WO1993023535A1

WO1993023535A1 - Menschlicher 5ht-1b rezeptor (serotonin rezeptor), verfahren zur herstellung und seine verwendungen

Info

Publication number: WO1993023535A1
Application number: PCT/EP1993/001105
Authority: WO
Inventors: Alfred Bach; Liliane Unger; Peter H. Seeburg; Mark Voigt
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1992-05-16
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 1993-11-25
Also published as: DE4216319A1; EP0641386A1; JPH07506724A; CA2135905A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen humanen 5-HT1B-Rezeptor und für ihn codierende DNA-Sequenzen, sowie Herstellverfahren für DNA-Sequenzen und Rezeptor. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für diesen Rezeptor.

Description

MENSCHLICHER 5HT-1B REZEPTOR (SEROTONIN REZEPTOR) , VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG

UND SEINE VERWENDUNGEN

5 Beschreibung

Die Erfindung betrifft einen neuen Serotonin-Rezeptor und seine Verwendung, sowie Verfahren zum Auffinden von funktionalen Liganden für diesen Rezeptor.

10

Der Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiolo^¬ gischer Funktionen, hinsichtlich kognitiver Fähigkeiten oder auch im Bereich des Verhaltens. Störungen der serotonergen

15 Reizübertragen sind involviert in zahlreiche pathologische Zust nde wie Depression, Migräne, Bluthochdruck oder Bulämie. Serotonin entfaltet seine physiologische und patho- physiologische Wirkung über Rezeptoren, die Serotonin mit unterschiedlicher Affinität binden. Diese Rezeptoren können

20 in 4 Klassen unterteilt werden: 5-HTχ, 5-HT₂, 5-HT₃, 5-HT₄. Diese Unterteilung reflektiert sowohl unterschiedliche Rezeptorkopplung als auch unterschiedliche Rezeptorbindungs- profile für eine Reihe von 5-HT-Rezeptorliganden. Bei Nage¬ tieren sind mindestens 4 Subtypen der 5-HTι Rezeptor-

25 Subklasse beschrieben (5-HTι_A bis 5-HTι_D) . Alle 5-HT-Rezep- toren besitzen hohe Affinität zu Serotonin (Ki < 100 nm) und sind über G-Proteine an Adenylatzyklase, oder Phospho- lipase C gekoppelt.

30 In ihrer Primärstruktur aufgeklärt sind bislang 5 Serotonin- Rezeptoren 5-HTι_A, 5-HTι_C. 5-HTι_D-iiite. 5-HT₂ und 5-HT₃. Die anderen Subtypen sind lediglich pharmakologisch (Bindungsda¬ ten) oder funktioneil (Signaltransduktion second messenger) beschrieben.

35

Ein 5-HTi_B-Rezeptor wurde bisher nur in Nagetieren gefunden, im Menschen konnten bislang weder pharmakologisch noch mole¬ kularbiologisch 5-HT _B-Rezeptoren nachgewiesen werden.

40 Bislang gibt es keine Antagonisten, die selektiv für die

5-HT-Rezeptor-Subklasse spezifisch sind. Alle bekannten An¬ tagonisten binden mit hoher Affinität an mindestens eine weitere Klasse von Neuro ransmitter-Rezeptoren. Insbesondere beim 5-HTι_S-Rezeptor sind nahezu keine subtypspezifisehen Substanzen bekannt, so daß bislang auch wenig über die phy¬ siologische Bedeutung dieses Rezeptors ausgesagt werden konnte.

Es bestand daher die Aufgabe, die molekulare Struktur eines humanen 5-HTi_B-Rezeptors aufzuklären und Verfahren bereitzu¬ stellen, um ihn in hoher Reinheit herzustellen. Eine weitere Aufgabe bestand darin, Verfahren zur Auffindung spezifischer funktionaler Liganden für diesen Rezeptor zur Verfügung zu stellen.

Es wurde nun ein neuer humaner Serotonin-Rezeptor der Klasse 1 (5-HTι_B) gefunden (SEQ ID NO 3), sowie DNA-Sequen- zen, die für solche Rezeptoren codieren. Eine cDNA, die für ein erfindungsgemäßes Protein codiert, ist.in SEQ ID NO 2 dargestellt.

Weitere geeignete DNA-Sequenzen sind solche, die zwar eine andere Nukleotidsequenz als die in SEQ ID NO 2 aufgeführte besitzen, die aber infolge der Degeneration des genetischen Codes für die in SEQ ID NO 3 aufgeführte Polypeptidkette oder Teile davon codieren. Weiterhin sind solche DNA- Sequenzen geeignet, die für 5-HTι_B-Rezeptoren codieren, und die unter Standardbedingungen mit der in SEQ ID NO 2 darge¬ stellten Nukleotidsequenz oder mit einer Nukleotidsequenz , die für das in SEQ ID ΝO 3 dargestellte Protein codiert, hybridisieren. Die experimentellen Bedingungen für DΝA- Hybridisierung sind in Lehrbüchern der Gentechnik, bei- spielsweise in Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 x SSC (1 x SSC: 0,15M ΝaCl, 15mM Νatriumcitrat pH 7,2) zu verstehen.

Weiterhin wurden gentechnische Herstellverfahren für diesen Rezeptor gefunden. Außerdem wurde gefunden, daß sich die für diesen Rezeptor codierende DΝA-Sequenzen zum Auffinden von funktionalen Liganden für diesen Rezeptor verwenden lassen. Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HTi_B-Rezeptoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man mit einer für einen 5-HTi₃-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz Zellen transfiziert, die Membranen dieser Zellen isoliert und mit diesen Membra¬ nen übliche Rezeptorbindungsexperimente durchführt. Ein wei- teres erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifizierung funk¬ tionaler Liganden für 5-HTι_B-Rezeptoren ist dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man mit einer für einen 5-HTι_B-Rezeptor codie¬ renden DNA-Sequenz Zellen transfiziert und die in diesen Zellen durch Bindung des Liganden an den Rezeptor verur- sachte Veränderung des second messenger Spiegels durch ein Reportersystem detektiert.

Die neuen Polypeptide und DNAs lassen sich gentechnisch unter Verwendung bekannter Methoden herstellen. So kann man aus Hirngewebe mRNA isolieren und in doppelsträngige cDNA übersetzen. Diese cDNA kann als Matrize für die Polymerase- Kettenreaktion verwendet werden. Durch die Verwendung spezi¬ fischer Primer kann so unter geeigneten Reaktionsbedingungen die entsprechende cDNA amplifiziert werden. Durch die Ver- wendung geeigneter Primer kann die amplifizierte cDNA ohne vorherige Klonierung sequenziert werden. Die dabei verwende¬ ten Methoden sind beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology" (Hrsg. F.M. Ausubel et al.) 1989, ISBN 0-471 50338-x (Vol. 1 u. 2 set) , für die Polymerase-Ketten- reaktion in Saiki et al. (1985) Science 230, 1350-54 bzw. Mullis and Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350 be¬ schrieben.

Die so charakterisierte cDNA ist mit Hilfe von Restriktions- enzymen leicht zugänglich. Die dabei entstehenden Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleo- tiden, Adaptoren oder Genfragmenten, können benutzt werden, um die für das Protein kodierende Sequenzen zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z.B. die handelsüblichen Plasmide M13mpl8 oder Bluescript, erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzel- len oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine in unterschiedlichen WirtsSystemen ermöglichen. Die Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtsorga¬ nismen mit den so erhaltenen Hybridplasmiden ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben (M. Wigler et al., Cell, 16 (1979), 777 - 785; F.L. Graham and A.J. van der Eb, Virology 52, 1973), 456 - 467).

Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwen¬ den, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die für den hier beschriebenen ^'5-HTι_B-Rezeptor kodierende cDNA unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promotors oder unter die Kontrolle des Cytomegalievi- rus-Promotors setzen (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139 bis 144) . Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons des Gens, das für diesen 5-HTι_B-Rezep- tor kodiert. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vek¬ toren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Beson¬ ders vorteilhaft ist die Integration des Fremdgens in einen Vektor, der den Promotor des Cytomegalievirus enthält.

Alternativ dazu kann man Zellen mit einem geeigneten Vektor derart transfizieren, daß die transiente Expression der so eingebrachten DNA für eine pharmakologische Charakterisie¬ rung der exprimierten heterologen Polypeptide ausreicht. Auch hier ist die Kontrolle der Expression durch den Promo- tor des Cytomegalievirus besonders vorteilhaft.

In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resi¬ stenz kodieren, ist die Verwendung von "Shuttle'-Vektoren gut geeignet. Konstruktionen und Vermehrung des Plasmids er¬ folgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z.B. in die embryonale menschlichen Nieren-Zeilinie HEK 293. Besonders geeignete "Shuttle"-Vektoren sind die kommerziell erhältlichen Plas- mide vcCMV, pCDM8 und pCDNAI (INVITROGEN, San Diego, USA) .

Auch andere Zellsysteme, z.B. Hefe und andere Pilze, Insek¬ tenzellen sowie tierische und humane Zellen wie z.B. CHO-, COS- und L-Zellen, können in Verbindung mit geeigneten Ex- pressionsvektoren zur Expression der klonierten cDNA verwen¬ det werden. Die eukaryontisehen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren. Ferner besitzen sie die Fä¬ higkeit, ihre Produkte posttranslational zu modifizieren.

Die exprimierten Rezeptorproteine können durch Detergenzien wie CHAPS (3-[ (3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-l-pro- pansulfonat) solubilisiert werden und durch Affinitätschro^¬ matographie, beispielsweise mit rezeptorspezifischen Anti- körpern, nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Das reine Polypeptid kann, nach Kristallisation und Röntgen- Strukturanalyse oder anderen geeigneten physikalischen Ver¬ fahren wie NMR oder Raster-Tunnelmikroskopie, dazu benutzt werden, die räumliche Struktur der Liganden-Bindungsstelle aufzuklären.

Die exprimierten Rezeptorproteine können nach entsprechender Reinigung auch als Antigene für die Generierung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper dienen. Diese Antikörper wie- derum können gegebenenfalls für diagnostische Zwecke verwen¬ det werden. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit für solche Antikörper besteht in ihrer Verwendung als Hilfsmittel zum rationalen Drug Design. So können Rezeptor-spezifischen An¬ tikörper beispielsweise als Antigen für die Generierung an- tiidiotypischer Antikörper eingesetzt werden. Solche Anti¬ körper können für definierte Bereiche ein Abbild des Rezep¬ tors darstellen und für das Screening nach spezifischen Re¬ zeptorliganden oder für das rationale Drug Design verwendet werden.

Rezeptor exprimierende Zellinien stellen ein wichtiges In¬ strument im Screening nach spezifischen Rezeptorliganden dar. Dazu können die Membranen dieser Zellen für Rezeptor¬ bindungstests verwendet werden. Mit entsprechenden Reporter- Systemen versehen, z.B. Luciferase, die an ein Promotorsy¬ stem gekoppelt sind, welches reguliert wird durch Verbindun¬ gen von Signaltransduktionswegen wie Ca⁺⁺, cAMP, IP₃-Metabo- lite (second messenger) , können direkt Informationen über Wirkungsweise (Agonismus / Antagonismus) eines Rezeptorli- ganden gewonnen werden. (Science 252, 1424 (1991); Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 88, 5061, (1991)). Auch ist es möglich, diese Verbindungen des Signaltransduktionsweges in den Re- zeptor-exprimierenden Zellen nach Ligandenbindung durch ge- eignete Methode (RIA, ELISA, Fluoreszenzfarbstoffe) direkt nachzuweisen.

Weiterhin kann der Stromfluß durch die Zellmembran in Abhän- gigkeit von der Ligandenbindung gemessen werden.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es mög¬ lich, andere DNA-Sequenzen als hier beschrieben, z.B. che¬ misch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression des beschriebenen humanen 5-HTι_B-Rezep- tors zu benutzen.

Mit Hilfe der Erfindung wird es möglich, Substanzen zu iden¬ tifizieren und zu charakterisieren, die an den hier be- schriebenen Rezeptor binden und dort agonistisch oder anta¬ gonistisch wirken.

weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Beispielen näher beschrieben.

Für gentechnische Methoden sei dazu z.B. auf das Handbuch von Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, oder "DNA cloning", Vol. I bis III, IRI Press 1985 bis 1987, Herausgeber D.M. Glover, hingewiesen.

Beispiel 1

Isolierung einer cDNA- die für den 5-HTι_B-Rezeptor der Ratte kodiert

0,5 g Großhirn einer Ratte wurden in 6 M Guanidiniumthiocya- nat, 5 mM Natriumeitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5 % Sarcosyl im ULTRA-TURRAX aufgeschlossen. Grobe Zell¬ trümmer wurden bei 3 000 U/min abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen für 12 Stunden bei 45 000 U/min abgetrennt. Anschließend wurde die PolyA^-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschroma¬ tographie an oligo (dt)-Cellulose abgetrennt.

Mit Hilfe des Enzyms AMV-Reverse Transcriptase und oligo(dt)12-18 als Starter wurde die polyA⁺-RNA in einzel- strängige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E. coli-DNA-Polymerase I. An die dop- pelsträngige cDNA wurde mit Hilfe des Enzyms ^-*?4-DNA-Ligase ein EcoRI Adaptor mit folgender Sequenz angesetzt: 5'AATT CCATGGATGCATGC 3'. Der kommerziell erhältliche Phagenvek- tor λ gt 10 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI lineari- siert. Phagen-DNA und cDNA wurden miteinander ligiert und mit einem kommerziell erhältlichen Verpackungsextrakt zu in¬ fektiösen Phagen verpackt. Die rekombinanten Phagen wurde mit E.coli C 600 Hfl auf NZYDT-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die so erhaltene cDNA-Bibliothek enthielt 2 x 10⁶ unabhängige Klone. Nach Amplifikation der cDNA-Bibliothek entsprechend herkömmlicher Methoden wurden 500 000 Phagen mit C 600 Hfl Zellen ausplattiert. Die Phagen wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, mit 0,5 N NaOH /1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2-stündi- ges Backen bei 80°C fest an das Filter gebunden. Die Filter wurden in 6 x SET-Puffer (1 x SET = 0,15 M NaCl, 15 mM Tris / HC1, pH 7,4, 1 mM EDTA) , 0,1 % SDS und 5 x Denhardt's Lö¬ sung (100 x Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h bei 68°C vorhybridisiert.

Hybridisiert wurde mit einer Nick-translatierten cDNA-Probe (SEQ ID NO 1) welche für den 5-HTι_B-Rezeptor der Ratte ko¬ diert.

Die Filter wurden in einer Lösung, die 5 x SET, 0,1 % SDS, 30 % Formamid, 5 x Denhardt's und 10 % Dextransulfat ent¬ hielt, über Nacht bei 42°C unter leichtem Schütteln in¬ kubiert. Danach wurden sie mehrfach in 2 x SET/0, 1 % SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einen Röntgenfilm exponiert. Klone, die beim "Screening" eine radioaktive

Antwort gaben, wurden isoliert und weitergezüchtet, um die entsprechende Phagen-DNA zu gewinnen.

Phagen-DNA wurde durch Inkubation der gereinigten Phagen mit Proteinase K (ad 60 μg/ml) bei 55°C für 1 h und an¬ schließender Phenol/Chloroformextraktion präpariert. Nach Zugabe von 3 Volumen Ethanol (-20°C) fiel die Phagen-DNA aus und wurde mit einer sterilen Injektionsnadel in 70 %iges Ethanol überführt, gewaschen und kurz sedimentiert. Nach kurzem Trocknen des Pellets an der Luft wurde es in TE- Puffer suspendiert. Beispiel 2

Herstellung von einzelsträngiger DNA, die für den 5-HTχ_B-Re- zeptor der Ratte kodiert

Ausgangspunkt war die in Beispiel 1 beschriebene Phagen-DNA. Sie wurden jeweils einzeln präparativ mit dem Restriktions¬ enzym Eco RI geschnitten. Die Eco RI-Fragmente, welche die cDNA-Insertionen enthielten, wurden elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. Jeweils 30 ng dieser Fragmente wurden bei 4⁼C für 12 h mit 100 ng des Eco RI geschnittenen, kommerzi¬ ell erhältlichen Klonierungsvektors M13mpl8 oder M13mpl9 li- giert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 μl. Die Ligation wurde durch 5 minütiges Erhitzen auf 80°C beendet.

1/10 Volumen eines jeden Ligationsansatzes wurde zur Trans¬ formation von 100 μl kompetenten JM 101 Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformati¬ onsansatz 60 μl 0,2 M IPTG-Lösung und 120 μl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT- Agarplatten mit 200 μl JM 101 Zellen (ODεoo = D ausplat¬ tiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich (GIBCO- BRL) . Klone, welche cDNA-Insertionen enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werde .

Ein Klon enthielt eine cDNA, welche für den 5-HTι_S-Rezeptor kodiert. Die DNA-Sequenz dieses Klons ist im Sequenzproto¬ koll 1 wiedergegeben.

Beispiel 3

Klonierung des humanen 5-HTι_B-Rezeptors

Ausgangspunkt hierfür war kommerziell erhältliche polyA⁺-RNA von humanem Gehirn (Clonetech; Best.-Nr. 6516-2) .

Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (AMV) und oligo ⁽dt)i2_ιa als Starter wurden 5 μg dieser polyA⁺-RNA in ein- zelstrangige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E.coli DNA-Polymerase. 5 ng dieser cDNA wurde als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt. Dazu wurde das DNA Amplifikations-Kit GeneAmp— (Bestell-Nr. 182 414) von Perkin Eimer verwendet. Es wurde entsprechend den Herstellerangaben verfahren. Die PrimerSe¬ quenz wurde abgeleitet von der im Sequenzprotokoll 1 angege¬ benen Sequenz für den 5-HTι_B-Rezeptor der Ratte. Die Primer hatten folgende Sequenz:

(5htlb Start) A: 5' CGC/TCC/GCA/GCC/AGG/ACG/AGG/GCT/ATG 3'

(5htlb Stop)

B: 5' CTT/AGG/CGA/CCC/CCA/TGC/CAT/TGA/CAA/GTC/A 3'

Die Annealingtemperatur. lag bei 60°C und wurde 3 min beibe¬ halten. Danach wurden die Primer bei 72°C für 2 min verlän- gert. Denaturiert wurde bei 94°C für 1 min. Dieser Tempera¬ turzyklus wurde 40mal wiederholt. In einer Polymerase-Ket- tenreaktion wurden jeweils 20 p ol Primer A und B einge¬ setzt. 10 % dieses Ansatzes wurden nach Ablauf der Reaktion auf 1 % Agarosegel aufgetragen, um die Reaktionsprodukte zu analysieren. Die dominante Bande komigrierte mit einer DNA- Bande von ca. 1200 Basenpaaren. Sie wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert in One-Phor-all Puffer (Pharmacia) auf¬ genommen und mit dem Klenow-Fragment der E.coli DNA Polyme- rase I inkubiert. Die Konzentration an Desoxynukleotidtri- phosphaten betrug dabei 50 μM (jeweils für dATP, dTTP, dCTP, dGTP) .

Die Herstellung einzelsträngiger DNA erfolgte analog Bei¬ spiel 2 mit dem einen Unterschied jedoch, daß das PCR-Frag- ment in die Smal-Schnittstelle von mpl8 einkloniert wurde. Die DNA-Sequenz des humanen 5-HTι_B-Rezeptorgens ist in Se¬ quenzprotokoll 2 (SEQ ID NO 2) beschrieben. Die Homologie zum 5HTι_B-Rezeptorgen der Ratte beträgt ca. 90 %. Die aus SEQ ID NO 2 abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Sequenzpro- tokoll 3 wiedergegeben.

Ein Klon mit der in SEQ ID NO 2 dargestellten cDNA-Sequenz wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, unter der Nummer DSM 6860 hinterlegt. Beispiel 4

Transiente Expression des klonierten humanen Rezeptorgens in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 Zellen

Wenn nicht anders beschrieben, wurden zur Zellkultur die Vorschriften von Lindl und Bauer ("Zeil- und Gewebekultur", Gustav Fischer Verlag) verwendet.

Doppelsträngige mp 18 DNA, welche die Rezeptor cDNA als In- sert enthielt, wurde mit den Enzymen EcoRI und Hindlll ge¬ spalten. Das daraus resultierende für den Rezeptor kodie¬ rende Fragment mit überhängenden Enden wurde mit Hilfe der Enzyme T₄-DNA-Polymerase und Klenow-Fragment der E.coli DNA Polymerase nach Standardbedingungen (vgl. Current Protocols in Molecular Biology s.o.) behandelt, um glatte Enden zu ge¬ nerieren. Danach wurden an dieses Fragment die kommerziell erhältichen Linker (Invitrogen) mit der Sequenz 5'-CTTAGAGCAC-3' und 3'-GAATCTC-5' ligiert. Das mit diesen Linkern versehenen DNA-Fragment wurde unter Standardbedin¬ gungen in die kommerziell erhältlichen, BstXI geschnittenen Vektoren pCDM8 und rcCMV (Invitrogen) ligiert. Die daraus resultierenden rekombinanten Plasmide wurden nach bekannter Weise vermehrt. HEK 293 Zellen wurden unter Standard-Bedin- gungen in einer 10-cm-Zellkulturschale bis zu einer Zellzahl von 7 bis 8 x 10⁶ Zellen kultiviert. Nach Trypsinierung wur¬ den die Zellen 1:3 in MEM Medium (Gibco) , das 2,2 g/1 NaHC0 enthielt, verdünnt und erneut in 10 cm Petrischalen ausge¬ sät. Danach wurden die Zellen für 40 bis 48 h bei 37°C kul- tiviert.

Die zu transfizierende DNA wurde wie folgt vorbereitet: 20 μg der DNA-Lösung (1 mg/ml) , gereinigt über CsCl-Gra- dient, wurden mit 437 μl H O versetzt, danach wurden 62,5 μl 2 M CaCl2 zugesetzt und schließlich 500 μl BBS. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca⁺⁺-Präzipi- tate.

Die Lösung wurde auf 10-cm-Zellkulturschale mit den.nach obiger Vorschrift kultivierten 293 Zellen gegeben. Nach vor¬ sichtiger Durchmischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in ei¬ nem 3 % CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfer- nung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml serumfreiem Medium wurden den Zellen 10 ml Vollme¬ dium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation in einem 5 % Cθ₂~Inku- bator konnten die Zellen für pharmakologische und elektro- physiologische Untersuchungen verwendet werden.

Alternativ wurde die DNA auch Liposomen-vermittelt in die Zellen eingebracht. Dabei wurde Lipofectin der Firma GIBCO- BRL den Herstellerangaben entsprechend eingesetzt.

Beispiel 5

Rezeptor-Bindungstest

Den nach Beispiel 4 transfizierten und kultivierten Zellen wurden 2,5 ml kaltes PBS zugesetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden weitere 5 ml PBS zugegeben und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale ent¬ fernt. Die Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei ca. 1 200 g 10 min lang zentrifugiert.

Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurden die Zel¬ len zur Membranpräparation verwendet.

Nach Resuspendierung des Zellpellets in 1,5 ml 10 mM Tris- HC1 pH 7,2 wurden die Zellen mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 50 000 g in einem So- vall SS 34 Rotor bei 4°C 20 min zentrifugiert. Das Membran¬ pellet wurde in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 aufgenommen und erneut mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX homogenisiert. Nach Zen_^ trifugation wie oben wurde das Pellet in 3,5 ml BB (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl) aufgenommen. Nach kurzer Homo¬ genisierung mit einem Gewebe-Homogenisator konnten die Mem¬ branen in dem eigentlichen Bindungstest eingesetzt werden.

800 μl dieser so hergestellten Membranen wurden bei 4°C mit [³H] Serotonin (Endkonzentration 2 nM) und verschiedenen Konzentrationen der zu testenden Substanz für 2 h inkubiert. Danach wurden die Membranen über Glasfaserfilter (Schlei¬ cher & Schuell No. 34) filtriert, um das nicht-gebundene ra- dioaktive markierte Serotonin abzutrennen. Die Menge an ge¬ bundenen [³H] Serotonin wurde im Flüssigkeits-Szintillati- onszähler bestimmt. Folgende Substanzen (erhältlich bei RBI, Natick, MA, USA un¬ ter der angegebenen Katalog-Nr. ) wurden beim humanen 5-HTι_B-Rezeptor als Testsubstanzen eingesetzt:

5-Carboxyamidotryptamin (5-CT) (Nr. C117) (-) Propranolol (Nr. P110) Methysergid (Nr. M137) Rauwolscin (Nr. R104) MDL 7222 (Nr. T102) 8-OH-DPAT (Nr. S002)

Dabei wurden folgende Ki-Werte (nM) bestimmt:

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft

(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38

(C) ORT: Ludwigshafen

(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: D-6700

(G) TELEPHON: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170

(ii) ANMELDETITEL: Serotonin-Rezeptor: Verfahren zu seiner Herstellun und Verwendung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3

(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 1414 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: CDNS zu mRNS

(iii) HYPOTHETISCH: NEIN

(iii) ANTISENSE: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

CCTGTGACCT CTCCTTTCGG CTGAGAACAC AGGCGGAGGA GTTTACTGAG GAACCCACGG 6 AACTGGCTAG CCAAAGGAGA CAAGCCTATA GTCTCCATGA TCCTCCCGTC CTCTGTTCTT 12

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARÄKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 1228 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzel

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS : cDNS zu iriRNS

(iii) HYPOTHETISCH: NEIN

(iii) ANTISENSE : NEIN

(ix) MERKMALE :

(A) NAME/SCHLÜSSEL : CDS

(B) LAGE : 28 . . 1197

(D) SONSTIGE ANGÄBEN: /product= "Human 5-HT 1B Rezep¬ tor"

ER^SATZBLATT (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

CGCTCCGCAG CCAGGACGAG GAGAGCT ATG GAG GAA CCG GGT GCT CAG TGC 51

Met Glu Glu Pro Gly Ala Gin Cys 1 5

GCT CCA CCG CCG CCC GCG GGC TCC GAG ACC TGG GTT CCT CAA GCC AAC 99 Ala Pro Pro Pro Pro Ala Gly Ser Glu Thr Trp Val Pro Gin Ala Asn

10 15 20

TTA TCC TCT GCT CCC TCC CGA AAC TGC AGC GCC AAG GAC TAC ATT TAC 147 Leu Ser Ser Ala Pro Ser Arg Asn Cys Ser Ala Lys Asp Tyr Ile Tyr 25 30 35 40

CAG GAC TCT ATC TCC CTA CCC TGG AAA GTA CTG CTG GTT ATG CTA TTG 195 Gin Asp Ser Ile Ser Leu Pro Trp Lys Val Leu Leu Val Met Leu Leu

45 50 55

GCG CTC ATC ACC TTG GCC ACC ACG CTC TCC AAT GCC TTT GTG ATT GCC 243 Ala Leu Ile Thr Leu Ala Thr Thr Leu Ser Asn Ala Phe Val Ile Ala

60 65 70

ACA GTG TAC CGG ACC CGG AAA CTG CAC ACC CCG GCT AAC TAC CTG ATC 291 Thr Val Tyr Arg Thr Arg Lys Leu His Thr Pro Ala Asn Tyr Leu Ile

75 80 85

GCC TCT CTG GCG GTC ACC GAC CTG CTT GTG TCC ATC CTG GTG ATG CCC 339 Ala Ser Leu Ala Val Thr Asp Leu Leu Val Ser Ile Leu Val Met Pro

90 95 100

ATC AGC ACC ATG TAC ACT GTC GCC GGC CGC TGG ACA CTG GGC CAG GTG 387 Ile Ser Thr Met Tyr Thr Val Ala Gly Arg Trp Thr Leu Gly Gin Val 105 110 115 120

GTC TGT GAC TTC TGG CTG TCG TCG GAC ATC ACT TGT TGC ACT GCC TCC 435 Val Cys Asp Phe Trp Leu Ser Ser Asp Ile Thr Cys Cys Thr Ala Ser

125 130 135

ATC CTG CAC CTC TGT GTG ATC GCC CTG GAC CGC TAC TGG GCC ATC ACG 483 Ile Leu His Leu Cys Val Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Thr

140 145 150

GAC GAC GTG GAG TAC TCA GCT AAA AGG ACT CCC AAG AGG GCG GCG GTC 531 Asp Asp Val Glu Tyr Ser Ala Lys Arg Thr Pro Lys Arg Ala Ala Val

155 160 165

ATG ATC GCG CTG GTG TGG GTC TTC TCC ACC TCT GCC TCG CTG CCG CCC 579 Met Ile Ala Leu Val Trp Val Phe Ser Thr Ser Ala Ser Leu Pro Pro

170 175 180

TTC TTC TGG CGT CAG GCT AAG GCC GAA GAG GAG GTG TCG GAA TGC GTG 627 Phe Phe Trp Arg Gin Ala Lys Ala Glu Glu Glu Val Ser Glu Cys Val 185 190 195 200

GTG AAC ACC GAC CAC ATC CTC TAC ACG GTC TAC TCC ACG GTG GGT GCT 675 Val Asn Thr Asp His Ile Leu Tyr Thr Val Tyr Ser Thr Val Gly Ala 205 210 215

ERSATZBLATT TTC TAC TTC CCC ACC CTG CTC CTC ATC GCC CTC TAT GGC CGC ATC TAC 723 Phe Tyr Phe Pro Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Tyr Gly Arg Ile Tyr

220 225 230

GTA GAA GCC CGC TCC CGG ATT TTG AAÄ CAG ACG CCC AAC AGG ACC GGC 771 Val Glu Ala Arg Ser Arg Ile Leu Lys Gin Thr Pro Asn Arg Thr Gly

235 240 245

AAG CGC TTG ACC CGA GCC CAG CTG ATA ACC GAC TCC CCC GGG TCC ACG 819 Lys Arg Leu Thr Arg Ala Gin Leu Ile Thr Asp Ser Pro Gly Ser Thr

250 255- 260

TCC TCG GTC ACC TCT ATT AAC TCG CGG GTT CCC GAC GTG CCC AGC GAA 867 Ser Ser Val Thr Ser Ile Asn Ser Arg Val Pro Asp Val Pro Ser Glu 265 270 275 280

TCC GGA TCT CCT GTG TAT GTC AAC CAA GTC AAA GTG CGA GTC TCC GAC 915 Ser Gly Ser Pro Val Tyr Val Asn Gin Val Lys Val Arg Val Ser Asp

285 290 295

GCC CTG CTG GAA AAG AAG AAA CTC ATG GCC GCT AGG GAG CGC AAA GCC 963 Ala Leu Leu Glu Lys Lys Lys Leu Met Ala Ala Arg Glu Arg Lys Ala

300 305 310

ACC AAG ACC CTA GGG ATC ATT TTG GGA GCC TTT ATT GTG TGT TGG CTA 1011 Thr Lys Thr Leu Gly Ile Ile Leu Gly Ala Phe Ile Val Cys Trp Leu

315 320 325

CCC TTC TTC ATC ATC TCC CTA GTG ATG CCT ATC TGC AAA GAT GCC TGC 1059 Pro Phe Phe Ile Ile Ser Leu Val Met Pro Ile Cys Lys Asp Ala Cys

330 335 340

TGG TTC CAC CTA GCC ATC TTT GAC TTC TTC ACA TGG CTG GGC TAT CTC 1107 Trp Phe His Leu Ala Ile Phe Asp Phe Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Leu 345 350 355 360

AAC TCC CTC ATC AAC CCC ATA ATC TAT ACC CTG TCC AÄT GAG GAC TTT 1155 Asn Ser Leu Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Leu Ser Asn Glu Asp Phe

365 370 375

AAA CAA GCA TTC CAT AAA CTG ATA CGT TTT AAG TGC ACA AGT 1197

Lys Gin Ala Phe His Lys Leu Ile Arg Phe Lys Cys Thr Ser 380 385 390

TGACTTGTCA ATGGCATTGG GGTCGCCTAA G 1228

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LäNGE: 390 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

ERSATZBLATT (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Met Glu Glu Pro Gly Ala Gin Cys Ala Pro Pro Pro Pro Ala Gly Ser

1 5 10 15

Glu Thr Trp Val Pro Gin Ala Asn Leu Ser Ser Ala Pro Ser Arg Asn

20 25 30

Cys Ser Ala Lys Asp Tyr Ile Tyr Gin Asp Ser Ile Ser Leu Pro Trp

35 40 45

Lys Val Leu Leu Val Met Leu Leu Ala Leu Ile Thr Leu Ala Thr Thr

50 55 60

Leu Ser Asn Ala Phe Val Ile Ala Thr Val Tyr Arg Thr Arg Lys Leu 65 70 75 80

His Thr Pro Ala Asn Tyr Leu Ile Ala Ser Leu Ala Val Thr Asp Leu

85 90 95

Leu Val Ser Ile Leu Val Met Pro Ile Ser Thr Met Tyr Thr Val Ala

100 105 110

Gly Arg Trp Thr Leu Gly Gin Val Val Cys Asp Phe Trp Leu Ser Ser

115 120 125

Asp Ile Thr Cys Cys Thr Ala Ser Ile Leu His Leu Cys Val Ile Ala

130 135 140

Leu Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Thr Asp Asp Val Glu Tyr Ser Ala Lys 145 150 155 160

Arg Thr Pro Lys Arg Ala Ala Val Met- Ile Ala Leu Val Trp Val Phe

165 170 175

Ser Thr Ser Ala Ser Leu Pro Pro Phe Phe Trp Arg Gin Ala Lys Ala

180 185 190

Glu Glu Glu Val Ser Glu Cys Val Val Asn Thr Asp His Ile Leu Tyr

195 200 205

Thr Val Tyr Ser Thr Val Gly Ala Phe Tyr Phe Pro Thr Leu Leu Leu

210 215 220

Ile Ala Leu Tyr Gly Arg Ile Tyr Val Glu Ala Arg Ser Arg Ile Leu 225 230 235 240

Lys Gin Thr Pro Asn Arg Thr Gly Lys Arg Leu Thr Arg Ala Gin Leu

245 250 255

Ile Thr Asp Ser Pro Gly Ser Thr Ser Ser Val Thr Ser Ile Asn Ser

260 265 270

Arg Val Pro Asp Val Pro Ser Glu Ser Gly Ser Pro Val Tyr Val Asn

275 280 285

Gin Val Lys Val Arg Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Lys Lys Lys Leu

290 295 300

Met Ala Ala Arg Glu Arg Lys Ala Thr Lys Thr Leu Gly Ile Ile Leu 305 310 315 320

Gly Ala Phe Ile Val Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Ile Ser Leu Val 325 330 335 Met Pro Ile Cys Lys Asp Ala Cys Trp Phe His Leu Ala Ile Phe Asp

340 345 350

Phe Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Leu Asn Ser Leu Ile Asn Pro Ile Ile

355 360 365

Tyr Thr Leu Ser Asn Glu Asp Phe Lys Gin Ala Phe His Lys Leu Ile

370 375 380

Arg Phe Lys Cys Thr Ser 385 390

Claims

Patentansprüche

1. Proteine mit der in SEQ ID NO 3 beschriebenen Amino- säuresequenz.

2. DNA-Sequenzen, die für 5-HTι_B-Rezeptoren codieren und die aus der Gruppe, die von

a) DNA-Sequenzen der in SEQ ID NO 2 beschriebenen Struktur,

b) DNA-Sequenzen, die für Proteine gemäß Anspruch 1 codieren, und

c) DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit DNA-Sequenzen a) oder b) hybridisieren, gebildet wird,

ausgewählt sind.

3. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 enthält.

4. Verfahren zur Herstellung eines 5-HTι_B-Rezeptors unter Verwendung eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 3.

5. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 2 zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HTι_B-Re- zeptoren.

6. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5-HTi_ß-Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer für einen 5-HTι_B-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 Zellen transfiziert, die Membranen dieser Zellen isoliert und mit diesen Membranen übliche Rezeptorbindungsexperimente durchführt.

7. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für 5~HTi_B-Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer für einen 5-HTι_B-Rezeptor codierenden DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 Zellen transfiziert und die in diesen Zellen durch Bindung der Liganden an den Rezeptor verur- sachte Veränderung des second messenger Spiegels durch ein Reportersystem detektiert.