KR100892184B1 - 핵산 분자를 탐지하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 한 시료에서 적어도 2개의 서로 상이한 핵산 분자를 동시에 탐지하는 방법에 관하는데, 첫 번째 단계에서 멀티플렉스(multiplex) PCR 및 두 번째 단계에서 혼성화 반응은 마이크로어레이에 고착된 프로브로 실시된다. 이후, 혼성화된 PCR 산물은 탐지되고 선택적으로 정량되는데, 각 경우에 서로 상이한 핵산과 특이적으로 혼성화되는 혼성화 반응용 프로브는 최대 2℃, 바람직하게는 최대 1℃ 차이로 서로 상이한 융점(Tm)을 갖는다.

Description

핵산 분자를 탐지하는 방법{METHODS FOR THE DETECTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES}
본원 발명은 한 시료에서 적어도 2개의 서로 상이한 핵산 분자를 동시에 탐지하는 방법에 관하는데, 첫 번째 단계에서 멀티플렉스(multiplex) PCR 및 두 번째 단계에서 혼성화 반응은 마이크로어레이에 고착된 프로브로 실시하고, 여기서 혼성화된 PCR 산물은 탐지되고 선택적으로 정량된다. 본원 발명은 또한, 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키기 위한 마이크로어레이와 세트 및 한 시료에서 적어도 2개의 서로 상이한 핵산 분자의 동시 검출을 위한 키트에 관한다.
시료에서 핵산 분자의 탐지는 매우 다양한 분야, 예를 들면 의약, 품질 관리, 연구 등에 실시되고 있다. 종종, 한 시료에서 적어도 2개, 바람직하게는 20개, 50개, 100개 또는 그 이상의 서로 상이한 핵산 분자를 탐지하는 것이 필요하다. 시간과 비용으로 인해, 한 시료에서 상이한 핵산 분자를 동시에 탐지하는 것이 바람직하다. 일련의 간행물은 핵산 분자의 탐지에 관하고 이런 탐지를 실행하기 위한 다양한 방법을 개시한다.
미국 특허 5,994,066에서는 생물 시료에서 박테리아 또는 항생제 저항성을 탐지하는 방법을 기술한다. 첫 번째 방법에 따라, 멀티플렉스-PCR은 여러 항생제 저항성의 동시 탐지를 위하여 실시된다. 증폭된 산물 탐지의 한 예로 아가로즈 겔 전기영동, 형광 분극, 형광 라벨렝에 의한 탐지가 언급되었다. 혼성화 방법은 시료에서 조사된 서열을 탐지하는 이차적인 방법으로 기술되는데, 이런 혼성화는 65℃에서 실시되고, 시료와 특정 표적 DNA의 혼성화는 두 뉴클레오티드 서열간 높은 동일성을 시사한다.
미국 특허 6,045,996에서는 마이크로어레이에서 뉴클레오티드 서열을 혼성화시키는 방법을 기술한다. 혼성화 온도는 20 내지 75℃이다. 표적 뉴클레오티드의 예로 멀티플렉스 PCR의 증폭 산물이 언급되었다.
미국 특허 5,614,388에 따라 특정 뉴클레오티드 서열은 PCR로 증폭되는데, 여기서 증폭 산물은 혼성화로 탐지된다. 적절한 구체예에서, 멀티플렉스 PCR이 실시된다. 탐지는 엄격한 조건을 조정하여 특이적으로 실시할 수 있다. 엄격한 혼성화 조건에서 온도는 특이적인 혼성화를 가능하게 하는 온도이다. 혼성화 온도의 예는 50 내지 55℃이다.
미국 특허 5,846,783은 뉴클레오티드 서열을 탐지하는 방법에 관하는데, 멀티플렉스 PCR이후 혼성화로 탐지를 실시한다. 가령, 혼성화는 55℃ 온도에서 실시된다.
WO 98/48041 A2는 항생제-저항성 박테리아 균주를 동정하는 방법에 관하는데, 여기서 유전자는 PCR로 증폭되고 혼성화 프로브로 탐지된다. 이런 과정동안 혼성화는 엄격한 조건, 예를 들면 혼성화 DNA의 융점보다 20℃ 낮은 온도하에 실시된다. 적절하게는, 유사한 융점 온도를 갖는 올리고뉴클레오티드가 선택되고, 따 라서 동일한 혼성화 혼합물에서 여러 유전자가 동일한 조건에서 검사될 수 있다. 한 예로써 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에서 혼성화가 기술되어 있다. 혼성화 온도는 45 내지 60℃이다.
하지만, 전술한 이들 방법은 동시에 탐지가능한 핵산 분자의 특이성과 최대 숫자에서 한계가 있다. 이들 방법중 일부에서 멀티플렉스 PCR이 첫 번째 단계에서 실시되는데, 이 단계에서 여러 뉴클레오티드 서열의 동시 증폭이 담보된다. 하지만, 다양한 뉴클레오티드 서열의 후속 탐지에 문제가 발생하는데, 그 이유는 이런 방법으로는 다수의 뉴클레오티드 서열을 동시에 특이적으로 검출하는 것이 불가능하기 때문이다. 혼성화 반응이 PCR 반응이후에 실시되면, 특이적이고 엄격한 혼성화 조건이 뉴클레오티드 서열 각각에 대하여 조정되어야 하고 온도 역시 좀더 짧은 서열에서는 좀더 낮게 조정되어야 하는데(미국 특허 6,045,996), 이로 인해 동시에 탐지가능한 뉴클레오티드 서열의 가능 개수가 감소한다. WO 98/48041 A2에서는 동일한 혼성화 혼합물에 여러 유전자를 검사할 수 있도록 유사한 융점을 갖는 올리고뉴클레오티드를 선별하도록 제안하였지만, 최대 8개의 올리고뉴클레오티드만 한 어레이에서 검사된다.
따라서, 이들 방법은 다수의 핵산 분자, 예를 들면 항생제 저항성을 탐지하는 방법으로는 부적합하다. 이런 탐지 방법에서, 단지 적은 수의 올리고뉴클레오티드의 동시 탐지에 국한되는 방법은 부적합하고 너무 노동 집약적이며 특히 선별에 많은 시간이 소비된다.
따라서, 본원 발명의 목적은 한 시료에서 일정 올리고뉴클레오티드 또는 유전자의 탐지가 신속하고 비용-효율적으로 실시될 수 있도록 다수의 핵산 분자를 동시에 탐지할 수 있는 방법을 제시하는 것이다.
본원 발명의 방법에서 서로 상이한 핵산 분자에 특이적으로 혼성화되는 혼성화 반응용 프로브는 최대 2℃, 바람직하게는 최대 1℃ 차이로 서로 상이한 융점(Tm)을 갖는다. 혼성화 반응에 사용되는 프로브의 융점이 최대 2℃, 바람직하게는 최대 1℃ 차이로 서로 상이하다는 점에서 한 시료에서 다수의 핵산 분자를 동시에 탐지하는 것이 처음으로 가능해졌는데, 그 이유는 온도, 염 농도, pH 등과 관련하여 동일한 조건이 모든 프로브의 혼성화 반응에 대하여 조정되기 때문이다. 융점 Tm은 절반의 분자가 나선 상태로 존재하는 온도(정해진 파라미터, 예를 들면 염 농도하에)로 정의된다.
거의 모든 핵산 분자에 일정한 융점을 갖는 서열을 제공하는 것이 가능하다.
서열의 융점을 계산하는 한가지 방법은 상용 소프트웨어 "Gene Runner 3.0"(1994, Hastins Software, Inc.)을 사용하는 것이다. 이 소프트웨어는 다양한 방법/알고리즘으로 Tm을 측정할 수 있다. 본원은 Breslauer et al.(Proc. Natl. Acad. Science 83: 3746-3750, Predicting DNA duplex stabilityfrom the base sequence)에 따른 "최근접-이웃 열역학적 융점"-방법의 평가에 기초한다. 계산 파라미터는 예로써 염 농도에서 660 mM과 시료 농도에서 7.5 pM이다. 동시 혼성화 실험을 위한 여러 프로브의 Tm 측정은 결정적인 절대 평가가 아니고(염과 DNA 농도에 따라 좀더 높거나 낮아질 수 있다), 선택적인 방법(즉, 15 내지 30개 염기 길이 를 갖는 프로브, "열역학적 프로브") 및 개별 프로브의 Tm에서 서로 상대적 관계의 평가이다. 이런 방식으로, 검사되는 핵산 분자나 유전자에 혼성화되는 서열("혼성화 서열")은 특이적인 프로브가 만들어 질수 있도록 계산되고 선택될 수 있다.
본원 발명에서, 핵산 분자에는 예로써 특정 유전자, 유전자나 게놈의 일부, mRNA, mRNA의 일부 등이 포함된다.
본원 발명에서 "멀티플렉스-PCR"은 서로 상이한 적어도 2개의 핵산 분자가 동시에 증폭되는 PCR, 다시 말하면 여러 프라이머의 지원으로 상이한 서열이 1회 반응으로 동시에 증폭되는 PCR을 의미한다.
"마이크로어레이"는 다수의 프로브가 고밀도로 고착되어 동일한 조건하에 다수의 핵산 분자가 동시에 혼성화될 수 있는 담체를 의미한다. 마이크로어레이는 DNA 분자의 탐지에 주로 사용되지만 펩티드의 검출에도 사용된다. 마이크로어레이의 지원으로 시험관내 DNA-진단이 실질적으로 단순화되고 복잡한 검사가 단일 작업 단계로 신속하게 실시될 수 있는데, 그 이유는 수천개의 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오티드가 상대적으로 작은 마이크로어레이에 고착될 수 있기 때문이다. 가령, 마이크로어레이에서 혼성화는 수만개 유전자의 동시 검사를 담보한다. 이미 일련의 상이한 마이크로어레이가 뉴클레오티드 서열의 탐지에 사용되고 있으며, 개별 파라미터는 폭넓은 범위에서 당업자에 의해 선택되고 있다(Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14. December 1996, pp. 1675-1679).
본원 발명에서 마이크로어레이의 재료, 크기, 구조 등은 개수, 크기, 서열의 측면에서 고착되는 프로브에 적합시킬수 있다.
다른 한편, 핵산 분자의 단순한 탐지, 다시 말하면 이들이 시료에 존재하는 지를 검사하는 것이 가능한데, 이런 검사는 Yes/No 결과로 나타난다. 하지만, 본원 발명에서는 시료에서 핵산 분자의 함량을 정량하는 것도 가능한데, 이는 마이크로어레이의 사용으로 매우 특이적으로 실시될 수 있다. 이를 위하여, 당업자에게 공지된 임의의 탐지 방법, 예를 들면 화학적, 효소적, 물리-화학적 또는 항원-항체 결합 과정이 이용될 수 있다. 탐지되는 핵산은 방사능, 형광 또는 화학발광 분자로 표지될 수 있다. 이들 탐지 방법은 당업자에게 공지되어 있어 본원에서는 구체적으로 설명하지 않으며, 개별 방법의 선택은 탐지되는 핵산 분자 및 산물이 단순히 탐지되는지 또는 정량되는지에 좌우된다.
프로브의 준비는 공지된 방법에 따라 달성한다.
프로브의 융점 차이가 적을수록 좀더 특이적인 핵산 분자가 탐지될 수 있는데, 그 이유는 이런 혼성화에 의해 완전히 상보적이지 않은 서열의 혼성화없이 고도로 특이적인 혼성화가 담보되고 가양성과 가음성 결과의 위험이 낮아지거나 완전히 제거되기 때문이다.
프라이머와 프로브는 혼성화 서열(즉, 프로브와 혼성화되는 서열)보다 좀더 긴 서열을 보유하는 핵산 분자가 증폭되도록 선택할 수 있다. 하지만, 혼성화 서열만 증폭되도록, 다시 말하면 개별 프로브와 혼성화되는 서열로만 핵산 분자가 구성되도록 하는 것도 가능하다.
적절하게는, 본원 발명에 따라 서로 상이한 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8개, 특히 바람직하게는 적어도 12개의 핵산 분자가 한 시료에서 동시에 탐지된 다. 이 시료에서 탐지되는 서로 상이한 핵산 분자의 개수는 실질적으로 상한선은 없다.
특히 적절하게는, 항생제 저항성 유전자에 포함된 핵산 분자가 탐지된다. 다수의 항생제 저항성 유전자는 공지되어 있으며, 일반적인 탐지 방법은 항생제-함유 영양배지에서 장기간 에러-유발성 미생물 성장 검사 및 생존 미생물의 후속적인 확인으로 실시된다. 유전자 증폭과 후속 혼성화로 항생제 저항성을 동정하는 방법이 이미 보고되긴 했지만(WO 98/48041 A2), 특이성의 감소없이 한 시료에서 여러 항생제 저항성 유전자를 동시에 검사하는 것은 불가능하였다. 본원 발명에 따른 방법으로는 시료에서 무제한의 항생제 저항성 유전자를 탐지할 수 있는데, 이는 항생제-저항성 박테리아 균주의 축적이 발생하는 병원 등에서 특히 중요하다. 가닥 DNA 분리 방법이 실용적이다. 어떤 경우든, 에피솜에 인코드된 저항성을 상실하지 않도록 소형 분자(예, 플라스미드 등)는 동시-정제되어야 한다.
핵산 분자로 선택되는 항생제 저항성 유전자로부터 유래된 서열 부분은 개별 유전자에 특이적이고 다른 유전자에는 나타나지 않는다. 이런 방식으로, 가양성 검사 결과를 좀더 효과적으로 예방할 수 있다.
적절하게는, 항생제 저항성 유전자는 베타-락타마제 blaZ, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, fosB 단백질, 아데닌 메틸라제 ermC, aacA-aphD 아미노글리코시드 저항성, 3'5'-아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 aphA-3, mecR, 페니실린 결합 단백질 PBP2' 아미노글리코시드-3'-아데닐트랜스퍼라제 aadA, 테트라사이클린-저항성 단백질 tetC, DHFR DfrA, D-Ala:D-Ala 리가제 VanB에 대한 유전자에서 선택 된다. 이들은 심각한 의학적 어려움을 유발하고 빈번하게 발생하는 항생제 저항성으로, 이들 항생제 저항성은 신속하고 매우 특이적인 검사 방법을 제공하는데 특히 중요하다. 이런 검사 방법은 항생제 저항성이 한 시료에서 동시에 검사되는 경우, 다시 말하면 각 항생제 저항성 유전자에 특이적인 핵산 분자가 멀티플렉스 PCR에 의해 동시에 증폭되고 후속으로 마이크로어레이에서 프로브와 혼성화되는 경우에 특히 적합한데, 여기서 적어도 한가지 프로브는 각 핵산 분자 및 결과적으로 항생제 저항성 유전자에 특이적이다.
상기 검사 방법은 혼성화 반응이 30-80℃, 바람직하게는 40-70℃, 특히 바람직하게는 55-65℃에서 실시되는 경우에 특히 적합하다. 조정되는 혼성화 온도는 프로브의 융점에 좌우되고 본원 발명에 따라 각 혼성화 반응에서 계산되고 조정될 수 있는데, 이런 작업은 혼성화 반응동안 온도가 일정하게 유지되도록 하는데 특히 중요하다. 온도를 55 내지 65℃로 조정하는 것이 본원 발명에 특히 적합한 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 이 온도 범위에서 프로브가 특이성과 길이의 측면에서 본원 발명에 특히 적합하기 때문이다.
정확한 탐지를 위하여, 혼성화 반응은 매우 엄격한 조건하에 실시되는 것이 바람직하다. 이는 여러 뉴클레오티드에서 차이가 나는 서열이 아닌 매우 상보적인 서열에서만 혼성화가 담보되도록 혼성화 조건이 조정되어야 한다는 것을 의미한다. 혼성화 조건은 1개의 뉴클레오티드에서 차이가 나는 서열이 아닌 완전히 상보적인 서열만 서로 결합되는 혼성화 조건을 선택하는 것이 특히 바람직하다. 이런 방식으로, 한 시료에서 핵산 분자의 고도로 특이적인 탐지를 담보하고 가양성 결과가 발생하지 않는 방법을 제공한다. 매우 엄격한 조건은 반응 혼합물에서 온도와 이온력을 선택함으로써 조정된다. 가령, 혼성화 온도는 프로브의 융점보다 5 내지 10℃ 낮은 온도로 조정된다; 완충액은 혼성화 온도와 관련하여 원하는 이온 강도 또는 pH에 맞게 선택된다.
적절하게는, 멀티플렉스-PCR은 표지된 프라이머로 실시된다. 이런 방식으로, 증폭된 PCR 산물이 혼성화 반응이후 탐지될 수 있는 라벨링을 갖도록 담보한다. 전술한 바와 같이, 라벨링은 형광, 발광, 방사능 등을 측정하여 예로써 색깔 반응을 통하여 확인되고 정량될 수 있는 화학적, 물리-화학적 또는 효소적으로 검출가능한 신호일 수 있다.
특이적인 방법에서 혼성화 반응은 "+"와 "-"가닥의 분리이후 실시되는 것이 바람직하다. 따라서, 탐지되는 개별 가닥 분자와의 결합에 대하여 프로브와 상동한 서열을 보유하는 가닥이 이들 프로브와 경쟁하는 일이 발생하지 않도록 하고, 이의 실패는 특히 정량적 탐지의 경우에 잘못된 결과를 유발할 수 있다. "+"와 "-"개별 가닥을 분리하면, 프로브에 상보적인 개별 가닥만 혼성화 혼합물에 존재하게 된다.
이런 과정동안 프로브와 상동한 서열을 보유하는"+"개별 가닥은 멀티플렉스-PCR이후 분리되는 것이 특히 바람직하다. 이런 방식으로, 프로브에 상보적인 서열을 보유하는"-"개별 가닥은 혼성화 혼합물에 남게 되고 그 직후에 혼성화 반응이 실시될 수 있다.
특히 바람직한 분리 과정은 프라이머가 "+"개별 가닥의 신장에 사용되는 것 으로 특성화되는데, 이들 가닥은 가급적 5' 말단에서 "+" 개별 가닥의 분리를 담보하는 물질, 특히 적어도 한가지 비오틴 분자에 결합된다. 이런 방식으로, "+" 개별 가닥은 PCR의 증폭 단계동안 변화되고 중간 단계의 추가없이 완전한 분리가 특이적으로 담보될 수 있다. 이런 방식으로, "-" 개별 가닥이 분리되는 위험 역시 제거된다. 비오틴은 DNA 서열에 쉽게 결합하고 특이적으로 분리될 수 있다는 점에서 특히 적합하다.
이를 위하여, 비오틴 분자는 "+" 개별 가닥의 신장을 위한 프라이머에 결합되고 "+"개별 가닥은 멀티플렉스-PCR이후 비드에 결합된 스트렙타비딘에 의해 분리되는 것이 특히 바람직하다. 비드를 통하여 넓은 범위의 스트렙타비딘이 시료에 도입될 수 있는데, 여기서 비오틴 분자는 스트렙타비딘에 완전히 결합한다. 더 나아가, 비드는 스트렙타비딘-비오틴 화합물이 시료로부터 다시 분리되도록 담보한다. 이렇게 사용되는 비드는 공지되어 있으며 유리 또는 자성 코어로 구성될 수 있다.
적절하게는, 정제 단계는 혼성화 단계를 선행한다. 이런 방식으로, 혼성화를 간섭할 수 있는 물질을 혼성화 혼합물로부터 제거하는데, 이런 정제 단계는 "+"개별 가닥의 분리동안 또는 분리이후에 선택적으로 진행된다. 정제는 예로써 DNA의 침전 및 완충액으로 DNA의 재흡수에 의해 실시될 수 있다.
다른 측면에서, 본원 발명은 전술한 방법에 따라 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키는 마이크로어레이에 관하는데, 탐지되는 서로 상이한 핵산 분자와 특이적으로 혼성화되는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 6개, 특히 바람직하게는 적어도 12개 프로브가 상기 마이크로어레이 표면에 결합하고 최대 2℃, 바람직하게는 최대 1℃ 차이의 융점을 갖는다. 마이크로어레이와 프로브와 관련하여, 본원 발명에 제시된 상기 정의는 여기에도 적용된다. 환언하면, 마이크로어레이에 결합하는 프로브의 개수는 탐지되는 핵산 분자의 개수에 좌우되는데, 이때 탐지되는 핵산 분자와 혼성화되지 않는 추가의 프로브 역시 네거티브 기준으로 마이크로어레이에 결합될 수 있다. 전술한 바와 같이 중요한 점은 프로브의 융점이 최대 2℃, 바람직하게는 최대 1℃ 정도 서로 차이가 나고, 따라서 프로브에 상보적인 서열을 보유하는 모든 핵산 분자가 프로브와 균등하게 특이적이고 단단하게 혼성화되는 혼성화 반응에 대하여 조건이 조정될 수 있다는 점이다.
적절하게는, 프로브는 100 내지 500 ㎛, 바람직하게는 200 내지 300 ㎛, 특히 바람직하게는 240 ㎛의 직경을 갖는 마이크로어레이 표면의 반점(spot)에 결합된다. 이런 직경을 갖는 반점은 본원 발명에 따른 전술한 방법에 특히 적합한데, 혼성화 반응이후 탐지는 특히 분명하고 확실한 결과를 산출한다. 반점 각각은 한가지 유형의 프로브, 다시 말하면 동일한 서열을 보유하는 프로브를 보인다. 병렬 기준으로 마이크로어레이의 여러 반점에 동일 유형의 프로브를 제공하는 것도 가능하다.
게다가, 반점은 서로 100 내지 500 ㎛, 바람직하게는 200 내지 300 ㎛, 특히 바람직하게는 280 ㎛의 거리를 갖는 것이 바람직하다. 이런 방식으로, 마이크로어레이에 최대치의 반점이 제공되도록 담보하면서, 동시에 탐지 과정동안 다양한 반점 및 프로브와 탐지되는 결합된 핵산 분자가 분명하게 구별될 수 있도록 한다.
적절하게는, 마이크로어레이는 유리, 합성 재료 또는 막으로 구성된다. 이들 재료는 마이크로어레이에 특히 적합한 것으로 입증되었다.
프로브는 마이크로어레이의 표면에 공유 결합되는 것이 특히 바람직하다. 이런 방식으로 마이크로어레이에 프로브의 단단한 결합은 프로브-마이크로어레이 결합의 분리 및 혼성화와 세척동안 발생하는 왜곡된 결과를 예방한다. 마이크로어레이가 코팅된 유리로 구성되면, 일차 아민기는 시프 염기(Schiff base) 형성으로 유리 표면의 자유 알데하이드기와 반응할 수 있다.
프로브는 15 내지 25개, 바람직하게는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 혼성화 서열을 보유하는 것이 적합한 것으로 입증되었다. 전술한 바와 같이 혼성화 서열은 탐지되는 핵산 분자와 혼성화되는 서열이다. 프로브는 혼성화 서열보다 더 길게 만들어 질 수도 있지만, 프로브의 길이가 추가적으로 증가하면 다른 핵산 분자와의 원치않는 결합이 발생하게 되는데, 이는 결과를 왜곡하게 된다. 따라서, 프로브는 마이크로어레이 표면과의 결합에 필요한 부분을 제외하고, 혼성화 서열로만 구성되는 것이 바람직하다. 15 내지 25개, 바람직하게는 20개의 뉴클레오티드 길이가 적합한 것으로 입증되었는데, 그 이유는 이런 길이 범위에서 전술한 방법으로 원하는 융점을 갖는 혼성화 서열을 발견할 수 있기 때문이다. 이런 길이는 특이적인 결합을 가능하게 하고 우연히 다른 DNA 분자가 탐지되는 핵산 서열과 동일한 서열을 가지는 위험을 제거할 만큼 충분하다.
적절하게는, 프로브는 5' 말단에 dT10 서열을 보유하고 이를 통하여 프로브는 마이크로어레이에 결합될 수 있다. 이런 방식으로, 마이크로어레이와 혼성화 서열은 후자가 핵산 분자에 자유롭게 접근할 수 있을 만큼 충분한 거리를 갖는다. Tm은 예로써 5 내지 15, 바람직하게는 10일 수 있다.
항생제 저항성 유전자의 동시 검출을 위하여 혼성화 서열로서 프로브는 No.25, No.26, No.27, No.28, No.29, No.30, No.31, No.32, No.33, No.34, No.35, No.36에서 선택되는 서열을 포함한다. 이들 서열은 특히 박테리아 균주에서 자주 발생하고 의학적으로 중요한 항생제 저항성 유전자에서 나타난다. 이들은 베타-락타마제 blaZ, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, fosB 단백질, 아데닌 메틸라제 ermC, aacA-aphD 아미노글리코시드 저항성, 3'5'-아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 aphA-3, mecR, 페니실린 결합 단백질 PBP2' 아미노글리코시드-3'-아데닐트랜스퍼라제 aadA, 테트라사이클린-저항성 단백질 tetC, DHFR DfrA, D-Ala:D-Ala 리가제 VanB에 대한 항생제 저항성 유전자이며, 서로 최대 1 ℃ 차이의 융점을 갖는다.
다른 측면에서, 본원 발명은 전술한 본원 발명의 방법중 한가지에 따라 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키기 위한 세트에 관하는데, 상기 세트는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 6개, 특히 바람직하게는 적어도 12개 프로브를 포함하고, 각 프로브는 탐지되는 서로 상이한 핵산 분자와 특이적으로 혼성화되고 서로(즉, 세트에서 개별적인 다른 프로브 분자/탐지되는 핵산 쌍) 최대 2℃, 바람직하게는 최대 1℃ 차이의 융점을 갖는다. 게다가, 상기 세트는 여러 용기를 포함할 수 있는데, 용기마다 동일한 서열을 보유하는 프로브가 존재한다. 이를 통하여 마이크로어레이에서 반점마다 동일한 서열의 프로브를 적용하는 것이 가능하다. 한 용기에 서로 상이한 2가지이상의 서열을 보유하는 프로브를 제공하는 것도 가능하다.
적절하게는, 프로브는 15 내지 25개, 바람직하게는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 혼성화 영역을 보유한다.
이에 더하여, 각 프로브는 5' 말단에 dT10 서열을 보유하고, Tm은 5 내지 15, 바람직하게는 10인 경우가 적합하다.
혼성화 영역에서 각 프로브는 No.25, No.26, No.27, No.28, No.29, No.30, No.31, No.32, No.33, No.34, No.35, No.36에서 선택되는 서열을 보유하는 것이 특히 바람직하다.
다른 측면에서, 본원 발명은 한 시료에서 서로 상이한 적어도 2개의 핵산 분자를 동시에 탐지하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
ㆍ 전술한 본원 발명에 따른 마이크로어레이;
ㆍ 탐지되는 핵산 분자의 특이적인 증폭을 위한 프라이머를 갖는 적어도 한가지 용기;
ㆍ 선택적으로, 전술한 본원 발명의 세트.
용기는 동일한 서열을 보유하는 프라이머뿐만 아니라 한 핵산 분자의 증폭을 위한 하나의 프라이머 쌍, 또는 서로 상이한 여러 핵산 분자의 증폭을 위한 여러 프라이머 쌍을 포함할 수 있지만, 이들 프라이머는 일정한 농도로 존재해야 한다. 키트는 각각 증폭 반응, 혼성화 반응, 탐지에 필요한 완충액, 염, 용액뿐만 아니라 전술한 본원 발명의 방법을 실시하기 위한 사용자 프로토콜을 포함할 수도 있다.
마이크로어레이는 이미 고착된 프로브를 포함할 수 있다. 프로브를 포함하는 세트는 마이크로어레이로부터 분리되어 존재하거나(마이크로어레이가 비어있는 경우, 다시 말하면 결합된 프로브를 전혀 보유하고 있지 않는 경우), 또는 마이크로어레이의 통합된 구성요소일 수도 있다.
적절하게는, 키트는 탐지되는 적어도 한가지 핵산 분자를 파지티브 시료로서 보유하는 적어도 1개의 용기를 포함한다. 전술한 바와 같이, 용기는 동일한 서열을 보유하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 여러 용기가 키트에 제공될 수 있지만 한 용기로 서로 상이한 여러 서열을 보유하는 핵산을 제공할 수도 있다. 가령, 키트가 항생제 저항성 유전자의 탐지에 제공되는 경우에, 키트는 파지티브 시료로 혼성화 서열 SEQ ID NO. 25 내지 36을 보유하는 서열에 핵산 분자를 제공할 수 있다.
키트는 비드에 결합된 스트렙타비딘을 갖는 용기를 추가로 포함하는 것이 특히 바람직하다. 이는 "+" 또는 "-"개별 가닥이 비오틴에 결합된 프라이머를 통하여 비오틴에 결합되는 경우에 증폭된 "+"와 "-" 개별 가닥의 분리를 가능하게 한다.
본원 발명은 하기에 제시된 실시예 및 도면으로 좀더 상세하게 설명하지만, 이들 실시예와 도면은 본원 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 겔 전기영동으로 12가지 ABR 표적의 PCR 산물의 분리를 도시한다.
도 2는 ABR 칩의 마이크로어레이 설계를 도시한다.
도 3은 검사 과정의 순서도를 도시한다.
도 4는 ABR 칩에서 대조 혼성화의 실례를 도시한다.
도 5는 멀티플렉스 증폭이후 ABR 칩 탐지의 결과를 도시한다.
1. 참고 "ABR 표적"의 유전자 합성
일련의 항생제 저항성(ABR) 서열은 시험관내 유전자 합성으로 만들었는데, 그 이유는 "전형 균주"가 없거나 또는 당해 미생물로 작업이 안전 문제(2이상의 생물학적 안정도)로 불가능하였기 때문이다. 표 1에서 모든 표적은 요약하고 번호(No.)를 부여하는데, 대조 저항성은 벡터에서 유래되고 일차적으로 칩의 유효성을 확인하는데 이용된다. 이들 표적에서 프로브는 ABR 칩 원형(prototype)에 제공된다.
Figure 112003032407665-pct00001
표 2는 PCR 프라이머 서열 및 상기 원형에서 발생된 PCR 산물의 길이를 제시한다. 도 1에서 아가로즈 겔 전기영동이후 12가지 PCR 산물이 관찰된다.
Figure 112003032407665-pct00002
2. 마이크로어레이 설계
당해 항생제 저항성(ABR) 유전자의 가용한(PCR) 각 핵산 분자에서, 고도 특이적 DNA 프로브는 생물정보학적 표준 방법으로 찾는다. 일반적으로, 소프트웨어 "Gene Runner 3.0"(1994, Hastings Software, Inc.)이 이용되는데, PCR과 Hyb 프라이머 선별에는 "프라이머 3", Steve Rozen & Helen J. Skaletsky(1998)이 이용되고; 상동성 검색과 데이터베이스 교차-검사에는 "Fast3", W. R. Pearson and D.J. Lipman(19998), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, W.R. Perason(1990), "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" Methods in Enzymology 183:63-98이 이용되고; 정렬에는 Clustalx 1.8", Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jean-mougin, F and Higgins, D.G. (1997), The Clustalx window interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 24:4876-4882가 이용된다. 다른 가능한 ABR 표적과의 잠재적 교차-혼성화가 배제될 수 있다는 사실이 특히 주목을 받았다. 광범위한 EMBL과 GenBank 데이터베이스 검색으로 개별 프로브가 "외래" 서열과 오인 혼성화되지 않도록 하였다. dsPCR 산물과의 혼성화동안 최적 조건을 담보하기 위하여 프로브는 PCR 단편의 A/T 풍부한 영역에 집중된다. 여기서 최적 조건은 좀더 용이하게 변성되는 dsDNA 영역(예, A/T가 풍부한 영역)을 프로브가 "인식"하는 경우에 혼성화가 일반적으로 좀더 효과적으로 진행된다는 것을 의미한다.
각 프로브는 65℃±1의 Ts 값을 갖고 칩 표면과 혼성화 서열간 스페이서(spacer)로서 5' 말단에 여분의 dT10 서열을 보유한다(표 3). 모든 올리고뉴클레오티드는 5' (CH2)6-NH2 수식으로 합성되고 역상 크로마토그래피 HPLC 프로토콜로 정제되었다. 프로브는 1 mM 농도로 조정되고 MT 평판에서 -20℃에 저장된다.
Figure 112003032407665-pct00003
3. 어레이 설계
프로브는 유리 표면에 공유 결합되고, 이런 과정동안 5' 일차 아미노기는 시프 염기("실릴화된 슬라이드", CEL Associates) 형성으로 유리 표면의 자유 알데하이드기와 반응한다. 프로브는 스포터(spotter)(Affymetrix 417 Arrayer)로 유리 담체에 도포된다. 이런 과정동안, 스포팅(spotting) 프로토콜은 우수한 반복재현성과 반점 일관성을 위하여 최적화된다. 스포팅은 3 x SSC 0.1% SDS에서 히트/도트로 달성한다. 반점은 대략 240 ㎛의 직경을 갖고 280 ㎛의 반점-대-반점 거리로 마이크로어레이에 도포된다. 각 반점에 대하여 2개의 복제물이 존재한다. 칩의 유효성을 확인하기 위한 대조 프로브(Bluescript 폴리링커 서열)는 전형적 패턴("가이드 도트")과 네거티브 대조(여백, "완충 도트")로 도포된다.
도 2는 ABR 칩의 어레이 설계를 도시한다. 12가지 ABR 표적의 위치는 개별 번호(No.)로 표시한다. "가이드 도트"는 검은색이고, "완충 도트"는 백색이며, 이질성 대조의 위치는 회색으로 표시된다.
4. 칩 유효성 확인과 대조 혼성화
대체로 혼성화 조건은 대조 프로브 세트의 도움으로 마이크로어레이에서 최적화된다.
마이크로어레이에서 6개의 반점은 BS 폴리링커-특이적 서열을 보유하는 대조 프로브를 보유한다. 혼성화는 15 x 15 ㎜(2.25 ㎟) 커브 슬립하에 55℃에서 1시간동안 7 ㎕ 부피에서 3' 말단 Cy5-dCTP 표지된 올리고뉴클레오티드(BSrevco, 5' AAGCTCACTGGCCGTCGTTTTAAA SEQ ID NO. 39)로 실시한다.
칩은 표준 프로토콜(2 x SSC 0.1% SDS, 0.2 x SSC 0.1% SDS, 0.2 x SSC, 최종적으로 0.1 x SSC, 각 2분)에 따라 세척한다. 이후 유리 담체는 적절한 레이저 출력과 PMT 전압 조정을 갖는 공초점 형광 스캐너(Affymetrix 418 Array Scanner)로 자세히 조사한다.
도 3에서, ABR 칩에서 대조 혼성화를 도시한다. "가이드 도트" 대조 및 특이적인 각 표적(No.1 내지 no.12)중 한가지로 개별적으로 실현된 12가지 혼성화 실험의 결과(각 경우에 좌에서 우로, No.1 내지 No.3, No.4 내지 No.6, No.7 내지 No.9, No.10 내지 No.12)를 확인할 수 있다.
5. ABR 칩 원형으로 예비 연구
ABR 칩의 첫 번째 기능 검사에서, 3가지 상이한 ABR 표적과 2가지 대조 표적(앰피실린 No.8과 테트라사이클린 No.10)의 2가지 상이한 시료 혼합물("MixA"와 "MixB")이 준비되었다: "MixA"는 대표 표적이외에 카나마이신(aphA-3 No.2), 트리메트로프림(dhfrA No.4), 젠타마이신(aacA No.12)을 함유한다; "MixB"는 대표 표적이외에 반코마이신(vanB No.6), 에리트로마이신(ermC No.7), fosfomycin(fosB No.11)을 함유한다. 이들 합성 주형은 주형 함량을 가능한 정확하게 조정하는데 사용된다. 멀티플렉스 증폭은 35회 사이클로 표준 PCR 조건하에 실시되는데, 여기서 프로브와 상동한 "+"개별 가닥의 증폭을 위한 프라이머는 비오틴 분자에 결합된다. 프로브에 상보적인 서열을 보유하는 "-"개별 가닥에 대한 프라이머는 마커 분자 5' Cy-5에 결합된다: 반응 제제는 정제하고, 개별 가닥은 dyna-비드에서 알칼린 변성으로 분리하고 ABR 원형 어레이에서 55℃에 1시간동안 SSARC 완충액에서 혼성 화시킨다(도 4):
A) PCR(개별 제제에서 대조)
ㆍ 25 ㎕ 부피:
1.0 ㎕ 주형(3 fmol/㎕)
1.0 ㎕ 프라이머 + (25 μM) 5'-비오틴 [VBC-GENOMICS]
1.0 ㎕ 프라이머 - (25 μM) 5'-Cy5 [VBC-GENOMICS]
2.5 ㎕ HotStarTM 완충액 (10x) [Qiagen]
0.5 ㎕ dNTPs (10 mM) [Roche]
0.1 ㎕ HotStarTM Taq DNA 중합효소 [Qiagen]
ad 25 ㎕ with aqua bidest
ㆍ 사이클링: 15분 95℃ 30 x [30 sec 95℃, 20 sec 60℃, 40 sec 72℃] 10분 72℃
ㆍ QIA-quickTM PCR-정제 키트로 PCR 제제의 정제
B) 멀티플렉스-PCR
ㆍ 50 ㎕ 부피:
x ㎕ 주형(x fmol/㎕)
6.0 ㎕ 프라이머 "칵테일"+ (je 25 μM) 5'-비오틴 [VBC-GENOMICS]
6.0 ㎕ 프라이머 "칵테일"- (je 25 μM) 5'-Cy5 [VBC-GENOMICS]
5.0 ㎕ HotStarTM 완충액 (10x) [Qiagen]
1.0 ㎕ dNTPs (10 mM) [Roche]
0.2 ㎕ HotStarTM Taq DNA 중합효소 [Qiagen]
ad 50 ㎕ with aqua bidest
ㆍ 사이클링: 15분 95℃ 35 x [30 sec 95℃, 20 sec 55℃, 40 sec 72℃] 10분 72℃
ㆍ QIA-quickTM PCR-정제 키트로 PCR 제제의 정제
c) 단일-가닥 분리
ㆍ 200 ㎕ 1 x TS 완충액으로 20 ㎕ Dynabead(10 ㎍/㎕)[Roche]를 2 x 세척한다
ㆍ 8 ㎕ 6 x TS 완충액에 넣는다
ㆍ 37℃에서 30분동안 40 ㎕ PCR 제제와 함께 배양한다
ㆍ 200 ㎕ 1 x TS 완충액으로 Dynabead를 2 x 세척한다
ㆍ RT에서 5분동안 20 ㎕ 0.2 N NaOH로 DNA를 2 x 변성시킨다
ㆍ 120 ㎕ 90% EtOH/0.3 M NaOAC로 침전시킨다(20분 -20℃, 16,500 rpm에서 30분 4℃)
ㆍ 70% EtOH로 펠렛을 세척하고 건조시키며 14 ㎕ SSARC 완충액에 넣는다
D) 혼성화
ㆍ 98℃에서 3분동안 0.1 ㎕ BSrevco-Cy5(1 μM)로 SSARC 완충액에서 7 ㎕ 혼성화 시료를 변성시키고, 즉시 얼음위에 위치시킨다.
ㆍ 15 x 15 ㎜ 커버 슬립하에 55℃에서 1시간동안 혼성화시킨다
ㆍ 슬라이드를 세척한다(2 x SCC 0.1% SDS 5분 RT, 0.2 x SSC 5분 RT, 0.2 x SSC 5분 RT, 0.1 x SSC 2분 RT)
ㆍ 슬라이드를 자세하게 조사한다
E) 완충액
ㆍ TS 완충액: 100 mM Tris-Cl, pH 7.6, 150 mM NaCl; 가압증기멸균됨
ㆍ SSARC 완충액: 4 x SSC, 0.1%(w/v) Sarkosyl; 0.2 ㎛ 여과됨
ㆍ SSC 완충액: 20x: 3 M NaCl, 0.3 M 구연산삼나트륨(이수화물), pH 7.0
칩은 세척하고 자세하게 조사한다.
도 5는 2가지 합성 표적 및 2가지 대조 표적, 좌측에"MixA"와 우측에 "MixB"의 멀티플렉스 증폭과 후속 ABR 칩 탐지를 도시한다. ABR 표적이 정확하게 배정되면 각 네거티브하에 형광 스캔의 "모의 색깔(false color)"이 관찰된다. 도 5에 도시된 바와 같이, 정확한 표적의 완벽한 배정이 2가지 상이한 시료 혼합물에서 가능하다. 이는 본원 발명에 따른 12가지 핵산 분자의 동시 탐지가 명확한 결과를 산출한다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Osterreichisches Forschungszentrum Seibersdorf <120> Detection of antibiotic resistance genes <130> Antibiotic resistance genes <140> <141> <160> 39 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer <400> 1 gaccgaaaca atgtggaatt gg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer <400> 2 gccatcttca tgttggagct ttt 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer <400> 3 tgtggaacgg gaaaaggaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer <400> 4 cccgatatcc tccctgatcg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence:Primer <400> 5 gcgttaatgg cattcgacca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description 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Claims (45)

  1. 한 시료에서 최소 2개의 서로 상이한 핵산 분자를 동시에 탐지하는 방법에 있어서, 첫 번째 단계에서 멀티플렉스(multiplex) PCR 및 두 번째 단계에서 혼성화 반응은 증폭된 서열을 보유하는 마이크로어레이에 고착된 프로브로 실시하고, 여기서 혼성화된 PCR 산물은 탐지되고 선택적으로 정량되고, 각 경우에 핵산 분자의 서로 상이한 증폭된 서열과 특이적으로 혼성화되는 혼성화 반응용 프로브는 최대 2℃ 차이로 서로 상이한 융점(Tm)을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 한 시료에서 최소 6개의 서로 상이한 핵산 분자가 동시에 탐지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 항생제 저항성 유전자에 포함되는 핵산 분자가 탐지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 항생제 저항성 유전자는 베타-락타마제 blaZ, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, fosB 단백질, 아데닌 메틸라제 ermC, aacA-aphD 아미노글리코시드 저항성, 3'5'-아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 aphA-3, mecR, 페니 실린 결합 단백질 PBP2', 아미노글리코시드-3'-아데닐트랜스퍼라제 aadA, 테트라사이클린-저항성 단백질 tetC, DHFR DfrA, D-Ala:D-Ala 리가제 VanB에 대한 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 혼성화 반응은 30-80℃에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 혼성화 반응은 프로브의 용융 온도이하 5 내지 10℃에서실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 멀티플렉스 PCR은 표지된 프라이머로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 혼성화 반응은 "+"와"-"개별 가닥의 분리이후에 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 프로브와 상동한 서열을 보유하는 "+"개별 가닥은 멀티플렉스 PCR이후 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 프라이머는 "+"개별 가닥의 신장에 사용되고, 이들 개별 가닥은 "+" 개별 가닥의 분리를 담보하는 하나 이상의 비오틴 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 비오틴 분자는 "+" 개별 가닥의 신장을 위한 프라이머에 결합되고, "+"개별 가닥은 멀티플렉스-PCR이후 비드에 결합된 스트렙타비딘에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 정제 단계는 혼성화 단계를 선행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 제시된 방법에 따라 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키기 위한 마이크로어레이에 있어서, 탐지되는 서로 상이한 증폭된 핵산 분자-서열과 특이적으로 혼성화되는 최소 2개의 프로브가 마이크로어레이 표면에 결합되고 최대 2℃ 차이의 융점을 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  14. 제 13 항에 있어서, 프로브는 100 내지 500 ㎛의 직경을 갖는 마이크로어레이 표면의 반점(spot)에 결합되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  15. 제 14 항에 있어서, 반점은 서로 100 내지 500 ㎛의 거리를 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  16. 제 13 항에 있어서, 유리, 합성 재료 또는 막으로 구성되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  17. 제 13 항에 있어서, 프로브는 마이크로어레이 표면에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  18. 제 13 항에 있어서, 프로브는 15 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 혼성화 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  19. 제 13 항에 있어서, 각 프로브는 5' 말단에 dT 서열을 보유하고 상기 서열을 통하여 마이크로어레이에 결합되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  20. 제 18 항에 있어서, 혼성화 서열로서 프로브는 SEQ ID No.25, No.26, No.27, No.28, No.29, No.30, No.31, No.32, No.33, No.34, No.35, No.36에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  21. 제 1 항에 제시된 방법에 따라 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키기 위한 세트에 있어서, 상기 세트는 최소 2개의 프로브를 포함하고, 각 프로브는 탐지되는 서로 상이한 증폭된 핵산 분자-서열과 특이적으로 혼성화되고 서로 최대 2℃ 차이의 융점을 갖는 것을 특징으로 하는 세트.
  22. 제 21 항에 있어서, 프로브는 15 내지 25개 뉴클레오티드를 포함하는 혼성화 영역을 보유하는 것을 특징으로 하는 세트.
  23. 제 21 항에 있어서, 각 프로브는 5' 말단에 dT 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 세트.
  24. 제 22 항에 있어서, 각 프로브는 혼성화 영역에 SEQ ID No.25, No.26, No.27, No.28, No.29, No.30, No.31, No.32, No.33, No.34, No.35, No.36에서 선택되는 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 세트.
  25. 한 시료에서 서로 상이한 최소 2개의 핵산 분자를 동시에 탐지하는 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 키트:
    ㆍ 제 13 항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이;
    ㆍ 탐지되는 핵산 분자의 특이적인 증폭을 위한 프라이머를 보유하는 적어도 한가지 용기; 그리고
    ㆍ 제 21 항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 세트.
  26. 제 25 항에 있어서, 탐지되는 최소 한개의 핵산 분자를 파지티브 시료로서 보유하는 최소 한개의 용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  27. 제 25 항에 있어서, 비드에 결합된 스트렙타비딘을 보유하는 용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제 1 항에 있어서, 혼성화 반응용 프로브는 최대 1℃ 차이로 서로 상이한 융점(Tm)을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 한 시료에서 최소 8개의 서로 상이한 핵산 분자를 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 한 시료에서 최소 12개의 서로 상이한 핵산 분자를 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 혼성화 반응은 40-70℃에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항에 있어서, 혼성화 반응은 55-65℃에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 9 항에 있어서, 프라이머는 "+"개별 가닥의 신장에 사용되고, 이들 개별 가닥은 5'-말단에서 "+" 개별 가닥의 분리를 담보하는 하나 이상의 비오틴 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 13 항에 있어서, 최소 6개의 프로브가 이용되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  35. 제 13 항에 있어서, 최소 12개의 프로브가 이용되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  36. 제 34항 또는 제35항에 있어서, 최대 1℃ 차이의 융점을 가지는 서로 상이한 증폭된 핵산 분자-서열이 이용되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  37. 제 14 항에 있어서, 프로브는 200 내지 300 ㎛의 직경을 갖는 마이크로어레이 표면의 반점(spot)에 결합되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  38. 제 37 항에 있어서, 프로브는 240 ㎛의 직경을 갖는 마이크로어레이 표면의 반점(spot)에 결합되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  39. 제 15 항에 있어서, 반점은 서로 200 내지 300 ㎛의 거리를 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  40. 제 39 항에 있어서, 반점은 서로 280 ㎛의 거리를 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  41. 제 18 항에 있어서, 프로브는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 혼성화 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
  42. 제 1 항에 제시된 방법에 따라 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키기 위한 세트에 있어서, 상기 세트는 최소 6개의 프로브를 포함하고, 각 프로브는 탐지되는 서로 상이한 증폭된 핵산 분자-서열과 특이적으로 혼성화되고 서로 최대 2℃ 차이의 융점을 갖는 것을 특징으로 하는 세트.
  43. 제 1 항에 제시된 방법에 따라 멀티플렉스-PCR 산물을 혼성화시키기 위한 세트에 있어서, 상기 세트는 최소 12개의 프로브를 포함하고, 각 프로브는 탐지되는 서로 상이한 증폭된 핵산 분자-서열과 특이적으로 혼성화되고 서로 최대 2℃ 차이의 융점을 갖는 것을 특징으로 하는 세트.
  44. 제 42 항 또는 43 항에 있어서, 각 프로브는 탐지되는 서로 상이한 증폭된 핵산 분자-서열과 특이적으로 혼성화되고 서로 최대 1℃ 차이의 융점을 갖는 것을 특징으로 하는 세트.
  45. 제 22 항에 있어서, 프로브는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 혼성화 영역을 보유하는 것을 특징으로 하는 세트.
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