DE4216319A1

DE4216319A1 - Serotonin Rezeptor, Verfahren zur Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE4216319A1
Application number: DE19924216319
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Bach; Liliane Dr Unger; Peter H Prof Dr Seeburg; Mark Dr Voigt
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1992-05-16
Filing date: 1992-05-16
Publication date: 1993-11-18
Also published as: WO1993023535A1; CA2135905A1; EP0641386A1; JPH07506724A

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Serotoninrezeptor und seine Verwendung, sowie Verfahren zum Auffinden von funktionalen Liganden für diesen Rezeptor.

Der Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiolo gischer Funktionen, hinsichtlich kognitiver Fähigkeiten oder auch im Bereich des Verhaltens. Störungen der serotonergen Reizübertragen sind involviert in zahlreiche pathologische Zustände wie Depression, Migräne, Bluthochdruck oder Bulämie. Serotonin entfaltet seine physiologische und patho physiologische Wirkung über Rezeptoren, die Serotonin mit unterschiedlicher Affinität binden. Diese Rezeptoren können in 4 Klassen unterteilt werden: 5-HT₁, 5-HT₂, 5-HT₃, 5-HT₄. Diese Unterteilung reflektiert sowohl unterschiedliche Rezeptorkopplung als auch unterschiedliche Rezeptorbindungs profile für eine Reihe von 5-HT-Rezeptorliganden. Bei Nage tieren sind mindestens 4 Subtypen der 5-HT₁ Rezeptor subklasse beschrieben (5-HT_1A bis 5-HT_1D). Alle 5-HT-Rezep toren besitzen hohe Affinität zu Serotonin (Ki < 100 nm) und sind über G-Proteine an Adenylatzyklase, oder Phospho lipase C gekoppelt.

In ihrer Primärstruktur aufgeklärt sind bislang 5 Serotonin rezeptoren 5-HT_1A, 5-HT_1C, 5-HT_1D-like, 5-HT₂ und 5-HT₃. Die anderen Subtypen sind lediglich pharmakologisch (Bindungsda ten) oder funktionell (Signaltransduktion second messenger) beschrieben.

Ein 5-HT_1B-Rezeptor wurde bisher nur in Nagetieren gefunden, im Menschen konnten bislang weder pharmakologisch noch mole kularbiologisch 5-HT_1B-Rezeptoren nachgewiesen werden.

Bislang gibt es keine Antagonisten, die selektiv für die 5-HT-Rezeptor-Subklasse spezifisch sind. Alle bekannten An tagonisten binden mit hoher Affinität an mindestens eine weitere Klasse von Neurotransmitter-Rezeptoren. Insbesondere beim 5-HT_1B-Rezeptor sind nahezu keine subtypspezifischen Substanzen bekannt, so daß bislang auch wenig über die phy siologische Bedeutung dieses Rezeptors ausgesagt werden konnte.

Es bestand daher die Aufgabe, die molekulare Struktur eines humanen 5-HT_1B-Rezeptors aufzuklären und Verfahren bereitzu stellen, um ihn in hoher Reinheit herzustellen. Eine weitere Aufgabe bestand darin, Verfahren zur Auffindung spezifischer funktionaler Liganden für diesen Rezeptor zur Verfügung zu stellen.

Es wurde nun ein neuer humaner Serotoninrezeptor der Klasse 1 (5-HT_1B) gefunden (SEQ ID NO 3), sowie DNA-Sequen zen, die für solche Rezeptoren codieren. Eine cDNA, die für ein erfindungsgemäßes Protein codiert, ist in SEQ ID NO 2 dargestellt.

Weitere geeignete DNA-Sequenzen sind solche, die zwar eine andere Nukleotidsequenz als die in SEQ ID NO 2 aufgeführte besitzen, die aber infolge der Degeneration des genetischen Codes für die in SEQ ID NO 3 aufgeführte Polypeptidkette oder Teile davon codieren. Weiterhin sind solche DNA- Sequenzen geeignet, die für 5-HT_1B-Rezeptoren codieren, und die unter Standardbedingungen mit der in SEQ ID NO 2 darge stellten Nukleotidsequenz oder mit einer Nukleotidsequenz, die für das in SEQ ID NO 3 dargestellte Protein codiert, hybridisieren. Die experimentellen Bedingungen für DNA- Hybridisierung sind in Lehrbüchern der Gentechnik, bei spielsweise in Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 14·SSC (1·SSC: 0,15M NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH 7,2) zu verstehen.

Weiterhin wurden gentechnische Herstellverfahren für diesen Rezeptor gefunden. Außerdem wurde gefunden, daß sich die für diesen Rezeptor codierende DNA-Sequenzen zum Auffinden von funktionalen Liganden für diesen Rezeptor verwenden lassen. Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HT_1B-Rezeptoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man mit einer für einen 5-HT_1B-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz Zellen transfiziert, die Membranen dieser Zellen isoliert und mit diesen Membra nen übliche Rezeptorbindungsexperimente durchführt. Ein wei teres erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifizierung funk tionaler Liganden für 5-HT_1B-Rezeptoren ist dadurch gekenn zeichnet, daß man mit einer für einen 5-HT_1B-Rezeptor codie renden DNA-Sequenz Zellen transfiziert und die in diesen Zellen durch Bindung des Liganden an den Rezeptor verur sachte Veränderung des second messenger Spiegels durch ein Reportersystem detektiert.

Die neuen Polypeptide und DNAs lassen sich gentechnisch unter Verwendung bekannter Methoden herstellen. So kann man aus Hirngewebe mRNA isolieren und in doppelsträngige cDNA übersetzen. Diese cDNA kann als Matrize für die Polymerase- Kettenreaktion verwendet werden. Durch die Verwendung spezi fischer Primer kann so unter geeigneten Reaktionsbedingungen die entsprechende cDNA amplifiziert werden. Durch die Ver wendung geeigneter Primer kann die amplifizierte cDNA ohne vorherige Klonierung sequenziert werden. Die dabei verwende ten Methoden sind beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology" (Hrsg. F.M. Ausubel et al.) 1989, ISBN 0-471 50338-x (Vol. 1 u. 2 set), für die Polymerase-Ketten reaktion in Saiki et al. (1985) Science 230, 1350-54 bzw. Mullis and Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350 be schrieben.

Die so charakterisierte cDNA ist mit Hilfe von Restriktions enzymen leicht zugänglich. Die dabei entstehenden Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleo tiden, Adaptoren oder Genfragmenten, können benutzt werden, um die für das Protein kodierende Sequenzen zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide M13mp18 oder Bluescript, erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzel len oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine in unterschiedlichen Wirtssystemen ermöglichen.

Die Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtsorga nismen mit den so erhaltenen Hybridplasmiden ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben (M. Wigler et al., Cell, 16 (1979), 777-785; F.L. Graham and A.J. van der Eb, Virology 52, 1973), 456-467).

Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwen den, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die für den hier beschriebenen 5-HT_1B-Rezeptor kodierende cDNA unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promotors oder unter die Kontrolle des Cytomegalievi rus-Promotors setzen (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139 bis 144). Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons des Gens, das für diesen 5-HT_1B-Rezep tor kodiert. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vek toren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Beson ders vorteilhaft ist die Integration des Fremdgens in einen Vektor, der den Promotor des Cytomegalievirus enthält.

Alternativ dazu kann man Zellen mit einem geeigneten Vektor derart transfizieren, daß die transiente Expression der so eingebrachten DNA für eine pharmakologische Charakterisie rung der exprimierten heterologen Polypeptide ausreicht. Auch hier ist die Kontrolle der Expression durch den Promo tor des Cytomegalievirus besonders vorteilhaft.

In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resi stenz kodieren, ist die Verwendung von "shuttle"-Vektoren gut geeignet. Konstruktionen und Vermehrung des Plasmids er folgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z. B. in die embryonale menschlichen Nieren-Zellinie HEK 293. Besonders geeignete "shuttle"-Vektoren sind die kommerziell erhältlichen Plas mide vcCMV, pCDM8 und pCDNAI (INVITROGEN, San Diego, USA).

Auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe und andere Pilze, Insek tenzellen sowie tierische und humane Zellen wie z. B. CHO-, COS- und L-Zellen, können in Verbindung mit geeigneten Ex pressionsvektoren zur Expression der klonierten cDNA verwen det werden.

Die eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren. Ferner besitzen sie die Fä higkeit, ihre Produkte posttranslational zu modifizieren.

Die exprimierten Rezeptorproteine können durch Detergenzien wie CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-1-pro pansulfonat) solubilisiert werden und durch Affinitätschro matographie, beispielsweise mit rezeptorspezifischen Anti körpern, nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Das reine Polypeptid kann, nach Kristallisation und Röntgen- Strukturanalyse oder anderen geeigneten physikalischen Ver fahren wie NMR oder Raster-Tunnelmikroskopie, dazu benutzt werden, die räumliche Struktur der Liganden-Bindungsstelle aufzuklären.

Die exprimierten Rezeptorproteine können nach entsprechender Reinigung auch als Antigene für die Generierung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper dienen. Diese Antikörper wie darum können gegebenenfalls für diagnostische Zwecke verwen det werden. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit für solche Antikörper besteht in ihrer Verwendung als Hilfsmittel zum rationalen Drug Design. So können Rezeptor-spezifischen An tikörper beispielsweise als Antigen für die Generierung an tiidiotypischer Antikörper eingesetzt werden. Solche Anti körper können für definierte Bereiche ein Abbild des Rezep tors darstellen und für das Screening nach spezifischen Re zeptorliganden oder für das rationale Drug Design verwendet werden.

Rezeptor exprimierende Zellinien stellen ein wichtiges In strument im Screening nach spezifischen Rezeptorliganden dar. Dazu können die Membranen dieser Zellen für Rezeptor bindungstests verwendet werden. Mit entsprechenden Reporter systemen versehen, z. B. Luciferase, die an ein Promotorsy stem gekoppelt sind, welches reguliert wird durch Verbindun gen von Signaltransduktionswegen wie Ca⁺⁺, cAMP, IP₃-Metabo- lite (second messenger), können direkt Informationen über Wirkungsweise (Agonismus/Antagonismus) eines Rezeptorli ganden gewonnen werden. (Science 252, 1424 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5061, (1991)). Auch ist es möglich, diese Verbindungen des Signaltransduktionsweges in den Re zeptor-exprimierenden Zellen nach Ligandenbindung durch ge eignete Methode (RIA, ELISA, Fluoreszenzfarbstoffe) direkt nachzuweisen.

Weiterhin kann der Stromfluß durch die Zellmembran in Abhän gigkeit von der Ligandenbindung gemessen werden.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es mög lich, andere DNA-Sequenzen als hier beschrieben, z. B. che misch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression des beschriebenen humanen 5-HT_1B-Rezep tors zu benutzen.

Mit Hilfe der Erfindung wird es möglich, Substanzen zu iden tifizieren und zu charakterisieren, die an den hier be schriebenen Rezeptor binden und dort agonistisch oder anta gonistisch wirken.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Beispielen näher beschrieben.

Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, oder "DNA cloning", Vol. I bis III, IRI Press 1985 bis 1987, Herausgeber D.M. Glover, hingewiesen.

Beispiel 1

Isolierung einer cDNA- die für den 5-HT_1B-Rezeptor der Ratte kodiert:
0,5 g Großhirn einer Ratte wurden in 6 M Guanidiniumthiocya nat, 5 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5% Sarcosyl im ULTRA-TURRAX aufgeschlossen. Grobe Zell trümmer wurden bei 3000 U/min abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen für 12 Stunden bei 45000 U/min abgetrennt. Anschließend wurde die PolyA⁺-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschroma tographie an oligo (dt)-Cellulose abgetrennt.

Mit Hilfe des Enzyms AMV-Reverse Transcriptase und oligo(dt)12-18 als Starter wurde die polyA⁺-RNA in einzel strängige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E. coli-DNA-Polymerase I. An die dop pelsträngige cDNA wurde mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase ein EcoRI Adaptor mit folgender Sequenz angesetzt: 5′AATT CCATGGATGCATGC 3′. Der kommerziell erhältliche Phagenvek tor λ gt 10 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI lineari siert. Phagen-DNA und cDNA wurden miteinander ligiert und mit einem kommerziell erhältlichen Verpackungsextrakt zu in fektiösen Phagen verpackt. Die rekombinanten Phagen wurde mit E.co1i C 600 Hfl auf NZYDT-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die so erhaltene cDNA-Bibliothek enthielt 2·10⁶ unabhängige Klone. Nach Amplifikation der cDNA-Bibliothek entsprechend herkömmlicher Methoden wurden 500 000 Phagen mit C 600 Hfl Zellen ausplattiert. Die Phagen wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, mit 0,5 N NaOH /1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2-stündi ges Backen bei 80°C fest an das Filter gebunden. Die Filter wurden in 6·SET-Puffer (1·SET = 0,15 M NaCl, 15 mM Tris /HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA), 0,1% SDS und 5·Denhardt′s Lö sung (100·Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h bei 68°C vorhybridisiert.

Hybridisiert wurde mit einer Nick-translatierten cDNA-Probe (SEQ ID NO 1) welche für den 5-HT_1B-Rezeptor der Ratte ko diert.

Die Filter wurden in einer Lösung, die 5·SET, 0,1% SDS, 30% Formamid, 5·Denhardt′s und 10% Dextransulfat ent hielt, über Nacht bei 42°C unter leichtem Schütteln in kubiert. Danach wurden sie mehrfach in 2·SET/0,1% SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einen Röntgenfilm exponiert. Klone, die beim "Screening" eine radioaktive Antwort gaben, wurden isoliert und weitergezüchtet, um die entsprechende Phagen-DNA zu gewinnen.

Phagen-DNA wurde durch Inkubation der gereinigten Phagen mit Proteinase K (ad 60 µg/ml) bei 55°C für 1 h und an schließender Phenol/Chloroformextraktion präpariert. Nach Zugabe von 3 Volumen Ethanol (-20°C) fiel die Phagen-DNA aus und wurde mit einer sterilen Injektionsnadel in 70%iges Ethanol überführt, gewaschen und kurz sedimentiert. Nach kurzem Trocknen des Pellets an der Luft wurde es in TE- Puffer suspendiert.

Beispiel 2

Herstellung von einzelsträngiger DNA, die für den 5-HT_1B-Re zeptor der Ratte kodiert:
Ausgangspunkt war die in Beispiel 1 beschriebene Phagen-DNA. Sie wurden jeweils einzeln präparativ mit dem Restriktions enzym Eco RI geschnitten. Die Eco RI-Fragmente, welche die cDNA-Insertionen enthielten, wurden elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. Jeweils 30 ng dieser Fragmente wurden bei 4°C für 12 h mit 100 ng des Eco RI geschnittenen, kommerzi ell erhältlichen Klonierungsvektors M13mp18 oder M13mp19 li giert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 µl. Die Ligation wurde durch 5 minütiges Erhitzen auf 80°C beendet.

1/10 Volumen eines jeden Ligationsansatzes wurde zur Trans formation von 100 µl kompetenten JM 101 Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformati onsansatz 60 µl 0,2 M IPTG-Lösung und 120 µl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT- Agarplatten mit 200 µl JM 101 Zellen (OD₆₀₀ = 1) ausplat tiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich (GIBCO- BRL). Klone, welche cDNA-Insertionen enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden.

Ein Klon enthielt eine cDNA, welche für den 5-HT_1B-Rezeptor kodiert. Die DNA-Sequenz dieses Klons ist im Sequenzproto koll 1 wiedergegeben.

Beispiel 3 Klonierung des humanen 5-HT_1B-Rezeptors

Ausgangspunkt hierfür war kommerziell erhältliche polyA⁺-RNA von humanem Gehirn (Clonetech; Best.-Nr. 6516-2).

Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (AMV) und oligo (dt)_12-18 als Starter wurden 5 µg dieser polyA⁺-RNA in ein zelsträngige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E.coli DNA-Polymerase. 5 ng dieser cDNA wurde als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt. Dazu wurde das DNA Amplifikations-Kit GeneAmp^TM (Bestell-Nr. 182 414) von Perkin Elmer verwendet. Es wurde entsprechend den Herstellerangaben verfahren. Die Primerse quenz wurde abgeleitet von der im Sequenzprotokoll 1 angege benen Sequenz für den 5-HT_1B-Rezeptor der Ratte. Die Primer hatten folgende Sequenz:

Die Annealingtemperatur lag bei 60°C und wurde 3 min beibe halten. Danach wurden die Primer bei 72°C für 2 min verlän gert. Denaturiert wurde bei 94°C für 1 min. Dieser Tempera turzyklus wurde 40mal wiederholt. In einer Polymerase-Ket tenreaktion wurden jeweils 20 pmol Primer A und B einge setzt. 10% dieses Ansatzes wurden nach Ablauf der Reaktion auf 1% Agarosegel aufgetragen, um die Reaktionsprodukte zu analysieren. Die dominante Bande komigrierte mit einer DNA- Bande von ca. 1200 Basenpaaren. Sie wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert in 0ne-Phor-all Puffer (Pharmacia) auf genommen und mit dem Klenow-Fragment der E.co1i DNA Polyme rase I inkubiert. Die Konzentration an Desoxynukleotidtri phosphaten betrug dabei 50 µM (jeweils für dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

Die Herstellung einzelsträngiger DNA erfolgte analog Bei spiel 2 mit dem einen Unterschied jedoch, daß das PCR-Frag ment in die SmaI-Schnittstelle von mp18 einkloniert wurde. Die DNA-Sequenz des humanen 5-HT_1B-Rezeptorgens ist in Se quenzprotokoll 2 (SEQ ID NO 2) beschrieben. Die Homologie zum 5HT_1B-Rezeptorgen der Ratte beträgt ca. 90 %. Die aus SEQ ID NO 2 abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Sequenzpro tokoll 3 wiedergegeben.

Ein Klon mit der in SEQ ID NO 2 dargestellten cDNA-Sequenz wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, unter der Nummer DSM 6860 hinterlegt.

Beispiel 4

Transiente Expression des klonierten humanen Rezeptorgens in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 Zellen:
Wenn nicht anders beschrieben, wurden zur Zellkultur die Vorschriften von Lindl und Bauer ("Zell- und Gewebekultur", Gustav Fischer Verlag) verwendet.

Doppelsträngige mp 18 DNA, welche die Rezeptor cDNA als In sert enthielt, wurde mit den Enzymen EcoRI und HindIII ge spalten. Das daraus resultierende für den Rezeptor kodie rende Fragment mit überhängenden Enden wurde mit Hilfe der Enzyme T₄-DNA-Polymerase und Klenow-Fragment der E.coli DNA Polymerase nach Standardbedingungen (vgl. Current Protocols in Molecular Biology s. o.) behandelt, um glatte Enden zu ge nerieren. Danach wurden an dieses Fragment die kommerziell erhältichen Linker (Invitrogen) mit der Sequenz 5′-CTTAGAGCAC-3′ und 3′-GAATCTC-5′ ligiert. Das mit diesen Linkern versehenen DNA-Fragment wurde unter Standardbedin gungen in die kommerziell erhältlichen, BstXI geschnittenen Vektoren pCDM8 und rcCMV (Invitrogen) ligiert. Die daraus resultierenden rekombinanten Plasmide wurden nach bekannter Weise vermehrt. HEK 293 Zellen wurden unter Standard-Bedin gungen in einer 10-cm-Zellkulturschale bis zu einer Zellzahl von 7 bis 8·10⁶ Zellen kultiviert. Nach Trypsinierung wur den die Zellen 1:3 in MEM Medium (Gibco), das 2,2 g/l NaHCO₃ enthielt, verdünnt und erneut in 10 cm Petrischalen ausge sät. Danach wurden die Zellen für 40 bis 48 h bei 37°C kul tiviert.

Die zu transfizierende DNA wurde wie folgt vorbereitet: 20 µg der DNA-Lösung (1 mg/ml), gereinigt über CsCl-Gra dient, wurden mit 437 µl H₂O versetzt, danach wurden 62,5 µl 2 M CaCl₂ zugesetzt und schließlich 500 µl BBS. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca⁺⁺-Präzipi tate.

Die Lösung wurde auf 10-cm-Zellkulturschale mit den nach obiger Vorschrift kultivierten 293 Zellen gegeben. Nach vor sichtiger Durchmischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in ei nem 3% CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfer nung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml serumfreiem Medium wurden den Zellen 10 ml Vollme dium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation in einem 5% CO₂-Inku bator konnten die Zellen für pharmakologische und elektro physiologische Untersuchungen verwendet werden.

Alternativ wurde die DNA auch Liposomen-vermittelt in die Zellen eingebracht. Dabei wurde Lipofectin der Firma GIBCO- BRL den Herstellerangaben entsprechend eingesetzt.

Beispiel 5 Rezeptor-Bindungstest

Den nach Beispiel 4 transfizierten und kultivierten Zellen wurden 2,5 ml kaltes PBS zugesetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden weitere 5 ml PBS zugegeben und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale ent fernt. Die Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei ca. 1200 g 10 min lang zentrifugiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurden die Zel len zur Membranpräparation verwendet.

Nach Resuspendierung des Zellpellets in 1,5 ml 10 mM Tris- HCl pH 7,2 wurden die Zellen mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 50 000 g in einem So vall SS 34 Rotor bei 4°C 20 min zentrifugiert. Das Membran pellet wurde in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 aufgenommen und erneut mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX homogenisiert. Nach Zen trifugation wie oben wurde das Pellet in 3,5 ml BB (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl) aufgenommen. Nach kurzer Homo genisierung mit einem Gewebe-Homogenisator konnten die Mem branen in dem eigentlichen Bindungstest eingesetzt werden.

800 µl dieser so hergestellten Membranen wurden bei 4°C mit (₃H) Serotonin (Endkonzentration 2 nM) und verschiedenen Konzentrationen der zu testenden Substanz für 2 h inkubiert. Danach wurden die Membranen über Glasfaserfilter (Schlei cher & Schuell No. 34) filtriert, um das nicht-gebundene ra dioaktive markierte Serotonin abzutrennen. Die Menge an ge bundenen (₃H) Serotonin wurde im Flüssigkeits-Szintillati onszähler bestimmt.

Folgende Substanzen (erhältlich bei RBI, Natick, MA, USA un ter der angegebenen Katalog-Nr.) wurden beim humanen 5-HT_1B-Rezeptor als Testsubstanzen eingesetzt:

5-Carboxyamidotryptamin (5-CT) (Nr. C117)
(-) Propanolol (Nr. P110)
Methysergid (Nr. M137)
Rauwolscin (Nr. R104)
MDL 7222 (Nr. T102)
8-OH-DPAT (Nr. S002)

Dabei wurden folgende Ki-Werte (nM) bestimmt:

5-CT
5
(-) Propanolol	5
Methysergid	500
Rauwolscin	4500
MDL 7222	<10,000
8-OH-DPAT	<10,000

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Proteine mit der in SEQ ID NO 3 beschriebenen Amino säuresequenz.

2. DNA-Sequenzen, die für 5-HT_1B-Rezeptoren codieren und die aus der Gruppe, die von

a) DNA-Sequenzen der in SEQ ID NO 2 beschriebenen Struktur,
b) DNA-Sequenzen, die für Proteine gemäß Anspruch 1 codieren, und
c) DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit DNA-Sequenzen a) oder b) hybridisieren, gebildet wird, ausgewählt sind.

3. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 enthält.

4. Verfahren zur Herstellung eines 5-HT_1B-Rezeptors unter Verwendung eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 3.

5. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 2 zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HT_1B-Re zeptoren.

6. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HT_1B-Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer für einen 5-HT_1B-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 Zellen transfiziert, die Membranen dieser Zellen isoliert und mit diesen Membranen übliche Rezeptorbindungsexperimente durchführt.

7. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HT_1B-Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer für einen 5-HT_1B-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 Zellen transfiziert und die in diesen Zellen durch Bindung der Liganden an den Rezeptor verur sachte Veränderung des second messenger Spiegels durch ein Reportersystem detektiert.