JPH11504809A - 精神分裂症の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＨ遺伝子中のマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子Ｅｐの存在のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出に基づく精神分裂症の診断方法に関する。本発明はまた、この方法を実施するために使用されるプライマーに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 精神分裂症の診断方法 本発明は精神分裂症の診断方法に関する。より詳細には本発明は、ＴＨ遺伝子 中に存在するＤＮＡの反復配列中に精神分裂症患者に特異的に出現するいくつか の形態の変異を検出する方法に関する。本発明はまた、この反復配列中で精神分 裂症に関連する特異的な対立遺伝子を検出するために有用なプライマーに関する 。 すべてのクラスのＤＮＡ反復配列に突然変異が存在することは公知の現象であ る。しかしながら、これらの突然変異の機能的な意味は未だ確認されていない。 マイクロサテライトは、高頻度に反復するＤＮＡ配列のクラス、即ち反復モチー フの数の変異（参考文献１）及び／または反復モチーフの配列の変異に起因する 高度な多型性を有するＤＮＡ配列のクラスを表す。従ってこれらのマイクロサテ ライトは、遺伝子地図を作成するため及び病理学に関与する遺伝子座を同定する ための遺伝子マーカーとして使用されてきた（参考文献２）。マイクロサテライ トの種々の対立遺伝子のサイズは、反復モチーフの数の変異に依存する。反復的 二量体の配列決定実験によって、反復モチー フの数の変異及び反復モチーフの配列の変異が証明された。これらの変異は特に 、“完全”反復、即ち塩基配列中に中断を含まない反復に対応するか、または、 配列中に１つまたは複数のモチーフの中断、即ち（１つまたは複数の）欠失また は（１つまたは複数の）挿入を含む“不完全”反復に対応する（参考文献３）。 三量体または四量体の反復モチーフ中にも同様に長さ及び／または配列の変異が 観察された。例えば、マイクロサテライトＨＵＭＨＰＲＴＢ（参考文献４）及び ＨＵＭＴＨ０１（参考文献５）においてこの種の変異が観察された。 本出願人は、特に精神分裂症に関連する遺伝的変化の研究に関心をもち、その ために、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の遺伝子と精神分裂症との関連につ いて、特にマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１を対象として研究していた。ＴＨ はカテコールアミンの生合成経路の律速酵素である。精神病理学及び神経病理学 に関してはＴＨ遺伝子中に局在するマーカーを利用した種々の遺伝的研究が進め られてきた（参考文献６及び７）。しかしながら、精神分裂症との遺伝的関連を 証明する論文は現時点ではまだどの文献にも発表されていない。 マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１は、チロシンヒドロキシ ラーゼ遺伝子の第一イントロン中に局在する。このマイクロサテライトは、反復 モチーフＴＣＡＴの四量体から構成されている。このマイクロサテライトはある 程度の多型性を有しており、異なる数の反復モチーフを有する複数の対立遺伝子 が記載されている。最も高頻度で見出される対立遺伝子は、１０個の反復モチー フから成り、配列ＣＡＴで示される５番目の反復モチーフが１塩基対の欠失を有 している対立遺伝子である。 従って本出願人は、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１中の配列及び長さの変 異の存在を追求することによって精神分裂症におけるＴＨ遺伝子の関与を研究し た。得られた結果から、完全対立遺伝子が極めて希有であり、精神分裂症患者に のみ存在することが証明された。これらの結果は、種々の民族的起源の患者集団 において再現された。即ち、９４人の精神分裂症患者を含む２３９人のフランス 人の被験者集団において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅｉ及びＥｐと命名された異なる６ つの対立遺伝子が検出された。これらの異なる対立遺伝子は、最も長い２つの対 立遺伝子が互いに１塩基対だけ違っている以外は、互いに４塩基対（１完全モチ ーフ）の違いを有していた。これらの種々の対立遺伝子の配列決定によって、マ イクロサテライトＨＵＭＴ Ｈ０１が配列ＴＣＡＴを有する反復モチーフを有していること、並びに、夫々６ 、７、８及び９個の反復モチーフを含む対立遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにおいては 上記反復モチーフが完全に反復されていることが証明された。その反面で、１０ 個の反復配列を含む対立遺伝子Ｅの大多数においては、５番目の反復モチーフ中 に１個のチミジンの欠失が等しく観察される。この欠失の結果として、配列（Ｔ ＣＡＴ）４（ＣＡＴ）（ＴＣＡＴ）５を有しているＥｉ（不完全を意味する）と 命名された不完全対立遺伝子が生じる。対立遺伝子Ｅｉは、コーカシア人の集団 中に最も高頻度に発生する対立遺伝子である（参考文献５）。対照的に、配列（ ＴＣＡＴ）１０を有する完全Ｅ対立遺伝子（Ｅｐと命名）は極めて希有である。 従って、試験した精神分裂症患者集団全体に関しては、５人の患者だけが完全対 立遺伝子を有していた。対立遺伝子Ｅｐを有する被験者全員が精神分裂症患者で あり、１４５人の健常な対照被験者ではこの対立遺伝子が存在しないという意外 な結果が得られた（表１参照）。これらの結果は、対立遺伝子Ｅｐの存在と精神 分裂症との間の高度に有意な関連を証明する。更に、対立遺伝子Ｅｐを保有して いる５人の精神分裂症患者は、散発性精神分裂症の症例を示し、 その臨床サブタイプは、妄想性精神分裂症が１症例、無関心精神分裂症が３症例 、分裂性精神分裂症が１症例に分類された。 本出願人は次にこの研究の範囲を異なる民族起源の別の集団に拡大した。即ち 、８８人のチュニジア人の集団で同様の関連試験を実施した。得られた結果は、 試験したチュニジア人の集団で観察された異なる対立遺伝子Ａ−Ｅの頻度がフラ ンス人の集団で観察された頻度とは有意に違っていることを示した（表１参照） 。しかしながら、４人だけが完全対立遺伝子Ｅｐを保有しており、彼ら全員が精 神分裂症患者であることが判明した（１人の妄想性精神分裂症、３人の無関心精 神分裂症）。この場合にも病気のタイプはすべて散発性であった。 これらの結果は、ＴＨと精神分裂症との関連の第一の証明となる。これらの結 果から、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の配列（ＴＣＡＴ）１０を有する完 全対立遺伝子Ｅｐが精神分裂症に有意に関連し、従って、この種の病理学研究の 遺伝ツールを構成することが明らかである。 この対立遺伝子が精神分裂症に特異的に関連することは、散発性躁鬱病に罹患 した１００人の患者集団に対する試験によって更に確認された。即ち、散発性躁 鬱病患者の誰からも対立遺 伝子Ｅｐの存在は検出されなかった。 対立遺伝子と精神分裂症とが関連するという証明は、診断及び治療の分野で様 々に応用できる。従って本発明は、もはや臨床論だけに依存することなく生物学 的試験によって精神分裂症を診断する可能性をここに初めて提供したものである 。本発明の１つの目的は特に、ＴＨ遺伝子中のマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０ １の対立遺伝子Ｅｐの存在を検出することから成る精神分裂症の診断方法を提供 することである。本発明方法は更に、特に分裂病質、分裂気質、などのような精 神分裂症の発症前状態の診断にも応用できる。従って、本発明は、現在では専ら 臨床徴候に頼るしかないこれらの病理学のより精密な診断基準を提供し得る。本 発明は更に、対立遺伝子Ｅｐを保有する患者の家族の遺伝的傷害性を同定するこ とによって、この種の精神障害に関する疾病素質を解明し得る。治療的な見地か らは、本発明は、精神分裂症のタイプに応じて最適の医学的治療を決定し得ると いう利点を与える。カテコールアミン経路に関与するという仮説が確認されれば 、本発明によってより的確な治療方法を使用できるようになる。更に、たとえ対 立遺伝子Ｅｐの存在の機能的関与が最終的に確認されなくても、マイクロサテラ イ トＨＵＭＴＨ０１がＴＨ遺伝子の第一イントロンに局在しており、この領域で、 ＴＨの４つのアイソフォームを与える代替スプライシングが証明されていること に注目すべきである（参考文献８）。従って、この領域の遺伝子変異がＴＨ遺伝 子の発現の調節に影響を与え、これが精神分裂症の出現に結び付くことは十分に 予測できる。 従って本発明の第一の態様は、ＴＨ遺伝子中のマイクロサテライトＨＵＭＴＨ ０１の対立遺伝子Ｅｐの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏ検出することから成る精神分裂 症の診断方法を提供することである。配列（ＴＣＡＴ）１０を有するこの対立遺 伝子の存在が証明されることはいくつかの精神分裂症に特徴的である。約５％の 症例でこの対立遺伝子が検出されるので、この対立遺伝子が存在しないからとい って精神分裂症の存在を否定することはできない。本発明の方法はまた、精神分 裂症の遺伝的キャラクタリゼーション、及び精神分裂症のサブタイピングにも応 用できる。前述のように、対立遺伝子Ｅｐは散発性精神分裂症にしか存在しない と考えられる。本発明方法はまた、精神分裂症の疾病素質の証明にも応用できる 。 本発明方法においては、種々の技術によって対立遺伝子Ｅｐ を検出し得る。使用可能な技術のうちでも、好ましい技術の例としては配列決定 、ゲル分離またはＳＳＣＰ（一本鎖コンフォーメーション多型性ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析法 がある。 配列決定に関しては、当業者に公知の任意の方法を使用し得る。特に、ＤＮＡ 自動シークエンサーを使用するのが有利である。蛍光性プライマーを用いるチェ ーンターミネーション法によって二重鎖鋳型に対して配列決定を行うのが好まし い。このための適当なキットは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）から提供さ れている配列決定キットＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｋｉｔである。マイク ロサテライトＨＵＭＴＨ０１の配列決定、またはより精確にはこのマイクロサテ ライトを保有する単離フラグメントの配列決定によって、患者に存在する対立遺 伝子を直接認識することができ、従って、配列（ＴＣＡＴ）１０を有する対立遺 伝子Ｅｐの有無を証明できる。配列決定によって得られた結果は例えば図２に示 されている。 対立遺伝子Ｅｐを証明するための好ましい技術は、ゲル分離 である。この技術は、ＤＮＡフラグメントの配列決定を要せずに、種々の対立遺 伝子を夫々のサイズに従って識別し得るという利点を有している。この技術は、 変性条件下で変性ＤＮＡフラグメントがアクリルアミドゲル（好ましくは６％） 中で泳動することに基づく。例えば、（特にリンのγ位を）標識したプライマー の使用、試験フラグメントへのα−ｄＣＴＰの導入、低温プローブのα（アルフ ァ）の使用、臭化エチジウムによる検出、または放射性標識プローブとのハイブ リダイゼーション（ブロッティング）に基づく当業者に公知の任意の技術によっ てバンドを検出し得る。ゲル分離の詳細なプロトコルを実施例に例示する。図３ に示すように、この技術は、配列決定を要せずにマイクロサテライトの対立遺伝 子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅｉ及びＥｐを速やかに識別し得る。 ＳＳＣＰによる同定技術もまた、ゲルアクリルアミドゲルに基づく分離方法で あるが、非変性条件下で行われる。この技術は、種々のフラグメントをそれらの コンフォーメーションに従って識別し得る（実施例参照）。 本発明の方法を患者のＤＮＡサンプルに対して実施する。このサンプルは、マ イクロサテライトＨＵＭＩＴＨ０１を少なく とも含んでいなければならない。好ましくはこのサンプルは、ＴＨ遺伝子の第一 イントロンの全部または一部を含む。更に好ましくはこのサンプルは、両端にフ ランキング配列を有するマイクロサテライトＨＵＭＩＴＨ０１を含むＴＨ遺伝子 のフラグメントを含む。試験すべきＤＮＡサンプルは、患者から採取された細胞 から得られる。好ましくはこのサンプルは、簡単な採血によって容易に得られる 血液細胞（例えば単核細胞）である。特に、繊維芽細胞、上皮細胞、ケラチノサ イト、などのような他のタイプの細胞も使用できる。次に、細胞からＤＮＡを抽 出し、対立遺伝子Ｅｐの検出に使用する。このために、得られたゲノムＤＮＡを 制限酵素によって消化し、適当なベクターにクローニングし、例えばＴＨの第一 イントロンに対応するプローブと共にハイブリダイゼーションによってＴＨをス クリーニングし、次いで、上述のように分析する。極めて好ましくは、マイクロ サテライトＨＵＭＴＨ０１を含む領域に対応するかなりの量の遺伝物質を得るた めに、抽出されたＤＮＡを１回または複数の増幅反応で予め処理する。当業者に 公知の任意の技術、特に所謂ＰＣＲ〔ポリメラーゼ連鎖反応Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ ｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｉｏｎ，Ｓａｉ ｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４； Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．＆ ＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５ （１９８７）３３５−３５０〕によって、増幅処理する。この場合、“Ｄ ＮＡサーマルサイクラー”（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業 者の使用説明書通りに使用して増幅を行うとよい。増幅に使用される温度条件及 び媒体条件は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら，１９８９に記載されているような一 般的条件である。特定の条件は実施例に与えられている。本発明を実施するため には、十分に小さいサイズのマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１を保有するＤＮ Ａフラグメントを使用するのが有利である。これによって、配列決定に依存する ことなく対立遺伝子を識別し得るという利点が得られる。更に、対照配列決定試 験を実施するとしても、限られたサイズのフラグメントだけを配列決定するのが 好ましい。有利にも、使用されるＤＮＡフラグメントは、３００ｂｐよりも小さ いサイズの増幅フラグメントである。このフラグメントは、図１に示すようなＴ Ｈ遺伝子のマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１とフランキング配列とを含む。更 に好ましくは、増幅されたフラグメントが２００ｂｐ未満である。 １６０ｂｐ未満のサイズの増幅フラグメント、更に１００ｂｐ未満の増幅フラグ メントでも極めて優れた結果が得られた。このために、本発明はまた、マイクロ サテライトＨＵＭＴＨ０１を保有する小さいサイズのＤＮＡフラグメントを増幅 し得る特異的プライマーを記載している。即ち、本発明は特に、１９２ｂｐ、１ ５６ｂｐ及び７７ｂｐのフラグメントを夫々増幅し得る３対のプライマーを記載 している。これらのプライマーの配列、並びに増幅フラグメントの配列及びＴＨ 遺伝子上の位置は実施例に与えられている。図１に示す配列に由来のマイクロサ テライトＨＵＭＴＨ０１とフランキング領域とを少なくとも含む３００ｂｐ未満 のフラグメントを増幅し得る他の任意のプライマーも本発明の一部を構成してい る。本発明のプライマーは、１０〜４０マーの長さ、好ましくは１５〜３０マー の長さを有しているのが有利である。これらのプライマーの配列は、図１に与え られた配列から、増幅フラグメントのサイズ、マイクロサテライトに対する位置 関係、プライマーの選択された長さ、に従って決定される。 本発明の範囲内で、使用されるプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍ ３９４型シンセサイザー（Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）のようなＤＮ Ａ自動合成機を製造業者の使用説明書通りに用いて、当業者に公知の技術、特に 任意にβ位でシアノエチル基によって保護されたホスホアミダイト化学を使用す ることによって合成できる。また、当業者に公知の任意の技術によってプライマ ーを標識してもよい。 試験すべきＤＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれ でもよい。より好ましくは、上述のような特異的プライマーによって増幅された ゲノムＤＮＡの増幅産物である。 本発明の別の目的は、上記に定義したようなプライマー対を含む対立遺伝子Ｅ ｐの検出キットに関する。このキットは好ましくは精神分裂症診断用キットであ る。 上述のように、本発明は、精神分裂症、発症前状態の遺伝子検出及び遺伝子特 性化の方法を初めて提供する。上述の診断目的以外に、特に、該当する症状に従 ってより的確な治療に結び付く十分な治療の可能性を提供する。図面の簡単な説明 図１は、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１を含むＴＨ遺伝 子の第一イントロンの一部の配列を、増幅プライマーの位置と共に示す。 図２は、配列決定によって証明されたマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対 立遺伝子Ｅｐを示す。 図３は、ゲル分離によって証明されたマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対 立遺伝子Ｅｐを示す。 表１は、精神分裂症患者の試験集団または患者でない試験集団のマイクロサテ ライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子の分布を示す。実施例 １．ＤＮＡの調製 血液サンプルをヘパリンの存在下に収集し、単核細胞をＦｉｃｏｌｌ ｈｙｐ ａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌａ，スエーデン）勾配で単離した。 次に、標準技術でＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの直接抽出には以下のプロトコルを 使用した。 採取した血液を５０ｍｌの試験管に導入し、赤血球を破壊するために溶解バッ ファを加えて（溶解バッファ＝４０ｍｌの１ＮトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５＋２０ ｍｌの０．５ＭのＥＤＴＡ＋総量２リットルになるまでのｍｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ ）、最終 容量５０ｍｌとした。次に、懸濁液を４℃、２５００ｒｐｍで１５分間遠心する 。上清を廃棄し、ペレットに５０ｍｌの溶解バッファを再度添加する。同じ処理 （遠心、上清除去、溶解バッファ中へのペレットの取り上げ）を２回繰り返す。 この３回目の遠心後、ペレットを回収する。 次に、（出発血液５ｍｌあたり）５ｍｌの溶解バッファと１２５μｌの２０％ ラウリルサルコシルと５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｎｇ／ｍｌ）とを添加 する。 得られた溶液を混合し、水浴に入れ、５５℃で一夜撹拌する。 翌朝、２倍容の９５％エタノールを加え（５ｍｌを最終１５ｍｌとする）、次 いで綿状物質が形成されるまで転倒させて溶液を沈殿させる。ここでＰ１０００ ピペット（円錐の先端を切った形のチップ付き）を用いてＤＮＡを５ｍｌの試験 管に回収する。次に、８０％エタノールを加え、混合物を冷蔵庫に維持する。翌 朝、エタノールを交換し、夕刻にアルコールを除去して、綿状物質を乾燥させる （試験管をティッシュペーパー上で転倒させる）。 ここで、ＤＮＡを１×ＴＥに溶解する。ＴＥの量は綿状物質の大きさ次第で、 ２００μｌから１ｍｌとする。３７℃の回転 機上で一夜放置し、次いで、分光法でＤＮＡ濃度を測定する。２．フランス人集団 ２１人の家族性患者を含む異なる祖先の９４人の慢性精神分裂症患者（６２人 の男性と３２人の女性、平均年齢４２±１２．３）を試験した。情意的障害及び 精神分裂的不安症の一覧表（Ｔａｂｌｅａｕ ｄｅｓ Ｄｅｓｏｒｄｒｅｓ Ａ ｆｆｅｃｔｉｆｓ ｅｔ ｄｅ ｌ’Ａｎｘｉｅｔｅ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎ ｉｑｕｅｓ）（ＳＡＤＳＬＡ，参考文献１０）のフランス語訳による臨床像及び 直接問診によって得られたデータを用い、ＤＳＭＩＩＩ基準（参考文献９）に従 って診断判定を実施した。記載の手順で各患者を臨床サブタイプに分類した。精 神医学的変調のない非縁戚の１４５人の対照（８４人の男性と６１人の女性、平 均年齢４８±８．３）を試験した。３．チュニジア人集団 １３人の家族性患者を含む異なる祖先の４４人の慢性精神分裂症患者（３３人 の男性と１１人の女性、平均年齢３７±８．２）を試験した。臨床像から得られ たデータを用い、ＤＳＭＩＩＩＲ基準（参考文献１１）に従って診断判定を実施 した。これらの患者を、精神医学的障害のない非縁戚の４４人の対照被 験者（３７人の男性と７人の女性、平均年齢３５±５．９）と比較した。４．増幅反応に使用されたプライマー （ＴＣＡＴ）４ＴＣＡ（ＴＣＡＴ）５という配列を有するマイクロサテライト ＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子Ｅｐから増幅反応の標的鋳型を構成した。マイクロ サテライトはＴＨ遺伝子の配列の１０７０位に局在している。ＴＨ遺伝子の配列 は公表されておりＧｅｎｅｂａｎｋ（Ｎｏ．Ｄ００２６９）から入手し得る。 種々のプライマー対をＰＣＲ増幅に使用した。これらのプライマー対を、増幅 フラグメントのサイズと共に以下に示す。ＴＨ遺伝子の配列上のこれらのプライ マーの位置を図１に示す（配列番号１も参照）。プライマー対Ａ ： （１）5’GGCAAATAGGGGGCAAAA3’（センス）（配列番号１）及び （２）5’TTATCCAGCCTGGCCCAC3’（アンセンス）（配列番号２）。 予測された増幅フラグメントの長さは１９２ｂｐである。プライマー対Ｂ ： （１）5’GGCAAATAGGGGGCAAAA3’（センス）（配列番号３）及び （２）5’GGCTTCCGAGTGCAGGTC3’（アンセンス）（配列番号４）。 予測された増幅フラグメントの長さは１５６ｂｐである。プライマー対Ｃ ： （１）5’GTTCCTCCCTTATTTCCC3’（センス）（配列番号５）及び （２）5’AGGGAACACAGACTCCAT3’（アンセンス）（配列番号６）。 予測された増幅フラグメントの長さは７７ｂｐである。５．増幅反応プロトコル ＰＣＲ反応に使用された混合物は、実施例１で調製した４０ｎｇのゲノムＤＮ Ａと、各々２００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰと、１８ピ コモル（１００ｎｇ）の各プライマーと、５０ｍＭのＫＣｌと、１０ｍＭのトリ ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）と、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂と、１．０ｍＣｉの（ａ −³²Ｐ）ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）とを最終容量１５ｍｌに含んでい た。 ９６℃で３分間の初期変性後、０．７５単位のＴａｑポリメ ラーゼを９２℃で各サンプル（ＤＮＡ＋ミックス）に添加し、次に、５６℃で３ ０秒のハイブリダイゼーション、７２℃で３０秒の伸長及び９２℃で３０秒の変 性を１サイクルとして３０サイクル反復した。６．ゲル分離 ３マイクロリットルのＰＣＲ反応産物を３マイクロリットルの“停止溶液”（ ０．０２５のブロモフェノールブルーと０．０２５のキシレンシアノールと０． ９５の脱イオン化ホルムアミド）に混合し、変性ゲル（６％アクリルアミド／ビ スアクリルアミド１９：１）にロードする。電気泳動後（２５００ボルト、５５ ミリアンペア）、ゲルを型から取出して乾燥する。オートラジオグラフィーで処 理するためにゲルをＸＯＭＡＴ（Ｋｏｄａｋ）フィルムと一緒にカセットに配置 し（増幅スクリーンなしに）、室温で一夜露光する。７．ＰＣＲ−ＳＳＣＰ反応プロトコル この反応は以下のプロトコルに従って複数段階で行った。 １．二重鎖（α³²Ｐ−ＡＴＰの使用）または一本鎖（一方のプライマーをγ³² Ｐ−ＡＴＰによってリン酸化）の放射性マーカーで標識した標的ＤＮＡ配列（１ ５０−２００ｂｐ）のＰＣ Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅。 １ｍｌのＰＣＲ産物を２．５ｍｌのローディングバッファ（８０％の脱イオン 化ホルムアミド、５０ｍＭのＴＢＥ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のキシレン− シアノール、０．５％のブロモフェノールブルー）と混合する。 ２．９６℃で３〜５分間のＤＮＡ変性処理。 ３．融氷中でのサンプルの急速冷却。 ４．非変性ポリアクリルアミドゲル（６％のアクリル／ビスアクリルアミド３ ７．５：１、０．５×ＴＢＥ）中の急速沈殿。 ５．４℃、５０ワットまたは室温、１０ワット（ゲル中に１０％のグリセロー ル添加）での電気泳動。 ６．乾燥ゲルのオートラジオグラフィー。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年２月１８日 【補正内容】 請求の範囲 １．ＴＨ遺伝子中のマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子Ｅｐの存在 をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することを特徴とする精神分裂症の診断方法。 ２．対立遺伝子Ｅｐの検出を配列決定及び／またはゲル分離及び／またはＳＳＣ Ｐによって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．対立遺伝子Ｅｐの検出をゲル分離によって行うことを特徴とする請求項２に 記載の方法。 ４．患者から抽出したＤＮＡに対して検出を行うことを特徴とする請求項１から ３のいずれか一項に記載の方法。 ５．ＤＮＡを単核細胞から抽出することを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．検出に先立ってＤＮＡを増幅することを特徴とする請求項４または５に記載 の方法。 ７．増幅されたＤＮＡがＴＨ遺伝子の第一イントロンの全部または一部を含むこ とを特徴とする請求項４に記載の方法。 ８．増幅されたＤＮＡが、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１ とフランキング配列とを含む３００ｂｐ未満のサイズのフラグメントであること を特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．増幅されたＤＮＡが、２００ｂｐ未満、好ましくは１６０ｂｐ未満のサイズ のフラグメントであることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１とフランキング領域とを少なくとも含 む２００ｂｐ未満のフラグメントを増幅し得るプライマー対。 １１．プライマーが１０〜４０マー、好ましくは１５〜３０マーの長さを有する ことを特徴とする請求項１０に記載のプライマー対。 １２．配列番号１及び２のプライマーから成るプライマー対Ａ、配列番号３及び ４のプライマーから成るプライマー対Ｂ、並びに配列番号５及び６のプライマー から成るプライマー対Ｃから選択されることを特徴とする請求項１１に記載のプ ライマー対。 １３．請求項１０に記載のプライマー対を含む、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ ０１の対立遺伝子Ｅｐの検出用キット。 １４．精神分裂症を診断するための請求項１３に記載のキット。 １５．精神分裂症の遺伝的特性化を行うための請求項１に記載 の方法。 １６．精神分裂症の疾病素質を証明するための請求項１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＴＨ遺伝子中のマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子Ｅｐの存在 をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することを特徴とする精神分裂症の診断方法。 ２．対立遺伝子Ｅｐの検出を配列決定及び／またはゲル分離及び／またはＳＳＣ Ｐによって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．対立遺伝子Ｅｐの検出をゲル分離によって行うことを特徴とする請求項２に 記載の方法。 ４．患者から抽出したＤＮＡに対して検出を行うことを特徴とする請求項１から ３のいずれか一項に記載の方法。 ５．ＤＮＡを単核細胞から抽出することを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．検出に先立ってＤＮＡを増幅することを特徴とする請求項４または５に記載 の方法。 ７．増幅されたＤＮＡがＴＨ遺伝子の第一イントロンの全部または一部を含むこ とを特徴とする請求項４に記載の方法。 ８．増幅されたＤＮＡが、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１ とフランキング配列とを含む３００ｂｐ未満のサイズのフラグメントであること を特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．増幅されたＤＮＡが、２００ｂｐ未満、好ましくは１６０ｂｐ未満のサイズ のフラグメントであることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１とフランキング領域とを少なくとも含 む３００ｂｐ未満のフラグメントを増幅し得るプライマー対。 １１．プライマーが１０〜４０マー、好ましくは１５〜３０マーの長さを有する ことを特徴とする請求項１０に記載のプライマー対。 １２．配列番号１及び２のプライマーから成るプライマー対Ａ、配列番号３及び ４のプライマーから成るプライマー対Ｂ、並びに配列番号５及び６のプライマー から成るプライマー対Ｃから選択されることを特徴とする請求項１１に記載のプ ライマー対。 １３．請求項１０に記載のプライマー対を含む、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ ０１の対立遺伝子Ｅｐの検出用キット。 １４．精神分裂症を診断するための請求項１３に記載のキット。 １５．精神分裂症の遺伝的特性化を行うための請求項１に記載 の方法。 １６．精神分裂症の疾病素質を証明するための請求項１に記載の方法。