DE69608682T2 - Verfahren zur diagnose von schizophrenie - Google Patents

Verfahren zur diagnose von schizophrenie

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose der Schizophrenie. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von Variationen in einer repetierten DNA-Sequenz, die in dem TH-Gen vorhanden ist, von denen bestimmte Formen spezifisch bei Schizophreniepatienten erscheinen. Die Erfindung betrifft auch zum Nachweis von spezifischen Allelen dieser repetierten Sequenz in Zusammenhang mit der Schizophrenie verwendbare Primer.
  • Die Anwesenheit von Mutationen in allen Klassen von repetierten DNA-Sequenzen ist ein bekanntes Phänomen. Jedoch ist die funktionelle Signifikanz dieser Mutationen unbestimmt. So stellen die Mikrosatelliten eine reichliche Klasse von repetierten DNA-Sequenzen dar, die einen großen Polymorphismus im Zusammenhang mit Variationen in der Anzahl von repetierten Motiven (Lit. 1) und/oder in der Sequenz dieser Motive darstellen. Diese Mikrosatelliten wurden deshalb als genetische Marker zur Konstruktion der genetischen Karten und zur Identifikation von Loci, die an bestimmten Pathologien beteiligt sind (Lit. 2), verwendet. Die Größe verschiedener Allele eines Mikrosatelliten hängt von Variationen in der Anzahl der repetierten Motive ab. Erfahrungen in der Sequenzierung von repetierten Dimeren erlaubten auch den Nachweis einer Variation in der Anzahl der repetierten Motive und in ihrer Sequenz. Diese Variationen können insbesondere vollständigen Repetitionen, d. h. ohne Unterbrechung in der Basensequenz, oder unvollständigen Repetitionen, die eine oder mehrere Unterbrechungen in der Sequenz der Motive entweder als Deletion(en) oder Insertion(en) enthalten (Lit. 3), entsprechen. Ebenso wurden auch Variationen der Länge und/oder der Sequenz bei den trimeren oder tetrameren repetitiven Motiven beobachtet. So wurden Variationen dieses Typs bei den Mi krosatelliten HUMHPRTB (Lit. 4) und HUMTH01 (Lit. 5) beobachtet.
  • Die Anmelderin hat sich besonders für die Erforschung genetischer Veränderungen im Zusammenhang mit der Schizophrenie interessiert. Dazu hat die Anmelderin eine Untersuchung bezüglich der Assoziation zwischen dem Gen der Tyrosinhydroxylase (TH) und der Schizophrenie, genauer über den Mikrosatelliten HUMTH01, durchgeführt. TH ist das begrenzende Enzym des Biosynthesewegs der Catecholamine. Verschiedene genetische Untersuchungen psychiatrischer und neurologischer Pathologien wurden unter Verwendung von im TH-Gen lokalisierten Markern durchgeführt (Lit. 6 und 7). Jedoch gibt es bis heute in der Literatur keinen Nachweis einer genetischen Assoziation mit der Schizophrenie.
  • Der Mikrosatellit HUMTH01 ist im ersten Intron des Gens der Tyrosinhydroxylase lokalisiert. Dieser Mikrosatellit besteht aus repetierten tetrameren TCAT-Motiven. Er zeigt einen bestimmten Polymorphismus, wobei von verschiedenen Allelen beschrieben wurde, dass sie zahlreiche variierte repetierte Motive besitzen. Das am häufigsten angetroffene Allel enthält 10 repetierte Motive und eine Deletion eines Basenpaars im fünften repetierten Motiv, das die CAT- Sequenz trägt.
  • Die Anmelderin hat so die Beteiligung des TH-Gens an der Schizophrenie untersucht, indem die Anwesenheit von Variationen der Sequenz und der Länge in dem Mikrosatelliten HUMTH01 untersucht wurde. Die erhaltenen Ergebnisse erlaubten den Nachweis, dass das vollständige Allel sehr selten war und nur bei Schizophreniepatienten vorhanden war. Diese Ergebnisse wurden an Patientenpopulationen verschiedenen ethnischen Ursprungs reproduziert. So wurden an einer französischen Population mit 239 Teilnehmern, davon 94 Schizophrenie-Kranke, 6 verschiedene Allele mit den Bezeichnungen A, B, C, D, Ei und Ep nachgewiesen. Diese ver schiedenen Allele unterscheiden sich untereinander um 4 Basenpaare (1 vollständiges Motiv), ausgenommen die zwei längeren, die sich um ein einziges Basenpaar unterscheiden. Die Sequenzierung dieser verschiedenen Allele erlaubte den Nachweis, dass das repetierte Motiv des Mikrosatelliten HUMTH01, die TCAT-Sequenz, in den Allelen A, B, C und D vollständig repetiert ist, die jeweils 6, 7, 8 bzw. 9 repetierte Motive enthalten. Umgekehrt zeigt das Allel E, das 10 repetierte Motive enthält, in der Mehrzahl der Fälle die gleiche Deletion eines Thymidins in einem fünften repetierten Motiv. Diese Deletion führt zu einem unvollständigen Allel der Sequenz (TCAT)4(CAT)(TCAT)5 mit der Bezeichnung Ei (für unvollständig). Das Allel Ei ist das häufigste Allel in der kaukasischen Population (Lit. 5). Im Gegensatz dazu ist das vollständige Allel E der Sequenz (TCAT)10 (mit der Bezeichnung Ep) sehr selten. So besaßen an der Gesamtheit der getesteten Population der Schizophrenen nur fünf Patienten ein vollständiges Allel. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen überraschenderweise, dass alle Probanden, die das Ep-Allel tragen, Schizophreniepatienten sind, während dieses Allel bei den 145 gesunden Kontrollen fehlt (vergleiche Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen einen hochsignifikanten Zusammenhang zwischen der Anwesenheit des Ep-Allels und der Schizophrenie. Außerdem sind die 5 Schizophreniepatienten, die das Ep-Allel tragen, sporadische Schizophreniefälle, deren klinischer Subtyp eine paranoide Schizophrenie in einem Fall, eine undifferenzierte Schizophrenie in drei Fällen und eine desorganisierte Schizophrenie in einem Fall ist.
  • Die Anmelderin hat anschließend diese Untersuchung auf eine weitere Population eines anderen ethnischen Ursprungs ausgedehnt. So wurde eine Untersuchung zu einem ähnlichen Zusammenhang an einer Population von 88 Tunesiern durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Häufigkeit der verschiedenen Allele A-E, die an der getesteten tunesischen Population aufgefunden wird, sich signifikant von der unterscheidet, die bei der französischen Population beobachtet wurde (vergleiche Tabelle 1). Jedoch erwiesen sich nur 4 Individuen als Träger des vollständigen Allels Ep, die allesamt Schizophreniepatienten waren (1 paranoide Schizophrenie und 3 undifferenzierte Schizophrenien), wobei diese Formen auch dort sporadische Formen waren.
  • Diese Ergebnisse stellen den ersten Nachweis einer Assoziation zwischen TH und der Schizophrenie dar. Sie zeigen klar, dass das vollständige Ep-Allel des Mikrosatelliten HUMTH01 der Sequenz (TCAT)10 signifikant mit der Schizophrenie assoziiert sein kann und daher ein genetisches Werkzeug zum Aufspüren dieses Krankheitstyps darstellt.
  • Die Spezifität der Assoziation dieses Allels mit der Schizophrenie wurde weiterhin durch eine Untersuchung an einer Population von 100 Patienten mit einer sporadischen manisch-depressiven Psychose bestätigt. Die Anwesenheit des Ep-Allels wurde bei keinem dieser Patienten nachgewiesen.
  • Der Nachweis einer Assoziation zwischen diesem Allel und der Schizophrenie bietet zahlreiche Anwendungen auf dem Gebiet der Diagnose und Therapie. So bietet die vorliegende Erfindung erstmalig die Möglichkeit, Schizophrenie durch einen biologischen Test und nicht mehr ausschließlich durch klinische Argumente zu diagnostizieren. Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren zur Diagnose der Schizophrenie, bei dem man die Anwesenheit des Ep-Allels des Mikrosatelliten HUMTH01 in dem TH-Gen nachweist. Dieses Verfahren kann auch auf die Diagnose von Krankheitszuständen vom Bild der Schizophrenie, wie insbesondere der Schizotypie, schizoiden Individuen etc., angewendet werden. Die Erfindung erlaubt somit die Festlegung von Diagnosekriterien dieser Krankheitszustände, die heute ausschließlich klinischer Natur sind. Außerdem erlaubt die Erfindung auch den Nachweis von Prädispo sitionen dieses Typs von psychiatrischer Störung durch Identifikation einer genetischen Verletzbarkeit in den Familien von Patienten, die dieses Ep-Allel tragen. Von einem therapeutischen Gesichtspunkt aus erlaubt die Erfindung vorteilhafterweise die Definition von geeigneteren medikamentösen Behandlungen als Funktion des Typs der Schizophrenie. Unter Bestätigung der Hypothese einer Beteiligung des Catecholaminwegs erlaubt die Erfindung die Verwendung zielgerichteter Therapien. Außerdem, wenn die funktionellen Beteiligungen der Anwesenheit des Ep-Allels nicht definitiv gesichert sind, ist darauf hinzuweisen, dass der Mikrosatellit HUMTH01 im ersten Intron des TH- Gens lokalisiert ist, einer Region, von der gezeigt wurde, dass ein alternatives Spleißen zu 4 TH-Isoformen führt (Lit. 8). Es ist nun möglich, dass genetische Variationen in dieser Region die Regulation der Expression des TH-Gens beeinflussen und dass dies mit dem Auftreten der Schizophrenie in Zusammenhang steht.
  • Gemäß einem ersten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung nun ein Verfahren zur Diagnose der Schizophrenie, das durch die in-vitro-Detektion der Anwesenheit des Ep-Allels des Mikrosatelliten HUMTH01 in dem TH-Gen gekennzeichnet ist. Der Nachweis dieses Allels der Sequenz (TCAT)10 ist für bestimmte Schizophrenieformen charakteristisch. Das Fehlen dieses Allels schließt nicht die Existenz einer Schizophrenie aus, wobei dieses Allel in etwa 5% der Fälle angetroffen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch auf die genetische Charakterisierung von Schizophrenen und auf die Subtypisierung der Schizophrenie anwendbar. Wie vorstehend angegeben scheint das Ep-Allel nur bei sporadischen Schizophrenien vorhanden zu sein. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch auf den Nachweis der Prädisposition der Schizophrenie anwendbar.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Nachweis des Ep-Allels durch verschiedene Techniken durchgeführt wer den. Unter den verwendbaren Techniken können bevorzugt die Sequenzierung, die Abtrennung über Gel oder auch die SSCP- Technik (single strand conformation polymorphism) zitiert werden.
  • Bezüglich der Sequenzierung kann jedes einem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren verwendet werden. Insbesondere ist es vorteilhaft, einen automatischen DNA- Sequenzierer zu verwenden. Die Sequenzierung wird bevorzugt an doppelsträngigen Matrices durch das Kettenabbruchverfahren unter Verwendung fluoreszierender Primer durchgeführt. Ein Qeeignetes Kit hierfür ist das Sequenzierungkit Taq Dye Primat Kit von Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA). Die Sequenzierung des Mikrosatelliten HUMTH01 oder genauer eines isolierten Fragments, das diesen Mikrosatelliten trägt, erlaubt direkt die Erkennung des bei dem Patienten vorhandenen Allels und so den Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens des Ep-Allels der Sequenz (TCAT)10. Die durch Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse sind beispielsweise in Fig. 2 dargestellt.
  • Eine bevorzugte Technik zum Nachweis des Ep-Allels ist die Gelseparation. Diese Technik besitzt den Vorteil, dass sie die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Allelen als Funktion ihrer Größe erlaubt, ohne dass es notwendig ist, die DNA-Fragmente zu sequenzieren. Diese Technik beruht auf der Wanderung der denaturierten DNA-Fragmente unter denaturierenden Bedingungen in einem Acrylamidgel (bevorzugt 6%ig). Die Detektion der Banden kann durch jede einem Fachmann bekannte Technik, basierend beispielsweise auf der Verwendung von markierten Startersequenzen (insbesondere in γ an Phosphor), auf der Einführung von α- dCTP in die getesteten Fragmente, auf der Verwendung von kalten Sonden in α (alpha), auf eine Detektion mit Ethidiumbromid oder auch auf Hybridisierung (Blot) mit einer radioaktiv markierten Sonde beruhen. Ein genaues Protokoll zur Abtrennung über Gele ist beispielhaft in den Beispie len angegeben. Wie in Fig. 3 angegeben, erlaubt diese Technik die rasche Unterscheidung zwischen den Allelen A, B, C, D, Ei und Ep des Mikrosatelliten ohne Sequenzierung.
  • Bezüglich der Identifikationstechnik mittels SSCP handelt es sich auch um ein Trennverfahren über ein Acrylamidgel, aber unter nichtdenaturierenden Bedingungen. Diese Technik erlaubt die Unterscheidung der verschiedenen Fragmente als Funktion ihrer Konformation (vergleiche Beispiele).
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird an einer DNA-Probe des Patienten durchgeführt. Diese Probe muß mindestens den Mikrosatelliten HUMTH01 enthalten. Sie enthält bevorzugt die Gesamtheit oder einen Teil des ersten Introns des TH-Gens. Noch bevorzugter enthält sie ein Fragment des TH-Gens, das den Mikrosatelliten HUMTH01 in Angrenzung an flankierende Sequenzen enthält. Die zu testende DNA-Probe kann aus dem Patienten entnommenen Zellen erhalten werden. Es handelt sich bevorzugt um Blutzellen (beispielsweise mononukleäre Zellen), die leicht durch einfache Blutentnahme erhalten werden. Andere Zelltypen können verwendet werden, wie insbesondere die Fibroblasten, die Epithelzellen, die Keratinozyten etc. Die DNA wird anschließend aus den Zellen extrahiert und zur Detektion des Ep-Allels verwendet. Dafür kann die erhaltene genomische DNA mit Restriktionsenzymen gespalten, in geeignete Vektoren cloniert, auf TH beispielsweise oder durch Hybridisierung mit einer dem ersten Intron von TH entsprechenden Sonde selektioniert, anschließend wie vorstehend beschrieben analysiert werden. Ganz besonders bevorzugt wird die extrahierte DNA vorher einer oder mehreren Amplifikationsreaktion(en) unterworfen, um eine bedeutende Menge an der Region, die den Mikrosatelliten HUMTH01 trägt, entsprechenden Materials zu erhalten. Die Amplifikation kann nach jeder einem Fachmann bekannten Technik und insbesondere nach der sogenannten PCR-Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] durchgeführt werden. In dieser Hinsicht kann die Amplifikation unter Verwendung eines DNA thermal cycler (Perkin Eimer Cetus) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt werden. Die Bedingungen bezüglich Temperatur und des zur Amplifikation verwendeten Mediums sind die allgemeinen Bedingungen, wie beispielsweise in Maniatis et al., 1989 beschrieben. Spezifische Bedingungen sind auch in den Beispielen angegeben. Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, ein DNA-Fragment zu verwenden, das den HUMTH01-Mikrosatelliten mit einer ausreichend kleinen Größe enthält. Dies erlaubt vorteilhafterweise eine Unterscheidung zwischen den Allelen, ohne auf eine Sequenzierung zurückgreifen zu müssen. Außerdem, wenn die Kontrollexperimente zur Sequenzierung durchgeführt werden, ist es auch bevorzugt, nur Fragmente mit begrenzter Größe sequenzieren zu müssen. Vorteilhafterweise ist das verwendete DNA-Fragment ein amplifiziertes Fragment einer Größe kleiner 300 bp. Dieses Fragment trägt den Mikrosatelliten HUMTH01 und flankierende Sequenzen des TH-Gens, wie in Fig. 1 dargestellt. Noch bevorzugter umfasst das amplifizierte Fragment weniger als 200 bp. Besonders beachtliche Resultate wurden mit amplifizierten Fragmenten einer Größe kleiner als 160 bp und sogar kleiner 100 bp erhalten. Dazu beschreibt die vorliegende Erfindung auch spezifische Primer, die die Amplifikation von DNA-Fragmenten kleiner Größe, die den Mikrosatelliten HUMTH01 tragen, erlauben. Ebenso beschreibt die Erfindung insbesondere 3 Paar Primer, die jeweils die Amplifikation der Fragmente zu 192 bp, 156 bp bzw. 77 bp erlauben. Die Sequenz dieser Primer ist in den Beispielen angegeben, ebenso die Sequenz und die Position auf dem TH-Gen des amplifizierten Fragments. Jeder andere Primer, der die Amplifikation eines Fragments von weniger als 300 bp erlaubt, das mindestens den Mikrosatelliten HUMTH01 und eine flankierende Region, abgeleitet von der in Fig. 1 dargestellten Sequenz, trägt, ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Vorteil hafterweise besitzen die erfindungsgemäßen Primer eine Länge 10 und 40 mer und bevorzugt zwischen 15 und 30 mer. Die Sequenz dieser Primer kann ausgehend von der in Fig. 1 angegebenen Sequenz als Funktion der Größe des amplifizierten Fragments, seiner Lokalisation um den Mikrosatelliten und der gewählten Länge der Primer bestimmt werden.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Primer können nach jeder einem Fachmann bekannten Technik und insbesondere unter Verwendung der Phosphoramiditchemie, gegebenenfalls in β durch eine Cyanoethylgruppe geschützt (Sinha et al., 1984, Giles 1985) mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, wie dem Synthesegerät Applied Biosystems Modell 394 (Applies Biosystem, Foster City, CA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers synthetisiert werden. Die Primer können auch durch jede einem Fachmann bekannte Technik markiert werden.
  • Die Patentanmeldung WO94/03640 beschreibt ein Paar Primer (SEQ ID NO: 62 und SEQ ID NO: 63), die die Amplifikation eines genomischen DNA-Segments, das den Mikrosatelliten HUMTH01 enthält, erlauben können.
  • Die zu testende DNA-Probe kann eine genomische DNA, eine cDNA oder auch eine RNA sein. Sie ist bevorzugt ein Amplifikationsprodukt der genomischen DNA, die mit spezifischen Primern wie vorstehend beschrieben amplifiziert wurde.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Kit zur Detektion des Ep-Allels, umfassend ein Paar Primer wie vorstehend definiert. Dieses Kit ist vorteilhafterweise ein Kit zur Detektion der Schizophrenie.
  • Wie vorstehend angegeben, stellt die Erfindung erstmals ein genetisches Verfahren zum Nachweis und zur genetischen Charakterisierung von Krankheiten mit dem Erscheinungsbild der Schizophrenie bereit. Außer den genannten diagnosti schen Anwendungen bietet dieses Verfahren auch wichtige therapeutische Möglichkeiten, die insbesondere in Zusammenhang mit einer besseren zielgerechten Behandlung als Funktion der betroffenen Störung verbunden sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die als erläuternd und nicht als beschränkend anzusehen sind.
    • Liste der Figuren
  • Fig. 1: Sequenz eines Teils des ersten Introns des TH- Gens, umfassend den Mikrosatelliten HUMTH01. Die Position der Amplifikationprimer ist angegeben.
  • Fig. 2: Nachweis des Ep-Allel des Mikrosatelliten HUMTH01 durch Sequenzierung.
  • Fig. 3: Nachweis des Ep-Allels des Mikrosatelliten HUMTH01 durch Abtrennung auf dem Gel.
  • Tabelle 1: Verteilung der Allele des Mikrosatelliten HUMTH01 in Kontrollpopulationen, die von Schizophrenie befallen sind oder nicht.
    • Beispiele 1. Herstellung der DNA
  • Blutproben wurden auf Heparin gewonnen und die mononukleären Zellen wurden über einen Ficoll-hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) isoliert. Die DNA wurde anschließend gemäß Standardtechniken extrahiert. Für eine direkte Extraktion der DNA wurde das folgende Protokoll verwendet:
  • Das gewonnene Blut wurde in Röhrchen zu 50 ml gegossen, und Lysepuffer wurde zugesetzt, um die Erythrozyten abzutrennen (LYSEPUFFER = 40 ml 1N TRIS HCl, pH 7,5 + 20 ml 0,5M EDTA + H&sub2;O MilliQ qsp 2 l), Endvolumen: 50 ml. Die Suspension wurde anschließend 15 min bei 2500 UpM bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, 50 ml Lysepuffer wurden erneut dem Bodensatz zugesetzt. Der gleiche Arbeitsschritt (Zentrifugation, Verwerfung des Überstands, Wiederaufnahme des Bodensatzes in Lysepuffer) wurde zweimal wiederholt. Am Ende dieser 3 Zentrifugationen wurde der Bodensatz gewonnen.
  • Anschließend werden zugesetzt:
  • 5 ml Lysepuffer (auf 5 ml Ausgangsblut)
  • 125 ul 20%iges Laurylsarcosyl
  • 50 ul Proteinase K (20 ng/ml)
  • Die so erhaltene Lösung wurde vermischt und unter Rühren auf dem Wasserbad bei 55ºC während der Nacht gehalten.
  • Am nächsten Morgen wurden 2 Volumina 95%iges Ethanol zugesetzt (wenn 5 ml → 15 ml Endvolumen), anschließend wurde die Lösung durch Umdrehen bis zur Bildung einer Flocke ausgefällt. Die DNA wurde anschließend mit Hilfe einer Pipette P1000 (mit abgeschnittenem Pipettenende) in ein 5 ml Röhrchen aufgenommen. Anschließend wurde 80%iges Ethanol zugesetzt, und das Gemisch wurde in einen Kühlschrank gegeben. Am nächsten Morgen wurde Ethanol ausgetauscht, dann am Abend der Alkohol abgezogen und die Flocke wurde trocknen gelassen (das Röhrchen wurde umgekehrt auf ein Kleenex® gestellt).
  • Die DNA wurde anschließend mit 1X TE aufgenommen; nach der Größe der Flocke variiert die TE-Menge von 200 ul bis 1 ml. Es wird während der ganzen Nacht in einer rotierenden Maschine bei 37ºC belassen, dann wird die DNA-Konzentration spektrometrisch bestimmt.
    • 2. Französische Population:
  • 94 Patienten verschiedenen Ursprungs mit chronischer Schizophrenie (62 Männer und 32 Frauen mittleren Alters 42+/- 12,3) einschließlich 21 Familienfälle wurden untersucht. Die Diagnose wurde gemäß den DSM-III-Kriterien (Lit. 9) unter Verwendung der Angaben aus medizinischen Tabellen und direkten Interviews gemäß einer französischen Übersetzung der Tabelle der affektiven Störungen und der schizophrenen Angsterkrankung (SADS-LA, Lit. 10) gestellt. Jedem Patienten wurde ein klinischer Substyp gemäß dem beschriebenen Verfahren zugeordnet. 145 nicht verwandte Kontrollen wurden untersucht (84 Männer und 61 Frauen; Durchschnittsalter 48+/-8,3), die keine psychiatrische Störung zeigten.
    • 3. Tunesische Population:
  • 44 Patienten verschiedenen Ursprungs mit chronischer Schizophrenie (33 Männer und 11 Frauen, mittleres Alter 37+/- 8,2) einschließlich 13 familiärer Fälle wurden untersucht. Die Diagnose wurde gemäß dem DSM-IIIR-Kriterium (Lit. 11) unter Verwendung der Angaben aus medizinischen Tabellen gestellt. Diese Patienten wurden mit 44 Kontrollpatienten ohne Verwandtschaft untereinander (37 Männer und 7 Frauen; mittleres Alter 35+/-5,9) ohne psychiatrische Störung verglichen.
    • 4. Für die Amplifikationsreaktionen verwendete Primer
  • Die Zielmatrix für die Amplifikationsreaktion besteht aus dem Ep-Allel des Mikrosatelliten HUMTH01, dessen Sequenz (TCAT)4TCA(TCAT)5 lautet. Der Mikrosatellit ist in Position 1070 der Sequenz des TH-Gens, wie publiziert und in Genebank (Nr. D00269) zugänglich, lokalisiert.
  • Verschiedene Primerpaare wurden zur Amplifikation mittels PCR verwendet. Diese Paare sind nachstehend angegeben, ebenso die Größe des amplifizierten Fragments. Die Position dieser Primer auf der Sequenz des TH-Gens ist in Fig. 1 angegeben (vergleiche auch SEQ ID NO: 1).
    • Paar A:
  • 1) 5' GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3' (Sinn) (SEQ ID NO: 1) und
  • 2) 5' TTA TCC AGC CTG GCC CAC 3' (Antisinn) (SEQ ID NO: 2).
  • Die vorgesehene Amplifikationslänge beträgt 192 bp.
    • Paar B:
  • 3) 5' GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3' (Sinn) (SEQ ID NO: 3) und
  • 4) 5' GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3' (Antisinn) (SEQ ID NO: 4).
  • Die vorgesehene Amplifikationslänge beträgt 156 bp.
    • Paar C:
  • 5) 5' GTT CCT CCC TTA TTT CCC 3' (Sinn) (SEQ ID NO: 5) und
  • 6) 5' AGG GAA CAC AGA CTC CAT 3' (Antisinn) (SEQ ID NO: 6).
  • Die vorgesehene Amplifikationslänge beträgt 77 bp.
    • 5. Protokoll der Amplifikationsreaktionen
  • Das für die PCR-Reaktion verwendete Gemisch enthält 40 ng genomische DNA, hergestellt gemäß Beispiel 1,200 mM jedes dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 18 umol (100 ng) jedes Primers, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1,5 mM MgCl und 1,0 mci (α-³²P)dCTP (Amersham, UK) in einem Endvolumen von 15 ml.
  • Nach einer anfänglichen Denaturierung von 3 min bei 96ºC werden 0,75 Einheiten Taq-Polymerase jeder Probe (DNA + Gemisch) bei 92ºC zugesetzt. Auf jede Stufe folgen 30 Zyklen, umfassend eine Hybridisierung für 30 s bei 56ºC, eine Elongation während 30 s bei 72ºC und eine Denaturierung während 30 s bei 92ºC.
    • 6. Abtrennung über Gel
  • Drei Mikroliter des Reaktionsprodukts der PCR, vermischt mit 3 Mikroliter der Stopplösung (0,025 Bromphenolblau und 0,025 Xylolcyanol, 0,95 deionisiertes Formamid) werden auf ein denaturierendes Gel (6% Acrylamid/Bisacrylamid 19 : 1) gegeben. Nach elektrophoretischer Wanderung (2500 Volt, 55 mA) wird das Gel aus der Form genommen und getrocknet. Es wird in eine Kassette (ohne Schutz des Amplifikators) mit einem XOMAT®-(Kodak)-Film für eine Autoradiographie gegeben und während der Nacht bei Umgebungstemperatur exponiert.
    • 7. Protokoll für die PCR-SSCP-Reaktion
  • Diese Reaktion wurde in mehreren Stufen gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt:
  • 1- Amplifikation mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) der Ziel-DNA-Sequenz (150 bis 250 bp) mit radioaktiver Markierung der zwei Stränge (Verwendung von α³²P- ATP) oder eines Strangs (Kinierung eines der Primer mit γ³²P-ATP).
  • Ein ml des PCR-Produkts wurde mit 2,5 ml Ladungspuffer (80%iges entionisiertes Formamid, 50 mM TBE, 1 mM EDTA, 0,5% Xylol-Cyanol, 0,5% Bromphenolblau) vermischt.
  • 2- Denaturierung der DNA bei 96ºC während 3 bis 5 min.
  • 3- Rasche Abkühlung der Proben in schmelzendem Eis
  • 4- Rasche Aufbringung auf ein nichtdenaturierendes Polyacrylamidgel (6% Acryl/Bisacrylamid 37,5 : 1, 0,5X TBE).
  • 5- Elektrophoretische Wanderung bei 4ºC und bei 50 W oder bei Umgebungstemperatur und 10 W (mit 10% Glycerin in dem Gel).
  • 6- Autoradiographie des getrockneten Gels. TABELLE 1
    • Liste der Literaturangaben
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  • 11. American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders (3. überarbeitete Aufl.) - Washington, DC = APA (1987).
    • SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER:
  • (A) NAME: RHONE-POULENC RORER S. A.
  • (B) STRASSE: 20, Avenue Raymond ARON
  • (C) STADT: ANTONY
  • (D) LAND: FRANKREICH
  • (E) POSTLEITZAHL: 92165
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUR DIAGNOSE DER SCHIZOPHRENIE
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
  • (iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Band
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0,
  • Version #1.30 (OEB)
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear ·
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH:. NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 3
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 4
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 5
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 6
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 636 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 7

Claims (16)

1. Verfahren zur Diagnose von Schizophrenie, dadurch gekennzeichnet, dass man in vitro die Anwesenheit des Ep- Allels des Mikrosatelliten HUMTH01 in dem TH-Gen nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das vollständige Ep-Allel durch Sequenzierung und/oder durch Abtrennung auf Gel und/oder durch SSCP nachweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das vollständige Ep-Allel durch Abtrennung auf Gel nachweist.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man den Nachweis an einem DNA-Extrakt des Patienten durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichent, dass die DNA aus mononucleären Zellen extrahiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichent, dass die DNA vor der Detektion amplifiziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichent, dass die amplifizierte DNA die Gesamtheit oder einen Teil des ersten Introns des TH-Gens umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichent, dass die amplifizierte DNA ein Fragment mit einer Größe kleiner als 200 bp ist, das den Mikrosatelliten HUMTH01 und flankierende Sequenzen enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichent, dass die amplifizierte DNA ein Fragment mit einer Größe kleiner als 200 bp und bevorzugt kleiner 160 bp ist.
10. Primerpaar, das die Amplifikation eines Fragments von weniger als 200 bp erlaubt, das mindestens den Mikrosatelliten HUHTH01 und eine flankierende Region enthält.
11. Primerpaar nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer eine Länge zwischen 10 und 40mer, bevorzugt zwischen 15 und 30mer, besitzen.
12. Primerpaar nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es aus dem Paar A, umfassend die Primer SEQ ID N0. 1 und 2, dem Paar B, umfassend die Primer SEQ ID NO. 3 und 4, und dem Paar C, umfassend die Primer SEQ ID NO. 5 und 6, ausgewählt ist.
13. Kit zum Nachweis des vollständigen Ep-Allels des Mikrosatelliten HUNTH01, umfassend ein Primerpaar nach Anspruch 10.
14. Kit nach Anspruch 13 zur Diagnose der Schizophrenie.
15. Verfahren zur genetischen Charakterisierung von Schizophrenen, dadurch gekennzeichnet, dass man in vitro die Anwesenheit des vollständigen Ep-Allels des Mikrosatelliten HUMTH01 in dem TH-Gen nachweist.
16. Verfahren zum Nachweis einer Präsisposition für Schizophrenie, dadurch gekennzeichnet, dass man in vitro die Anwesenheit des vollständigen Ep-Allels des Mikrosatelliten HUMTH01 in dem TH-Gen nachweist.
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