JPH07506724A

JPH07506724A - セロトニン受容体，その製造方法及び使用

Info

Publication number: JPH07506724A
Application number: JP5519833A
Authority: JP
Inventors: バッハ，　アルフレート; ウンガー，　リーリアーネ; ゼーブルク，　ペーター，　ハー．; ヴォイト，　マーク
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1992-05-16
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 1995-07-27
Also published as: EP0641386A1; WO1993023535A1; CA2135905A1; DE4216319A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】セロトニン受容体、その製造方法及び使用技術分野本発明は新規セロトニン受容体及びその使用、ならびに該受容体の機能的リガンドを見出す方法に関する背景技術神経伝達体セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、認識能力に関し又は行動分野において、多数の生理学的機能で重要な役割を演じる。セロトニン作動刺戟伝達の障害は、多数の生理学的症状、例えばうつ病、片頭痛、高血圧又は食欲亢進に関連している。セロトニンは、異なる親和性でセロトニンに結合する受容体を介して、その生理学的及び病理生理学的作用を発揮する。これらの受容体は次の４クラスに分類されうる：５　）ＩＴ、、り　Ｉ（Ｔ２．５　ＨＴ３．５−ＨＴ４゜この分類は、多数の５−ＨＴ−受容体リガントに関し受容体カップリング（Ｒｅｚｅｐｔｏｒｋ。

１）ｐｌＵｎｇ）の相違及び受容体結合プロフィール（Ｒｅｚｅｐｔｏｒｂｉｎｄｕｎｇｓｐｒｏｆｉｌｅ）の相違の上に反映する。醤歯動物の場合には、５− ＨＴＩ受容体の下位クラス（５ｕｂｋｌａｓｓｅ）の少な（とも４種類の亜種（５ｕｂｔｙｐｅｎ）が記載されている（５−ＨＴＩＡ〜５−ＨＴｌ、）　、すべての５−　ＨＴ　−受容体は、セロトニンに対する高い親和性を有しており（Ｋｉ＜１０１００ｎかつＧ−タンパク質ヲ介シテアデニル酸シクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｚｙｋｌａｓｅ）又はホスホリパーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ）　Ｃに結合される。

従来、５クラスのセロトニン受容体、５　ＨＴＬＡ。

５−ＨＴ□０．５　ＨＴｌｎ−＋＋ｈｅ、５ＨＴ２及び５−ＨＴ、の−次構造が解明されている。他の亜種は、薬理学的（結合データ）又は機能的（シグナルトランスダクション・セカンド・メツセンジャー＝　Ｓｉｇｎａｌｔｒｄ−ｎｓｄｕｋｔｉｏｎ　５ｅｃｏｎｄ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）にのみ記載されてしする。

５−ＨＴ１■−受容体は、従来は醤歯動物にのみ見出されており、ヒトの場合には５−　ＨＴ　１　＠−受容体は従来薬理学的又は分子生物学的にも検出することができなかった。

従来は、５−ＨＴ−受容体の下位クラスに対して選択的に特異性を有するアンタゴニストは存在していない。すべての公知アンタゴニストは、高い親和性をもって神経伝達体−受容体の少なくとも１種の他のクラスに結合する。特に５−ＨＴｌ。−受容体の場合には、亜種特異性物質は殆ど知られていないので、従来はまたこの受容体の生理学的重要性についても殆ど言及することはできなかった。

従って、ヒトの５−ＨＴｌ、−受容体の分子構造を解明し、該受容体を高純度で製造する方法を提供するという課題が生じた。もう一つの課題は、該受容体の特異的機能的リガンドを発見する方法を提供することであった。

発明の開示ところで、クラス１　（５−ＨＴｌ、）の新規ヒトセロトニン−受容体（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０３）ならびに該受容体をコードするＤＮＡ配列が見出された。本発明のタンパク質をコードするｃ　ＤＮＡはＳＥＱ　ＩＤＮＯ２で表わされる。

他の適当なりＮＡ配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２で記載されるヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有するが、しかし遺伝コードの退化によりＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３で記載されたポリペプチド鎖又はその部分をコードするＤＮＡ配列である。さらに、５−ＨＴ　１　＠−受容体をコードしかつ標準条件下で５ＥＱＩＤ　ＮＯ２で表わされるヌクレオチド配列又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３で表わされるタンパク質をコードするヌクレオチド配列と共にハイブリッド形成するようなりＮＡ配列も適当である。ＤＮＡハイブリッド形成の実験条件は、遺伝子工学の教科書、例えばＭａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、　、”１ｌｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８９に記載されている。

標準条件とは、例えば濃度０．１〜１ｘｓｓｃ　（１ｘＳＳＣ：ＮａＣｌ　０．１５Ｍ、クエン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）１５ｍＭ）を有する緩衝水溶液中で濃度４２〜５８℃の謂である。

また、該受容体の遺伝子工学的製造方法も見出された。また該受容体をコードするＤＮＡ−配列が該受容体に対する機能的リガンドを発見するために使用されうることも見出された。さらに本発明の対象は、５−ＨＴ□、−受容体の機能的リガンドを固定する方法であり、同方法は５−ＨＴｌ、−受容体をコードするＤＮＡ配列で細胞を形質転換し、これらの細胞の膜を単離しかつこれらの膜を用いて常用の受容体結合試験を行うことを特徴としている。５　ＨＴｌｍ−受容体の機能的リガンドを固定する本発明の他の方法は、５−ＨＴ工。

−受容体をコードしているＤＮＡ配列を細胞に導入し、これらの細胞内で受容体へのりガントの結合によって惹起された、第２メツセンジヤーの水準変化を一つのリポータ−系によって検出することを特徴としている。

新規ポリペプチド及びＤＮＡは公知方法の使用下に遺伝子工学的に製造することができる。すなわち脳組織からｍＲＮＡを単離し、二本鎖ｃＤＮＡに翻訳することができる。このｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用することができる。すなわち適当な反応条件下で特異的プライマーを使用することによって相応のｃＤＮＡを増幅することができる。増幅されたｃＤＮＡは適当なプライマーを使用することによって、予めクローニングすることなく配列決定されつる。

ここで使用される方法は、例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔ。

ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　（Ｈｒｓｇ、　Ｆ、　Ｍ　ｅｔａｌ、）１９８９、ｌ５ＢＮ　０−４７１　５０３３８−Ｘ　（Ｖｏｌ、１及び２５ｅｔ）に記載されており、ポリメラーゼ連鎖反応に関しては５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３５０−５４及びＭｕｌｌｉｓ　＆Ｆａｌｏｏｎａ　（１９８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５５．３３５−３５０に記載されている。

このような特性を有するｃＤＮＡは制限酵素によって容易に得られる。この場合に生じるフラグメントを、場合によっては化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプター又は遺伝子フラグメントと組合せて、該タンパク質をコードする配列をクローン化するために利用することができる。遺伝子フラグメント又は合成りＮＡ配列のクローニングベクター、例えば市販のプラスミドＭｌ　３ｍｐ　１８又はブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）中への挿入は公知のように行われる。また遺伝子又は遺伝子フラグメントは、化学的に合成された適当な制御領域又は細菌、ファージ、真核細胞又はそれらのウィルスから単離された制御領域を有していてもよく、これらの領域は種々の宿主系におけるタンパク質の発現を可能にする。

このようにして得られた／Ｘイブリッドプラスミドによる適当な宿主生物の形質転換又はトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｋｔｉｏｎ）も同様に公知であり、詳細に記載されている（Ｍ、　ｆｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｃｅ１ｌ、１６（ｉ９７９）　、７７７−７８５　；Ｆ、　Ｌ、　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　＾。

Ｊ、　ｖａｎ　ｄｅｒ　ＥｂＳＶｉｒｏｌｏｇｙ　５２．１９７３．４５６−４６７）。

哺乳動物細胞で発現する場合には、発現すべき遺伝子、この場合には前記の５　ＨＴＩｓ−受容体をコードするｃＤＮＡを、マウスーメタロチオネンー又はウィルス５Ｖ４０−プロモーターの制御下又はサイトメガロウィルス−プロモーターの制御下におくベクターを使用することができる（Ｌ　Ｐａｇｅ　ＭａｒｔｉｎＳＧｅｎｅ、　３７　（１９８５）　、１３９〜１４４）。発現にとっては、この５　ＨＴｌｓ−受容体をコードする遺伝子のメチオニン開始コドンの存在が不可欠である。次にエピソームとしての又はゲノム中に組込まれたこれらのベクターの複製を有するクローンを単離する。特に、サイトメガロウィルスのプロモーターを有するベクター中に外来遺伝子を組込むのが有利である。

また、このように導入されたＤＮＡの一時的な発現が発現された異種ポリペプチドの薬理学的特性確認にとって十分であるように、適当なベクターを細胞に導入することもできる。

細菌細胞での複製及び抗生物質耐性をコードする原核配列と組合せてシャトルベクターを使用するのが好適である。先ずプラスミドの構成及び増殖が細菌細胞中で行われ一次に原核細胞、例えばヒトの胚子腎臓細胞系（ｅｍｂｒｙｏｎａｌｅ　ｍｅｎｓｃｈｌｉｃｈｅ　Ｎ１ｅｒｅｎ−Ｚｅｌｌｉｎｉｅ）ＨＥＫ２９３中への移入が行われる。特に適当なシャトルベクターは市販のプラスミドｖ　ｃ　ＣＭＶ、ｐＣＤＭ８及びＩ）ＣＤＮＡ　Ｉ　（Ｉ　ＮＶＩ　ＴＲ０ＧＥＮ、ＳａｎＤｉｅｇｏＳＵ　Ｓ　Ａ　）である。

また他の細胞系、例えば酵母及び他の菌類、昆虫細胞ならびに動物及びヒトの細胞例えばＣＨＯ−１Ｃ０Ｓ−及びＬ細胞を、クローン化ｃＤＮＡの発現のための適当な発現ベクターと組合せて使用してもよい。

真核発現系は、その産生物を有効にかつ大抵自然の形で発現することができるという利点を有する。さらに同発現系はその産生物を翻訳後に修飾する能力を有する。

発現された受容体タンパク質は、洗浄剤例えばＣＨＡＰＳ　（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニラムコ−１−プロパンスルホネート）によって可溶化しかつ例えば受容体特異性抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって公知法により精製することができる。純粋なポリペプチドは、結晶化及びＸ線構造分析又は他の適当な物理学的方法、例えばＮＭＲ又は走査型トンネル顕微鏡によりリガンドの結合部位の空間的構造を解明するために利用することができる。

発現された受容体タンパク質は、適当な精製後にはポリクロナール又はモノクロナール抗体を形成するための抗原としても使用することができる。これらの抗体はまた場合によって診断用にも利用することができる。このような抗体の他の使用可能性は合理的薬剤設計用の補助作用物として使用する点にある。すなわち受容体特異的抗体は、抗イデイオタイプ抗体（ａｎｔｉｉｄｉｏｔｙｐｉｓｃｈｅ　Ａｎｔｉｋ（ｌｒｐｅｒ）を産生ずるための抗原として使用することができる。このような抗体は限定された領域に関しては受容体のコピーでありかつ特異的受容体リガンドを得るスクリーニングのため又は合理的薬剤設計のために使用することができる。

受容体を発現する細胞系は特異的受容体リガンドをめるスクリーニングにおける重要な手段である。このためにこれらの細胞の膜を受容体結合試験のために使用することができる。シグナル変換経路（Ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｋｔｉｏｎｓｖｅｇｅ）の化合物、例えばＣａ＋＋、ＣＡＭＰ、ＩＦ５−代謝産物（第２メツセンジヤー）によって調節されるプロモーター系に結合されている適当なリポータ−系（Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓｙｓｔｅｍ）を設けることによって、受容体リガンドの作用方式［アゴニスム（＾ｇｏ−ｎｉｓｍｕｓ）　／アンタゴニスム（＾ｎｔａｇｏｎｉｓ＋ｎｕｓ）　］　に関する情報を直接得ることができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２．１４２４　（１９９１）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．５０６１（１９９１））。また、リガンド結合後に受容体発現細胞中のシグナル変換経路の前記化合物を適当な方法（ＲＩ　ＡＳＥＬ　Ｉ　ＳＡ、蛍光染料）によって直接検出することもできる。

さらに細胞膜を通る電流もリガンド結合の関数として測定することができる。前記のヒト５−ＨＴｌ、−受容体の発現のためには、遺伝暗号の退化のために本明細書に記載された、例えば化学的に合成された遺伝子とは異なるＤＮＡ配列を利用することができる。

本発明によって、本発明に記載された受容体に結合し、そこで作動的又は拮抗的に作用する物質を同定しかつ特性確認することが可能になる。

本発明の他の実施態様は実施例に詳述する。

遺伝子工学的方法に関しては、例えばマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の教科書”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−１ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８９、又は“ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　 ”　Ｖｏｌ、Ｉ　〜ｍ、ＩＲＩ　Ｐｒｅｓｓ１９８５〜１９８７、編集者り、　Ｍ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）を参照することができる。

例　１ラットの５　ＨＴｌｍ−受容体をコードするｃＤＮＡの単離ラットの大脳０．５９を、グアニジニウムチオシアネート６Ｍ、クエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）５ｍＭ、２−メルカプトエタノール０．１Ｍ５０．５％サルコシル（５ａｒｃｏｓｙｌ）中でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸで分解した。大きい細胞片を３００　Ｏｒｐｍで遠心分離によって除去した。ＲＮＡを、４５０００　ｒｐｍで１２時間ノ５．７Ｍ　Ｃｓ　Ｃ＋−クッシせンによる遠心分離によって除去した。次にポリＡ＋を含有するＲＮＡフラクションをオリゴ（ｄ　ｔ）− セルロースによるアフィニティークロマトグラフィーによって分離した。

ポリＡ＋　−ＲＮＡを、スタータ（５ｉＢｒｔｅｒ）としてＡＭＶ逆転酵素及びオリゴ（ｄ　ｔ　）　１２−１８を用いて一本鎖ｃＤＮＡに転写した。第２の鎖の合成は、Ｅ、ｃｏｌｉ−ＤＮＡポリメラーゼ■を用いて行った。この二本鎖ｃＤＮＡに、酵素Ｔ４−ＤＮＡリパーゼを用いて次の配列：５’　ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧＣ３′を有するＥｃｏＲＩアダプターを付加した。商業的に得られるファージベクターλｇｔｌｏを制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１で切断した。ファージＤＮＡとｃＤＮＡを相互に連結し、商業的に得られる詰込み抽出物を詰込んで感染ファージにした。この組換えファージをＥ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００Ｈｆｌと一緒にＮＺＹＤＴ板上に塗布し、３７℃で一晩インキユベートした。このようにして得られたｃ　ＤＮＡライブラリーは２Ｘ１０’の独立的クローンを含む。常法によりｃ　ＤＮＡライブラリーを増幅した後、ファージ５０００００個をＣ６００Ｈｆｌ細胞と一緒に培地に塗布した。ファージをニトロセルロースフィルター上に移し、０．５Ｎ　ＮａＯＨ／１．５Ｍ　ＮａＣ１で溶解し、変性ＤＮＡを８０℃で２時間焼く（Ｂａｃｋｅｎ）ことによってフィルターに固（結合した。このフィルターを６ＸＳＥＴ緩衝液（ＩＸＳＥＴ＝Ｑ。

１５Ｍ　ＮａＣＬ１５ｍＭ）　リ　ス／ＨＣＩ、ｐＨ７゜４．１ｍＭＥＤＴＡ）　、０．１％ＳＤＳ及び５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液（ｌ　Ｑ　Ｑ　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ＝　Ｆｉｃｏｌｌｌｇ、ポリビニルピロリドン１ｇ、Ｂ　Ｓ　Ａ　１９　／　５０ｍ１）中で６８℃で４時間予めパイグリッド形成させたハイブリッド形成のためには、ラットの５−ＨＴｌ。

−受容体をコードする、切断修復で標識された（　Ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｅｒｔ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ試料（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

１）を用いた。

該フィルターヲ、５ｘＳＥＴ、０．１％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ及び１０％デキストランスルフェートを含有する溶液中で、静かに振盪しつつ４２℃で一晩インキユベートした。次いで該フィルターを２ｘＳＥＴ１０．１％ＳＤＳ中で４２℃で数回洗浄し、乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露した。スクリーニングの際に放射性応答をするクローンを単離し、さらに培養した相応のファージＤＮＡを収得した。

精製したファージをプロティナーゼＫ（ａｄ６０μ９／ｍｌ）と−緒に５５°Ｃで一時間インキユベートし、次にフェノール／クロロホルム抽出を行うことによってファージＤＮＡを調製した。エタノール３容の添加（−２０℃）後に、ファージＤＮＡは沈殿した。これを無菌注射針で７０％エタノール中に移し、洗浄しかっ暫時沈降させた。ペレットを暫時空気乾燥してから、ＴＥ緩衝液中に懸濁させた。

例　２ラットの５　ＨＴｌ−一受容体をコードする一本鎖ＤＮＡの調製。

出発点は、例１で記載したファージＤＮＡであった。該ＤＮＡをそれぞれ個々に制限酵素ＥｃｏＲＩで調製的に切断した。ｃＤＮＡ挿入断片を含有するＥｃｏＲＩフラグメントを電気泳動法によりゲルから溶離した。

これらのフラグメント３０ｎｇをそれぞれ、４℃、１２時間でＥｃｏＲＩで切断された市販クローニングベクターＭ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９　１１００ｎに連結した。連結混合物の容積は１０μ！であった。

連結反応は５分間８０℃に加熱することによって停止した。

各連結混合物の１７１０容積を、適格なＪＭＩ　Ｏ１細胞１００ｍ１の形質転換のために使用した。形質転換終了後に、０．２Ｍ　ＴＰＴＧ溶液６０ｕ１４及びＸＧａ１１２０μＡ（２０ｍ＋／諷ｌ）を形質転換混合物に添加した。この混合物をＮＺＹＤＴトツブアーガー（Ｔｏｐ−ａｇａｒ）のＮＺＹＤＴ寒天平板培地上にＪＭＩＯＩ細胞（ＯＤｅｏｏ−１）２００μＡと一緒に塗布した。ＮＺＹＤＴ培地は市販されている（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯＢＲＬ）。

ｃＤＮＡ挿入断片を含有しているクローンは、プラークが青色着色を欠いていることにより同定することができた。

クローンは、５　ＨＴｌｍ−受容体をコードするｃＤＮＡを有していた。このクローンのＤＮＡ配列は配列記録１に記載しである。

例　３ヒトの５−ＨＴｌ、−受容体のクローニング本例の出発点はヒト大脳の市販ポリＡ＋　−ＲＮＡであった（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　；オーダ一番号６５１６−２）。

スタータとして逆転写酵素（ＡＭＶ）及びオリゴ（ｄｔ）　１２−１８を用いて、前記ポリＡ＋−ＲＮＡ５μ９を一本鎖ＤＮＡに転写した。二番目の鎖の合成はＥ、　ｃ。

１ｉＤＮＡポリメラーゼで行った。このｃＤＮＡ５ｎ９をポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として使用した。このためにパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）製のＤＮＡ増幅キットＧｅｎｅＡｍｐＴ″（オーダ一番号１８２４１４）を使用した。メーカーの指示によりこれを行った。プライマーの配列は、配列記録１に記載された、ラットの５　ＨＴ１＠−受容体の配列から誘導した。

プライマーは次の配列を有していた：（５ｈｔｌｂ出発）Ａ−５’　ＣＧＣ／ＴＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＣ／ＡＧＧ／ＡＣＧ／ＡＧＧ／ＧＣＴ／ＡＴＧ　３’（５ｈｔｌｂ停止）Ｂ：５’　ＣＴＴ／＾ＧＧ／ＣＧＡ／ＣＣＣ／ＣＣ＾／ＴＧＣ／ＣＡＴ／ＴＧ＾／ＣＡ＾／ＧＴＣ／＾　３′アニ一リング温度は６０℃であり、３分間この温度を保った。次に７２℃で２分間プライマーを延長した。９４℃で１分間変性を行った。この温度サイクルを４０回反復した。１回のポリメラーゼ連鎖反応においてはプライマーＡ及びＢをそれぞれ２０　ｐｅａｌ使用した。反応終了後に、前記混合物の１０％を１％寒天ゲル上に塗布して反応生成物を分析した。優性バンド（ｄ。

ｍ１ｎａｎｔｅ　Ｂａｎｄｅ）は約１２００の塩基対のＤＮＡバンドと一緒に移動した。優性バンドを電気泳動法によりゲルから溶離し、Ｏｎｅ　−Ｐ　ｈｏｒ　−ａｌｌ緩衝液［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　］中に取り、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｖ　−Ｆｒａｇｍｅｎｔ）と−緒にインキュベートした。この場合デオキシヌクレオチド三燐酸の濃度は５０ＭＭであった（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰＳｄＣＴＰそれぞれに関して）。

−重鎖ＤＮＡの調製も例２と同様に行った、但しＰＣＲフラグメントをｍｐ１８のＳｍａ　Ｉ切断位置にクローン化して導入する点が相違していた。ヒトの５− ＨＴ　１　ｍ−受容体遺伝子のＤＮＡ配列は配列記録２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０２）に記載しである。ラットの５−ＨＴ、、−受容体遺伝子に対する相同性は約９０％である。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２から誘導されるアミノ酸配列は配列記録３に記載しである。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２に記載されたｃ　ＤＮＡ配列を有するクローンは、ドイツ国微生物収集機関（Ｄｅｕｔｓ−ｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）及びツエルクルツーレ（Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅ）　Ｇ　ｍｂＨ（ブラウンンユヴァイク在）に寄託番号ＤＳＭ６８６０で寄託された。

例　４ヒトの胚芽腎臓（Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ＝　ＨＥ　Ｋ）２９３細胞におけるクローン化されたヒト受容体遺伝子の過渡的発現他の指摘がない限り、細胞培養のためにはリンドル（Ｌｉｎｄｌ）及びバウアー（Ｂａｕｅｒ）　（”Ｚｅｌｌ−ｕｎｄ　Ｇｅ−ｖｅｂｅｋｕｌｔｕｒ”　、Ｇｕｓｔａｖ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）の規定を使用した。

挿入断片として受容体ｃＤＮＡを有する２本鎖ｍｐ１８ＤＮＡを、酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍで切断した。これから生じかつ突出末端を有する、前記受容体をコードするフラグメントを、標準条件（分子生物学における前記の最新実験記録参照）下で酵素Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼ及びＥ、　Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントによって処理し、平滑な末端を形成させた。次にこのフラグメントに、配列５′−ＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣ−３’及び３’　−ＧＡＡＴＣＴＣ−５′を有する市販のリンカ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を連結した。これらのリンカ−を有するＤＮＡフラグメントを、標準条件下で市販のＢＳｔＸｒ切断ベクターｐＣＤＭ８及びｒ　ｃ　ＣＭ　Ｙ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。これから生じる組換えプラスミドを公知法により複製させた。

ＨＥＫ２９３細胞を標準条件下でｌＱｃｍ細胞培養ンヤーレ中で７〜８Ｘ１０６細胞数になるまで培養した。トリプシン処理後に細胞を、Ｎ　ａ　ＨＣＯａ　２　、２９　／　ｌを含有するＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ）中で１＝３に希釈し、再び１０ｃ、ベトリシャーレ中に接種した。

次に細胞を３７℃で４０〜４８時間培養した。

導入すべきＤＮＡは次のように調製した：ＣｓＣ１勾配により精製したＤＮＡ溶液２０μｇ（１ｍｇ／雪ｌ）にＨ２Ｏ４３７ｕｌ−を加え、次に２Ｍ　ＣａＣｌ２６２．５μｌを加え、最後にＢＢ３５００μｌを加えた。

室温でｌＱｍｉｎ以内にＣａ”十沈殿物が形成された。

この溶液を、前記規定により培養された２９３細胞と一緒に１０ｃｉ細胞培養シヤーレに入れた。注意深く混合した後、該細胞を３％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１５〜２０時間培養した。次いで血清不含の培養液５ｍｌを注意深（加えた。全培養液を除去し、血清不含の培養液５冨ｌを用いる洗浄過程を反復した後、完全培養液ＩＱｍｌを細胞に加えた。５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間インキュベートした後、該細胞を薬理学的及び電気生理学的試験のために使用することができた。

また、ＤＮＡをリポソーム仲介によって細胞中に導入した。この場合にはＧ　Ｉ　ＢＣＯＢＲＬ社製のりポフエクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）をメイカーの指示により使用した。

例　５受容体結合試験例４で導入しかつ培養した細胞に低温ＰＢ３２．５ｍｌを加えた。室温で５分インキュベートした後、さらにＰＢ３５ｍｌを加え、細胞を注意深（、培養シャーレの表面から取出した。細胞懸濁液を遠心管中に移し、約１２００９で１０分間遠心分離した。上澄みを注意深（除去した後、細胞を脱調製のために使用した。

細胞ペレットを１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７゜２）１５冨！中に再懸濁した後、細胞をＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸにより均質化した。この均質化物をソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）　Ｓ　Ｓ　３４０−ター内で５０．０００９で、４℃で２０分遠心分離した。膜ペレ、ソトを１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，２）１．５ｍｌ中に取り、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸを用いて再び均質化した。

前記のように遠心分離した後、ベレットをＢＢ　（１０ｍＭ　ト　リ　ス　−　ＨＣＩ　ｐＨ７，２、１００ｍＭ　ＮａＣ１）の３５票！中に取った。組織ホモジナイザーで暫時均質化した後、誤脱を実際の結合試験で使用することができた。

このように製造された誤脱８００μｌを、［３Ｈ］−セロトニン（最終濃度２ｎＭ）及び種々の濃度の被検物質と一緒に４℃で２時間インキュベートした。次に誤脱をガラス繊維フィルターにより濾過して、結合しなかった放射能標識セロトニンを分離した。結合［３１（コーセロトニンの量を液体シンチレーションカウンターで測定した。

ヒト５−ＨＴ工、受容体の試験物質として次の物質（ＵＳＡのＲＢ　Ｉ　、Ｎａｔｉｃｋ、　Ｍ　Ａで得られる、申告されたカタログ番号を有する）を使用した・５−カルボキシルアミドトリプトアミン（５−ＣＴ）（Ｎｏ、Ｃ１１７）（） −プロプラノール（Ｐｒｏｐｒａｎ−ｏｌｏｌ）　（Ｎｏ、　Ｐ　１１０　）メチセルギッド（Ｍｅｔｈｙｓｅｒｇｉｄ）　（Ｎｏ、　Ｍｌ　３７）ラウヴオルシン（Ｒａｕｖｏｌｓｃｉｎ）　（Ｎｏ、Ｒ１０４）ＭＤＬ７２２２　（Ｎｏ、Ｔ１０２）８−ＯＨ−ＤＰＡＴ　（Ｎｏ、８００２）この場合次のＫｉ値（ｎＭ）が測定された：メチセルギソド　５００ラウヴオルシン　４５００ＭＤＬ７２２２　＞１０．０００８−ＯＨ−ＤＰＡＴ　＞１０．０００配　列　記　録（１）一般的情報。

（ｉ）　出願人・（Ａ）名称　ＢＡＳＦアクチエンゲルシャフト（Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）（Ｂ）街・カルルーボッシューンユトラーセ（Ｃａｒｌ−Ｂｏｓｃｈ −３ｔｒａｓｓｅ）　３８（Ｃ）市　ルートヴインクスハーフエン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）（Ｅ）国：ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便番号：Ｄ−６７００（Ｇ）１１話：　０６２１／６０４８５２６（Ｈ）テレ７ｙｙクス：　０６２１／６０４３１２３（Ｉ）テレッスク＝１７６２１７５１７０（ｉｉ）出願のタイトル：セロトニン受容体：その製造及び使用（ｆｆｉ）配列数：３（ｔｖ）コンピューター可読形式：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）：ｌンビューター：　Ｉ　ＢＭ　ＰＣＣ互換性）（Ｃ）オペレーションシステム：Ｐｃ−Ｄｏｓ／Ｍ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔ　Ｉ　ｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃　１　、　Ｏ。

Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５　（ＥＰＡ）（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＩの情報：（ｉ）配列特徴・（Ａ）長さ：１４１４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鐘形　一本（Ｄ）トポロジー・線状（ｉｆ）分子の種類：　ｍＲＮｓに対するｃＤＮｓ（迅）仮説：なしくｔｖ）抗感作（ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ）：なしくｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＩ：２．ｍ　Ｎ１Ｎコθ−ＡＣＡＡＡ　１４１４（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２の情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：　１２２８塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鐘形ニ一本（Ｄ）トポロジー二線状（ｎ）分子の種類：ｍＲＮＳに対するｃＤＮＡ（ｆｆｌ）仮説：なしくｆｖ）抗感作（ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ）：なしくＬｘ）特徴：（Ａ）名称／かぎ：　ＣＤ５（Ｂ）位置：２８．．１１９７（Ｄ）他のデータ、産生物＝ヒト５−ＨＴ　ＩＢ受容体（ＸＩ）配列記述＋ＳＥＱ　ｒＩ）　ＮＯ２：ＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧ　ＣＣＭ；ＧＡＣＧＡＧ　ＧＡＧＡＧＣＴ　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＧＣ’ｒ　ＣＡＧ　ＴＧＣ５P Ｍｅｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓｒ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＣＣＧＣＧ　ＧＧＣＴＣＣＧＡＧ　ＡＣＣ’ｆ’Ｑｆｆ　ＧＴＴ　ＣＣ’ｌ’　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＡＣ９９Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　（ｉｉｎ　Ａｌａ　Ａｓ■ ＴＴＡ　ＴＣＣＴＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＣＴＣＣＣＧＡ　ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＭＧ　ＧＡＣＴＡＣＡＴＴ　ＴＡＣ１４７Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　ＴｙｒＣＡＧ　ＧＡＣＴＣ’ｒ　ＡＴＣＴＣＣＣＴＡ　ＣＣＣＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡπＣＴＡＴＴＧ　１９５Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ匡Ｃ）　ＣＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＡＣＣＡＣＧ　ＣＴＣＴＣＣＡＡ’ｒ　ＧＣＣ苛ＧπＡＴＴ　ＧＣＣ２４３Ａｌａ　Ｌｓｕ　工Ｒｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　工１ａ　Ａｌａ６０　６５　フ０ＡＣＡ　ＣＴＣＴＡＣＣＧＧ　ＡＣＣＣＧＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＧ　ＧＣＴ　ＡＡＣＴＡＣＣＴＧ　、ＡＴＣ２９１Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｍｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　’ｒｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ｌ１ｅＧＣＣＴＣ’ｒ’　ＣＴＧ　ＧＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧ　Ｃ１ｆ’ｒ　ＧＴＧ　ＴＣＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＣＣ３３９Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ａｈａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｐｒ。

９０　９５　１ｏ。

ＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧ　ＴＡＣＡＣＴ　ＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ｃＧｃ　ＣｋＧ　ＧＴＧ　３８７ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　０７ｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　５ｅｒＡＴＣＣＴＧ　ＣＡＣＣＴＣ’ｆ’ＧＴ　ＧＴＧ　ＡＴＣＧＣＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＧＣＴＡＣＴＧＧ　ＧＣＣＡＴＣＡＣＧ　４８３ｔｉｅ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　ＣｙＳ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　ｒ、ｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　’ｒｒｐ　Ａｌａ工１ｅ　Ｔｈ■ ＧＡＣＧＡＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＡＣＴＣＡ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＣＣＣＭＧ　ＡＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＴＣ５３１人ｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａ１ＡＴＧ　ＡＴＣＧＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴ　ＧＣＣＴＣＧ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＣＣＣ５７９Ｍｅｔ　Ｘｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

ＴＴＣＴＴＣＴＩＣＧ　ＣＣＴＣＡＧ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＧＣＣＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　罵ＴＴＪ　ＧＡＡ　ＴＧＣＧＴＧ　６２７ＧＴＧ　ＡＡＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＡＣＡＣＧ　ＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＧＣ’ｒ　６７５’ｒＴＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧ　ｃＮ：　ＣＴＣＡ’ｒ’ＣＧＣＣＣ’ｌｌ（’ｆ’Ａ’ｌ’　（Ｘ２ＣＣＧＣＡＴＣＴＡＣ７２R Ｐｈ＠　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ｐｒｏ　ａｎｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｘ１＠　Ａｌａ　Ｌａｕ　’ｒｙｒ　ＧＩＹ紅ｑ　Ｉｌｅ　智ｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｘｇ　Ｉｌａ　Ｌｅｕ　Ｔ−ｙＢ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　ｐｒｏ　Ａｓｎ　ｋｒＬｊ　Ｔｈｒ　ＧhＹＡＡＧ　ＣＧＣ′ｒＴＧ　ＡＣＣＣＧＡ　ＧＣＣＣＡＧ　Ｃ’１℃ＡＴＡ　ＡＣＣＧＡＣ’ｒＣＣＣＣＣ（５ＴＣＣＡＣＧ　８１９ｔ、ｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　’ｒ■■ ＴＣＣＴＣＧ　ＣＴＣＡＣＣＴＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＣＴＣＧ　Ｃ（４慣ＣＣＣＧＡＣＧＴＧ　ＣＣＣＡＧＣＧＡＡ　８６７ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＶａＩ　Ｔｈｒ　５ｌｌｆ　工１ｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｇｌ■ ＴＣＣＧＧＡ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＴｋＴ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＡ　ＧｒＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＣＧＡ　Ｇ’ｌＮ：　ＴＣＣＧＡＣ９１５ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＩＩｙｒ　Ｖａｌ　ＡＳｎ　Ｇｉｎ　ｖａｔ　ＬｙＳ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａ１Pｐ２８５　’　２９０　２９５３００　’　３０５　３１０Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｉｌａ　ｒＡｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈ＠工１ｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　ｆ、ａｕＣＣＣＴ’ｌ’Ｃ’Ｉ ’ｌ’ＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＣＴＡ　ＧＴＯ入ＴＧ　ＣＣＴ　入’１（ＴＣＣ入入入　ＣＡＴ　ＧＣＣＴＧＣ１０５９Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈ＠　Ｘｌｅ　工１＠　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍａｅ　Ｐｒｏ　工１ｍ　Ｃｙｍ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　入１ａ　ＣｙｓＴｒｐ　Ｐｈａ　Ｈｌｓ　Ｉ、ａｕ　Ａｌａ工１ｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ八ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　工１ａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈａ八Ｍ　ＣＭ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ｆｆｉ　ＡＡＧ　ＴＧＣＡＣＡ　ＡＧＴ　１１９７Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ａｌａ　ｐｈｅ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌ＋Ｙ８　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　５ｅｒ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３の情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝３９０個のアミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｔ）分子の種類：タンパク質（ｘｉ）配列記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　＾１．ａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　入１ａ　Ｇｌｙ　５ｅ■ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＧＩＹ　入１ａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＸｉｓ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　入ｒｇ　工ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　入ｒｑ　Ｓａｒ　ｋｌ：ｑ　工１ａ　Ｌｅ■ Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　入ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　八ｒｇ　ｘｌａ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＸｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　工ｌｅ　Ａｓｎ　５ｅｒＧｌｙ　Ａｌａ　ｐｈｅ　Ｉｌａ　ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ工１ｅ　工ｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ、　、　ＰＣＴ／ＥＰ　９３１０１１０５□ Ｆ＆−一四Ｆｍｌｌｌｌｍｍロー−−〜−−：―Ｍ１輪＋ｍ−Ｅｘａ＠−−１Ｐ＊−一−ｓｍ、階、１１４２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）（７２）発明者　ゼーブルク、　ベーター、　バー。

ドイツ連邦共和国　Ｄ−６９００ハイデルベルク　エルツェッカーヴエーク　５Ｉ（７２）発明者　ヴオイト、　マークアイルランド国　ダヴリン　キリニー　ワトソン　ドライブ　８

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＳＥＱＩＤＮＯ３で記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
２．５−ＨＴ１Ｂ−受容体をコードしかつａ）ＳＥＱＩＤＮＯ２で記載される構造を有するＤＮＡ配列、ｂ）請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列及びｃ）標準条件下でＤＮＡ配列ａ）又はｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列によって形成される群から選択されているＤＮＡ配列。
３．請求項２記載のＤＮＡ配列を含有する発現ベクター。
４．請求項３記載の発現ベクターを使用して５−ＨＴ１Ｂ−受容体を製造する方法。
５．５−ＨＴ１Ｂ−受容体の機能的リガンドを同定するために請求項２記載のＤＮＡ配列を使用すること。
６．５−ＨＴ１Ｂ−受容体の機能的リガンドを同定する方法において、５−ＨＴ１Ｂ−受容体をコードする請求項２記載のＤＮＡ配列を細胞に導入し、これらの細胞の膜を単離しかつこれらの膜を用いて通常の受容体結合試験を行うことを特徴とする前記方法。
７．５−ＨＴ１Ｂ−受容体の機能的リガンドを同定する方法において、５−ＨＴ１Ｂ−受容体をコードする請求項２記載のＤＮＡ配列を細胞に導入しかつこれらの細胞内で該受容体へのリガンドの結合によって惹起される、第二メッセンジャーの水準変化を一つのリポーター系によって検出することを特徴とする前記方法。