-
Gebiet der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft einen neuen monoklonalen Maus-Antikörper gegen
humanes MP52. Genauer betrifft diese Erfindung einen monoklonalen
Maus-Antikörper
gegen humanes MP52, der in der Lage ist, an ein dimeres humanes
MP52 jedoch nicht an ein monomeres humanes MP52 zu binden.
-
Ferner
betrifft diese Erfindung ein Hybridom, das in der Lage ist, einen
oben beschriebenen monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes MP52 zu
produzieren und dessen Verwendung.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Humanes
MP52 wurde erstmals 1994 auf Basis seiner cDNA isoliert als osteogenetischer
Faktor, der der TGF-β-Genfamilie
angehört
(Biochem. Biophy. Res. Comm., Vol. 204, Nr. 2, 1994). Humanes MP52
wird als Protein mit 120 Aminosäureresten
mit Alanin am N-Terminus angesehen und seine Aminosäuresequenz ist
in WO 93/16099 und WO 95/04819 offenbart. Aus verschiedenen Tierversuchen
ist ersichtlich, dass MP52 ähnlich
anderen osteogenetischen Faktoren an der Osteogenese beteiligt ist.
Es sind jedoch noch viele unbekannte Punkte verblieben hinsichtlich
dessen, wodurch MP52 bei der Osteogenese direkt induziert wird und über welchen
Mechanismus Osteogenese abläuft
und zu diesem Thema sind nur wenige Berichte erschienen.
-
Außerdem unterscheidet
sich Maus-MP52 nur in einer Aminosäure der Sequenz an der N-terminalen Stelle
von humanem MP52 und somit ist MP52 von einem Gen abgeleitet, das über Arten
streng konserviert ist, so dass es nicht leicht ist, einen Antikörper für humanes
MP52 aus einer Maus zu erhalten, obwohl in WO 93/16099 berichtet
wurde, dass ein monoklonaler Maus-Antikörper erhältlich ist.
-
Offenbarung
der Erfindung
-
Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen
humanes MP52 bereitzustellen, der in der Lage ist, an ein dimeres
humanes MP52 jedoch nicht an ein monomeres humanes MP52 zu binden.
-
Es
ist versucht worden, humanes MP52 auf gentechnischem Wege zu produzieren.
Bei der Reinigung von humanem MP52, welches hergestellt wurde durch
Inkubation von Wirtszellen, in die für humanes MP52 kodierende cDNA
integriert wurde, hat sich herausgestellt, dass es wirksam ist,
das humane MP52 unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zu
reinigen, der in der Lage ist, spezifisch an humanes MP52 zu binden.
Genauer wird ein monoklonaler Antikörper, der für humanes MP52 spezifisch ist,
auf einem Träger
getragen und mit einem grob gereinigten MP52 in Kontakt gebracht,
um humanes MP52 durch Bindung zu isolieren und anschließend wird
humanes MP52 abgetrennt. In diesem Fall ist es offenbar von Vorteil,
einen solchen monoklonalen Antikörper
zu verwenden, der in der Lage ist, spezifisch an ein dimeres humanes
MP52 zu binden, um das aktive dimere MP52 zu isolieren.
-
Der
monoklonale Antikörper
gegen humanes MP52 kann für
die Quantifizierung vom humanem MP52 verwendet werden. Die Quantifizierung
von humanem MP52 ist nützlich
für die
Erläuterung
von MP52-induzierenden Faktoren und für Untersuchungen des Osteogenese-Mechanismus.
In diesem Fall kann ein dimeres MP52 in einem lebenden Körper zu
einem inaktivierten Monomer oder Fragmenten davon abgebaut werden. Einzig
das aktive dimere MP52 kann unter Verwendung eines monoklonalen
Antikörpers,
der spezifisch an ein dimeres MP52 bindet, detektiert werden.
-
Außerdem stellt
die Erfindung einen Antikörper
bereit, der in der Lage ist, an eine biologisch aktive Stelle von
humanem MP52 zu binden. Das heißt,
es wird ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes MP52 bereitgestellt,
der die Bindung zwischen humanem MP52 und dessen Rezeptor verhindern
kann. Der erfindungsgemäße Antikörper erkennt
spezifisch eine hochgeordnete Struktur von humanem MP52 und bindet an
humanes MP52 an dessen aktive Stelle, um dessen Aktivität zu hemmen.
Da der Antikörper
eine aktive Stelle von humanem MP52 erkennt, erkennt er sogar in
dem dimeren MP52 keinerlei inaktive Teile. Dies ist offensichtlich
von Vorteil, wenn es für
seine Trennung oder Untersuchung angewendet wird.
-
Der
erfindungsgemäße monoklonale
Maus-Antikörper
kann durch die folgenden Schritte entsprechend eines gut bekannten
Verfahrens zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers produziert
werden:
- (1) Sensibilisieren von Mäusen mit
humanem MP52 als Immunogen über
einen längeren
Zeitraum,
- (2) Durchführen
von Zellfusion zwischen Milzzellen von sensibilisierten Mäusen und
Maus-Myelomzellen,
- (3) Screening der resultierenden Hybridoma nach Hybridoma die
einen monoklonalen Antikörper
für humanes
MP52 produzieren,
- (4) Klonieren der gewünschten
Antikörper-produzierenden
Hybridoma,
- (5) Durchführen
einer Kultur der klonierten Zellen in großem Maßstab, um einen Antikörper zu
produzieren oder intraperitoneales Transplantieren der klonierten
Zellen in Mäuse,
um einen Antikörper
zu produzieren, und
- (6) Abtrennen und Reinigen des Antikörpers, der in dem Kulturüberstand
oder den Aszites enthalten ist.
-
Die
folgenden Schritte werden im Folgenden hierin ausführlicher
beschrieben werden.
-
Bei
der Herstellung von immunsensibilisierten Mäusen in Schritt (1) wird eine
Lösung
von humanem MP52 in 10 mM wässriger
Salzsäure
gemischt und mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA) emulgiert und
die resultierende Emulsion wird Mäusen mehrere Male mit einer
Frequenz von 4 Mal pro 4 Monate intraperitoneal verabreicht. Der
Gehalt des MP52 beträgt
geeigneterweise von 10 μg
bis 100 μg.
Nach einem Zeitraum von etwa einem Monat seit der Verabreichung
wird den Mäusen
intraperitoneal eine Lösung
von 10–100 μg humanem
MP52 verabreicht, das gleichermaßen mit einem inkompletten
Freundschen Adjuvans (IFA) emulgiert wurde. Es ist wünschenswert,
den Mäusen,
die kontinuierlich mit humanem MP52 zusammen mit den Adjuvantien
sensibilisiert wurden, nach einem weiteren Zeitraum von ein bis
zwei Monaten subkutan 10–100 μg humanes
MP52 ohne jegliche Adjuvantien zu verabreichen, und wenige Tage
vor Zellfusion wird den Mäusen
weiter 10–100 μg humanes
MP52 intravenös
in die Schwanzvene verabreicht.
-
Die
Herstellung von humanem MP52 wurde unter Verwendung eines Expressionsvektors,
in den die für
das humane MP52 kodierende cDNA integriert ist, und unter Verwendung
von Tierzellen, wie z. B. CHO-Zellen, und Bakterien, wie z. B. Escherichia
coli als Wirt, versucht. Die gegenwärtigen Erfinder haben versucht,
einen monoklonalen Antikörper
herzustellen, indem als sensibilisierendes Antigen humanes MP52,
welches in CHO-Zellen produziert wurde, (im Folgenden hierin als
CHO-MP52 bezeichnet) [die humanes MP52-produzierende Tierzelllinie
MC-2 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency
of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki, Japan) mit der internationalen Hinterlegungsnummer FERM
BP-5142 hinterlegt.) bzw. humanes MP52 welches von Escherichia coli
produziert wurde (im Folgenden hierin als rhMP52 bezeichnet) [ein
Expressionsvektor für
humanes MP52 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki, Japan) mit der internationalen Hinterlegungsnummer FERM
BP-5499 hinterlegt.] verwendet wurde. Bei allen resultierenden Antikörpern handelte
es sich um IgMs mit einer niedrigeren Spezifität. Es gelang den Erfindern
jedoch, einen monoklonalen Antikörper
mit einer höheren
Spezifität
herzustellen, indem sowohl CHO-MP52 als auch rhMP52 als sensibilisierendes
Antigen verwendet wurden.
-
In
der Zellfusion von Schritt (2) wird zunächst die Milz der in Schritt
(1) ausreichend immunsensibilisierten Maus exzidiert und anschließend wird
auf herkömmliche
Weise eine Suspension der Milzzellen hergestellt. Als nächstes wird
eine Mischung der resultierenden Milzzellen und Maus-Myelomzellen
einer Zellfusions-Behandlung unter Verwendung von warmem Polyethylenglycol
unterzogen. Nach der Behandlung werden nicht fusionierte Zellen
aus der Zellmischung entfernt, wobei ein Medium verwendet wird,
welches fötales
Kälberserum
(FCS) und HAT [Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T)]
enthält.
Die resultierende Mischung wird portionsweise in eine 96-Well-Platte
geschüttet
mit einer niedrigen Konzentration (einer Konzentration, in welcher
ein Klon in der Lage ist, sich in einem Well zu vermehren) und nach
einer Woche wird ein Überstand
in dem Well, in dem eine Vermehrung festgestellt wurde, gewonnen.
-
Die
Untersuchung eines Antikörpers
gegen humanes MP52, der in dem Überstand
von Schritt (3) gebildet wurde, kann unter Verwendung einer Platte
mit 96 Wells durchgeführt
werden, die mit humanem MP52 beschichtet sind, welches als Immunogen
verwendet wird, gemäß einem
herkömmlichen
ELISA-Verfahren. Um den Antikörper
für humanes
MP52 zu selektieren, der nicht an ein monomeres humanes MP52, jedoch
an ein dimeres humanes MP52 gebunden ist, werden zwei ELISA-Verfahren
kombiniert, worin 1) unbehandeltes (nichtreduziertes) dimeres humanes
MP52 (D-rhMP52) und 2) reduziertes monomeres humanes MP52 (M-rhMP52) verwendet
werden. In diesem Fall kann das Monomermolekül in einem reduzierten Zustand
leicht das entsprechende Dimer bilden, wenn es auf der Platte beschichtet
ist und daher wird das Monomer, welches für die Beschichtung verwendet
werden soll, auf herkömmliche
Weise sulfoniert, um eine Rückbildung
des dimeren Moleküls
zu verhindern. Weiter wird die spezifische Reaktivität des Antikörpers mit
dem monomeren humanen MP52 und dimerem humanem MP52 nach einem Western
Blot-Verfahren bestätigt.
Als Ergebnis wurden ein monoklonaler Antikörper, der heftig entweder mit
M-rhMP52 oder D-rhMP52 reagiert, und ein monoklonaler Antikörper, der
mit beiden reagiert, erhalten.
-
Die
Spezifität
des monoklonalen Antikörpers
kann durch Western Blot-Verfahren bestätigt werden. Und zwar werden
rhMP52s unter den nicht-reduzierenden Bedingungen (D-rhMP) und den
reduzierenden Bedingungen (M-rhMP) SDS-PAGE unterzogen und anschließend durch
das Standardverfahren zu einer Nitrocellulosemembran transferiert.
Die Nitrocellulosemembran, welche das transferierte rhMP52 trägt, wurde
in dem Kulturüberstand,
der einen monoklonalen Antikörper
enthält,
inkubiert, es wurde durch ein mit HRPO-markiertes Hasenimmunoglobulin
detektiert. Die Ergebnisse stimmten mit denen des primären Screenings mit
dem ELISA überein.
-
Außerdem kann
die Spezifität
durch TGF-β2
und BMP-2, denen humanes MP52 ähnlich
ist, als Antikörper
für das
ELISA auf dieselbe Weise bestätigt
werden. Keiner der erhaltenen monoklonalen Antikörper reagierte sowohl mit dem
TGF-β2 als
auch dem BMP-2.
-
Der
Klonierungsvorgang in Schritt (4) wird durchgeführt, durch portionsweises Schütten bei
0,5 Zellen pro 1 Well, gemäß einem „Limiting
Dilution"-Verfahren.
-
Der
Schritt (5) wird nach einem gut bekannten Verfahren durchgeführt. Im
Vergleich zu dem Fall, bei dem ein kloniertes Hybridom in einem
herkömmlichen
Medium inkubiert wird und ein Antikörper aus dem Kulturüberstand
erhalten wird, kann der Antikörper
durch eine intraperitoneale Transplantation des Hybridoms in Mäuse mit
einer mehrmals hundertfachen bis mehrmals tausendfachen Konzentration
gewonnen werden.
-
Der
Schritt (6) wird nach einem gut bekannten Verfahren durchgeführt. Es
kann eine Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Protein A oder Protein G durchgeführt werden.
-
Die
Merkmale des vorliegenden monoklonalen Antikörpers können, wie im Folgenden gezeigt,
zusammengefasst werden:
- (1) Er ist an ein dimeres
MP52 gebunden.
- (2) Er ist nicht an ein monomeres MP52 gebunden.
- (3) Seine H-Ketten Unterklasse ist γ.
- (4) Er hat nicht mit anderen osteogenetischen Faktoren, die
zur TGF-β-Genfamilie
gehören,
insbesondere TGF-β und
BMP-2, die ähnliche
Aminosäuresequenzen
aufweisen, kreuzreagiert.
-
Die
Reinigung von humanem MP52 unter Verwendung des vorliegenden monoklonalen
Antikörpers kann
gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren durchgeführt
werden. Der vorliegende monoklonale Antikörper wird auf einem Adsorbens,
wie beispielsweise Sephadex (hergestellt von Pharmacia), adsorbiert.
Eine grob gereinigte Lösung
von humanem MP52 wird durch das Adsorbens geleitet, um humanes MP52
zu adsorbieren. Als nächstes
kann das adsorbierte humane MP52 mit einem geeigneten Eluenten auf
herkömmliche
Weise behandelt werden, um humanes MP52 mit einer höheren Reinheit
hervorzubringen.
-
Die
Antikörper
können
durch das Sandwich ELISA-Verfahren unter Verwendung der gereinigten
monoklonalen Antikörper
(20 Spezies von aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 18, 20, 21 und 22) und den jeweils HRPO-markierten monoklonalen
Antikörpern
in Typen klassifiziert werden.
-
Als
Ergebnis davon wurden die monoklonalen Antikörper, welche sich in ihrer
Spezifität
für 10
Spezien von Epitopen unterscheiden, identifiziert. Sie wurden wie
angegeben als Typen A, B, C, D, E, F, G, H, I und J klassifiziert.
-
Es
ist bekannt, dass die Ratten-osteoblastische Zelllinie ROB/C26 einen
Rezeptor für
das humane MP52 besitzt. Es ist bekannt, dass wenn das humane MP52
zu der Kultur dieser Zelllinie zugegeben wird, die Aktivität der alkalischen
Phosphatase (ALP) erhöht
wird. Wenn die gereinigten monoklonalen Antikörper zu der Kultur zugegeben
werden und sie die ALP-Aktivität
hemmen, so bedeutet das, dass sie die biologische Aktivität von humanem
MP52 hemmen.
-
Als
Ergebnis wurde festgestellt, dass die Spezien von aMP-4, 5, 8, 11,
20 und 21 eine starke hemmende Wirkung zeigen. Von den so getesteten
Spezien waren aMP-4
und aMP-5 Antikörper,
die spezifisch mit dem D-rhMP52 reagierten und sie wurden daher
als monoklonale Antikörper
beurteilt, die in der Lage waren, die MP52/MP52-Rezeptor-Bindung
unter physiologischen Bedingungen wesentlich zu hemmen.
-
Die
Quantifizierung von humanem MP52 unter Verwendung des vorliegenden
monoklonalen Antikörpers
kann durch ein gut bekanntes ELISA-Verfahren durchgeführt werden.
Spezifische Beispiele dafür
sind ebenfalls als Beispiele in der vorliegenden Beschreibung offenbart.
Die Quantifizierung von humanem MP52 kann mit einer so niedrigen
Sensitivität
wie 42,4 pg/ml durchgeführt
werden.
-
Kurze Erklärung der
Zeichnungen
-
1 ist
eine Plasmidkarte des durch Referenz 1 (2) erhaltenen rhMP52-Expressionsvektors (pKOT245).
-
2 ist
eine Plasmidkarte des CHO-MP52-Expressionsvektors pMSS99 (5,0 kb).
Die Basensequenz der CHO-MP52-DNA sind die Nukleotide von 576 bis
2297, wie in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls gezeigt.
-
3 ist
eine Fotografie eines Western Blot-Analyse-Diagramms der Reaktivität des vorliegenden monoklonalen
Antikörpers
gegenüber
einem monomeren rhMP52 (A) und einem dimeren rhMP52 (B).
-
4 ist
ein Diagramm, welches erhalten wurde, wenn die Identifizierung (d.
h. Typisierung) der vorliegenden monoklonalen Antikörper untersucht
wurde. Als veranschaulichende Beispiele sind solche Antikörper gezeigt,
die mit aMP-1 und aMP-4 beschichtet sind.
-
5 ist
ein Diagramm, welches die Quantifizierungskurven für MP52 unter
Verwendung des vorliegenden monoklonalen Antikörpers zeigt.
-
Beste Ausführungsform
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Referenzen und Beispiele
veranschaulicht.
-
Referenz 1 – Herstellung
von rhMP52
-
1. Konstruktion des Expressionsvektors
-
(1) Isolierung einer maturen
Region von MP52
-
Eine
mature Region von humaner MP52-cDNA wurde durch PCR amplifiziert
unter Verwendung des Plasmidvektors (pSK52s), welcher cDNA, die
in WO 93/16099 beschrieben wurde, als Matrizen-DNA enthält.
-
Gemäß dem Verfahren
zur Steigerung der Produktivität
der Zielproteine, über
das von M. Nobuhara et al. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331–1338, 1988)
berichtet wurde, wurde ein Teil der DNA der maturen Region des MP52-Gens
durch eine bestimmte DNA-Sequenz ersetzt, die keine Alternierung
der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz erlaubt, um den
AT-Gehalt in der Nähe
des ATG-Startcodons zu erhöhen.
-
Die
Rekonstruktion wurde durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung des
bestimmten 5'-PCR-Primers
eingeführt,
welcher die Mutation der SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls umfasst.
Für die
DNA-Sequenz der PCR-Primer wurde die DNA in SEQ ID Nr. 3 als 5'-Primer und die DNA
in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls als 3'-Primer verwendet.
-
Die
PCR wurde durchgeführt,
indem die Matrizen-DNA (10 ng), 50 pmol jedes der PCR-Primer in
einer Vorwärtsrichtung
und in Rückwärtsrichtung,
dNTP (0,2 mmol) und MgCl2 (1,5 mmol) in
dasselbe Testgefäss zusammen
mit Taq DNA-Polymerase (5 U) zugegeben wurden.
-
Es
wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt;
die Bedingungen jedes Zyklus waren 94°C für eine Minute zur Denaturierung,
55°C für eine Minute
zum Primer-Annealing und 72°C
für zwei
Minuten zur Primer-Extension.
-
Die
bei der PCR erhaltenen Produkte wurden durch Elektrophorese in 1,5%-iger
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC) isoliert und die Fragmente
mit ungefähr
360 bp wurden isoliert (Fragment 1).
-
(2) Konstruktion eines
E. coli-Expressionsvektors für
das erfindungsgemäße Protein
-
Um
die Anzahl der Kopien des Plasmids pro Bakterium zu steigern, wurde
die ori-Region für den Replikationsursprung
von der des pBR-Vektors gegen die des pUC-Vektors ausgetauscht. Die Taq-Promotor-Region
wurde aus dem im Handel erhältlichen
E. coli-Expressionsvektor pKK223-3 (bezogen von Pharmacia Biotech)
durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SspI und EcoRI isoliert,
mit Mungbohnennuklease (Takara Shuzo, Katalog-Nr. 2420A) behandelt,
an das Startkodon von Fragment 1 ligiert durch T4 DNA-Ligase (Takara
Shuzo, Katalog 2011A). Die rrnBT1T2-Terminator-Region von pKK223-3 wurde durch
Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SalI und SspI isoliert,
mit dem Endkodon von Fragment 1 ligiert, welches durch SalI verdaut
war. Anschließend
wurde sie in die SmaI-Stelle des pUC18-Vektors ligiert, um den Expressionsvektor {pKOT245
(Accession Nr. BIKOKEN-KI-FERM BP-5499)} (1) zur Herstellung
des Proteins zu konstruieren. Die Länge von pKOT245 beträgt 3,7 kb.
Die Nukleotidsequenz des für
das Protein konstruierten Expressionsvektors wurde mit einem Pharmacia
ALF DNA-Sequenzierer analysiert.
-
(3) Transformation
-
Die
Transformation wurde gemäß dem Rubidiumchlorid-Transformationsvertahren
von Kushner et al. (Genetic Engineering, S. 17, Elsevier, 1978)
durchgeführt.
PKOT245 wurde verwendet, um den Wirtsstamm E. coli W3110M nach dem
oben beschriebenen Verfahren zu transformieren, um E. coli Transformante
für die Herstellung
des Proteins zu produzieren.
-
2. Kultivierung
-
(1) Kultivierung
-
Die
E. coli, welche das erfindungsgemäße Protein exprimieren, wurden
in modifiziertem SOC-Medium (Bactotrypton 20 g/l, Bactohefeextrakt
5 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgCl2·6H2O 2,03 g/l, Glucose 3,6 g/l) vorkultiviert.
Es wurden 100 ml der Bakteriensuspension verwendet, um 5 l des Produktionsmediums
(Bactotrypton 5 g/l, Zitronensäure
4,3 g/l, K2HPO4 4,675
g/l, KH2PO4 1,275
g/l, NaCl 0,865 g/l, FeSO4·7H2O 100 mg/l, CuSO4·5H2O 1 mg/l, MnSO4·nH2O 0,5 mg/l, CaCl2·2H2O 2 mg/l, Na2B4O7·10H2O 0,225 mg/l, (NH4)6Mo7O24 0,1
mg/l, ZnSO4·7H2O
2,25 mg/l, CoCl2·6H2O
6 mg/l, MgSO4·7H2O
2,2 g/l, Thiamin HCl 5,0 mg/l, Glucose 3 g/l) zu impfen, welches
in einem 10 Liter Fermentierer unter Rühren bei Luftzufuhr kultiviert
wurde, und anschließend wurde
beim Erreichen des frühen
Stadiums der logarithmischen Wachstumsphase (OD550 =
5,0) Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Kultivierung
wurde fortgeführt
bis OD550 = 150 erreicht war. Während der
Kultivierung wurde die Temperatur bei 32°C und der pH-Wert durch Zugeben
von Ammoniak bei 7,15 gehalten. Um eine Verringerung der Konzentration
an gelöstem
Sauerstoff zu verhindern wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht um die
Konzentration an gelöstem
Sauerstoff bei einer Luftsättigung
von 50% zu halten. Die Kultivierung wurde durch Zugabe einer 50%igen
Glucoselösung
bei einem Wert von 0,2%, fortgeführt,
um eine hohe Zelldichte zu erhalten, wobei es Anzeichen einer plötzlichen Erhöhung der
Konzentration an gelöstem
Sauerstoff gab.
-
(2) Herstellung von E.
coli-Einschlusskörpern
-
Die
durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Kulturbrühe wurde
zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche anschließend in
25 mM Tris-HCl-Puffer suspendiert wurden, der 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (pH
7,3) enthielt. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie durch
einen Homogenisierer (hergestellt von APV Gaulin Inc.) geleitet
wurden und es wurde erneut zentrifugiert, um das Präzipitat,
welches die Einschlusskörper
enthält,
zu ernten.
-
3. Reinigung
-
(1) Solubilisieren von
E. coli-Einschlusskörpern
-
Nach
dreimaligem Waschen mit 1%igem Triton X-100 wurden die E. coli Einschlusskörper mit
3000 g für
30 Minuten bei 4°C
zentrifugiert und anschließend wurde
das resultierende Präzipitat
unter Schallbehandlung mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 8,3, 8 M Harnstoff, 10
mM DTT und 1 mM EDTA solubilisiert.
-
(2) Herstellung von Monomeren
-
Die
solubilisierte Lösung
wurde für
30 Minuten bei 4°C
mit 20 000 g zentrifugiert und der resultierende Überstand
wurde gesammelt. Der erhaltene Überstand
wurde mit SP-Sepharose FF (Pharmacia AB) behandelt, äquilibriert
mit 20 mM Tris-HCl-Puffer,
pH 8,3, 6 M Harnstoff und 1 mM EDTA und anschließend nach dem Waschen mit derselben
Lösung
wurde er mit der gleichen Lösung,
die 0,5 M NaCl enthielt, eluiert. Zum Eluat wurden Na2SO3 und Na2S4O6 zugegeben, um
die jeweilige Endkonzentration von 111 mM bzw. 13 mM zu erreichen
und anschließend
wurde bei 4°C
für 15
Stunden sulfoniert. Die sulfonierte Lösung wurde gelfiltriert an Sephacryl
S-200 (Pharmacia AB), äquilibriert
mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 6 M Harnstoff, 0,2 M NaCl und
1 mM EDTA, um gereinigte sulfonierte Monomere des erfindungsgemäßen Proteins
zu erhalten.
-
(3) Rückfaltung
-
Die
Lösung
der sulfonierten Monomere wurde unter Rühren in ein 9-faches Volumen
an 50 mM Na-Glycin-Puffer pH 9,8, 1 M NaCl, 30 mM CHAPS, 5 mM EDTA,
2 mM GSH (reduzierte Form von Glutathion) und 1 mM GSSG (oxidierte
Form von Glutathion) zugegeben und anschließend für 3 Tage bei 4°C inkubiert, zur
Oxidation und Rückfaltung
des erfindungsgemäßen Proteins.
-
(4) Herstellung von Homodimeren
-
Das
rückgefaltete
MP52 wurde auf eine RESOURCE RPC-Säule (Pharmacia AB) einer Revers-Phasen-HPLC
aufgebracht, die mit 25%igem Acetonitril, welches 0,05 TFA enthielt
voräquilibriert
war, und anschließend
wurde mit einem linearen Gradienten von 25–45% Acetonitril, welches 0,05%
TFA enthielt, eluiert. Das Eluat wurde bei einer Absorption von
280 nm überwacht.
Die Fraktionen des homodimeren Proteins wurden gesammelt und lyophilisiert.
Die Probe wurde durch Sephacryl S-200 gelfiltriert, welches mit
20 mM Tris-Phosphatpuffer mit pH 8,0 äquilibriert war, der 0,8 M
Harnstoff und 1 M NaCl enthielt, und anschließend wurden die Fraktionen
mit homodimerem Protein auf dieselbe Weise wie oben beschrieben
unter Verwendung von Reverse-Phasen-HPLC gesammelt.
-
(5) Bestimmung der physikalisch-chemischen
Eigenschaften des gereinigten erfindungsgemäßen Proteins
-
a) Analyse der N-terminalen
Aminosäuresequenz
-
Die
Analyse hinsichtlich der N-terminalen Aminosäuresequenz der gereinigten
Proteine wurde unter Verwendung eines Aminosäuresequenzierers Modell 476A
(Applied Biosystems Inc.) durchgeführt, um die Aminosäuresequenz
vom N-Terminus zur
30. Aminosäure
der Sequenz zu bestätigen,
wie in SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls gezeigt.
-
b) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
-
Die
Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
der gereinigten Proteine, die oben erhalten wurden, wurde mit einem
Aminosäuresequenzierer
(PICO TAG Systems, Waters) durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle
1 gezeigt. Die in Tabelle 1 beschriebene Nummer gibt die Anzahl
der Aminosäurereste
pro einem monomeren Protein an. Tabelle
1
- –
- nicht detektierbar
-
c) Analyse durch Elektrophorese
-
Durch
SDS-PAGE Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde
bestätigt,
dass das Molekulargewicht der oben erhaltenen gereinigten Proteine
etwa 28 kDa beträgt.
-
Aus
den in den obigen Punkten a), b) und c) gezeigten Ergebnissen geht
hervor, dass das erfindungsgemäße Protein
ausschließlich
119 Aminosäurereste
umfasst, ausgehend vom N-terminalen Pro.
-
Referenz 2 – Herstellung
von CHO-MP52
-
(1) Konstruktion des Expressionsvektors
für CHO-MP52
-
Der
pSK52s-Vektor, welcher humanes MP52-Gen enthält, welcher von Dr. Hötten von
Biopharm GmbH bezogen wurde, wurde mit HindIII verdaut und ein DNA-Fragment, welches
humanes MP52 enthielt, wurde durch Extraktion aus 0,8%igen, niedrig
schmelzenden Agarosegelen isoliert und in die HindIII-Stelle des pABstop-Vektors ligiert,
welcher von Dr. Gerd Zettlmeissl von Behringwerke AG bezogen wurde.
Die Struktur des CHO-MP52-Expressionsvektors, pMSS99 (5,0 kb), wie
in 2 gezeigt, wurde durch DNA-Sequenzierung und Restriktionsenzym-Mapping
bestätigt.
Die CHO-MP52 DNA-Sequenz in pMSS99 waren die Nukleotide von dem 576.
zu dem 2279., gezeigt in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls.
-
(2) Etablierung von CHO-Klonen,
welche CHO-MP52 produzieren
-
CHO-DUKX-B11-Zellen,
Mutanten von CHO-Zellen, die von Dr. Zettlmeissl von Behringwerke
AG bereitgestellt wurden, wurden durch ein Calciumphosphatvermitteltes
DNA-Transferverfahren mit pMSS99 und pSVOAdhfr cotransfiziert, welche
ebenfalls von Dr. Zettlmeissl bereitgestellt wurden. Anschließend wurden sehr
produktive Klone von CHO-MP52 durch ein Genamplifikationsprotokoll
unter Verwendung von Methotrexat (MTX) etabliert.
-
10 μg an pMSS99
und 2 μg
an pSVOAdhfr wurden in 1 ml an 25 mM HEPES-140 mM NaCl-0,75 mM Na2HPO4 (pH 7,05) gelöst, anschließend mit
50 μl an
2,5 M CaCl2 vermischt. Die resultierenden
Präzipitate wurden
in einer 10 cm Schale auf CHO-DUKX-B11-Zellen aufgebracht, und sie
standen für
30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurden 8 ml an MEM ALPHA
mit Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden (MEMα+),
welche 10% fötales
Kälberserum
(FBS) enthielten, zu der Zellschicht zugegeben, um in einem CO2-Inkubator für 4–6 h zu inkubieren. Nach der
Behandlung mit 10%igem Glycerin in MEMα+, welches
10% FBS enthielt für
3 min bei Raumtemperatur, wurden die Zellen in MEMα+,
welches 10 FBS enthielt, für
2 Tage kultiviert. Anschließend
wurden die Zellen erneut in MEM ALPHA ohne Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside
(MEMα–)
gegeben, welches 10% dialysiertes FBS enthielt, um die Transformanten
zu selektieren. Die transformierten Klone wurde isoliert und durch
Western Blot-Analyse, wie im nächsten
Abschnitt beschrieben, auf die Expression von CHO-MP52 untersucht.
-
Die
CHO-MP52-produzierenden Klone wurden schrittweise weiter selektiert
in steigenden Konzentrationen an Methotrexat (MTX), um das MP52-Gen
entsprechend mit dem pSVOAdhfr-Gen zu amplifizieren. Verschiedene
Klone wurden erhalten, die 1–3 μg an CNO-MP52/106-Zellen/24 h bei 400 nM MTX produzieren.
-
(3) Detektion von CHO-MP52
in den Kulturüberständen
-
Die
Klone wurden wie folgt durch Western Blot-Analyse auf die Expression
von CHO-MP52 untersucht: die Kulturüberstände (1–15 μl) wurden auf SDS-PAGE (15–25% Polyacrylamid-Gradient-Gel,
Daiichi Pure Chemicals) unter reduzierenden Bedingungen aufgetragen,
anschließend
wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert (Clear Blot Membrane-P,
ATTO). Die Membran wurde für
1 h mit Block Ace (Dai-Nihon Seiyaku) blockiert, mit Tris-gepufferter
Saline (TBS) gespült,
anschließend
mit 10 μg/ml
an Hühnerantikörpern gegen
CHO-MP52 in 10fach verdünntem
Block Ace über
Nacht behandelt. Nach dem Waschen der Membran mit 0,1%igem Tween
20 in TBS (TTBS) wurde die Membran mit Hasenanti-Hühner IgG-ALP-Konjugat
(Sigma A 9171) in 10fach verdünntem
Block Ace für
1 h behandelt. Die Membran wurde mit TTBS gewaschen, anschließend mit
alkalischem Phosphatase-Konjugat-Substrat-Kit (BIO-RAD) umgesetzt, um
die Banden, welche MP52 entsprechen, sichtbar zu machen.
-
(4) Zellkultur der CHO-MP52
produzierenden CHO-Zelllinie
-
Die
CHO-Zelllinie mit der höchsten
Produktivität
an CHO-MP52, MC-2 (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5142) wurde mit Rollflaschen,
die MEMα– supplementiert
mit 10% FBS, 400 nM MTX, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin
enthielten, aufgezogen. Nachdem die MC-2 Zellen Konfluenz erreicht
hatten, wurden sie mit serumfreiem MEMα– gewaschen
und anschließend
in serumfreiem DME/F12, welches mit 10 mM HEPES (pH 7,3), 10 KIU
Aprotinin, 1 mM Natriumbutyrat, 6 μg/ml Natriumselenat, 5 μg/ml Transferrin,
18 μg/ml Ethanolamin,
9 μg/ml
Insulin, 10 U/ml Penicillin, 100 μg/ml
Streptomycin supplementiert war, kultiviert. Das konditionierte
Medium wurde für
eine Woche jeden Tag gesammelt.
-
(5) Reinigung von CHO-MP52
-
Der
CHO-Kulturüberstand
und 0,1 Vol. an 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, wurden gemischt
und auf eine POROS HS-Säule
(10 ml, PerSeptive Biosystems) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM
NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, äquilibriert worden war. Die
Proteine wurden mit einem linearen Gradienten an NaCl von 0,05 bis
2 M eluiert und in 20 Fraktionen a 10 ml gesammelt. Es wurde beobachtet,
dass es sich bei den eluierten MP52 um drei Typen von Monomeren
handelte, und ihre ungefähren
Molekulargewichte wurden durch SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen
als 52, 40 und 14 kD ermittelt. Diese Monomere bilden drei Typen
von Homodimeren (104 kD, 80 kD und 28 kD) und drei Typen von Heterodimeren
(92 kD: 40 kD–52
kD, 66 kD: 14 kD–52
kD und 54 kD: 14 kD–40
kD) und alle diese Dimere wurden als CHO-MP52 bezeichnet außer dem
28 kD Homodimer, welches als das mature Homodimer von humanem MP52
bekannt zu sein schien (WO 95/04819). Daher wurden das 104 kD Homodimer
und das 80 kD Homodimer aus den obigen Fraktionen isoliert, um die
N-terminalen Aminosäuresequenzen
und die biologischen Aktivitäten
zu untersuchen.
-
Die
Fraktionen von der 5. bis zur 9. Fraktion wurden zusammengefasst
und auf das etwa 10fache konzentriert. Das Konzentrat wurde auf
eine Superdex 200 pg (1,6 I. D. × 60 cm, Pharmacia) aufgebracht,
die zuvor mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,1, welcher 1 M NaCl
enthielt, äquilibriert
worden war. Das Eluieren wurden bei einer Flussrate von 0,5 ml/min
durchgeführt.
Die Fraktionen, welche das 104 kD Homodimer enthielten, und die
Fraktionen, welche das 80 kD Homodimer enthielten, wurden separat
zusammengefasst. Jede wurde auf eine Revers-Phasen-HPLC-Säule aufgetragen (RESOURCE RPC,
3 ml, Pharmacia) und diese wurde mit 35–40% Acetonitril eluiert. Die
Konzentrationen des isolierten CHO-MP52 wurden durch Densitometrie der
Banden der Proteine auf SDS-PAGE-Gel ermittelt.
-
Die
Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
wurde unter Verwendung eines Puls-Flüssiggasphasensequenzierers
(Applied Biosystems Modell 476) für das 80 kD Homodimer bzw.
das 108 kD Homodimer durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
-
-
Die
80 kD Aminosäuresequenzen
gingen aus von Lys 121 oder Ala 122 bis zu Arg 474 und die Sequenz
von 104 kD war von Ala 1 bis Arg 474 in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls.
Es wurde kürzlich
entdeckt, dass die CHO-Zellen drei Typen von Homodimeren, 104 kD,
80 kD und 28 kD und drei Typen von Heterodimeren, nämlich Dimere
mit 92 kD, 66 kD und 54 kD produzierten.
-
Beispiel 1
-
1. Antigenherstellung
und Sensibilisierungsverfahren
-
Ein
Dimer (im Folgenden hierin kurz als „D-rhMP52" bezeichnet, wie speziell in Referenz
1 beschrieben) wurde exprimiert von E. coli (Hinterlegungs-Nr. FERM
BP-5499) mit einem
Plasmid (pKOT245), welches eine cDNA enthält, die für die Aminosäuresequenz
von humanem MP52 kodiert, und durch Oxidieren eines monomeren rhMP52,
welches durch Solubilisieren des Einschlusskörpers durch das Standardverfahren
erhalten wurde, konstituiert. Das D-rhMP52 durchlief solche Verfeinerungsverfahren,
wie beispielsweise isoelektrische Präzipitation und Gelpermeation,
um das rhMP52 mit der Endkonzentration von etwa 0,5 mg/ml zu erhalten.
Dieses gereinigte rhMP52 wurde als Antigen verwendet. Andernfalls
wurde ein Dimer (im Folgenden hierin kurz als „CHO-MP52" bezeichnet, wie insbesondere in Referenz
2 beschrieben) von einer CHO-Zelle (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5142)
exprimiert und in den oben genannten Konzentrationen als Antigen
verwendet. Die Herstellung einer immunisierten Maus wurde bewirkt,
indem einer BALB/c-Maus durch intraperitoneale Injektion 70, 20,
10 und 52 μg
der Emulsion verabreicht wurden, die durch Lösen des CHO-MP52 (welches nicht weniger
als 80% eines unvollständig
verarbeiteten Vorläufers
enthielt) in einer wässrigen
10 mM Salzsäurelösung und
Mischen der resultierenden Lösung
mit einem kompletten Freundschen Adjuvans (CFA) in einem Verhältnis von
1 : 1 jeweils am 0., 7., 16. und 112. Tag hergestellt wurde, und
18 μg der
entsprechend hergestellten Emulsion des MP52 (welche etwas eines
Monomers enthielt) am 29. Tag verabreicht wurden, und nach einem
Intervall von etwa einem Monat 50 μg der Emulsion verabreicht wurde,
die durch Mischen einer Lösung, welche
das D-rhMP52 enthielt, mit einem inkompletten Freundschen Adjuvans
(IFA) in einem Verhältnis
von 1 : 1 erhalten wurde. Der so kontinuierlich sechs Mal sensibilisierten
Maus wurden am 42. Tag nach der letzten Injektion 60 μg des D-rhMP52
subkutan verabreicht ohne Verwendung eines Adjuvans, und nach einem
Intervall von 42 Tagen (3 Tage vor Fusion der Zelle) wurden 50 μg des D-rhMP52
intravenös
durch die Schwanzvene injiziert.
-
Beispiel 2 Zellfusion
-
Nach
3 Tagen nach der letzten Immunisierung wurde die Milz der sensibilisierten
Maus exzidiert und Milzzellen wurden präpariert. Die so erhaltenen
Milzzellen wurden mit einer murinen Myelomzelllinie (SP2/0) in einem
Verhältnis
von 10 : 1 vermischt, die resultierende Mischung wurde mit 1500
Upm zentrifugiert und die Zellpellets wurden langsam gelöst, wenn
sie in 40%igem Polyethylenglycol (PEG1500) bei 37°C warm gehalten
wurden. Die gelösten
Zellpellets wurden vorsichtig mit der Spitze einer Pipette gerührt, während langsam 1
ml eines RPMI 1640 Kulturmediums, das FCS ausschließt (hergestellt
von Nissui Seiyaku K. K.), dazu gegeben wurde. Anschließend wurde
die Geschwindigkeit der Zentrifugation innerhalb eines Zeitraums
von ungefähr
6 Minuten stufenweise von 250 Upm auf 1000 Upm erhöht. Die
am Ende der beschleunigten Zentrifugation erhaltenen Pellets wurden
einmal mit einem FCS-freien Kulturmedium gewaschen. Schließlich wurden die
Pellets mit Hilfe einer Lösung,
die durch Zugabe von HAT [Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T)]
zu einem RPMI 1640 Kulturmedium, welches 20 FCS enthielt, hergestellt
wurde, über
die Wells einer 96-Well-Platte verteilt um so 10 000 Milzzellen
in jedes Well einzubringen.
-
Beispiel 3 Primäres Screening
durch das ELISA-Verfahren
-
Das
Produkt aus ungefähr
6000 fusionierten Zellen wurde durch das folgende Verfahren auf
die Fähigkeit
hin untersucht, einen monoklonalen Antikörper gegen humanes MP52 zu
ergeben.
- 1) Das für die Immunisierung verwendete
D-rhMP52 und ein monomeres rhMP52, welches erhalten wurde, indem
das D-rhMP52 reduziert wurde und das Reduktionsprodukt einer Sulfonierung
von dessen SH-Gruppe unterzogen wurde (im Folgenden hierin kurz
als „M-rhMP52" bezeichnet), um
die -ss-Bindung zu hemmen, wurden auf Platten (NUNC, MAXISORP) aufgebracht,
jeweils mit einer Konzentration von 1 μg/ml in einer festen Menge von
50 μl und
sie wurden bei Raumtemperatur für
eine Stunde inkubiert, um die Platten zu beschichten.
- 2) Die beschichteten Platten wurden mit PBS (Waschflüssigkeit),
welches Tween 20 enthielt, gewaschen und anschließend wurde
dazu der nicht-verdünnte
Kulturüberstand
in einer festen Menge von 50 μl
pro Well der Platte hinzugefügt,
und es wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
- 3) Die Inhalte der Wells wurden drei Mal mit der Waschflüssigkeit
gewaschen und anschließend
wurden zu den Wells HRPO-markierte Hasenimmunoglobulin-Antikörper gegen
Mausimmunoglobuline (DAKO, F206) in einer Konzentration von ungefähr 1 μg/ml in einer
festen Menge von 45 μl
pro Well hinzugefügt.
Das in diesem Fall verwendete Verdünnungsmittel wurde hergestellt,
indem Casein (hergestellt von Kanto Kagaku K. K.) in einer Konzentration
von 2 mg/ml in einer 0,1 M Tris-Hydroxymethylaminomethan-Pufferlösung (TBS,
pH 7,4) gelöst
wurde.
- 4) Die Wells wurden bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert und
drei Mal mit der Waschflüssigkeit gewaschen,
und zu den gewaschenen Wells wurde eine farbgebende Flüssigkeit
(Chromogen-TBM, hergestellt von Behringwerke) in einer festen Menge
von 50 μl
pro Well zugegeben.
- 5) Die folgende Färbereaktion
wurde bei Raumtemperatur für
ungefähr
5 Minuten ablaufen gelassen und dann durch Zugabe von 50 μl an 0,5
N Schwefelsäure
angehalten.
- 6) Der Färbegrad
wurde innerhalb von 30 Minuten nach dem Anhalten der Reaktion bei
einer Absorption von OD450 nm gemessen.
-
Von
insgesamt 23 aufeinander folgend synchronisierten monoklonalen Antikörpern aMP-1
bis aMP-23 wurden die 20 monoklonalen Antikörper, außer aMP-17, aMP-19 und aMP-23,
die den anschließenden
Klonierungsprozess nicht überstanden,
erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Bei der Unterscheidung
zwischen dem positiven und dem negativen Test wurde der Durchschnittswert ±10 SD
(OD450 nm = 0,05) als Cutoff-Wert verwendet.
Die monoklonalen Antikörper
aMP-1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 9, 12, 14, 15, 18 und 22 reagierten nur mit D-rhMP52 und
die monoklonalen Antikörper
aMP-8, 10, 11, 13, 16, 20 und 21 reagierten sowohl mit D-rhMP52 als auch mit
M-rhMP52. Die 20 monoklonalen Antikörper wurden vom Gesichtspunkt
der Spezifität
her in zumindest zwei Arten von Antikörpern eingeteilt.
-
Beispiel 4 Bestätigung der
Spezifität
durch das Western Blot-Verfahren
-
- 1) Das rhMP52 (1 μg/Spur/0,5 mm) wurde SDS-PAGE
unter Verwendung eines 15–25%
Gradientengels (hergestellt von Daiichi Kagakusha K. K.) unterzogen,
unter nicht-reduzierenden Bedingungen (um zu bewirken, dass das
Antigen als D-rhMP52 wandert) und unter reduzierenden Bedingungen
(um zu bewirken, dass das Antigen als M-rhMP52 wandert), und anschließend durch
das Standardverfahren auf eine Nitrocellulosemenbran transferiert
(30 V, 2 h).
- 2) Die Nitrocellulosemembran, welche die Basis für den Transfer
gebildet hatte, wurde für
nicht weniger als 20 Minuten in einer TBS-Lösung, welche Casein mit einer
Konzentration von ungefähr
3 mg/ml enthielt, eingetaucht belassen, um eine nicht-spezifische
Reaktion zu blockieren.
- 3) Die Nitrocellulosemembran, die das transferierte rhMP52 trägt, wurde
in dem Kulturüberstand,
welcher einen monoklonalen Antikörper
(im Bereich von 4 μg/ml– 40 μg/ml) enthielt,
inkubiert, indem sie beim Raumtemperatur für eine Stunde in dem Kulturüberstand
in dessen nicht-modifizierter Form geschüttelt wurde.
- 4) Der inkubierte Antikörper
wurde mit einer großen
Menge an Phosphatpufferlösung
(PBS, pH 7,2) gewaschen (drei Mal erneutes Eintauchen in die Lösung für 5 Minuten,
wobei die Lösung
am Ende jedes Eintauchens durch einen neuen Vorrat ersetzt wurde).
- 5) HRPO-markierte Hasenimmunoglobulin-Antikörper gegen Mausimmunoglobuline
wurden als zweiter Antikörper
in einer Konzentration von 1 μg/ml
in eine Casein-TBS-Verdünnungslösung gegeben
und darin bei Raumtemperatur für
eine Stunde inkubiert.
- 6) Der inkubierte Antikörper
wurde auf dieselbe Weise wie oben in 4) sorgfältig gewaschen.
- 7) Der gewaschene Antikörper
wurde eingetaucht in einem farbgebenden Mittel (TrueBlue/Peroxidasesubstrat,
hergestellt von Kirkegaard Perry Laboratories) belassen, um eine
Färbereaktion
einzugehen. Anschließend
wurde er sorgfältig
mit fließendem
Wasser gewaschen. Die Ergebnisse stimmten mit denen des primären Screenings
mit ELISA überein.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
-
Beispiel 5 Bestimmung
der Unterklasse des monoklonalen Antikörpers
-
Die
Unterklassen eines monoklonalen Antikörpers, der von dem Klon produziert
wurde, wurde bestimmt durch die Verwendung eines Maus-monoklonalen
Antikörper-Isotypisierungskits,
RPN29, hergestellt von Amersham Corp., entsprechend dessen Bedienungsanleitung.
Die Unterklassen des monoklonalen Antikörpers sind in Tabelle 4 gezeigt.
Es wurde gefunden, dass alle monoklonalen Antikörper eine L-Ketten-Unterklasse κ und eine
H-Ketten-Unterklasse γ1
oder γ2a
besitzen.
-
Beispiel 6 Bestätigung der
Spezifität
-
Das
humane MP52 ist ein Molekül,
welches der TGF-β-Genfamilie
angehört
und es wurde gefunden, dass es bezüglich der Struktur und der
Aminosäuresequenz
der übrigen
TGF-β-Genfamilie,
insbesondere TGF-β2
und BMP-2, ähnelt.
Um den erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
zu untersuchen und zu bestimmen, ob er eine Spezifität für das humane
MP52 aufweist oder nicht, wurden das humane rekombinante TGF-β2 (rhTGFß2) und
das humane rekombinante BMP-2 (rhBMP-2) beschafft und auf dieselbe
Weise wie in Beispiel 3 oben dem ELISA-Test unterzogen, um ihre
Spezifität
zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
-
Keiner
der monoklonalen Antikörper
reagierte mit TGF-β2
und BMP-2. Es wurde somit bestätigt,
dass sie spezifische Antikörper
für MP52
sind.
-
Beispiel 7 Reinigung des
Antikörpers
-
Die
Reinigung der monoklonalen Antikörper
aus dem Kulturüberstand
und den Maus-Aszites-Flüssigkeiten
wurde durch Verwendung der Protein-A- oder Protein-G-Säule (hergestellt von Pharmacia)
entsprechend deren Betriebsanleitungen durchgeführt. Die Protein-A-Säule wurde
verwendet, um den Antikörper
aus dem Kulturüberstand
zu reinigen und die Protein-G-Säule
wurde verwendet, um den Antikörper
aus den Aszites-Flüssigkeiten
zu reinigen.
-
Beispiel 8 Sekundäres Screening
(Typisieren) durch ein Sandwich-ELISA-Verfahren
-
- 1) Die gereinigten monoklonalen Antikörper (20
Spezien von aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 18, 20, 21 und 22) wurden jeweils über die Wells einer 96-Well-Platte
mit einer Konzentration von 1 μg/ml
verteilt, um die Wells jeweils mit einer festen Menge von 50 μl zu beschichten
(eine Stunde bei Raumtemperatur).
- 2) Nachdem die beschichteten Wells drei Mal mit einer Waschflüssigkeit
(BEP-II, hergestellt von Behringwerke) gewaschen worden waren, wurde
eine Lösung,
die durch Verdünnen
des D-rhMP52 auf eine vorgeschriebene Konzentration von 30 ng/ml
mit Casein/TBS erhalten wurde, in einer festen Menge von 50 μl über die
Wells verteilt und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
- 3) Nach dreimaligem Waschen mit der Waschflüssigkeit wurden die oben in
1) gezeigten monoklonalen Antikörper,
die zuvor durch Verwendung eines Antikörper-Markierungssystems (hergestellt von
American Qualex Corp. und vertrieben unter der Bezeichnung „Biotinylation
Kit") biotinyliert
worden waren, jeweils mit Casein/TBS auf eine Konzentration von
1 μg/ml
verdünnt,
und die biotinylierten monoklonalen Antikörper wurden jeweils zu den
Wells aller Arten von monoklonalen Antikörpern, die in 1) oben beschichtet
worden waren, hinzugefügt.
Beispielsweise wurden alle biotinylierten Spezies von aMP-1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 und
22 jeweils mit den Platten umgesetzt, die mit der Spezies aMP-1-beschichtet
worden waren, und alle biotinylierten monoklonalen Antikörper wurden
jeweils auf dieselbe Weise wie oben (Raumtemperatur für eine Stunde)
mit den Platten umgesetzt, die mit den Spezies aMP-2–22-beschichtet
worden waren.
- 4) Nach dreimaligem Waschen mit einer Waschflüssigkeit
wurde eine HRPO-markierte
AVIDIN-PEROXIDASE (hergestellt von Sigma) in einer Konzentration
von 1 μg/ml
zu Casein/TBS zugegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
- 5) Nach dem Waschen auf dieselbe Weise wie oben wurden sie auf
dieselbe Weise wie in 3) und 4) einer Färbereaktion unterzogen.
- 6) Nach einer Inkubation für
15 Minuten wurde die Reaktion angehalten und das Ausmaß der Färbereaktion wurde
auf dieselbe Weise wie in 3), 5) und 6) gemessen.
-
Ein
Teil der Ergebnisse ist in 4 gezeigt.
Ein und derselbe monoklonale Antikörper sollte in allen Kombinationen
dieselben. Ergebnisse zeigen. Für
die Spezies aMP-1 und aMP-4, die als Beispiel in 4 gezeigt
sind, wurde jedoch gefunden, dass sie grundverschiedene Antikörper darstellen.
Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die Ähnlichkeit und Unähnlichkeit
aller monoklonalen Antikörper
bestimmt. Als Ergebnis wurden die monoklonalen Antikörper, welche
sich in der Spezifität
für 10
Spezies von Epitopen unterscheiden, identifiziert. Sie wurden wie
in Tabelle 6 angegeben als Typ A, B, C, D, E, F, G, N, 1 und J klassifiziert.
-
Beispiel 9 Hemmung der
biologischen Aktivität
von D-rhMP52 durch den monoklonalen Antikörper
-
Es
ist bekannt, dass die Ratten-osteoblastische Zelllinie ROB/C26 einen
Rezeptor für
das humane MP52 besitzt. Es ist bekannt, dass die Aktivität der alkalischen
Phosphatase (ALP) erhöht
wird, wenn das humane MP52 zu der Kultur dieser Zelllinie hinzugegeben
wird. Wenn das rhMP52 in einer vorgeschriebenen Menge zugegeben
wurde und alle gereinigten monoklonalen Antikörper in der Endkonzentration
von 20 μg/ml zugegeben
wurden, so wurde untersucht, ob sie die ALP-Aktivität hemmen
oder nicht. Wenn das rhMP52 in einer Konzentration von 10 ng/ml
zu ROB/C26 zugegeben wurde und anschließend für mehrere Tage inkubiert wurde,
so wurde über
den MP52-Rezeptor auf der Oberfläche
der Zellen ein Reiz geleitet und als Folge davon wurde die ALP-Aktivität gesteigert.
Die ALP-Aktivität
konnte durch eine Färbereaktion
quantifiziert werden, die mit einem für das ALP spezifischen Substrat
hervorgerufen wurde, auf dieselbe Weise wie in ELISA (unter der Voraussetzung,
dass die Wellenlänge
für die
Bestimmung OD405 nm betrug). Die Ergebnisse
sind in Tabelle 7 gezeigt. Das rhMP52 allein zeigte in Abwesenheit
des Antikörpers
eine ALP-Aktivität
von 0,158 OD405 nm. Diese ALP-Aktivität wurde
durch die Zugabe eines monoklonalen Antikörpers verändert. Die Stärke der
hemmenden Wirkung des monoklonalen Antikörpers war proportional zu der
Kleinheit dieser Veränderung
der APL-Aktivität
abgestuft. Als Ergebnis wurde erkannt, dass die Spezien von aMP-4,
5, 8, 11, 20 und 21 eine starke hemmende Wirkung aufweisen. Von
den auf diese Weise getesteten Spezies waren aMP-4- und aMP-5-Antikörper, die
spezifisch mit dem D-rhMP52 reagierten (Tabelle 1), und sie wurden
daher als monoklonale Antikörper
eingestuft, die im Gegensatz zu den Spezien von aMP-8, 11, 20 und
21, die zusätzlich
mit dem M-rhMP52 reagieren, dazu in der Lage waren, unter physiologischen
Bedingungen die MP52/MP52-Rezeptor-Bindung wesentlich zu hemmen.
Die Hybridoma, welche die monoklonalen Antikörper aMP-4 und aMP-5 ergeben,
wurden beim Life Science Industrial Technology Research Institute
der Agency of Industrial Technology hinterlegt (1–3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan), unter den Hinterlegungs-Nummern
FERM BP-5939 bzw. FERM BP-5940.
-
Beispiel 10 Quantifizierung
von MP52 durch monoklonalen Antikörper durch das Sandwich-ELISA-Verfahren
-
Die
monoklonalen Antikörper
wurden wie in Beispiel 8 beschrieben in 10 Typen eingeteilt. Aus
diesen wurde unter Verwendung von aMP-4 mit Typ C und aMP-5 mit
Typ D ein Sandwich-ELISA konstruiert. Und zwar:
- 1)
Eine 96-Well-Platte wird mit 50 μl
gereinigtem aMP-5, jeweils mit einer Konzentration von 5 μg/ml, beschichtet
(1 h, bei Raumtemperatur).
- 2) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit werden zu jedem Well
50 μl gereinigtes
MP52 in einer Konzentration von höchstens 1 ng/ml, nach und nach
mit Casein/Tris-Puffer verdünnt
wird, zugegeben. Die Platte wird für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
- 3) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit werden zu jedem Well
50 μl an
biotinyliertem gereinigtem aMP-4-Antikörper in einer Konzentration
von 1 μg/ml
zugegeben und für
1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
- 4) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit wird AVIDIN-PEROXIDASE
(SIGMA A-3151) in
einer Konzentration von 1 μg/ml
zugegeben und für
1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
- 5) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit wird die sich ergebende
Färbereaktion
auf dieselbe Weise fortschreiten gelassen wie bei 3) und 4) gezeigt.
- 6) Nach 30 Minuten wird die sich ergebende Färbereaktion durch Zugabe von
50 μl an
0,5 N Schwefelsäure angehalten.
- 7) Das Ausmaß der
Färbung
wurde nach dem Anhalten der Reaktion bei einer Absorption von OD450 nm gemessen.
-
Die
Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Die Detektionsgrenze
lag bei ungefähr
23,9 pg/ml und die Quantifizierungsgrenze betrug 42,4 pg/ml.
-
In
dieser Beschreibung bedeutet die Detektionsgrenze eine Konzentration
an MP52, die entscheidend höher
ist als die der Lösung
ohne MP52 als Hintergrundkonzentration, und die Quantifizierungsgrenze
bedeutet die niedrigste Konzentration an PM 52, die mit Zuverlässigkeit
detektiert wird.
-
Tabelle
3
Ergebnis des anti-MP52 Antikörper Titers, detektiert durch
ELISA
-
Tabelle
4
Unterklasse des monoklonalen Antikörpers
-
Tabelle
5
Spezifität
des monoklonalen Antikörpers
-
Tabelle
6
Klassifizierung des monoklonalen Antikörpers
-
Tabelle
7
Test der Hemmung der ALP-Aktivität durch den monoklonalen Antikörper
-
Industriell anwendbar
-
Der
erfindungsgemäße monoklonale
Maus-Antikörper
gegen humanes MP52 ist nützlich
zur Verwendung beispielsweise für
die Reinigung oder Untersuchung von humanem MP52, welches gentechnisch
hergestellt wurde.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-