DK175403B1 - DNA kodende for proteiner, der binder til human IL-1 - Google Patents

Description

DK 175403 B1 I

Den foreliggende opfindelse angar generelt DNA kodende for proteiner, der bin- I

der til human IL-1 I

lnterleukin-1oog lnterleukin-ΐβ (IL-Ισ og IL-1 β) er fjernt beslægtede polypeptid- I

hormoner, der spiller en central rolle ved reguleringen af immun— og inflammatoriske re- I

5 sponser Disse to proteiner blev oprindeligt begge klassificeret som IL-1 på grundlag af

en fælles lymfocytaktiveringsfaktor (LAF) aktivitet og en fælles hovedcellekilde, akti- I

verede makrofager De samlede informationer fra undersøgelser, hvor der blev anvendt I

rensede naturlige og rekombinante IL-1 molekyler, har gjort det klart, at IL-1 a og IL-1 β I

hver især medierer de fleste, om ikke alle, af det det brede spektrum af aktiviteter, der I

10 tidligere blev tilskrevet IL-1 Grundlaget for dette næsten identiske spektrum af biologi- I

ske aktiviteter antages at være en enkelt klasse plasmamembran IL-1 receptorer, der I

binder både IL-1 a og IL-1 β I

Der er tidligere blevet publiceret nogle fa foreløbige rapporter vedrørende eksi- I

stensen af en IL-1 plasmamembranreceptor Hidtil har strukturel karakterisenng af Inter- I

I 15 leukin-1 receptoren været begrænset til bestemmelser af molekylvægten af dette protein I

I ved gelfiltrenng, ved SDS-PAGE analyse af covalente komplekser dannet ved kemisk I

I 125 I

I tværbinding mellem receptoren og l-IL-1 molekyler og ved immunpræcipitenng af

I mærkede overfladeproteiner I

I Dover et al (j Exp Med 162 501,1985) og Dover et al (Proc Natl Acad Sci I

I 20 USA 83 1060, 1986) beskriver kemiske tværbindingsundersøgelser, der viser et tilsyne- I ladende 79 5 kilodalton (kDa) plasmamembranprotein på LBRM-33-1A5 murme T-lym- I fomaceller og et overfladeprotein på 78 kDa på en murin fibroblastcellelime, der bandt I 125 I l-mærket human lnterleukin-1 β Kilianetal (J Immunol 136 4509,1986) rapporte- I 125 I rede, at murin l-IL-1 a, der binder til munne thymomaceller, kunne blive blokeret med I 25 human fL-Ισ og IL-1 β Dover et al (Nature 324 266,1986) rapporterede kompetitive I v bindingsundersøgelser, der viste, at IL-1 a og IL-1 β bandt til de samme celleoverfladere- I ceptorer på LBRM-33-1A5 celler, humane dermale fibroblaster, munne BALB-3T3 celler I samt ARH77, en human B-lymfoblastoidcellelime Receptorerne i de forskellige celleli- I mer udviste lignende, men ikke identiske bindingskarakteristika Det blev påvist, at IL-1 I 30 receptorerne på porerne synoviale fibroblaster (Bird et al, Nature 324 263, 1986) og hu- I mane dermale fibroblaster (Chin et al, J Exp Med 165 70,1987) giveren hovedart i I størrelsesområdet Mr 97 000-100 000, når de tværbindes med mærket IL-7„hvilket lader I formode, at et protein med Mr 80 000 var ansvarligt for binding af IL-1 I modsætning I hertil udviste IL-1 receptorer, der på denne måde blev karaktenseret på humane B-celler I 35 (Matsushima et al. J Immunol 136 4496,1986), en tilsyneladende molekylvægt på I DK 175403 B1 I 60 000

Bron og MacDonald, FEBS Letters 219 365 (1987) besknver immunpræcipitenng af murin IL-1 receptor fra overfldemærkede EL-4 celler under anvendelse af et polyklo- nalt kanmantiserum rettet mod IL-1 Dette arbejde viser, at den murine receptor er et gly- 5 coprotein med en tilsyneladende molekylvægt på ca 82 000 dalton

Radiomærket IL-1 er blevet anvendt i kemiske tværbindingsundersøgelser og til påvisning af receptor i detergentekstrakter af celler Resultaterne af disse ovenfor anfør- te forsøg lader formode, at et protein med Mf 60 000 eller 80 000 er ansvarligt for bin- ding af IL-1 Tværbindingen af radiomærket IL-1 til celler har også ført til den lejligheds- H 10 vise påvisning af proteiner, som adskiller sig fra hovedarten med Mr 80 000, hvilket lader ’ formode, at IL-1 bindingsmolekylet kan forekomme i membranen som del af et multi- subumt-receptorkompleks

Til undersøgelse af strukturen og de biologiske egenskaber af IL-1 receptorer og den rolle, IL-1 receptorer spiller for responserne af forskellige cellepopulationer over for 15 IL-1 stimulering, eller den effektive anvendelse af IL-1 receptorer til terapi, diagnose eller analyse, er der brug for homogene IL-1 receptorsammensætninger Sådanne sammen- sætninger er teoretisk tilgængelige via oprensning af solubiliserede receptorer, der ud- trykkes af dyrkede celler, eller ved kloning og ekspression af gener, der koder for recep- torerne Hidtil har flere forhmdnnger imidlertid stået i vejen for opnåelsen af disse mål 20 Selv i cellelinier, der vides at udtrykke påviselige niveauer af IL-1 receptor, er IL- 1 receptoren til stede som en meget lille komponent af de samlede celleproteiner Des- uden kendte man ingen cellelinier, der konstitutivt og kontinuert udtrykte høje niveauer af IL-1 receptorer For eksempel udtrykker den munne EL-4 6 1 cellelinie påviselige m- veauer af IL-1 receptor, men niveauet af IL-1 receptorekspression har en tendens til at I 25 nedbrydes med tiden, hvilket i høj grad komplicerer arbejdet met at opnå tilstrækkelige mængder af receptor til tilvejebnngelse af et anvendeligt udgangsmateriale til oprens- ning Således blev der tilvejebragt en fremgangsmåde til fortløbende udvælgelse af cel- ler til opnåelse af acceptable niveauer af IL-1 receptorekspression under anvendelse af I fluorescensaktiveret cellesortenng (FACS) 30 Yderligere problemer opstår, når man forsøger at klone mammale gener, der ko- I der for IL-1 receptor Selvom der kan opnås en proteinsammensætning med tilstrækkelig I renhed til at tillade N-terminal proteinsekvensbestemmelse, tillader degenereringen af I den genetiske kode typisk ikke, at en egnet probe defineres uden omfattende yderligere I forsøg Det kan kræve mange iterative forsøg at definere en probe med den fornødne I 35 specificitet til identificenng af en hybridiserende sekvens i et cDNA-bibliotek For at om- 3 DK 175403 B1 gå dette problem blev der udtænkt en hidtil ukendt direkte receptorekspressionsklo-ningstekmk til undgåelse af behovet for gentagen screening under anvendelse af forskellige prober af ukendt specificitet Denne teknik, som aldrig tidligere er blevet anvendt, tillader direkte visualisering af receptorekspression efter transfektion af en mammal celleli-5 nie med en højekspressionsvektor indeholdende en cDNA-klon, der koder for receptoren

Oprensede IL-1 receptorsammensætninger vil være nyttige i diagnostiske assays for IL-1 eller IL-1 receptor og ligeledes til opnåelse af antistoffer mod IL-1 receptor til anvendelse i diagnose og terapi Desuden kan oprensede IL-1 receptorsammensætninger 10 anvendes direkte i terapi til binding eller fjernelse af IL-1, hvorved der tilvejebringes en metode til regulering af immunaktiviteterne eller de inflammatoriske aktiviteter af dette cytokin

Den foreliggende opfindelse tilvejebnnger en DNA-sekvens, der koder for et protein, der er i stand til at binde human IL-1, hvon DNA-sekvensen koder for en aminosyre-15 sekvens, der er mere end 80% homolog med aminosyresekvensen vist i figurerne 5A-5B eller til en del deraf, som består af ammosyrerne 1-319 vist i de omtalte figurer

Den foreliggende opfindelse tilvejebnnger også rekombinante ekspressionsvektorer omfattende de ovenfor definerede DNA-sekvenser, rekombinante IL-1 R molekyler fremstillet under anvendelse af de rekombinante ekspressionsvektorer, samt fremgangs-20 måder til fremstilling af de rekombinante IL-1 R molekyler under anvendelse af ekspression svektorerne

Den foreliggende opfindelse tilvejebnnger også i det væsentlige homogene proteinsammensætninger, der omfatter munn eller human IL-1 receptor Den murine molekyle er et glycoprotein med en molekylvægt på ca 82 000 dalton ifølge bestemmlse ved 25 SDS-PAGE, en bindingsaffinitet (K ) for human IL-1 σ fra 3-6 x 10^ M’1, og den N-termi-nåle aminosyresekvens LEIDVCTEYPNQIVLFLSVNEIDIRK

I et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til oprensning af IL-1 receptor, der omfatter tilsætning af en prøve omfattende IL-1 receptor til en affim-tetsmatnx omfattende et IL-1 molekyle bundet til en uopløselig bærer og eluenng af bun-30 det IL-1 receptor fra affimtetsmatnxen Den delvist oprensede IL-1 receptor kan oprenses yderligere ved overførsel til en lectinaffimtetskolonne og efterfølgende eluenng af IL-1 receptoren fra lectinaffmitetskolonnen Den delvist oprensede IL-1 receptor kan derefter behandles ved revers fase højtryksvæskekromatografi og elueres som en enkelt ab-sorbanstop ved 280 nm, der når den analyseredes ved hjælp af SDS-PAGE og sølv-35 farvning, optrådte som et enkelt bånd Som anført ovenfor havde den native murme IL-1 I DK 175403 B1 receptor en tilsyneladende molekylvægt på ca 82 000 dalton ifølge bestemmelse ved

SDS-PAGE

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også sammensætninger til anvendelse ved terapi, diagnose eller assay of IL-1 receptor eller til tilvejebringelse af antistoffer mod 5 IL-1 receptorer omfattende virksomme mængder af opløselige native eller rekombinante receptorproteiner fremstillet iht de foregående fremgangsmåder Sådanne opløselige re- kombinante receptormolekyler omfatter afkortede proteiner, hvori områderne af receptor- molekylet, der ikke er nødvendige for IL-1 binding, er blevet udeladt Disse og andre aspekter af opfindelsen vil fremgå af den efterfølgende detaljerede beskrivelse og teg- 10 ningen Oplysninger, der ikke er relateret til opfindelsen genstand, er givet til information

Fig 1 er et restriktionskort over cDNA-konstruktioner omfattende kodnmgsområ- derne for de munne og humane IL-1 R gener Det murme fragment, isoleret fra EL-4 6 1 C10 celler og til stede som en indføjelse i klon GEMBL78, er blevet deponeret hos Ame- ncan Type Culture Collection under løbenummeret ATCC 67563 15 Fig 2 er en skematisk afbildning af det mammale højekspressionsplasmid pDC301, som er beskrevet mere detaljeret i eksempel 6 , Fig 3A-3C er en grafisk sammenligning mellem IL-1 bindingsegenskabeme af 195 naturlige og rekombinante IL-1 receptorer Fig 3A sammenligner direkte binding af I- IL-1 a til celler, der udtrykker nativ IL-1 receptor (EL4 6 1 C10) eller rekombinant receptor 20 (COS-lL-1 R), fig 3B viser dataene fra fig 3A indtegnet i Scatchard-koondnatsystemet 125

Fig 3C viser kompetitiv l-IL-1 a binding mellem umærket IL-1 a og IL-1 β I fig 3 angi- ver C koncentrationen af IL-1 sat til bindingsinkubationen (molær), r angiver molekyler af IL-1 bundet pr celle IL-1 ø og IL-1 β regulerer tilsyneladende cellers metabolisme gennem et fælles 25 plasmamembranreceptorprotem IL-1 receptor fra detergentopløsninger af EL-4 6 1 C10 celler er blevet stabilt adsorberet til nitrocellulose under fuld bibeholdelse af IL-1 bm- I dingsaktivitet Dette assaysystem blev anvendt til overvågning af oprensningen af IL-1 receptoren og til undersøgelse af virkningerne af adskillige kemiske modifikationer på re- I ceptorbindmgsaktiviteten IL-1 receptorer ekstraheret fra EL-4 6 1 C10 celler kan bindes 30 til og specifikt elueres fra IL-1 a koblet til Sepharose eller andre egnede affimtetskroma- I tografibærere I Oprensning ved den foregående fremgangsmåde resulterede ved sølyfarvnmg af I polyacrylamidgeler i identifikation af et protein på Mf 82 000 dalton, som var til stede i I fraktioner, der udviste IL-1 bindingsaktivitet Forsøg, ved hvilke celleoverfladeproteiner af 35 EL-4 celler radiomærkedes og l-maerket receptor oprensedes ved affmitetskromato- 5 DK 175403 B1 graft, lod formode, at proteinet med M 82 000 blev udtrykt på plasmamembranen N-glycanasebehandling af dette materiale viste, at 21-35% af den samlede Mr (82 000) af receptoren var N-bundet carbonhydrat

Til definition af de kemiske egenskaber af IL-1 receptoren udtænktes et enkelt, 5 reproducerbart og kvantitativt assaysystem til påvisning af IL-1 receptor i detergentopløsninger Med dette assay kan receptoroprensningen følges, og ændringer i receptor-bindingsaktiviten som respons på kemisk modifikation af receptoren kan let overvåges

Bindinqsassav for IL-1 receptor 10 Rekombinant human IL-Ιβ og IL-1a kan fremstilles ved ekspression ιΈ coli og oprensning til homogenitet som beskrevet af Kronheim et al (Bio/Technology 4 1078, 1986) Rekombinant human IL-1 a udtrykkes fortnnsvis som et polypeptid sammensat af de C-terminale 157-rester af IL-1 a, der svarer til 17 500 formen af proteinet, der afgives af aktiverede makrofager Det oprensede protein opbevares ved —70°C i fosfatpufret 15 saltvand som en forrådsopløsning på 3 mg/ml 10 pi (30 pg) portioner af forråds- 125 opløsningen mærkes med natnum ( I) lodid ved en modificeret chloramin-T-metode beskrevet af Dover et al (Nature 324 266,1986) og Segal et al (J Immunol 118 1338,

1977) Ved denne procedure sættes 10 pg rlL-Ισ (0,57 nmol) 110 μΙ fosfat(0,05 M)pufret saltvand (0,15 M), pH 7,2, (PBS) til 2,5 mCi (1,0 nmol) natriumiodid 125 μΙ 0,05 M

_4 20 natriumfosfat, pH 7,0 Reaktionen indledes ved tilsætning af 30 μ11,4 x 10 M chlor- amin-T (.4,2 nmol, Sigma Chemical Co , St Louis, MO, USA) Efter 30 minutter på is fraktioneres reaktionsblandingen ved gelfiltrenng på en Biogel P6 (Bio-Rad, Richmond, 125 CA, USA) kolonne med 1 ml leje-volumen Rutinemæssigt inkorporeres 40-50% 11 protein 125 25 l-IL-1 σ kan oprenses ved gelfiltrering eller andre egnede metoder og med det -8 samme fortyndes til en arbejdsforradsopløsnmg på 3 x 10 Μ i Roswell Park Memorial

Institute (RPMI) 1640 medium omfattende 1 vægt/vol % bovin serumalbumin (BSA), 0,1 vægt/vol % natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,4 (bindingsmedium) for at undgå radiolyse Sådanne fortyndede opløsninger kan lagres i op til 1 måned uden påviseligt tab af re- 15 30 ceptorbindmgsaktivitet Den specifikke aktivitet er rutinemæssigt i området 1-3x10 cpm/mmol (ca latomiodpr IL-1 a molekyle) Typisk er det mærkede protein i begyndelsen (før fortynding) 100% aktivt ifølge bestemmelse af dets evne til at fremkalde IL-2 125 produktion ud fra EL-4 6 1 C10 celler Desuden kan 100% af I cpm præcipiteres ved med tnchloreddikesyre, og >95% kan absorberes af IL-1 receptorbærende celler 35 EL-4 6 1 C10 celler propageres i suspensionskultur som beskrevet af MacDonald I DK 175403 B1 etal.J Immunol 135 3964(1985) En IL-1 receptor negativ variantlime af EI-4 celler, EL-4 (M) (ATCC TIB 39), dyrkes på identisk måde Celler overvåges ugentligt for IL-1 re- 125 ceptorekspression ved l-IL-1 σ-bmding

Til opretholdelse af relativt høje niveauer af receptorekspression kan celler sorte- 5 res under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og fluoresceinkonju- geret rekombinant IL-1 a Fluoresceinkonjugeret rlL-1a (FITC IL-1 σ) fremstilles ved om- sætning af 2,9 nm protein med 100 nm fluorescemisothiocyanat (Research Organics,

Cleveland, Ohio) i et samlet volumen på 70 μΙ borat(0,02 M)pufret saltvand (0,15 M), pH

8,5, i to timer ved 37°C Protein adskilles fra ukonjugeret farvestof ved gelfiltrering på en 10 P6 kolonne med 1 ml lejevolumen som beskrevet af Dover et al (J Exp Med 162 501, 1985) Under anvendelse af et EPICS C flowcytometer (Coulter Instruments, 488 nM ar- gonlaserlime, 300 MW, forstærkning 20, PMT-spændmg 1700), opsamles celler, der til- vejebrmger det højeste fluorescenssignalmveau (fx toppen 1,0% eller 0,1 %, efter ønske) og anvendes til etablering af cellekulturer for receptorekspression 15 Til ekstraktion vaskes fra celler, der ved centrifugenng er høstet fra kulturen, en gang med bindingsmedium og sedimenteres ved 200 x g 110 minutter til dannelse af en tæt pellet (ca 8x10 celler/ml) Til pelleten sættes samme volumen PBS indeholdende 1% Tnton X-100 og en cocktail af proteaseinhibitorer (2 mM phenylmethylsulfonylfluond, 1 μΜ pepstatin, 1 μιτι leupeptin og 2 mM O-phenanthrolin) Cellerne blandes med 20 ekstraktionspufferen ved kraftig hvirvlmg, og blandingen inkuberes på is 115 minutter, hvorefter blandingen centrifugeres ved 11 000 x g i 30 minutter ved 8°C til fjernelse af kerner og andre rester Supernatanten gøres 0,02 vægt/vol % i natriumazid og opbeva- I res enten ved 8°C eller —70°C uden at der kan påvises tab af IL-1 receptoraktivitet i op til 6 måneder ved nogen af temperaturerne

I 5 I

25 Medmindre andet er anført anbringes til fastfasebindingsassays 1 μΙ (4 x 10 cel- I leækvivalenter) portioner ekstrakt på tørre BA85/21 nitrocellulosemembraner (Schleicher I & Schuell, Keene, NH), og membranerne holdes ved stuetemperatur, indtil de er tørre I Tørre membraner kan opbevares ved stuetemperatur indtil brug Under disse betingelser forbliver receptorbindingsaktivitet stabil i op til to måneder Før brug rekonstitueres mem- 30 braneme ved inkubation i Tns(0,05 M)pufret saltvand (0,15 M), pH 7,5, indeholdende 3 I vol/vol % BSA i 30 minutter til blokering af nonspecifikke bindingssteder, membranerne I vaskes to gange med PBS (20 ml pr filter), en gang med bindingsmedium og skæres, I mens de er våde, 10,9 x 0,9 cm kvadrater med IL-1 receptorekstrakten i midten Kvadra- I terne anbnnges i 24-brønds bakker (Costar, Cambridge, MA) og dækkes med 200 μΙ

I -i oc \ oc I

I 35 bindingsmedium indeholdende *3l-lL-1a eller -IL-Ισ og umærkede inhibitorer Bak- 7 DK 175403 B1 kerne anbringes dernæst på en nutator og inkuberes i et køleskab (8°C) i to timer Her- 125 efter kan der udtages en 60 pi portion fra hver brønd til bestemmelse af ubundet I-rlL-Ισ Derefter bortsuges den resterende opløsning og kasseres, og nitrocellulosefiltrene vaskes ved tilsætning og bortsugning af i rækkefølge 1 ml bindingsmedium og tre 5 gange 1 ml PBS til hvert brønd Nitrocellulosekvadraterne fjernes dernæst og tørres på filterpapir Derefter anbnnges de enten på Kodak X-omat AR film i tolv timer ved —70°C, eller de anbringes 112 x 75 cm glasrør og tælles på en gammatæller

Tabel 1 viser cDNA-sekvensen for klon GEMBL78 Nukleotider nummereres fra begyndelsen af fragmentet CTG-kodonen, der specificerer leucinresten, som udgør N-10 terminalen, er understreget ved position 282, og TAG-terminatorkodonen, der afslutter den åbne læseramme, er understreget ved position 1953

Tabellerne 2A-2C viser cDNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens for kodningsområdet af den i tabel 1 viste cDNA I tabellerne 2A-2C er nukleotider og aminosyrer nummereret fra leucinresten, der repræsenterer N-terminalen af det modne 15 protein De alternative initiatomnethioniner, N-terminalen og det formodede 21-amino-syretransmembranområde af den munne IL-1 receptor er understreget

Tabel 3 viser en cDNA-sekvens, der omfatter det komplette kodningsområde af det humane IL-1 R gen Nukleotider er nummereret fra begyndelsen af et fragment, kaldet R3A, der omfatter N-terminalen og en kort sekvens af 5’ ikke-translateret DNA CTG-20 kodonen, der specificerer leucinresten, som udgør N-terminalen, er understreget ved position 135, og TAG-terminatorkodonen, der afslutter den åbne læseramme, er understreget ved position 1791

Tabellerne 4A-4C viser cDNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens af kodningsområdet af en cDNA-kodende for human IL-1 receptor I tabellerne 4A-4C er 25 nukleotider og aminosyrer nummereret fra leucinresten (understreget), der repræsenterer N-terminalen af det modne protein 20-aminosyretransmembranområdet er også understreget

Tabel 5 er en sammenligning af de fra munne og humane IL-1 receptorer afledte aminosyresekvenser Transmembranområderne af hvert protein er understreget, og be-30 varede cysteinrester er vist med en stjerne Potentielle N-bundne glycosylenngssteder er vist med trekanter ved siden af asparaginrester

Definitioner "lnterleukin-1 receptor" og "IL-IR” betegner proteiner, som er i stand til at binde 35 lnterleukin-1 (IL-1) molekyler og i deres native konfiguration som mammale plasmamem- I DK 175403 B1 I 8 branproteiner antageligt spiller en rolle i omsætning af det af IL-1 tilvejebragte signal til en celle Som anvendt i det foreliggende omfatter betegnelsen analoge til native protei- ner med IL-1 -bindings— eller signalomsætningsaktivitet Specifikt omfattet er afkortede eller opløselige former af IL-1 receptorproteinet, som ikke har et cytoplasma— eller trans- 5 membranområde Den forudsagte molekylvægt af det murine protein, som svarer til se- kvensen af det i tabellerne 2A-2B viste modne protein er 64 597 dalton, mens den forud- sagte molekylvægt af prækursoren er 66 697 dalton Begge disse skøn er eksklusive glycosylermg Den forudsagte molekylvægt af det humane protein, som svarer til se- kvensen af det i tabellerne 4A-4C viste modne protein er 63 486 dalton, mens den forud- 10 sagte molekylvægt af prækursoren er 65 402 dalton "I det væsentlige identisk" og "i det væsentlige lig" betyder, når udtrykkene an- vendes til defmenng af aminosyresekvenser, at en given sekvens, fx en mutantsekvens, adskiller sig fra en referencesekvens ved en eller flere substitutioner, udeladelser eller tilføjelser, hvis nettoeffekt ikke resulterer i en ugunstig funktionel forskel mellem refe- 15 rencesekvens og omhandlet sekvens I forbindelse med den foreliggende opfindelse an- ses aminosyresekvenser med mere end 30% lighed for at være i det væsentlige lig hin- anden, og aminosyresekvenser med mere end 80% lighed anses for at være i det væ- sentlige identiske Ved definitionen af nuklemsyresekvenser anses alle omhandlede nuklemsyresekvenser, som er i stand til at indkode aminosyresekvenser, der i det væ- 20 sentlige er lig hinanden, for at være i det væsentlige lig med en referencenukleinsyre- sekvens, og alle nuklemsyresekvenser, som er i stand til at indkode i det væsentlige identiske aminosyresekvenser, anses for at være i det væsentlige identiske med en refe- rencesekvens Ved bestemmelse af lighed skal der ses bort fra forkortelser eller interne I udeladelser af referencesekvensen Sekvenser med en mindre grad af lighed, sammen- I 25 lignelig biologisk aktivitet og ækvivalente ekspressionskaraktenstika anses for at være ækvivalenter I forbindelse med den foreliggende opfindelse anses en "underenhed" af I en IL-1 R for at udgøre en ammosyresekvens med mindst 20 aminosyrer I Som anvendt i det foreliggende betyder "rekombinant", at et protein hidrører fra I rekombmante (fx mikrobeile eller mammale) ekspressionssytemer "Mikrobiel" henviser I 30 til rekombmante proteiner produceret i bakterie— eller svampe— (fx gær) ekspressions- I sytemer Som et produkt definerer "rekombinant mikrobielt" et protein, der i det væsentli- I ge er fri for native endogene substanser og ikke ledsaget af associeret nativ glycosyle- I nng Protein udtrykt i de fleste bakteriekulturer, fx E coli, vil være fnt for glycan, protein I udtrykt i gær kan have et glycosyleringsmønster, der adskiller sig fra det, der bliver ud- I 35 trykt i mammale celler 9 DK 175403 B1

Som anvendt i beskrivelsen som en karakterisering af IL-1 receptorer betyder "biologisk aktiv" enten, at et givet molekyle har en tilstrækkelig aminosyresekvenslighed til fælles med udførelsesformerne af opfindelsen til at være i stand til at binde mindst 0,01 nmol IL-1 pr nmol IL-1 receptor eller IL-1 receptoranalog, eller alternativt haren til-5 strækkelig aminosyresekvenslighed til fælles til at være i stand til at transmittere en IL-1 stimulus til en celle, fx som en komponent i en hybridreceptorkonstruktion Fortrinsvis er biologisk aktive IL-1 receptorer ifølge opfindelsen i stand til at binde mere end 0,1 nmol IL-1 pr nmol receptor, og mest foretrukket mere end 0,5 nmol IL-1 pr nmol receptor "DNA-sekvens" henviser til en DNA-polymer i form af et separat fragment eller 10 som en komponent af en større DNA-konstruktion, som er blevet afledt af DNA, som mindst en gang er blevet isoleret 11 det væsentlige ren form, dvs fri for kontaminerende endogene matenaler og i en mængde eller koncentration, der tillader identifikation, manipulation og udvinding af sekvensen og dens nukleotidsekvenskomponenter ved biokemiske standardmetoder, fx under anvendelse af en kloningsvektor Sådanne sekvenser til-15 vejebringes fortrinsvis i form af en åben læseramme, som ikke er afbrudt af interne ikke-translaterede sekvenser, eller intraner, som typisk er til stede i eukaryotiske gener Det vil imidlertid være åbenlyst, at genom-DNA indeholdende de relevante sekvenser, også vil kunne anvendes Sekvenser af ikke-translateret DNA kan være til stede 5’ eller 3'fra den åbne læseramme, hvor disse sekvenser ikke forstyrrer manipulation eller ekspres-20 sion af kodningsområderne "Nukleotidsekvenser" henviser til en heteropolymer af deoxyribonukleotider DNA-sekvenser, der indkoder de i overensstemmelse med opfindelsen tilvejebragte proteiner, samles af cDNA-fragmenter og korte oligonukleotidlinkere eller af en række ohgonukleotider til opnåelse af et syntetisk gen, som kan udtrykkes i en rekombmant 25 transkriptionel enhed "Rekombmat ekspressionsvektor" henviser til et plasmid, der omfatter en transkriptionel enhed omfattende en samling af (1) et eller flere genetiske elementer med en regulatonsk rolle ved genekspression, fx promotorer eller forstærkere, (2) en strukturel eller kodningssekvens, som transknberes til mRNA og translateres til protein, 30 og (3) passende transknptions— og translationsimtienngs— og termmenngssekvenser Strukturelle elementer til anvendelse i gærekspressionssystemer, omfatter fortnnsvis en ledersekvens, der muliggør extracellulær udskillelse af translateret protein ved en værtscelle Alternativt kan rekombmant protein, når det bliver udtrykt uden en leder— eller transportsekvens, omfatte en N-terminal methionmrest Denne rest kan eventuelt deref-35 ter spaltes fra det udtrykte rekombinante protein til tilvejebringelse af et slutprodukt I DK 175403 B1 "Rekombmant mikrobielt ekspressionssytem" betegner en i det væsentlige homo- gen monokultur af egnede værtsmikroorganismer, fx baktener såsom E coli eller gær såsom S cerevisiae, som har en stabilt i kromosomal DNA integreret rekombinant transkriptionel enhed eller bærer den transkriptionelle enhed som en komponent i et den 5 værende plasmid Generelt er celler, der udgør systemet, afkommet af en enkelt op- I havstransformant Rekombmante ekspressionssystemer som defineret i det foreliggende vil udtrykke heterologt protein ved induktion af de regulatonske elementer, som er bun- det til DNA-sekvensen eller det syntetiske gen, som skal udtrykkes 10 Isolation af cDNA’er. der koder for IL-1 receptorer

Til opnåelse af den munne kodningssekvens isoleredes en DNA-sekvens, der koder for munn IL-1 R (mlL-1 R), fra et cDNA-bibliotek, der var fremstillet ved revers transkription af polyadenyleret RNA isoleret fra den munne cellelinie EL-4 6 1 C10 Bib- lioteket screendes ved direkte ekspression af kombinerede cDNA-fragmenter i COS-7 15 abeceller under anvendelse af en mammal ekspressionvektor (pDC201), der anvender regulatonske sekvenser hidrørende fra SV40 og Adenovirus 2 Transfektanter, der ud- trykker biologisk aktiv IL-1 R, blev identificeret ved inkubenng af transficerede COS-7 cel- H 125 ler med medium indeholdende l-IL-ΐσ, vask af cellerne til fjernelse af ubundet mær- ket IL-1 σ og ved at bringe cellemonolagene i kontakt med røntgenfilm til påvisning af 20 koncentrationer af IL-1 a binding Pa denne måde påviste transfektanter optræder som mørke steder mod en relativt lys baggrund

Under anvendelse af denne teknik screenedes ca 150 000 cDNA'er i puljer på ca 350 cDNA’er indtil assay af en transfektantpulje viste positive IL-1o bindingssteder

En nedfrosset baktenebeholdnmg fra denne positive pulje dyrkedes i kultur og udplade- 25 des til tilvejebringelse af individuelle kolonier, der screenedes indtil der blev identificeret I en enkelt klon (klon 78), som styrede syntese af et overfladeprotein med påviselig IL-1 I bindingsaktivitet Denne klon isoleredes, og dens indføjelse sekvensbestemtes til be- stemmelse af sekvensen af den i tabel 1 anførte murine cDNA Initiatormethiomnen for I det uforkortede translationsprodukt af det native munne gen er en af to alternative 30 methionmrester, der findes ved positionerne—19 og—161 tabel 2 A Den første amino- syrerest af det modne receptorprotein blev udledt ved sammenligning med en N-terminal I aminosyresekvens opnået fra højt oprensede IL-1 R præparater hidrørende fra EL-4 6 1 I C10 celler Denne rest er en leucmrest vist ved position 1 i tabel 2A 1671 nukleotidkod- I nmgsområdet, der svarer til det modne protein, koder for 576 aminosyrer, inklusive 15 I 35 cystemrester og et formodet 21-aminosyretransmembranområde Lokaliseret N-terminal ^^ · ’'μ1·»)", .··-*». -ί1'· w DK 175403 B1 11 til transmembranområdet er 7 potentielle N-glycosylenngssteder En kloningsvektor omfattende den uforkortede murme cDNA, kaldet GEMBL78, er blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA under løbenummeret ATCC 67563 Deponeringen blev foretaget under Budapest-konventionens betingelser 5 En probe opbyggedes ud fra den munne sekvens og anvendtes til screening af humane cDNA-biblioteker, der var fremstillet ud fra kulturer af en human T-celleklon dyrket i nærvær af OKT3-antistof og IL-2 Dernæst isoleredes og sekvensbestemtes cDNA-kloner, der hybndiserede til den murine probe Under anvendelse af et fragment afledt af humane cDNA-kloner opnåedes og sekvensbestemtes en 1707 nukleotid human kod-10 mngssekvens Nukleotidsekvensen af den humane cDNA, inklusive 5' og 3' utranslatere- ’ de sekvenser, er vist i tabel 3 Nukleotidsekvensen af den humane åbne læseramme og den afledte aminosyresekvens af det humane protein er anført i tabellerne 4A-4C Denne sekvens omfatter 569 aminosyrer (inklusive et signalpeptid pa 17 aminosyrer), inklusive 16 cysteinrester, hvoraf de 13 er bevaret mellem de munne og humane gener Den 15 humane sekvens omfatter desuden 6 potentielle N-glycosylenngssteder, hvoraf de 5 er bevaret mellem murine og humane Aminosyresekvensen i tabellerne 4A-4C er nummereret fra en leucinrest, der anses for at være den sandsynlige N-terminal på basis af sammenligninger med det munne protein Det formodede transmembranområde af det humane gen har en længde på 20 aminosyrer Sekvenserne af de antagede intracellu-20 lære dele af de munne og humane gener er i høj grad (87%) bevaret, de extracellulære områder (78%) og transmembranområdeme (63%) er bevaret lidt mindre bortset fra lo-kalisenngen af cysteiner, der antageligt er involveret i intramolekylær disulfidbindmg og visse N-glycosylenngssteder De fra de humane og munne gener udledte aminosyrese-kvenser er sammenlignet i tabel 5 25 De munne og humane gener, der indkoder integrate membranproteiner, omfatter mtracellulære områder uden nogen tilsyneladende homologi med nogen kendt proteinsekvens og extracellulære dele, der synes at være organiseret i områder, der ligner dem for medlemmerne af immunglobulingensuperfamihen Immunglobulinlignende områder har typisk kun minimal aminosyrelighed, men har en fælles tredimensional struktur be-30 stående af to β-flader holdt sammen af en disulfidbindmg Den i dannelse af denne disul-fidbinding involverede cysteinrest samt nogle andre kntiske rester er bevaret i høj grad og optræder i samme relative position i næsten alle medlemmer af familienMedlemmer af immunglobulmsuperfamilien omfatter ikke kun konstante og variable immunglobulm-omrader, men også et antal andre celleoverflademolekyler, hvoraf mange er involveret i 35 celle-celle interaktioner I DK 175403 B1 I 12 I Som de fleste mammale gener indkodes mammale IL-1 R'er antageligt af multi- exon gener Alternative mRNA-konstruktioner, som kan tilskrives forskellige mRNA- splejsmngstilfælde efter transkription og som har store identitets— eller lighedsområder til fælles med cDNA'erne ifølge opfindrlsen, anses for at falde inden for opfindelsens H 5 rammer I sine nukleinsyreudførelsesformer tilvejebringer den foreliggende opfindelse DNA-sekvenser, der koder for mammale IL-1 R'er Eksempler på mammale IL-1 R'er om-

fatter primat IL-1 R, human IL-1 R, murin, canm, felin, bovin, ovin, equin og porcin IL-1R

IL-1 R DNA'er tilvejebringes fortrinsvis i en form, som kan udtrykkes i en rekombmant 10 transkriptionel enhed under kontrol af mammale, mikrobielle eller virale transkriptionelle eller translationelle kontrolelementer For eksempel vil en sekvens, som skal udtrykkes i en mikroorganisme, ikke indeholde intraner I foretrukne aspekter omfatter DNA-sekven- serne mindst en, men eventuelt mere end en sekvenskomponenter afledt af en cDNA- sekvens eller en kopi deraf Sådanne sekvenser kan være bundet til eller flankeret af 15 DNA-sekvenser fremstillet ved samling af syntetiske oligonukleotider Syntetiske gener, der udelukkende er samlet af oligonukleotider, kunne imidlertid blive opbygget under an- vendelse af den i det foreliggende beskrevne sekvensinformation Eksempler på sekven- ser omfatter sådanne, der i det væsentlige er identiske med de i tabellerne 2A-2C viste nukleotidsekvenser Alternativt kan kodnmgssekvenseme omfatte kodoner, der koder for 20 en eller flere yderligere aminosyrer, som befinder sig ved N-terminalen, fx en N-terminal ATG-kodon, der specificerer methionm bundet i læseramme med nukleotidsekvensen I P g a kodedegeneration kan der forekomme betragtelige variationer i nukleotidsekven- ser, der koder for samme aminosyresekvens, eksempler på DNA-udførelsesformer er I sådanne, der svarer til sekvensen af nukleotiderne 1-1671 i tabellerne 2A-2C og nukleo- 25 tiderne 1-1656 i tabellerne 4A-4C Andre udførelsesformer omfatter sekvenser, som kan I hybndisere til sekvensen i tabellerne 2A-2C eller 4A-4C under moderat strenge betingel- ser (50°C, 2 x SSG), og andre sekvenser degenererer til de ovenfor beskrevne, der I koder for biologisk aktive IL-1 R polypeptider I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også ekspressionsvektorer til fremstil- I 30 ling af oprenset IL-1 R i nyttige mængder Vektorerne kan omfatte syntetiske eller cDNA- I afledte DNA-fragmenter, der koder for mammale IL-1 R'er eller bioækvivalente homolo- I ger, der operativt er koblet til regulatoriske elementer afledt af mammale, bakterielle, vi- I rale, gær— eller bakteriofag-gener Nyttige regulatoriske elementer er beskrevet mere I detaljeret nedenfor Efter transformation, transfektion eller infektion af passende celleli- I 35 mer kan sådanne vektorer induceres til at udtrykke rekombmant protein 13 DK 175403 B1

Mammale lL-1R’er kan udtrykkes i mammale celler, gær, bakterier eller andre celler under kontrol af passende promotorer Celle-fne translationssystemer vil også kunne anvendes til fremstilling af mammal IL-1R under anvendelse af RNA’er afledt af DNA-konstruktioneme ifølge opfindelsen Passende klonings— og ekspressionsvektorer 5 til anvendelse med bakterielle, mammale, svampe— og gærcelleværter er beskrevet af Pouvels et al (Cloning Vectors A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985), idet de relevante dele af beskrivelsen hermed inkorporeres i det foreliggende ved henvisning

Forskellige mammale cellekultursystemer kan anvendes til ekspression af rekom-binant protein Ekempler på egnede mammale værtscellelimer omfatter COS-7 limerne 10 af nyreceller fra aber beskrevet af Gluzman (Cell 23 175,1985), og andre cellelinier, som kan udtrykke en passende vektor, fx C127— 3T3—, CHO—, HeLa— og BHK-celleli-merne Mammale ekspressionsvektorer kan omfatter ikke-transkriberede elementer såsom et replikationsområde, en egnet promotor og forstærker og andre 5’— og 3’-flanke-rende ikke-transkriberede sekvenser og 5'— eller 3’ ikke-translaterede sekvenser såsom 15 nødvendige ribosombindingssteder, et polyadenyleringssted, splejsningsdonor— og ac-ceptorsteder samt termineringssekvenser Fra det virale SV40 genom hidrørende DNA-I sekvenser, fx SV40-origin-, tidlig promotor—, forstærker—, splejsnings— og polyadenyle- I ringssteder kan anvendes til tilvejebringelse af andre genetiske elementer, der kræves til I ekspression af en heterolog DNA-sekvens Yderligere detaljer vedrørende anvendelsen I 20 af en mammal højekspressionsvektor til fremstilling af en rekombinant mammal IL-1R er I anført i eksemplerne 4 og 6 nedenfor Eksempler på vektorer kan opbygges som beskre- I vet af Okayama og Berg (Mol Cell Biol 3 280,1983) I Ét nyttigt system til stabil ekspression af et højt niveau af mammale receptor- I cDNA'er i murine C127 epitheliale brystceller kan opbygges i det væsentlige som be- I 25 skrevet af Cosman et al (Molecular Immunol 23 935,1986)

I Gærsystemer, der fortrinsvis anvender Saccharomyces-arter såsom S

I cerevisiae, kan også anvendes til ekspression af de rekombinante proteiner ifølge opfin- I delsen Gær af andre slægter, fx Pichta eller Kluyveromyces, er også blevet anvendt I som produktionsstammer for rekombinante proteiner I 30 Generelt vil nyttige gærvektorer omfatte replikationsområder og valgbare markø-

I rer, der tillader transformation af både gær og E coli, fx ampicillmresistensgenet fra E

I coli og S cerevisiae TRP1 gen, og en promotor hidrørende fra et gærgen med høj eks- I pression til fremkaldelse af transkription af en nedenstrøms strukturel sekvens Sadanne I promotorer kan afledes af transkriptionelle gærenheder, der koder for gener med høj I 35 ekspression såsom bl a 3-phosphoglyceratkinase (PGK), σ-faktor, sur phosphatase el- I DK 175403 B1 I 14 ler varmechockproteiner Den heterologe strukturelle sekvens samles i en passende læ- seramme med translationsinitienngs— og terminermgssekvenser og fortrinsvis en leder- sekvens, som kan styre udskillelse af translateret protein i det extracellulære medium

Eventuelt kan den heterologe sekvens kode for et fusionsprotein, der indeholder et N- 5 terminalt identifikationsprptid (fx Asp-Tyr-Lys-(Asp)4-Lys) eller en anden sekvens, der H resulterer i de ønskede karakteristika, fx stabilisering eller forenklet oprensning af ud- trykt rekombinant produkt

Nyttige gærvektorer kan samles under anvendelse af DNA-sekvenser fra pBR322 til udvælgelse og replikation i E coli (Ampr-gen og replikationsområde) og gær- 10 DNA-sekvenser indeholdende en glucose-undertrykbar alkoholdehydrogenase 2 (ADH2) promotor ADH2-promotoren er blevet beskrevet af Russell et al (J Biol Chem 258 2674, 1982) og Beier et al (Nature 300 724, 1982) Sådanne vektorer kan også om- fatte et gær-TRP1-gen som en valgbar markør og gær-2p-replikationsområdet En gær- ledersekvens, fx σ-faktorlederen, der styrer udskillelse af heterologe proteiner fra en 15 gærvært, kan indføjes mellem promotoren og det strukturelle gen, som skal udtrykkes (se Kurjan et al, US-patentskrift 4 546 082, Kurjan et al, Cell 30 933 (1982), og Bitter et al, Proc Natl Acad Sci USA 81 5330,1984) Ledersekvensen kan modificeres til nær sin 3'-ende at indeholde et eller flere nyttige restnktionssteder til lettelse af fusionen af ledersekvensen med fremmede gener 20 Egnede gærtransformationsprotokoller er kendte for fagmanden Et eksempel på I en teknik er beskrevet af Hinne et al (Proc Natl Acad Sci USA 75 1929,1978), ved hvilken Trp+-transformanter udvælges i et selektivt medium bestående af 0,67% gær- nitrogenbase, 0,5% casaminosyrer, 2% glucose, 10 pg/ml adenin og 20 pg/ml uracil H Værtsstammer, som er transformeret med vektorer, der omfatter ADH2-promoto- 25 ren, kan dyrkes for ekspression i et beriget medium bestående af 1% gærekstrakt, 2% pepton og 1% glucose suppleret med 80 pg/ml adenin og 80 pg/ml uracil Derepression af ADH2-promotoren optræder, når mediets glucose er opbrugt Rå gærsupernatanter høstes ved filtrering og holdes ved 4°C før yderligere oprensning

Nyttige ekspressionsvektorer til bakteriel anvendelse opbygges ved indføjelse af I 30 en DNA-sekvens, der koder for mammal IL-1R sammen med egnede translationsimtie- rings— og termineringssignaler i operativ læsefase med en funktionel promotor Vektoren vil omfatte en eller flere fænotypiske valgbare markører og et replikationsområde for at

sikre forstærkning i værten Egnede prokaryotiske værter for transformation omfatter E

I coli. Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium og forskellige arter af slægterne Pseudo- I 35 monas, Streptomyces og Staphylococcus, selvom andre værter om ønsket også kan an- 15 DK 175403 B1 vendes

Ekspressionsvektorer opbygges hensigtsmæssigt ved spaltning af cDNA-kloner på steder nær ved kodonen, der indkoder den N-terminale rest af det modne protein Syntetiske oligonukleotider kan dernæst anvendes til "tilbageføring" af udeladte afsnit af 5 kodningsområdet og tilvejebringelse af en bindingssekvens for tigering af kodningsfragmentet i passende læseramme i ekspressionsvektoren og eventuelt en kodon, der specificerer en initiatormethionm

Som et repræsentativt, men ikke begrænsende eksempel kan nyttige ekspressionsvektorer til baktenel anvendelse omfatte en valgbar markør og et bakterielt replika-10 tionsområde hidrørende fra kommercielt tilgængelige plasmider omfattende genetiske elementer af den velkendte kloningsvektor pBR322 (ATCC 37017) Sådanne kommercielle vektorer omfatter fx pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svenge9 og pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA) Disse pBR322 "ryggrads'-afsnit kombineres med en passende promotor og den strukturelle sekvens, som skal udtrykkes 15 Et specielt nyttigt baktenelt ekspressionssystem anvender fag λ P^ promotoren og den termolabile cl857-repressor Plasmidvektorer, som kan fas fra American Type I Culture Collection og som indbefatter derivater af λ P^ promotoren, omfatter plasmid I pHUB2, der forefindes i E coli stamme JMB9 (ATCC 37092), og pPLc28, der forefindes I i E coli RR1 (ATCC 53082) Andre nyttige promotorer for ekspression i E coli omfatter I 20 den af Studier et al (J Mol Biol 189 113,1986) beskrevne T7 RNA-polymerasepromo- I tor, den af Lauer (J Mol Appl Genet 1 139-147. 1981) beskrevne lacZ-promotor. der er I tilgængelig som ATCC 37121, og den af Maniatis (Molecular Cloning A Laboratory I Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, 1982, p 412) beskrevne tac-promotor, der er til- I gængelig som ATCC 37138 I 25 Efter transformation af en egnet værtsstamme og dyrkning af værtsstammen til I en passende celletæthed udsættes den valgte promotor for derepression med passende I midler (fx temperaturændring eller kemisk induktion), og celler dyrkes i endnu et stykke I tid Celler høstes typisk ved centrifugering, brydes med fysiske eller kemiske midler, og I den resulterende rå ekstrakt tilbageholdes for yderligere oprensning Celler dyrkes fx i I 30 en 101 fermenteringsbeholder under anvendelse af maksimal luftning og kraftig omrø- I ring Der anvendes fortrinsvis et antiskumdannelsesmiddel (Antifoam A) Kulturer dyrkes I ved 30°C i det af Mott et al (Proc Natl Acad Sci USA 82 88, 1985) beskrevne superin- I duktionsmedium, der alternativt omfatter antibiotika, udsættes for derepression ved en I celletæthed svarende til &qqq = 0,4-0,5 ved forhøjelse af temperaturen til 42“C og hø- I 35 stes fra 2-20, fortnnsvis 3-6, timer efter temperaturforøgelsen Cellemassen koncentre- I DK 175403 B1 I 16 res indledningsvis ved filtrenng eller anden måde og centrifugeres dernæst ved 10 000 x g 110 minutter ved 4°C efterfulgt af hurtig nedfrysning af cellepelleten

Oprensede mammale IL-1 R'er eller bioækvivalente homologer fremstilles fortrins- vis ved dyrkning af egnede vært/vektorsystemer til ekspression af de rekombmante 5 translationsprodukter af de syntetiske gener ifølge opfindelsen, som derefter oprenses fra kulturmedier

En alternativ fremgangsmåde til fremstilling af oprenset IL-1 R omfatter oprens- nmg fra cellekultursupematanter eller ekstrakter Ved denne fremgangsmåde anvendes en cellelinie, der fremtiller nyttige mængder af proteinet Supematanter fra sådanne cel- j 10 leliniér kan eventuelt koncentreres under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt pro- teinkoncentrationsfilter, fx en Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltrenngsenhed Efter koncentrationstrinnet kan koncentratet anbringes på en egnet oprensnmgsmatrix som tidligere beskrevet For eksempel kan en egnet affimtetsmatnx omfatte et IL-1—eller lectin— eller antistof molekyle, som er bundet til en egnet bærer Alternativt kan der an- 15 vendes en amonbytterharpiks, fx en matrix eller et substrat med diethylammoethyl (DEAE) sidegrupper Matricerne kan være acrylamid, agarose, dextran, cellulose eller andre typer, der sædvanligvis anvendes til proteinoprensning Alternativt kan der anven- des et kationbytnmgtrin Egnede kationbyttere omfatter forskellige uopløselige matncer omfattende sulfopropyl— eller carboxymethylgrupper Sulfopropylgrupper er foretrukket 20 Til sidst kan der til yderligere oprensning af en IL-1 R sammensætning anvendes et eller flere revers fase højtryksvæskekromatografi (RP-HPLC) tnn under anvendelse af hydrofobe RP-HPLC-medier, fx silicagel med methyl— eller andre alifatiske sidegrupper H Nogle af eller alle de foregående oprensnmgstnn kan i forskellige kombinationer også I anvendes til tilvejebringelse af et homogent rekombinant protein I 25 I bakteriekultur fremstillet rekombinant protein isoleres sædvanligvis ved indled- mngsvis ekstraktion fra cellepellets efterfulgt af et eller flere koncentrerings—, udsalt- nings—, vandig lonbytmngs— eller størrelseseksklusionskromatografitrin Endelig kan I højtryksvæskekromatografi (HPLC) udføres som sidste oprensnmgstnn Mikrobielle cel- I ler, der anvendes til ekspression af rekombinant mammal IL-1 R, kan brydes ved en hvil- I 30 ken som helst passende fremgangsmåde, inklusive skiftende nedfrysning/optønmg, so- I mkering, mekanisk brydning eller anvendelse af cellelyserende midler I Fermentering af gær, der udtrykker mammal IL-IR som et udskilt protein, gør op- rensning meget enklere Udskilt rekombinant protein, der stammer fra en fermentering i stor malestok, kan oprenses ved fremgangsmåder, som er analoge med de af Urdal et I 35 al (J Chromatog 296 171, 1984), beskrevne Denne reference beskriver to sekventiel- 17 DK 175403 B1 le, revers fase HPLC-trin til oprensning af rekombinant human GM-CSF på en præparativ HPLC-kolonne I dens forskellige udførelsesformer tilvejebringer den foreliggende opfindelse i det væsentlige homogene, rekombinante mammale IL-1R polypeptider, som er fri for 5 kontaminerende endogene materialer, med eller uden associeret glycosylenng af det native mønster Det native murine IL-1R molekyle udvindes fra cellekulturekstrakter som et glycoprotein med en tilsyneladende molekylvægt pa ca 82 kD bestemt ved SDS-PAGE I mammale ekspressionssytemer udtrykte IL-1R'er, fx COS-7 celler, kan have en molekylvægt og et glycosyleringsmøsnter, som ligner eller er lidt forskellige fra de native mo-10 lekylers afhængigt af ekspressionssystemet Ekspression af IL-1R DNA'er i baktener såsom E coli tilvejebnnger ikke-glycosylerede molekyler med en tilsyneladende molekylvægt på ca 60 kD ifølge bestemmelse ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser

Rekombinante IL-1 R proteiner ifølge opfindelsen omfatter også N-terminal 15 methionyl munne og humane IL-1 R Yderligere udførelsesformer omfatter opløselige forkortede versioner, hvon visse områder, fx transmembranområdet og de intracellulære områder, er udeladt, hvorved der tilvejebringes et molekyle, der kun har et IL-1-bindingsområde Mammale IL-1R'er udtrykt som fusionsproteiner med en polypeptidleder, der omfatter sekvensen Asp-Tyr-Lys-(Asp4)-Lys, eller med andre egnede peptid— eller pro-20 teinsekvenser, der anvendes som hjælpemidler til ekspression i mikroorganismer eller oprensning af mikrobielt udtrykte proteiner, er også omfattet

Bioækvivalente homologer af proteinerne ifølge opfindelsen omfatter forskellige analoge, fx forkortede versioner af IL-1R'er, hvori terminale eller interne rester eller sekvenser, der ikke er nødvendige for biologisk aktivitet, er udeladt Andre omhandlede 25 analoger er sådanne, hvori en eller flere cysteinrester er blevet udeladt eller erstattet med andre aminosyrer, fx neutrale aminosyrer Andre mutagenesefremgangsmåder omfatter modifikation af nabostillede dibasiske aminosyrerester til forøgelse af ekspression i gærsystemer, hvori KEX2-proteaseaktivitet er til stede, eller modifikation af proteinsekvensen til eliminering af et eller flere N-bundne glycosylenngssteder 30 Som anvendt i det foreliggende henviser "mutant aminosyresekvens" til et poly- peptid, som er indkodet af en nukleotidsekvens, der bevidst er gjort forskellig fra en nativ sekvens "Mutant protein" eller "analog” betyder et protein omfattende en mutant aminosyresekvens "Nativ sekvens" henviser til en aminosyre— eller nukleinsyesekvens, som er identisk med en vild type eller nativ form af et gen eller protein Udtrykkene "KEX2-35 proteasegenkendelsessted" og “N-glycosylenngssted" er defineret nedenfor Som an- I DK 175403 B1 vendt til definering af specielle aspekter af opfindelsen betyder udtrykket ,'inaktivenng,,1 ændring af et udvalgt KEX2-proteasegenkendelsessted for at retardere eller hindre H spaltning med KEX2-proteasen af Saccharomyces cerevisiae, eller ændring af et N- glycosyleringssted for at udelukke covalent binding af oligosacchanddele til specielle 5 aminosyrerester ved cellen

Stedspecifikke mutageneseprocedurer kan anvendes til inaktivenng af KEX2- proteasebehandlingssteder ved udeladelse, tilføjelse eller erstatning af rester for at æn- dre Arg-Arg, Arg-Lys og Lys-Arg par for at eliminere forekomsten af disse nabostillede basiske rester Lys-Lys par er betydeligt mindre tilbøjelige til KEX2-spaitnmg, og omdan- H 10 nelse af Arg-Lys eller Lys-Arg til Lys-Lys repræsenterer en konservativ og foretrukket fremgangsmåde til inaktivenng af KEX2-steder De resulterende analoge er mindre tilbø- jelige til at blive spaltet med KEX2-protease pa andre steder end i gær a-faktorlederse- kvensen, hvor spaltning ved udskillelse er tilsigtet

Mange udskilte proteiner antager covalent bundne carbonhydratenheder efter 15 translation, hyppigt i form af oligosacchandenheder, der ved N-glycosidbindinger er bun- det til asparaginsidekæder Både strukturen og antallet af oligosacchandenheder, som er bundet til et givet udskilt protein, kan variere betragteligt, hvilket resulterer i mange forskellige tilsyneladende molekylmasser, der kan tilskrives et enkelt glycoprotein mlL- 1R er et glycoprotein af denne type Forsøg på at udtrykke glycoprotemer i rekombinante 20 systemer kan kompliceres af den heterogenitet, der kan tilsknves denne variable carbon- hydratkomponent For eksempel kan oprensede blandinger af rekombinante glycoprote- iner såsom human eller munn granulocyt-makrofagkolomstimulerende faktor (GM-CSF) bestå af 0-50 vægt-% carbonhydrat Miyajima et al (EMBO Journal 5 1195,1986) rap- porterede ekspression af en rekombmant munn GM-CSF, hvon N-glycosyleringssteder 25 var blevet muteret for at udelukke glycosylering og reducere heterogeniteten af det gær- udtrykte produkt

Tilstedeværelsen af variable mængder af associeret carbonhydrat i rekombinante glycoprotemer komplicerer oprensningsprocedurerne, hvorved udbyttet reduceres Des- uden er der, hvis glycoproteinet anvendes som et terapeutisk middel, mulighed for, at I 30 modtageren vil udvikle immunreaktioner over for gærcarbonhydratdelene, hvilket kræ- ver, at terapien afbrydes Af disse grunde kan biologisk aktive, homogene analoge af im- munregulatonske glycoprotemer med reduceret carbonhydratindhold være ønskelige til I terapeutisk anvendelse

Funktionelle mutantanaloger til mammale IL-1 R’er med inaktiverede N-glycosyle- 35 rmgssteder kan fremstilles ved oligonukleotidsyntese og ligering eller ved sted-specifikke 19 DK 175403 B1 mutagenesetekmkker som beskrevet nedenfor Disse analogproteiner kan med god udbytte fremstilles i en homogen, carbonhydrat-reduceret form under anvendelse af gær-ekspressionssystemer N-glycosylermgssteder i eukaryotiske proteiner er karakteriseret ved aminosyretripletten Asn-A1 -Z, hvor A1 er en aminosyre bortset fra Pro, og Z er Ser 5 eller Thr I denne sekvens tilvejebnnger asparagm en sidekaedeaminogruppe til covalent binding af carbonhydrat Et sådant sted kan elimineres ved substituenng af Asn eller resten Z med en anden aminosyre, udeladelse af Asn eller Z, eller indføjelse af en ikke-Z aminosyre mellem A og Z, eller en aminsyre, som ikke er Asn, mellem Asn og A For-tnnsvis udføres substitueringer på konservativ måde, dvs de mest foretrukne substitue-10 ringsammosyrer er sådanne, hvis fysisk-kemiske egenskaber ligner egenskaberne af den rest, som skal erstattes På lignende måde bør den potentielle virkning af udeladelsen eller indføjelsen på den biologiske aktivitet tages i betragtning, når en udeladelses-eller indføjelsesstrategi tages i anvendelse

Udover de ovenfor beskrevne specielle analoger kan der bekvemt fremstilles tal-15 rige DNA-konstruktioner omfattende alle eller en del af de i tabellerne 2A-2C eller 4A-4C viste nukleotidsekvenser, sammen med oligonukleotidkassetter, der omfatter yderligere nyttige restriktionssteder Mutationer kan indføres pa specielle steder ved syntetisenng af oligonukleotider, der indeholder en mutantsekvens, flankeret af restnktionssteder, som muliggør ligering til fragmenter af den native sekvens Efter ligering indkoder den 20 resulterende rekonstruerede sekvens en analog med den ønskede aminosyreindføjelse, —substituering eller —udeladelse

Alternativt kan der anvendes oligonukleotid-styrede stedspecifikke mutagenese-procedurer til tilvejebringelse af et ændret gen med specielle kodoner, som er ændret iht den krævede substituering, udeladelse eller indføjelse Som eksempler besknver 25 Walder et al (Gene 42 133, 1986), Bauer et al (Gene 37 73,1985), Craik (Biotechm-ques, January 1985, 12-19), Smith et al (Genetic Engineering Pnnciples and Methods,

Plenum Press, 1981) og US-patentskrift nr 4 518 584 egnede teknikker, som inkorporeres i det foreliggende ved henvisning I en udførelsesform af opfindelsen er aminosyresekvensen af IL-1R bundet til en 30 gær σ-faktorledersekvens via en N-terminal fusionskonstruktion, der omfatter et nukleo-tid, som koder for peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)

Sidstnævnte sekvens er stærkt antigemsk og tilvejebringer en epitop, der bindes reversibelt af specifik monoklonalt antistof, hvilket muliggør en hurtig assay og en let oprensning af udtrykt rekombmant protein Denne sekvens spaltes også specifikt af bovin 35 mucosal enterokinase ved resten, der følger umiddelbart efter Asp-Lys parret Fusions- | I DK 175403 B1 proteiner, som er maskeret med dette peptid, kan også være resistente over for intracel- lulær nedbrydning i E coli En alternativ konstruktion er Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-

Lys-Glu-lle-Gly-Arg, der tilvejebringer et faktor X genkendelsessted umiddelbart neden- strøms for enterokinasestedet I 5 Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende eksempler, som skal tjene til be- lysning, men ikke til begrænsning af opfindelsen

Eksempel 1

Fremstilling af IL-1g affmitetsmatnx og affinitetsoprensnina af receptor fra 10 overflademærkede EL-4 6 1 C10 celler H 125

Celleoverladeproteiner på EL-4 6 1 C10 celler radiomærkedes med I ved den afCosmanetal (Molecular Immunol 23 935, 1986) beskrevne glucoseoxidase- lactoperoxidasemetode Mærkede celler pelleteredes ved centrifugering, vaskedes tre gange med PBS og ekstraheredes med PBS indeholdende 1% Triton X-100 og den i 15 den ovenfor specificerede assayprotokol beskrevne cocktail af proteaseinhibitorer Triton X-100 ekstrakten centrifugeredes 110 minutter i en Eppendorf mikrocentnfuge, og super-

natanten opbevaredes ved -70“C

Rekombinant IL-Ισ blev bundet til cyanogenbromid-aktiveret Sepharose 4B

I (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) eller til Affigel-10 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) iht 20 producentens forslag For eksempel sattes til en opløsning af IL-1o (1,64 mg/ml 19,5 ml PBS) 3 ml kvældet, syrevasket, CNBR-aktiveret Sepharose Opløsningen rystedes nat- ten over ved 4eC, og en portion af supematanten testedes for protein ved en fluorescammproteinassay som beskrevet af Udenfnend et al (Science 178 871, 1972) I under anvendelse af BSA som standard 98% af proteinet var blevet bundet til gelen, H 25 hvilket lod formode, at kolonnen havde en slutladnmg på 5,1 mg IL-Ισ pr ml gel 300 pi I 1 M glycin-ethyl-ester (Sigma Chemical Co , St Louis, MO, USA) sattes til opslæmnm- gen til blokenng af uomsatte steder på gelen I Gelen vaskedes grundigt med 0,1 M glycinpuffer, pH 3,0, indeholdende 0,1%

I Tnton X-100, PBS indeholdende 0,1% Triton X-100, RIPA-puffer (0,05 MTns-HCI, pH

I 30 7,5, 0,15 M NaCI, 1% NP40,1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) og PBS indeholdende 0,1% Tnton X-100 og 10 mM ATP Små kolonner (200 μΙ) fremstilledes i polypropylen- holdere til engangsbrug (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) og vaskedes med PBS mdehol- 125 dende 1% Tnton X-100 Portioner på 100 μ! l-mærket ekstrakt overførtes til en kolon-

I ne, der dernæst vaskedes med PBS indeholdende 1% Tnton X-100, RIPA-puffer, PBS

I 35 indeholdende 0,1% Tnton X—100 og 10 mM ATP, og PBS med 1% Triton X-100 21 DK 175403 B1 125 IL-1 receptoren på munne T-celler er en robust struktur, som kan binde l-IL-1 o i Triton X-100 detergentopløsninger For at kunne udvinde receptor fra en sådan affi-mtetsmatrix er der behov for en mild elueringsprocedure Mild syrebehandling kan resultere i hurtig dissociering af forud dannede IL-1o/IL-1 receptorkomplekser Baseret på 5 denne iagttagelse anvendtes pH 3,0 glycin HCI puffer indeholdende 0,1% Triton X-100 til eluermg af receptor fra IL-Ισ affinitetskolonnerne, hvilken receptor opsamledes-i 0,05 ml fraktioner Tilstedeværelsen af receptor i fraktionerne påvistes ved dot-blot som beskre- 125 vet ovenfor under anvendelse af l-mærket IL-1a

Analyse ved SDS-PAGE forløb som følger Til 50 μΙ af hver kolonnefraktion sat-10 tes 50 μΙ 2 x SDS prøvepuffer (0,125 M Tris HCI, pH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol) Opløsningen anbragtes i et kogende vandbad i 3 minutter, og portioner på 40 μΙ anbragtes i en prøvebrønd med 10% polyacrylamidgel, hvilken prøveanordning blev opstillet og kørt iht den af Laemmli (Nature 227 680,1970) beskrevne fremgangsmåde Geler fikseredes og farvedes under anvendelse af 0,25% Coomassie bnl-15 liant blue i 25% isopropanol og 10% eddikesyre, affarvedes i 25% isopropanol og 10% eddikesyre, behandledes med Enhance (New England Nuclear, Boston, MA, USA), tørredes og eksponeredes til Kodak X-omat AR film ved -70°C Molekylvægtsmarkører, 14 mærket med C, opnåedes fra New England Nuclear og omfattede cytochrom C (Mr 12 300), lactoglobulm A (Mr 18 367), carbonsyreanhydrase (Mf 31 000), ovalbuman (Mf 20 46 000), bovinserumalbomm (M2 69 000), phosphorylase B (M2 97 400) og myosm (Mf 200 000) Alternativt analyseredes fraktioner med receptoraktivitet ved SDS-poly-acrylamidgelelektroforese efterfulgt af sølvfarvning som tidligere beskrevet af Urdal et al (Proc Natl Acad Sci USA 81 6481,1984)

Dot-blot analyse af fraktioner elueret fra IL-1 σ affinitetsmatrixen viste, at IL-1 25 bindingsaktivitet blev påvist i fraktioner, der opsamledes efter at pH 3,0 glycinpuffer var blevet sat til kolonnen Fraktioner, der gav positivt resultat ved denne assay, afslørede ved analyse med SDS-PAGE, at et protein med Mf 82 000 kunne påvises ved fremkaldelse af gelen med sølvfarve Til bestemmelse af, hvilke af de ved sølvfarvning påviste proteiner, der blev udtrykt på celleoverfladen, overflademærkedes EI-4 6 1 celler med 125 30 I ved lactoperoxidaseglucoseoxidaseproceduren Radiomærkede celler ekstrahere-des dernæst med PBS indeholdende 1% Tnton X-100, og portioner af detergentekstrakten tilførtes en IL-Ισ affimtetsmatrix Fraktioner, der blev opsamlet fra denne,kolonne efter overførsel af pH 3,0 glycinpuffer til kolonnen, indeholdt et radiomærket protein med Mr 82 000 35 I DK 175403 B1 I 22

Eksempel 2 I

Sammenligning af egenskaber af cellulær IL-1 reæptor oq IL-1 receptor isoleret fra I

celleekstrakter I

I et foreløbigt forsøg sammenlignedes bindingsegenskaberne af IL-1 receptoren ι I

I 5 intakte EL-4 6 1 C10 celler og efter ekstraktion fra celler 3,8 x 10® EL-4 6 1 C10 celler I

opdeltes i to lige store portioner, hvoraf den ene ekstraheredes som beskrevet ovenfor I

I De resterende celler resuspenderedes til 3,8 x 107 celler/ml og anvendtes til dirkete I

H bindingsundersøgelser Ekstrakter adsorberedes til nitrocellulose og anvendtes til fastfa- I

105 I

sebindingsundersøgelser under anvendelse af forskellige koncentrationer af l-IL-Ισ I

H 10 med eller uden umærket IL-1 Efter vask og tørring taltes nitrocellulosefiltrene først for ' I

Ί25 I

bundet l-IL-1a og anbragtes derefter på film for autoradiografi Ikke-specifik bag- I

.7 125 I

grund måltes i nærvær af 5,7 x 10 M umærket rlL-18 De opnåede data viste, at I- I

IL-1 a blev bundet til ekstrakten på nitrocellulose på en IL-1 koncentrationsafhængig må- I

125 I

de, og at l-IL-Ισ blev specifikt bundet til det omradet af blotten, hvor der forefindes I

15 ekstrakt Desuden kunne binding i vid udstrækning blokeres ved optagelse af umærket I

IL-1 σ i inkubationsblandingen I

Sammenligningen viste endvidere, at ikke kun receptormveauerne var de samme I

1 begge tilfælde, man at receptorerne efter adsorption til nitrocellulose udviste en affinitet I

for ligand, der ikke kunne skelnes fra affiniteten af receptoren 1 intakte celler Der fandtes I

20 ingen signifikant forskel mellem antallet af receptorer pavist på inakte celler og recepto- I

rer påvist efter detergentekstraktion Dette stemmer overens med den antagelse, at ho- I

vedparten af receptorerne var til stede på den ydre overflade af plasmamembranen 1 in- I takte celler

Til måling af specificiteten af binding af IL-1 receptorer på nitrocellulosefiltre an- 25 bragtes 2 μΙ EL-4 6 1 C10 ekstrakt på mtrocellulosefiltre, tørredes, blokeredes og analy- såredes som beskrevet ovenfor De følgende proteiner testedes for deres kapacitet til at I mhibere ^®l-IL-1o binding human rlL-1a (7,62 x 10"7 M), human rlL-1 β (7,62 x 10"7 I M), human IL-2 (8,9 x 10*7 M), munn IL-3 (7,5 x 10-4 M), munn GM-CSF (7,5 x 10*7 M), 1-9 rekombmant munn IL-4 (5x10 M), human epidermal vækstfaktor (3 pg/ml), fibroblast- 30 vækstfaktor (1 pg/ml), rotte-kæbespytkirtelnervevækstfaktor (2 pg/ml), bovin insulin (1 x I 10‘7 M), humant luteimseringshormon (1 pg/ml), humant væksthormon (1,7 x 10‘7 M), skjordbruskkirtelstimuleringshormon (1 pg/ml) og follikelstimulenngshormon (1. pg/ml) I Alle inkubationer udførtes ved 1,9 x 10’1® M ^®l-IL-1a

Dette forsøg viste, at ekstraheret receptor bibeholder samme specificitet som tid- I 35 ligere påvist for intakte celler Som det viste sig at være tilfælde med intakte celler frem- ' ~ -hø* yt !·*-τ,τ—" ’ DK 175403 B1 23 125 bragte kun IL-1aog IL-1 β signifikant inhibenng af l-IL-1a binding Dataene viste, at 125 umærket IL-1 a og IL-1 β frembragte >90% inhibenng af l-IL-1 a binding, mens der ik ke lagttoges nogen signifikant blokade med nogen af de andre hormoner

Til bestemmelse af, om receptor fdetergentopløsning binder IL-1 med en affim-5 tet, der svarer til den af receptor i cellemembraner eller adsorberet til nitrocellulose, udførtes et tredje forsøg, i hvilket der anventes en nitrocellulose dot-blot bmdmgsassay til testning af evnen af en EL-4 6 1 C10 ekstrakt i Triton X-100 opløsning til at inhibere bin-125 ding af l-IL-1 cr til den faste fase EL-4 6 1 C10 ekstrakter adsorberedes til mtrocellu- 125 lose, tømedes, blokeredes og inkuberedes med en blanding af l-IL-1 a og ekstrakter 10 indeholdende receptorer i detergentopløsning

Koncentrationen af receptor i opløsningsfasen bestemtes ud fra en mætningsbindingskurve til 1 pi portioner blottet på nitrocellulose, hvilket gjorde det muligt af beregne receptorer/μΙ og dermed IL-1 receptorkoncentration (M) Ekstrakten fortyndedes gennem PBS Tnton X-100 opløsning (0,5% Triton) for at holde detergenkoncentrationen kon- 125

15 stant Inhibenngskurven viste, at receptoren i opløsning bandt til l-IL-1 amed en K

9-1 3 (4,5 ± 0,5 x 10 M ), som svarer til den for receptoren på den faste fase eller i membraner Endvidere var den gode overensstemmelse mellem den teoretiske kurve, som er baseret på en enkelt kompetitiv inhiberingsmodel, og dataene samstemmende med den hypotese, at en enkelt type IL-1 bindingsprotein var til stede i membranekstrakten 20 Til undersøgelse af integriteten af receptoren som en funktion af koncentrationen

af totale EL-4 6 1 C10 membranproteiner udførtes et fjerde forsøg Blandinger af EL-4 6 1 C10 ekstrakt i forskellige forhold i området fra 10 til 100% fremstilledes enten med en ekstrakt fra celler, der ikke udtrykker IL-1 receptoren, EL-4 (M) celler, eller med PBS

Triton X-100 (0,5%) Hver blanding analyseredes for receptorkoncentration, og affinitet 125 25 af l-IL-1 a binding analyseredes ved kvantitativ dot-blot binding Receptorkoncentra tion aftog lineært med procentdelen den tilstedeværende EL-4 6 1 C10 ekstrakt, uanset om membranprotemkoncentration holdtes på et konstant niveau eller ikke I begge blan- 125 dingsserier forblev affiniteten af receptoren for l-IL-1 a konstant Disse data stemmer overens med en af to hypoteser, enten er receptorbindingsfunktionen indeholdt i en en-30 kelt polypeptidkæde eller, hvis den funktionale receptor kræver to eller flere underenheder for IL-1 binding, er kæderne tilstrækkeligt tæt forbundet til, at fortynding via detergent ikke adskiller dem _ I DK 175403 B1 I 24

Eksempel 3

Oprensning af IL-1 receptor til homogenitet oa bestemmelse af N-terminal sekvens 300-500 I EL-4 6 1 C10 celler dyrkedes til mætning under de tidligere beskrevne betingelser, høstedes og ekstraheredes med PBS-1% Triton X-100 Detergentekstrakten 5 overførtes til en IL-1 a affinitetskolonne, og kolonnen vaskedes som tidligere beskrevet 105

Fraktioner indeholdende IL-1 receptor påvistes ved l-IL-Ισ dot-blot proceduren ef- H terfulgt af eluering af kolonnen med 0,1 M glycin HCI, pH 3,0, indeholdende 0,1% Tnton X-100 Portioner af fraktionerne analysedes ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese

Denne ved affinitetskromatografi på Affigel-IL-Ισ fremstillede, delvist oprensede 10 IL-1 receptorsammensætning indstilledes således, at den indehold følgende puffersam- mensætning 10 mM Tris-HCI, pH 8, 250 mM NaCI, 0,5 mM MgC^, 0,5 mM MnC^, 0,5 mM CaCI2 og 0,01% (vol/vol) Triton X-100 (WGA-puffer) IL-1 receptorsammensætnmgn overførtes dernæst til en 1 ml kolonne med hvedekimaggluitinin (WGA) bundet til

Sepharose CI-6B, ækvilibreret med WGA-puffer Efter overførsel af IL-1 receptorsam- 15 mensætningen vaskedes WGA-kolonnen med 20 ml WGA-puffer efterfulgt af 10 mM Tris HCI, pH 8, 0,01% (vol/vol) Triton X-100 IL-1 receptorproteinet elueredes fra WGA-kolon- nen med 10 mM Tris-HCI, pH 8, 0,5 M N-acetylglucosamin og 0,01% (vol/vol) Tnton X- 125 100 Tilstedeværelsen af biologisk aktiv IL-1 receptor påvistes ved l-IL-Ισ dot-blot proceduren Fraktioner analyseredes også ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese efter- 20 fulgt af sølvfarvning

Materiale, der elueredes fra WGA-kolonnen, overførtes til en C8 RP-HPLC-ko- lonne C8 RP-HPLC-kolonnen (Brownlee Labs RP-300,1 mm x 50 mm) var forud blevet ækvilibreret med 0,1% (vol/vol) trifluoreddikesyre (TFA) i H20 af HPLC-kvalitet ved en I strømningshastighed på 50 μΙ/mmut Efter overførsel af det IL-1 receptorholdige matena- I 25 le vaskedes C8 RP-HPLC-kolonnen med 0,1% (vol/vol) TFA i H20 ved 50 μΙ/mmut indtil I absorbansen ved 280 nm vendte tilbage til basislimen IL-1 receptorproteinet elueredes fra kolonnen ved at køre en lineær gradient med 0,1% (vol/vol) TFA i acetomtnl fra ΟΙ 100% med en hastighed på 1 %/minut Portioner af fraktionerne analyseredes ved SDS- I polyacrylamidgelelektroforese Det viste sig, at IL-1 receptorproteinet bestod af et enkelt I 30 bånd på en SDS-polyarylamidgel, der migrerede med en molekylvægt på 82 000

Det oprensede IL-1 receptorprotein analyseredes ved Edman-nedbrydnmg under I anvendelse af et Applied Biosystems Model 470A proteinsekvensbestemmejsesapparat I Proteinet (150 picomol) blev ikke modificeret før analyse Resultaterne af N-terminal pro- I teinsekvensanalysen af IL-1 receptoren viser den følgende sekvens af aminosyrerester 35 NH2-Leu-Glu-lle-Asp-Val-Cys-Thr-Glu-Tyr-Pro-Asn-Gln-lle-Val-Leu-Phe-Leu-Ser-Val- 25 DK 175403 B1

Asn-Glu-lle-Asp-lle-Arg-Lys

Denne proteinsekvens fandtes at være enestående, når den sammenlignedes med den information, der den 17 marts 1987 var tilgængelig i proteinsekvensdatabasen i Protein Identificatin Resource National Biomedical Research Foundation Den tilgæn-5 gelige information i databasen rummede 4 253 sekvenser bestående af 1 029 056 rester

Eksempel 4

Isolennq af cDNA kodende for munn IL-1R ved direkte ekspression af aktivt protein i 10 COS-7 celler

Et cDNA-bibliotek opbyggedes ved revers transkription af polyadenyleret mRNA isoleret fra total RNA ekstraheret fra EL-4 6 1 C10 celler ved en fremgangsmåde lig den af Chirgwm et al beskrevne (Biochem 18 5294,1979) I korte træk lyseredes cellerne i en guanidmiumisothiocyanatopløsning, og lysatet lejredes over en pude af CsCI og cen-15 tnfugeredes indtil RNA'en var pelleteret RNA-pelleten resuspenderedes og oprensedes yderligere ved proteasenedbrydmng, organisk ekstraktion og alkoholpræcipitation Poly A+ RNA isoleredes ved oligo dT cellulosekromatografi, og dobbeltstrenget cDNA fremstilledes ved en fremgangsmåde, der lig den af Gubier og Hoffman beskrevne (Gene 25 263, 1983) I korte træk kopieredes RNA’en til cDNA ved revers transknptase under 20 anvendelse af enten oligo dT eller tilfældige oligonukleotider som primer cDNA'en gjordes dobbeltstrenget ved inkubation med E coll DNA-polymerase I og RNase H, og enderne gjordes stumpe ved yderligere inkubation med T4 DNA-polymerase Den stump-endede cDNA ligeredes i Smal-skåret dephosphoryleret pDC201 vektor DNA

Den eukaryotiske højekspressionsvektor pDC201 samledes fra SV40, adeno-25 virus 2 og pBR322 DNA, der i rækkefølge omfattede (1) et SV40-fragment indeholdende replikationsområdet, tidlige og sene promotorer samt forstærker, (2) et adenovirus 2 fragment indeholdende den sene hovedpromotor, den første exon og en del af den første intron af den tredelte sene leder, (3) en syntetisk sekvens omfattende et Hindlll-sted, et splejsnmgsacceptorsted, anden og tredje exon af den tredelte adenovirus 2 le-30 der og et multipelt kloningssted omfattende et Smal-sted, (4) yderligere SV40-sekvenser indeholdende tidlige og sene polyadenylenngssteder, (5) adenovirus 2 sekvenser omfattende de virus-associerede RNA-gener, og (6) pBR322 elementer for replika.tion i E coli Det resulterende EL-4 6 1 C10 cDNA-bibliotek i pDC201 anvendtes til transfor-menng af E coli stamme DH5a, og rekombinanter udpladedes til tilvejebringelse af ca 35 350 kolonier pr plade og tilstrækkeligt mange plader til at tilvejebnnge ca 25 000 totale I DK 175403 B1 H kolonier pr screen Kolonier skrabedes fra hver plade, kombineredes, og ud fra hver pul- je fremstilledes plasmid DNA Den kombinerede DNA anvendtes dernæst til transfektion af subkonfluente lag af abe COS-7 celler under anvendelse af DEAE-dextran efterfulgt af chlorquinbehandling som beskrevet af Luthman et al (Nucleic Acids Res 11 1295, 5 1983) og McCutchan et al (J Natl Cancer Inst 41 351,1986) Cellerne dyrkedes der- næst i kultur i tre dage for at muliggøre forbigående ekspression af de indføjede se- kvenser Efter tre dage kasseredes cellekultursupernantanter, og cellemonolagene i hver plade analyseredes for IL-1 binding som følger 3 ml RPMI-medium indeholdende 3 x H 10" M l-IL-1 a sattes til hver plade, og pladerne inkuberedes i 2 timer ved 8°C Det- 10 te medium kasseredes derefter, og hver plade vaskedes med 10 ml RPMI 1640 medium (ikke indeholdende mærket IL-1 σ) Kanterne af hver plade blev så knækket af, hvilket ef- terlod en flad skive, der bragtes i kontakt med røntgenfilm i 72 timer ved —70°C under H anvendelse af en forstærkende screen IL-1 bindingsaktivitet blev synlig på de fremkald- te film som et mørkt sted mod en relativt ensartet baggrund 15 Efter screening af ca 150 000 rekombinanter fra biblioteket på denne måde blev der iagttaget, at en transfektantpulje tilvejebragte IL-1 bindingssteder, som var klart syn- lige mod baggrunden

Et nedfrosset lager af bakterier fra den positive pulje anvendtes dernæst til opnå- else af plader med ca 350 kolonier Replika af disse plader fremstilledes på mtrocellu- 20 losefiltre, hvorefter pladerne skrabedes, og plasmid DNA fremstilledes og transficeredes som beskrevet ovenfor til identificering af en positiv plade Baktener fra individuelle kolo- mer fra mtrocellulosereplikaeme af denne plade dyrkedes 12 ml kulturer, der anvendtes til opnåelse af plasmid DNA, som transficeredes i COS-7 celler som beskrevet ovenfor På denne måde isoleredes en enkelt klon, klon 78, som var i stand til at inducere eks- 25 pression af 11-1R i COS-celler Indføjedelsen subklonedes i et plasmid afledt af pBR322 (GEMBL) og sekvensanalyseredes ved konventionélle teknikker Sekvensen er vist i ta- bel 1 I Eksempel 5 30 Isolering af humane cDNA-kloner. der hvbndiserer til murm IL-1 receptorprobe DNA'er I En cDNA-polynukleotidprobe fremstilledes ud fra 2356 basepar (bp) fragmentet

af klon 78 (se eksempel 4) ved mck-translation under anvendelse af DNA-polymerase I

I Den anvendte metode var i det væsentlige lig den af Maniatis et al (ovenfor, p 109) be- I skrevne

I 35 Et cDNA-bibliotek opbyggedes ved revers transknption af polyadenyleret mRNA

DK 175403 B1 I

isoleret fra total RNA ekstraheret fra de dyrkede celler af en human T-cellelime kaldet I

klon 22, beskrevet af Acres et al (J Immunol 138 2132,1987) Disse celler dyrkedes ι I

RPMI 1640 medium plus 10% kalvefosterserum som beskrevet af Acres et al (ovenfor), I

i nærvær af 10 ng/ml OKT3 antistof og 10 ng/ml human IL-2 cDN'en gjordes dob- I

5 beltstrenget under anvendelse af DNA-polymerase I, gjordes stump-endet med T4 DNA- I

polymerase, methyleredes med EcoRI methylase til beskyttelse af EcoRI spaltnmgsste- I

derne i cDNA'en, og ligeredes til EcoRI-lmkere De resulterende konstruktioner blev nedbrudt med EcoRI til fjernelse af eksemplarerne af linkerne ved hver ende af cDNA'en på nær et, og ligeret til EcoRI-skårne og dephosphorylerede arme af bakteriofag Mgt10 10 (Huynh et al, DNA Cloning A Practical Approach, Glover, ed , IRL Press, pp 49-78)

Den ligerede DNA pakkedes i fagpartikler under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt sæt (Stratagene Cloning Synstems, San Diego, CA, USA 92121) til dannelse af et bibliotek af rekombmanter Rekombinanterne udpladedes på E coli stamme C600(hfl’) og screenedes ved standard plaque-hybridisenngstekmkker under moderat strenge be-15 tingelser (50eC, 6 x SSC)

Efter flere screeningsrunder isoleredes ni kloner fra biblioteket, der hybndiserede til cDNA-proben Kloneme plaque-oprensedes og anvendtes til fremstilling af bakteriofag DNA, som blev nedbrudt med EcoRI Nedbrydningsprodukterne underkastedes elektro-forese på en agarosegel, blottedes på nylonfiltre og testedes igen for hybndisenng Klo-20 nerne blev nedbrudt med EcoRI efterfulgt af præparativ agarosegelelektroforese, subklo-nedes dernæst i et EcoRI-skåret denvat (pGEMBL) af standard kloningsvektoren pBR322, der indeholdt en polylinker med et enestående EcoRI-sted, et BamH1-sted og talrige andre enestående restnktionssteder Et eksempel på en vektor af denne type er beskrevet af Dente et al (Nucleic Acids Research 11 1645, 1983) 25 Restriktronskortlægning og sekvensbestemmelse af en 4,8 kb human IL-1R klon viste, at klonen omfattede en sekvens, der koder for 518 aminosyrer, som udviste 80% aminosyresekvensidentititet med den tilsvarende munne sekvens i det extraceilulaere eller N-terminale område distalt til transmembranområdet, 63% identitet i transmembranområdet og 87% identitet i det cytoplasmiske eller C-terminale område Desuden var fle-30 re cysteinrester og de fleste N-bundne glycosyleringssteder mellem de munne og humane sekvenser Et 440 bp EcoRI-Nsil fragment afledt af 5'-delen af den humane IL-1R klon P-mærkedes ved mck-translation som beskrevet ovenfor og anvendtes til screening af et cDNA-bibliotek fremstillet ved randomiseret pnming af klon 22 mRNA fremstillet som beskrevet ovenfor 23 kloner, der hydbridiserede til proben, blev isoleret og ana-35 lyseret ved restnktionskortlægnmg Sekvensbestemmelse af en af disse kloner tilveje- I DK 175403 B1 H bragte den sekvensinformation, der svarer til de resterende N-terminale 34 aminosyrer af det humane protein Kodningen og de udledte aminosyresekvenser af det komplette

kodningsområde af human IL-1R er vist i tabellerne 4A-4C

5 Eksempel 6 H Ekspression af rekombinant IL-1 receptor under anvendelse af et høieffektivt mammalt H ekspressionssvstem

Det mammale ekspressionsplasmid pDC201, afbildet i fig 2, er udformet til at ud- H trykke cDNA-sekvenser indføjet ved dets multiple kloningssted (MCS) ved transfektion i 10 mammale celler Idet der nu henvises til fig 2 omfatter pDC201 følgende komponenter SV40 (skraveret felt) indeholder SV40-sekvenser fra koordinater 5171 -270 inklusive re- plikationsområdet, forstærkersekvenser og tidlige og sene promotorer Fragmentet er orienteret således, at transkriptionsretningen fra den tidlige promoter er som vist ved pi- len Ad-MLP (uskraveret felt) indeholder adenovirus-2 sekvenser fra koordinater 5779- 15 6231 inklusive den sene hovedpromotor, den første exon og en del af intronen mellem den første og den anden exon af den tredelte leder TPL (stiplet felt) indeholder en syn- tetisk DNA-sekvens, der specificerer adenovirus-2 sekvenser 7056-7172, 9634-9693 (in- deholdende acceptorsplejsningsstedet af den anden exon af den tredelte leder, den an- den exon og en del af den tredje exon af den tredelte leder) og et multipelt kloningssted 20 (MCS) indeholdende steder for Kpnl, Smal og Bg1 II pA (skraveret felt) indeholder SV40-sekvenser fra 4127-4100 og 2770-2533, der omfatter polyadenyleringen og termi- neringssignaleme for tidlige transknption VA (udfyldt felt) indeholder adenovirus-2 se- kvenser fra 10226-11555, der omfatter de virus-associerede RNA-gener (VAI og VAII)

De fuldt optrukne linier stammer fra pBR322 og repræsenterer (begyndende efter pA- 25 sekvenserne og i retning med uret) koordinater 29-23, 651-185 (på hvilket punkt VA-se- I kvenseme bliver indføjet), 29-1,4363-2486 og 1094-375 pDC201 er et derivat af I pMLSV, der tidligere er beskrevet af Cosman et al, Molec Immunol 23 935(1986) H Til ekspression af rekombinant IL-1 receptor dyrkedes COS-celler og transficere- I des som beskrevet af Cosman et al, ovenfor, med plasmid DNA'en fra en 1,5 ml kultur I 30 af E coli transformeret med pDC201, som har en IL-1 R cDNA-indføjelse (klon 78) Efter I 72 timers dyrkning høstedes celler ved vaskmng en gang med 10 ml PBS og efterfølgen- I de behandling med en EDTA-opløsnmg (natriumphosphat 0,05 M, natnumchlorid 0,15 I M, EDTA 0,005 M, pH 7,4) 120 minutter ved 37°C efterfulgt af skrabnmg Til sam- I meniigning transficeredes COS-celler med en pDC201 kontrolvektor, der ikke indeholdt I 35 nogen indføjelse, og EL-4 6 1 C10 celler og EL-4 M celler (en IL-1 receptor-negativ va- 29 DK 175403 B1 riant af EL-4 celler) dyrkedes og høstedes som beskrevet af McDonald et al, J Immunol 135 3964 (1985)

Ved mættende DNA-koncentrationer indeholdt det transficerede COS- cellemonolag gennemsnitligt 45 000 steder pr celle Da de parentale COS-celler 5 udtrykte kUn ca 500 receptorer pr celle, kan det beregnes, at mere end 98% af alle IL-1 receptorer i den transficerede population var rekombinante Flowcytometri under anvendelse af FITC-IL-1o afslørede, at kun 4,2% af cellerne blev farvet klart, hvorfor hver af disse transficerede COS-celler indeholdt ca 1,1x10 IL-1 bindingssteder

Plasmamembranproteiner af EL-4 6 1 C10 celler og af COS celler transficeret .

10 med vektor DNA indeholdende cDNA, der koder for IL-1 receptoren (klon 78), mærkedes 125 med I som beskrevet i eksempel 1 ovenfor Celler ekstraheredes derefter med PBS indeholdende 1% Triton X-100 og en cocktail af proteaseinhibitorer (2 mM phenylmethyl-sulphonylfluond, 1 mM pepstatin, 1 mM leupeptm og 2 mM O-phenanthrolm) Detergentekstrakter underkastedes affinitetskromatografi som beskrevet i eksempel 1 på Affigel- 15 10 (Biorad, Richmond, CA), hvortil der var blevet bundet rekombmant human IL-1or 125 l-mærket receptor elueredes dernæst med prøvepuffer (0,0625 M Tns-HCI, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol) og analyseredes ved SDS-polyacryl-amidgelelektroforese på en 10% gel Geler underkastedes dernæst autoradiografi Den ved affinitetskromatografi på IL-1 a kolonner oprensede rekombinante IL-1 receptor 20 migrerede med en relativ mobilitet på ca 80 000 på SDS-polyacrylamidgeler, hvilket var sammenligneligt med den mobilitet, der udvistes af den på samme måde fra EL-4 6 1 C10 celler oprensede IL-1 receptor

DNA'en fra klon 78 førte, når den transficeredes i COS-celler, til ekspression af IL-1 bindingsaktivitet, der praktisk taget var identisk med den, der udvistes af EL-4 6 1 25 C10 celler, som vist i fig 3A-3C

g

Til bindingsassays resuspenderedes COS-celler ved 1,7 x 10 celler/ml til EL-4 M (1,5 x 10^ celler/ml) celler som bærere EL-4 M og EL-4 6 1 C10 resuspenderedes

ved 1,5x10^ celler/ml Alle cellesuspensioner og bindingsanalyser udførtes i RPMI

1640/10% BSA/0,1% natnumazid/20 mM HEPES, pH 7,4 Bindingsinkubationer med 125 125 30 l-IL-1 er eller l-IL-1 β og umærket IL-1 σ og IL-1 β udførtes som beskrevet andet- 125 steds i beskrivelsen l-IL-1 σ bandt til de transficerede COS-celler med en K på 3,0 9-1 a ± 0,2 x 10 M (Fig 3B) K 'en for den native receptor på EL-4 6 1 C10 celler var 4,3 ± 9-1 a 3x10 M Alle bindinger var til rekombinante receptorer (se fig 3A), den parentale 125 COS-cellepopulation bandt ikke påviseligt l-IL-1 a i dette forsøg 125 35 I et koldt sammenlignmgsforsøg var koncentrationen af fn l-IL-1 σ 7,72 ± 0,13 _______ , I ' DK 175403 B1 I 30 -in 4 x 10 M Pa de transficerede COS-celler var den maksimale binding 2,98 ± 0,3 x 10 molekyler/celle (ingen inhibering), og baggrunden (målt i nærvær af 6 x 10*^ M umærket IL-1or) var 921 ± 60 molekyler/celle (100% inhibering) På EL-4 6 1 C10 cellerne var den

H

maksimale binding 1,33 ± 0,02 x 10 molekyler/celle, og baggrunden (se ovenfor) var 47 125 5 ± 2 molekyler/celle Binding af l-IL-1 o, både til de transficerede COS-celler og til EL- 4 6 1 C10 celler, kunne udkonkurreres fuldstændigt af et overskud af enten umærket IL- 1 a eller umærket IL-1 li (fig 3C) Inhibenngskonstanterne for IL-1 a og for IL-1 β var me- get lig hinanden for hver celletype (fig 3C) 10 Eksempel 7

H Fremstilling af monoklonale antistoffer mod IL-1 R

Præparater af oprenset rekombinant IL-1 R, fx human IL-1 R, eller transficerede COS-celler, der udtrykker høje niveauer af IL-1 R, anvendes til dannelse af monoklonale antistoffer mod IL-1 R under anvendelse af konventionelle teknikker, fx de i US-patent- 15 skrift nr 4 411 993 beskrevne Sådanne antistoffer er sandsynligvis anvendelige til ind- virkning på IL-1 binding til IL-1 receptorer, fx til forbednng af toxiske eller andre uønske- de virkninger af IL-1

Til immumsenng af mus emulgeres IL-1 R immunogen i komplet Freund’s adju- vans og injiceres i Balb/c mus i mængder fra 10-100 pg 10 til 12 dage senere boostedes 20 de immuniserede dyr med yderligere immunogen emulgeret i ukomplet Freund’s adju- H vans og boostes periodisk derefter iht et ugentligt eller tougentligt immuniseringsskema

Serumprøver udtages penodisk ved retro-orbital åreladning eller halespids-excision for testning ved dot-blot assay, ELISA-test (enzymbundet immunsorbentassay) eller inhibe- 125 nng af binding af l-IL-1 a til ekstrakter af EL-4 6 1 C10 celler (som beskrevet ovenfor) 25 Andre assayfremgangsmader er også egnede Efter påvisning af en passende antistofti- ter indgives en intravenøs injektion af antigen i saltvand til positive dyr 3 til 4 dage sene- re aflives dyrene, splenocyter høstes og fusioneres til den murine myelomacellelmie NS1 Ved denne fremgangsmåde frembragte hybridomacellelimer udplades i multiple I mikrotiterplader i et HAT-selektivt medium (hypoxanthin, aminoptenn og thymidin) til inhi- I 30 bering af proliferation af ikke-fusionerede celler, myelomahybrider og miltcellehybrider I Således frembragte hybndomakloner kan screenes ved en ELISA-test for reakti- I vitet med IL-1 R, fx ved tilpasning af de af Engvall et al, Immunochmeistry 8871 (1971) I og i US-patentsknft nr 4 703 004 beskrevne teknikker Positive kloner injiceres dernæst i de peritoneale caviteter af syngemske Balb/c-mus til fremstilling af ascites mdeholden- I 35 de høje koncentrationer (>1 mg/ml) anti-IL-1 R monoklonalt antistof Det resulterende 31 DK 175403 B1 monoklonale antistof kan oprenses ved ammomumsulfatpræcipitation efterfulgt af gel-eksklusionskromatografi og/eller affinitetskromatografi baseret på binding af antistof til protein A af Staphylococcus aureus 5 Eksempel 8

Ekspression af 1L-1R i gær

Til ekspression af human eller munn IL-1R i gær opbygges en fra plXY120 afledt gærekspressionsvektorsom følger plXY120 er identisk med pYoHuGM (ATCC 53157), bortset fra, at den ikke indeholder nogen cDNA-indføjelse og omfatter et polylinker/multi-10 pelt kloningssted med et Ncol sted Denne vektor omfatter DNA-sekvenser fra følgende kilder (1) et stort Sphl (nukleotid 562) til EcoRI (nukleotid 4361) fragment udskåret fra plasmid pBR322 (ATCC 37017), inklusive replikationsområdet og amptcillinresistens-markøren for udvælgelse i E coli, (2) S cerevisiae DNA, der omfatter TRP-1 markøren, 2 pm replikationsområdet, ADH2-promotoren, og (3) DNA, der koder for et 85 amino-15 syresignalpeptid afledt fra genet, der koder for den udskilte peptid-o-faktor (se Kurjan et al, US-patent 4 546 082) Et Asp718 restriktionssted blev indført ved position 237 i a-faktorsignalpeptidet for at lette fusion til heterologe gener Dette tilvejebragtes ved ændring af thymidinresten ved nukleotid 241 til en cytosinrest ved oligonukleotid-styret in vitro mutagenese som beskrevet af Craik, Biotechmques 12 (1985) Et syntetisk oligo-20 nukleotid indeholdende multiple kloningssteder og med følgende sekvenser indføjedes fra Asp718-stedet ved aminosyre 79 nær ved 3'—enden af σ-faktorsignalpeptidet til et Spel-sted i 2 pm sekvensen

Asp718 Stul Ncol BamHI

GTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGAGGCCTCCATGGAT..· 25 GAAACCTATTTTCTCTGATGTTCCTGCTGCT ACTGTTCTCCGGAGGTACCTA . .

| *-----Polylinker—

Smal Spel . .CCCCCGGGACA ...GGGGGCCCTGTGATC ---Polylinker----»| 30 pBC120 adskiller sig også fra pYoHuGM ved tilstedeværelsen af et 514 bp DNA-frag-ment afledt af den enkeltstrengede fag f 1, der indeholder replikationsområdet og det m-tergemske omrade, som er blevet indføjet ved Nru1-stedet i pBR322-sekvensen Tilste-35 deværelsen af et f1 replikationsområde tillader frembringelse af enkeltstregede DNA-ko- I DK 175403 B1 I 32 pier af vektoren ved transformation i passende stammer af E coli og supennfektion med bakteriofag f1, hvilket letter DNA-sekvensbestemmelse af vektoren og tilvejebring er et grundlag for in vitro mutagenese Til indføjelse afen cDNA nedbrydes plXY120 med

Asp718, der spalter nær ved 3’-enden af σ-faktoriederpeptidet (nukleotid 237), og fx .

5 Ncol, der spalter i polylinkeren Det store vektorfragment oprenses dernæst og ligeres til H et DNA-fragment, der koder for proteinet, som skal udtrykkes

Til skabelse af en udskillelsesvektor til ekspression af human IL-1R spaltes et I

cDNA-fragment, som indeholder den komplette åbne læseramme, der koder for hlL-1 R, med en passende restriktionsendonuklease proximalt til N-terminalen af det modne pro- 10 tein Derefter syntetiseres et eller flere oligonukleotider, som er i stand til at ligere til 5'— og 3'-enderne af hlL-1R-fragmentet, idet eventuelle kodoner, der er udeladt ved isolering af fragmentet, regenereres, og der også tilvejebnnges cohæsive terminaler til ligenng til plXY120 for tilvejebnngelse af en kodningssekvens, som befinder sig i ramme med hen- syn tii en intakt o-faktorledersekvens 15 De resulterende ekspressionsvektorer oprenses dernæst og anvendes til trans- formation af en diploid gærstamme af S cerevisiae (XV2181) ved standardteknikker, sa- som de i EPA 0165654 beskrevne, idet der udvælges på grundlag af tryptophanproto- H tropher De resulterende transformanter dyrkes for ekspression af et hlL-1R protein som et udskilt eller ekstraheret produkt Kulturer, som skal analyseres for hlL-1R ekspres- I 20 sion, dyrkes i 20-50 ml YPD-medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 1% glucose) ved 8 37°C til en celledensitet på 1 -5 x 10 celler/ml Til adskillelse af celler fra medium fjernes I celler ved centrifugering, og mediet filtreres gennem et 0,45 pm celluloseacetatfilger før analyse Supernatanter fremstillet af den transformerede gærstamme, eller ekstrakter fremstillet ud fra desintegrerede gærceller analyseres for tilstedeværelsen af hlL-1 R un- I 25 der anvendelse af bmdsassays som beskrevet ovenfor I Eksempel 9 I Konstruktion, ekspression og oprensning af afkortet rekombinant munn IL-1 receptor I En afkortet version af IL-1 receptorproteinet fremstilledes under anvendelse af et I 30 ekspressionssystem, som var kompatibelt med HELA-EBNA1 cellelinien, der konstitutivt I udtrykker Epstem-Barr virusnukleusantigen drevet fra CMV-umiddelbar-tidlig forstærker I promotoren Den anvendte ekspressionsvektor betegnedes HAV-EO, et denvat af I pDC201, der indeholder Epstein-Barr virus origin og tillader et højt niveau af ekspression I i HELA-EBNA cellelinien HAV-EO er afledt af pDC201 ved erstatning af den sene I 35 adenovirus hovedpromotor med syntetiske sekvenser fra HIV-1, der strækker sig fra 33 DK 175403 B1 cap-stedet af den virale mRNA, under anvendelse af den tidlige SV40-promotor til at drive ekspression af HIV-1 tat genet

Ekspressionskonstruktionen for den opløselige afkortede IL-1 receptor frembragtes tnnvist Hele kodningsområdet af receptoren og en del af det utranslaterede 5'-områ-5 de fjernedes fra den oprindelige IL-1 receptorklon 78 ved nedbrydning med Asp 718 og Ndel Dette fragment, der ikke indeholdt utranslaterede 3’-sekvenser, klonedes i HAVEO til dannelse af HAV-EO-FL9 En variant af dette plasmid, der indeholdt en translatio-nel stopkodon umiddelbart efter kodonen for prolin 316 og som manglede hele kodningssekvensen 3' herfor, opbyggedes derefter ved standardmetoder og kaldtes for HAV-EO-10 MEXT

HAV-EO-MEXT vektor DNA indførtes i HELA-EBNA celler ved en modificeret po- lybrentransfektion som beskrevet af Kavai og Nishizava (Mol Cell Biol 4 1172, 1984) fi 1,5 x 10 celler podedes 110 ml DMEM + 10% FCS i en 10 cm vævskulturskål Celler in-I kuberedes ved 37°C, 10% CO2116 timer Medierne fjernedes dernæst, og der tilsattes I 15 3 ml serumfri DMEM indeholdende 10 pg/ml DNA og 30 pg/ml polybren (Sigma) Skåle- I ne inkuberedes dernæst ved 37°C/10% C02 1 yderligere 6 timer, på hvilket tidspunkt I DNA-blandingen fjernedes og cellerne udsattes for glycerol-chock ved tilsætning af 3 ml I serumfri DMEM + 25% glycerol (vol/vol) 11 minut Glycerol fjernedes, og cellerne vaske- I des to gange med medium Dernæst tilsattes 10 ml DMEM + 10% FCS, og cellerne inku- I 20 beredes ved 37°C/10% C02 118 timer I Transficerede celler fjernedes dernæst med trypsin og opdeltes i et forhold på I 2 I 1 9 1 T175 cm kolber (til opnåelse af ca 10% konfluens), der indeholdt 25 ml DMEM + I 1 % FCS Supernatanter indeholdende midlertidigt udtrykt opløselig murin IL-1 receptor I høstedes hver 24 time i indtil 10 dage I ipc; I 25 IL-1 a bindingsaktivitet 1 mediet måltes ved inhibering af IL-1 a til EL4 6 1 C10 I celler som beskrevet af Mosley et al (J Biol Chem 267 2941, 1987) med undtagelse, i .i 1 af at mærket IL-1 a (2 x 10 , 50 pi) først inkuberedes med testprøven (50 μΙ) i to timer I 6 I ved 8°C før tilsætning af celler (2,5 x 10 celler, 50 μΙ) Hver testprøve analyseredes 16 I fortyndinger (X3), og mhiberingsdosisresponskurven anvendtes til bestemmelse af den I 30 relative inhibitoriske titer I Opløselig IL-1 receptor oprensedes fra kultursupernatanter som beskrevet for na- I turlig receptor af Urdal et al (J Biol Chem 263 280,1988) Kultursupernatanter ledtes I over en 1 ml leje volumen IL-1 a kolonne, kolonnen vaskedes med PBS og elueredes I med 0,1 M glycm-HCI Syreeluatfraktioner neutrahseredes med det samme og testedes I 35 derefter for IL-1 bindingsaktivitet under anvendelse af radioreceptonnhibenngsanalyse DK 175403 B1 SDS-polyacrylamidgelelektroforese af det ved syrebehandling eluerede materiale viste, at det indeholdt to bånd med Mr 60 000 og 54 000 N-glycanasebehandlmg af dette ma- teriale viste, at størrelsesheterogeniteten skyldes forskelle i N-bundet glycosylenng mel- lem det to arter Opløselig IL-l receptor bibeholder fuld IL-1 bindingsaktivitet 35 DK 175403 B1

Tahpl 1 cDNA-cpkvens af IL-IR klon i GEMBI 78

1 5’ -TGGGTCGTCT GACTAGAAGT GAGCTGTCTG TCATTCTTGT GCACGCCAGC

51 CCAGTTAATCA TTTGGAGGCA AAGCAAACTG TAAGTAATGC TGTCCTGGGC

101 TGACTTGAGG AjGGCAGTTTT CGTTTTAACA GCCAGTGTTT ATTTGCTCAG

151 CAAACGTTGT CTCGGGGAGA AATGTCGCTG GATGTCATCA GAGTTCCCAG

201 TGCCCCGAAC CGTGAACAAC ACAAATGGAG AATATGAAAG TGCTACTGGG

251 GCTCATTTGT CTCATGGTGC CTCTGCTGTC GCTGGAGATT GACGTATGTA

301 CAGAATATCC AAATCAGATC GTTTTGTTTT TATCTGTAAA TGAAATTGAT

351 ATTCGCAAGT GTCCTCTTAC TCCAAATAAA ATGCACGGCG ACACCATAAT

401 TTGCTACAAG AATGACAGCA AGACCCCCAT ATCAGCGGAC CGGGACTCCA

451 GGATTCATCA GCAGAATGAA CATCTTTGGT TTGTACCTGC CAAGGTGGAG

501 GACTCAGGAT ATTACTATTG TATAGTAAGA AACTCAACTT ACTGCCTCAA

551 AACTAAAGTA ACCGTAACTG TGTTAGAGAA TGACCCTGGC TTGTGTTACA

601 GCACACAGGC CACCTTCCCA CAGCGGCTCC ACATTGCCGG GGATGGAAGT

651 CTTGTGTGCC CTTATGTGAG TTATTTTAAA GATGAAAATA ATGAGTTACC

701 CGAGGTCCAG TGGTATAAGA ACTGTAAACC TCTGCTTCTT GACAACGTGA

751 GCTTCTTCGG AGTAAAAGAT AAACTGTTGG TGAGGAATGT GGCTGAAGAG

801 CACAGAGGGG ACTATATATG CCGTATGTCC TATACGTTCC GGGGGAAGCA

851 ATATCCGGTC ACACGAGTAA TACAATTTAT CACAATAGAT GAAAACAAGA

901 GGGACAGACC TGTTATCCTG AGCCCTCGGA ATGAGACGAT CGAAGCTGAC

951 CCAGGATCAA TGATACAACT GATCTGCAAC GTCACGGGCC AGTTCTCAGA

1001 CCTTGTCTAC TGGAAGTGGA ATGGATCAGA AATTGAATGG AATGATCCAT

1051 TTCTAGCTGA AGACTATCAA TTTGTGGAAC ATCCTTCAAC CAAAAGAAAA

1101 TACACACTCA TTACAACACT TAACATTTCA GAAGTTAAAA GCCAGTTTTA

1151 TCGCTATCCG TTTATCTGTG TTGTTAAGAA CACAAATATT TTTGAGTCGG

1201 CGCATGTGCA GTTAATATAC CCAGTCCCTG ACTTCAAGAA TTACCTCATC

1251 GGGGGCTTTA TCATCCTCAC GGCTACAATT GTATGCTGTG -TGTGCATCTA

1301 TAAAGTCTTC AAGGTTGACA TAGTGCTTTG GTACAGGGAC TCCTGCTCTG

1351 GTTTTCTTCC TTCAAAAGCT TCAGATGGAA AGACATACGA TGCCTATATT

1401 CTTTATCCCA AGACCCTGGG AGAGGGGTCC TTCTCAGACT TAGATACTTT

1451 TGTTTTTAAA CTGTTGCCTG AGGTCTTGGA GGGACAGTTT GGATACAAGC

1501 TGTTCATTTA TGGAAGGGAT GACTATGTTG GAGAAGATAC CATCGAGGTT

1551 ACTAATGAAA ATGTAAAGAA AAGCAGGAGG CTGATTATCA TTCTAGTGAG

1601 AGATATGGGA GGCTTCAGCT GGCTGGGCCA GTCATCTGAA GAGCAAATAG

1651 CCATATACAA TGCTCTCATC CAGGAAGGAA TTAAAATCGT CCTGCTTGAG

1701 TTGGAGAAAA TCCAAGACTA TGAGAAAATG CCAGATTCTA TTCAGTTCAT

1751 TAAGCAGAAA CACGGAGTCA TTTGCTGGTC AGGAGACTTT CAAGAAAGAC

1801 CACAGTCTGC AAAGACCAGG TTCTGGAAAA ACTTAAGATA CCAGATGCCA

1851 GCCCAACGGA GATCACCATT GTCTAAACAC CGCTTACTAA CCCTGGATCC

1901 TGTGCGGGAC ACTAAGGAGA AACTGCCGGC AGCAACACAC TTACCACTCG

1951 GCTAGCATGG CAAAAGTGGG CAGGCCAAGA ACTTCGGAAT ATCTCCCATC

2001 ATAAGAGGCT GCAGCTGGGC TGTGCCTCCC AGTAAAACAG TCACGAACCA

2051 AACCTGTGCA GTCCCTTGTT CCAGATCACC TGGAACTGGA TTGGGAAGAG

2101 AACAGGACTT GGTGGCCAGG ACCGCTCAGA GAGCCATGGT TGCTCAGGGA

2151 TGCTGCTCCG GGATGCTTGA CTAACAGTCG AGGCAGTGAA CTGGGTGTAG

2201 AAAGCGTCAG GAAATGGCCA CATGTGTGGA TGGTTTAATT AGATTCTGTG

2251 GAGTCTCACA GTGGGATTGT GGCTGTCTGA GGACACTTTG GGGGGTCGCT_

2301 GTCCAAGAAG TGGCTCCCCA AAGTATAAGT GCGGGTGAGG TTTACTGATA

2351 CCCCAC-3' I DK 175403 B1

I 36 I

I Tabel 2A Sekvens af kodmnqsområde af murin IL-1 receptorqen I

5' -ATG GAG AAT ATG AAA GTG CTA CTG GGG CTC ATT TGT CTC ATG GTG -15 I

I Het Glu Asn Het Lys Val Leu Lcu Gly Leu Ile Cys Leu Het Val -5 I

I CCT CTG CTG TCG CTG GAG ATT GAC GTA TGT ACA G AA TAT CCA AAT 33 I

Pro Leu Leu Ser Leu Glu Ile Asp Val Cys Thr Glu Tyr Pro Asn 11 I

CAG ATC GTT TTG TTT TTA TCT GTA AAT G AA ATT GAT ATT CGC AAG 78 - I

I Gin Ile Val Leu Phe Leu Ser Val Asn Glu Ile Asp Ile Arg Lys 26 I

I TGT CCT CTT ACT CCA AAT AAA ATG CAC GGC GAC ACC ATA ATT TGG 123 I

Cys Pro Leu Thr Pro Asn Lys Het Bis Gly Asp Thr Ile Ile Trp 41 I

I TAC AAG AAT GAC AGC AAG ACC CCC ATA TCA GCG GAC CGG GAC TCC 168 I

Tyr Lys Asn Asp Ser Lys Thr Pro Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ser 56 I

I AGG ATT CAT CAG CAG AAT GAA CAT CTT TGG TTT GTA CCT GCC AAG 213 I

Arg Ile His Gin Gin Asn Glu Bis Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys 71 I

I GTG GAG GAC TCA GGA TAT TAC TAT TGT ATA GTA AGA AAC TCA ACT 258 I

Val Glu Asp Ser Gly Tyr Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Asn Ser Thr 86 I

I TAC TGC CTC AAA ACT AAA GTA ACC GTA ACT GTG TTA GAG AAT GAC 303 I

I Tyr Cys Leu Lys Thr Lys Val Thr Val Thr Val Leu Glu Asn Asp 101 I

CCT GGC TTG TGT TAC AGC ACA CAG GCC ACC TTC CCA CAG CGG CTC 348 I

I Pro Gly Leu Cys Tyr Ser Thr Gin Ala Thr Phe Pro Gin Arg Leu 116 I

I CAC ATT GCC GGG GAT GGA AGT CTT GTG TGC CCT TAT GTG AGT TAT 393 I

I His Ile Ala Gly Asp Gly Ser Leu Val Cys Pro Tyr Val Ser Tyr 131 I

I TTT AAA GAT GAA AAT AAT GAG TTA CCC GAG GTC CAG TGG TAT AAG 438 I

I Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Glu Val Gin Trp Tyr Lys 146 I

I AAC TGT AAA CCT CTG CTT CTT GAC AAC GTG AGC TTC TTC GGA GTA 483 I

I Asn Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Val Ser Phe Phe Gly Val 161 I

AAA GAT AAA CTG TTG GTG AGG AAT GTG GCT GAA GAG CAC AGA GGG 528 I

Lys Asp Lys Leu Leu Val Arg Asn Val Ala Glu Glu His Arg Gly 176 I

GAC TAT ATA TGC CCT ATG TCC TAT ACG ,TTC CGG GGG AAG CAA TAT 573 I

Asp Tyr Ile Cys Arg Met Ser Tyr Thr Phe Arg Gly Lys Gin Tyr 191 I

CCG GTC ACA CGA GTA ATA CAA TTT ATC ACA ATA GAT GAA AAC AAG 618 I

Pro Val Thr Arg Val Ile Gin Phe Ile Thr Ile Asp Glu Asn Lys 206 I

37 DK 175403 B1

Tabel 2B Sekvens af kodning s område af munn IL-1 receptorqen AGG GAC AGA CCT GTT ATC CTG AGC CCT CGG AAT GAG ACG ATC GAA 663

Arg Asp Arg Pro Val Ile Leu Ser Pro Arg Asn Glu Thr Ile Glu 221 GCT GAC CCA GGA TCA ATG ATA C AA CTG ATC TGC AAC GTC A CG GGC 708

Ala Asp Pro Gly Ser Met Ile Gin Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly 236 CAG TTC TCA GAC CTT GTC TAC TGG AAG TGG AAT GGA TCA GAA ATT 753

Gin Phe Ser Asp Leu Val Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Glu Ile 251 GAA TGG AAT GAT CCA TTT CTA GCT GAA GAC TAT CAA TTT GTG GAA 798

Glu Trp Asn Asp Pro Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Gin Phe Val Glu 266 CAT CCT TCA ACC AAA AGA AAA TAC ACA CTC ATT ACA ACA CTT AAC 843

Els Pro Ser Thr Lys Arg Lys Tyr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Asn 281 ATT TCA GAA GTT AAA AGC CAG TTT TAT CGC TAT CCG TTT ATC TGT 888

Ile Ser Glu Val Lys Ser Gin Phe Tyr Arg Tyr Pro Phe Ile Cys 296 GTT GTT AAG AAC ACA AAT ATT TTT GAG TCG GCG CAT GTG CAG TTA 933

Val Val Lys Asn Thr Asn Ile Phe Glu Ser Ala His Val Gin Leu 311 ATA TAC CCA GTC CCT GAC TTC AAG AAT TAC CTC ATC GGG GGC TTT 978

Ile Tyr Pro Val Pro Asp Phe Lys Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Phe 326 , ATC ATC CTC ACG GCT ACA ATT GTA TGC TGT GTG TGC ATC TAT AAA 1023

Ile Ile Leu Thr Ala Thr Ile Val Cys Cys Val Cys Ile Tyr Lys 341 GTC TTC AAG GTT GAC ATA GTG CTT TGG TAC AGG GAC TCC TGC TCT 1068

Val Phe Lys Val Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Ser 356 GCT TTT CTT CCT TCA AAA GCT TCA GAT GGA AAG ACA TAC GAT GCC 1113

Gly Phe Leu Pro Ser Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala 371 TAT ATT CTT TéT CCC AAG ACC CTG GGA GAG GGG TCC TTC TCA GAC 1158

Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp 386 TTA GAT ACT TTT GTT TTT AAA CTG TTG CCT GAG GTC TTG GAG GGA 1203

Leu Asp Thr Phe Val Phe Lys Leu Leu Pro Glu Val Leu Glu Gly 401 CAG TTT GGA TAC AAG CTG TTC ATT TAT GGA· AGG GAT GAC TAT GTT 1248

Gin Phe Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val 416 GGA GAA GAT ACC ATC GAG GTT ACT AAT GAA AAT GTA AAG AAA AGC 1293

Gly Glu Asp Thr Ile Glu Val Thr Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser 431 I DK 175403 B1 j I 38

Tabel 2C Sekvens af kodninosomrade af munn IL-1 receptorqen AGG AGG CTG ATT ATC ATT CTA GTG AGA GAT ATG GGA GGC TTC AGC 1338

Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Asp Met Gly Gly Phe Ser 446 I TGG CTG GGC CAG TCA TCT GAA GAG CAA ATA GCC ATA TAC AAT GCT 1383

Trp Leu Gly Gin Ser Ser Glu Glu Gin Ile Ala Ile Tyr Asn Ala 461 H CTC ATC CAG.GAA GGA ATT AAA ATC GTC CTG CTT GAG TTG GAG AAA 1428

Leu Ile Gin Glu Gly Ile Lys Ile Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys 476 I ATC CAA GAC TAT GAG AAA ATG CCA GAT TCT ATT CAG TTC ATT AAG 1473 H Ile Gin Asp Tyr Glu Lys Met Pro Asp Ser Ile Gin Phe Ile Lys 491 CAG AAA CAC GGA GTC ATT TGC TGG TCA GGA GAC TTT CAA GAA AGA 1518

Gin Lys His Gly Val Ile Cys Trp Ser Gly Asp Phe Gin Glu Arg 506 CCA CAG TCT GCA AAG ACC AGG TTC TGG AAA AAC TTA AGA TAC CAG 1563 H Pro Gin Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Leu Arg Tyr Gin 521 I ATG CCA GCC CAA CGG AGA TCA CCA TTG TCT AAA CAC CGC TTA CTA 1608 I Met Pro Ala Gin Arg Arg Ser Pro Leu Ser Lys His Arg Leu Leu 536 I ACC CTG-GAT CCT GTG CGG GAC ACT AAG GAG AAA CTG CCG GCA GCA 1653 I Thr Leu Asp Pro Val Arg Asp Thr Lys Glu Lys Leu Pro Ala Ala 551 ACA CAC TTA CCA CTC GGC TAG-3' 1671

Thr His Leu Pro Leu Gly End 557 39 DK 175403 B1

Tabel 3 cDNA-sekvens af human IL-IR konstruktion

1 5'-AGACGCACCC TCTGAAGATG GTGGACTCCC TCCTGAGAAG CTGGGACCCC

51 TTGGTAAAAG ACAAGGCCTT CTCCAAGAAG AATATGAAAG TGTTACTCAG

101 ACTTATTTGT TTCATAGCTC TACTGATTTC TTCTCTGGAG GCTGATAAAT

151 GCAAGGAACG TGAAGAAAAA ATAATTTTAG TGTCATCTGC AAATGAAATT

201 GATGTTCGTC CCTGTCCTCT TAACCCAAAT GAACACAAAG G C ACT AT AA C

251 TTGGTATAAA GATGACAGCA AGACACCTGT ATCTACAGAA CAAGCCTCCA

301 GGATTCATCA ACACAAAGAG AAACTTTGGT TTGTTCCTGC TAAGGTGGAG

351 GATTCAGGAC ATTACTATTG CGTGGTAAGA AATTCATCTT ACTGCCTCAG

401 AATTAAAATA AGTGCAAAAT TTGTGGAGAA TGAGCCTAAC TTATGTTATA

451 ATGCACAAGC CATATTTAAG CAGAAACTAC CCGTTGCAGG AGACGGAGGA

501 CTTGTGTGCC CTTATATGGA CTTTTTTAAA AATGAAAATA ATGAGTTACC

551 TAAATTACAG TGGTATAAGG ATTGCAAACC TCTACTTCTT GACAATATAC

601 ACTTTAGTGG AGTCAAAGAT AGGCTCATCG TGATGAATGT GGCTGAAAAG

651 CATAGAGGGA ACTATACTTG TCATGCATCC TACACATACT TGGGCAAGCA

701 ATATCCTATT ACCCGGGTAA TAGAATTTAT TACTCTAGAG GAAAACAAAC

751 CCACAAGGCC TGTGATTGTG AGCCCAGCTA ATGAGACAAT GGAAGTAGAC

801 TTGGGATCCC AGATACAATT GATCTGTAAT GTCACCGGCC AGTTGAGTGA

851 CATTGCTTAC TGGAAGTGGA ATGGGTCAGT AATTGATGAA GATGACCCAG

901 TGCTAGGGGA AGACTATTAC AGTGTGGAAA ATCCTGCAAA CAAAAGAAGG

951 AGTACCCTCA TCACAGTGCT TAATATATCG GAAATTGAAA GTAGATTTTA

1001 TAAACATCCA TTTACCTGTT TTGCCAAGAA TACACATGGT ATAGATGCAG

2051 CATATATCCA GTTAATATAT CCAGTCACTA ATTTCCAGAA GCACATGATT

1101 GGTATATGTG TCACGTTGAC AGTCATAATT GTGTGTTCTG TTTTCATCTA

1151 TAAAATCTTC AAGATTGACA TTGTGCTTTG GTACAGGGAT TCCTGCTATG

1201 ATTTTCTCCC AATAAAAGCT TCAGATGGAA AGACCTATGA CGCATATATA

1251 CTGTATCCAA AGACTGTTGG GGAAGGGTCT ACCTCTGACT GTGATATTTT

1301 TGTGTTTAAA GTCTTGCCTG AGCTCTTGGA AAAACAGTGT GGATATAAGC

1351 TGTTCATTTA TGGAAGGGAT GACTACGTTG GGGAAGACAT TGTTGAGGTC

1401 ATTAATGAAA ACGTAAAGAA AAGCAGAAGA CTGATTATCA TTTTAGTCAG

1451 AGAAACATCA GGCTTCAGCT GGCTGGGTGG TTCATCTGAA GAGCAAATAG

1501 CCATGTATAA TGCTCTTGTT CAGGATGGAA TTAAAGTTGT CCTGCTTGAG

1551 CTGGAGAAAA TCCAAGACTA TGAGAAAATG CCAGAATCGA TTAAATTCAT

, 1601 TAAGCAGAAA CATGGGGCTA TCCGCTGGTC AGGGGACTTT ACACAGGGAC

1651 CACACTCTGC AAAGACAAGG TTCTGGAAGA ATGTCAGGTA CCACATGCCA 1701 GTCCAGCGAC GGTCACCTTC ATCTAAACAC CAGTTACTGT CACCAGCCAC 1751 TAAGGAGAAA CTGCAAAGAG AGGCTCACGT GCCTCTCGGG TAGCATGGAG 1801 AAGTTGCCAA GAGTTCTTTA GGTGCCTCCT GTCTTATGGC GTTGCAGGCC 1851 AGGTTATGCC TCATGCTGAC TTGCAGAGTT CATGGAATGT AACTATATCA 1901 TCCTTTATCC CTGAGGTCAC CTGGAATCAG ATTATTAAGG GAATAAGCCA 1951 TGACGTCAAT AGCAGCCCAG GGCACTTCAG AGTAGAGGGC TTGGGAAGAT 2001 CTTTTAAAAA GGCAGTAGGC CCGGTGTGGT GGCTCACGCC TATAATCCCA 2051 GCACTTTGGG AGGCTGAAGT GGGTGGATCA CCAGAGGTCA GGAGTTCGAG 2101 ACCAGCCCAG CCAACATGGC AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAAAAA 2151 TGAGCTAGGC ATGGTGGCAC ACGCCTGTAA'TCCCAGCTAC ACCTGAGGCT 2201 GAGGCAGGAG AATTGCTTGA ACCGGGGAGA CGGAGGTTGC AGTGAGCCGA

2251 GTTTGGGCCA CTGCACTCTA GCCTGGCAAC AGAGCAAGAC TCCGTCTCAA_

2301 AAAAAGGGCA ATAAATGCCC TCTCTGAATG TTTGAACTGC CAAGAAAAGG

2351 CATGGAGACA GCGAACTAGA AGAAAGGGCA AGAAGGAAAT AGCCACCGTC

2401 TACAGATGGC TTAGTTAAGT CATCCACAGC CCAAGGGCGG CGGCTATGCC

2451 TTGTCTGGGG ACCCTGTAGA GTCACTGACC CTGGAGCGGC TCTCCTGAGA ' 2501 GGTGCTGCAG GCAAAGTGAG ACTGACACCT CACTGAGGAA GGGAGACATA i 2551 TTCTTGGAGA ACTTTCCATC TGCTTGTATT TTCCATACAC ATCCCCAGCC-3' I DK 1754Θ3 B1 I 40

Tabel 4A Sekvens af kodmnqsområde af human iL-1 receptoroen I Af G AAA GTG TT A CTC AGA CTT ATT TGT TTC ATA GCT CTA CTG ATT -9

Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile -3 ; TCT TCT CTG GAG GCT GAT AAA TGC AAG GAA CGT G AA G AA AAA ATA 39

Ser Ser Leo Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile 13 I ATT TT A GTG TCA TCT GCA AAT GAA ATT GAT GTT CGT CCC TGT CCT 84

Ile Leu Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro 28 I CTT AAC CCA AAT GAA CAC AAA GGC ACT ATA ACT TGG TAT AAA GAT 129 H Leu Asn Pro Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp 43 GAC AGC AAG ACA CCT GTA TCT ACA GAA CAA GCC TCC AGG ATT CAT 174

Asp Ser Lys Thr Pro Val Ser Thr Glu Gin Ala Ser Arg Ile His 58 CAA CAC AAA GAG AAA CTT TGG TTT GTT CCT GCT AAG GTG GAG GAT 219

Gin His Lys Glu Lys Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp 73 TCA GGA CAT TAC TAT TGC GTG GTA AGA AAT TCA TCT TAC TGC CTC 264

Ser Gly His Tyr Tyr Cys Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu 88 I AGA ATT AAA ATA AGT GCA AAA TTT GTG GAG AAT GAG CCT AAC TTA 309

Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu 103 TGT TAT AAT GCA CAA GCC ATA TIT AAG CAG AAA CTA CCC GTT GCA 354

Cys Tyr Asn Ala Gin Ala Ile Phe Lys Gin Lys Leu Pro Val Ala 118 GGA GAC GGA GGA CTT GTG TGC CCT TAT ATG GAG TTT TTT AAA AAT 399

Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr Het Glu Phe Phe Lys Asn 133 I GAA AAT AAT GAG TTA CCT AAA TTA CAG TGG TAT AAG GAT TGC AAA 444

Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gin Trp Tyr Lys Asp Cys Lys 148 I CCT CTA CTT CTT GAC AAT ATA CAC TTT AGT GGA GTC AAA GAT AGG 489

Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Val Lys Asp Arg 163 I CTC AT C GTG ATG AAT GTG GCT GAA AAG CAT AGA GGG AAC TAT ACT 534 I Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr 178 I TGT CAT GCA TCC TAC ACA TAC TTG GGC AAG CAA TAT CCT ATT ACC 579 I Cys His Ala Ser Tyr llir Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro Ile Thr 193 CGG GTA ATA GAA TTT ATT ACT CTA GAG GAA AAC AAA CCC ACA AGG 624 I Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg 208 I CCT GTG ATT GTG AGC CCA GCT AAT GAG ACA ATG GAA GTA GAC TTG -669 I Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu 223 41 DK 175403 B1

Tabel 4B Sekvens af kodmnqsomrade af human IL-1 receptoroen GGA TCC CAG ATA C AA TTG ATC TGT AAT GTC ACC GGC CAG TTG AGT 714

Gly Ser Gin Ile Gin Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gin Leu Ser 238 GAC ATT GCT TAC TGG AAG TGG AAT GGG TCA GTA ATT GAT G AA GAT 759

Asp Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp 253 GAC CCA GTG CTA GGG G AA GAC TAT TAC AGT GTG GAA AAT CCT GCA 804

Asp Pro Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala 268 AAC AAA AGA AGG AGT ACC CTC ATC ACA GTG CTT AAT ATA TCG GAA 849

Asn Lys Arg Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu 283 ATT GAA AGT AGA TTT TAT AAA CAT CCA TTT ACC TGT TTT GCC AAG 894

Ile Glu Ser Arg Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cy s Phe Ala Lys 298 AAT ACA CAT GGT ATA GAT GCA GCA TAT ATC CAG TTA ATA TAT CCA 939

Asn Thr His Gly Ile Asp Ala Ala Tyr Ile Gin Leu Ile Tyr Pro 313 GTC ACT AAT TTC CAG AAG CAC ATG ATT GGT ATA TGT GTC ACG TTG 984

Val Thr Asn Phe Gin Lys His Het Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu 328 ACA GTC ATA ATT GTG TGT TCT GTT TTC ATC TAT AAA ATC TTC AAG 1029

Thr Val Ile Ile Val Cys Ser Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys 343 ATT GAC ATT GTG CTT TGG TAC AGG GAT TCC TGC TAT GAT TTT CTC 1074

Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu 358 CCA ATA AAA GCT TCA GAT GGA AAG ACC TAT GAC GCA TAT ATA CTG 1119

Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu 373 TAT CCA AAG ACT GTT GGG GAA GGG TCT ACC TCT GAC TGT GAT ATT 1164

Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr Ser Asp Cys Asp Ile 388 TTT GTG TTT AAA GTC TTG CCT GAG GTC TTG GAA AAA CAG TGT GGA 1209

Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Lys Gin Cys Gly 403 TAT AAG CTG TTC ATT TAT GGA AGG GAT GAC TAC GTT GGG GAA GAC 1254

Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val Gly Glu Asp 418 ATT GTT GAC GTC ATT AAT GAA AAC GTA AAG AAA AGC AGA AGA CTG 1299

Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg Arg Leu 433 ATT ATC ATT TTA GTC AGA GAA ACA TCA GGC TTC AGC TGG CTG GGT 1344

Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Gly 448 GGT TCA TCT GAA GAG CAA ATA GCC ATG TAT AAT GCT CTT GTT CAG 1389

Gly Ser Ser Glu Glu Gin Ile Ala Het Tyr Asn Ala Leu Val Gin 463 GAT GGA ATT AAA GTT GTC CTG CTT GAG CTG GAG AAA ATC CAA GAC 1434

Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gin Asp 478 I DK 175403 B1 I 42 I Tabel 4C Sekvens af kodmnqsomrade af human IL-1 receptorqen I TAT GAG AAA ATG CCA GAA TOG ATT AAA TTC ATT AAG CAG AAA CAT 1479

Tyr Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gin Lys His 493 I GGG GCT ATC CGC TGG TCA GGG GAC TTT ACA CAG GGA CCA CAG TCT 1524

Gly Ale Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gin Gly Pro Gin Ser 508 GCA AAG ACA AGG TTC TGG AAG AAT GTC AGG TAC CAC ATG CCA GTC 1569

Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val 523 CAG CGA CGG TCA CCT TCA TCT AAA CAC CAG TTA CTG TCA CCA GCC 1614 I GI« Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys Bis Gin Leu Leu Ser Pro Ala 538 ACT AAG GAG AAA CTG C AA AGA GAG GCT CAC GTG CCT CTC GGG TAG 1656

H Thr Lys Glu Lys Leu Gin Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly End 552 I

43 DK 175403 B1

Tabel 5 Sammenligning af human og murm IL-1 receptorammosyresekvens |Ξ| gi« |Ξ| ^ o ^-2 M 2 £ < ^ M %. - g—g S—S V5-K 2 —O—S I «2 Μ—M G— C* 2 2 P M 2 -W J <=> rC cC Q 2 O-O f> t-M L? -C-5 I 2 55—55 β—β 3—o o E >—> i 2

O § > S —& G—S Q—O I O

£ 9 *6=5? p=§ · s

2—2 sd & m—·—i tn c P—P · P

>- i—< Om-Om 2-—3 S 2 P->-· I 2 CM -Pm 2 ---3 O-O o E2 M -M p

Cm f—i PJ -Id MM -t—C Om -Om Cm -Cm I O

t2— U £ —g 0 2 E α Η—H ' C

tn—tn z—2 to — to P_o-· P—P S o § § <j § Q S S ft, —cm u—o tn—og S—2 2—2 p—q P—P o Cm 2—2 5 ~5« £ p m—S 2—2 2 o uj—ul

Em t-M Cd 00 x H O-O td-Cd M M

£=£ ti g &“&

I 5 CM -CM o g -S <3 -¾ -C td-td M t-M

O CJ O — O -te 5j 2 *£ to CM -CM to to h«; I J> -i> CM -CM O CM f-M -2 CO o

E-ΙΠ —3 -2 tn -to M CM > 2 CM CM

I X tn tn > 2 o ti 2—β 5—S

S—g Q —O >—> H — P P—> P —P

Pm—cm O—o CM—cm 2—2 Cm—Cm p-—P

2 p < — < « — g 2—2 y fe S — S

13 -2 > t-l P Q <C > Q —p o — o

cm—cm cm tn E 2 cm p 0 2 H—P

0— o* -a—2 2—2 o—o* q—o 2—u.

CM bC 2 « 2 -2 P M to -to W CO

(x; 2 o-O CM -CO Cm -Cm P Cm 2 O

5 C-M CM Cd Q CM CM CO -CO CO W

Q Q E -Cm 2 t-M CC P O -U 2 2 1— I — f-M CM P P — P 2 2 to -CO 2 — 2 co—to <—< m—μ P—P o—tn r>—

S g O-O Cm -Cm Cm --Cm > P t> f-M

< h to o pso P—1-< E—v.

tn to 2 to f-M -t-M CO -to Ui -Ui t-M t-M o—p

ίο «ο P—>-* fc>—b> to 2 fM—cm tn—tn J—P

> Cm O—O* pc. -pc t-M > P-P O to CM CM

—-J t-3—O P —P CO-CO P --3 O-O > m3 ι-i > g tn n > to—to t-M—tn > t-M tq—rd

-t-M Pm-CM CM-fM t-M-l-M P—P >J——3 < H

O μα p P — P C* g — g <3 «C — <C ·< — C CO -«d 2 2—S O — O r-3—3 p—O 2—2 2 < a e s-a p-e E=E |-S s_a — Cd Em > 3 2 M — M n:—tc. <-< 2 —2

Cm 2 P P E m3 J tn -O tH t-M U -Cd — b * <: > P—ti η—cm p—o o — o 2—2

2 > to P P—P co P tn—co 2—2 H—P

p—q tn > tn—tn cC 2 -c—< 2—2 i q 5 m 2—2 < *5 S—cc 2—2 2—2 t od 2 -2 t-M H pj 2 2 2 M2 2 2 I t> 2 —2 CC 2 υ -U * g P 2 —2 c? O I 2

2 -to 2 -2 Cm M <2 2 -2 Q -tn -C. Q

2 I CJ -CJMt p -p CM — CM 2 -2 2 -2 Cu 2 Μ I P—P Cv g O 2 2 P C? fc« —t* 2 f-t 2 —2 2 H O-tn H —W P 2 2 -2 2 2 2 -2 2 -2 C« -pc *> -b- O -O -» 2 -2 2 2 I 2 02-2 <1 E -B 2 2 2-2 C3-O O «

< > 2—2 βω P o q—q 2 o tn—S

m 5c p-—Ξ—co P—p pC—cC p 2 u.—2 22 t> m ^ ^ p—p P—P q q 2—2 υ—υ * o—o ·* p~ — > co—co b«—t· 2—2 2 2 M-M p—p 2 —2 Q «Ϊ 2 —2 O —O 2—2 2-2 p—P £ 2 2—2 1 >—>· 2—2 2—2 ed cjj m P i>—& 2 m—μ m—m 2—05 2— 2 O—O H 2 2·—2 Q —P H —M 2—2

2-2 2 —2 2-2 P—p H M —M O O

S —> Q —O 2 t2 P g 2-U, 2-2 >--< L·—y ω—ω q—p ω 5 E—E 2—cc 2—2 S—g >—5 β—β o ω μ > 2—2 3C —χ 2 B 2 Β X B 2 E JC a 2Β2Θ

Claims (4)

1 DNA-sekvens, der i det væsentlige består af en enkelt åben læseramme nukleotidsekvens, som koder for et protein, der er i stand til at binde human IL-1, hvori

5 DNA-sekvensen koder for en aminosyresekvens, der er mere end 80% homolog med aminosyresekvensen vist i figurerne 5A-5B eller til en del deraf, som består af aminosyréme 1-319 vist i de omtalte figurer I 2 DNA-sekvens ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den er udvalgt blandt 10 (a) en cDNA-klon med en nukleotidsekvens afledt fra den kodende region af et nativt humant IL-IR gen, (b) en DNA-sekvens, som er i stand til at hybridisere til en sekvens, der er komplementær til en klon af (a) under moderat stringente betingelser (f eks 50°C,

2. SSC), og som koder for et protein, der er i stand til at binde human IL-1, eller 15 (c) en DNA-sekvens, der som resultat af den genetiske kode er degenereret til en i (a) og (b) defineret DNA-sekvens, og som koder for et protein, der er i stand til at binde human IL-1 I 3 DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at den i det væ- 20 sentlige består af et syntetisk gen, der koder for et protein, der er i stand til at binde til human IL-1, og som kan udtrykkes i en rekombinant transknptionel enhed omfattende mducerbare regulatoriske elementer afledt af en mikrobiel eller viral operon I 4 DNA-sekvens ifølge krav 1-3, KENDETEGNET ved, at den mindst omfatter I 25 en sekvenskomponent afledt af en cDNA-sekvens eller en kopi deraf I 5 DNA-sekvens ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den koder for et I protein, der ikke indeholder et transmembran- og et cytoplasmatisk domæne I 30 6 DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, KENDETEGNET | I ved, at den er i det væsentlige på ren form I 7 Rekombinant ekspressionsvektor, KENDETEGNET ved, at den omfatter en I DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 I 35 DK 175403 B1 45

8 Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, der er i stand til at binde human IL-1, KENDETEGNET ved, at man dyrkeren passende værtscelle omfattende en vektor ifølge krav 7 under betingelser, der fremmer ekspression 5