og humane IL-1 R gener. Det murine fragment, isoleret I

I 10 fra EL-4 6.1 C10 celler og til stede som en indføjelse i klon GEMBL78, er blevet depo- I

I neret hos American Type Culture Collection under løbenummeret ATCC 67563. I

I Fig. 2 er en skematisk afbildning af det mammale højekspressi- I

onsplasmid pDC301, som er beskrevet mere detaljeret i eksempel 6.

I Fig. 3A-3C er en grafisk sammenligning mellem IL-1 bindings- I

I 15 egenskaberne af naturlige og rekombinante IL-1 receptorer. Fig. 3A sammenligner I

I direkte binding af 125l-IL-1a til celler, der udtrykker nativ IL-1 receptor (EL4 6.1 C10) I

I eller rekombinant receptor (COS-IL-1R), fig. 3B viser dataene fra fig. 3A indtegnet i I

I Scatchard-kooridnatsystemet. Fig. 3C viser kompetitiv 125l-IL-1a binding mellem H

I umærket IL-1 α og IL-1 li. I fig. 3 angiver C koncentrationen af IL-1 sat til bindingsinku- I

I 20 bationen (molær), r angiver molekyler af IL-1 bundet pr. celle. I

I IL-1 α og IL-1 R regulerer tilsyneladende cellers metabolisme gennem et I

I fælles plasmamembranreceptorprotein. IL-1 receptor fra detergent-opløsninger af EL-4 I

I 6.1 C10 celler er blevet stabilt adsorberet til nitrocellulose under fuld bibeholdelse af I

I IL-1 bindingsaktivitet. Dette assaysystem blev anvendt til overvågning af oprensningen I

I 25 af IL-1 receptoren og til undersøgelse af virkningerne af adskillige kemiske modi- I

I fikationer på receptorbindingsaktiviteten. IL-1 receptorer ekstraheret fra EL-4 6.1 C10 I

I celler kan bindes til og specifikt elueres fra IL-1 koblet til Sepharose eller andre egne- H

de affinitetskromatografibærere. I

I Rensning ved den foregående fremgangsmåde resulterede ved I

30 sølvfarvning af polyacrylamidgeler i identifikation af et protein på Mr 82.000 dalton, I

I som var til stede i fraktioner, der udviste IL-1 bindingsaktivitet. Forsøg, ved hvilke cel-

leoverfladeproteiner af EL-4 celler radiomærkedes og 125l-mærket receptor rensedes I

I ved affinitetskromatografi, lod formode, at proteinet med Mr 82.000 blev udtrykt på

I plasmamembranen. N-glycanasebehandling af dette materiale viste, at 21-35% af den I

I 35 samlede Mr (82.000) af receptoren var N-bundet carbonhydrat. I

I i I

11 I DK 175810 B1

Til definition af de kemiske egenskaber af IL-1 receptoren udtænktes et enkelt, reproducerbart og kvantitativt assaysystem til påvisning af IL-1 receptor i detergentopløsninger. Med denne assay kan receptorrensningen følges, og ændringer i I

receptorbindingsaktiviten som respons på kemisk modifikation af receptoren kan let I

5 overvåges. I

Bindinasassav for IL-1 receptor I

Rekombinant human IL-1 β og IL-1a kan fremstilles ved ekspression i E. I

coli og rensning til homogenitet som beskrevet af Kronheim et al. (Bio/Technology I

10 4:1078,1986). Rekombinant human IL-1a udtrykkes fortrinsvis som et polypeptid I

sammensat af de C-terminale 157-rester af IL-1 a, der svarer til Mr 17.500 formen af I

proteinet, der afgives af aktiverede makrofager. Det rensede protein opbevares ved - I

70°C i fosfatpufret saltvand som en forrådsopløsning på 3 mg/ml. 10 μΙ (30 pg) portio- I

ner af forrådsopløsningen mærkes med natrium (125l) iodid ved en modificeret chlora- I

15 min-T-metode beskrevet af Dover et al. (Nature 324:266,1986) og Segal et al. (J. Im- 1

munol. 118:1338, 1977). Ved denne procedure sættes 10 pg rlL-1a (0,57 nmol) i 10 μΙ I

fosfat (0,05 M)pufret saltvand (0,15 M), pH 7.2, (PBS) til 2,5 mCi (1,0 nmol) natriumio- I

did i 25 μΙ 0,05 M natriumfosfat, pH 7,0. Reaktionen indledes ved tilsætning af 30 μΙ I

1,4 x 10"4 M chloramin-T (.4,2 nmol, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Efter I

20 30 minutter på is fraktioneres reaktionsblandingen ved gelfiltrering på en Biogel P6 I

(Bio-Rad, Richmond, CA, USA) kolonne med 1 ml leje-volumen. Rutinemæssigt inkor- I

poreres 40-50% 125l i protein. I

125l-IL-1a kan renses ved gelfiltrering eller andre egnede metoder og med I

det samme fortyndes til en arbejdsforrådsopløsning på 3 x 10'® M i Roswell Park Me- I

25 mortal Institute (RPMI) 1640 medium omfattende 1 vægt/vol % bovin serumalbumin I

(BSA), 0,1 vægt/vol % natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,4 (bindingsmedium) for at I

undgå radiolyse. Sådanne fortyndede opløsninger kan lagres i op til 1 måned uden : I

påviseligt tab af receptorbindingsaktivitet. Den specifikke aktivitet er rutinemæssigt i I

området 1-3 x 1015 cpm/mmol (ca. 1 atom iod pr. lL-1a molekyle). Typisk er det mær-

30 kede protein i begyndelsen (før fortynding) 100% aktivt ifølge bestemmelse af dets I

evne til at fremkalde IL-2 produktion ud fra EL-4 6.1 C10 celler. Desuden kan 100% af I

125I cpm præcipiteres ved med trichlor-eddikesyre, og >95% kan absorberes af IL-1 I

receptorbærende celler. I

EL-4 6.1 C10 celler propageres i suspensionskultur som beskrevet af I

35 MacDonald et al., J. Immunol. 135:3964 (1985). En IL-1 receptor negativ variantlinie af I

SDK 175810 B1 I

de. Celler overvåges I

iceptorekspression kan I

illesortering (FACS) og fluo- I

et rlL-1a (FITC IL-1a) frem- I

sceinisothiocyanat (Re- I

70 μΙ borat(0,02 M)pufret I

;illes fra ukonj ugeret farve- I

m som beskrevet af Dover I

t EPICS C flowcytometer I

stærkning 20, PMT- I

ieste fluorescensslgnalni- I

s til etablering af cellekultu- I

ifugering er høstet fra kultu- I

OO x g i 10 minutter til dan- I

ttes samme volumen PBS I

ihibitorer (2 mM phenyl- I

mM O-phenanthrolin). Cel- I

g, og blandingen inkuberes I

11.000 x g i 30 minutter ved I

øres 0,02 vægt/vol % i na- I

der kan påvises tab af IL-1 I

rerne. I

isebindingsassays 1 μΙ (4 x I

nitrocellulosemembraner I

is ved stuetemperatur, indtil I

leratur indtil brug. Under I

op til to måneder. Før brug - I

pufret saltvand (0,15 M), pH I

g af nonspecifikke bin- I

ml pr. filter), en gang med I

m kvadrater med IL-1 re- I

ids bakker (Costar, Cam- I

oldende 125I-IL-1 α eller12S- I

ist på en nutator og inkube- I

DK 175810 B1 7 res j et køleskab (8°C) i to timer. Herefter kan der udtages en 60 μΙ portion fra hver brønd til bestemmelse af ubundet 125l-rlL-1a. Derefter bortsuges den resterende opløsning og kasseres, og nitrocellulosefiltrene vaskes ved tilsætning og bortsugning af i rækkefølge 1 ml bindingsmedium og tre gange 1 ml PBS til hvert brønd. Nitrocellulo-5 sekvadrateme fjernes dernæst og tørres på filterpapir. Derefter anbringes de enten på Kodak X-omat AR film i tolv timer ved -70°C, eller de anbringes i 12 x 75 cm glasrør og tælles på en gammatæller.

Tabel 1 viser cDNA-sekvensen for klon GEMBL78. Nukleotider nummereres fra begyndelsen af fragmentet. CTG-kodonen, der specificerer leucinresten, 10 som udgør N-terminaleri, er understreget ved position 282, og TAG-terminatorkodon-en, der afslutter den åbne læseramme, er understreget ved position 1953.

Tabellerne 2A-2C viser cDNA-sekvensen og den afledte aminosyre-sekvens for kodningsområdet af den i tabel 1 viste cDNA. I tabellerne 2A-2C er nukleotider og aminosyrer nummereret fra leucinresten, der repræsenterer N-terminalen af 15 det modne protein. De alternative initiator-methioniner, N-terminalen og det formodede 21 -aminosyretransmembranornråde af den murine IL-1 receptor er understreget.

Tabel 3 viser en cDNA-sekvens, der omfatter det komplette kodningsområde af det humane IL-1 R gen. Nukleotider er nummereret fra begyndelsen af et fragment, kaldet R3A, der omfatter N-terminalen og en kort sekvens 20 af 5' ikke-translateret DNA. CTG-kodonen, der specificerer leucinresten, som udgør N-terminalen, er understreget ved position 135, og TAG-terminatorkodonen, der afslutter den åbne læseramme, er understreget ved position 1791.

Tabellerne 4A-4C viser cDNA-sekvensen og den afledte aminosyre-sekvens af kodningsområdet af en cDNA-indkodende human IL-1 receptor. I tabeller-25 ne 4A-4C er nukleotider og aminosyrer nummereret fra leucinresten (understreget), der repræsenterer N-terminalen af det modne protein. 20-aminosyretransmembran-området er også understreget.

Tabel 5 er en sammenligning af de fra murine og humane IL-1 receptorer afledte aminosyresekvenser. Transmembranområderne af hvert protein er understre-30 get, og bevarede cysteinrester er vist med en stjerne. Potentielle N-bundne glycosyle-ringssteder er vist med trekanter ved siden af asparaginrester.

Definitioner "lnterleukin-1 receptor" og "IL-IR" betegner proteiner, som er i stand til at 35 binde lnterleukin-1 (IL-1) molekyler og i deres native konfiguration som mammale . plasmamembranproteiner antageligt spiller en rolle i omsætning af det af IL-1 tilveje-

I DK 175810 B1 I

I 8 I

I bragte signal til en celle. Som anvendt i det foreliggende omfatter betegnelsen analoge I

I til native proteiner med IL-1-bindings- eller signalomsætningsaktivitet. Specifikt om- I

I fattet er afkortede eller opløselige former af IL-1 receptorproteinet, som ikke har et I

I cytoplasma- eller transmembranområde. Den fomdsagte molekylvægt af det murine I

I 5 protein, som svarer til sekvensen af det i tabellerne 2A-2B viste modne protein er I

I 64.597 dalton, mens den forudsagte molekylvægt af prækursoren er 66.697 dalton. I

Begge disse skøn er eksklusive glycosylering. Den forudsagte molekylvægt af det hu- I

I mane protein, som svarer til sekvensen af det i tabellerne 4A-4C viste modne protein I

I er 63.486 dalton, mens den forudsagte molekylvægt af prækursoren er 65.402 dalton. I

I 10 "I det væsentlige identisk" og "i det væsentlige lig" betyder, når udtrykke- I

ne anvendes til definering af aminosyresekvenser, at en given sekvens, fx. en mutant- I

I sekvens, adskiller sig fra en referencesekvens ved en eller flere substitutioner, udela- I

I delser eller tilføjelser, hvis nettoeffekt ikke resulterer i en ugunstig funktionel forskel I

H mellem referencesekvens og omhandlet sekvens. I forbindelse med den foreliggende I

15 opfindelse anses aminosyresekvenser med mere end 30% lighed for at være i det I

væsentlige lig hinanden, og aminosyresekvenser med mere end 80% lighed anses for I

at være i det væsentlige identiske. Ved definitionen af nukleinsyresekvenser anses I

alle omhandlede nukleinsyresekvenser, som er i stand til at indkode aminosyrese- I

kvenser, der i det væsentlige er lig hinanden, for at være i det væsentlige lig med en I

20 referencenukleinsyresekvens, og alle nukleinsyresekvenser, som er i stand til at ind- I

kode i det væsentlige identiske aminosyresekvenser, anses for at være i det I

H væsentlige identiske med en referencesekvens. Ved bestemmelse af lighed skal der I

ses bort fra forkortelser eller interne udeladelser af referencesekvensen. Sekvenser I

med en mindre grad af lighed, sammenlignelig biologisk aktivitet og ækvivalente eks- I

25 pressionskarakteristika anses for at være ækvivalenter. I forbindelse med den forelig- I

gende opfindelse anses en "underenhed" af en IL-1 R for at udgøre en aminosyrese- I

Som anvendt i det foreliggende betyder "rekombinant", at et protein hid- I

H rører fra rekombinante (fx. mikrobelle eller mammale) ekspressionssytemer. "Mikrobi- I

30 el" henviser til rekombinante proteiner produceret i bakterie- eller svampe- (fx. gær) I

H ekspressionssytemer. Som et produkt definerer "rekombinant mikrobielt" et protein, I

der i det væsentlige er fri for native endogene substanser og ikke ledsaget af associ- I

eret nativ glycosylering. Protein udtrykt i de fleste bakteriekulturer, fx. E. coli, vil være I

frit for glycan; protein udtrykt i gær kan have et glycosyleringsmønster, der adskiller sig I

DK 175810 B1 9

Som anvendt i beskrivelsen som en karakterisering af IL-1 receptorer betyder "biologisk aktiv" enten, at et givet molekyle har en tilstrækkelig aminosvrese-kvenslighed til fælles med udførelsesformeme af opfindelsen til at være i stand til at binde mindst 0,01 nmol IL-1 pr. nmol IL-1 receptor eller IL-1 receptoranalog, eller al-5 ternativt har en tilstrækkelig aminosyresekvenslighed til fælles til at være i stand til at transmittere en IL-1 stimulus til en celle, fx. som en komponent i en hybridreceptor-konstruktion. Fortrinsvis er biologisk aktive IL-1 receptorer ifølge opfindelsen i stand til at binde mere end 0,1 nmol IL-1 pr. nmol receptor, og mest foretrukket mere end 0,5 nmol IL-1 pr. nmol receptor.

10 "DNA-sekvens" henviser til en DNA-polymer i form af et separat fragment eller som en komponent af en større DNA-konstruktion, som er blevet afledt af DNA, som mindst en gang er blevet isoleret i i det væsentlige ren form, dvs. fri for kontami-nerende endogene materialer og i en mængde eller koncentration, der tillader identifikation, manipulation og udvinding af sekvensen og dens nukleotidsekvenskomponen-15 ter ved biokemiske standardmetoder, fx. under anvendelse af en kloningsvektor. Sådanne sekvenser tilvejebringes fortrinsvis i form af en åben læseramme, som ikke er afbrudt af interne ikke-translaterede sekvenser, eller introner, som typisk er til stede i eukaryotiske gener. Det vil imidlertid være åbenlyst, at genom-DNA indeholdende de relevante sekvenser, også vil kunne anvendes. Sekvenser af ikke-translateret DNA 20 kan være til stede 5’ eller 3' fra den åbne læseramme, hvor disse sekvenser ikke forstyrrer manipulation eller ekspression af kodningsområderne.

"Nukleotidsekvenser" henviser til en heteropolymer af deoxyrbonukleo-tider. DNA-sekvenser, der indkoder de i overensstemmelse med opfindelsen tilvejebragte proteiner, samles af cDNA-fragmenter og korte oligonukleotidlinkere eller af en 25 række oligonukleotider til opnåelse af et syntetisk gen, som kan udtrykkes i en rekom-binant transkriptionel enhed.

"Rekombinat ekspressionsvektor" henviser til et plasmid, der omfatter en transkriptionel enhed omfattende en samling af (1) et eller flere genetiske elementer med en regulatorisk rolle ved genekspression, fx. promotorer eller forstærkere, (2) en 30 strukturel eller kodningssekvens, som transkriberes til mRNA og translateres til protein, og (3) passende transkriptions- og translationsinitierings- og termineringsekvenser. Strukturelle elementer til anvendelse i gærekspressionssystemer, omfatter fortrinsvis en ledersekvens, der muliggør extracellulær udskillelse af translateret protein ved en værtscelle. Alternativt kan rekombinant protein, når det bliver udtrykt uden en leder-35 eller transportsekvens, omfatte en N-terminal methioninrest. Denne rest kan eventuelt

I DK 175810 B1 I

I 10 I

I derefter spaltes fra det udtrykte rekombinante protein til tilvejebringelse af et slutpro- I

I dukt. I

I "Rekombinant mikrobielt ekspressionssytem" betegner en i det I

væsentlige homogen monokultur af egnede værtsmikroorganismer, fx. bakterier så- I

I 5 som E. coli eller gær såsom S. cerevisiae, som har en stabilt i kromosomal DNA inte- I

I greret rekombinant transkriptione! enhed eller bærer den transkriptionelle enhed som I

I en komponent i et deri værende plasmid. Generelt er celler, der udgør systemet, af- I

I kommet af en enkelt ophavstransformant. Rekombinante ekspressionssystemer som I

I defineret i det foreliggende vil udtrykke heterologt protein ved induktion af de regu- I

I 10 latoriske elementer, som er bundet til DNA-sekvensen eller det syntetiske gen, som I

skal udtrykkes. I

I Isolation af cDNA'er. der indkoder 1L-1 receptorer I

Til opnåelse af den murine kodningssekvens isoleredes en DNA- I

I 15 sekvens, der indkoder murin IL-1R (mlL-1 R), fra et cDNA-bibliotek, der var fremstillet I

ved revers transkription af polyadenyleret RNA isoleret fra den murine cellelinie EL-4 I

I 6.1 C10. Biblioteket screendes ved direkte ekspression af kombinerede cDNA- I

I fragmenter i COS-7 abeceller under anvendelse af en mammal ekspressionvektor I

(pDC201), der anvender regulatoriske sekvenser hidrørende fra SV40 og Adenovirus I

20 2. Transfektanter, der udtrykker biologisk aktiv IL-1 R, blev identificeret ved inkubering I

af transficerede COS-7 celler med medium indeholdende 125l-IL-1a, vask af cellerne til I

fjernelse af ubundet mærket IL-1a og ved at bringe cellemonolagene i kontakt med I

røntgenfilm til påvisning af koncentrationer af IL-1cx binding. På denne måde påviste I

transfektanter optræder som mørke steder mod en relativt lys baggrund. I

H 25 Under anvendelse af denne teknik screenedes ca. 150.000 cDNA'er i I

puljer på ca. 350 cDNA'er indtil assay af en transfektantpulje viste positive IL-1 a bin- I

dingssteder. En nedfrosset bakteriebeholdning fra denne positive pulje dyrkedes i I

kultur og udpladedes til tilvejebringelse af individuelle kolonier, der screenedes indtil I

H der blev identificeret en enkelt klon (klon 78), som styrede syntese af et overfladepro- I

30 tein med påviselig IL-1 bindingsaktivitet. Denne klon isoleredes, og dens indføjelse I

sekvensbestemtes til bestemmelse af sekvensen af den i tabel 1 anførte murine I

H cDNA. Initiatormethioninen for det uforkortede translationsprodukt af det native murine I

H gen er en af to alternative methioninrester, der findes ved positionerne -19 og -16 i I

H tabel 2 A. Den første aminosyrerest af det modne receptorprotein blev udledt ved I

35 sammenligning med en N-terminal aminosyresekvens opnået fra højt rensede IL-1 R I

H præparater hidrørende fra EL-4 6.1 C10 celler. Denne rest er en leucinrest vist ved I

DK 175810 B.1 11 position 1 i tabel 2A. 1671 nukleotidkodningsområdet, der svarer til det modne protein, indkoder 576 aminosyrer, inklusive 15 cvsteinrester og et formodet 21-aminosvretrans-membranområde. Lokaliseret N-terminal til transmembranområdet er 7 potentielle N-glycosyleringssteder. En kloningsvektor omfattende den uforkortede murine cDNA, 5 kaldet GEMBL78, er blevet deponeret hos American Type Culture Collection,

Rockville, MD, USA under løbenummeret ATCC 67563. Deponeringen blev foretaget under Budapestkonventionens betingelser.

En probe opbyggedes ud fra den murine sekvens og anvendtes til screening af humane cDNA-biblioteker, der var fremstillet ud fra kulturer af en human T-10 celleklon dyrket i nærvær af OKT3-antistof og IL-2. Dernæst isoleredes og sekvensbestemtes cDNA-kloner, der hybridiserede til den murine probe. Under anvendelse af et fragment afledt af humane cDNA-kloner opnåedes og sekvensbestemtes en 1707 nukleotid human kodningssekvens. Nukleotidsekvensen af den humane cDNA, inklusive 5' og 3' utranslaterede sekvenser, er vist i tabel 3. Nukleotidsekvensen af den 15 humane åbne læseramme og den afledte aminosyresekvens af det humane protein er anført i tabellerne 4A-4C. Denne sekvens omfatter 569 aminosyrer (inklusive et signalpeptid på 17 aminosyrer), inklusive 16 cysteinrester, hvoraf de 13 er bevaret mellem de murine og humane gener. Den humane sekvens omfatter desuden 6 potentielle N-glycosyleringssteder, hvoraf de 5 er bevaret mellem murine og humane. Ami-20 nosyresekvensen i tabellerne 4A-4C er nummereret fra en leucinrest, der anses for at være den sandsynlige N-terminal på basis af sammenligninger med det murine protein. Det formodede transmembranområde af det humane gen har en længde på 20 aminosyrer. Sekvenserne af de antagede intracellulære dele af de murine og humane gener er i høj grad (87%) bevaret, de extracellulære områder (78%) og transmembra-25 . nområderne (63%) er bevaret lidt mindre bortset fra lokaliseringen af cysteiner, der antageligt er involveret i intramolekylær disulfidbinding og visse N-glycosyleringssteder. De fra de humane og murine gener udledte aminosyresekvenser er sammenlignet i tabel 5.

De murine og humane gener, der indkoder integrate membranproteiner, 30 omfatter intracellulære områder uden nogen tilsyneladende homologi med nogen kendt proteinsekvens og extracellulære dele, der synes at være organiseret i områder, der ligner dem for medlemmerne af immunglobulin-gensuperfamilien. Immunglobulin-lignende områder har typisk kun minimal aminosyrelighed, men har en fælles tredimensional struktur bestående af to li-flader holdt sammen af en disulfidbinding. Den i 35 dannelse af denne disulfidbinding involverede cysteinrest samt nogle andre kritiske rester er bevaret i høj grad og optræder i samme relative position i næsten alle med-

I DK 175810 B1 I

I i

I lemmer af familien. Medlemmer af immunglobulinsuperfamilien omfatter ikke kun kon- I

stante og variable immunglobulinområder, men også et antal andre celleoverflademo- I

I lekyler, hvoraf mange er involveret i celle-celle interaktioner. I

I Som de fleste mammale gener indkodes mammale IL-1 R'er antageligt af I

I 5 multi-exon gener. Alternative mRNA-konstruktioner, som kan tilskrives forskellige I

I mRNA-splejsningstilfælde efter transkription og som har store identitets- eller ligheds- I

I områder til fælles med cDNA'eme ifølge opfindelsen, anses for at falde inden for op- I

I findeisens rammer. I

I I sine nukleinsyreudførelsesformer tilvejebringer den foreliggende opfin- I

I 10 delse DNA-sekvenser, der indkoder mammale IL-1 R’er. Eksempler på mammale IL- I

1 R’er omfatter primat IL-1 R, human IL-1 R, murin, canin, felin, bovin, ovin, equin og I

I porcin IL-1 R. IL-1 R DNA'er tilvejebringes fortrinsvis i en form, som kan udtrykkes i en I

I rekombinant transkriptionel enhed under kontrol af mammale, mikrobielle eller virale I

I transkriptionelle eller translationelle kontrolelementer. For eksempel vil en sekvens, I

I 15 som skal udtrykkes i en mikroorganisme, ikke indeholde intraner. I foretrukne aspekter I

I omfatter DNA-sekvenseme mindst en, men eventuelt mere end en sekvenskompo- I

nenter afledt af en cDNA-sekvens eller en kopi deraf. Sådanne sekvenser kan være I

I bundet til eller flankeret af DNA-sekvenser fremstillet ved samling af syntetiske oligo- I

nukleotider. Syntetiske gener, der udelukkende er samlet af oligonukleotider, kunne I

20 imidlertid blive opbygget under anvendelse af den i det foreliggende beskrevne se- I

kvensinformation. Eksempler på sekvenser omfatter sådanne, der i det væsentlige er I

I identiske med de i tabellerne 2A-2C viste nukleotidsekvenser. Alternativt kan kod- I

ningssekvenserne omfatte kodoner, der indkoder en eller flere yderligere aminosyrer, I

som befinder sig ved N-terminalen, fx. en N-terminal ATG-kodon, der specificerer I

25 methionin bundet i læseramme med nukleotidsekvensen. P.g.a. kodedegeneration kan I

der forekomme betragtelige variationer i nukleotidsekvenser, der indkoder samme I

aminosyresekvens; eksempler på DNA-udførelsesformer er sådanne, der svarer til I

sekvensen af nukleotiderne 1-1671 i tabellerne 2A-2C og nukleotideme 1-1656 i ta- I

bellerne 4A-4C. Andre udførelsesformer omfatter sekvenser, som kan hybridisere til I

30 sekvensen i tabellerne 2A-2C eller 4A-4C under moderat strenge betingelser (50°C, 2 I

x SSG), og andre sekvenser degenererer til de ovenfor beskrevne, der indkoder biolo- I

gisk aktive IL-1 R polypeptider. I

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også ekspressionsvektorer til I

H fremstilling af renset IL-1 R i nyttige mængder. Vektorerne kan omfatte syntetiske eller I

35 cDNA-afledte DNA-fragmenter, der indkoder mammale IL-1 R'er eller bioækvivalente I

H homologer, der operativt er koblet til regulatoriske elementer afledt af mammale, bak- I

DK 175810 B1 13 terielle, virale, gær- eller bakteriofag-gener. Nyttige regulatoriske elementer er beskrevet mere detaljeret nedenfor. Efter transformation, transfektion eller infektion af Dassende cellelinier kan sådanne vektorer induceres til at udtrykke rekombinant protein.

Mammale IL-1 R'er kan udtrykkes i mammale celler, gær, bakterier eller 5 andre celler under kontrol af passende promotorer. Cellefrie translationssystemer vil også kunne anvendes til fremstilling af mammal IL-1 R under anvendelse af RNA'er afledt af DNA-konstruktionerne ifølge opfindelsen. Passende klonings- og ekspressionsvektorer til anvendelse med bakterielle, mammale, svampe- og gærcelleværter er beskrevet af Pouvels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New 10 York, 1985), idet de relevante dele af beskrivelsen hermed inkorporeres i det foreliggende ved henvisning.

Forskellige mammale cellekultursystemer kan anvendes til ekspression af rekombinant protein. Ekempler på egnede mammale værtscellelinier omfatter COS-7 linierne af nyreceller fra aber beskrevet af Gluzman (Cell 23:175,1985), og andre 15 cellelinier, som kan udtrykke en passende vektor, fx. C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- og BHK-cellelinieme. Mammale ekspressionsvektorer kan omfatter ikke-transkriberede elementer såsom et replikationsområde, en egnet promotor og forstærker og andre 5'-og 3'-flankerende ikke-transkriberede sekvenser og 5 - eller 3' ikke-translaterede sekvenser såsom nødvendige ribosombindingssteder, et polyadenyleringssted, splejs-20 ningsdonor- og acceptorsteder samt termineringssekvenser. Fra det virale SV40 genom hidrørende DNA-sekvenser, fx. SV40-origin-, tidlig promotor-, forstærker-, splejsnings- og polyadenyleringssteder kan anvendes til tilvejebringelse af andre genetiske elementer, der kræves til ekspression af en heterolog DNA-sekvens. Yderligere detaljer vedrørende anvendelsen af en mammal højekspressionsvektor til fremstilling 25 af en rekombinant mammal IL-1 R er anført i eksemplerne 4 og 6 nedenfor. Eksempler på vektorer kan opbygges som beskrevet af Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983).

Et nyttigt system til stabil ekspression af et højt niveau af mammale re-ceptor-cDNA'er i murine C127 epitheliale brystceller kan opbygges j det væsentlige 30 som beskrevet af Cosman et al. (Molecular Immunol. 23:935,1986).

Gærsystemer, der fortrinsvis anvender Saccharomycesarter såsom S.

, cerevisiae, kan også anvendes til ekspression af de rekombinante proteiner ifølge op findelsen. Gær af andre slægter, fx. Pichia eller Kluyveromyces, er også blevet anvendt som produktionsstammer for rekombinante proteiner.

35 Generelt vil nyttige gærvektorer omfatte replikationsområder og valgbare markører, der tillader transformation af både gær og E. coli, fx. ampicillinresistensge-

I DK 175810 B1 I

I 14 I

I net fra E. coli og S. cerevisiae TRP1 gen, og en promotor hidrørende fra et gaergen I

I med høj ekspression til fremkaldelse af transkription af en nedenstrøms strukturel se* I

kvens. Sådanne promotorer kan afledes af transkriptionelle gærenheder, der indkoder I

I gener med høj ekspression såsom bl.a. 3-phosphoglyceratkinase (PGK), α-faktor, sur I

I 5 phosphatase eller varmechockproteiner. Den heterologe strukturelle sekvens samles i I

en passende læseramme med translationsinitierings- og termineringssekvenser og I

I fortrinsvis en ledersekvens, som kan styre udskillelse af translateret protein i det ex- I

I tracellulære medium. Eventuelt kan den heterologe sekvens indkode et fusionsprotein, I

der indeholder et N-terminalt identifikationsprptid (fx. Asp-Tyr-Lys-(Asp)4-Lys) eller en I

I 10 anden sekvens, der resulterer i de ønskede karakteristika, fx. stabilisering eller for- I

I enklet rensning af udtrykt rekombinant produkt. I

Nyttige gærvektorer kan samles under anvendelse af DNA-sekvenser fra I

pBR322 til udvælgelse og repiikation i E. coli (Ampr-gen og replikationsområde) og I

I gær-DNA-sekvenser indeholdende en glucoseundertrykbar alkoholdehydrogenase 2 I

I 15 (ADH2) promotor. ADH2-promotoren er blevet beskrevet af Russell et al. (J. Biol. I

I | Chem. 258:2674,1982) og Beier et al. (Nature 300:724,1982). Sådanne vektorer kan I

også omfatte et gær-TRP1-gen som en valgbar markør og gær-2p-replikations- I

I | området. En gærledersekvens, fx. α-faktorlederen, der styrer udskillelse af heterologe I

I I proteiner fra en gærvært, kan indføjes mellem promotoren og det strukturelle gen, som I

I 1 20 skal udtrykkes (se. Kurjan et al., US-patentskrift 4.546.082, Kurjan et al., Cell 30:933 I

I (1982), og Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984). Ledersekvensen I

kan modificeres til nær sin 3'-ende at indeholde et eller flere nyttige restriktionssteder I

til lettelse af fusionen af ledersekvensen med fremmede gener. I

H Egnede gærtransformationsprotokoller er keridte for fagmanden. Et ek- I

25 sempel på en teknik er beskrevet af Hinne et al. (Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75:1929, I

1978), ved hvilken Trp+-transformanter udvælges i et selektivt medium bestående af I

0,67% gæmitrogenbase, 0,5% casaminosyrer, 2% glucose, 10 pg/ml adenin og 20 I

pg/ml uracil. I

Værtsstammer, som er transformeret med vektorer, der omfatter ADH2- I

30 promotoren, kan dyrkes for ekspression i et beriget medium bestående af 1 % gæreks- I

trakt, 2% pepton og 1% glucose suppleret med 80 pg/ml adenin og 80 pg/ml uracil. I

Derepression af ADH2-promotoren optræder, når mediets glucose er opbrugt. Rå I

gærsupernatanter høstes ved filtrering og holdes ved 4° C før yderligere rensning. I

Nyttige ekspressionsvektorer til bakteriel anvendelse opbygges ved ind- I

35 føjelse af en DNA-sekvens, der indkoder mammal IL-1R sammen med egnede trans- I

lationsinitierings- og termineringssignaler i operativ læsefase med en funktionel pro- I

DK 175810 B1 15 motor. Vektoren vil omfatte en eller flere fænotypiske valgbare markører og et replika-tionsområde for at sikre forstærkning i værten. Egnede prokaryotiske værter for transformation omfatter E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium og forskellige arter af slægterne Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus, selvom andre værter 5 om ønsket også kan anvendes.

Ekspressionsvektorer opbygges hensigtsmæssigt ved spaltning af cDNA-kloner på steder nær ved kodonen, der indkoder den N-terminale rest af det modne protein. Syntetiske oligonukleotider kan dernæst anvendes til "tilbageføring" af udeladte afsnit af kodningsområdet og tilvejebringelse af en bindingssekvens for ligering | ' 10 af kodningsfragmentet i passende læseramme i ekspressionsvektoren og eventuelt en kodon, der specificerer en initiatormethionin.

Som et repræsentativt, men ikke begrænsende eksempel kan nyttige ekspressionsvektorer til bakteriel anvendelse omfatte en valgbar markør og et bakterielt replikationsområde hidrørende fra kommercielt tilgængelige plasmider omfattende 15 genetiske elementer af den velkendte kloningsvektor pBR322 (ATCC 37017). Sådanne kommercielle vektorer omfatter fx. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,

Sverige9 og pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA). Disse pBR322 "ryggrads"-afsnit kombineres med en passende promotor og den strukturelle sekvens, som skal udtrykkes.

20 Et specielt nyttigt bakterielt ekspressionssystem anvender fag λ PL

promotoren og den termolabile cl857-repressor. Plasmidvektorer, som kan fås fra American Type Culture Collection og som indbefatter derivater af λ PL promotoren, omfatter plasmid pHUB2, der forefindes i E. coli stamme JMB9 (ATCC 37092), og pPLc28, der forefindes i E. coli RR1 (ATCC 53082). Andre nyttige promotorer for eks-25 pression i E. coli omfatter den af Studier et al. (J. Mol. Biol. 189:113, 1986) beskrevne T7 RNA-polymerasepromotor, den af Lauer (J. Mol. Appl. Genet. 1:139-147,1981) beskrevne lacZ-promotor. der er tilgængelig som ATCC 37121, og den af Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p.

412) beskrevne tac-promotor, der er tilgængelig som ATCC 37138.

30 Efter transformation af en egnet værtsstamme og dyrkning af værtsstammen til en passende celletæthed udsættes den valgte promotor for derepression med passende midler (fx. temperaturændring eller kemisk induktion), og celler dyrkes i endnu et stykke tid. Celler høstes typisk ved centrifugering, brydes med fysiske eller kemiske midler, og den resulterende rå ekstrakt tilbageholdes for yderlige-35 re rensning. Celler dyrkes fx. i en 101 fermenteringsbeholder under anvendelse af maksimal luftning og kraftig omrøring. Der anvendes fortrinsvis et antiskum-

I DK 175810 B1 I

I I

I dannelsesmiddel (Antifoam A). Kulturer dyrkes ved 30°C i det af Mott et al. (Proc. Natl. I

I Acad. Sci. USA 82:88, 1985) beskrevne superinduktionsmedium, der alternativt om- I

I fatter antibiotika, udsættes for derepression ved en celletæthed svarende til A600 = I

0,4-0,5 ved forhøjelse af temperaturen til 42°C og høstes fra 2-20, fortrinsvis 3-6, timer I

I 5 efter temperaturforøgelsen. Cellemassen koncentreres indledningsvis ved filtrering I

I eller anden måde og centrifugeres dernæst ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4°C ef- I

I terfulgt af hurtig nedfrysning af cellepelieten. I

I Rensede mammale I L-1R'er eller bioækvivalente homologer fremstilles I

I fortrinsvis ved dyrkning af egnede vært/vektorsystemer til ekspression af de rekombi- ' I

I 10 nante translationsprodukter af de syntetiske gener ifølge opfindelsen, som derefter I

I oprenses fra kulturmedier. I

I En alternativ fremgangsmåde til fremstilling af renset 11-1R omfatter op- I

I rensning fra cellekultursupernatanter eller ekstrakter. Ved denne fremgangsmåde an- I

I vendes en cellelinie, der fremtider nyttige mængder af proteinet. Supematanter fra I

15 sådanne cellelinier kan eventuelt koncentreres under anvendelse af et kommercielt I

I tilgængeligt proteinkoncentrationsfilter, fx. en Amicon eller Millipore Pellicon ultrafil- I

treringsenhed. Efter koncentrationstrinnet kan koncentratet anbringes på en egnet I

I rensningsmatrix som tidligere beskrevet. For eksempel kan en egnet affinitetsmatrix I

omfatte et IL-1 - eller lectin- eller antistofmolekyle, som er bundet til en egnet bærer. I

B 20 Alternativt kan der anvendes en anionbytterharpiks, fx. en matrix eller et substrat med I

diethylaminoethyl (DEAE) sidegrupper. Matricerne kan være acrylamid, agarose, dex- I

tran, cellulose eller andre typer, der sædvanligvis anvendes til proteinrensning. Alter- I

B nativt kan der anvendes et kationbytningtrin. Egnede kationbyttere omfatter forskellige I

B uopløselige matricer omfattende sulfopropyl- eller carboxymethylgrupper. Sulfopropyl- I

I 25 grupper er foretrukket. I

B Til sidst kan der til yderligere rensning af en IL-1 R sammensætning an- I

B vendes et eller flere revers fase højtryksvæskekromatografi (RP-HPLC) trin under an- I

B vendelse af hydrofobe RP-HPLC-medier, fx. silicagel med methyl- eller andre alifatiske I

B sidegrupper. Nogle af eller alle de foregående rensningstrin kan i forskellige kombina- I

B 30 tioner også anvendes til tilvejebringelse af et homogent rekombinant protein. I

B I bakteriekultur fremstillet rekombinant protein isoleres sædvanligvis ved I

B indledningsvis ekstraktion fra cellepellets efterfulgt af et eller flere koncentrerings-, I

B udsaltnings-, vandig ionbytnings- eller størrelseseksklusionskromatografitrin. Endelig I

B kan højtryksvæskekromatografi (HPLC) udføres som sidste rensningstrin. Mikrobielle I

B 35 celler, der anvendes til ekspression af rekombinant mammal IL-1 R, kan brydes ved en I

17 DK 175810 B1 hvilken som helst passende fremgangsmåde, inklusive skiftende nedfrysning/optøning, sonikering, mekanisk brydning eller anvendelse af cellelvserende midler.

Fermentering af gær, der udtrykker mammal IL-IR som et udskilt protein, gør rensning meget enklere. Udskilt rekombinant protein, der stammer fra en fermen- , 5 tering i stor målestok, kan renses ved fremgangsmåder, som er analoge med de af Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171,1964), beskrevne. Denne reference beskriver to sekventielle, revers fase HPLC-trin til rensning af rekombinant human GM-CSF på en præparativ HPLC-kolonne.

I dens forskellige udførelsesformer tilvejebringer den foreliggende opfin-10 delse i det væsentlige homogene, rekombinante mammale IL-1R polypeptider, som er fri for kontaminerende endogene materialer, med eller uden associeret glycosylering af det native mønster. Det native murine IL-IR molekyle udvindes fra cellekulturekstrakter som et glycoprotein med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 82 kD bestemt ved SDS-PAGE. I mammale ekspressionssytemer udtrykte IL-1R'er, fx. COS-7 celler, kan 15 have en molekylvægt og et glycosyleringsmøsnter, som ligner eller er lidt forskellige fra de native molekylers afhængigt af ekspressionssystemet. Ekspression af IL-1R DNA'er i bakterier såsom E. coli tilvejebringer ikke-glycosylerede molekyler med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 60 kD ifølge bestemmelse ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser.

20 Rekombinante IL-1 R proteiner ifølge opfindelsen omfatter også N- terminal methionyl murine og humane IL-1 R; Yderligere udførelsesformer omfatter opløselige forkortede versioner, hvori visse områder, fx. transmembranområdet og de intracellulære områder, er udeladt, hvorved der tilvejebringes et molekyle, der kun har et IL-1-bindingsområde. Mammale IL-1 R'er udtrykt som fusionsproteiner med en poly-25 peptidleder, der omfatter sekvensen Asp-Tyr-Lys-(Asp4)-Lys, eller med andre egnede peptid- eller proteinsekvenser, der anvendes som hjælpemidler til ekspression i mikroorganismer eller oprensning af mikrobielt udtrykte proteiner, er også omfattet.

Bioækvivalente homologer af proteinerne ifølge opfindelsen omfatter forskellige analoge, fx. forkortede versioner af IL-1 R'er, hvori terminale eller interne 30 rester eller sekvenser, der ikke er nødvendige for biologisk aktivitet, er udeladt. Andre omhandlede analoger er sådanne, hvori en eller flere cysteinrester er blevet udeladt eller erstattet med andre aminosyrer, fx. neutrale aminosyrer. Andre mutagenese-fremgangsmåder omfatter modifikation af nabostillede dibasiske aminosyrerester til I forøgelse af ekspression i gærsystemer, hvori KEX2-proteaseaktivitet er til stede, eller 35 modifikation af proteinsekvensen til eliminering af et eller flere N-bundne glycosyle-ringssteder.

I DK 175810 B1 I

I 18 I

I Som anvendt i det foreliggende henviser "mutant aminosyresekvens" til I

I et polypeptid, som er indkodet af en nukleotidsekvens, der bevidst er gjort forskellig fra I

I en nativ sekvens. "Mutant protein" eller "analog" betyder et protein omfattende en I

I mutant aminosyresekvens. "Nativ sekvens" henviser til en aminosyre- eller nukleinsy- I

I 5 esekvens, som er identisk med en vild type eller nativ form af et gen eller protein. I

I Udtrykkene "KEX2-proteasegenkendelsessted" og "N-glycosyleringssted" er defineret I

I nedenfor. Som anvendt til definering af specielle aspekter af opfindelsen betyder ud- I

I trykket "inaktivering", ændring af et udvalgt KEX2-proteasegenkendelsessted for at I

retardere eller hindre spaltning med KEX2-proteasen af Saccharomyces cerevisiae, I

I 10 eller ændring af et N-glycosyleringssted for at udelukke covalent binding af oligosac- I

chariddele til specielle aminosyrerester ved cellen. I

I Stedspecifikke mutageneseprocedurer kan anvendes til inaktivering af I

I KEX2-proteasebehandlingssteder ved udeladelse, tilføjelse eller erstatning af rester I

I for at ændre Arg-Arg, Arg-Lys og Lys-Arg par for at eliminere forekomsten af disse I

15 nabostillede basiske rester. Lys-Lys par er betydeligt mindre tilbøjelige til KEX2- I

I spaltning, og omdannelse af Arg-Lys eller Lys-Arg til Lys-Lys repræsenterer en kon- I

I servativ og foretrukket fremgangsmåde til inaktivering af KEX2-steder. De resulteren- I

de analoge er mindre tilbøjelige til at blive spaltet med KEX2-protease på andre steder I

I end i gær α-faktorledersekvensen, hvor spaltning ved udskillelse er tilsigtet. : I

I 20 Mange udskilte proteiner antager covalent bundne carbonhydratenheder i I

efter translation, hyppigt i form af oligosaccharidenheder, der ved N-glycosidbindinger I

er bundet til asparaginsidekæder. Både strukturen og antallet af oligosaccharidenhe- I

I der, som er bundet til et givet udskilt protein, kan variere betragteligt, hvilket resulterer I

i mange forskellige tilsyneladende molekylmasser, der kan tilskrives et enkelt gly- I

H 25 coprotein. mlL-1 R er et glycoprotein af denne type. Forsøg på at udtrykke glycoprotei- I

ner i rekombinante systemer kan kompliceres af den heterogenitet, der kan tilskrives I

denne variable carbonhydratkomponent. For eksempel kan rensede blandinger af re- I

kombinante glycoproteiner såsom human eller murin granulocytmakrofagkoloni- ' I

stimulerende faktor (GM-CSF) bestå af 0-50 vægt-% carbonhydrat. Miyajima et al. : I

30 (EMBO Journal 5:1195,1986) rapporterede ekspression af en rekombinant murin GM- I

CSF, hvori N-glycosyleringssteder var blevet muteret for at udelukke glycosylering og I

reducere heterogeniteten af det gærudtrykte produkt. I

Tilstedeværelsen af variable mængder af associeret carbonhydrat i re- I

kombinante glycoproteiner komplicerer rensningsprocedurerne, hvorved udbyttet re- I

35 duceres. Desuden er der, hvis glycoproteinet anvendes som et terapeutisk middel, i I

mulighed for, at modtageren vil udvikle immunreaktioner over for gærcarbonhydratde- : I

Η ' I

I DK 175810 B1 lene, hvilket kræver, at terapien afbrydes. Af disse grunde kan biologisk aktive, homogene analoge af immunregulatoriske glycoproteiner med reduceret carbonhvriratinH-hold være ønskelige til terapeutisk anvendelse.

Funktionelle mutantanaloger til mammale IL-1R'er med inaktiverede N-5 glycosyleringssteder kan fremstilles ved oligonukleotidsyntese og ligering eller ved stedspecifikke mutageneseteknikker som beskrevet nedenfor. Disse analogproteiner kan med god udbytte fremstilles i en homogen, carbonhydratreduceret form under anvendelse af gærekspressionssystemer. N-glycosyleringssteder i eukaryotiske proteiner er karakteriseret ved aminosyretripletten Asn-A1-Z, hvor A1 er en aminosyre 10 bortset fra Pro, og Z er Ser eller Thr. I denne sekvens tilvejebringer asparagin en side-kædeaminogruppe til covalent binding af carbonhydrat. Et sådant sted kan elimineres ved substituering af Asn eller resten Z med en anden aminosyre, udeladelse af Asn eller Z, eller indføjelse af en ikke-Z aminosyre mellem A1 og Z, eller en aminsyre, som ikke er Asn, mellem Asn og A1. Fortrinsvis udføres substitueringer på konservativ må-15 de, dvs. de mest foretrukne substitueringsaminosyrer er sådanne, hvis fysisk-kemiske egenskaber ligner egenskaberne af den rest, som skal erstattes. På lignende måde bør den potentielle virkning af udeladelsen eller indføjelsen på den biologiske aktivitet tages i betragtning, når en udeladelses- eller indføjelsesstrategi tages i anvendelse.

Udover de ovenfor beskrevne specielle analoger kan der bekvemt frem-20 stilles talrige DNA-konstruktioner omfattende alle eller en del af de i tabellerne 2A-2C eller 4A-4C viste nukleotidsekvenser, sammen med oligonukleotidkassetter, der omfatter yderligere nyttige restriktionssteder. Mutationer kan indføres på specielle steder ved syntetisering af oligonukleotider, der indeholder en mutantsekvens, flankeret af restriktionssteder, som muliggør ligering til fragmenter af den native sekvens. Efter 25 ligering indkoder den resulterende rekonstruerede sekvens en analog med den ønskede aminosyreindføjelse, -substituering eller -udeladelse.

Alternativt kan der anvendes oligonukleotidstyrede stedspecifikke muta-geneseprocedurer til tilvejebringelse af et ændret gen med specielle kodoner, som er ændret iht. den krævede substituering, udeladelse eller indføjelse. Som eksempler 30 beskriver Walder et al. (Gene 42:133,1986), Bauer et al. (Gene 37:73, 1985), Craik (Biotechniques, January 1985,12-19), Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) og US-patentskrift nr. 4.518.584 egnede teknikker, som inkorporeres i det foreliggende ved henvisning.

I en udførelsesform af opfindelsen er aminosyresekvensen af IL-1R bun-35 det til en gær α-faktorledersekvens via en N-terminal fusionskonstruktion, der omfatter et nukleotid, som indkoder peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK).

I DK 175810 B1 I

I 20 I

I Sidstnævnte sekvens er stærkt antigenisk og tilvejebringer en epitop, der bindes re- I

I versibelt af specifik monoklonalt antistof, hvilket muliggør en hurtig assay og en let I

I rensning af udtrykt rekombinant protein. Denne sekvens spaltes også specifikt af bovin I

mucosal enterokinase ved resten, der følger umiddelbart efter Asp-Lys parret. Fusi- I

I 5 onsproteiner, som er maskeret med dette peptid, kan også være resistente over for I

I intracellulær nedbrydning i E. coli. En alternativ konstruktion er Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp- I

I Asp-Asp-Lys-Glu-lle-Gly-Arg, der tilvejebringer et faktor X genkendelsessted umiddel- I

I bart nedenstrøms for enterokinasestedeL I

I Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende eksempler, som skal tjene I

I 10 til belysning, men ikke til begrænsning af opfindelsen. I

I Eksempel 1 I

Fremstilling af IL-1 α affinitetsmatrix og affinitetsoprensnina af receptor fra overflade- I

I mærkede EL-4 6.1 C10 celler I

15 Celleoverladeproteiner på EL-4 6.1 C10 celler radiomærkedes med 125l I

ved den af Cosman et al. (Molecular Immunol. 23:935,1986) beskrevne glucoseoxt- I

I dase-lactoperoxidasemetode. Mærkede celler pelleteredes ved centrifugering, vaske- I

des tre gange med PBS og ekstraheredes med PBS indeholdende 1% Triton X-100 og I

I den i den ovenfor specificerede assayprotokol beskrevne cocktail af proteaseinhibito- I

20 rer. Triton X-100 ekstrakten centrifugeredes i 10 minutter i en Eppendorf mikrocentri- I

fuge, og supematanten opbevaredes ved -70°C. I

Rekombinant IL-1 α blev bundet til cyanogenbromidaktiveret Sepharose I

4B (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) eller til Affigel-10 (Bio-Rad, Richmond, CA, I

USA) iht. producentens forslag. For eksempel sattes til en opløsning af IL-1 α (1,64 I

25 mg/ml i 9,5 ml PBS) 3 ml kvældet, syrevasket, CNBR-aktiveret Sepharose. Opløsnin- I

gen rystedes natten over ved 4°C, og en portion af supematanten testedes for protein I

ved en fluorescaminproteinassay som beskrevet af Udenfriend et al. (Science I

178:871,1972) under anvendelse af BSA som standard. 98% af proteinet var blevet I

bundet til gelen, hvilket lod formode, åt kolonnen havde en slutladning på 5,1 mg IL-1a I

H 30 pr. ml gel. 300 pi 1 M glycinethylester (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) sat- I

tes til opslæmningen til blokering af uomsatte steder på gelen. I

Gelen vaskedes grundigt med 0,1 M glycinpuffer, pH 3,0, indeholdende I

0,1% Triton X-100, PBS indeholdende 0,1% Triton X-100, RIPA-puffer (0,05 M Tris- I

H HCI, pH 7,5, 0,15 M NaCI, 1% NP40,1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) og PBS in- I

35 deholdende 0,1 % Triton X-100 og 10 mM ATP. Små kolonner (200 μΙ) fremstilledes i I

polypropylenholdere til engangsbrug (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) og vaskedes I

I DK 175810 B1 : med PBS indeholdende 1% Triton X-100. Portioner på 100 μΙ 125l-mærket ekstrakt ! overførtes til en kolonne, der dernæst vaskedes med PBS indeholdende 1% Triton X-

I 100, RIPA-puffer, PBS indeholdende 0,1 % Triton X-100 og 10 mM ATP, og PBS med I

i I

j 1% Triton X-100. I

!' 5 IL-1 receptoren på murine T-celler er en robust struktur, som kan binde I

i 125l-IL-1a i Triton X-100 detergentopløsninger. For at kunne udvinde receptor fra en I

; sådan affinitetsmatrix er der behov for en mild elueringsprocedure. Mild syrebehand- I

ling kan resultere i hurtig dissociering af forud dannede IL-1 cx/IL-1 receptorkomplekser. I

Baseret på denne iagttagelse anvendtes pH 3,0 glycin HCI puffer indeholdende 0,1 % I

10 Triton X-100 til eluering af receptor fra IL-1 α affinitetskolonneme, hvilken receptor op- I

samledes i 0,05 ml fraktioner. Tilstedeværelsen af receptor i fraktionerne påvistes ved I

dot-blot som beskrevet ovenfor under anvendelse af 125l-mærket IL-1 α. I

Analyse ved SDS-PAGE forløb som følger. Til 50 μΙ af hver kolon- I

nefraktion sattes 50 μΙ 2 x SDS prøvepuffer (0,125 M Tris HCI, pH 6,8,4% SDS, 20% I

15 glycerol, 10% 2-mercaptoethanol). Opløsningen anbragtes i et kogende vandbad i 3 I

j minutter, og portioner på 40 μΙ anbragtes i en prøvebrønd med 10% polyacrylamidgel, I

hvilken prøveanordning blev opstillet og kørt iht. den af Laemmli (Nature 227:680, I

1970) beskrevne fremgangsmåde. Geler fikseredes og farvedes under anvendelse af I

0,25% Coomassie brilliant blue i 25% isopropanol og 10% eddikesyre, affarvedes i I

20 25% isopropanol og 10% eddikesyre, behandledes med Enhance (New England Nu- I

clear, Boston, MA, USA), tørredes og eksponeredes til Kodak X-omat AR film ved - I

70°C. Molekylvægtsmarkører, mærket med 14C, opnåedes fra New England Nuclear I

og omfattede cytochrom C (Mr 12.300), lactoglobulin A (Mr 18.367), carbonsyreanhy- I

drase (Mr 31.000), ovålbuman (Mr 46.000), bovinserumalbomin (M2 69.000), phos- . I

25 phorylase B (M2 97.400) og myosin (Mr 200.000). Alternativt analyseredes fraktioner I

med receptoraktivitet ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese efterfulgt af sølvfarvning I

som tidligere beskrevet af Urdal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6481,1984). I

Dot-blot analyse af fraktioner elueret fra IL-1 α affinitetsmatrixen viste, at I

IL-1 bindingsaktivitet blev påvist i fraktioner, der opsamledes efter at pH 3,0 glycin- I

30 puffer var blevet sat til kolonnen. Fraktioner, der gav positivt resultat ved denne assay,

afslørede ved analyse med SDS-PAGE, at et protein med Mr 82.000 kunne påvises I

ved fremkaldelse af gelen med sølvfarve. Til bestemmelse af, hvilke af de ved sølv- I

farvning påviste proteiner, der blev udtrykt på celleoverfladen, overflademærkedes El- I

4 6.1 celler med 125l ved lactoperoxidaseglucoseoxidaseproceduren. Radiomærkede I

35 celler ekstraheredes dernæst med PBS indeholdende 1% Triton X-100, og portioner af I

detergentekstrakten tilførtes en IL-1 α affinitetsmatrix. Fraktioner, der blev opsamlet fra I

SDK 175810 B1

>ldt et radio- I

isoleret fra I

ne af IL-1 re- I

c 10B EL-4 6.1 ! I

ss som be- I

r/ml og an- I

irocellulose og I

Hige koncen- I

taltes nitro- I

dr autoradio- I

IL-1IJ. De op- I

på en IL-1 I

et området af I

skning bloke- I

saueme var de I

ulose udviste I

i i intakte cel- I

vist på inakte I

jrens med den I

flade af plas- I

filtre, tørredes, I

ier testedes I

10-7 M), hu- I

; 10-4 M), mu- I

i epidermal I

ilnerve- I

ormon (1 I

jshormon (1 I

I DK 175810 B1 1 μς/ml) og follikelstimuleringshormon (1 pg/-ml). Alle inkubationer udførtes ved 1,9 x 10-10 M 125I-IL-1 a.

Dette forsøg viste, at ekstraheret receptor bibeholder samme specificitet som tidligere påvist for intakte celler. Som det viste sig at være tilfælde med intakte 5 celler frembragte kun IL-1 α og IL-1 β signifikant inhibering af 125I-IL-1 α binding. Datae- i ne viste, at umærket IL-1 α og IL-1 β frembragte >90% inhibering af 125l-IL-1cc binding, mens der ikke iagttages nogen signifikant blokade med nogen af de andre hormoner.

Til bestemmelse af, om receptor i detergentopløsning binder IL-1 med en affinitet, der svarer til den af receptor i cellemembraner eller adsorberet til nitrocellulo-10 se, udførtes et tredje forsøg, i hvilket der anventes en nitrocellulose dot-blot bindings-assay til testning af evnen afen EL-4 6.1 C10 ekstrakt i Triton X-100 opløsning til at inhibere binding af 125l-IL-1a til den faste fase. EL-4 6.1 C10 ekstrakter adsorberedes til nitrocellulose, tørredes, blokeredes og inkuberedes med en blanding af l2Sl-IL-1aog ekstrakter indeholdende receptorer i detergentopløsning.

15 Koncentrationen af receptor i opløsningsfasen bestemtes ud fra en mæt ningsbindingskurve til 1 pi portioner blottet på nitrocellulose, hvilket gjorde det muligt af beregne receptorer/μΙ og dermed IL-1 receptorkoncentration (M). Ekstrakten fortyndedes gennem PBS Triton X-100 opløsning (0,5% Triton) for at holde detérgenkoncen-trationen konstant. Inhiberingskurven viste, at receptoren i opløsning bandt til 125l-IL-1a 20 med en Ka (4,5 ± 0,5 x 109 M-1), som svarer til den for receptoren på den faste fase eller i membraner. Endvidere var den gode overensstemmelse mellem den teoretiske kurve, som er baseret på en enkelt kompetitiv inhiberingsmodel, og dataene samstemmende med den hypotese, at en enkelt type IL-1 bindingsprotein var til stede i membranekstrakten.

25 Til undersøgelse af integriteten af receptoren som en funktion af koncen trationen af totale EL-4 6.1 C10 membranproteiner udførtes et fjerde forsøg. Blandinger af EL-4 6.1 C10 ekstrakt i forskellige forhold i området fra 10 til 100% fremstilledes enten med en ekstrakt fra celler, der ikke udtrykker IL-1 receptoren, EL-4 (M) celler, eller med PBS Triton X-100 (0,5%). Hver blanding analyseredes for receptorkoncen-30 tration, og affinitet af 125l-IL-1a binding analyseredes ved kvantitativ dot-blot binding. Receptorkoncentration aftog lineært med procentdelen den tilstedeværende EL-4 6.1 C10 ekstrakt, uanset om membranproteinkoncentration holdtes på et konstant niveau eller ikke. I begge blandingsserier forblev affiniteten af receptoren for 125I-IL-1 α konstant. Disse data stemmer overens med en af to hypoteser, enten er receptorbin-35 dingsfunktionen indeholdt i en enkelt polypeptidkæde eller, hvis den funktionale re- I DK 175810 B1

I 24 I

ceptor kræver to eller flere underenheder for IL-1 binding, er kæderne tilstrækkeligt tæt I

I forbundet til, at fortynding via detergent ikke adskiller dem. I

I Eksempel 3 I

I 5 Rensning af IL-1 receptor til homogenitet og bestemmelse af N-terminal sekvens I

300-500 I EL-4 6.1 C10 celler dyrkedes til mætning under de tidligere I

beskrevne betingelser, høstedes og ekstraheredes med PBS*1 % Triton X-100. Deter- I

gentekstrakten overførtes til en IL-1a affinitetskolonne, og kolonnen vaskedes som I

tidligere beskrevet. Fraktioner indeholdende IL-1 receptor påvistes ved 125l-IL-1a dot- I

I 10 blot proceduren efterfulgt af eluering af kolonnen med 0,1 M glycin HCI, pH 3,0, inde- I

I holdende 0,1 % Triton X-100. Portioner af fraktionerne analysedes ved SDS-po- : I

lyacrylamidgelelektroforese. I

I Denne ved affinitetskromatografi på Affigel-IL-1a fremstillede, delvist I

rensede IL-1 receptorsammensætning indstilledes således, at den indehold følgende I

I 15 puffersammensætning: 10 mM Tris-HCI, pH 8, 250 mM NaCI, 0,5 mM MgCI2, 0,5 mM I

I MnCI2, 0,5 mM CaCI2 og 0,01% (vol/vol) Triton X-100 (WGA-puffer). IL-1 receptor- I

sammensætningn overførtes dernæst til en 1 ml kolonne med hvedekimaggluitinin I

(WGA) bundet til Sepharose C1-6B, ækvilibreret med WGA-puffer. Efter overførsel af I

IL-1 receptorsammensætningen vaskedes WGA-kolonnen med 20 ml WGA-puffer I

I 20 efterfulgt af 10 mM Tris HCI, pH 8,0,01% (vol/vol) Triton X-100. IL-1 receptorproteinet I

H elueredes fra WGA-kolonnen med 10 mM Tris-HCI, pH 8, 0,5 M N-acetylglucosamin I

og 0,01 % (vol/vol) Triton X-100. Tilstedeværelsen af biologisk aktiv IL-1 receptor påvi- I

stes ved 125l-IL-1a dot-blot proceduren. Fraktioner analyseredes også ved SDS- I

polyacryfamidgelelektroforese efterfulgt af sølvfarvning. I

25 Materiale, der elueredes fra WGA-kolonnen, overførtes til en C8 RP- I

HPLC-kolonne. C8 RP-HPLC-kolonnen (Brownlee Labs RP-300,1 mm x 50 mm) var I

forud blevet ækvilibreret med 0,1% (vol/vol) trifluoreddikesyre (TFA) i H20 af HPLC- I

kvalitet ved en strømningshastighed på 50 pl/minut. Efter overførsel af det IL-1 recep- I

torholdige materiale vaskedes C8 RP-HPLC-kolonnen med 0,1% (vol/vol) TFA i H20 I

30 ved 50 μΙ/minut indtil absorbansen ved 280 nm vendte tilbage til basislinien. IL-1 re- I

H ceptorproteinet elueredes fra kolonnen ved at køre en lineær gradient med 0,1 % I

(vol/vol) TFA i acetonitril fra 0-100% med en hastighed på 1 %/minut. Portioner af frak- I

tionerne analyseredes ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Det viste sig, at IL-1 I

receptorproteinet bestod af et enkelt bånd på en SDS-polyarylamidgel, der migrerede I

H 35 med en molekylvægt på 82.000. I

DK 175810 B1 25

Det rensede IL-1 receptorprotein analyseredes ved Edmannedbrydning under anvendelse af et Applied Biosystems Model 470A proteisekvensbestemmelses-apparat. Proteinet (150 picomol) blev ikke modificeret før analyse. Resultaterne af N-terminal proteinsekvensanalysen af IL-1 receptoren viser den følgende sekvens af 5 aminosyrerester: NH2-Leu-Glu-lle-Asp-Val-Cys-Thr-Glu-Tyr-Pro-Asn-Gln-lle-Val-Leu-Phe-Leu-Ser-Val-Asn-Glu-lle-Asp-lle-Arg-Lys.

Denne proteinsekvens fandtes at være enestående, når den sammenlignedes med den information, der den 17. marts 1987 var tilgængelig i proteinse-kvensdatabasen i Protein Identificatin Resource National Biomedical Research Foun-10 dation. Den tilgængelige information i databasen rummede 4.253 sekvenser bestående af 1.029.056 rester.

Eksempel 4

Isolering af cDNA-indkodende murin IL-1 R ved direkte ekspression af aktivt protein i 15 COS-7 celler

Et cDNA-bibliotek opbyggedes ved revers transkription af polyadenyleret mRNA isoleret fra total RNA ekstraheret fra EL-4 6.1 C10 celler ved en fremgangsmåde lig den af Chirgwin et al. beskrevne (Biochem. 18:5294,1979). I korte træk lyseredes cellerne i en guanidiniumisothio-cyanatopløsning, og lysatet lejredes over en pude 20 af CsCI og centrifugeredes indtil RNA’en var pelleteret. RNA-pelleten resuspendere-des og rensedes yderligere ved proteasenedbrydning, organisk ekstraktion og al-koholpræcipitation. Poly A+ RNA isoleredes ved oligo dT cellulosekromatografi, og dobbeltstrenget cDNA fremstilledes ved en fremgangsmåde, der lig den af Gubier og Hoffman beskrevne (Gene 25:263,1983). I korte træk kopieredes RNA'en til cDNA 25 ved revers transkriptase under anvendelse af enten oligo dT eller tilfældige oligo-' nukleotider som primer. cDNA’en gjordes dobbeltstrenget ved inkubation med E. coli DNA-polymerase I og RNase H, og enderne gjordes stumpe ved yderligere inkubation med T4 DNA-polymerase. Den stumpendede cDNA ligeredes i Smalskåret dephos-phoryleret pDC201 vektor DNA.

30 Den eukaryotiske højekspressionsvektor pDC201 samledes fra SV40, adenovirus 2 og pBR322 DNA, der i rækkefølge omfattede (1) et SV40-fragment indeholdende replikationsområdet, tidlige og sene promotorer samt forstærker, (2) et adenovirus 2 fragment indeholdende den sene hovedpromotor, den første exon og en del af den første intran af den tredelte sene leder, (3) en syntetisk sekvens omfattende 35 et Hindlll- sted, et splejsningsacceptorsted, anden og tredje exon af den tredelte adenovirus 2 leder og et multipelt kloningssted omfattende et Smal-sted, (4) yderligere

DK 175810 B1 I

26 I

SV40-sekvenser indeholdende tidlige og sene potyadenyleringssteder, (5) adenovirus I

2 sekvenser omfattende de virusassocierede RNA-gener, og (6) pBR322 elementer for I

replikation i E. coli. I

Det resulterende EL-4 6.1 C10 cDNA-bibliotek i pDC201 anvendtes til | I

5 transformering af E. coli stamme DH5a, og rekombinanter udpladedes til tilvejebrin- ' I

gelse af ca. 350 kolonier pr. plade og tilstrækkeligt mange plader til at tilvejebringe ca. I

25.000 totale kolonier pr. screen. Kolonier skrabedes fra hver plade, kombineredes, og I

ud fra hver pulje fremstilledes plasmid DNA. Den kombinerede DNA anvendtes der-

næst til transfektion af subkonfluente lag af abe COS-7 celler under anvendelse af I

10 DEAE-dextran efterfulgt af chlorquinbehandling som beskrevet af Luthman et al. (Nu- H

cleic Acids Res. 11:1295, 1983) og McCutchan et al. (J: Natl. Cancer Inst. 41:351, I

1986). Cellerne dyrkedes dernæst i kultur i tre dage for at muliggøre forbigående eks- I

pression af de indføjede sekvenser. Efter tre dage kasseredes cellekultursupeman- I

tanter, og cellemonolagene i hver plade analyseredes for IL-1 binding som følger. 3 ml H

15 RPMI-medium indeholdende 3 x 10-10M 125l-IL-1a sattes til hver plade, og pladerne I

inkuberedes i 2 timer ved 8°C. Dette medium kasseredes derefter, og hver plade va- I

skedes med 10 ml RPMI 1640 medium (ikke indeholdende mærket IL-1a). Kanterne af I

hver plade blev så knækket af, hvilket efterlod en flad skive, der bragtes i kontakt med

røntgenfilm i 72 timer ved -70°C under anvendelse af en forstærkende screen. IL-1 I

20 bindingsaktivitet blev synlig på de fremkaldte film som et mørkt sted mod en relativt I

ensartet baggrund. I

Efter screening af ca. 150.000 rekombinanter fra biblioteket på denne H

måde blev der iagttaget, at en transfektantpulje tilvejebragte IL-1 bindingssteder, som I

var klart synlige mod baggrunden. I

25 Et nedfrosset lager af bakterier fra den positive pulje anvendtes dernæst I

til opnåelse af plader med ca. 350 kolonier. Replika af disse plader fremstilledes på I

nitrocellulosefiltre, hvorefter pladerne skrabedes, og plasmid DNA fremstilledes og I

transficeredes som beskrevet ovenfor til identificering af en positiv plade. Bakterier fra I

individuelle kolonier fra nitrocellulosereplikaeme af denne plade dyrkedes i 2 ml kultu- I

30 rer, der anvendtes til opnåelse af plasmid DNA, som transficeredes i COS-7 celler som H

beskrevet ovenfor. På denne måde isoleredes en enkelt klon, klon 78, som var i stand I

til at inducere ekspression af 11-1R i COS-celler. Indføjedelsen subklonedes i et plas- I

mid afledt af pBR322 (GEMBL) og sekvensanalyseredes ved konventionelle teknikker. I

Sekvensen er vist i tabel 1.

27 DK 175810 B1 \

Eksempel 5 j i

Isolering af humane cDNA-kloner. der hvbridiserer til murin IL-1 receptorprobe DNA'er

En cDNA-polynukleotidprobe fremstilledes ud fra 2356 basepar (bp) fragmentet af klon 78 (se eksempel 4) ved nick-translation under anvendelse af DNA-5 polymerase I. Den anvendte metode var i det væsentlige lig den af Maniatis et al.

(ovenfor, p. 109) beskrevne.

Et cDNA-bibliotek opbyggedes ved revers transkription af polyadenyleret mRNA isoleret fra total RNA ekstraheret fra de dyrkede celler af en human T-cellelinie kaldet klon 22, beskrevet af Acres et al. (J. Immunol. 138:2132,1987). Disse celler 10 dyrkedes i RPM11640 medium plus 10% kalvefosterserum som beskrevet af Acres et al. (ovenfor), i nærvær af 10 ng/ml OKT3 antistof og 10 ng/ml human IL-2. cDN’en gjordes dobbeltstrenget under anvendelse af DNA-polymerase I, gjordes stumpendet med T4 DNA-polymerase, methyleredes med EcoRI methylase til beskyttelse af EcoRI spaltningsstedeme i cDNA'en, og ligeredes til EcoRI-linkere. De resulterende kon-15 struktioner blev nedbrudt med EcoRI til fjernelse af eksemplarerne af linkeme ved hver ende af cDNA’en på nær ét, og ligeret til EcoRI-skårne og dephosphorylerede arme af bakteriofag Agt10 (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL Press, pp. 49-78). Den ligerede DNA pakkedes i fagpartikler under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt sæt (Stratagene Cloning Synstems, San Diego, CA, USA 20 92121) til dannelse af et bibliotek af rekombinanter. Rekombinanteme udpladedes på E. coli stamme C600(hf1-) og screenedes ved standard plaquehybridiseringsteknikker under moderat strenge betingelser (50°C, 6 x SSC).

Efter flere screeningsrunder isoleredes ni kloner fra biblioteket, der hybri-diserede til cDNA-proben. Klonerne plaque-rensedes og anvendtes til fremstilling af 25 bakteriofag DNA, som blev nedbrudt med EcoRI. Nedbrydningsprodukteme underkastedes elektroforese på en agarosegel, blottedes på nylonfiltre og testedes igen for hybridisering. Klonerne blev nedbrudt med EcoRI efterfulgt af præparativ agarose-gelelektroforese, subklonedes dernæst i et EcoRI-skåret derivat (pGEMBL) af standard kloningsvektoren pBR322, der indeholdt en polylinker med et enestående EcoRI-30 sted, et BamH1-sted og talrige andre enestående restriktionssteder. Et eksempel på en vektor af denne type er beskrevet af Dente et al. (Nucleic Acids Research 11:1645, 1983).

Restriktionskortlægning og sekvensbestemmelse af en 4,8 kb human IL-1R klon viste, at klonen omfattede en sekvens, der indkoder 518 aminosyrer, som ud-35 viste 80% aminosyresekvensidentititet med den tilsvarende murine sekvens i det ex-tracellulære eller N-terminale område distalt til transmembranområdet, 63% identitet i

DK 175810 B1 I

28 I

transmembranområdet og 87% identitet i det cytoplasmiske eller C-terminale område. i m

I

Desuden var flere cysteinrester og de fleste N-bundne glycosyleringssteder mellem de I

murine og humane sekvenser. Et 440 bp EcoRI-Nsil fragment afledt af 5-delen af den I

humane IL-IR klon 32P-mærkedes ved nick-translation som beskrevet ovenfor og I

5 anvendtes til screening af et cDNA-bibliotek fremstillet ved randomiseret priming af I

klon 22 mRNA fremstillet som beskrevet ovenfor. 23 kloner, der hydbridiserede til pro- I

ben, blev isoleret og analyseret ved restriktionskortlægning. Sekvensbestemmelse af I

en af disse kloner tilvejebragte den sekvensinformation, der svarer til de resterende N- I

terminale 34 aminosyrer af det humane protein. Kodningen og de udledte aminosyre- I

10 sekvenser af det komplette kodningsområde af human IL-1R er vist i tabellerne 4A-4C. I

Eksempel 6 I

Ekspression af rekombinant IL-1 receptor under anvendelse af et høieffektivt mammalt I

ekspressionssvtem I

15 Det mammale ekspressionsplasmid pDC201, afbildet i fig. 2, er udformet I

til at udtrykke cDNA-sekvenser indføjet ved dets multiple kloningssted (MCS) ved I

transfektion i mammale celler. Idet der nu henvises til fig. 2 omfatter pDC201 følgende I

komponenter: SV40 (skraveret felt) indeholder SV40-sekvenser fra koordinater 5171- I

270 inklusive replikationsområdet, forstærkersekvenser og tidlige og sene promotorer. I

20 Fragmentet er orienteret således, at transkriptionsretningen fra den tidlige promoter er H

som vist ved pilen. Ad-MLP (uskraveret felt) indeholder adenovirus-2 sekvenser fra I

koordinater 5779-6231 inklusive den sene hovedpromotor, den første exon og en del I

af intronen mellem den første og den anden exon af den tredelte leder. TPL (stiplet I

felt) indeholder en syntetisk DNA-sekvens, der specificerer adenovirus-2 sekvenser H

25 7056-7172, 9634-9693 (indeholdende acceptorsplejsningsstedet af den anden exon af I

den tredelte leder, den anden exon og en del af den tredje exon af den tredelte leder) I

og et multipelt kloningssted (MCS) indeholdende steder for Kpnl, Smal og Bglll. pA I

(skraveret felt) indeholder SV40-sekvenser fra 4127-4100 og 2770-2533, der omfatter I

polyadenyleringen og termineringssignaleme for tidlige transkription. VA (udfyldt felt) I

30 indeholder adenovirus-2 sekvenser fra 10226-11555, der omfatter de virusassociere- I

de RNA-gener (VAI og VAII). De fuldt optrukne linier stammer fra pBR322 og repræ- I

senterer (begyndende efter pA-sekvenseme og i retning med uret) koordinater 29-23, I

651-185 (på hvilket punkt VA-sekvenseme bliver indføjet), 29-1,4363-2486 og 1094- I

375. pDC201 er et derivat af pMLSV, der tidligere er beskrevet af Cosman et al., Mo- I

35 lec. Immunol. 23:935 (1986). I

DK 175810 B1 29

Til ekspression af rekombinant IH receptor dyrkedes COS-celler og transficeredes som beskrevet af Cosman et al., ovenfor, med plasmid DNA’en fra en 1,5 ml kultur af E. coli transformeret med pDC201, som har en IL-1R cDNA-indføjelse (klon 78). Efter 72 timers dyrkning høstedes celler ved vaskning en gang med 10 ml j 5 PBS og efterfølgende behandling med en EDTA-opløsning (natriumphosphat 0,05 M, | natriumchlorid 0,15 M, EDTA 0,005 M, pH 7,4) i 20 minutter ved 37°C efterfulgt af skrabning. Til sammenligning transficeredes COS-celler med en pDC201 kontrol vektor, der ikke indeholdt nogen indføjelse, og EL-4 6.1 C10 celler og EL-4 M celler (en 11-1 receptornegativ variant af EL-4 celler) dyrkedes og høstedes som beskrevet af 10 McDonald et al., J. Immunol. 135:3964 (1985).

Ved mættende DNA-koncentrationer indeholdt det transficerede COS-cellemonolag gennemsnitligt 45.000 steder pr. celle. Da de parentale COS-celler udtrykte kun ca. 500 receptorer pr. celle, kan det beregnes, at mere end 98% af alle IL-1 receptorer i den transficerede population var rekombinante. Flowcytometri under an-15 vendelse af FITC-IL-1a afsløre-de, at kun 4,2% af cellerne blev farvet klart, hvorfor hver af disse transficerede COS-celler indeholdt ca. 1,1 x 106 IL-1 bindingssteder.

Plasmamembranproteiner af EL-4 6.1 C10 celler og af COS celler trans-ficeret med vektor DNA indeholdende cDNA, der indkoder IL-1 receptoren (klon 78), mærkedes med 125l som beskrevet i eksempel 1 ovenfor. Celler ekstraheredes derefter 20 med PBS indeholdende 1% Triton X-100 og en cocktail af proteaseinhibitorer (2 mM phenylmethylsulphonylfluorid, 1 mM pepstatin, 1 mM leupeptin og 2 mM O-phenanthrolin). Detergentekstrakter underkastedes affinitetskromatografi som beskrevet i eksempel 1 på Affigel-10 (Biorad, Richmond, CA), hvortil der var blevet bundet rekombinant human IL-1a 125l -mærket receptor elueredes dernæst med prøvepuffer 25 (0,0625 M Tris-HCI, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol) og analy seredes ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese på en 10% gel. Geler underkastedes dernæst autoradiografi. Den ved affinitetskromatografi på IL-1a kolonner rensede rekombinante IL-1 receptor migrerede med en relativ mobilitet på ca. 80.000 på SDS-polyacrylamidgeler, hvilket var sammenligneligt med den mobilitet, der udvistes af den 30 på samme måde fra EL-4 6.1 C10 celler oprensede IL-1 receptor.

DNA'en fra klon 78 førte, når den transficeredes i COS-celler, til ekspression af IL-1 bindingsaktivitet, der praktisk taget var identisk med den, der udvistes af EL-4 6.1 C10 celler, som vist i fig. 3A-3C.

Til bindingsassays resuspenderedes COS-celler ved 1,7 x 106 celler/ml til 35 EL-4 M (1,5 x 107 celler/ml) celler som bærere. EL-4 M og EL-4 6.1 C10 resuspenderedes ved 1.5 x 107 celler/ml. Alle cellesuspensioner og bindingsanalyser udførtes i

I DK 175810 B1 I

H

I I

I RPM11640/10% BSA/0,1% natriumazid/20 mM HEPES, pH 7,4. Bindingsinkubationer I

I med 125l-IL-1a eller 125I-IL-1 β og umærket IL-1aog IL-1 β udførtes som beskrevet I

I andetsteds i beskrivelsen. 125l-IL-1a bandt til de transficerede COS-celler med en Ka I

I på 3,0 ± 0,2 x 109 M-1 (Fig. 3B). Ka'en for den native receptor på EL-4 6.1 C10 celler I

5 var 4,3 ± 3 x 109 M-1. Alle bindinger var til rekombinante receptorer (se fig. 3A), den I

parentale COS-cellepopulation bandt ikke påviseligt 125I-IL-1 α i dette forsøg. I

I I et koldt sammenligningsforsøg var koncentrationen af fri 1251-1 L-1a I

I 7,72 ± 0,13 x 10-10 M. På de transficerede COS-celler var den maksimale binding I

2,98 ± 0,3 x 104 molekyler/celle (ingen inhibering), og baggrunden (målt i nærvær af 6 I

I 10 x 10-7 M umærket IL-1a) var 921 ± 60 molekyler/celle (100% inhibering). På EL-4 6.1 I

I C10 cellerne varden maksimale binding 1,33 ±0,02 x 104 molekyler/celle, og bag- I

I grunden (se ovenfor) var 47 + 2 molekyler/celle. Binding af 125l-IL-1a, både til de I

transficerede COS-celler og til EL-4 6.1 C10 celler, kunne udkonkurreres fuldstændigt I

I af et overskud af enten umærket IL-1 α eller umærket IL-1 β (fig. 3C). Inhiberingskon- I

I 15 stanterne for IL-1 α og for IL-1 β var meget lig hinanden for hver celletype (fig. 3C). I

Eksempel 7 I

I Fremstilling af monoklonale antistoffer mod IL-1 R I

I Præparater af renset rekombinant IL-1 R, fx. human IL-1 R, eller transfice- I

I 20 rede COS-celler, der udtrykker høje niveauer af IL-1 R, anvendes til dannelse af mo- I

noklonale antistoffer mod IL-1 R under anvendelse af konventionelle teknikker, fx. de i I

I US-patentskrift nr. 4.411.993 beskrevne. Sådanne antistoffer er sandsynligvis anven- I

I delige til indvirkning på IL-1 binding til IL-1 receptorer, fx. til forbedring af toxiske eller I

I andre uønskede virkninger af IL-1.

I 25 Til immunisering af mus emulgeres IL-1 R immunogen i komplet Freund's I

I ! adjuvans og injiceres i Baib/c mus i mængder fra 10-100 pg. 10 tiM 2 dage senere I

I boostedes de immuniserede dyr med yderligere immunogen emulgeret i ukomplet H

I Freund's adjuvans og boostes periodisk derefter iht. et ugentligt eller tougentligt im- I

I muniseringsskema. Serumprøver udtages periodisk ved retroorbital åreladning eller

I 30 halespidsexcision for testning ved dot-blot assay, ELISA-test (enzymbundet immun- H

I sorbent-assay) eller inhibering af binding af 1251-IL-loc til ekstrakter af EL-4 6.1 C10 I

I celler (som beskrevet ovenfor). Andre assayfremgangsmåder er også egnede. Efter I

I påvisning af en passende antistoftiter indgives en intravenøs injektion af antigen i salt- H

I vand til positive dyr. 3 til 4 dage senere aflives dyrene, splenocyter høstes og fusione- I

I 35 res til den murine myelomacellelinie NS1. Ved denne fremgangsmåde frembragte hy- I

I bridomacellelinier udplades i multiple mikrotiterplader i et HAT-selektivt medium (hy- DK 175810 B1 31 poxanthin, aminopterin og thymidin) til inhibering af proliferation af ikke-fusionerede celler, mvelomahvbrider oa miltcellehvbrider.

Således frembragte hybridomakloner kan screenes ved en ELISA-test for reaktivitet med IL-1R, fx. ved tilpasning af de af Engvall et al., Immunochmeistry 8:871 5 (1971) og i US-patentskrift nr. 4.703.004 beskrevne teknikker. Positive kloner injiceres dernæst i de peritoneale caviteter af syngeniske Balb/c-mus til fremstilling af ascites indeholdende høje koncentrationer (>1 mg/ml) anti-IL-1 R monoklonalt antistof. Det resulterende monoklonale antistof kan renses ved ammoniumsulfatpræcipitation efterfulgt af geleksklusionskromatografi og/eller affinitetskromatografi baseret på binding 10 af antistof til protein A af Staphylococcus aureus.

Eksempel 8

Ekspression af IL-1R i gær

Til ekspression af human eller murin IL-1R i gær opbygges en fra 15 plXY120 afledt gærekspressionsvektor som følger. plXY120 er identisk med pYo-HuGM (ATCC 53157), bortset fra, at den ikke indeholder nogen cDNA-indføjelse og omfatter et polylinker/multipelt kloningssted med et Ncol sted. Denne vektor omfatter DNA-sekvenser fra følgende kilder: (1) et stort Sphl (nukleotid 562) til EcoRI (nukleotid 4361) fragment udskåret fra plasmid pBR322 (ATCC 37017), inklusive replikationsom-20 rådet og ampiciilinresistensmarkøren for udvælgelse i E. coli, (2) S. cerevisiae DNA, der omfatter TRP-1 markøren, 2 pm replikationsområdet, ADH2-promotoren, og (3) DNA, der indkoder et 85 aminosyresignalpeptid afledt fra genet, der indkoder den udskilte peptid-a-faktor (se Kurjan et al., US-patent 4.546.082). Et Asp718 restriktionssted blev indført ved position 237 i a-faktorsignalpeptidet for at lette fusion til heterolo-25 ge gener. Dette tilvejebragtes ved ændring af thymidinresten ved nukleotid 241 til en cytosinrest ved oligonukleotidstyret in vitro mutagenese som beskrevet af Craik, Bio-techniques:12 (1985). Et syntetisk oligonukleotid indeholdende multiple kloningssteder og med følgende sekvenser indføjedes fra Asp718-stedet ved aminosyre 79 nær ved 3-enden af α-faktorsignalpeptidet til et Spel-sted i 2 pm sekvensen:

I DK 175810 B1 I

I 11

Asp718 Stul Ncol BamHI I

GTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGAGGCCTCCATGGAT...

GAAACCTATTTTCTCTGATGTTCCTGCTGGTACTGTTCTCCGGAGGTACCTA...

j <——Polylinker— I

I Smal Spel I

...CCCCCGGGACA

...GGGGGCCCTGTGATC

I —Polylinker—-»| i I

I

pBC120 adskiller sig også fra pYoHuGM ved tilstedeværelsen af et 514 bp DNA-

I 5 fragment afledt af den enkeltstrengede fag f1, der indeholder replikationsområdet og j I

I det intergeniske område, som er blevet indføjet ved Nru 1-stedet i pBR322-sekvensen. I

I Tilstedeværelsen af et f1 replikationsområde tillader frembringelse af enkeltstregede

DNA-kopier af vektoren ved transformation i passende stammer af E. coli og superin- I

fektion med bakteriofag f1, hvilket letter DNA-sekvensbestemmelse af vektoren og

I 10 tilvejebringer et grundlag for in vitro mutagenese. Til indføjelse af en cDNA nedbrydes I

I pIXY 120 med Asp718, der spalter nær ved 3'-enden af α-faktorlederpeptidet (nukieotid

I 237), og fx. Ncol, der spalter i polylinkeren. Det store vektorfragment renses dernæst I

I og ligeres til et DNA-fragment, der indkoder proteinet, som skal udtrykkes. H

Til skabelse af en udskillelsesvektor til ekspression af human IL-1R I

15 spaltes et cDNA-fragment, som indeholder den komplette åbne læseramme, der ind- I

I koder hlL-1 R, med en passende restriktionsendonuklease proximalt til N-terminalen af I

det modne protein. Derefter syntetiseres et eller flere oligonukleotider, som er i stand I

I til at ligere til 5'- og 3'-endeme af hlL-1R-fragmentet, idet eventuelle kodoner, der er H

I udeladt ved isolering af fragmentet, regenereres, og der også tilvejebringes cohæsive I

I 20 terminaler til Sigering til plXY120 for tilvejebringelse af en kodningssekvens, som befin- I

I der sig i ramme med hensyn til en intakt α-faktorledersekvens. I

I De resulterende ekspressionsvektorer renses dernæst og anvendes til

I transformation af en diploid gærstamme af S. cerevisiae (XV2181) ved standardtek- I

I nikker, såsom de i EPA 0165654 beskrevne, idet der udvælges på grundlag af tryp- I

I 25 tophanprototropher. De resulterende transformanter dyrkes for ekspression af et hIL- I

I 1R protein som et udskilt eller ekstraheret produkt. Kulturer, som skal analyseres for I

I hlL-1R ekspression, dyrkes i 20-50 ml YPD-medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 1% I

I glucose) ved 37°C til en celledensitet på 1-5 x 108 celler/ml. Til adskillelse af celler fra I

I medium fjernes celler ved centrifugering, og mediet filtreres gennem et 0,45 pm cellu- DK 175810 B1 33 loseacetatfilger før analyse. Supematanter fremstillet af den transformerede gærstamme, eller ekstrakter fremstillet ud fra desintegrerede gærceller analyseres for tilstedeværelsen af hlL-1R under anvendelse af bindsassays som beskrevet ovenfor.

5 Eksempel 9

Konstruktion, ekspression oa rensning af afkortet rekombinant murin IL-1 receptor En afkortet version af IL-1 receptorproteinet fremstilledes under anvendelse af et ekspressionssystem, som var kompatibelt med HELA-EBNA1 cellelinien, der konstitutivt udtrykker Epstein-Barr virusnukleusantigen drevet fra CMV-10 umiddelbartidlig forstærker promotoren. Den anvendte ekspressionsvektor betegnedes HAV-EO, et derivat af pDC201, der indeholder Epstein-Barr virus origin og tillader et højt niveau af ekspression i HELA-EBNA cellelinien. HAV-EO er afledt af pDC201 ved erstatning af den sene adenovirus hovedpromotor med syntetiske sekvenser fra HIV-1, der strækker sig fra cap-stedet af den virale mRNA, under anvendelse af den tidlige 15 SV40-promotor til at drive ekspression af HIV-1 tat genet.

Ekspressionskonstruktionen for den opløselige afkortede IL-1 receptor frembragtes trinvist. Hele kodningsområdet af receptoren og en del af det utranslate-rede 5'-område fjernedes fra den oprindelige IL-1 receptorklon 78 ved nedbrydning med Asp 718 og Ndel. Dette fragment, der ikke indeholdt utranslaterede 3'-sekvenser, 20 klonedes i HAV-EO til dannelse af HAV-EO-FL9. En variant af dette plasmid, der indeholdt en translationei stopkodon umiddelbart efter kodonen for prolin 316 og som manglede hele kodningssekvensen 3' herfor, opbyggedes derefter ved standardmetoder og kaldtes for HAV-EO-MEXT.

HAV-EO-MEXT vektor DNA indførtes i HELA-EBNA celler ved en modi-25 ficeret polybrentransfektion som beskrevet af Kavai og Nishizava (Mol. Cell Biol.

4:1172, 1984). 1,5 x 106 celler podedes i 10 ml DMEM + 10% FCS i en 10 cm vævskulturskål, Celler inkuberedes ved 37°C, 10% C02 i 16 timer. Medierne fjernedes dernæst, og der tilsattes 3 ml serumfri DMEM indeholdende 10 pg/ml DNA og 30 pg/ml polybren (Sigma). Skålene inkuberedes dernæst ved 37°C/10% C02 i yderligere 6 30 timer, på hvilket tidspunkt DNA-blandingen fjernedes og cellerne udsattes for glyce-rolchock ved tilsætning af 3 ml serumfri DMEM + 25% glycerol (vol/vol) i 1 minut. Glycerol fjernedes, og cellerne vaskedes to gange med medium. Dernæst tilsattes 10 ml DMEM + 10% FCS, og cellerne inkuberedes ved 37°C/10% C02 i 18 timer.

Transficerede celler fjernedes dernæst med trypsin og opdeltes i et for-35 hold på 1:9 i T175 cm2 kolber (til opnåelse af ca. 10% konfluens), der indeholdt 25 ml

DK 175810 B1 I

34

DMEM + 1% FCS. Supematanter indeholdende midlertidigt udtrykt opløselig murin IL- I

1 receptor høstedes hver 24. time i indtil 10 dage. I

IL-1a bindingsaktivitet i mediet måltes ved inhibering af 125IL-1a til EL4 I

6.1 C10 celler som beskrevet af Mosley et al. (J. Biol. Chem. 267:2941,1987) med I

5 undtagelse, af at mærket IL-1a (2x10-11, 50 pi) først inkuberedes med testprøven I

(50 μΙ) i to timer ved 8°C før tilsætning af celler (2,5 x 10e celler, 50 μΙ). Hver testprøve

analyseredes i 6 fortyndinger (X3), og inhiberingsdosisresponskurven anvendtes til H

bestemmelse af den relative inhibitoriske titer. H

^ Opløselig IL-1 receptor oprensedes fra kultursupematanter som H

10 beskrevet for naturlig receptor af Urdal et al. (J. Biol. Chem. 263:280, 1988). Kultursu- I

pematanter ledtes over en 1 ml leje volumen IL-1 oc kolonne, kolonnen vaskedes med H

PBS og elueredes med 0,1 M glycin-HCI. Syreeluatfraktioner neutraliseredes med det I

samme og testedes derefter for IL-1 bindingsaktivitet under anvendelse af radiore- I

ceptorinhiberingsanalyse. SDS-polyacrylamidgelelektroforese af det ved syrebehand- I

15 ling eluerede materiale viste, at det indeholdt to bånd med Mr 60.000 og 54.000. N- I

glycanasebehandling af dette materiale viste, at størrelsesheterogeniteten skyldes H

forskelle i N-bundet glycosylering mellem det to arter. Opløselig IL-1 receptor bibehol- I

der fuld IL-1 bindingsaktivitet. H

DK 175810 B1 35

Tabel 1: cDNA-sekvens af IL-1R klon i GEMBI78 1 5' -TGGGTCGTCT GACTAGAAGT GAGCTGTCTG ΤΠΑΤΤΓΤΤΓΓΓ artrr.iy^hnr

51 CCAGTAATCA TTTGGAGGCA AAGCAAACTG TAAGTAATGC TGTCCTGGGC

101 TGACTTCAGG AGGCAGITTT CGTTTTAACA GCCAGTGTTT ATTTGCTCAG

151 CAAACGTTGT CTCGGGGAGA AATGTCGCTG GATGTCATCA GAGTTCCCAG

201 TGCCCCGAAC CGTGAACAAC ACAAATGGAG AATATGAAAG TGCTACTGGG

251 GCTCATTTGT CTCATGCTGC CTCTCCTGTC CCTCCACATT CACCTATGTA

301 CAGAATATCC AAATCAGATC GTTTTGXTTT TATCTGTAAA TGAAATTGAT

351 ATTCGCAAGT GTCCTCTTAC TCCAAATAAA ATGCACGGCG ACACCATAAT

401 TTGGTACAAG AATGACAGCA AGACCCCCAT ATCAGCGGAC CGGGACTCCA

451 GGATTCATCA GCAGAATGAA CATCTTTGGT TTGTACCTGC CAAGGTGGAG

501 GACTCAGGAT ATTACTATTG TATAGTAAGA AACTCAACTT ACTGCCTCAA

551 AACTAAAGTA ACCGTAACTG TGTTAGAGAA TGACCCTGGC TTGTGTTACA

601 GCACACAGGC CACCTTCCCA CÅGCGGCTCC ACATTGCCGG GGATGGAAGT

651 CTTGTGTGCC CTTATGTGAG TTATTTTAAA GATGAAAATA ATGAGTTACC

701 CGAGGTCCAG TGGTATAAGA ACTGTAAACC TCTGCTTCTT GACAACGTGA

751 GCTTCTTCGG AGTAAAAGAT AAACTGTTGG TGAGGAATGT GGCTGAAGAG

801 CACAGAGGGG ACTATATATG CCGTATGTCC TATACGTTCC GGGGGAAGCA

851 ATATCCGGTC ACACGAGTAA TACAATTTAT CACAATAGAT GAAAACAAGA

901 GGGACAGACC TGTTATCGTG AGCCCTCGGA ATGAGACGAT CGAAGCTGAC

951 CCAGGATCAA TGATACAACT GATCTGCAAC GTCACGGGCC AGTTCTCAGA

1001 CCTTGTCTAC TGGAAGTGGA ATGGATCAGA AATTGAATGG AATGATCCAT

1051 TTCTAGCTGA AGACTATCAA TTTGTGGAAC ATCCTTCAAC CAAAAGAAAA

1101 TACACACTCA TTACAACACT TAACATTTCA GAAGTTAAAA GCCAGTTTTA

1151 TCGCTATCCG TTTATCTGTG TTGTTAAGAA CACAAATATT TTTGAGTCGG

1201 CGCATGTGCA GTTAATATAC CCAGTCCCTG ACTTCAAGAA TTACCTCATC

1251 GGGGGCTTTA TCATCCTCAC GGCTACAATT GTATGCTGTG TGTGCATCTA

1301 TAAAGTCTTC AAGGTTGACA TAGTGCTTTG GTACAGGGAC TCCTGCTCTG

1351 GTTTTCTTCC TTCAAAAGCT TCAGATGGAA AGACATACGA TGCCTATATT

1401 CTTTATCCCA AGACCCTGGG AGAGCGGTCC TTCTCAGACT TAGATACTTT

1451 TGTTTTTAAA CTGTTGCCTG AGGTCTTGGA GGGACAGTTT GGATACAAGC

1501 TGTTCATTTA TGGAACGGAT GACTATGTTG GAGAAGATAC CATCGAGGTT

1551 ACTAATGAAA ATGTAAAGAA AAGCAGGAGG CTGATTATCA TTCTAGTGAG

1601 AGATATGGGA GGCTTCAGCT GGCTGGGCCA CTCATCTGAA GAGCAAATAG

1651 CCATATACAA TGCTCTCATC CAGGAAGGAA TTAAAATCGT CCTGCTTGAG

1701 TTGGAGAAAA TCCAAGACTA TGAGAAAATG CCAGATTCTA TTCAGTTCAT

1751 TAAGCAGAAA CACGGAGTCA TTTGCTGGTC AGGAGACTTT CAAGAAAGAC

1801 CACAGTCTCC AAAGACCAGG TTCTGGAAAA ACTTAAGATA CCAGATGCCA

1851 GCCCAACGGA GATCACCATT GTCTAAACAC CGCTTACTAA CCCTGGATCC

1901 TGTGCGGGAC ACTAAGGAGA AACTGCCGGC AGCAACACAC TTACCACTCG

1951 GCTAGCATGG CAAAAGTGGG CAGGCCAAGA ACTTCGGAAT ATCTCCCATC

2001 ATAAGAGGCT GCAGCTGGGC TGTGCCTCCC AGTAAAACAG TCACGAACCA

2051 AACCTGTGCA GTCCCTTGTT CCAGATCACC TGGAACTGGA TTGGGAAGAG

2101 AACAGGACTT GGTGGCCAGG ACCGCTCAGA GAGCCATGGT TGCTCAGGGA

2151 TGCTGCTCCG GGATGCTTCA CTAACAGTCG AGGCAGTGAA CTGGGTGTAG

2201 AAAGCGTCAG GAAATGGCCA CATGTnrnr^A TGGTTTAATT AGATTCTGTG

2251 GAGTCTCACA GTGGGATTGT GGCTGTCTGA GGAGACTTTG GGGGGTCGCT

2301 GTCCAAGAAG TGGCTCCCCA AAGTATAAGT GCGGGTGAGG TTTACTGATA

! 2351 CCCCAC-3'

I DK 175810 B1 I

I 36 I

I Tabel 2A: Sekvens af kodningsområde af murin IL-1 receptoraen I

I 5'-ATC GAG AAT ATG AAA GTG CTA CTC CGC CTC ATT TGT CTC ATG GTG -15 I

I Met Clu Asn Hct Lys Tel leu Leu Gly Leu Ile Cys Leu Net Val I

I CCT CTG CTG TCG CTG GAG ATT GAC CTA TCT ACA CAA TAT CCA AAT 33 I

I Pro Leu Leu Ser Leu Clu Ile Asp Val Gys Thr Clu Tyr Pro Asn 11 I

I CAG ATC CTT TTC TTT TTA TCT CTA AAT CAA ATT CAT ATT CCC AAC 78 I

I Gin Ile Val Leu Phe Leu Ser Val Asn Glu Ile Asp Ile Arg Lys 26 , I

TGT CCT CTT AGT CCA AAT AAA ATG GAC GGC GAC ACC ATA ATT TCG 123 I

I Cys Pro Leu Thr Fro Asn Lys Met Bis Gly Asp Thr Ile Ile Trp 41 I

I TAC AAG AAT CAC ACC AAC ACC CCC ATA TCA CCC GAC CGC GAC TCC 168 I

I Tyr Lys Asn Asp Ser Lys Thr Pro Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ser 36 I

AGG ATT CAT CAG CAG AAT GAA CAT CTT TGG ITT CTA CCT GCC AAG 213 I

I Arg Ile Bis Gin Gin Asn Glu Bis Leu Trp Fhe Val Pro Ala Lys 71 I

I GTG GAG GAC TCA GGA TAT TAC TAT TGT ATA GTA AGA AAC TCA ACT 258 I

Val Glu Asp Ser Gly Tyr Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Asn Ser Thr 86 I

TAC TGC CTC AAA ACT AAA CTA ACC CTA ACT CTC TTA GAG AAT GAC 303 I

Tyr Cys Leu Lys Thr Lys Val Thr Val Thr Val Leu Glu Asn Asp 101 I

CCT GCC TTG TGT TAC AGC ACA CAG GCC ACC TTC CCA CAG CGG CTC 348 I

Pro Gly Leu Cys Tyr Ser Thr Gin Ala Thr Phe Pro Gin Arg Leu 116 I

I CAC ATT GCC GGG GAT GGA AGT CTT CTG TCC CCT TAT GTG AGT TAT 393 I

Bis Ile Ala Gly Asp Gly Ser Leu Val Cys Pro Tyr Val Ser Tyr 131 I

I ITT AAA GAT GAA AAT AAT CAG TTA CCC GAG CTC CAG TGG TAT AAG 438 I

Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Glu Val Gin Trp Tyr Lys 146 I

I AAC TCT AAA CCT CTC CTT CTT CAC AAC CTG ACC TTC TTC GGA GTA 4B3 I

Asn Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Vel Ser Phe Phe Gly Val 161 I

I AAA GAT AAA CTG TTG GTG AGG AAT GTG CCT GAA GAG CAG AGA GGG 528 I

Lys Asp Lys Leu Leu Val Arg Asn Val Ala Glu Glu Bis Arg Gly 176 I

GAC TAT ATA TGC CCT ATG TCC TAT AOG TTC CGG GGG AAG CAA TAT 573 I

Asp Tyr Ile Cys Arg Net Ser Tyr Thr Phe Arg Gly Lys Gin Tyr 191 I

CCC CTC ACA CCA GTA ATA CAA TTT ATC ACA ATA GAT GAA AAC AAG 618 I

Pro Val Thr Arg Val Ile Gin Phe Ile Thr Ile Asp Glu Asn Lys 206 I

I DK 175810 B1

Tabel 2B: Sekvens af kodninosområde af murin IL-1 receotoroen ACG GAC AGA CCT GTT KTC CTC AGC OCT OGG AAT GAG ACG ATC GAA 663

Arg Asp Arg Pro Val Ile Len Ser Pro Arg Asn Glu Thr Ile Glu 221

CCT GAC CCA CCA TCA ATG ATA CAA CTG ATC tCC AAC CTC ACC CCC 70S

Ale Asp Pro Gly Ser Met Ile Gin leu Ile Cys Asn Tel Thr Gly 236 CAG TTC TCA GAC CTT CTC TAC TGC AAG TGC AAT GGA TCA GAA ATT 753

Cln Phe Ser Asp Leu Tal Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Glu Ile 231 GAA TGC AAT GAT CCA TTT CTA CCT GAA GAC TAT CAA ITT CTC GAA 79Θ

Glu Trp Asn Asp Pro Phe Leu Ala Glu Asp lyr Gin Phe Vel Glu 266 CAT CCT TCA ACC AAA AGA AAA TAC ACA CTC ATT ACA ACA CTT AAC 843

Bl« Pro Set Thr Lys Arg Lys Tyr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Asn 281

ATT TCA GAA CTT AAA AGC CAG TTT TAT CGC TAT CCG TTT ATC TGT 88B

Ile Ser Glu Val Lys Ser Gin Phe Tyr Arg Tyr Pro Phe Ile Cys 296 GTT GTT AAG AAC ACA AAT ATT TTT GAG TCC G CG CAT CTG CAG TTA 933

Val Val Lys Asn Thr Asn Ile Phe Glu Ser Ala Bis Val Gin Leu 311 ATA TAC CCA CTC CCT GAC TTC AAC AAT TAC CTC ATC GGG CGC TTT 978

Ile Tyr Pro Val Pro Asp Phe Lys Asn Tyr leu Ile Gly Gly Phe 326 ATC ATC CTC ACG CCT ACA ATT GTA TGC TGT CTG TCC ATC TAT AAA 1023

Ile Ile Leu Thr Ala Thr Ile Val Cys Cys Val Cys Ile Tyr Lys 341 CTC TTC AAG GTT GAC ATA CTG CTT TGC TAC ACG GAC TCC TGC TCT 1068

Val Phe Lys Val Asp Ile Vel Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Ser 336 CCT ITT CTT CCT TCA AAA CCT TCA CAT CCA AAC ACA TAC CAT CCC 1113

Gly Phe Leu Pro Ser Lys Ale Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala 371 TAT ATT CTT TAT CCC AAG ACC CTG GGA GAG GGG TCC TTC TCA GAC 1138

Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp 386 TTA GAT ACT TTT CTT TTT AAA CTC TTG CCT CAG CTC TTC CAG GGA 1203

Leu Asp Thr Phe Val Phe Lys Leu leu Pro Glu Val Leu Glu Gly 401 CAG TTT GGA TAC AAG CTG TTC ATT TAT GGA AGG GAT CAC TAT GTT 1248

Cln Phe Gly Tyr Lys leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val 416 CCA GAA GAT ACC ATC GAG GTT ACT AAT GAA AAT GTA AAG AAA AGC 1293

Gly Glu Asp Thr Ile Glu Val Thr Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser 431

I DK 175810 B1 I

I 38 I

I Tabel 2C: Sekvens af kodninosområde af murin IL-1 receptorqen I

AGG AGG CTG ATT ATC ATT CTA GTG AGA GAT ATG GGA GGC TTC AGC 1338 I

I Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Asp Het Gly Gly Phe Ser 446 I

I TGG CTG GGC CAG TCA TCT GAA GAG CAA ATA GCC ATA TAC AAT GCT 1383 I

I Trp Leu Gly Gin Ser Ser Glu Glu Gin Ile Ala Ile tyr Asn Ale 461 I

I CTC ATC CAG GAA GGA ATT AAA ATC GTC CTG CTT GAG TTG GAG AAA 1428 I

I Leu Ile Gin Glu Gly Ile Lys Ile Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys 476

ATC CAA GAC TAT GAG AAA ATG CCA GAT TCT ATT CAG TTC ATT AAG 1473 I

I Ile Gin Asp Tyr Glu Lys Het Pro Asp Ser Ile Gin Phe Ile Lys 491 I

I CAG AAA CAC GGA GTC ATT TGC TGG TCA GGA GAC TTT CAA GAA AGA 151B I

Gin Lys Bis Gly Val Ile Cys Trp Ser Gly Asp Phe Gin Glu Arg 506 I

I CCA CAG TCT GCA AAG ACC AGG TTC TGG AAA AAC TTA AGA TAC CAG 1563 I

Pro Gin Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Leu Arg Tyr Gin 521 I

H ATG CCA GCC CAA CGG AGA TCA CCA TTG TCT AAA CAC CGC TTA CTA 1608 I

Net Pro Ala Gin Arg Arg Ser Pro Leu Ser Lys His Arg Leu Leu 536 I

ACC CTG GAT CCT GTG CGG GAC ACT AAG GAG AAA CTG CCG GCA GCA 1653 I

Thr Leu Asp Pro Val Arg Asp Thr Lys Glu Lys Leu Pro Ala Ala 551 I

I ACA CAC TTA CCA CT C GGC TAG-3' 1671 I

Thr His Leu Pro Leu Gly End 557 I

DK 175810 B1 39 1.5 * -AGACGCACCC TCTCAAOATG CTCCACTCCC TCCTCACAAC CTCGCACCCC 51 TTGCTAAAAG ACAAGGCCTT CTCCAAGAAG AATATCAAAC TCTTACTCAG 101 ACTTATTTGT TTCATAGCTC TACTGATTTC TTCTCTGGAG GCTGATAAAT 151 6GAAGGAAGG TGAAGAAAAA ATAATTTTAG TGTCATCTGC AAATGAAATT 201 GATGTTCGTC CCTCTCCTCT TAACCCAAAT GAACACAAAG GCACTATAAC 251 TTGGTATAAA GATGACAGCA AGACACCTGT ATCTACAGAA CAAGCCTCCA 301 GGATTCATCA ACACAAAGAG AAACTTTGGT TTGTTCCTCC TAAGGTGGAG 351 GATTCAGGAC ATTACTATTC CGTGGTAAGA AATTCATCTT ACTCCCTCAC A01 aattaaaata ACTGCAAAAT ttctggagaa tcagcctaac ttatgttata A51 atgcacaagc catatttaag cagaaactac ccgttgcagg agacggagga

301 CTTGTCTCCC CTTATATGCA CTTTTTTAAA AATGAAAATA ATCAGTTACC 551 TAAATTACAG TGGTATAAGC ATTGCAAACC TCTACTTCTT CACAATATAC 601 ACTTTAGTGG ACTCAAAGAT AGCCTCATOG TGATGAATGT GGCTGAAAAG 651 CATAGAGGGA ACTATACTTG TCATGCATCC TACACATACT TGGGCAAGCA 701 ATATCCTATT ACCCGGGTAA TAGAATTTAT TACTCTAGAG GAAAACAAAC 751 CCACAAGGCC TGTGATTGTG AGCCCAGCTA ATGAGACAAT GGAAGTACAC B01 TTGGGATCCC AGATACAATT GATCTCTAAT GTCACCGGCC AGTTGAGTGA 851 CATTGCTTAC TGGAACTCGA ATGGGTCAGT AATTGATGAA GATGACCCAG 901 TGCTAGGGGA AGACTATTAC AGTGTCGAAA ATCCTGCAAA CAAAAGAAGG 951 AGTACCCTCA TCACACTGCT TAATATATCG CAAATTGAAA CTAGATTTTA 1001 TAAACATCCA TTTACCTGTT TTGCCAAGAA TACACATGGT ATAGATGCAG 1051 CATATATCCA CTTAATATAT CCAGTCACTA ATTTCCAGAA GCACATGATT 1101 GGTATATCTG TCACGTTGAC AGTCATAATT GTGTGTTCTG TTTTCATCTA 1151 TAAAATCTTC AACATTGACA TTCTCCTTTG CTACAGGGAT TCCTGCTATG 1201 ATTTTCTCCC AATAAAAGCT TCAGATGGAA AGACCTATGA CGCATATATA 1251 CTGTATCCAA AGACTCTTGG GGAAGCGTCT ACCTCTGACT GTGATATTTT 1301 TGTGTTTAAA GTCTTGCCTG AGGTCTTGGA AAAACAGTGT GGATATAAGC 1351 TCTTCATTTA TGGAACGGAT GACTACCTTG GGGAACACAT TGTTGAGGTC 1401 ATTAATGAAA ACGTAAAGAA AAGCAGAAGA CTGATTATCA TTTTAGTCAG 1451 ACAAACATCA GGCTTCAGCT CGCTGGCTGG TTCATCTCAA GAGCAAATAC 1501 CCATGIATAA TGCTCTIGTT CAGGATGGAA TTAAAGTTGT CCTGCTTGAG 1551 CTGGAGAAAA TCCAAGACTA TGAGAAAATG CCAGAATCGA TTAAATTCAT 1601 TAAGCAGAAA CATGGGGCTA TCCGCTGGTC AGGGGACTTT ACACAGGGAC 1651 CACAGTCTGC AAAGACAAGG TTCTGCAAGA ATGTCAGGTA CCACATGCCA 1701 Gtccaccgac GGTCACCTTC ATCTAAACAC CACTTACTCT CACCAGCCAC 1751 TAAGCAGAAA CTGCAAAGAG AGGCTCACGT GCCTCTCCGG TAGCATGGAG 1801 AAGTTGCCAA GAGTTCTTTA GCTGCCTCCT CTCTTATGGC GTTCCAGGCC 1851 AGGTTATGCC TCATGCTGAC TTGCAGAGTT CATGGAATGT AACTATATCA 1901 TCCTTTATCC CTGAGGTCAC CTGCAATCAG ATTATTAAGG GAATAAGCCA 1951 TGACGTCAAT AGCAGCCCAG GGCACTTCAG AGTAGAGGGC TTGGGAAGAT 2001 CTTTTAAAAA GGCAGTAGGC CCGGTGTGGT GGCTCACGCC TATAATCCCA 2051 GCACTTTGGG AGGCTGAAGT GGCTGCATCA CCAGAGGTCA GGACTTCGAG 2101 ACGACCCCAG CCAACATGGC AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAAAAA 2151 TGAGCTAGGC ATGGTGGCAC ACCCCTGTAA TCCCAGCTAC ACCTGACGCT 2201 CAGGCAGGAG AATTCCTTCA ACCCGGGAGA CGGAGCTTGC AGTGAGCCGA 2301 GTTTGGGCCA CTGCACTCTA GCCTGGCAAC AGAGCAAGAC TCCCTCTCAA 2351 AAAAAGCGCA ATAAATGCCC TCTCTGAATG TTTGAACTGC CAAGAAAAGG 2401 CATGGAGACA GCGAACTAGA AGAAAGGGCA AGAAGGAAAT AGCCACCGTC 2451 TACACATGGC TTACTTAAGT CATCCACAGC CCAAGGCCGG CGGCTATGCC 2501 TTGTCIGGGG ACCCTGTACA CTCACTGACC CTGGAGCGGC TCTCCTGAGA 2551 GGTGCTGCAG CCAAAGTGAG ACTGACACCT CACTGAGGAA CGGAGACATA

2601 TTCTTGGAGA ACTTTCCATC TGCTTGTATT TTCCATACAC A7CCCCAGCC-3'

Tabel 3: cDNA-sekvens af human IL-1R konstruktion

40 I

DK 175810 B1 I

Tabel 4A: Sekvens af kodninasområde af human IL-1 receptorgen I

ATG AAA GTC TTA CTC ACA CIT ATT TGT TTC ATA CCT CTA CTG ATT -9 I

Het Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Lev Lev Ile -3 I

TCT TCT CTG GAG CCT CAT AAA TCC AAG GAA CCT CAA GAA AAA ATA 39 I

Ser Ser bro Glu A1& Asp Lys Cys Lys Clu Arg Clu Clu Lys Ile 13 H

ATT TTA CTC TCA TCT GCA AAT CAA ATT GAT GTT CCT CCC TGT CCT 84

Ile Leu Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro 28 ^ I

CTT AAC CCA AAT GAA CAC AAA GGC ACT ATA ACT TGG TAT AAA GAT 129 I

Leu Aan Pro Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp 43 I

GAC AGC AAG ACA CCT CTA TCT ACA GAA CAA GCC TCC ACG ATT CAT 174 I

Asp Ser Lys Thr Pro Val Ser Thr Glu Gin Ala Ser Arg Ile His 58 I

CAA CAC AAA GAG AAA CTT TGG TTT CTT CCT GCT AAG CTG GAG GAT 219 I

Gin His Lys Glu Lys Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp 73

TCA GGA CAT TAC TAT TCC GTG CTA AGA AAT TCA TCT TAC TGC CTC 264 I

Ser Gly His Tyr Tyr Cys Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu 88 H

AGA ATT AAA ATA AGT GCA AAA TTT CTC GAC AAT GAG CCT AAC TTA 309 I

Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu 103 I

TGT TAT AAT GCA CAA GCC ATA TTT AAG CAG AAA CTA CCC GTT GCA 354 I

Cys Tyr Asn Ala Gin Ala Ile Phe Lys Gin Lys Leu Pro Val Ala 118 I

GGA GAC GGA GGA CTT GTG TGC CCT TAT ATG GAG TTT TTT AAA AAT 399 I

Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr Het Glu Phe Phe Lys Asn 133 I

CAA AAT AAT GAG TTA CCT AAA TTA CAC TGG TAT AAG GAT TCC AAA 444 I

Clu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gin Trp Tyr Lys Asp Cys Lys 148

CCT CTA CTT CTT CAC AAT ATA CAC ITT AGT GGA CTC AAA GAT AGG 489 I

Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Vel Lys Asp Arg 183 I

CTC ATC CTG ATG AAT GTG GCT GAA AAG CAT AGA GGG AAC TAT ACT 534 I

Leu Ile Val Het Asn Val Ala Glu Lys Bis Arg Gly Asn Tyr Thr 178 I

TGT CAT CCA TCC TAC ACA TAC TTC GGC AAG CAA TAT CCT ATT ACC 579 I

Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro Ile Thr 193 I

CCC CTA ATA CAA TTT ATT ACT CTA GAG GAA AAC AAA CCC ACA AGG 624 I

Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg . 208 I

CCT GTG ATT GTG AGC CCA GCT AAT GAG ACA ATG GAA CTA GAC TTG 669 I

Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Het Glu Val Asp Leu 223 I

DK 175810 B1 I

Tabel 4B: Sekvens af kodninqsområde af human IL-1 receptorgen I

CCA TCC CAC ATA CAA TTG ATC TCT AAT CTC ACC CCC CAC TTG ACT 714 Gly Ser Cln Ile Gin Leu Ile Cys Asn Val Thr Cly Cln Leu Ser 238 GAC ATT GCT TAC TGG AAC TOG AAT GGG TCA GTA ATT CAT CAA CAT 739

Asp Ile Aln Tyr Trp Lys Trp Asn Cly Ser Val Ile Asp Glu Asp 253 CAC CCA CTC CTA GGG CAA CAC TAT TAC ACT CTC CAA AAT CCT GCA 804

Asp Pro Tal Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala 268 AAC AAA AGA AGG AGT ACC CTC ATC ACA CTC CTT AAT ATA TCG GAA 869

Asn Lys Arg Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu 283 ATT GAA ACT AGA TTT TAT AAA CAT CCA ΤΤΓ ACC TCT TTT CCC AAG 894

Ile Clu Ser Arg Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys 298 AAT ACA CAT GCT ATA GAT CCA CCA TAT ATC CAC TTA ATA TAT CCA 939

Asn Thr His Gly Ile Asp Ala Ala lyr Ile Gin Leu Ile Tyr Pro 313 I CTC ACT AAT TIC CAC AAG CAC ATC ATT CCT ATA TGT CTC ACG TTG 984

Val Thr Asn Phe Gin Lys Bis Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu 328 ACA CTC ATA ATT GTG TGT TCT CTT TTC ATC TAT AAA ATC TTC AAC 1029

Thr Vel Ile Ile Val Cys Ser Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys 343 ATT GAC ATT CTC CTT TGG TAC AGG GAT TCC TCC TAT CAT TTT CTC 1074

Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu 358 CCA ATA AAA GCT TCA GAT CGA AAG ACC TAT GAC GCA TAT ATA CTG 1119

Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu 373 TAT'CCA AAG ACT CTT GGG GAA GGG TCT ACC TCT GAC TCT GAT ATT 1164 Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr Ser Asp Cys Asp Ile 388 TTT CTG TTT AAA CTC TTG CCT GAG CTC TTG GAA AAA CAG TGT GGA 1209

Phe Vel Pha Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Lys Gin Cys Gly 403 TAT AAG CTG TTC ATT TAT GGA AGG GAT GAC TAC GTT GGG GAA GAC 1254

Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Cly Arg Asp Asp Tyr Vel Gly Glu Asp 418 ATT CTT GAG CTC ATT AAT GAA AAC CTA AAG AAA AGC AGA AGA CTG 1299

Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg Arg Leu 433 ATT ATC ATT TTA CTC AGA GAA ACA TCA GGC TTC ACC TGG CTG CCT 1344

Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Gly 448 GCT TCA TCT CAA GAG CAA ATA GCC ATG TAT AAT GCT CTT CTT CAG 1389

Cly Ser Ser Glu Clu Gin Ile Ala Het Tyr Asn Ala Leu Val Gin 463 CAT CGA ATT AAA CTT CTC CTG CTT CAG CTG CAC AAA ATC CAA GAC 1434

Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Clu Lys Ile Gin Asp 478

DK 175810 B1 I

I

Tabel 4C: Sekvens af kodninasområd'e af human IL-1 receptoraen I

I TAT GAG AAA ATG CCA C AA TCG ATT AAA TTC ATT AAG CAG AAA CAT 1479 I

I Tyr Glu Lys Net Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gin Lys Bis 493 I

CGG CCT ATC CGC TGG TCA GGG GAC ΤΤΓ ACA CAG GCA CCA CAG TCT 1524 I

Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gin Gly Pro Gin Ser 508 I

I GCA AAG ACA AGG TTC TGG AAG AAT GTC AGC TAC CAC ATG CCA GTC 1569 I

Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr Bis Net Pro Val 523 I

I CAG CGA CGG TCA CCT TCA TCT AAA CAC CAG TTA CTG TCA CCA GCC 1614 I

I Gin Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys Bis Gin Leu Leu Ser Pro Ala 538 I

I ACT AAG GAG AAA CTG CAA AGA GAG GCT CAC GTG CCT CTC GGG TAG 1656 I

Thr Lys Glu Lys Leu Gin Arg Glu Ala Bis Val Pro Leu Gly End 552 I

I I

Η' I

Η I

43 DK 175810 B1

Tabel 5: Sammenligning af human oo murin 1L-1 receptoraminosvresekvens i f 1=1 ΙξΙ j-1 1|-μ| Lj I-j ij fif *l=j* pa j:j 1-1 1=1 |J ||| j:| |il -|=| |:| jfj |ξ| 1 I |=| ,|=| |z^

U Sil Sil “111· |J III

i

Claims (7)

44 I DK 175810 B1 I

1. Homogen biologisk aktiv opløselig human lnterleukin-1 Re- H ceptor (IL-1R) sammensætning, hvori nævnte humane IL-1R har en aminosyrese- H 5 kvens der er mere end 80% homolog med aminosyresekvensen vist i Tabel 4A-4C · H eller til den del af sekvensen, der består af aminosyreme 1-319 vist i de nævnte figurer H og, hvor den nævnte IL-1 R ikke har en cytoplasmatisk eller transmembran region. I

2. Isoleret IL-1 receptor omfattende aminosyresekvensen be- I 10 stående af aminosyreme 1-319 i Tabel 4A-4C. I

3. Isoleret opløselig IL-1 receptor omfattende en opløselig I form af polypeptidet ifølge Tabel 4A-4C, hvori den opløselige IL-1 receptor har IL-1 I bindende aktivitet og, hvor den nævnte IL-1R ikke har en cytoplasmatisk eller trans- I 15 membran region. I

4. Opløselig human IL-1 receptor til medicinsk anvendelse, I hvor receptoren har en aminosyresekvens der er mere end 80% homolog med amino- I syresekvensen vist i Tabel 4A-4C eller til den del af sekvensen, der består af aminosy- I 20 rerne 1-319 vist i de nævnte figurer og, hvor den nævnte IL-1R ikke har en cytoplas- I matisk eller transmembran region. H

5. Anvendelse af en opløselig human IL-1 receptor til fremstil- H ling af et medikament til regulering af immun- eller inflammatoriske responser, hvor 25 receptoren har en aminosyresekvens, der er mere end 80% homolog med aminosyre- H sekvensen vist i Tabel 4A-4C eller til den del af sekvensen, der består af aminosyreme H 1-319 vist i de nævnte figurer og, hvor den nævnte IL-1 R ikke har en cytoplasmatisk H eller transmembran region. H

6. Farmaceutisk præparat, som er egnet til parenteral admini- I strering til en human patient til regulering af immun- eller inflammatoriske responser, H KENDETEGNET ved, at den omfatter en virksom mængde af en opløselig human IL-1 I receptor ifølge Tabel 4A-4C i blanding med en egnet diluent eller bærer. I

7. Antistof, som er immunreaktivt med en IL-1 receptor, der H har aminosyreme 1-552 i Tabel 4A-4C. I