WO2000028023A2

WO2000028023A2 - ISCHÄMIE/REPERFUSIONSINDUZIERBARE DNAs UND PROTEINE

Info

Publication number: WO2000028023A2
Application number: PCT/EP1999/008372
Authority: WO
Inventors: René Zimmermann; Guangping Wang
Original assignee: Kerckhoff-Klinik Gmbh
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2000-05-18
Also published as: AU1159200A; DE19851294C1; WO2000028023A3

Abstract

Kurzzeitige Phasen koronären Verschlusses führen zu einer ischämischen Präkonditionierung des Herzens. Dies führt dazu, daß das betroffene Myokard gegenüber längeren Phasen von Ischämie resistenter wird. Bei der ischämischen Präkonditionierung sind eine Reihe von Genen induziert oder bevorzugt exprimiert. Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, die in der Lage sind, bei der ischämischen Präkonditionierung, insbesondere der ischämischen Präkonditionierung des Herzens, mitzuwirken. Die Erfindung betrifft weiterhin die Proteine selbst, unter anderem auch zur Verwendung als Arzneimittel, beispielsweise zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung von Herzinfarkten oder örtlichen kontraktilen Dysfunktionen. Daneben stellt die Erfindung Nucleinsäuresonden bereit, mit denen die Expression von Genen, die eine Rolle bei der ischämischen Präkonditionierung spielen, nachgewiesen werden kann.

Description

ISCHÄMIE/REPERFUSIONSINDUZIERBARE DNAs UND PROTEINE

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, die bei der ischämischen Präkonditionierung eine Rolle spielen. Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, die eine entsprechende DNA enthalten, und Wirtszellen, die mit einem dieser Expressionsvektoren transformiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Proteine, die bei der ischämischen Präkonditionierung beteiligt sind, Antikörper gegen diese Proteine sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die dieses Protein enthalten.

Kurzzeitige Phasen koronären Verschlusses führen zu einer ischämischen Präkonditionierung (IPC) und einem myokardia- len Stunning (MS) (myokardiale Funktionsstörung) des Herzens. Die ischämische Präkonditionierung führt dazu, daß das betroffene Myokard gegenüber längeren Phasen von Ischämie resistenter wird, wodurch in dramatischer Weise die Stärke eines etwaig folgenden Myokardinfarktes verringert wird und wodurch der kontraktile, metabolische und ionische Zustand verbessert wird (Murry, C.E., Jennings, R.B., Rei- 00/28023

mer, K.A., Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium, Circulation 1986; 74:1124-1136; Schott, R.J., Rohmann, S., Brau, E.R., Scha- per, W., Ischemic preconditioning reduces infarct size in swine myocardium, Cir. Res. 1990; 66:1133-1142; de Albu- querque, C.P., Gerstenblith, G. Weiss, R.G., Importance of metabolic inhibition and cellular pH in mediating preconditioning contractile and metabolic effects in rat hearts, Cir. Res. 1994; 74:139-150; Steenbergen, C, Perlman, M.E., London, R.E., Murphy, E., Mechanism of preconditioning: Io- nic alteration, Cir. Res. 1993; 72:112-125). Im Unterschied dazu wird MS als eine regionale kontraktile Dysfunktion definiert, die lange andauert, ohne daß sie zu irreversiblen Schädigungen führt (Heyndrickx, G.R., Millard, R.W. , Mcrit- chie, R.J., Maroko, P.R. , Vatner, S.F., Regional myocardial functional and_. electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs, J. Clinic. Inv. 1975; 56:978-985; Braunwald, E., Kloner, R.A. , The stunned myocardium: prolonged, postischemic ventricular dysfunction, Circulation 1982; 66:1146-1149). Die exakten Mechanismen, die für IPC und MS verantwortlich sind, wurden bisland noch nicht ermittelt. Einige Untersuchungen haben ergeben, daß sich infolge kurzer Phasen der Ischämie, gefolgt von Reperfusion, Veränderungen der Expression einer Reihe von Genen ergeben. So wurde beispielsweise gezeigt, daß in Schweineherzen nach lOminütigem Verschluß der linken vorderen absteigenden Koronararterie, gefolgt von einer 30- minütigen Reperfusion, gefolgt von einem erneuten lOminüti- gen Verschluß mit anschließender 30minütiger Reperfusion, die Genexpression von c-fos, egr-1 und jun B in starkem Ma- O 00/28023

ße induziert war (Brand, T., Sharma, H.S., Fleischmann, K.E., Duncker, D.J., McFalls, E.O., Verdouw, P.D., Schaper, W. , Proto-oncogene expression in porcine myocardium sub- jected to ischaemia and reperfusion, Cir. Res. 71:1351- 1360, 1992) . Diese frühen Ergebnisse führten jedoch nicht zu einem vollständigen Verständnis der Ereignisse, die zu einer ischämischen Präkonditionierung und damit zu einem verringerten Infarktrisiko führen. Im wesentlichen sind die Gene, deren Expression als Folge eines durch Ischämie/Re- perfusion hervorgerufenen Stresses induziert bzw. verstärkt ist, noch nicht bekannt.

Der vorliegenden Erfindung liegt damit die Aufgabe zugrunde, DNAs bereitzustellen, die für Proteine kodieren, die in der Lage sind, bei der ischämischen Präkonditionierung mitzuwirken und die insbesondere in der Lage sind, das Infarktrisiko zu senken und/oder die Schwere eines Infarktes zu verringern. Weiterhin sollten die Proteine selbst bereitgestellt werden. Zudem war es Aufgabe der Erfindung, DNA-Sonden bereitzustellen, mit denen die E.xpression von Genen nachgewiesen werden kann, die insbesondere bei der ischämischen Präkonditionierung verstärkt exprimiert oder gar induziert werden. Derartige Sonden sind auch geeignet, Vollänge-cDNAs oder genomische DNAs dieser Gene zu identifizieren. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen aufgeführten Merkmale gelöst .

Demgemäß betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, ausgewählt aus : 00/28023

(a) einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 oder dem jeweiligen komplementären Strang dazu,

(b) einer DNA-Sequenz, die mit einer der Sequenzen unter (a) oder Fragmenten davon unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,

(c) einer DNA, die lediglich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht befähigt ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der unter (a) definierten Sequenzen zu hybridisieren.

SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO : 5 sind die Nucleinsäuresequenzen von cDNAs von Genen aus dem Schweineherz, die als Folge von Ischämie/Reperfusion und dem damit verbundenen Streß induziert werden bzw. in verstärktem Maße exprimiert werden. In dieser Anmeldung wird die Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 1 manchmal als RKD 7.1 bezeichnet. Entsprechend sind (i) SEQ ID NO : 3 und W12 sowie (ii) SEQ ID NO:4 und W28 rev und (iii) SEQ ID NO:5 und W28 uni identisch.

Unter Ischämie versteht man eine Unterbrechung oder spürbare Verringerung der Durchblutung, oder eine Blutleere einzelner Organteile infolge mangelnder Blutzufuhr, z.B. infolge von Thrombose, Embolie, Endarteriitis, Druck von Tumoren oder durch experimentellen Verschluß von blutzuführenden Gefäßen. Eine Ischämie kann zur Nekrose des betreffenden Gewebes führen. Unter Reperfusion versteht man den O 00/28023

Vorgang, daß das Unterbrechen der Blutzufuhr wieder aufgehoben wird.

Ischämie kann bei jedem durchbluteten Organ auftreten. Von besonderer Wichtigkeit ist jedoch im allgemeinen die Ischämie, die durch Verschluß von Herzgefäßen hervorgerufen wird (Ischämie des Herzens) . Unter dem Begriff "Ischämie/Reper- fusion" ist ein Vorgang zu verstehen, bei dem zeitweise, beispielsweise durch den Verschluß oder Abbinden eines Blutgefäßes, eine Ischämie erzeugt wird und anschließend das Gewebe wieder durchblutet wird. Ein typisches Ischä- mie/Reperfusionsprotokoll ist eine zweimalige Abfolge eines lOminütigen Verschlusses eines Gefäßes, gefolgt von einer 30minü igen Reperfusion.

"Ischämische Präkonditionierung" (IPC) bedeutet, daß durch kurzzeitige Phasen der Ischämie, die noch zu keiner Nekrose des Gewebes führen, die Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber erneuten ischämischen Vorgängen erniedrigt wird. Wie bereits ausgeführt, führt eine ischämische Präkonditionierung des Herzens dazu, daß etwaig nachfolgende Infarkte in ihrer Stärke verringert sind oder das Risiko eines Infarktes vermindert ist .

Zum Isolieren der Sequenz gemäß SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 wird im wesentlichen wie folgt vorgegangen: Die linke vordere absteigende Koronararterie von Schweinen wird während zehn Minuten verschlossen. Dann folgt eine 30minü ige Reperfusion und ein erneuter lOminü- tiger Verschluß, und eine weitere 30minütige Reperfusion. O 00/28023

Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Herzgewebe dieser Tiere wird die RNA isoliert, und es werden mittels mRNA Differential Displays cDNAs hergestellt, und deren Sequenz ermittelt. Dadurch wird ein Rückschluß auf Gene möglich, deren Expression im Schweineherz als Folge der Ischämie induziert oder aber verstärkt wird. Das Verfahren zum Durchführen des Differential Displays ist dem Fachmann bekannt (Liang, P., Pardee, A.B., Differential display^'of eukaryo- tic messenger RNA by means of the polymerase chain reacti- on, Science 1992, 257:967-971; Liang, P., Averboukh, L. , Pardee, A.B., Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimiza- tion, Nucleic Acids Res., 1993, 21:3269-3275; Bauer, D., Muller, H. , Reich, J. et al . , Identification of differen- tially expressed mRNA species by an improved display tech- nique (DDRT-PCR) , Nucleic Acids Res., 1993, 21:4272-4280). Auf diese Weise wurden die cDNAs mit der SEQ ID NO : 3 , 4, 5 und 6 erhalten. Sollte die isolierte cDNA nicht Vollänge besitzen, so ist es möglich, eine Herz-cDNA-Genbank des Schweines auf Vollänge-cDNAs durchzumustern. Schweineherz- cDNA-Genbanken sind z.B. von Stratagene, Heidelberg, Deutschland, verfügbar (in Uni-ZAP XR) bzw. für einen Fachmann ohne weiteres herstellbar. Das Verfahren zum Durchmustern einer cDNA-Genbank ist dem Fachmann bekannt und wird zudem in der Beispielsektion detailliert beschrieben. Mittels des beschriebenen Grundverfahrens wurde unter Verwendung einer DNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 als Hybridisierungssonde eine Vollänge cDNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l erhalten. Die Expression der den SEQ ID NO:l, 3, 4, 5 und 6 entsprechenden Gene 00/28023

im Schweineherzen ist als Folge der Ischämie induziert bzw. verstärkt .

SEQ ID NO:l ist die Nucleinsäuresequenz einer cDNA mit 3463 Bp. Die Sequenz enthält ein typisches Polyadenylierungs- signal AATAAA, 23 Nucleotide stromaufwärts des Poly(A)- Schwanzes. Weiterhin wurde ein offener Leserahmen von 2031 BP nachgewiesen. 97% der Vertebraten-mRNAs besitzen ein Pu- rin, üblicherweise ein A in Position -3; 46% der Vertebraten-mRNAs besitzen ein G in Position +4 (Kozak, M. , An Ana- lysis of vertebrate mRNA sequence: intimation of transla- tional control, J. Cell. Biol., 115:887-903, 1991). Somit ergibt sich bei Vertebraten die Konsensus-Sequenz A/GNNAIΩG für ein Translationsstartsignal. Das erste ATG in der SEQ ID NO:l, das diese Bedingungen erfüllt, liegt an Position 195 und ist somit ein wahrscheinliches Translations-Initiationssignal. Unter Verwendung des FASTA-Programmes wurde die EMBL-DNA-Datenbank auf etwaige Homologien mit der SEQ ID NO:l untersucht. Diese Untersuchung ergab, daß SEQ ID NO:l keine signifikante Homologie zu irgendeiner anderen DNA-Sequenz in dieser Datenbank aufweist. Lediglich drei kurze EST-Sequenzen weisen eine Homologie von etwa 89% zu SEQ ID NO:l auf. Die ESTs mit der Zugangsnummer AA177794, AA215030 und W62755 sind dabei homolog zu den Nucleotiden 1211-1556, 1711-2049 bzw. 2782-3077 der SEQ ID NO:l. Weitere Informationen zu diesen ESTs sind nicht bekannt.

Um zu bestätigen, daß das zu SEQ ID N0:1 gehörende Gen bevorzugt in ischämischem Myokard exprimiert wird, wurde eine DNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l als 00/28023

Sonde verwendet, um die Expression dieses Gens im Schweineherz zu überprüfen. Die statistische Analyse ergibt, daß die Expression des Gens im Schweineherz tatsächlich infolge von Ischämie/Reperfusion erhöht ist. Es wurden zwei RNA- Transkripte nachgewiesen, deren Größe etwa 6 und 8 kBp betrug. Weiterhin wurde die Expression des entsprechenden Gens in anderen Organen überprüft, und es wurde nachgewiesen, daß die Messenger-RNA in Herz, Leber, Lunge, Niere, Milz, Darmgewebe, Gehirn und Skelettmuskulatur exprimiert wird.

Insbesondere betrifft die Erfindung DNAs, die die kodierende Sequenz der SEQ ID NO:l oder aber einen Teil der kodierenden Sequenz der SEQ ID NO:l umfassen. Unter einem "Teil der kodierende Sequenz der SEQ ID NO:l" soll ein DNA-Fragment verstanden werden, das in der Lage ist, unter strin- genten Bedingungen an den kodierenden Abschnitt gemäß SEQ ID NO:l zu hybridisieren.

Ebenfalls mittels des Verfahrens des Differential Displays wurden Nucleinsäuren mit Sequenzen gemäß der SEQ ID NO: 3, NO:4, NO: 5 und NO: 6 identifiziert. Bei SEQ ID NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6 handelt es sich somit ebenfalls um cDNAs. SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO : 5 sind dabei Teilsequenzen einer einzelnen, durch Differential Display aufgefundenen cDNA. Die Sequenzanalyse der SEQ ID NO: 3, NO: 4 und NO: 5 ergab, daß diese keinerlei signifikante Homologie zu irgendeinem anderen Gen aufweisen. Die Expression der Gene, von denen die cDNAs der SEQ 'IDs NO : 3 , NO: 4 und NO: 5 abgeleitet wurden, sind ebenfalls im Schweinegewebe infolge von Ischämie/Re- O 00/28023

perfusion in signifikanter Weise im Vergleich zu nichtischämischem Myokardgewebe erhöht. Im Vergleich zu nicht- ischämischem Myokardgewebe ist ihre Expression zweifach (SEQ ID NO:3) bzw. l,9fach (SEQ ID NO:4 und 5) erhöht. Erneut ergab eine Untersuchung der Gesamt-RNA anderer Gewebe, daß die Gene, von denen SEQ ID NO: 3, NO: 4 und NO: 5 abgeleitet sind, in Herz, Leber, Lunge, Darm, Hirn, Niere und Skelettmuskel exprimiert werden.

Die Erfindung betrifft somit insbesondere die Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO : 3 , NO: 4 , NO: 5 und NO: 6. In Kenntnis der Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO: 3, NO:4, NO: 5 und NO: 6 ist es für den Fachmann völlig problemlos, beispielsweise unter Verwendung einer PCR-Reaktion und geeigneten Primern die entsprechenden cDNAs aus einer geeigneten Genbank zu amplifizieren und anschließend zu klonieren. Mutationen in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO : 3 , NO:4, NO: 5 und NO: 6 können mittels dem Fachmann bekannter Verfahren eingeführt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin auch die zu den SEQ ID NO:l, NO:3, NO : 4 , NO : 5 und NO : 6 komplementären Stränge.

Weiterhin umfaßt die Erfindung auch die DNA-Sequenzen, die mit einer der Sequenzen SEQ ID NO:l, NO: 3, NO:4, NO: 5 oder NO: 6 oder den dazu komplementären Strängen unter stringen- ten Bedingungen hybridisieren können. Insbesondere umfaßt die Erfindung DNAs,. die unter stringenten Bedingungen mit der kodierenden Region gemäß SEQ ID NO:l hybridisieren können. Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich auf O 00/28023

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Hybridisierungsbedingungen bzw. auf nachfolgende Waschvorgänge, die der Fachmann üblicherweise als "stringent" bezeichnet (siehe z.B. T. Maniatis et al . , Molecular Cloning (Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Laboratory 1982, pp. 387-389) . Ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine derartige Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung mit 4 X. SSC bei 65°C, gefolgt von einer Stunde Waschen in 0,1 X SSC bei 65°C. Ein alternatives Beispiel für stringen- te Hybridisierung ist eine Hybridisierung in 50% Formamid und 4 X. SSC bei 42 °C. Die Erfindung betrifft weiterhin DNAs, die letztlich für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren wie die SEQ ID NO:l, NO: 3, NO: 4 oder NO: 5, oder aber für Muteine, fusionierte Proteine oder funktioneile Derivate davon, die jedoch aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Sequenz ID NO:l, NO:3, NO:4 oder NO: 5 unterschiedlich sind. Möglicherweise würde eine derartige DNA unter stringenten Bedingungen nicht an die DNA-Sequenzen der SEQ ID NO:l, NO: 3, NO: 4 oder NO: 5 hybridisieren, obwohl sie unter Umständen für ein in der Proteinsequenz identisches Protein kodieren würde. Die Erfindung umfaßt daher auch die DNAs, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht befähigt sind, mit einer der cDNA- Sequenzen der SEQ ID NO:l, NO: 2, NO: 3, NO:4, NO: 5 oder NO: 6 zu hybridisieren. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind dabei bevorzugt DNA-Sequenzen, die vom Schwein, dem Menschen, dem Kaninchen, der Maus oder einem anderen Wirbeltier abgeleitet sind. Hybridisierungsexperimente mit einer Nucleinsäure der SEQ ID NO:l mit DNA aus Menschen, Schweinen, Kaninchen und Maus zeigten, daß das entsprechende Gen O 00/28023

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in diesen Arten in hohem Maße konserviert ist. Die Erfindung betrifft daneben auch synthetische Gene.

Die Erfindung betrifft insbesondere erfindungsgemäße DNA- Sequenzen, die für ein Protein kodieren, das in der Lage ist, bei der ischämischen Präkonditionierung mitzuwirken, insbesondere aber Proteine, die bei der ischämischen Präkonditionierung des Herzens eine Rolle spielen: Wie bereits oben ausgeführt und wie in der Beispielsektion noch im einzelnen ausgeführt werden wird, sind die den SEQ IDs NO:l, N0:2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO : 6 entsprechenden Gene des Schweines infolge der Ischämie/Reperfusion induziert bzw. in der Expression verstärkt. Somit müssen die von diesen Genen kodierten Proteine eine Rolle bei der ischämischen Präkonditionierung spielen. Derartige Proteine können Proteine sein, die in nicht durch Ischämie/Reperfusion gestreßten Zellen nicht nachweisbar sind, da die dazugehörigen Gene nicht exprimiert werden. Durch Ischämie/Reperfusion werden die entsprechenden Gene induziert, und dadurch können als Folge dieses Stresses die Proteine nach Ischämie/Reperfusion nachgewiesen werden. Daneben können aber die Proteine, die eine Rolle bei der ischämischen Präkonditionierung spielen, auch Proteine sein, die in geringerer Konzentration auch außerhalb der Phasen der Ischämie/Reperfusion nachweisbar sind, deren Konzentration in der Zelle als Folge einer verstärkten Genexpression aber nach^' Ischämie/Reperfusion erhöht ist. Beispiele derartiger Proteine sind Reparaturproteine, insbesondere Proteine, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur spielen. "Mitwirken bei der ischämischen Präkonditionierung" bedeutet insbesondere, daß O 00/28023

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die betreffenden Proteine in der Lage sind, die Toleranz des Gewebes gegenüber erneuten ischämischen Vorgängen zu erhöhen. In bezug auf das Herz bedeutet ein Mitwirken eines Proteins bei der ischämischen Präkonditionierung insbesondere, daß das Protein in der Lage ist, die Stärke eines Herzinfarktes zu verringern und/oder das Risiko eines Infarktes zu vermindern. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Protein bei einer ischämischen Präkonditionierung mitwirkt, sind dem Fachmann bekannt (Vogt, A.M. , Htun, P., Kluge, A. , Zimmermann, R. und Schaper, W. ; Insulin-Like Growth Factor II Delays Myocardial Infarction in Experimental Coronary Artery Occlusion, Cardiovascular Research 33 (1997), S. 469-477, und Vogt, A.M. , Htun, P., Arras, M. , Podzuweit, T. und Schaper, W. ; Intramyocardial Infusion of Tool Drugs for the Study of Molecular Mechanisms in Ischemic Preconditioning, Basic Res. Cardiol . 91 (1996), S. 389-400). Ein typischer Test zur Bestimmung, ob und inwieweit ein Protein bei der ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitwirkt, kann beispielsweise wie folgt vorgenommen werden: Schweine erhalten während 60 Minuten intramyokardiale Infusionen mit einer Lösung, die das Protein, das bei der ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitwirkt, enthält. Kontrolltiere erhalten ebenfalls intramyokardiale Infusionen, allerdings lediglich mit einem Puffer (z.B. Krebs-Hanseleit-Puffer) . Auch in diesem Fall beträgt die Injektionszeit 60 Minuten. Anschließend werden bei Tieren aus beiden Gruppen die linken vorderen absteigenden Koro- nararterien während 60 Minuten beispielsweise durch eine Ligatur verschlossen (Okklusion) , gefolgt von 120 Minuten Reperfusion. Danach wird die linke vordere absteigende Ko- 00/28023

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ronararterie erneut verschlossen, und es wird Natriumfluo- rescein intravenös als Bolus injiziert. Nach Töten der Tiere wird das linke Ventrikel in Scheiben geschnitten. Ischämische Regionen können beispielsweise als nicht-fluoreszie- rende Bereiche bei Untersuchung mit Schwarzlicht identifiziert werden. Anstelle des oben beschriebenen Verfahrens können auch fluoreszierende Mikrosphären verwendet werden. Weiterhin kann eine Infarktdiagnose mit Triphenyltetrazoli- umchlorid (TTC) oder aber durch Co-Infusion von Propidiumi- odid und dem zu untersuchenden Protein erfolgen (Vogt et al., 1996 a.a.O.). Detaillierte Hinweise auf Verfahren zur Bestimmung, ob ein Protein eine Rolle bei der ischämischen Präkonditionierung spielt, finden sich in der Beispielsektion. Ein Protein besitzt dann die Fähigkeit, bei einer ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitzuwirken, wenn Tiere, die mit dem betreffenden Protein vorbehandelt wurden, in dem eben beschriebenen Testsystem kleinere Infarktbereiche, insbesondere kleinere nekrotische Bereiche, aufweisen als Kontrolltiere, die mit dem entsprechenden Protein nicht vorbehandelt wurden.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine wie oben definierte DNA-Sequenz zusammen mit anderen DNA-Sequenzen, die die Expression ermöglichen. Dazu wird die entsprechende DNA, insbesondere der kodierende Bereich der SEQ ID N0:1, funktio- nell mit transkriptionellen und translationellen regulatorischen Sequenzen verbunden. Transkriptionelle regulatorische Sequenzen sind beispielsweise Promotoren, Enhancer und Terminationssignale, wie auch Spleißsignale. Translationelle regulatorische Sequenzen sind beispielsweise die RNA- O 00/28023

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Stabilität erhöhende oder modifizierende Sequenzen, RNA- Promotoren und dergleichen.

Bei den Sequenzen, die mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO: 2, NO: 3, NO : 4 , NO : 5 oder NO : 6 oder dem komplementären Strang dazu hybridisieren können oder die lediglich aufgrund des genetischen Codes nicht befähigt sind, unter stringenten Bedingungen mit diesen Sequenzen zu hybridisieren, kann es sich um eine genomische DNA-Sequenz oder aber um eine cDNA-Sequenz handeln.

Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:l, NO: 3, NO:4 oder NO : 5. Am meisten bevorzugt sind DNAs, die den kodierenden Bereich gemäß SEQ ID NO:l enthalten. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Varianten der kodierenden Sequenz gemäß SEQ ID NO:l, insoweit diese Varianten entweder für ein Protein kodieren, das bei der ischämischen Präkonditionierung eine Rolle spielt, oder/und unter stringenten Bedingungen mit dem kodierenden Bereich gemäß SEQ ID NO:l hybridisieren können. Beispiele von Varianten sind DNAs, bei denen ein oder mehrere Nucleotide des kodierenden Bereichs gemäß SEQ ID NO:l deletiert oder durch ein anderes Nucleotid substituiert sind. Bevorzugt weisen diese Varianten eine Homologie auf Nucleotidebene von mehr als 50%, bevorzugt mehr als 60%, bevorzugter mehr als 70%, bevorzugter mehr als 80% und am meisten bevorzugt von mehr als 90% auf. Diese Homologien treten bevorzugt in einem Bereich von mehr als 100 Nucleo- tiden, bevorzugt mehr als 500 Nucleotiden, bevorzugter mehr als 1000 und am bevorzugtesten von mehr als 1500 Nucleoti- „,„„_Λ„, O 00/28023

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den auf. Weitere Beispiele der erfindungsgemäßen Varianten sind Varianten, die zur SEQ ID NO : 1 eine Homologie von mehr als 70% in einem Bereich von mehr als 500 Nucleotiden, bevorzugt eine Homologie von 70% in einem Bereich von mehr als 1000 Nucleotiden, bevorzugter eine Homologie von mehr als 70% in einem Bereich von 1500 Nucleotiden, aufweisen. Die erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere der kodierende Bereich gemäß SEQ ID NO : 1, können zudem mit beliebigen anderen DNA-Fragmenten fusioniert sein.

Darüberhinaus sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung DNA-Varianten der SEQ ID NO:l, die lediglich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht an die SEQ ID NO:l hybridisieren können, die aber immer noch für ein Protein kodieren, das bei der ischämischen Präkonditionierung eine Rolle spielen kann.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Expressionsvektor, der eine erfindungsgemäße DNA, insbesondere die kodierende Region der SEQ ID NO:l, enthält. Diese Vektoren können zudem regulatorische Sequenzen in funktioneller Verbindung mit den oben definierten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten, so daß die Expression der erfindungsgemäßen DNA möglich ist. Der Expressionsvektor kann zudem einen bakteriellen Replikationsursprung, wie z.B. den ColEl-Origi,n von Escherichia coli, enthalten, so daß eine Replikation des Expressionsvektor in Bakterien möglich ist. Weiterhin kann der Expressionsvektor Sequenzen enthalten, die eine Persi- stenz des Vektors in eukaryonten Zellen ermöglicht. Hier kann es sich beispielsweise um ein episomales Replikations- O 00/28023

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signal handeln, wie z.B. den Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus . In diesem Fall muß der Expressionsvektor zusätzlich noch ein Gen für die die Persistenz aufrechterhaltenden Gene, die zur Erkennung des Epstein-Barr- Origin of Replications benötigt werden, enthalten. Der Expressionsvektor kann auch ein Integrationssignal enthalten, das die Integration des Plasmides in das Genom eukaryonter Zellen ermöglicht.

Bevorzugte prokaryonte Plasmide sind pBR322-Derivate, bevorzugte eukaryonte Vektoren schließen virale Vektoren, wie z.B. BPV, Vaccinia oder SV40, 2-Micron-Plasmide oder ihre Derivate ein.

Die erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere die Nucleinsäure- sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO:3, NO:4, NO : 5 oder NO: 6, können u.a. auch als DNA-Sonden dienen, die in der Lage sind, mit einer RNA zu hybridisieren, die von einer erfindungsgemäßen DNA durch Transkription gebildet wurde. Die erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere die Nucleinsäuren gemäß SEQ ID NO:l, NO: 3, NO:4, NO : 5 und NO : 6 , können weiterhin dazu verwendet werden, die entsprechenden natürlichen DNAs bzw. Gene und die von diesen Genen transkribierten RNAs nachzuweisen. Auf diese Art und Weise können die erfindungsgemäßen DNAs dazu verwendet werden, die Stärke der Expression der betreffenden Gene in verschiedenen Geweben nachzuweisen. Die hierzu benötigten Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere ist hier die in-situ-Hybri- disierung, die in-situ-PCR, quantitative Northern-Hybridisierung, quantitative RNA-PCR usw. zu nennen. Es ist für _ΛΛ ,„„„„, O 00/28023

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einen Fachmann offensichtlich, daß als Hybridisierungssonde außer den erfindungsgemäßen DNAs auch RNAs einer entsprechenden Nucleinsäuresequenz verwendet werden können. Diese RNAs sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Eine Hybridisierung kann zudem auch zu dem Zweck erfolgen, das Vollän- ge-Gen oder das vollständige genomische Gen zu den Nuclein- säuresequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO: 3, N0:4, NO: 5 und NO: 6 zu isolieren. Die beschriebenen Verwendungen als Hybridisierungssonde sind zudem nicht einschränkend, sondern es ist jede Verwendung der erfindungsgemäßen DNA oder entsprechender erfindungsgemäßer RNAs als Hybridisierungssonde Gegenstand dieser Erfindung. Die Durchführung von Hybridisie- rungsversuchen ist dem Fachmann bekannt . Beispiele für Hy- bridisierungsbedingungen finden sich an anderer Stelle in dieser Anmeldung sowie in dem Abschnitt "Beispiele".

Die Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der die erfindungsgemäße DNA enthält . Geeignete Wirtszellen sind prokaryonte oder eukaryonte Wirtszellen. Bevorzugte prokaryonte Wirtszellen sind beispielsweise Bakterien, wie Escherichia coli, Bazillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Seratia etc. Der bevorzugte prokaryonte Wirt ist E. coli. Beispiele für E. co- li-Stämme sind E. coli K12 Stamm 94 (ATCC 31446) und E. coli X1776 (ATCC 31537) . Bevorzugte eukaryonte Wirtszellen sind Säugetierzellen, wie z.B. menschliche Zellen, Affenzellen, Mauszellen und chinesische Hamster-Eierstockzellen (Chinese harnster ovary; CHO) , da in diesen Zellen in der Regel eine korrekte posttranslationelle Modifikation stattfindet, die Proteine sich in korrekter Weise falten, eine 00/28023

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korrekte Ausbildung von Disulfidbindungen erfolgt, wie auch eine korrekte Glycosylierung. Weitere geeignete Zellen sind Hefezellen und Insektenzellen. Um eine Selektion in den Wirtszellen zu ermöglichen, können die Expressionsvektoren geeignete Selektionsmarkergene enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Proteine, die von einer der erfindungsgemäßen DNAs exprimiert werden. Es handelt sich somit also unter anderem um Proteine, die von einer DNA-Sequenz, ausgewählt aus (a) einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, NO:3, NO:4, NO: 5 oder dem jeweils komplementären Strang dazu, (b) einer DNA-Sequenz, die mit einer der Sequenzen unter (a) oder Fragmenten davon unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, oder (c) einer DNA, die lediglich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht befähigt ist, unter stringenten Bedingungen mit einer unter (a) definierten Sequenz zu hybridisieren, codiert werden. Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Protein ist das von der cDNA mit der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l abgeleitete Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2. Dieses Protein wird in dieser Anmeldung manchmal als gp67 bezeichnet. Das entsprechende Gen wird bevorzugt in Herz exprimiert, das durch Ischämie/Perfusion in Streß versetzt wurde.

Dieses Protein enthält 608 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von etwa 67 kd. Das Protein enthält zwei N-gebundene Glucosylierungsstellen. Da die Kodonse- quenz für die N-gekoppelte Glycosylierung ein Tripeptid der Sequenz NXS/T aufweist (wobei X jede Aminosäure außer Pro- lin ist) , sind die Aminosäuresequenzen NRS von Aminosäurerest 221-223 und NNS von 469 bis 471 zwei mögliche N-ge- koppelte Glycosylierungsstellen. (In dieser Anmeldung sind die Aminosäuren z.T. unter Bezugnahme auf den Ein-Buchsta- ben-Code bezeichnet.) Zusätzlich enthält die Sequenz eine mögliche cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphory- lierungsstelle (Konsensussequenz: R/K(2) -X-S/T) , acht mögliche Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen (Konsensussequenz: S/T-X-R/K) , zehn mögliche Caseinkinase-II-Phospho- rylierungsstellen (Konsensussequenz: S/T-X-X-D/E) und zwei mögliche N-Myristylierungsstellen [Konsensussequenz : G-X (wobei X jede Aminosäure mit Ausnahme von E oder D, R, K, H, P, F, Y, W ist) -X-X-S/T/A/G/C/N-X (jede Aminosäure außer P) ] . Das Protein weist keine wesentliche Homologie zu irgendeinem bekannten Protein auf. Das Molekül weist außerdem mögliche ATP/GTP-Bindungsstellen auf. Hierbei handelt es sich um die Sequenzmotive AGLSTMKT und AARLERKT, die eine signifikante Ähnlichkeit zu dem ATP/GTP-P-Loop-Motiv der allgemeinen Sequenz A/GXXXXGKS/T haben. Zudem besitzt das Protein außer dem P-Loop-Motiv auch .die Kernsequenz DXXG der G3-Region, die bei allen GTPasen konserviert ist. So findet sich die Aminosäuresequenz DMRG an den Positionen 457-460. Da die Hydrophilizitätsberechnung der 608 Aminosäuren zeigt, daß das Polypeptid vollständig hydrophil zu sein scheint und keinen langen hydrophoben Abschnitt aufweist, wodurch der Schluß naheliegt, daß dieses Protein wahrscheinlich kein Transmembranprotein ist. Der vorher berechnete isoelektrische Punkt des Proteins beträgt 6,74. Aufgrund dieser Sequenzmotive kann davon ausgegangen werden, daß das Protein mit der SEQ ID NO: 2 eine Rolle bei Re- paraturprozessen, insbesondere bei der DNA-Reparatur, spielt .

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, sowie ein Mutein, ein fusioniertes Protein oder ein funktionelles Derivat der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 sowie ein Protein, das einen Teil der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist, oder ein Mutein davon. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 ist dabei von der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l abgeleitet. Daneben betrifft die Erfindung alle DNAs, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren.

Muteine in der hier verwendeten Bedeutung bezieht sich auf Analoga der SEQ ID NO: 2, bei denen

(i) eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, und/oder

(ii) eine oder mehrere Aminosäuren deletiert wurden, und/oder

(iii) eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz hinzuaddiert wurden.

Insbesondere erfaßt die Erfindung derartige Proteine, Muteine, fusionierte Proteine, funktioneile Derivate oder Proteine, die einen Teil der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen, die noch in der Lage sind, bei der ischämischen Präkonditionierung mitzuwirken. Derartige Muteine 00/28023

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können nach bekannten Verfahren und/oder durch ortsspezifische Mutageneseverfahren oder andere bekannte Techniken hergestellt werden. Ein derartiges Mutein hat vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die insoweit verändert wurde, daß die Funktion des entsprechenden Proteins noch aufrechterhalten werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzt ein derartiges Mutein eine wenigstens 40%ige Identität oder Homologie in bezug auf die Sequenz gemäß SEQ ID NO:2. Bevorzugter beträgt die Homologie wenigstens 50%, wenigstens 60 , wenigstens 70%, wenigstens 80% oder am bevorzugtesten wenigstens 90%. Bevorzugte Aminosäureaustausche in den Muteinen sind sogenannte "konservative Substitutionen" . Diese schließen synonyme Aminosäuren-Substitutionen innerhalb einer Gruppe ein, die ausreichend ähnliche physi- kochemische Eigenschaften haben, so daß die Substitution zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls aufrechterhalten läßt. Beispiele für bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt:

O 00/28023

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Tabelle 1

Bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren

Ebenso können Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren vorgenommen werden, ohne daß die Funktion des Proteins ver- O 00/28023

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ändert wird. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Insertionen oder Deletionen lediglich einige wenige Aminosäuren, z.B. weniger als 100, umfassen, vorzugsweise weniger als 50, bevorzugter weniger als 25, besonders bevorzugt weniger als 10, und dabei nicht Aminosäuren ausgetauscht werden, die für die Funktion kritisch sind, wie die oben beschriebenen cAMP-cGMP-abhängigen Proteinkinase-Phosphory- lierungsstellen. Beispiele zur Herstellung von Aminosäuresubstitution in den erfindungsgemäßen Proteinen sind in den US-Patenten 4,959,314, 4,588,585 und 4,737,462 beschrieben.

Der Begriff "fusioniertes Protein" bezieht sich auf Poly- peptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen, oder Muteine davon, die mit einem anderen Protein oder mit einem Peptid fusioniert sind. Als Peptide kommen beispielsweise sogenannte TAGs in Frage, mit denen beispielsweise die Aufreinigung des Proteins erleichert ist, wie z.B. ein HIS-TAG (Quiagen, Deutschland) oder kurze Peptide, die Epitope enthalten, über die ein Nachweis oder eine Reinigung des Fusionsproteins mit entsprechenden Antikörpern möglich ist . Als anderes Protein kommen beliebige Proteine in Frage, beispielsweise Proteine, mit denen die Verweildauer in Körperflüssigkeiten erhöht werden kann. Unter den Begriff fusionierte Proteine fallen im weiteren auch erfindungsgemäße Proteine, die mit anderen chemischen Verbindungen fusioniert wurden, wie z.B. mit Polyethylen- glykol (PEG) . Auf diese Art und Weise kann die Verweildauer in Körperflüssigkeiten ebenfalls erhöht werden. O 00/28023

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Unter dem Begriff "funktioneile Derivate" der Proteinsequenzen der SEQ ID NO: 2, der entsprechenden fusionierten Proteine oder der entsprechenden Muteine sollen Derivate verstanden werden, die z.B. dadurch hergestellt werden können, daß die funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten oder die N- oder C-terminalen Gruppen modifiziert werden. Funktionelle Derivate dieser Art sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung, so lange durch die Derivatisierung die biologische Aktivität der Proteine nicht zerstört wird und so lange durch die Modifikationen keine toxischen Proteine entstehen. Derartige Derivate können z.B. die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, Muteine oder fusionierte Proteine davon sein, die mit Polyethylenseitenketten modifiziert wurden, wodurch beispielsweise antigene Epitope maskiert werden können, wodurch die Verweilzeit des entsprechend modifizierten Polypeptids in Körperflüssigkeiten erhöht werden kann. Andere Derivate schließen aliphatische Ester von Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen (durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen) , N-Acylderivate , freie Aminqgruppen der Aminosäurereste, die mit Acylgruppen gebildet wurden (z.B. Alkanoyl oder carbocyclische Aroylgruppen) , oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen, die mit mit Acylgruppen gebildet wurden (z.B. Derivate der Seryl- oder Treonylreste) , ein. Die oben gegebenen Definitionen für Muteine, fusionierte Proteine und funktioneile Derivate ist so zu verstehen, daß in einem Molekül gleichzeitig mehrere Modifikationen im Vergleich zu der ursprünglichen Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 2 auftreten können. So ist es beispielsweise möglich, daß ein Protein an manchen Aminosäurepositionen deletiert ist, daß an anderer Stelle eine oder mehrere Aminosäuren gegen andere Aminosäuren ausgetauscht wurden, daß ein oder mehrere zusätzliche Aminosäuren hinzugefügt wurden und ein derartiges Molekül mit einem zweiten Protein fusioniert wurde. Derartige, für den Fachmann offensichtliche Modifikationen der ursprünglichen Aminosäuresequenz sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung.

Unter einem Protein, daß einen Teil der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO : 2 aufweist, sollen Proteine oder Peptide verstanden werden, die wenigstens einen kontinuierlichen Abschnitt von 10% der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 besitzen. Bevorzugt sind Proteine, die mehr als 40%, bevorzugter sind Proteine, die mehr als 60%, und besonders bevorzugt sind Proteine, die mehr als 80% der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 in kontinuierlicher Sequenz aufweisen. Muteine dieser so definierten Proteine sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung, das heißt also, Proteine, die wie oben definiert, beispielsweise Substitutionen, Additionen oder weitere Deletionen der wie gerade definierten Aminosäuresequenz aufweisen können.

Die erfindungsgemäßen Proteine sind bevorzugt Proteine, die bei der ischämischen Präkonditionierung, insbesondere der ischämischen Präkonditionierung des Herzens, eine Rolle spielen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten Proteins. Hierzu wird der Fachmann mittels Verfahren, die auf dem Fachgebiet O 00/28023

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üblich sind, zunächst eine DNA herstellen, die für das gewünschte Protein mit der gewünschten Aminosäuresequenz kodiert. Diese DNA wird, basierend auf gängigen Methoden, in einen geeigneten, wie oben definierten Expressionsvektor insertiert, der wiederum in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Diese Wirtszelle wird nun unter geeigneten Kultivierungsbedingungen kultiviert, so daß die Expression des Proteins ermöglicht wird. Zur Expression des Proteins kann die DNA-Sequenz und dadurch auch die Proteinsequenz so modifiziert werden, daß das Protein durch Anfügen eines Si- gnalpeptids in das Medium sekretiert wird. In diesem Fall kann die Isolierung des Proteins aus dem Medium erfolgen. Wird ein derartiges Sekretierungssignal nicht an die Proteinsequenz angefügt, so wird das Protein im Zellinneren akkumulieren. In diesem Fall wird der Fachmann mittels gängiger Verfahren eine Isolierung des Proteins aus der betreffenden Wirtszelle vornehmen. Verfahren zur Reinigung des Proteins sind dem Fachmann bekannt und schließen chromatographische Trennschritte (Anionenchromatographie, re- verse Phasenchromatographie etc.), Gelfiltration, elektro- phoretische Auftrennungen, Ammoniumsulfatfällungen, Dialyse, Affinitätschromatographie etc. ein.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Antikörper gegen die oben definierten erfindungsgemäßen Proteine. Der Begriff "Antikörper" schließt polyklonale Antikörper, mono- klonale Antikörper, chimäre Antikörper, anti-idiotypische Antikörper gegen Antikörper ein. Die Antikörper können entweder vollständige Moleküle oder Antikörperfragmente, wie beispielsweise das Fab-Fragment sein. O 00/28023

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Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren gewonnen werden können, die mit einem Antigen immunisiert wurden. Ein monoklonaler Antikörper besteht aus einer im wesentlichen homogenen Population von Antikörpern, die für ein Antigen spezifisch sind, wobei die Population im wesentlichen identische Epitopbindungsstellen aufweist. Monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper können nach dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden. In bezug auf monoklonale Antikörper siehe z.B. Kohler und Millstein, Na- ture 256:495-497 (1975) und US-Patent Nr. 4,376,110. Antikörper können von jeder Immunglobulinklasse einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA oder irgendeiner Subklasse davon sein.

Ein Anti-Idiotyp-Antikörper ist ein Antikörper, der Determinanten erkennt, die mit der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein Anti-Idiotyp-Antikörper kann durch Immunisierungs. eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z.B. Mausstamm) wie die Quelle des monoklonalen Antikörpers mit dem monoklonalen Antikörper gegen den der Anti-Idiotyp-Antikörper gebildet werden soll, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird gegen den monoklonalen Antikörper einen Antikörper bilden, der gegen die idiotypischen Determinanten des monoklonalen Antikörpers gerichtet ist . In diesem Zusammenhang wird auf das US-Patent Nr. 4,699,880 verwiesen. Beispiele für Antikörperfragmente sind, wie bereits erwähnt, das Fab- und das F (ab ') -Fragment, die in der Lage sind, Antigene zu binden. Den Fab- bzw. F (ab' ) -Fragmenten fehlt der F_c-Fragmentteil 00/28023

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des intakten Antikörpers. Die erfindungsgemäßen Antikörper einschließlich der Antikörperfragmente können verwendet werden, um in quantitativer oder qualitativer Weise die wie oben definierten Proteine nachzuweisen. Bevorzugt können die Antikörper z.B. verwendet werden, um die Expression, d.h. die Bildung eines Proteins gemäß der SEQ ID NO: 2, in Zellen nachzuweisen. Ein derartiger Nachweis kann durch Immunfluoreszenzverfahren unter Verwendung eines fluoreszenz- markierten Antikörpers, verbunden mit Lichtmikroskopie, Flußzytometrie oder fluorometrischem Nachweis, erfolgen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können somit auch histolo- gisch, beispielsweise in der Immunfluoreszenz oder in der Immunelektronenmikroskopie, zum in-situ-Nachweis eines wie oben definierten Proteins usw. verwendet werden. Der in- situ-Nachweis kann durch Entnahme einer Probe des betreffenden Gewebes aus einem Patienten und Verwendung eines markierten proteinspezifischen Antikörpers erfolgen. Auf diese Weise kann nicht nur das Vorhandensein eines wie oben definierten Proteins oder verwandter Proteine, sondern auch die Verteilung des Proteins in untersuchtem Gewebe bestimmt werden. Derartige histologische Assays umfassen die Inkubation einer biologischen Probe, wie z.B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextraktes, frisch geernteter Zellen oder Zellen, die in Zellkultur inkubiert wurden, in Gegenwart eines Antikörpers, der an die entsprechenden Proteine bindet, gefolgt von dem Nachweis des gebundenen Antikörpers mit einem weiteren markierten Antikörper. Alternativ ist es auch möglich, daß der erste Antikörper bereits markiert ist, so daß er direkt nachgewiesen werden kann. O 00/28023

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Die Antikörper können weiterhin verwendet werden, um Proteine in einem Proteinextrakt nachzuweisen. Derartige Verfahren, wie z.B. die Western-Blot-Verfahren, sind dem Fachmann bekannt .

Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung des Antikörpers sind Assays, insbesondere enzymgebundene Immunoassays (ELISA) . In diesem Fall wird das Protein in einem in-vitro- Testsystem so nachgewiesen, daß es entweder direkt mit einem Antikörper umgesetzt wird, an den ein Enzym gebunden wird; alternativ kann das Protein mit einem ersten Antikörper umgesetzt werden, der wiederum mit einem zweiten Antikörper, an den ein entsprechendes Enzym gebunden wurde, umgesetzt wird. Wenn der so gebildete Komplex mit einem geeigneten Substrat umgesetzt wird, so kann das Enzym dieses Substrats so umsetzen, daß ein nachweisbares Reaktionsprodukt entsteht, das beispielsweise durch Photometrie, Fluo- rometrie oder durch ein sonstiges optisches Verfahren nachgewiesen werden kann. Beispiele für derartige Enzyme sind die Mallatdehydrogenase, die Alkoholdehydrogenase, die Meerrettichperoxidase, die alkalische Phosphatase usw. Andere üblicherweise verwendete Nachweisverfahren unter Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Zudem können Antikörper verwendet werden, um die Proteine, gegen die sie gerichtet sind, zu reinigen bzw. zu isolieren. Dem Fachmann sind dem- entsprechende Affinitätschromatographische Verfahren bekannt . O 00/28023

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Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein wie oben definiertes Protein umfassen. Da die wie oben definierten Proteine eine Rolle bei der ischämischen Präkonditionierung spielen, können sie geeignet sein, nach Verabreichung in einen Patienten dessen Infarktrisiko zu senken. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Eine Verabreichung kann auf beliebigem Wege erfolgen, beispielsweise intramuskulär, intravenös, subkutan, oral oder mittels Suppositorien. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden zur Verabreichung durch Mischen eines erfindungsgemäßen Proteins oder eines Derivates davon mit physiologisch annehmbaren Trägern oder Stabilisatoren und/oder Exzipienten hergestellt und in Dosisform, z.B. durch Lyophilisierung in Dosierungsgefäßen, hergestellt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein wie oben definiertes Protein zur Verwendung als Arzneimittel. Diese Proteine können beispielsweise zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Prävention von Herzinfarkten oder örtlichen kontraktilen Dysfunktionen verwendet werden.

Das Plasmid pBlue-gp67 in E. coli wurde am 05.11. 1998 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Deutschland, unter der Nummer DSM 12473 hinterlegt. Dieses Plasmid enthält als Basisvektor das Plasmid pBlueskript SK (Strata- gene, Heidelberg, Deutschland) und ein 3,5 Kbp EcoRI-XhoI- Insert, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO:l umfaßt. O 00/28023

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Die Erfindung wird im weiteren durch die folgenden, in keiner Weise einschränkenden Beispiele und Figuren erläutert .

Figur 1: Putative Aminosäuresequenz des gp67-Proteins (SEQ ID NO: 2), das durch Analyse des Leserahmens der SEQ ID NO:l abgeleitet wurde

A) . Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist im Einbuchstabencode angegeben. Die angenommenen ATP-GTP-Bindungsstellen sind unterstrichen. Die möglichen N-gebundenen Glucosylie- rungsstellen (NXS/T) sind durch Fettdruck hervorgehoben. B) . Hydrophylizitätsplot der abgeleiteten Aminosäuresequenz des erwarteten gp67-Proteins . Hydrophobe Regionen befinden sich unterhalb der in der Mitte befindlichen waagerechten Linie, während hydrophile Bereiche darüber liegen. Der Plot wurde mit einem Fenster von sieben Aminosäuren [nach dem Verfahren von Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)] ermittelt.

Figur 2: Analyse der Expression des SEQ ID NO:l entsprechenden Gens ("gp67-Gen") durch Northern-Blot-Experimente

A) . Expression des gp67-Gens in ischämischem reperfundier- tem oder nicht-ischämischem Schweinemyokard nach 10 Minuten Ischämie durch Verschluß der linken, vorderen absteigenden Koronararterie, gefolgt von 30 Minuten Reperfusion und erneutem Verschluß während 10 Minuten (10 ' -30 ' -10 • ) bzw. in Kontrollgewebe ("sham"). Als Sonde bei diesem Northern- Blot-Experiment wurde ein radioaktives Fragment aus der Se- quenz gemäß SEQ ID NO:l verwendet. C: Nicht-ischämisches Kontrollgewebe. E: ischämisches/Reperfusions-Experimental- gewebe. B) . Die balkengraphische Darstellung zeigt die statistische Analyse der gp67-Genexpression. Die Daten sind als Mittelwert und Standardabweichung angegeben. C: Nicht- ischämisches Kontrollgewebe. E: ischämisches/Reperfusions- Experimentalgewebe . C) . Northern-Blot-Analyse, die die Ge- websverteilung von gp67-mRNA in Schweineorganen (Herz, Leber, Lunge, Niere, Milz, Darm, Hirn und Skelettmuskulatur) zeigt .

Figur 3: Evolutionäre Konservierung des gp67-Gens

Genomische DNA, die aus dem Menschen (1) , dem Schwein (2) , dem Kaninchen (3) und der Maus (4) gewonnen wurde, wurde mit dem Enzym EcoRI (A) oder PstI (B) gespalten, dann auf ene Nylonmembran transferiert und mit dem EcoRV/Ndel-cDNA- Fragment aus SEQ ID NO:l, enthaltend die gesamte kodierende Sequenz des gp67-Gens, hybridisiert. Die Filter wurden zuletzt in 0,2 x SSC/0,1% SDS bei 60°C während 40 min gewaschen. Marker: Lambda-DNA, mit den Enzymen EcoRI und Hindi- II gespalten.

Figur 4: Bestätigung der differentiellen Expression der Gene, die den cDNAs der SEQ ID NO: 3 und NO:4 entsprechen

A) . Northern-Hybridisierung, die die Expression der Gene zeigt, die den SEQ -ID NO:3 ("W12") und NO:4 ("W28") entsprechen, in ischämischem reperfundiertem oder nicht-ischämischem Schweinemyokard nach 10 Minuten Ischämie durch Ver- Schluß der linken, vorderen absteigenden Koronararterie, gefolgt von 30 Minuten Reperfusion und erneutem Verschluß während 10 Minuten ( "10 ' -30 ' -10 ' " ) , ebenso wie in Kontrollgeweben ("sham") . C: nicht-ischämisches Kontrollgewebe. E: ischämisches/Reperfusions-Experimentalgewebe. Hinweis: Die schwachen Banden über den spezifischen Banden, die SEQ ID NO:4 entsprechen ("W28") , sind Kreuz-Hybridisierungsbanden mit der 18S-rRNA. B) . Statistische Analyse der Genexpression der Gene, die den SEQ ID NO: 3 und NO:4 entsprechen. Im Vergleich mit nicht-ischämischem Myokard war die Expression der Gene, die den SEQ ID NO: 3 und NO: 4 entsprechen, in ischämischem reperfundiertem Myokard in hohem Maße erhöht . Als radioaktive Sonde wurde ein Fragment aus SEQ ID NO: 3 ("W12") bzw. SEQ ID NO:4 ("W28") verwendet.

Figur 5: Northern-Blot-Analyse, die die Expression der Gene, die den SEQ ID NO: 3 und NO:4 entsprechen, in Organen des Schweines zeigt. RNA wurde aus dem Herz-, Leber-, Lunge-, Nieren-, Milz-, Darm-, Hirn- und Skelettmuskelgewebe isoliert, geblotted und mit den cDNA-Fragmenten der SEQ ID NO:3 ("W12") bzw. NO:4 (^»W28¹¹) hybridisiert. Hinweis: Die Banden über den spezifischen Banden sind Kreuz-Hybridisie- rungsbanden mit 18S-rRNA.

Beispiel 1

Tierversuche

Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Physiological Society gehalten. Kastrierte männli- ehe deutsche Hausschweine vom Landrassentyp mit einem Gewicht von 21-39 kg wurden mit Azaperon (2 mg/kg i.m.) se- diert und mit Pentobarbiton (30 mg/kg i.v.) anästhesiert. Nach einer Luftröhrenintubation wurde der Thorax mittels einer Mittenlinien-Thorakotomie eröffnet. Nach 30 Minuten Stabilisierung nach der Operation wurde die linke vordere absteigende Koronararterie (LAD) während 10 Minuten verschlossen (Okklusion) - beispielsweise durch Abbinden des Gefäßes - gefolgt von 30 min Reperfusion, gefolgt von einem erneuten Verschluß während 10 Minuten. Die Schweine wurden unmittelbar nach der zweiten Okklusion (Zeitpunkt: 10 ' -30 ' - 10') oder nach 30 min (Zeitpunkt: 10 ' -30 ' -10 ' -30 ' ) bzw. 90 min (Zeitpunkt: 10 ' -30 ' -10 ' -90 ' ) Reperfusion getötet. Kon- trolloperierte Tiere wurden ohne Verschluß getötet. Experimentelles Gewebe wurde von dem LAD-Bereich und von Kontrollgewebe aus dem Bereich des linken Zirkumflex-Herzarterienbereichs entnommen.

Beispiel 7

Isolierung von RNA und Entfernung von nNA-Kontarrπ naf.ion

Gesamt-RNA wurde durch das Guanidin-Isothiocyanatverfahren isoliert. Um kontaminierende DNA zu entfernen, wurden 50 μg Gesam -RNA bei 37°C während 30 min mit 10 Einheiten rRNasin-RNase-Inhibitor (Promega, Heidelberg, Deutschland, 40 E/μl) , 10 Einheiten RQI-RNase-freie DNase (Promega, 1 E/μl) in 1 x PCR-Puffer II (Perkin-Elmer) , 1,5 mM MgCl₂ gespalten und dann mit Phenol : Chloroform (3:1) extrahiert und in Gegenwart von 0,3 M NaOAc mit Ethanol präzipitiert . ,„„„„., O 00/28023

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Das Pellet wurde in Diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandeltem Wasser aufgelöst .

Beispiel 3

Differential Display - Isolation von cDNAs gemäß SEQ ID NO : 3. 4. 5 und 6

Das Verfahren des Differential Displays wurde eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die als Folge eines koronaren Verschlusses verstärkt exprimiert werden bzw. sogar induziert werden. Dazu wurde RNA aus Herzgewebe isoliert, das, wie in Beispiel 1 beschrieben, einer koronaren Okklusion unterzogen wurde und mit RNA von Kontrollgewebe verglichen, das keinerlei Okklusion unterzogen wurde.

mRNA-Differential Display wurde in zwei parallelen Ansätzen unter Verwendung des Gene ExScreen Primer Kits (BIOMETRA GmbH, Deutschland) durchgeführt. Es wurden 2 μl gereinigte Gesamt-RNA (100 ng/μl) bei 70°C während 10 min mit 2 μl "Downstream Primer" (25 μM) und 3 , 5 μl DEPC-behandeltem Wasser denaturiert. Das Röhrchen wurde sofort auf Eis gegeben, und es wurden 4 μl dNTP-Gemisch (jeweils 100 μM) , 4 μl 5 x Puffer für der ersten Strang (mit dem Superscript-II- Enzym, Life Technologies, Deutschland geliefert) , 2 μl DTT (0,-LM), 0,5 μl rRNasin-RNase-Inhibitor zugegeben und bei Raumtemperatur während 3 min stehengelassen, bevor 2 μl Su- perscript-reverse Transkriptase (Life Technologies, 200 E/μl) zugegeben wurden. Nach 8 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die reverse Transkription bei 35°C während 00/28023

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einer Stunde durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 95°C während 5 min beendet, auf Eis zur sofortigen PCR-Amplifikation gegeben oder bei -20°C gelagert. Die PCR- Amplifikation (DDRT-PCR) wurde durch Herstellung eines Ma- stermixes vorbereitet. Für jedes Primerset wurden 20 μl PCR-Gemisch, enthaltend 1/10 Volumen Erststrang cDNA, 2,5 μM Downstream-Primer, der in der reversen Transkription verwendet wurde, 0,5 μM Upstream-Primer, 2 μM dNTP-Gemisch, 10 μCi ³⁵S-dATP (Amersham, Braunschweig, Deutschland, 10 mCi/ml) unter Verwendung eines GeneAmpl-PCR-Systems 9600 (Perkin-Elmer, Deutschland) amplifiziert . Die Reaktion begann mit einer initialen Denaturierung bei 95°C während 2 min, gefolgt von 40 Runden bei 94°C während 30 s, 40°C während 1 min, 72°C während 30 s und einer zusätzlichen Exten- sionsphase von 5 min bei 72°C. Nach der Amplifikation wurden 3,5 μl PCR-Produkt mit 2 μl Auf ragspuffer (25% Glyce- rin, 0,5% Bromphenol-Blau, 0,5% Xylencyanol) gemischt und durch Elektrophorese auf einem 6%igen nativen Polyacryl- amidgel in 1 x TBE-Puffer bei 60 W konstanter Leistung während 2,5 Stunden aufgetrennt. Das Gel wurde auf ein Stück 3 -MM-Papier übertragen, ohne Fixierung getrocknet, und damit wurde ein Röntgenfilm während drei Tagen bei Raumtemperatur belichtet.

Nach Entwicklung des Films und Auflegen in korrekter Lage auf das Gel wurden cDNA-Banden von Genen, die in differen- tieller Weise exprimiert wurden, identifiziert. Hierzu wurde das Expressionsmuster von Ansätzen aus Gewebe, das einem Verschluß unterzogen wurde, mit dem von Ansätzen verglichen, das aus Gewebe stammt, welches keinem Verschluß un- „,„„„.„ O 00/28023

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terzogen wurde. Die Experimente wurden grundsätzlich mindestens zweimal unabhängig durchgeführt. Die Banden, die auf differentiell exprimierte Gene hinweisen, wurden mit Nadelstichen markiert und die Gelstücke ausgeschnitten. Das Gelstück wurde zusammen mit dem 3 -MM-Papier während 15 min in einem dicht verschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen nach Hydratisierung während 10 min bei Raumtemperatur in 100 μl destilliertem Wasser gekocht. Die cDNA-Fragmente wurden durch Ethanolfällung in Gegenwart von 0,3 M NaOAc, 50 μg Glycogen gefällt und in 10 μl destilliertem Wasser aufgelöst. 4μl eluierte DNA in einem Reaktionsvolumen von 40 μl wurde unter Verwendung des gleichen Primersets erneut amplifiziert; die PCR-Bedingungen waren wie zuvor beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Konzentration des Downstre- am- und des Upstream-Primers 1,0 μM bzw. 0,5 μM betrug und daß 200 μM eines jeden dNTPs eingesetzt wurden und kein Isotop zugegeben wurde. Die entstandenen PCR-Produkte wurden in pCR-Script-Amp-SK- (+) -Vektor entsprechend den Angaben des Herstellers (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) kloniert . Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines AutoRead-Sequenzierungskits und des ALF-automatischen Sequenziergerätes (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) . Die Sequenz wurde durch Computeranalyse analysiert und mit der EMBL-DNA-Datenbank unter Verwendung des FASTA-Programms verglichen. Auf diese Weise wurden die Sequenzen der SEQ ID NO: 3, NO:4, NO: 5 und NO: 6 identifiziert. Diese weisen keine bzw. keine signifikante Homologie zu irgendwelchen bekannten Genen auf. SEQ -ID NO: 4 und NO: 5 sind Teilsequenzen einer vollständigen cDNA-Sequenz . 00/28023

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Beispiel 4

cDNA-Genbankdurchmusterung - Isolierung der cDNA-SEO ID NQ;1

Durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren des Differential Displays werden cDNAs gewonnen, die Genen entsprechen, die in dem analysierten Gewebe in bevorzugter Weise exprimiert werden. Die auf diese Weise gewonnene cDNA-Se- quenzen entsprechen allerdings meist nicht der vollständigen mRNA, und somit ist auch auf diese Weise in der Regel nicht die vollständige kodierende Sequenz des korrespondierenden Gens zu identifizieren. Zum Gewinnen der vollständigen kodierenden Sequenz sollte daher eine Durchmusterung einer cDNA-Genbank erfolgen. Zum Durchmustern einer cDNA- Genbank wurde eine DNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 mittels der Polymerase-Kettenreaktion amplifi- ziert und gleichzeitig markiert. 25 μl eines Gemisches, enthaltend 1 x PCR-Puffer (Perkin-Elmer, Deutschland) , 200 μM dNTP (ohne dCTP) , 2 mM MgCl₂, jeweils 25 pmol eines jeden Primers, 20 ng Matrizen-cDNA-Fragment, 0,5 μl Ampli-Taq- DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, 5 E/μl) und 5 μl α³²P dCTP (Amersham, 10 mCi/ml) wurden bei 94°C während 5 min, gefolgt von 30 Runden bei 94°C (45 s) , 52°C (45 s) , 72°C (1 min) amplifizier . Im Anschluß daran erfolgte noch eine Ex- tensionszeit von 10 min bei dem letzten Zyklus. Nach der Amplifikation wurden nicht-eingebaute Nucleotide und Primer im Überschuß durch -Ethanolfällung in Gegenwart von 4 M Am- moniumacetat entfernt. Eine Schweineherz-cDNA-Genbank in Uni-ZAP XR (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) wurde un- 00/28023

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ter Verwendung der wie oben markierten Sonde durchgemustert. Etwa 4,4 x 10⁵ pfu ("Plaque bildende Einheiten") wurden auf Filter transferiert, die in 50% Formamid, 5 x SSC, 5 x Denhart-Lösung, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und denaturierter Sonde bei 42°C über Nacht hybridisiert wurden. Die Filter wurden zweimal während 15 min in 2 x SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen und dann 15 min in 0,2 x SSC, 0,1% SDS zuerst bei 42°C und dann erneut während 15 min bei 55°C gewaschen. Zuletzt wurde zweimal in 0,2 x SSC/0,1% SDS bei 68°C während einer Stunde gewaschen (hierbei handelt es sich um stringente Hybridisie- rungsbedingungen) . Die Filter wurden zur Exposition eines Röntgenfilms bei -80°C mit einer Belichtungsdauer von 12- 18 h verwendet. Positive Klone wurden gepickt und bis zur Reinheit erneut durchgemustert. Das Herausschneiden des pBlueskript-Phagemids aus dem Uni-Zap XR-Vektor erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Das ausgeschnittene Plasmid wurde als pBluegp67 bezeichnet . Die DNA wurde wie oben beschrieben sequenziert, und die Sequenzdaten wurden erneut unter Verwendung des FASTA-Programms mit der EMBL-Datenbank verglichen.

Bei diesem Experiment wurde zu einem mittels Differential Display aufgefundenen kurzen cDNA-Fragment mit der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 die entsprechende vollständige cDNA-Sequenz erhalten. Diese cDNA-Sequenz ist die SEQ ID N0:1, die in dem Plasmid pBluegp67 enthalten ist. Die daraus abgeleitete Proteinsequenz ist als SEQ ID NO: 2 gezeigt. Beispiel 5

Northern-Blo -Analyse - Bestätigung der differenziellen Expression des der SEQ ID NQ:1. NQ: _r NO : 4 bzw. NO: entsprechenden Gens

Identische Mengen von Gesamt-RNA (20 μg) wurden auf einem 1%-Agarosegel, das 0,6 M Formaldehyd enthält, elektrophore- tisch aufgetrennt. Nach der Größenfraktionierung wurde die RNA auf eine Hybond-N-Nylonmembran (Amersham) mit einer 20 x SSC-Lösung durch Kapillartransfer geblottet und durch UV- Crosslinking immobilisiert (Stratagene) . Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 42 °C mit α-³²P-markierten Sonden (Read- prime DNA Labeling System, Amersham, und α-³²P-dCTP, 3000 Ci/mMol, Amersham) in einem Puffer durchgeführt, der 50% Formamid, 1 x P Puffer (5 x P Puffer: 1% BSA, 1% PVP, 1% Ficoll, 250 mM Tris-HCl, pH 7 , 5 , 0,5% Na-Pyrophosphat , 5% SDS) , 5% Dextransulfat, 1 M NaCl und 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthält . Die Membranfilter wurden dann zweimal in 2 x SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur während 20 min hybridisiert, gefolgt von zwei Waschungen jeweils während 10 min in 0,2 x SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur, bei 42°C bzw. 56°C. Die Filter wurden verwendet, um einen Röntgenfilm unter Verwendung eines verstärkenden Schirms bei -80°C zu belichten. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte unter Verwendung eines Phosphorlmagers (Molecular Dynamics) und der ImageQuant-Software, und Unterschiede, die auf eine unterschiedliche Beladung der Spuren zurückzuführen sind, wurden unter Verwendung eines 18S-rRNA-Sonde normalisiert. Durch derartige Experimente konnte bestätigt 00/28023

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werden, daß die Expression der den SEQ ID NO:l, NO: 3 und NO:4 bzw. NO: 5 entsprechenden Gene in Gewebe, das durch Ischämie/Reperfusion gestreßt wurde, in signifikante Weise im Vergleich zu nicht-ischämischem Myokardgewebe erhöht ist (siehe auch Figuren 2A, B und 4) . Die Expression der den SEQ ID NO: 3 und NO: 4 bzw. NO : 5 entsprechenden Gene war um den Faktor 2 bzw. 1,9 erhöht. Die Expression des der SEQ ID NO:l entsprechenden Genes war in Schweineherzgewebe, das durch Ischämie/Reperfusion gestreßt wurde, um den Faktor 1,7 erhöht. Durch Northern-Blot-Experimente wurde ebenfalls überprüft, ob die den SEQ ID NO:l, NO : 3 und NO:4 bzw. NO : 5 entsprechenden Gene in anderen Geweben als dem durch Ischämie/Reperfusion gestreßten Herzen exprimiert werden (siehe auch Figuren 2C und 5) . Hierzu wurde RNA aus der Leber, der Lunge, der Niere, der Milz, des Darms, des Hirns und des Skelettmuskels von Schweinen isoliert und in bezug auf die Genexpression durch Northern Blot analysiert. Dadurch wurde gezeigt, daß die den SEQ ID NO:l, NO: 3 und NO : 4 bzw. NO: 5 entsprechenden RNAs in allen Geweben exprimiert werden (siehe auch Figuren 2C und 4) .

Beispiel 6

Nachweis der Konservierung der gen t-.i sehen Information gemäß SEQ ID NO:l zwischen verschiedenen Tierarten - Southern-Blo -Analyse

Genomische DNA, die aus dem Menschen, Schweinen, Kaninchen und Maus isoliert wurde, wurde mit den Enzymen EcoRI oder PstI über Nacht gespalten, dann durch Elektrophorese auf O 00/28023

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einem 0, 7%-Agarosegel aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden auf eine Nylonmembran übertragen und mit dem 1,9 kb EcoRV/Ndel cDNA-Fragment der SEQ ID NO:l aus dem Plasmid pBluegp67, das die gesamte kodierende Sequenz des gp67 enthält, hybridisiert. Die Hybridisierung wurde in einer Lösung durchgeführt, die 50% Formaldehyd, 5 x SSC, 5 x Den- hardts Reagenz, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma- DNA enthält, bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Membranen wurden unter den gleichen Bedingungen wie oben hybridisiert, mit der Ausnahme, daß ein Endwaschschritt in 0,2 x SSC/0,1% SDS bei 60° während 45 min erfolgte. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, daß es in allen untersuchten Organismen zu SEQ ID NO:l homologe Gene gibt (siehe auch Figur 3) . Dies ist ein Hinweis darauf, daß das Gen von funktioneller Bedeutung ist .

Beispiel 7

Nachweis der Mitwirkung eines Proteins bei der ischämischen Präkonditionierung

Kastrierte männliche deutsche Hausschweine vom Landrassentyp mit Körpergewichten zwischen 27,5 und 33,5 kg werden mit 2 mg/kg Körpergewicht i.M. Azaperon (Stresnil, Janssen Pharmazeutika, Neuss, Deutschland) , und 2 mg/kg Körpergewicht s.c. Piritramid (Dipidolor, Janssen Pharmazeutika, Neuss, Deutschland) 30 min vor dem Beginn der Anästhesie mit 10 mg/kg Körpergewicht Metomidate (Hypnodil, Janssen Pharmazeutika, Neuss, Deutschland) prämediziert . Nach entweder oraler oder endotrachealer Intubation wird ein Bolus O 00/28023

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von 25 mg/kg Körpergewicht α-Chloralose (Sigma, Deisen- hofen, Deutschland) intravenös gegeben. Die Anästhesie wird durch kontinuierliche intravenöse Infusion von 25 mg/kg Körpergewicht je Stunde α-Chloralose aufrechterhalten. Nach weiterem Präparieren des Herzens, beispielsweise zur Messung des linken Ventrikulardrucks oder des Aortablutdrucks, wird den Tieren eine Stabilisierungsperiode von 20 min gewährt. Die Indexischämie ist eine 60minütige Okklusion (Verschluß) der linken vorderen absteigenden Koronararterie, gefolgt von einer 120minütigen Reperfusion. Kontrolltiere erhalten eine intramyokardiale Infusion von Krebs- Hanseleit-Puffer während 60 Minuten vor der Indexischämie. Zum Austesten einer Mitwirkung eines Proteins bei der ischämischen Präkonditionierung wird eine Lösung dieses Proteins in die Testtiere ebenfalls während 60 min durch intramyokardiale Infusion verabreicht . Nach der Vorbehandlung mit Krebs-Hanseleit-Puffer bzw. der Lösung des zu testenden Proteins erfolgt die 60minütige Okklusion, gefolgt von einer 120minütigen Reperfusion.

Am Ende dieses experimentellen Protokolls wird die linke vordere absteigende Koronararterie erneut verschlossen, und 1 g Natriumfluorescein (Flucka, Neu-Ulm, Deutschland, in 10 ml Kochsalzlösung gelöst) wird als Bolus in das linke Atrium injiziert. Alternativ kann in Tiere auch der DNA-Farbstoff Propidiu iodid in das linke Atrium zusammen mit 250 mg (entspricht 1,5 Mio Kügelchen) ZnCd-fluoreszierende Mi- krosphären einer Größe von 15 μm injiziert werden. Propidiumiodid wird lediglich von nekrotischen Zellen aufgenommen und bindet dort an nukleare DNA; Propidiumiodid kann die intakte Zellmembran nichtnekrotischer Zellen nicht passieren; die fluoreszierenden Mikrosphären markieren den nicht- okkludierten Bereich. Die Infarktdiagnose mit Triphenylte- trazoliumchlorid (TTC) kann zusätzlich in diesen Herzen vorgenommen werden. Nach der Gesamtverteilung des Farbstoffs werden die Tiere durch einen intravenösen Bolus von 20% Kaliumchlorid getötet, um einen Herzstillstand zu erzielen. Das Herz wird herausgeschnitten, und beide Atrien und das rechte Ventrikel werden entfernt. Das. linke Ventrikel wird in Scheibchen entlang der paarweise eingeführten Mikroinfusionsnadeln, rechtwinklig zu der linken vorderen absteigenden Koronararterie geschnitten. Nach dem Wiegen der Scheibchen werden die ischämischen Bereiche als nicht- fluoreszierende Bereiche durch Schwarzlichtuntersuchung oder als nicht-fluoreszierende Bereiche bei einer Anregungswellenlänge von 366 nm (bei Mikrosphären) identifiziert. Der Infarktbereich wird unter Verwendung eines TTC- Färbeverfahrens alleine oder zusätzlich zur Propidiumiodid- fluoreszenz abgegrenzt. Wenn entweder Fluorescein-Natrium oder Propidiumiodid durch Mikroinfusion infundiert werden, werden die gefärbten myokardialen Bereiche ebenfalls bestimmt. Die gefärbten Bereiche werden photographiert . Risikobereiche und Infarktbereiche können außerdem durch native NADH-Fluoreszenz, die bei einer Anregungswellenlänge von 366 nm emittiert und die für das bloße Auge nach 10 min Ischämie verschwindet, bestimmt werden. Nach dieser Zeit erscheint das ischämie/infarktgeschädigte Gewebe schwarz, wodurch die Risikobereiche genau abgrenzbar sind. Die Kombination von Propidiumiodid mit nativer NADH-Fluoreszenz ist eine andere Möglichkeit, um Änderungen in den NADH-Ge- webekonzentrationen für den Nachweis irreversibel geschädigten Myokards nachzuweisen. Genauere Beschreibungen der Verfahren zur Abgrenzung von geschädigtem bzw. nekroti- schem/ischämischem Gewebe finden sich in Vogt et al . , 1996 a.a.O. und Vogt et al., 1997 a.a.O. Substanzen, die bei der ischämischen Präkonditionierung eine Rolle spielen, lassen sich mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren dadurch ermitteln, daß Tiere, die mit dem wirksamen Protein behandelt wurden, kleinere Infarktbereiche aufweisen als Tiere, die lediglich mit Puffer vorbehandelt wurden.

Claims

O 00/2802346PATENTANSPRÜCHE

1. DNA-Sequenz, ausgewählt aus:

(a) einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 oder SEQ ID NO: 5 oder dem jeweiligen komplementären Strang dazu,

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA für ein Protein codiert, das in der Lage ist, bei der ischämischen Präkonditionierung, insbesondere der ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitzuwirken.

3. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zusammen mit anderen DNA-Sequenzen, die die Expression ermöglichen, ausgewählt aus Promotoren, Enhancern, Terminationssignalen oder sonstigen regulatorischen Sequenzen.

4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der DNA-Sequenz um eine genomische DNA-Sequenz handelt .

5. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der DNA-Sequenz um eine cDNA-Sequenz handelt.

6. Expressionsvektor, umfassend eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5. O 00/28023

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7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in funktioneller Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen vorliegt.

8. Wirtszelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 oder 7 enthält .

9. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß es sich um eine eukaryonte Zelle handelt .

10. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß es sich um eine prokaryonte Zelle handelt .

11. Protein, welches von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert wird.

12. Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) Proteinen, die eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO : 2 aufweisen,

(b) Muteinen, fusionierten Proteinen oder funktioneilen Derivaten der in (a) definierten Proteine,

(c) Proteinen, die einen Teil der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen, oder Muteinen oder funktioneilen Derivaten davon, gegebenenfalls in Fusion mit anderen Proteinen oder Peptiden.

13. Protein nach einem der Ansprüche 11 oder 12, das in der Lage ist, bei der ischämischen Präkonditionierung, insbesondere bei der ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitzuwirken.

14. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 11 bis 13, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10 unter Bedingungen, die für die Expression des Proteins geeignet sind, und Isolierung des Proteins.

15. Antikörper gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 13.

16. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß es ein polyclonaler Antikörper ist.

17. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch g e e n n z e i c h n e t , daß es ein monoclonaler Antikörper ist.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 13.

19. Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Verwendung als Arzneimittel.

20. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 11 bis 13 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Prävention von Herzinfarkten oder örtlicher kontraktiler Dysfunktionen.

21. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 15 bis 17 in einem Assay zum Nachweis eines Proteins nach einem der Ansprüche 11 bis 13.

22. Verwendung einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einer RNA, die mit einer dieser DNAs hybridisiert, als Hybridisierungssonde .