BG63017B1

BG63017B1 - Метод за диагностика на шизофрения

Info

Publication number: BG63017B1
Application number: BG102016A
Authority: BG
Inventors: Claudine Laurent; Jacques Mallet; Rolando Meloni
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2001-01-31
Also published as: KR19990008221A; ES2148760T3; DE69608682D1; EP0826068A1; SK147997A3; PL183819B1; BR9608432A; CA2217332A1; SI0826068T1; NZ308132A; US6210879B1; FR2733766A1; CZ291234B6; CZ346797A3; NO974974L; AU715264B2; AU5767896A; AP770A; PL323178A1; CN1125881C

Abstract

Изобретението се отнася до метод за диагностика на шизофрения чрез in vitro наличието на алел Ер намикросателит HUMTH 01 в гена ТН. Изобретението сеотнася и до иницииращи заряди, използвани по тозиметод.

Description

Област на приложение

Настоящото изобретение се отнася до метод за диагностика на шизофрения, по-специално до един начин за улавяне на изменения в повтарящите се последователности ADN, присъстващи в гена TH, чиито известни форми специфично се появяват при шизофренно болни. Изобретението се отнася също до инициатори, използваеми за улавяне на особеностите на тази повтаряща се последователност, свързана с шизофренията.

Ниво на техниката

Присъствието на мутации във всички видове повтарящи се последователности ADN е известно явление, но функционалното значение на тези мутации е неопределено. Микросателитите са голям клас повтарящи се последователности ADN, които показват голям полиморфизъм свързан с измененията в значителен брой повтарящи се подбуди (лит. изт. 1) и/ или в последователността на тези подбуди. Тези микросателити по тази причина се използват като генетични маркери за изграждане на генетични карти и за идентификация на “loci” патологични случаи (лит. изт. 2). Размерът на различните алели (алел означава всеки от двата гена, намиращи се на едно ниво върху два хромозома от един и същи чифт) на един микросателит зависи от измененията в значителния брой повтарящи се подбуди. По такъв начин, експериментите на последователно повтарящите се димери позволяват да се покаже изменение в значителен брой повтарящи се подбуди на тяхната последователност. Тези варианти могат да съответстват дословно на “пълни” повторения, това е така да се каже без прекъсване в последователността на базите, или на “непълни” повторения, съдържащи едно или повече прекъсвания в последователностите на подбудите, които въздействат на делецията (делециите) или на включването (включванията) (лит. изт. 3). Измененията по продължителност и/или по поселдователност също се наблюдават при трикартно или четирикратно повтарящи се подбуди. Така изменения от този тип се наблюдават при микросате лити HUMHPRTB (лит. изт. 4) и HUMTH01 (лит. изт. 5).

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася, по-специално до търсене на генетични изменения, свързани със шизофренията. Изследва се свързването между гена на тирозин хидроксилазата (TH) и шизофренията, ориентирано по-специално върху микросателита HUMTH01. TH е ограничаващ ензим при метода за биосинтез на катехоламините. Различни генетични изследвания на патологичната психиатрия и неврология са осъществени, като са използвани локални маркери в гена TH (лит. изт. 6 и 7). В литературата не съществува никакво доказателство за генетична връзка с шизофренията.

Микросателит HUMTH01 е локализиран в първия интрон на гена на тирозин хидроксилазата. Този микросателит е образуван от подбудите на четирикратно повтаряща се ТСАТ. Присъства един известен полиморфизъм, като са описани различни алели, имащи многобройни променливи повтарящи се подбуди. Найчесто срещащият се алел съдържа 10 повтарящи се подбуди и делеция на един основен чифт в петкратно повтаряща се подбуда, която съдържа последователността CAT.

Така заявителят изследва импликацията на гена TH в шизофренията, като търси присъствието на изменения на последователността и продължителността на микро-сателита HUMTH01. Получените резултати позволяват да се посочи, че съвършеният алел е твърде рядък, и присъства единствено при шизофренно болни. Тези резултати са възпроизведени върху пациенти от населения с различен етнически произход. Така, върху френско население от 239 лица, от които 94 болни от шизофрения, бяха уловени 6 различни алели, отбелязани с А, В, С, D, Ei и Ер. Тези различни алели се различават един от друг по 4 базови чифта (една цяла подбуда), с изключение на 2 по-продължителни, които се различават по един базов чифт. Последователността на тези различни алели позволява да се посочи, че повтарящата се подбуда на микросателита HUMTH01, последователността ТСАТ, точно се повтаря при алелите А, В, С, и D, които съдържат съответно 6, 7, 8 и 9 повтарящи се подбуди. В замяна, алелът Е, който съ държа 10 повтарящи се подбуди, присъства в мнозинството от алели на същата делеция на тинидин при петкратно повтарящата се подбуда. Тази делеция се проваля при един несъвършен алел на последователност (ТСАТ)4(САТ) (ТСАТ)5, отбелязан като Ei (за несъвършен). Алелът Ei е алел, по-често срещащ се при кавказкото население (лит. изт. 5). В противоположност, алелът Е, съответстващ на последователността (ТСАТ)Ю (отбелязан като Ер), е твърде рядък. Така, от сбора на изследваното шизофренно население, само 5 пациента принадлежащ към ясен алел. Получените резултати показват по неочакван начин, че всички лица с алел Ер са шизофренно болни, като този алел липсва при 145 здрави свидетели (Cf табл. 1). Тези резултати показват ясно изразена връзка между присъствието на алел Ер и шизофренията. Други 5 шизофрении пациенти, носители на алел Ер, са единични случаи на шизофрения, като клиничният подвид шизофренна параноя е в един случай, индиферентна шизофрения в 3 случая и дезорганизираща шизофрения е в 1 случай.

Изследването е разширено с население от друг етнически произход. Подобно изследване беше предприето при 88 тунизийци. Получените резултати показват, че честотата на различните алели А-Е, срещани в изследваното тунизийско население, е значително различна от тази, наблюдавана при френското население (Cf табл. 1). Обаче само 4 лица се оказаха носители напълно на алел Ер, като всички бяха пациенти с шизофрения (1 шизофренна параноя и 3 индиферентна шизофрения), чиито форми бяха също единични (спорадични) форми.

Тези резултати представляват първата демострация за връзка между TH и шизофренията. Те показват ясно, че съвършеният алел Ер при микросателита HUMTH01 на последователността (ТСАТ)Ю може да бъде свързан по изразителен начин с шизофренията и да образува фактически този генетичен инструмент за откриване на този тип патологично състояние.

Особеността на свързване на този алел с шизофренията беше потвърдена и от едно изследване върху население от 100 пациента, засегнати от спорадична маниако-депресивна психоза. Присъствие на алел Ер не беше уловено в никой от тези пациенти.

Постановката на очевидност на свързване между този алел и шизофренията предлага многобройни приложения в диагностичната и терапевтична област. Настоящото изобретение предлага за първи път възможността да се диагностицира шизофренията чрез биологичен тест и вече изключително чрез клинични аргументи. Един от обектите на настоящото изобретение се състои по-специално в метод за диагностика на шизофренията, изразяващ се в улавяне присъствието на алел Ер на микросателита HUMTH01 в гена TH. Този метод е приложим също за диагностика на патологични случаи от спектъра на шизофренията, особено такива като шизотипия, шизоидни индивиди и други. Така изобретението позволява да се изчистят критериите за диагностика на тези патологични случаи, които днес са изключително от клинично естество. Освен това, изобретението също позволява да се покажат предразположенията към този вид неясен психиатричен случай, чрез идентификация на генетичната уязвимост в семействата на пациенти, носители на този алел Ер. От терапевтична гледна точка изобретението позволява да се определи изгоден метод за съответно медицинско лечение в зависимост от вида на шизофренията. В потвърждение на хипотезата за импликация на пътя на катехоламините, изобретението позволява да се използват много целеви терапии. Освен това, ако функционалните импликации на присъстващия алел Ер не са окончателно установени, отбелязва се, че микросателитът HUMTH01 е локализиран в първия интрон на гена TH, регион, в който беше доказано алтернативно свързване, отнасящо се за 4 изоформи на гена TH (лит. изт. 8). Следователно, възможно е генетичните изменения в този регион да са предназначени за регулиране експресията на гена TH, и то така да бъде свързано с появяването на шизофренията.

Изобретението се отнася до метод за диагностика на шизофрения чрез улавяне in vitro присъствието на алел Ер на микросателит HUMTH01 в гена TH. Постановката на очевидност за този алел, последователността (ТСАТ)Ю, е характеристика на известни шизофрении. Отсъствието на този алел не изключва съществуването на шзофрения, тъй като този алел беше установен приблизително в 5 % от случаите. Методът на изобретението също е приложим за характеризиране генетиката на шизофрениите, и на подвидовете на шизофренията. Както е отбелязано преди това, алел Ер не присъства в спорадичните шизофрении. Методът на изобретението също е приложим, при постановка на очевидност, при предварително заключение на шизофрения.

По метода от изобретението улавянето на алел Ер може да бъде реализирано по различни техники. Между използваемите техники, може да бъде цитирана с предимство тази, при която се провежда образуването на последователност, разделяне върху гел или още техниката SSCP.

За образуване на последователност може да бъде използван всеки известен метод. С предимство се използва автоматичен уред за последователности ADN. За предпочитане е образуването на последователност да се осъществи върху двунишкови матрици по метода за завършване на веригите, като се използват флуоресцентни иницииращи заряди. Един комплект, приложим за това действие, е комплектът за образуване на последователност Taq Dye Primer Kit de chez Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City СА). Образуване на последователността на микросателита HUMTH01, или по-точно един изолиран фрагмент, носещ този микросателит, допуска директно да се познае присъстващият в пациента алел и така да се докаже присъствието или отсъствието на алел Ер на последователността (ТСАТ)Ю. Получените резултати с образуване на последователност са представени на фиг. 2.

Предпочитана техника за очевидността на постановката на алел Ер е отделянето върху гел. Тази присъстваща техника с предимство позволява разграничаването между различните алели, в зависимост от техния растеж, без да е необходим уред за последователности на фрагментите ADN. Тази техника се основава на миграцията при условието на денатуриращо средство, като фрагментите ADN денатурират в акриламиден гел (за предпочитане 6 %). Разкриването на групите може да бъде осъществено чрез всички техники, известни на специалиста от професията, базиране, например на приложението на белязани иницииращи заряди (именно на γ върху фосфор), на въвеждане на α-dCTP в изследваните фрагменти, на приложение на а (алфа) студени сонди, на разкриване на етанов бромид, или още чрез хибридизация (blot) с радиобелязана сонда.

Един прецизен протокол за разделяне върху гел е даден за илюстрирания документ в примерите. Както е отбелязано на фиг. 3, тази техника позволява бързо и без образуване на последователност, различаване на алелите А, В, С, D, Ei и Ер на микросателит.

При техниката на идентифициране чрез SSCP се работи по метод за разделяне върху акриламиден гел, при условие без промяна. Тази техника позволява да се разграничат различните фрагменти, в зависимост от тяхната конфигурация.

Методът на изобретението се осъществява върху проба ADN от пациента. Тази проба трябва да съдържа поне микросателитът HUMTH01. За предпочитане той съдържа целия или част от първия интрон на гена TH. Още повече за предпочитане той съдържа един фрагмент на гена TH, съдържащ микросателита HUMTH01, обшит с пристроени последователности. Пробата ADN за изследване може да бъде получена, като се излезе от клетки, взети от пациента. Отнася се предимно за кръвни клетки (например клетки с 1 ядро), които лесно се получават от обикновена кръвна проба. Могат да бъдат използвани други видове клетки, като фибробласти, епителни клетки, кератиноцити и други. След това ADN се екстрахира от клетките и се използва за откриване на алел Ер. Затова получената геномна ADN може да бъде преварена при ограничаване на ензимите, клонирана в съответни вектори, селекционирана, например за TH или хибридизирана с една съответна сонда на първия интрон на TH, след което анализирана, както е описано по-горе. Предпочита се екстрактът на ADN да е предварително подчинен на една или повече реакции на усилване, за да се получи значително количество от материала, съответстващ на региона, носещ микросателита HUMTH01. Усилването може да бъде реализирано чрез всяка известна техника, по-специално чрез техниката, наречена PCR [Polymerase - catalyzed Chaien Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354; Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350]. Усилването може да бъде осъществено, като се използва “DNA термичен апарат за циклизиране” (Perkin Elmer Cetus), в съответствие с указанията на производителя. Температурните условия и използваната среда за усилването са обикновени усло вия, като описаните в Maniatis et al., 1989. Специфични условия също са посочени в примерите. При постановката на работа съгласно изобретението с предимство се използва фрагментът ADN, носещ микросателита HUMTH01 с достатъчно малък размер. Това позволява зигодно разграничаване между алелите без задължително да се прибягва към образуване на последователност. Освен това, ако се реализират контролни опити за образуване на последователност, също е за предпочитане да няма апарат за образуване на последователност, който да ограничава размера на фрагментите. Изгодно е, използваният фрагмент да е един увеличен фрагмент с размер, по-малък от 300 pb. Този фрагмент носи микросателита HUMTH01 и пристроените последователности на гена TH, като представените на фиг. 1. Още повече се предпочита увеличеният фрагмент да бъде помалък от 200 pb. Особено забележителни резултати бяха получени с увеличени фрагменти с размер, по-малък от 160 pb, даже от 100 pb. Съгласно изобретението са описани също специфични иницииращи заряди, позволяващи увеличаване на фрагментите ADN до малък размер, носещи микросателита HUMTH01. Така изобретението описва в частност три двойки иницииращи заряди, позволяващи съответно увеличаване на фрагментите до 192 pb, 156 pb и 77 pb. Последователността на тези иницииращи заряди е дадена в примерите, както и последователността и позицията върху гена TH на увеличения фрагмент. Всеки друг иницииращ заряд, позволяващ увеличаване на даден фрагмент, по-малко от 300 pb, носещ поне микросателита HUMTH01, и един пристроен регион, произвеждащ последователността от фиг. 1, е също част от настоящото изобретение. За предпочитане иницииращите заряди съгласно изобретението имат дължина, включена между 10 и 40 структурни елемента, за предпочитане между 15 и 30 структурни елемента. Последователността на тези иницииращи заряди може да бъде определена, като се излезе от последователността, дадена на фиг. 1, зависимостта от размера на увеличения фрагмент, неговото локализиране около микросателита и избраната дължина на иницииращите заряди.

Използваните иницииращи заряди съгласно изобретението могат да бъдат синтезирани чрез всяка известна техника, особено ка то се използва химията на фосфорамидите, евентуално защитени на β място с цианоетилова група (Sinha et al., 1984, Giles 1985), c автоматичен апарат за синтезиране на ADN, като Synthetiseur Applied Biosystem Modele 394, (Applied Biosystem, Foster City СА), съгласно препоръките на производителя. Иницииращите заряди могат също да бъдат означени чрез всяка техника, известна на специалиста от областта.

Пробата ADN за изследване може да бъде една геномна ADN, една ADNc, или също една ARN, по-специално продукт на увеличение на геномна ADN, увеличена чрез специфични иницииращи заряди, като описаните погоре.

Друга цел на изобретението се отнася до комплект за улавяне на алела Ер, обхващащ една двойка иницииращи заряди, както са описани по-горе. Този комплект е преди всичко комплект за диагностика на шизофрения.

Настоящото изобретение за първи път представя един генетичен метод за улавяне и генетично охарактеризиране на болни от шизофрения. Освен посочените диагностични приложения, този метод също предлага значителни терапевтични възможности, свързани именно с по-добрата целенасоченост на лечението, в зависимост от степента на заболяването.

Настоящото изобретение е описано поподробно с помощта на примерите, които го илюстрират, без да го ограничават.

Описание на фигурите

Фигура 1 представлява последователност на една част от първия интрон на гена TH, включващ микросателита HUMTH01. Отбелязана е позицията на иницииращите заряди на увеличението;

фигура 2 е постановка за доказване на алел Ер чрез образуване на последователност на микросателита HUMTH01;

фигура 3 е постановка за доказване на случая Ер чрез отделяне върху гел на микросателита HUMTH01.

Таблица 1: Разпределяне на алелите на микросателита HUMTH01 при изследваното население, вредни или не за шизофренията.

ТАБЛИЦА!

	ФРАНЦИЯ **	ТУНИС
АПЕЛ	КОНТРОЛИ“	ШИЗОФРЕНИЦИ⁰	КОНТРОЛИ“	ШИЗОФРЕНИЦИ
A(tcat)6	54 (18.6%)	40 (21.3%)	20 (22.7%)	18 (20.5%)
B(tcat)7	54(18.6%)	43 (22.9%)	20 (22.7%)	20 (22.7%)
C(tcat)8	38 (13.1%)	18 (9.6%)	14 (15.9%)	8 (9.1%)
D(tcat)9	52 (17.9%)	23 (12.2%)	21 (23.9%)	26 (29.5%)
El (tcat)4cat(tcat)5	92 (31.8%)	58 (30.8%)	13 (14.8%)	12 (13.6%)
Ep (teat) 10	0 (0%)	6 ** (03.2%)	0 (0%)	4 (4.6%)

Примерни изпълнения

Примери, поясняващи изобретението

1. Получаване на ADN

Проби от кръв се събират върху хепа- 20 рин и едноядрените клетки се изолират върху гредиент Ficoll hipaque (Pharmacia, Upsala, Suede). По-нататък ADN се екстрахира съгласно стандартни техники. За директно екстрахиране на ADN се използва следния начин. 25

Събраната кръв се изсипва в епруветки от 50 ml и се добавя буферен разтвор за лизиране, за да се направи така, че да избухнат хематити (буферен разтвор за лизиране = 40 ml TRIS НС1 IN pH 7,5 + 20 ml EDTA 0,5 M + ₃₀H₂O milliQ qsp 2L), краен обем: 50 ml. След това суспензията се центрофугира 15 min при 2500 об./min и при 4°С. Изплувалата част се изхвърля, към утайката отново се добавя 50 ml буферен разтвор за лизиране. Същата one- 35 рация (центрофугиране, отстраняване на изплувалата част, възобновяване на утайката в беферния разтвор за лизиране) се повтаря 2 пъти. Емисията на тези 3 центрофугирания, утайката, се използва повторно.

Тогава се добавят: 5 ml буферен разтвор за лизиране (за 5 ml кръв при започване),

125 μΐ лаурилов саркосил 20 %, μΐ протеиназа К (20 ng/ml).

Полученият разтвор се размесва и се поставя в баня, като се разбърква под пара при 55°С в продължение на 1 нощ.

На следващия ден сутринта, се добавят 2 обема етанол 95 % (5 ml —> 15 ml накрая), след което разтворът се утаява чрез инверсия до образуване на снопче. Тогава ADN се из ползва повторно с помощта на пипета Р1000 (с накрайник с конусовиден профил) в епруветка от 5 ml. След това се добавя етанол 80 % и сместа се посатвя в хладилник. На следващия ден сутринта етанолът се подменя, след това, вечерта, алкохолът се извлича и снопчето се оставя да се суши (епруветката се поставя наопаки върху kleenex).

Тогава ADN се възобновява с ТЕ IX, следващата големина на снопчето е при количество на ТЕ от 200 μΐ до 1 ml. Оставя се през цялата нощ върху ротационна машина при 38°С, след което концентрацията на ADN се определя спектрометрично.

2. Френско население

Изследвани са 94 пациенти и от различен произход, засегнати от хронична шизофрения (62 мъже и 32 жени, средна възраст 42+/ - 12,3) включително 21 семейни случая. Диагнозата беше определена съгласно критерия DSM III (лит. изт. 9), като са използвани данни, произхождащи от медицински списъци и директни интервюта, последвани от френски превод на списък от маниакално депресивни заболявания и страхова шизофрения (SADS - LA литературен източник 10). На всеки пациент беше определен един клиничен подвид съгласно описаната процедура. Бяха изследвани 145 неявни очевидци (84 мъже и 61 жени; средна възраст 48 +/- 8,3), непритежаващи никакво психично заболяване.

3. Тунизийско население

Бяха изследвани 44 пациенти от различен произход, засегнати от хронична шизофрения (33 мъже и 11 жени, средна възраст 37 +/- 8,2), включително 13 семейни случая. Диагнозата беше определена съгласно критерия

DSM IIIR (лит. изт. 11), като са използвани данни, произхождащи от медицински списъци. Тези пациенти бяха сравнени с 44 контролни пациенти, без връзки между тях (37 мъже и 7 жени; средна възраст 35 +/- 5,9), непритежаващи никакво психично заболяване.

4. Иницииращи заряди, използвани за усилване на процесите

Желаната матрица за усилване на процесите е образувана за алел Ер на микросателит HUMTH01, чиято последователност е (ТСАТ)4ТСА(ТСАТ)5. Микросателитът е локализиран на позиция 1070 на последователността на гена TH такава, каквато е публикувана и достъпна в Genebank (n° D00269).

За усилване чрез PCR бяха използвани различни двойки иницииращи заряди. Тези двойки са дадени по-долу, така както и големината на увеличения фрагмент. Позицията на тези иницииращи заряди върху последователността на гена TH е дадена на фиг. 1 (виж също SEQ ID n° 1).

Двойка А:

1) 5’ GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3’ (страна) (SEQ ID n° 1) и

2) 5’ TTA TCC AGC CTG GCC CAC 3’ (обратна страна) (SEQ ID n° 2)

Предвидената дължина на увеличението е: 192 pb

Двойка В:

3) 5’ GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3’ (страна) (SEQ ID n° 3) и

4) 5’ GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3’ (обратна страна) (SEQ ID n° 4)

Предвидената дължина на увеличението е: 156 pb

Двойка С:

5) 5’ GTT ССТ ССС TTA ТТТ ССС 3’ (страна) (SEQ ID п° 5) и

6) 5’ AGG GAA CAC AGA СТС CAT 3’ (обратна страна) (SEQ ID п° 6).

Предвидената дължина на увеличението е: 77 pb

5. Протокол за усилване на процесите

Използваната смес за реакцията PCR включва: 40 ng геномна AND, получена съгласно пример 1, 200 шМ от всяка dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 18 pmol (100 ng от всеки иницииращ заряд, 50 mM КС1, 10 тМ Tris - НС1 (pH 8,5), 1,5 тМ MgCI и 1,0 mCi (а - ³²Р) dCTP (Amersham, UK) в краен обем от 15 ml.

След първоначално денатуриране от 3 min при 96°С, към всяка проба (AND+mix) при 92°С се добавят части от Taq полимераза, този етап е последван от 30 цикъла, обхващащи една хибридизация в продължение на 30” при 56°С, удължаване в продължение на 30” и 72°С и денатуриране в продължение на 30” и 92°С.

6. Разделяне върху гел μΐ от продукта на реакцията PCR, смесени с 3 μΐ “разтвор - ограничител” (0,025 бромфенолово синьо и 0,025 ксиленов цианол, 0,95 дейонизиран формамид) се зареждат в денатуриран гел (6 % акриламид / бисакриламид 19 : 1). След електрофорезна миграция (2500 volts, 55 mA) гелът се изважда и се суши. Той се поставя в касета (без увеличителен екран) с филм ХОМАТ (Kodak) за авторадиография и се експонира през нощта при стайна температура.

7. Протокол за реакцията PCR-SSCP

Тази реакция се осъществява в няколко етапа, в съответствие със следващата последователност:

1. Увеличаване чрез PCR (полимеразна верижна реакция) на целената последователност AND (150 - 200 рВ) с радиоактивна маркировка на 2 нишки (използване на а³²Р - АТР) или на 1 нишка (маркиране на един от иницииращите заряди с γ³²Ρ - АТР).

Един ml от продукта PCR се смесва с 2,5 ml буферен разтвор за зареждане (80 % дейонизиран формамид, 50 mM ТВЕ, 1 тМ EDTA, 0,5 % ксилен - цианол, 0,5 % бром фенолово синьо).

2. Денатуриране на ADN при 96°С в продължение на 3 - 5 min.

3. Бързо охлаждане на пробите в разтопяващ се лед.

4. Бързо отлагане в неденатуриращ се полиакриламиден гел (6 % акрил/бисакриламид 37,5 : 1, 0,5 X ТВЕ).

5. Електрофорезна миграция при 4°С и 50 W или при стайна температура и 10 W (с 10 % глицерол в гела).

6. Авторадиография на изсушения гел.

Списък на последователности (1) Обща информация:

(i) Заявител:

(A) Име: RHONE - POULENC RORER S.A.

(B) Улица: 20, avenue Raymond ARON (C) Град: ANTONY (Е) Страна: FRANCE (F) Пощенски код: 92165 (ii) Заглавие на изобретението: Метод за диагностика на шизофрения (iii) Брой на последователности: 7 (iv) Дешифрирана форма с електронно изчислителна машина (ЕИМ):

(A) Вид на носителя: лента (B) ЕИМ: IBM PC съвместима (C) Система на експлоатация:РС-0ОЗ/МЗDOS (D) Софтуер: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (ОЕВ) (2) Информация за последователност No1:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 чифтови бази (B) Вид: нуклеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността: последователност No1 :

GGCAAATAGG GGGCAAAA 18 (2) Информация за последователност No2:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 чифтови бази (B) Вид: нукпеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността: последователност No2:

TTATCCAGCC TGGCCCAC 18 (2) Информация за последователност No3:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 чифтови бази (B) Вид: нукпеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността:

последователност No3:

GGCAAATAGG GGGCAAAA (2) Информация за последователност No4:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 чифтови бази (B) Вид: нукпеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността: последователност No4:

GGCTTCCGAG TGCAGGTC 18 (2) Информация за последователност No5:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 чифтови бази (B) Вид: нукпеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността: последователност No5:

GTTCCTCCCT ТАТТТССС 18 (2) Информация за последователност N6:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 чифтови бази (B) Вид: нуклеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността: последователност No6:

AGGGAACACA GACTCCAT 18 (2) Информация за последователност No7:

(i) Характеристика на последователнрстта:

(A) Дължина: 636 чифтови бази (B) Вид: нуклеотид (C) Значителен брой от нишките: двоен (D) Конфигурация: линейна (ii) Вид на молекулата: ADNc (iii) Хипотетичност: не (iv) Обратни страни: не (xi) Описание на последователността:

последователност No7:

CTTGAATCTT AACGATCGGA ATGTGGAAAC AGGTCCCCGG CTGCTGCACC CAGCCCCCAC CCCCAGCTGC

АААТССАТСС ААААААТССА AGATGGCCAG во

CCCTTCCCAG

CCTAGTCAGC АССССААССА

GCTCTAGCAG CAGCTCATGG TGGGGGGTCC

ССТАСТСССА CCTGCCCCTG CCTCCCTCTG GCCTGCCTGC

TTGGGGAGGC

AGCCCCAAGG

120

180

TTCAAAGGGT

ATCTGGGCTC TGGGGTGATT CCCATTGGCC

САТТСАТТСА

ТТСАТТСАТТ

САТТСАТТСА ТТСАТТСАСС

GACCTGCACT

GCTTTTCAGC

CCTGGCACAT

CGGAAGCCCT GTGTACAGGG GACTGTGTGG CCACAGGAGG GGTCTTCGGT GCCTCCTTGG TTAAAATGGG

TGGGCAAATA

TGTTCCTCCC

ATGGAGTCTG

GCCAGGCTGG

GCACTCAGAA

GGGGGCAAAA

ТТАТТТСССТ

TGTTCCCTGT

ATAATCGGGA

CCTTGGGCTC

240

300

360

420

480

TAGCAGTGTC

ATTTCCAGGT

CGCCCTCCCC

ТАСССТСССС

TTIIIATTTA TGGACCTTGA ACCTTCTCAG GGACACAGGG CACGAGGCTC СССАТС

TTGAAATGTG

GTGTGAGTTG

540

CGCCCTCCCC CGTCCTCCCC 600

636

Claims

1. Метод за диагностика на шизофрения, характеризиращ се с това, че се открива in vitro наличието на алел Ер на микросателит HUMTH01 в гена TH.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че откриването на алел Ер се осъществява чрез създаване на последователност и/или чрез отделяне върху гел и/ или чрез SSCP.

3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че откриването на алел Ер се осъществява чрез отделяне върху гел.

4. Метод съгласно една от предшестващите претенции, характеризиращ се с това, че откриването се осъществява върху екстракт на ADN от пациента.

5. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че ADN се екстрахира, като се излиза от едноядрени клетки.

6. Метод съгласно претенция 4 или 5, характеризиращ се с това, че ADN се увеличава преди откриването.

7. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че увеличената ADN съдържа целия или част от първия интрон на гена TH.

8. Метод съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че увеличената ADN е фрагмент с размер, по-малък от 300 pb, носещ микросателита HUMTH01 и пристроените последователности.

9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че увеличената ADN е фрагмент с размер, по-малък от 200 pb, и за предпочитане по-малък от 160 pb.

10. Двойка иницииращи заряди, характеризираща се с това, че позволява увеличаване на фрагмент, по-малък от 300 pb, носещ поне микросателита HUMTH01 и един пристроен регион.

11. Двойка иницииращи заряди съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че иницииращите източници имат дължина, включена между 10 и 40 структурни елемента, за предпочитане между 15 и 30 структурни елемента.

12. Двойка иницииращи заряди съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че е избрана между двойка А, включваща иницииращите заряди SEQ ID η⁰ 1 и 2; двойката В, включваща иницииращите заряди SEQ ID п° 3 и 4, и двойката С, включваща иницииращите заряди SEQ ID п° 5 и 6.

13. Комплект за откриване на алел Ер на микросателит HUMTH01, характеризиращ се с това, че включва двойка иницииращи заряди съгласно претенция 10.

14. Комплект съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че е предназначен за диагностика на шизофрения.

15. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е предназначен за генетично характеризиране на шизофрении.

16. Метод съгласно претенция 1, харак11 теризиращ се с това, че е предназначен за очевидно доказване на предразположение към шизофрения.

Приложение: 3 фигури

Литература

1. Weber et al., Am. J. Hum. Genet. 44 (1989) 388.

2. Hearne et al., Trands Genet. 8 (1992) 288.

3. Weber et al., Genomics 7 (1990) 524.

4. Edwards et al., Genomics 12 (1992) 241.

5. Puers et al., Am. J. Hum. Genet. 53 (1993) 953.

6. Craddock et al., Ann. of Medecine 25 (1993) 317.

7. Leboyer et al., Lancet 335 (1990) 1219.

8. Grima et al., Nature 326 (1987) 707.

5 9. American Psychiatic Association,

Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders (3rd Edn) - Washington, DC = APA (1980).

10. Fyer et al., Anxiety Disorders clinic,

10 New York: New York State Psychiatric Institute (1985).

11. American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders (3rd Edn revised) - Washington, DC =