DE19806803A1

DE19806803A1 - Transporter für Saccharid-gekoppelte Zytostatika in Tumorzellen

Info

Publication number: DE19806803A1
Application number: DE19806803A
Authority: DE
Inventors: Manfred Wiesler; Hermann Koepsell
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 1999-11-25
Also published as: WO1999042477A8; WO1999042477A3; WO1999042477A2; JP2002504318A; EP1056857A2

Abstract

Beschrieben werden Nukleinsäuremoleküle aus einer Saccharidtransporterfamilie, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid gekoppelte Zytostatika kodieren. Ferner werden diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren beschrieben, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression des Transporters in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind sowie zur Gentherapie geeignet sind. Außerdem werden davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper beansprucht. Mit diesen erfindungsgemäßen Gegenständen können vorzugsweise Tumorzellen auf das Vorhandensein eines solchen Transporters untersucht werden. Bei Fehlen eines solchen Transporters in Tumorzellen kann dieser auf gentherapeutischem Weg eingebracht werden. Tumorzellen werden auf diesem Weg wirkungsvoller als bisher möglich einer Chemotherapie zugänglich gemacht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Transporter für Saccharid-gekoppelte Zytostatika in Tumorzellen. Weiter betrifft die Erfindung eine für den Transporter kodierende Nukleinsäure, gegen den Transporter gerichtete Antikörper und Mittel zum Nachweis des Transporters in Tumorzellen sowie Mittel zum Einbringen des Transporters in Tumorzellen.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen unterschiedlichster Art stellt die Che motherapie mit Zytostatika eine wichtige Säule der Therapie dar. Dabei muß der behandelnde Arzt die wichtige Entscheidung treffen, welches Zytostatikum aus der Vielzahl möglicher Zytostatika eingesetzt werden soll. Diese Entscheidung muß allerdings oft revidiert werden, da nach einiger Behandlungszeit festgestellt wird, daß das Zytostatikum nicht die gewünschte Wirkung entfaltet. Dies kann beispielsweise daran liegen, daß keine nennenswerte Aufnahme der Wirksub stanz im Tumor stattgefunden hat und das Zytostatikum schnell wieder ausge schieden wird. In einem solchen Fall ist kostbare Behandlungszeit verloren gegangen und die Tumorerkrankung häufig weiter fortgeschritten.

Man hat nun vor einiger Zeit herausgefunden, daß Saccharid-gekoppelte Zyto statika Vorteile für die Tumor-Chemotherapie bringen. Diese sind besser wasser löslich und häufig wirkungsvoller als ungekoppelte, da sie spezifischer wirken und weniger Nebenwirkungen haben. Saccharid-gekoppelte Zytostatika können im Gegensatz zu den herkömmlichen Zytostatika wegen ihrer Wasserlöslichkeit nicht passiv durch Zellmembranen gelangen. Sie benötigen für den Eintritt in Zellen Transportproteine oder Kanäle. Saccharid-gekoppelte Zytostatika sind beispielsweise im europäischen Patent EP-B-0 369 182 beschrieben. Man wußte aber bisher nicht, über welche Transportmechanismen diese Zytostatika in die Tumorzellen gelangen und hatte deshalb keine Möglichkeit, die zelluläre Auf nahme der Saccharid-gekoppelten Zytostatika zu modulieren und vorauszusagen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt nun darin, eine Möglichkeit bereit zustellen, mit dem Tumorzellen identifiziert werden können, die für Saccharid gekoppelte Zytostatika zugänglich sind. Weiter besteht die Aufgabe der vor liegenden Erfindung darin, Tumorzellen mit einem Transporter auszustatten, damit diese befähigt werden, Saccharid-gekoppelte Zytostatika zu transportie ren.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen definierten Gegen stände.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß bestimmte menschliche Tumor zellen einen Transporter aufweisen, mit dem Saccharid-gekoppelte Zytostatika leicht in die Zelle transportiert werden können. Bei diesem Transporter handelt es sich um eine Subtype von natriumabhängigen Zuckertransportern der sog. SGLT1-Familie, die als SAAT1 bezeichnet wird. Von den Erfindern wurde her ausgefunden, daß diese Transportersubtypen im Gegensatz zu den anderen Subtypen dieser Familie in der Lage ist, Saccharid-gekoppelte Zytostatika zu transportieren. Unter Saccharid-gekoppelten Zytostatika soll erfindungsgemäß jede zytostatisch wirksame Substanz verstanden werden, die sich für eine Chemotherapie von Tumoren eignet und mit einem Saccharid verbunden ist, vorzugsweise β-glykosidisch mit Glucose oder Galactose verbunden ist. Ganz bevorzugt ist darunter β-D-Glycosylisophosphoramid-Mustard (D-19575) zu verstehen. Diese Verbindung hat die folgende Formel:

Außerdem sind weitere bevorzugte Saccharid-gekoppelte Zytostatika in EP-8-0 369 182 zu finden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekoppelte Zyto statika kodiert. Diese Nucleinsäure kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Erfindungsgemäß ist dies eine Nucleinsäure, bevorzugt eine DNA, die folgendes umfaßt:

a) die Nucleinsäure von Fig. 1, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon,
b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder
c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten geneti schen Code verwandte DNA.

Die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle umfassen Nucleinsäure moleküle, die sich gegenüber der in Fig. 1 angegebenen Sequenz durch Dele tion(en), Insertion(en), Austausch(e) oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden. Der Begriff "Nucleinsäurefragment" soll einen Ausschnitt bzw. Segment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch dieses Nucleinsäurefragment codierte Protein noch Transporter aktivität aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann be kannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäu resequenz codiertes Protein noch über die biologische Aktivität eines Trans porters verfügt. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß das Protein in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert und die Eier danach bezüglich ihrer Transportaktivität untersucht werden (Busch et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, No. 51, S. 32599-32604, 1996).

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff "hybridisieren" bezieht sich dabei auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs bedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al.,supra). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das erfindungsgemäße Nuclein säuremolekül von einem Säuger, vorzugsweise von einem Menschen. Auf Nucleinsäurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolie rung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten cDNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Fig. 1 angebene Nucleinsäuresequenz oder einen Teil davon enthalten.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Ex pressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzuge ben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculo virus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-,trp-Promo tor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen Nuclein säuremoleküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus oder Vaccinia-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungs gemäßen Nucleinsäuremoleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Durch das genthera peutische Einbringen des Transporters in Tumorzellen, die diesen sonst nicht aufweisen, werden diese für Saccharid-gekoppelte Zytostatika empfänglich gemacht und können in einer Chemotherapie effizient vernichtet werden.

Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und ge eignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Der Fachmann weiß somit, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungs gemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, der Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expres sion der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Von den Erfindern wurde ein bevorzugter menschlicher Transporter für Saccarid gekoppelte Zytostatika mit SAAT1 bezeichnet, und ein Clon, der die cDNA- Teilsequenz von SAAT1 aus der Großhirnrinde des Menschen enthält, wurde am 11. Februar 1998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, unter der Hinterlegungsnummer DSM 11 991 hinterlegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekop pelte Zytostatika, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vor zugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Der Fachmann kennt dabei Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu.Rev.Biochem. 54 (1985), 237, LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993),187, Wong, Curr.Opin. Biotech.6 (1995), 517, Romanos, Curr.Opin. Biotech.6 (1995), 527, Williams et al., Curr. Opin. Biotech.6 (1995), 538, und Davies, Curr. Opin.Biotech.6 (1995), 543. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße Nu cleinsäure exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinität schromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen von dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codiertes oder nach dem vor stehenden Verfahren erhaltenes Protein mit Aktivität für den Transport von Saccharid-gekoppelten Zytostatika, wobei das Protein auch als Fusionsprotein vorliegen kann. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfin dungsgemäße Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im Wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Aus tauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäurere sten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Amino säuren am N- oder C-Terminus fehlen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Die Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen monoclonalen Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklo nale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten wer den. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekü len codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfre, Meth. Enzymol.73 (1981), 3, beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikör per können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine mit Transporteraktivität oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispiels weise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunoassays sind ELISA und RIA.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend be schriebenen Nucleinsäuren, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper als Arznei mittel. Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeu tisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen bei spielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, bei spielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Ver abreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z. B. direkt zu dem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium eines Tumors, der Art der Verabrei chung etc. ab.

Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung der erfin dungsgemäßen Nucleinsäuren Anwendung finden können. Andererseits kann das von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierte Protein direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien der für den Transporter codierenden Gene besitzen, Transporteraktivität herzustellen. Das Arzneimittel kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn die nachstehend beschriebenen Verfahren den Nachweis darüber liefern, daß in dem betreffenden Tumorgewebe eines Patienten biologisch aktive Transporter nicht oder in zu geringen Mengen gebildet werden.

Außerdem eignen sich die Gegenstände die vorliegende Erfindung für ein Ver fahren zum Nachweis der Expression eines von dem vorstehenden Nucleinsäure molekül codierten Transporters durch Bestimmung der Anwesenheit der diesen Transporter codierenden mRNA, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Gewinnung von mRNA aus Tumorgewebe,
b) Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit dem erfindungsge mäßen Nucleinsäuremolekül als Sonde unter Hybridisierungsbedin gungen, und
c) Nachweis der Anwesenheit der mit der Sonde hybridisierten mRNA, wodurch die Expression des Transporters in Tumorgewebe nach gewiesen wird.

Geeignete Methoden zur Durchführung dieses Verfahrens sind dem Fachmann bekannt und dieser kann auch zur Gewinnung geeigneter Proben, zur Durch führung geeigneter Extraktionsverfahren und Hybridisierungsverfahren und zum Nachweis spezifischer mRNAs nach den in den nachstehend angegebenen Beispielen genau beschriebenen Verfahren vorgehen.

Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR durchgeführt werden. Dabei werden Primer verwendet, die die den Transporter codierende Sequenz flankie ren. Insbesondere eignet sich eine RT-PCR. Dafür wird aus Tumorzellen RNA isoliert und einer reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion unterworfen. Die Durchführung einer RT-PCR ist dem Fachmann geläufig und es gibt inzwi schen auch käuflich erhältliche Kits dafür. Als Primer für menschliches SAAT1 können beispielsweise 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3' (forward) und 5'- CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse) verwendet werden und in Form eines Kits zusammen mit den anderen üblichen Reagenzien für RT-PCR zur Verfügung gestellt werden. Die PCR-Produkte werden dann beispielsweise auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, geblottet und bei 48°C an die ³²P-markierten internen Oligonukleotide 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT (forward) hybridisiert.

Ein von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierter Transporter kann auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte:

a) Gewinnen einer Probe aus Tumorgewebe,
b) Inkontaktbringen der so erhaltenen Probe mit dem vorstehend be schriebenen Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die Bin dung des Antikörpers an den Transporter erlauben, und
c) Nachweis des gebundenen Antikörpers, wodurch die Expression des Transporters in der Zelle nachgewiesen wird.

Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekann ten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußver fahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlauben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispiels weise ELISA oder RIA.

Bei den obigen Verfahren ist unter einer Probe aus Tumorgewebe bzw. unter Tumorzellen beispielsweise eine Biopsie (z. B. Feinnadel- oder Stanzbiopsie), Serumprobe (bei Blutzelltumoren), Liquorprobe oder Operationsmaterial zu verstehen.

Desweiteren eignen sich die Gegenstände der vorliegenden Erfindung dazu, Tumore und Metastasen, welche diesen SAAT1-Transporter exprimieren zu identifizieren. Dies kann geschehen, indem man dem Patienten ein z. B. mit Jod¹²⁵ radioaktiv markiertes Saccharid-gekoppeltes Zytostatikum verabreicht dann die Verteilung der Reaktivität im Körper des Patienten mit Hilfe einer Szintigraphie abtastet. Als zweite Methode kommt NMR mit ¹⁹F-markierten Zytostatika in Frage.

Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind außerdem geeignet, um neue Saccharid-gekoppelte Zytostatika, die über den SAAT1-Transporter in Tumorzel len aufgenommen, zu identifizieren. Dazu muß der SAAT1-Transporter in Oo zyten des Krallenfrosches Xenopus laevis oder in anderen Sequenzen exprimiert werden und die Aufnahme neuer Saccharid-gekoppelter Zytostatika muß gemes sen werden (vgl. Fig. 3).

Die Erfindung wird anhand der Figuren weiter beschrieben, welche zeigen:

Fig. 1: Nukleinsäureteilsequenz von SAAT1 aus der Großhirnrinde des Menschen,

Fig. 2: Aminosäureteilsequenz von SAAT1 aus dem Gehirn des Menschen,

Fig. 3: Nachweis, daß [¹⁴C]-β-D-Glc-IPM nur von SAAT1 und keiner anderen Subtype der SGLT-Familie transportiert wird,

Fig. 4: Expression von SAAT1 in verschiedenen Tumorgeweben,

Fig. 5: [¹⁴C]-β-D-Glc-IPM Aufnahme in suspendierte menschliche Karzinoma T84-Zellen durch SAAT1

Die folgende Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrie ben:

Beispiel 1: Transkription von SAAT1 in menschlichen Tumorzellen

Gesamt-RNA wurde gemäß Standardverfahren (Chomczynski et al., Anal. Bio chem. 162, S. 156-159, 1987) aus verschiedenen renalen Karzinomen (Nuklear grad 1-Tumor: Fig. 4 Spur c; Nukleargrad 2-Tumor: Spur d; Nukleargrad 3- Tumor: Spur e), aus Mäuse-Tumor-Xenografts (menschl. Colonkarzinom: Spur f; menschl. Ovarkarzinom: Spur g) und aus menschl. Karzinoma-Zellinien KTCT- L30 (Spur h), KTCTL104 (Spur i) oder T84 (Spur k) gewonnen. Die RNAs und eine Kontrolle ohne RNA (Spur b) wurden 10 Min. bei 37°C mit DNase (2U DNase/µg RNA) behandelt, um Reste genomischer DNA zu entfernen. Danach wurden sie einer reversen Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) unterworfen. Die RT-PCR wurde mit Titan^TMOne Tube RT-PCR-System (Boehrin ger Mannheim) den Herstellerinformationen folgend unterworfen. Es wurde jeweils 1 µg RNA verwendet und die eingesetzten Primer waren 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3' (forward) und 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse). Die PCR-Produkte und ein Größenmarker (Spur a) wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Ein Teil des Gels wurde mit Ethidiumbromid ange färbt (Fig. 4, obere Spalte). Der andere Teil des Gels wurde geblottet und bei 48°C an das ³²P-markierte Oligonukleotid 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT-3' (forward) hybridisiert. Die Membran wurde bei 48°C mit 6 × SSC enthaltend 0,05% (w/v) Natriumpyrophosphat gewaschen und zur Autoradiografie ein Film aufgelegt.

Als Kontrollexperiment wurde genomische DNA verwendet, mit der jede cDNA- Amplifikation aus genomischer DNA ausgeschlossen war.

Wie durch Fig. 4 verdeutlicht wird, ist das menschliche SAAT1-Fragment in Carcinomas der Niere, Darm und Ovarien, in Darmkrebszellen T84 und in zwei renalen Carcinoma-Zellinien nachweisbar.

Beispiel 2: Expression von [¹⁴C]-β-D-Glc IPM Transport durch SAAT1 in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis

In Xenopus laevis Oozyten wurden 50 nl Wasser mit und ohne 10 ng cRNA von SGLT1 (Typ eines Saccharid-Transporter aus Kaninchen), SGLT1 (Mensch), Hu14 (Typ eines weiteren Saccharid-Transporters aus Mensch), SMIT (Typ eines weiteren Saccharid-Transporters aus Hund) oder SAAT1 Schwein) injiziert. Nach 2-4 Tagen Inkubation wurde die Expression des jeweiligen Transporters durch Messung der Phlorizin-inhibierbaren Aufnahme nach 30 Minuten Inkuba tion mit 50 µM [¹⁴C] AMG (SGLT1, SAAT1), 1,25 mM [¹⁴C] AMG (Hu14) und 1 µM [³H] myo-Inositol gemessen. Die verwendeten Phlorizin-Konzentrationen waren 100 µM (SGLT1 aus Kaninchen), 200 µM (SGLT1 aus Mensch, Hu14, SAAT1) oder 500 µM (SMIT). Die exprimierte Phlorizin-inhibierbare Aufnahmera te von AMG und myo-Inositol waren 274 ± 22 (SGLT1, Kaninchen), 48 ± 5 (SGLT1, Mensch), 25 ± 1 (Hu 14), 6,5 ± 0,7 (SMIT) bzw. 18 ± 2 (SAAT1) pmol × Oozyte^-1 × h^-1. Unter identischen experimentellen Bedingungen wurden die gleichen Chargen injizierter Oozyten auf die Phlorizin-inhibierbare Aufnahme von 100 µM [¹⁴C]-β-D-Glc-IPM getestet.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt, woraus klar hervorgeht, daß nur SAAT1 das Saccharid-gekoppelte Zytostatikum zu transportieren vermag.

Beispiel 3: [¹⁴C]-β-D-Glc IPM Aufnahme in menschl. Carcinomazellen

T84-Zellen (ECACC Nr. 88021101), die von EACC (Salisbury, GB) erhalten wur den, wurden bei 37°C in einer 1 : 1 Mischung von Dulbecco's modified Eagle's- Medium und Ham's T12 Medium (Fa. Sigma) bei 5% CO₂ auf Gewerbekultur schalen der Firma Greiner kultiviert. Die Mischung enthielt weiter 10% fötales Rinderserum, 4 mM L-Glutamin, 10 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Nach Konfluenz der Zellen wurden diese durch 1-stündige Inkubation für 1 Std. bei 37°C mit Mg²⁺-Ca²⁺-freiem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) enthal tend 0,5 mM EDTA, 10 mM Hepes und 28 mM NaHCO₃, pH7,4 abgelöst, bei 1000 g sedimentiert und in PBS resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden 30 Sek. mit PBS, enthaltend verschiedene Konzentrationen D-[¹⁴C]-β-D-Glc-IPM inkubiert. Die Inkubationen wurden mit eiskaltem PBS enthaltend 1 mM Phlorizin (bekannt als Inhibitor für Glucosetransporter) gestoppt. Die Zellen wurden zweimal mit dieser Stoplösung gewaschen, mit 4M Guanidinthiocyanat solubili siert und auf Radioaktivität untersucht.

Dieses Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt, wo klar hervorgeht, daß T84-Zellen über einen Transporter verfügen, der es ermöglicht, daß β-D-Glc-IPM aufgenommen wird.

Beispiel 4: Herstellung von Antikörpern

Mit einem Gel-gereinigten Transporter-Proteinfragment gemäß Fig. 2 wurden Tiere wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung wurden 35 µg Gel-gereinigtes Protein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kanin chens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36µM 5' Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Protein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freunds Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Protein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

1. Nukleinsäure, kodierend für ein Transporterprotein für Saccharid-gekoppel te Zytostatika, wobei die Nukleinsäure umfaßt:

a) die Nukleinsäure von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehre re Basenpaare unterschiedliche Nukleinsäure bzw. ein Fragment davon,
b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende Nukleinsäure oder
c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte Nukleinsäure.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei sie eine DNA ist.

3. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1.

4. Transformante, enthaltend den Vektor nach Anspruch 3.

5. Transporterprotein für Saccharid-gekoppelte Zytostatika umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2 bzw. ein Fragment davon.

6. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 5, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 4 unter geeigneten Bedin gungen.

7. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 5.

8. Verwendung des Proteins nach Anspruch 5 als Reagens zur Analyse von Tumorzellen.

9. Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Analyse von Tumorzellen.

10. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 7 als Reagenz zur Analyse von Tumorzellen.

11. Verwendung des Proteins nach Anspruch 5, der Nukleinsäure nach An spruch 1 oder 2, oder des Plasmids nach Anspruch 3 zur Gentherapie von Tumorzellen.

12. Verwendung des Proteins nach. Anspruch 5, der Nukleinsäure nach An spruch 1 oder 2, oder des Plasmids nach Anspruch 3 zur Austestung neuer Saccharid-gekoppelter Zytostatika bezüglich ihrer prospektiven Aufnahme in Tumorzellen.