DE69732636T2

DE69732636T2 - Monoklonaler antikörper gegen humanes mp52

Info

Publication number: DE69732636T2
Application number: DE69732636T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kawagoe-shi KITAGAWA; Tomofumi Kawagoe-shi JITSUKAWA; Hiraku Kawasaki-shi NAKAGAWA; Sachiko Kawagoe-shi YANAGISAWA
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1996-05-13
Filing date: 1997-05-13
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2017-05-14
Also published as: NZ332414A; AP9801381A0; EP0919617A4; JPH1080273A; DE69732636D1; JP3868001B2; US6328963B1; AP816A; OA10924A; AU2652897A; EA199801011A1; PT919617E; NO985281D0; BR9709080A; EP0919617B1; ATE290074T1; NO985281L; CA2254857A1; EP0919617A1; PL329866A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft einen neuen monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes MP52. Genauer betrifft diese Erfindung einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes MP52, der in der Lage ist, an ein dimeres humanes MP52 jedoch nicht an ein monomeres humanes MP52 zu binden.
Ferner betrifft diese Erfindung ein Hybridom, das in der Lage ist, einen oben beschriebenen monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes MP52 zu produzieren und dessen Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Humanes MP52 wurde erstmals 1994 auf Basis seiner cDNA isoliert als osteogenetischer Faktor, der der TGF-β-Genfamilie angehört (Biochem. Biophy. Res. Comm., Vol. 204, Nr. 2, 1994). Humanes MP52 wird als Protein mit 120 Aminosäureresten mit Alanin am N-Terminus angesehen und seine Aminosäuresequenz ist in WO 93/16099 und WO 95/04819 offenbart. Aus verschiedenen Tierversuchen ist ersichtlich, dass MP52 ähnlich anderen osteogenetischen Faktoren an der Osteogenese beteiligt ist. Es sind jedoch noch viele unbekannte Punkte verblieben hinsichtlich dessen, wodurch MP52 bei der Osteogenese direkt induziert wird und über welchen Mechanismus Osteogenese abläuft und zu diesem Thema sind nur wenige Berichte erschienen.
Außerdem unterscheidet sich Maus-MP52 nur in einer Aminosäure der Sequenz an der N-terminalen Stelle von humanem MP52 und somit ist MP52 von einem Gen abgeleitet, das über Arten streng konserviert ist, so dass es nicht leicht ist, einen Antikörper für humanes MP52 aus einer Maus zu erhalten, obwohl in WO 93/16099 berichtet wurde, dass ein monoklonaler Maus-Antikörper erhältlich ist.
Offenbarung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes MP52 bereitzustellen, der in der Lage ist, an ein dimeres humanes MP52 jedoch nicht an ein monomeres humanes MP52 zu binden.
Es ist versucht worden, humanes MP52 auf gentechnischem Wege zu produzieren. Bei der Reinigung von humanem MP52, welches hergestellt wurde durch Inkubation von Wirtszellen, in die für humanes MP52 kodierende cDNA integriert wurde, hat sich herausgestellt, dass es wirksam ist, das humane MP52 unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zu reinigen, der in der Lage ist, spezifisch an humanes MP52 zu binden. Genauer wird ein monoklonaler Antikörper, der für humanes MP52 spezifisch ist, auf einem Träger getragen und mit einem grob gereinigten MP52 in Kontakt gebracht, um humanes MP52 durch Bindung zu isolieren und anschließend wird humanes MP52 abgetrennt. In diesem Fall ist es offenbar von Vorteil, einen solchen monoklonalen Antikörper zu verwenden, der in der Lage ist, spezifisch an ein dimeres humanes MP52 zu binden, um das aktive dimere MP52 zu isolieren.
Der monoklonale Antikörper gegen humanes MP52 kann für die Quantifizierung vom humanem MP52 verwendet werden. Die Quantifizierung von humanem MP52 ist nützlich für die Erläuterung von MP52-induzierenden Faktoren und für Untersuchungen des Osteogenese-Mechanismus. In diesem Fall kann ein dimeres MP52 in einem lebenden Körper zu einem inaktivierten Monomer oder Fragmenten davon abgebaut werden. Einzig das aktive dimere MP52 kann unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an ein dimeres MP52 bindet, detektiert werden.
Außerdem stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der in der Lage ist, an eine biologisch aktive Stelle von humanem MP52 zu binden. Das heißt, es wird ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes MP52 bereitgestellt, der die Bindung zwischen humanem MP52 und dessen Rezeptor verhindern kann. Der erfindungsgemäße Antikörper erkennt spezifisch eine hochgeordnete Struktur von humanem MP52 und bindet an humanes MP52 an dessen aktive Stelle, um dessen Aktivität zu hemmen. Da der Antikörper eine aktive Stelle von humanem MP52 erkennt, erkennt er sogar in dem dimeren MP52 keinerlei inaktive Teile. Dies ist offensichtlich von Vorteil, wenn es für seine Trennung oder Untersuchung angewendet wird.
Der erfindungsgemäße monoklonale Maus-Antikörper kann durch die folgenden Schritte entsprechend eines gut bekannten Verfahrens zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers produziert werden:

(1) Sensibilisieren von Mäusen mit humanem MP52 als Immunogen über einen längeren Zeitraum,
(2) Durchführen von Zellfusion zwischen Milzzellen von sensibilisierten Mäusen und Maus-Myelomzellen,
(3) Screening der resultierenden Hybridoma nach Hybridoma die einen monoklonalen Antikörper für humanes MP52 produzieren,
(4) Klonieren der gewünschten Antikörper-produzierenden Hybridoma,
(5) Durchführen einer Kultur der klonierten Zellen in großem Maßstab, um einen Antikörper zu produzieren oder intraperitoneales Transplantieren der klonierten Zellen in Mäuse, um einen Antikörper zu produzieren, und
(6) Abtrennen und Reinigen des Antikörpers, der in dem Kulturüberstand oder den Aszites enthalten ist.

Die folgenden Schritte werden im Folgenden hierin ausführlicher beschrieben werden.
Bei der Herstellung von immunsensibilisierten Mäusen in Schritt (1) wird eine Lösung von humanem MP52 in 10 mM wässriger Salzsäure gemischt und mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA) emulgiert und die resultierende Emulsion wird Mäusen mehrere Male mit einer Frequenz von 4 Mal pro 4 Monate intraperitoneal verabreicht. Der Gehalt des MP52 beträgt geeigneterweise von 10 μg bis 100 μg. Nach einem Zeitraum von etwa einem Monat seit der Verabreichung wird den Mäusen intraperitoneal eine Lösung von 10–100 μg humanem MP52 verabreicht, das gleichermaßen mit einem inkompletten Freundschen Adjuvans (IFA) emulgiert wurde. Es ist wünschenswert, den Mäusen, die kontinuierlich mit humanem MP52 zusammen mit den Adjuvantien sensibilisiert wurden, nach einem weiteren Zeitraum von ein bis zwei Monaten subkutan 10–100 μg humanes MP52 ohne jegliche Adjuvantien zu verabreichen, und wenige Tage vor Zellfusion wird den Mäusen weiter 10–100 μg humanes MP52 intravenös in die Schwanzvene verabreicht.
Die Herstellung von humanem MP52 wurde unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den die für das humane MP52 kodierende cDNA integriert ist, und unter Verwendung von Tierzellen, wie z. B. CHO-Zellen, und Bakterien, wie z. B. Escherichia coli als Wirt, versucht. Die gegenwärtigen Erfinder haben versucht, einen monoklonalen Antikörper herzustellen, indem als sensibilisierendes Antigen humanes MP52, welches in CHO-Zellen produziert wurde, (im Folgenden hierin als CHO-MP52 bezeichnet) [die humanes MP52-produzierende Tierzelllinie MC-2 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) mit der internationalen Hinterlegungsnummer FERM BP-5142 hinterlegt.) bzw. humanes MP52 welches von Escherichia coli produziert wurde (im Folgenden hierin als rhMP52 bezeichnet) [ein Expressionsvektor für humanes MP52 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) mit der internationalen Hinterlegungsnummer FERM BP-5499 hinterlegt.] verwendet wurde. Bei allen resultierenden Antikörpern handelte es sich um IgMs mit einer niedrigeren Spezifität. Es gelang den Erfindern jedoch, einen monoklonalen Antikörper mit einer höheren Spezifität herzustellen, indem sowohl CHO-MP52 als auch rhMP52 als sensibilisierendes Antigen verwendet wurden.
In der Zellfusion von Schritt (2) wird zunächst die Milz der in Schritt (1) ausreichend immunsensibilisierten Maus exzidiert und anschließend wird auf herkömmliche Weise eine Suspension der Milzzellen hergestellt. Als nächstes wird eine Mischung der resultierenden Milzzellen und Maus-Myelomzellen einer Zellfusions-Behandlung unter Verwendung von warmem Polyethylenglycol unterzogen. Nach der Behandlung werden nicht fusionierte Zellen aus der Zellmischung entfernt, wobei ein Medium verwendet wird, welches fötales Kälberserum (FCS) und HAT [Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T)] enthält. Die resultierende Mischung wird portionsweise in eine 96-Well-Platte geschüttet mit einer niedrigen Konzentration (einer Konzentration, in welcher ein Klon in der Lage ist, sich in einem Well zu vermehren) und nach einer Woche wird ein Überstand in dem Well, in dem eine Vermehrung festgestellt wurde, gewonnen.
Die Untersuchung eines Antikörpers gegen humanes MP52, der in dem Überstand von Schritt (3) gebildet wurde, kann unter Verwendung einer Platte mit 96 Wells durchgeführt werden, die mit humanem MP52 beschichtet sind, welches als Immunogen verwendet wird, gemäß einem herkömmlichen ELISA-Verfahren. Um den Antikörper für humanes MP52 zu selektieren, der nicht an ein monomeres humanes MP52, jedoch an ein dimeres humanes MP52 gebunden ist, werden zwei ELISA-Verfahren kombiniert, worin 1) unbehandeltes (nichtreduziertes) dimeres humanes MP52 (D-rhMP52) und 2) reduziertes monomeres humanes MP52 (M-rhMP52) verwendet werden. In diesem Fall kann das Monomermolekül in einem reduzierten Zustand leicht das entsprechende Dimer bilden, wenn es auf der Platte beschichtet ist und daher wird das Monomer, welches für die Beschichtung verwendet werden soll, auf herkömmliche Weise sulfoniert, um eine Rückbildung des dimeren Moleküls zu verhindern. Weiter wird die spezifische Reaktivität des Antikörpers mit dem monomeren humanen MP52 und dimerem humanem MP52 nach einem Western Blot-Verfahren bestätigt. Als Ergebnis wurden ein monoklonaler Antikörper, der heftig entweder mit M-rhMP52 oder D-rhMP52 reagiert, und ein monoklonaler Antikörper, der mit beiden reagiert, erhalten.
Die Spezifität des monoklonalen Antikörpers kann durch Western Blot-Verfahren bestätigt werden. Und zwar werden rhMP52s unter den nicht-reduzierenden Bedingungen (D-rhMP) und den reduzierenden Bedingungen (M-rhMP) SDS-PAGE unterzogen und anschließend durch das Standardverfahren zu einer Nitrocellulosemembran transferiert. Die Nitrocellulosemembran, welche das transferierte rhMP52 trägt, wurde in dem Kulturüberstand, der einen monoklonalen Antikörper enthält, inkubiert, es wurde durch ein mit HRPO-markiertes Hasenimmunoglobulin detektiert. Die Ergebnisse stimmten mit denen des primären Screenings mit dem ELISA überein.
Außerdem kann die Spezifität durch TGF-β2 und BMP-2, denen humanes MP52 ähnlich ist, als Antikörper für das ELISA auf dieselbe Weise bestätigt werden. Keiner der erhaltenen monoklonalen Antikörper reagierte sowohl mit dem TGF-β2 als auch dem BMP-2.
Der Klonierungsvorgang in Schritt (4) wird durchgeführt, durch portionsweises Schütten bei 0,5 Zellen pro 1 Well, gemäß einem „Limiting Dilution"-Verfahren.
Der Schritt (5) wird nach einem gut bekannten Verfahren durchgeführt. Im Vergleich zu dem Fall, bei dem ein kloniertes Hybridom in einem herkömmlichen Medium inkubiert wird und ein Antikörper aus dem Kulturüberstand erhalten wird, kann der Antikörper durch eine intraperitoneale Transplantation des Hybridoms in Mäuse mit einer mehrmals hundertfachen bis mehrmals tausendfachen Konzentration gewonnen werden.
Der Schritt (6) wird nach einem gut bekannten Verfahren durchgeführt. Es kann eine Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A oder Protein G durchgeführt werden.
Die Merkmale des vorliegenden monoklonalen Antikörpers können, wie im Folgenden gezeigt, zusammengefasst werden:

(1) Er ist an ein dimeres MP52 gebunden.
(2) Er ist nicht an ein monomeres MP52 gebunden.
(3) Seine H-Ketten Unterklasse ist γ.
(4) Er hat nicht mit anderen osteogenetischen Faktoren, die zur TGF-β-Genfamilie gehören, insbesondere TGF-β und BMP-2, die ähnliche Aminosäuresequenzen aufweisen, kreuzreagiert.

Die Reinigung von humanem MP52 unter Verwendung des vorliegenden monoklonalen Antikörpers kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Der vorliegende monoklonale Antikörper wird auf einem Adsorbens, wie beispielsweise Sephadex (hergestellt von Pharmacia), adsorbiert. Eine grob gereinigte Lösung von humanem MP52 wird durch das Adsorbens geleitet, um humanes MP52 zu adsorbieren. Als nächstes kann das adsorbierte humane MP52 mit einem geeigneten Eluenten auf herkömmliche Weise behandelt werden, um humanes MP52 mit einer höheren Reinheit hervorzubringen.
Die Antikörper können durch das Sandwich ELISA-Verfahren unter Verwendung der gereinigten monoklonalen Antikörper (20 Spezies von aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 und 22) und den jeweils HRPO-markierten monoklonalen Antikörpern in Typen klassifiziert werden.
Als Ergebnis davon wurden die monoklonalen Antikörper, welche sich in ihrer Spezifität für 10 Spezien von Epitopen unterscheiden, identifiziert. Sie wurden wie angegeben als Typen A, B, C, D, E, F, G, H, I und J klassifiziert.
Es ist bekannt, dass die Ratten-osteoblastische Zelllinie ROB/C26 einen Rezeptor für das humane MP52 besitzt. Es ist bekannt, dass wenn das humane MP52 zu der Kultur dieser Zelllinie zugegeben wird, die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) erhöht wird. Wenn die gereinigten monoklonalen Antikörper zu der Kultur zugegeben werden und sie die ALP-Aktivität hemmen, so bedeutet das, dass sie die biologische Aktivität von humanem MP52 hemmen.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Spezien von aMP-4, 5, 8, 11, 20 und 21 eine starke hemmende Wirkung zeigen. Von den so getesteten Spezien waren aMP-4 und aMP-5 Antikörper, die spezifisch mit dem D-rhMP52 reagierten und sie wurden daher als monoklonale Antikörper beurteilt, die in der Lage waren, die MP52/MP52-Rezeptor-Bindung unter physiologischen Bedingungen wesentlich zu hemmen.
Die Quantifizierung von humanem MP52 unter Verwendung des vorliegenden monoklonalen Antikörpers kann durch ein gut bekanntes ELISA-Verfahren durchgeführt werden. Spezifische Beispiele dafür sind ebenfalls als Beispiele in der vorliegenden Beschreibung offenbart. Die Quantifizierung von humanem MP52 kann mit einer so niedrigen Sensitivität wie 42,4 pg/ml durchgeführt werden.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 ist eine Plasmidkarte des durch Referenz 1 (2) erhaltenen rhMP52-Expressionsvektors (pKOT245).
2 ist eine Plasmidkarte des CHO-MP52-Expressionsvektors pMSS99 (5,0 kb). Die Basensequenz der CHO-MP52-DNA sind die Nukleotide von 576 bis 2297, wie in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls gezeigt.
3 ist eine Fotografie eines Western Blot-Analyse-Diagramms der Reaktivität des vorliegenden monoklonalen Antikörpers gegenüber einem monomeren rhMP52 (A) und einem dimeren rhMP52 (B).
4 ist ein Diagramm, welches erhalten wurde, wenn die Identifizierung (d. h. Typisierung) der vorliegenden monoklonalen Antikörper untersucht wurde. Als veranschaulichende Beispiele sind solche Antikörper gezeigt, die mit aMP-1 und aMP-4 beschichtet sind.
5 ist ein Diagramm, welches die Quantifizierungskurven für MP52 unter Verwendung des vorliegenden monoklonalen Antikörpers zeigt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Referenzen und Beispiele veranschaulicht.
Referenz 1 – Herstellung von rhMP52
1. Konstruktion des Expressionsvektors
(1) Isolierung einer maturen Region von MP52
Eine mature Region von humaner MP52-cDNA wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung des Plasmidvektors (pSK52s), welcher cDNA, die in WO 93/16099 beschrieben wurde, als Matrizen-DNA enthält.
Gemäß dem Verfahren zur Steigerung der Produktivität der Zielproteine, über das von M. Nobuhara et al. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331–1338, 1988) berichtet wurde, wurde ein Teil der DNA der maturen Region des MP52-Gens durch eine bestimmte DNA-Sequenz ersetzt, die keine Alternierung der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz erlaubt, um den AT-Gehalt in der Nähe des ATG-Startcodons zu erhöhen.
Die Rekonstruktion wurde durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung des bestimmten 5'-PCR-Primers eingeführt, welcher die Mutation der SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls umfasst. Für die DNA-Sequenz der PCR-Primer wurde die DNA in SEQ ID Nr. 3 als 5'-Primer und die DNA in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls als 3'-Primer verwendet.
Die PCR wurde durchgeführt, indem die Matrizen-DNA (10 ng), 50 pmol jedes der PCR-Primer in einer Vorwärtsrichtung und in Rückwärtsrichtung, dNTP (0,2 mmol) und MgCl₂ (1,5 mmol) in dasselbe Testgefäss zusammen mit Taq DNA-Polymerase (5 U) zugegeben wurden.
Es wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt; die Bedingungen jedes Zyklus waren 94°C für eine Minute zur Denaturierung, 55°C für eine Minute zum Primer-Annealing und 72°C für zwei Minuten zur Primer-Extension.
Die bei der PCR erhaltenen Produkte wurden durch Elektrophorese in 1,5%-iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC) isoliert und die Fragmente mit ungefähr 360 bp wurden isoliert (Fragment 1).
(2) Konstruktion eines E. coli-Expressionsvektors für das erfindungsgemäße Protein
Um die Anzahl der Kopien des Plasmids pro Bakterium zu steigern, wurde die ori-Region für den Replikationsursprung von der des pBR-Vektors gegen die des pUC-Vektors ausgetauscht. Die Taq-Promotor-Region wurde aus dem im Handel erhältlichen E. coli-Expressionsvektor pKK223-3 (bezogen von Pharmacia Biotech) durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SspI und EcoRI isoliert, mit Mungbohnennuklease (Takara Shuzo, Katalog-Nr. 2420A) behandelt, an das Startkodon von Fragment 1 ligiert durch T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo, Katalog 2011A). Die rrnBT₁T₂-Terminator-Region von pKK223-3 wurde durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SalI und SspI isoliert, mit dem Endkodon von Fragment 1 ligiert, welches durch SalI verdaut war. Anschließend wurde sie in die SmaI-Stelle des pUC18-Vektors ligiert, um den Expressionsvektor {pKOT245 (Accession Nr. BIKOKEN-KI-FERM BP-5499)} (1) zur Herstellung des Proteins zu konstruieren. Die Länge von pKOT245 beträgt 3,7 kb. Die Nukleotidsequenz des für das Protein konstruierten Expressionsvektors wurde mit einem Pharmacia ALF DNA-Sequenzierer analysiert.
(3) Transformation
Die Transformation wurde gemäß dem Rubidiumchlorid-Transformationsvertahren von Kushner et al. (Genetic Engineering, S. 17, Elsevier, 1978) durchgeführt. PKOT245 wurde verwendet, um den Wirtsstamm E. coli W3110M nach dem oben beschriebenen Verfahren zu transformieren, um E. coli Transformante für die Herstellung des Proteins zu produzieren.
2. Kultivierung
(1) Kultivierung
Die E. coli, welche das erfindungsgemäße Protein exprimieren, wurden in modifiziertem SOC-Medium (Bactotrypton 20 g/l, Bactohefeextrakt 5 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgCl₂·6H₂O 2,03 g/l, Glucose 3,6 g/l) vorkultiviert. Es wurden 100 ml der Bakteriensuspension verwendet, um 5 l des Produktionsmediums (Bactotrypton 5 g/l, Zitronensäure 4,3 g/l, K₂HPO₄ 4,675 g/l, KH₂PO₄ 1,275 g/l, NaCl 0,865 g/l, FeSO₄·7H₂O 100 mg/l, CuSO₄·5H₂O 1 mg/l, MnSO₄·nH₂O 0,5 mg/l, CaCl₂·2H₂O 2 mg/l, Na₂B₄O₇·10H₂O 0,225 mg/l, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0,1 mg/l, ZnSO₄·7H₂O 2,25 mg/l, CoCl₂·6H₂O 6 mg/l, MgSO₄·7H₂O 2,2 g/l, Thiamin HCl 5,0 mg/l, Glucose 3 g/l) zu impfen, welches in einem 10 Liter Fermentierer unter Rühren bei Luftzufuhr kultiviert wurde, und anschließend wurde beim Erreichen des frühen Stadiums der logarithmischen Wachstumsphase (OD₅₅₀ = 5,0) Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Kultivierung wurde fortgeführt bis OD₅₅₀ = 150 erreicht war. Während der Kultivierung wurde die Temperatur bei 32°C und der pH-Wert durch Zugeben von Ammoniak bei 7,15 gehalten. Um eine Verringerung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu verhindern wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht um die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei einer Luftsättigung von 50% zu halten. Die Kultivierung wurde durch Zugabe einer 50%igen Glucoselösung bei einem Wert von 0,2%, fortgeführt, um eine hohe Zelldichte zu erhalten, wobei es Anzeichen einer plötzlichen Erhöhung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff gab.
(2) Herstellung von E. coli-Einschlusskörpern
Die durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche anschließend in 25 mM Tris-HCl-Puffer suspendiert wurden, der 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (pH 7,3) enthielt. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie durch einen Homogenisierer (hergestellt von APV Gaulin Inc.) geleitet wurden und es wurde erneut zentrifugiert, um das Präzipitat, welches die Einschlusskörper enthält, zu ernten.
3. Reinigung
(1) Solubilisieren von E. coli-Einschlusskörpern
Nach dreimaligem Waschen mit 1%igem Triton X-100 wurden die E. coli Einschlusskörper mit 3000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und anschließend wurde das resultierende Präzipitat unter Schallbehandlung mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 8,3, 8 M Harnstoff, 10 mM DTT und 1 mM EDTA solubilisiert.
(2) Herstellung von Monomeren
Die solubilisierte Lösung wurde für 30 Minuten bei 4°C mit 20 000 g zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde gesammelt. Der erhaltene Überstand wurde mit SP-Sepharose FF (Pharmacia AB) behandelt, äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 6 M Harnstoff und 1 mM EDTA und anschließend nach dem Waschen mit derselben Lösung wurde er mit der gleichen Lösung, die 0,5 M NaCl enthielt, eluiert. Zum Eluat wurden Na₂SO₃ und Na₂S₄O₆ zugegeben, um die jeweilige Endkonzentration von 111 mM bzw. 13 mM zu erreichen und anschließend wurde bei 4°C für 15 Stunden sulfoniert. Die sulfonierte Lösung wurde gelfiltriert an Sephacryl S-200 (Pharmacia AB), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 6 M Harnstoff, 0,2 M NaCl und 1 mM EDTA, um gereinigte sulfonierte Monomere des erfindungsgemäßen Proteins zu erhalten.
(3) Rückfaltung
Die Lösung der sulfonierten Monomere wurde unter Rühren in ein 9-faches Volumen an 50 mM Na-Glycin-Puffer pH 9,8, 1 M NaCl, 30 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 2 mM GSH (reduzierte Form von Glutathion) und 1 mM GSSG (oxidierte Form von Glutathion) zugegeben und anschließend für 3 Tage bei 4°C inkubiert, zur Oxidation und Rückfaltung des erfindungsgemäßen Proteins.
(4) Herstellung von Homodimeren
Das rückgefaltete MP52 wurde auf eine RESOURCE RPC-Säule (Pharmacia AB) einer Revers-Phasen-HPLC aufgebracht, die mit 25%igem Acetonitril, welches 0,05 TFA enthielt voräquilibriert war, und anschließend wurde mit einem linearen Gradienten von 25–45% Acetonitril, welches 0,05% TFA enthielt, eluiert. Das Eluat wurde bei einer Absorption von 280 nm überwacht. Die Fraktionen des homodimeren Proteins wurden gesammelt und lyophilisiert. Die Probe wurde durch Sephacryl S-200 gelfiltriert, welches mit 20 mM Tris-Phosphatpuffer mit pH 8,0 äquilibriert war, der 0,8 M Harnstoff und 1 M NaCl enthielt, und anschließend wurden die Fraktionen mit homodimerem Protein auf dieselbe Weise wie oben beschrieben unter Verwendung von Reverse-Phasen-HPLC gesammelt.
(5) Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des gereinigten erfindungsgemäßen Proteins
a) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse hinsichtlich der N-terminalen Aminosäuresequenz der gereinigten Proteine wurde unter Verwendung eines Aminosäuresequenzierers Modell 476A (Applied Biosystems Inc.) durchgeführt, um die Aminosäuresequenz vom N-Terminus zur 30. Aminosäure der Sequenz zu bestätigen, wie in SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls gezeigt.
b) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Die Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung der gereinigten Proteine, die oben erhalten wurden, wurde mit einem Aminosäuresequenzierer (PICO TAG Systems, Waters) durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Die in Tabelle 1 beschriebene Nummer gibt die Anzahl der Aminosäurereste pro einem monomeren Protein an. Tabelle 1

–: nicht detektierbar

c) Analyse durch Elektrophorese
Durch SDS-PAGE Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde bestätigt, dass das Molekulargewicht der oben erhaltenen gereinigten Proteine etwa 28 kDa beträgt.
Aus den in den obigen Punkten a), b) und c) gezeigten Ergebnissen geht hervor, dass das erfindungsgemäße Protein ausschließlich 119 Aminosäurereste umfasst, ausgehend vom N-terminalen Pro.
Referenz 2 – Herstellung von CHO-MP52
(1) Konstruktion des Expressionsvektors für CHO-MP52
Der pSK52s-Vektor, welcher humanes MP52-Gen enthält, welcher von Dr. Hötten von Biopharm GmbH bezogen wurde, wurde mit HindIII verdaut und ein DNA-Fragment, welches humanes MP52 enthielt, wurde durch Extraktion aus 0,8%igen, niedrig schmelzenden Agarosegelen isoliert und in die HindIII-Stelle des pABstop-Vektors ligiert, welcher von Dr. Gerd Zettlmeissl von Behringwerke AG bezogen wurde. Die Struktur des CHO-MP52-Expressionsvektors, pMSS99 (5,0 kb), wie in 2 gezeigt, wurde durch DNA-Sequenzierung und Restriktionsenzym-Mapping bestätigt. Die CHO-MP52 DNA-Sequenz in pMSS99 waren die Nukleotide von dem 576. zu dem 2279., gezeigt in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls.
(2) Etablierung von CHO-Klonen, welche CHO-MP52 produzieren
CHO-DUKX-B11-Zellen, Mutanten von CHO-Zellen, die von Dr. Zettlmeissl von Behringwerke AG bereitgestellt wurden, wurden durch ein Calciumphosphatvermitteltes DNA-Transferverfahren mit pMSS99 und pSVOAdhfr cotransfiziert, welche ebenfalls von Dr. Zettlmeissl bereitgestellt wurden. Anschließend wurden sehr produktive Klone von CHO-MP52 durch ein Genamplifikationsprotokoll unter Verwendung von Methotrexat (MTX) etabliert.
10 μg an pMSS99 und 2 μg an pSVOAdhfr wurden in 1 ml an 25 mM HEPES-140 mM NaCl-0,75 mM Na₂HPO₄ (pH 7,05) gelöst, anschließend mit 50 μl an 2,5 M CaCl₂ vermischt. Die resultierenden Präzipitate wurden in einer 10 cm Schale auf CHO-DUKX-B11-Zellen aufgebracht, und sie standen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurden 8 ml an MEM ALPHA mit Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden (MEMα⁺), welche 10% fötales Kälberserum (FBS) enthielten, zu der Zellschicht zugegeben, um in einem CO₂-Inkubator für 4–6 h zu inkubieren. Nach der Behandlung mit 10%igem Glycerin in MEMα⁺, welches 10% FBS enthielt für 3 min bei Raumtemperatur, wurden die Zellen in MEMα⁺, welches 10 FBS enthielt, für 2 Tage kultiviert. Anschließend wurden die Zellen erneut in MEM ALPHA ohne Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside (MEMα^–) gegeben, welches 10% dialysiertes FBS enthielt, um die Transformanten zu selektieren. Die transformierten Klone wurde isoliert und durch Western Blot-Analyse, wie im nächsten Abschnitt beschrieben, auf die Expression von CHO-MP52 untersucht.
Die CHO-MP52-produzierenden Klone wurden schrittweise weiter selektiert in steigenden Konzentrationen an Methotrexat (MTX), um das MP52-Gen entsprechend mit dem pSVOAdhfr-Gen zu amplifizieren. Verschiedene Klone wurden erhalten, die 1–3 μg an CNO-MP52/10⁶-Zellen/24 h bei 400 nM MTX produzieren.
(3) Detektion von CHO-MP52 in den Kulturüberständen
Die Klone wurden wie folgt durch Western Blot-Analyse auf die Expression von CHO-MP52 untersucht: die Kulturüberstände (1–15 μl) wurden auf SDS-PAGE (15–25% Polyacrylamid-Gradient-Gel, Daiichi Pure Chemicals) unter reduzierenden Bedingungen aufgetragen, anschließend wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert (Clear Blot Membrane-P, ATTO). Die Membran wurde für 1 h mit Block Ace (Dai-Nihon Seiyaku) blockiert, mit Tris-gepufferter Saline (TBS) gespült, anschließend mit 10 μg/ml an Hühnerantikörpern gegen CHO-MP52 in 10fach verdünntem Block Ace über Nacht behandelt. Nach dem Waschen der Membran mit 0,1%igem Tween 20 in TBS (TTBS) wurde die Membran mit Hasenanti-Hühner IgG-ALP-Konjugat (Sigma A 9171) in 10fach verdünntem Block Ace für 1 h behandelt. Die Membran wurde mit TTBS gewaschen, anschließend mit alkalischem Phosphatase-Konjugat-Substrat-Kit (BIO-RAD) umgesetzt, um die Banden, welche MP52 entsprechen, sichtbar zu machen.
(4) Zellkultur der CHO-MP52 produzierenden CHO-Zelllinie
Die CHO-Zelllinie mit der höchsten Produktivität an CHO-MP52, MC-2 (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5142) wurde mit Rollflaschen, die MEMα^– supplementiert mit 10% FBS, 400 nM MTX, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin enthielten, aufgezogen. Nachdem die MC-2 Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie mit serumfreiem MEMα^– gewaschen und anschließend in serumfreiem DME/F12, welches mit 10 mM HEPES (pH 7,3), 10 KIU Aprotinin, 1 mM Natriumbutyrat, 6 μg/ml Natriumselenat, 5 μg/ml Transferrin, 18 μg/ml Ethanolamin, 9 μg/ml Insulin, 10 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin supplementiert war, kultiviert. Das konditionierte Medium wurde für eine Woche jeden Tag gesammelt.
(5) Reinigung von CHO-MP52
Der CHO-Kulturüberstand und 0,1 Vol. an 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, wurden gemischt und auf eine POROS HS-Säule (10 ml, PerSeptive Biosystems) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, äquilibriert worden war. Die Proteine wurden mit einem linearen Gradienten an NaCl von 0,05 bis 2 M eluiert und in 20 Fraktionen a 10 ml gesammelt. Es wurde beobachtet, dass es sich bei den eluierten MP52 um drei Typen von Monomeren handelte, und ihre ungefähren Molekulargewichte wurden durch SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen als 52, 40 und 14 kD ermittelt. Diese Monomere bilden drei Typen von Homodimeren (104 kD, 80 kD und 28 kD) und drei Typen von Heterodimeren (92 kD: 40 kD–52 kD, 66 kD: 14 kD–52 kD und 54 kD: 14 kD–40 kD) und alle diese Dimere wurden als CHO-MP52 bezeichnet außer dem 28 kD Homodimer, welches als das mature Homodimer von humanem MP52 bekannt zu sein schien (WO 95/04819). Daher wurden das 104 kD Homodimer und das 80 kD Homodimer aus den obigen Fraktionen isoliert, um die N-terminalen Aminosäuresequenzen und die biologischen Aktivitäten zu untersuchen.
Die Fraktionen von der 5. bis zur 9. Fraktion wurden zusammengefasst und auf das etwa 10fache konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Superdex 200 pg (1,6 I. D. × 60 cm, Pharmacia) aufgebracht, die zuvor mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,1, welcher 1 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Das Eluieren wurden bei einer Flussrate von 0,5 ml/min durchgeführt. Die Fraktionen, welche das 104 kD Homodimer enthielten, und die Fraktionen, welche das 80 kD Homodimer enthielten, wurden separat zusammengefasst. Jede wurde auf eine Revers-Phasen-HPLC-Säule aufgetragen (RESOURCE RPC, 3 ml, Pharmacia) und diese wurde mit 35–40% Acetonitril eluiert. Die Konzentrationen des isolierten CHO-MP52 wurden durch Densitometrie der Banden der Proteine auf SDS-PAGE-Gel ermittelt.
Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Puls-Flüssiggasphasensequenzierers (Applied Biosystems Modell 476) für das 80 kD Homodimer bzw. das 108 kD Homodimer durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Die 80 kD Aminosäuresequenzen gingen aus von Lys 121 oder Ala 122 bis zu Arg 474 und die Sequenz von 104 kD war von Ala 1 bis Arg 474 in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls. Es wurde kürzlich entdeckt, dass die CHO-Zellen drei Typen von Homodimeren, 104 kD, 80 kD und 28 kD und drei Typen von Heterodimeren, nämlich Dimere mit 92 kD, 66 kD und 54 kD produzierten.
Beispiel 1
1. Antigenherstellung und Sensibilisierungsverfahren
Ein Dimer (im Folgenden hierin kurz als „D-rhMP52" bezeichnet, wie speziell in Referenz 1 beschrieben) wurde exprimiert von E. coli (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5499) mit einem Plasmid (pKOT245), welches eine cDNA enthält, die für die Aminosäuresequenz von humanem MP52 kodiert, und durch Oxidieren eines monomeren rhMP52, welches durch Solubilisieren des Einschlusskörpers durch das Standardverfahren erhalten wurde, konstituiert. Das D-rhMP52 durchlief solche Verfeinerungsverfahren, wie beispielsweise isoelektrische Präzipitation und Gelpermeation, um das rhMP52 mit der Endkonzentration von etwa 0,5 mg/ml zu erhalten. Dieses gereinigte rhMP52 wurde als Antigen verwendet. Andernfalls wurde ein Dimer (im Folgenden hierin kurz als „CHO-MP52" bezeichnet, wie insbesondere in Referenz 2 beschrieben) von einer CHO-Zelle (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5142) exprimiert und in den oben genannten Konzentrationen als Antigen verwendet. Die Herstellung einer immunisierten Maus wurde bewirkt, indem einer BALB/c-Maus durch intraperitoneale Injektion 70, 20, 10 und 52 μg der Emulsion verabreicht wurden, die durch Lösen des CHO-MP52 (welches nicht weniger als 80% eines unvollständig verarbeiteten Vorläufers enthielt) in einer wässrigen 10 mM Salzsäurelösung und Mischen der resultierenden Lösung mit einem kompletten Freundschen Adjuvans (CFA) in einem Verhältnis von 1 : 1 jeweils am 0., 7., 16. und 112. Tag hergestellt wurde, und 18 μg der entsprechend hergestellten Emulsion des MP52 (welche etwas eines Monomers enthielt) am 29. Tag verabreicht wurden, und nach einem Intervall von etwa einem Monat 50 μg der Emulsion verabreicht wurde, die durch Mischen einer Lösung, welche das D-rhMP52 enthielt, mit einem inkompletten Freundschen Adjuvans (IFA) in einem Verhältnis von 1 : 1 erhalten wurde. Der so kontinuierlich sechs Mal sensibilisierten Maus wurden am 42. Tag nach der letzten Injektion 60 μg des D-rhMP52 subkutan verabreicht ohne Verwendung eines Adjuvans, und nach einem Intervall von 42 Tagen (3 Tage vor Fusion der Zelle) wurden 50 μg des D-rhMP52 intravenös durch die Schwanzvene injiziert.
Beispiel 2 Zellfusion
Nach 3 Tagen nach der letzten Immunisierung wurde die Milz der sensibilisierten Maus exzidiert und Milzzellen wurden präpariert. Die so erhaltenen Milzzellen wurden mit einer murinen Myelomzelllinie (SP2/0) in einem Verhältnis von 10 : 1 vermischt, die resultierende Mischung wurde mit 1500 Upm zentrifugiert und die Zellpellets wurden langsam gelöst, wenn sie in 40%igem Polyethylenglycol (PEG1500) bei 37°C warm gehalten wurden. Die gelösten Zellpellets wurden vorsichtig mit der Spitze einer Pipette gerührt, während langsam 1 ml eines RPMI 1640 Kulturmediums, das FCS ausschließt (hergestellt von Nissui Seiyaku K. K.), dazu gegeben wurde. Anschließend wurde die Geschwindigkeit der Zentrifugation innerhalb eines Zeitraums von ungefähr 6 Minuten stufenweise von 250 Upm auf 1000 Upm erhöht. Die am Ende der beschleunigten Zentrifugation erhaltenen Pellets wurden einmal mit einem FCS-freien Kulturmedium gewaschen. Schließlich wurden die Pellets mit Hilfe einer Lösung, die durch Zugabe von HAT [Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T)] zu einem RPMI 1640 Kulturmedium, welches 20 FCS enthielt, hergestellt wurde, über die Wells einer 96-Well-Platte verteilt um so 10 000 Milzzellen in jedes Well einzubringen.
Beispiel 3 Primäres Screening durch das ELISA-Verfahren
Das Produkt aus ungefähr 6000 fusionierten Zellen wurde durch das folgende Verfahren auf die Fähigkeit hin untersucht, einen monoklonalen Antikörper gegen humanes MP52 zu ergeben.

1) Das für die Immunisierung verwendete D-rhMP52 und ein monomeres rhMP52, welches erhalten wurde, indem das D-rhMP52 reduziert wurde und das Reduktionsprodukt einer Sulfonierung von dessen SH-Gruppe unterzogen wurde (im Folgenden hierin kurz als „M-rhMP52" bezeichnet), um die -ss-Bindung zu hemmen, wurden auf Platten (NUNC, MAXISORP) aufgebracht, jeweils mit einer Konzentration von 1 μg/ml in einer festen Menge von 50 μl und sie wurden bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert, um die Platten zu beschichten.
2) Die beschichteten Platten wurden mit PBS (Waschflüssigkeit), welches Tween 20 enthielt, gewaschen und anschließend wurde dazu der nicht-verdünnte Kulturüberstand in einer festen Menge von 50 μl pro Well der Platte hinzugefügt, und es wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
3) Die Inhalte der Wells wurden drei Mal mit der Waschflüssigkeit gewaschen und anschließend wurden zu den Wells HRPO-markierte Hasenimmunoglobulin-Antikörper gegen Mausimmunoglobuline (DAKO, F206) in einer Konzentration von ungefähr 1 μg/ml in einer festen Menge von 45 μl pro Well hinzugefügt. Das in diesem Fall verwendete Verdünnungsmittel wurde hergestellt, indem Casein (hergestellt von Kanto Kagaku K. K.) in einer Konzentration von 2 mg/ml in einer 0,1 M Tris-Hydroxymethylaminomethan-Pufferlösung (TBS, pH 7,4) gelöst wurde.
4) Die Wells wurden bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert und drei Mal mit der Waschflüssigkeit gewaschen, und zu den gewaschenen Wells wurde eine farbgebende Flüssigkeit (Chromogen-TBM, hergestellt von Behringwerke) in einer festen Menge von 50 μl pro Well zugegeben.
5) Die folgende Färbereaktion wurde bei Raumtemperatur für ungefähr 5 Minuten ablaufen gelassen und dann durch Zugabe von 50 μl an 0,5 N Schwefelsäure angehalten.
6) Der Färbegrad wurde innerhalb von 30 Minuten nach dem Anhalten der Reaktion bei einer Absorption von OD₄₅₀ nm gemessen.

Von insgesamt 23 aufeinander folgend synchronisierten monoklonalen Antikörpern aMP-1 bis aMP-23 wurden die 20 monoklonalen Antikörper, außer aMP-17, aMP-19 und aMP-23, die den anschließenden Klonierungsprozess nicht überstanden, erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Bei der Unterscheidung zwischen dem positiven und dem negativen Test wurde der Durchschnittswert ±10 SD (OD₄₅₀ nm = 0,05) als Cutoff-Wert verwendet. Die monoklonalen Antikörper aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 14, 15, 18 und 22 reagierten nur mit D-rhMP52 und die monoklonalen Antikörper aMP-8, 10, 11, 13, 16, 20 und 21 reagierten sowohl mit D-rhMP52 als auch mit M-rhMP52. Die 20 monoklonalen Antikörper wurden vom Gesichtspunkt der Spezifität her in zumindest zwei Arten von Antikörpern eingeteilt.
Beispiel 4 Bestätigung der Spezifität durch das Western Blot-Verfahren

1) Das rhMP52 (1 μg/Spur/0,5 mm) wurde SDS-PAGE unter Verwendung eines 15–25% Gradientengels (hergestellt von Daiichi Kagakusha K. K.) unterzogen, unter nicht-reduzierenden Bedingungen (um zu bewirken, dass das Antigen als D-rhMP52 wandert) und unter reduzierenden Bedingungen (um zu bewirken, dass das Antigen als M-rhMP52 wandert), und anschließend durch das Standardverfahren auf eine Nitrocellulosemenbran transferiert (30 V, 2 h).
2) Die Nitrocellulosemembran, welche die Basis für den Transfer gebildet hatte, wurde für nicht weniger als 20 Minuten in einer TBS-Lösung, welche Casein mit einer Konzentration von ungefähr 3 mg/ml enthielt, eingetaucht belassen, um eine nicht-spezifische Reaktion zu blockieren.
3) Die Nitrocellulosemembran, die das transferierte rhMP52 trägt, wurde in dem Kulturüberstand, welcher einen monoklonalen Antikörper (im Bereich von 4 μg/ml– 40 μg/ml) enthielt, inkubiert, indem sie beim Raumtemperatur für eine Stunde in dem Kulturüberstand in dessen nicht-modifizierter Form geschüttelt wurde.
4) Der inkubierte Antikörper wurde mit einer großen Menge an Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,2) gewaschen (drei Mal erneutes Eintauchen in die Lösung für 5 Minuten, wobei die Lösung am Ende jedes Eintauchens durch einen neuen Vorrat ersetzt wurde).
5) HRPO-markierte Hasenimmunoglobulin-Antikörper gegen Mausimmunoglobuline wurden als zweiter Antikörper in einer Konzentration von 1 μg/ml in eine Casein-TBS-Verdünnungslösung gegeben und darin bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
6) Der inkubierte Antikörper wurde auf dieselbe Weise wie oben in 4) sorgfältig gewaschen.
7) Der gewaschene Antikörper wurde eingetaucht in einem farbgebenden Mittel (TrueBlue/Peroxidasesubstrat, hergestellt von Kirkegaard Perry Laboratories) belassen, um eine Färbereaktion einzugehen. Anschließend wurde er sorgfältig mit fließendem Wasser gewaschen. Die Ergebnisse stimmten mit denen des primären Screenings mit ELISA überein. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.

Beispiel 5 Bestimmung der Unterklasse des monoklonalen Antikörpers
Die Unterklassen eines monoklonalen Antikörpers, der von dem Klon produziert wurde, wurde bestimmt durch die Verwendung eines Maus-monoklonalen Antikörper-Isotypisierungskits, RPN29, hergestellt von Amersham Corp., entsprechend dessen Bedienungsanleitung. Die Unterklassen des monoklonalen Antikörpers sind in Tabelle 4 gezeigt. Es wurde gefunden, dass alle monoklonalen Antikörper eine L-Ketten-Unterklasse κ und eine H-Ketten-Unterklasse γ1 oder γ2a besitzen.
Beispiel 6 Bestätigung der Spezifität
Das humane MP52 ist ein Molekül, welches der TGF-β-Genfamilie angehört und es wurde gefunden, dass es bezüglich der Struktur und der Aminosäuresequenz der übrigen TGF-β-Genfamilie, insbesondere TGF-β2 und BMP-2, ähnelt. Um den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zu untersuchen und zu bestimmen, ob er eine Spezifität für das humane MP52 aufweist oder nicht, wurden das humane rekombinante TGF-β2 (rhTGFß2) und das humane rekombinante BMP-2 (rhBMP-2) beschafft und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 oben dem ELISA-Test unterzogen, um ihre Spezifität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Keiner der monoklonalen Antikörper reagierte mit TGF-β2 und BMP-2. Es wurde somit bestätigt, dass sie spezifische Antikörper für MP52 sind.
Beispiel 7 Reinigung des Antikörpers
Die Reinigung der monoklonalen Antikörper aus dem Kulturüberstand und den Maus-Aszites-Flüssigkeiten wurde durch Verwendung der Protein-A- oder Protein-G-Säule (hergestellt von Pharmacia) entsprechend deren Betriebsanleitungen durchgeführt. Die Protein-A-Säule wurde verwendet, um den Antikörper aus dem Kulturüberstand zu reinigen und die Protein-G-Säule wurde verwendet, um den Antikörper aus den Aszites-Flüssigkeiten zu reinigen.
Beispiel 8 Sekundäres Screening (Typisieren) durch ein Sandwich-ELISA-Verfahren

1) Die gereinigten monoklonalen Antikörper (20 Spezien von aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 und 22) wurden jeweils über die Wells einer 96-Well-Platte mit einer Konzentration von 1 μg/ml verteilt, um die Wells jeweils mit einer festen Menge von 50 μl zu beschichten (eine Stunde bei Raumtemperatur).
2) Nachdem die beschichteten Wells drei Mal mit einer Waschflüssigkeit (BEP-II, hergestellt von Behringwerke) gewaschen worden waren, wurde eine Lösung, die durch Verdünnen des D-rhMP52 auf eine vorgeschriebene Konzentration von 30 ng/ml mit Casein/TBS erhalten wurde, in einer festen Menge von 50 μl über die Wells verteilt und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
3) Nach dreimaligem Waschen mit der Waschflüssigkeit wurden die oben in 1) gezeigten monoklonalen Antikörper, die zuvor durch Verwendung eines Antikörper-Markierungssystems (hergestellt von American Qualex Corp. und vertrieben unter der Bezeichnung „Biotinylation Kit") biotinyliert worden waren, jeweils mit Casein/TBS auf eine Konzentration von 1 μg/ml verdünnt, und die biotinylierten monoklonalen Antikörper wurden jeweils zu den Wells aller Arten von monoklonalen Antikörpern, die in 1) oben beschichtet worden waren, hinzugefügt. Beispielsweise wurden alle biotinylierten Spezies von aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 und 22 jeweils mit den Platten umgesetzt, die mit der Spezies aMP-1-beschichtet worden waren, und alle biotinylierten monoklonalen Antikörper wurden jeweils auf dieselbe Weise wie oben (Raumtemperatur für eine Stunde) mit den Platten umgesetzt, die mit den Spezies aMP-2–22-beschichtet worden waren.
4) Nach dreimaligem Waschen mit einer Waschflüssigkeit wurde eine HRPO-markierte AVIDIN-PEROXIDASE (hergestellt von Sigma) in einer Konzentration von 1 μg/ml zu Casein/TBS zugegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
5) Nach dem Waschen auf dieselbe Weise wie oben wurden sie auf dieselbe Weise wie in 3) und 4) einer Färbereaktion unterzogen.
6) Nach einer Inkubation für 15 Minuten wurde die Reaktion angehalten und das Ausmaß der Färbereaktion wurde auf dieselbe Weise wie in 3), 5) und 6) gemessen.

Ein Teil der Ergebnisse ist in 4 gezeigt. Ein und derselbe monoklonale Antikörper sollte in allen Kombinationen dieselben. Ergebnisse zeigen. Für die Spezies aMP-1 und aMP-4, die als Beispiel in 4 gezeigt sind, wurde jedoch gefunden, dass sie grundverschiedene Antikörper darstellen. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die Ähnlichkeit und Unähnlichkeit aller monoklonalen Antikörper bestimmt. Als Ergebnis wurden die monoklonalen Antikörper, welche sich in der Spezifität für 10 Spezies von Epitopen unterscheiden, identifiziert. Sie wurden wie in Tabelle 6 angegeben als Typ A, B, C, D, E, F, G, N, 1 und J klassifiziert.
Beispiel 9 Hemmung der biologischen Aktivität von D-rhMP52 durch den monoklonalen Antikörper
Es ist bekannt, dass die Ratten-osteoblastische Zelllinie ROB/C26 einen Rezeptor für das humane MP52 besitzt. Es ist bekannt, dass die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) erhöht wird, wenn das humane MP52 zu der Kultur dieser Zelllinie hinzugegeben wird. Wenn das rhMP52 in einer vorgeschriebenen Menge zugegeben wurde und alle gereinigten monoklonalen Antikörper in der Endkonzentration von 20 μg/ml zugegeben wurden, so wurde untersucht, ob sie die ALP-Aktivität hemmen oder nicht. Wenn das rhMP52 in einer Konzentration von 10 ng/ml zu ROB/C26 zugegeben wurde und anschließend für mehrere Tage inkubiert wurde, so wurde über den MP52-Rezeptor auf der Oberfläche der Zellen ein Reiz geleitet und als Folge davon wurde die ALP-Aktivität gesteigert. Die ALP-Aktivität konnte durch eine Färbereaktion quantifiziert werden, die mit einem für das ALP spezifischen Substrat hervorgerufen wurde, auf dieselbe Weise wie in ELISA (unter der Voraussetzung, dass die Wellenlänge für die Bestimmung OD₄₀₅ nm betrug). Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Das rhMP52 allein zeigte in Abwesenheit des Antikörpers eine ALP-Aktivität von 0,158 OD₄₀₅ nm. Diese ALP-Aktivität wurde durch die Zugabe eines monoklonalen Antikörpers verändert. Die Stärke der hemmenden Wirkung des monoklonalen Antikörpers war proportional zu der Kleinheit dieser Veränderung der APL-Aktivität abgestuft. Als Ergebnis wurde erkannt, dass die Spezien von aMP-4, 5, 8, 11, 20 und 21 eine starke hemmende Wirkung aufweisen. Von den auf diese Weise getesteten Spezies waren aMP-4- und aMP-5-Antikörper, die spezifisch mit dem D-rhMP52 reagierten (Tabelle 1), und sie wurden daher als monoklonale Antikörper eingestuft, die im Gegensatz zu den Spezien von aMP-8, 11, 20 und 21, die zusätzlich mit dem M-rhMP52 reagieren, dazu in der Lage waren, unter physiologischen Bedingungen die MP52/MP52-Rezeptor-Bindung wesentlich zu hemmen. Die Hybridoma, welche die monoklonalen Antikörper aMP-4 und aMP-5 ergeben, wurden beim Life Science Industrial Technology Research Institute der Agency of Industrial Technology hinterlegt (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan), unter den Hinterlegungs-Nummern FERM BP-5939 bzw. FERM BP-5940.
Beispiel 10 Quantifizierung von MP52 durch monoklonalen Antikörper durch das Sandwich-ELISA-Verfahren
Die monoklonalen Antikörper wurden wie in Beispiel 8 beschrieben in 10 Typen eingeteilt. Aus diesen wurde unter Verwendung von aMP-4 mit Typ C und aMP-5 mit Typ D ein Sandwich-ELISA konstruiert. Und zwar:

1) Eine 96-Well-Platte wird mit 50 μl gereinigtem aMP-5, jeweils mit einer Konzentration von 5 μg/ml, beschichtet (1 h, bei Raumtemperatur).
2) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit werden zu jedem Well 50 μl gereinigtes MP52 in einer Konzentration von höchstens 1 ng/ml, nach und nach mit Casein/Tris-Puffer verdünnt wird, zugegeben. Die Platte wird für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
3) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit werden zu jedem Well 50 μl an biotinyliertem gereinigtem aMP-4-Antikörper in einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
4) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit wird AVIDIN-PEROXIDASE (SIGMA A-3151) in einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
5) Nach Waschen mit einer Waschflüssigkeit wird die sich ergebende Färbereaktion auf dieselbe Weise fortschreiten gelassen wie bei 3) und 4) gezeigt.
6) Nach 30 Minuten wird die sich ergebende Färbereaktion durch Zugabe von 50 μl an 0,5 N Schwefelsäure angehalten.
7) Das Ausmaß der Färbung wurde nach dem Anhalten der Reaktion bei einer Absorption von OD₄₅₀ nm gemessen.

Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Die Detektionsgrenze lag bei ungefähr 23,9 pg/ml und die Quantifizierungsgrenze betrug 42,4 pg/ml.
In dieser Beschreibung bedeutet die Detektionsgrenze eine Konzentration an MP52, die entscheidend höher ist als die der Lösung ohne MP52 als Hintergrundkonzentration, und die Quantifizierungsgrenze bedeutet die niedrigste Konzentration an PM 52, die mit Zuverlässigkeit detektiert wird.
Tabelle 3 Ergebnis des anti-MP52 Antikörper Titers, detektiert durch ELISA
Tabelle 4 Unterklasse des monoklonalen Antikörpers
Tabelle 5 Spezifität des monoklonalen Antikörpers
Tabelle 6 Klassifizierung des monoklonalen Antikörpers
Tabelle 7 Test der Hemmung der ALP-Aktivität durch den monoklonalen Antikörper
Industriell anwendbar
Der erfindungsgemäße monoklonale Maus-Antikörper gegen humanes MP52 ist nützlich zur Verwendung beispielsweise für die Reinigung oder Untersuchung von humanem MP52, welches gentechnisch hergestellt wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes MP52 der an ein dimeres humanes MP52, aber nicht an ein monomeres humanes MP52 bindet.
Monoklonaler Maus-Antikörper nach Anspruch 1 mit den zusätzlichen nachfolgend erwähnten Merkmalen: (1) seine H-Ketten Unterklasse ist γ; (2) er kreuzreagiert nicht mit anderen osteogenetischen Faktoren, die zur TGF-β-Familie gehören, insbesondere TGF-β und BMP-2, die ähnliche Aminosäuresequenzen aufweisen.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei der monoklonale Antikörper an die aktive Stelle von humanem MP52 bindet.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der monoklonale Antikörper aMP-4, FERM P-15555 ist.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der monoklonale Antikörper aMP-5, FERM P-15556 ist.
Hybridom das in der Lage ist, den monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes MP52 nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zu produzieren.
Hybridom nach Anspruch 6, das in der Lage ist, den monoklonalen Maus-Antikörper aMP-4, FERM P-15555 oder aMP-5, FERM P-15556 zu produzieren.
Verfahren zur Reinigung eines dimeren humanen MP52, welches die Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humanes MP52 nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Verfahren zur Reinigung eines dimeren humanen MP52 nach Anspruch 8, welches die Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humanes MP52 aMP-4, FERM P-15555 oder aMP-5, FERM P-15556 umfasst.
In vitro-Verfahren zur Detektion eines dimeren humanen MP52, welches die Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humanes MP52 nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Verfahren zur Detektion eines dimeren humanen MP52 nach Anspruch 10, welches die Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humanes MP52 aMP-4, FERM P-15555 oder aMP-5, FERM P-15556 umfasst.
In vitro-Verfahren zur Hemmung der Aktivität von dimerem humanem MP52 unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humanes MP52 nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung eines monoklonalen Maus-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmzeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Aktivität von dimerem humanem MP52, welches an der Osteogenese beteiligt ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, welches die Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humanes MP52 aMP-4, FERM P-15555 oder aMP-5, FERM P-15556 umfasst.