SK287793B6 - Spôsob stanovenia molekúl nukleových kyselín - Google Patents

Spôsob stanovenia molekúl nukleových kyselín Download PDF

Info

Publication number
SK287793B6
SK287793B6 SK1083-2003A SK10832003A SK287793B6 SK 287793 B6 SK287793 B6 SK 287793B6 SK 10832003 A SK10832003 A SK 10832003A SK 287793 B6 SK287793 B6 SK 287793B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
probes
hybridization
nucleic acid
microarray
acid molecules
Prior art date
Application number
SK1083-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK10832003A3 (sk
Inventor
Wolfgang Schmidt
Axel M�Ndlein
Martin Huber
Hans Kroath
Original Assignee
Austrian Research Centers Gmbh-Arc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Austrian Research Centers Gmbh-Arc filed Critical Austrian Research Centers Gmbh-Arc
Publication of SK10832003A3 publication Critical patent/SK10832003A3/sk
Publication of SK287793B6 publication Critical patent/SK287793B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Predkladaný spôsob opisuje simultánnu detekciu najmenej dvoch navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke. V prvom kroku sa uskutoční multiplexová PCR, v druhom kroku sa uskutoční hybridizácia so sondami imobilizovanými v systéme mikropolí (microarray). Hybridizované produkty PCR sú následne detegované a prípadne aj kvantifikované, pričom sondy aplikované pri hybridizácii - každá hybridizuje špecificky s inou nukleovou kyselinou - majú teploty topenia odlišujúce sa maximálne o 2 °C, výhodne iba o 1 °C.

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka metódy na simultánnu detekciu najmenej dvoch navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke. V prvom kroku sa uskutoční multiplexová PCR; v druhom kroku sa uskutoční hybridizácia so sondami imobilizovaným na microarray-i. Hybridizované produkty PCR sú následne detegované a prípadne aj kvantifikované. Ďalej sa predkladaný vynález týka microarray-a, set-u na hybridizáciu multiplexových produktov PCR a kit-u na simultánnu detekciu prinajmenšom dvoch navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke.
Doterajší stav techniky
Detekcia molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke sa uskutočňuje v najrôznejších oblastiach, napr.: v medicíne, pri kvalite kontroly, vo výskume atď. V jednej vzorke je často nutné detegovať najmenej dve navzájom odlišné molekuly nukleových kyselín; často 20, 50, 100 alebo viac. Pritom je žiaduce, a to z časových i nákladových dôvodov, aby sa v jednej vzorke zároveň detegovali rôzne molekuly nukleových kyselín. Existuje celý rad prác týkajúcich sa detekcie molekúl nukleových kyselín ukazujúcich rôzne metódy jej realizácie.
V US 5 994 066 je opísaný spôsob na detekciu baktérií resp. rezistencií na antibiotiká v biologických vzorkách. Podľa prvej metódy sa uskutočňuje multiplexová PCR za súčasnej detekcie viacerých rezistencií na antibiotiká. Ako príklady pre detekciu amplifikovaných produktov sú uvedené: agarózová gélová elektroforéza, fluorescenčná polarizácia a detekcia prostredníctvom fluorescenčného značenia. Ďalej je ako druhý spôsob na detekciu hľadaných sekvencii vo vzorkách opísaná metóda hybridizácie, pričom hybridizácia sa uskutočňuje pri 65 °C a hybridizácia vzorky so špecifickou cieľovou DNA naznačuje vysoký stupeň zhody medzi obidvoma nukleotidovými sekvenciami.
V US 6 045 996 je opísaný spôsob hybridizácie nukleotidovej sekvencie na microarray-i. Ako hybridizačné teploty sú uvádzané teploty medzi 20 °C a 75 °C. Ako príklad pre cieľové nukleotidy sú udávané amplifikačné produkty multiplexovej PCR.
Podľa US 5 614 388 sú špecifické nukleotidové sekvencie amplifikované prostredníctvom PCR; následne sú produkty amplifikácie detegované prostredníctvom hybridizácie. Vo výhodnej forme uskutočnenia sa vykonáva multiplexová PCR. Detekcia sa dá špecificky uskutočniť nastavením striktných podmienok. Ako striktné podmienky hybridizácie sú uvádzané teploty, ktoré umožňujú špecifickú hybridizáciu. Ako príklady pre teploty hybridizácie je uvádzaná škála medzi 50 až 55 °C.
US 5 846 783 sa týka metódy na detekciu nukleotidových sekvencii, pri ktorej sa po multiplexovej PCR uskutočňuje detekcia prostredníctvom hybridizácie; napr. pri teplote 55 °C.
WO 98/48041 A2 sa týka metódy identifikovania kmeňov baktérií rezistentných na antibiotiká, pričom sú gény amplifikované prostredníctvom PCR a detegované hybridizačnými sondami. Hybridizácia má byť zrealizovaná za striktných podmienok, asi 20 °C pod bodom topenia hybridizovanej DNA. Oligonukleotidy sa volia výhodne tak, aby mali podobné teploty topenia a tým mohli byť testované za rovnakých podmienok viaceré gény v tej istej hybridizačnej usadenine. Ako príklad je následne opísaná hybridizácia na oligonukleotidovom microarray-i. Ako teplota hybridizácie sa uvádza teplota od 45 do 60 °C.
Tieto opísané metódy majú však jeden nedostatok a to, že sú limitované vzhľadom na špecifítu a maximálny počet molekúl nukleových kyselín, ktoré je možné súčasne detegovať. V niektorých z týchto metód je v prvom kroku zrealizovaná multiplexová PCR, čím je zároveň zaručené paralelné amplifíkovanie viacerých nukleotidových sekvencii. Následná detekcia rôznych nukleotidových sekvencii je však problematická, pretože podľa tejto metódy nie je možné zároveň špecificky detegovať väčší počet nukleotidových sekvencii. Ak sa má po PCR uskutočniť hybridizácia, musia byť pre každú nukleotidovú sekvenciu nastavené špecifické striktne hybridizačné podmienky, pričom pre kratšie sekvencie musí byť nastavená nižšia teplota ako pre dlhšie sekvencie - pozri napr. US 6 045 996 - čím sa však znižuje počet súčasne detegovateľných nukleotidových sekvencii. Vo WO 98/48041 A2 sa napríklad navrhuje použiť oligonukleotidy, ktoré majú podobné teploty topenia, aby sa mohli testovať viaceré gény v tej istej hybridizačnej usadenine, pričom by sa však na jednom array-i testovalo maximálne osem oligonukleotidov.
Tým pádom nie sú tieto metódy vhodné na realizáciu detekcie viacerých resp. veľkého počtu molekúl nukleových kyselín, napríklad pre detekciu rezistencií na antibiotiká. Spôsob, ktorý sa obmedzuje na paralelné detegovanie iba malého počtu oligonukleotidov, je pre tento typ detekcií nedostatočný a pre prax, predovšetkým pre sériové testovanie, pracovne a časovo príliš náročný.
Úlohou predkladaného vynálezu je preto poskytnúť spôsob, ktorý umožní súčasné detegovanie veľkého počtu molekúl nukleových kyselín; rýchly, lacný a s nízkymi pracovnými nákladmi realizovateľný dôkaz určitých oligonukleotidov resp. génov v jednej vzorke.
Podstata vynálezu
Pre metódu predkladaného vynálezu, predstavenú v úvode, je charakteristické, že sondy používané pri hybridizácii - vždy špecificky hybridizujúce s navzájom odlišnými molekulami nukleových kyselín - majú teploty topenia Tm odlišujúce sa navzájom maximálne o 2 °C, resp. výhodne najviac o 1 °C. Tým, že sa teploty topenia sond použitých pri hybridizácii navzájom líšia o maximálne 2 °C, resp. výhodne maximálne o 1 °C, je prvýkrát možné v jednej vzorke simultánne detegovať veľký počet molekúl nukleových kyselín, keďže pri hybridizácii sa pre všetky sondy nastavia tie isté podmienky s ohľadom na teplotu, ale aj koncentráciu soli, hodnotu pH atď. Teplota topenia Tm je definovaná ako teplota, pri ktorej sa nachádza (za príslušných parametrov ako napr. koncentrácia soli) polovica všetkých molekúl v hélixovom stave.
Pre takmer všetky molekuly nukleových kyselín je možné pripraviť sekvencie s určitou teplotou topenia:
Jedna možnosť, ako sa dá vypočítať teplota topenia sekvencie, je prostredníctvom komerčného softvéru „Gene Runner 3.0“ (© 1994, Hastings Software, Inc.). Softvér umožňuje určiť Tms prostredníctvom rôznych metód/algoritmov. Údaje v predkladanej patentovej prihláške sú hodnoty tzv. ”Nearest-neighbor thermodynamic melting temperature” podľa metódy Breslauer a kol. (Proc. Natl. Acad. Sciences 83:3746-3750, Predicting DNA duplex stability Írom the base sequence). Parametre na výpočet môžu byť napríklad 660 mM pre koncentráciu soli a 7,5 pM pre koncentráciu vzorky. Pre výpočet Tms viacerých sond na simultánny hybexperiment nie sú rozhodujúce absolútne hodnoty (ktoré môžu byť závislé od vyššej alebo nižšej koncentrácie soli a DNA), ale zvolená metóda (t. j. „termodynamická“ pre sondy s dĺžkou medzi 15 a 30 bázami) a vzájomné vzťahy medzi hodnotami Tnis jednotlivých sond. Týmto spôsobom sa dajú vypočítať a vybrať hybridizačné sekvencie určené na testovanie molekúl nukleových kyselín resp. génov, takže môžu byť vyrobené špecifické sondy.
V rámci predkladaného vynálezu predstavujú „molekuly nukleových kyselín“ úseky sekvencií ako napr. určité gény, časti génu alebo genómu; mRNA alebo časti mRNA atď.
Pod spojením „multiplexová PCR“ sa v rámci predkladaného vynálezu chápe PCR, pri ktorej sa súčasne amplifikujú prinajmenšom dve navzájom odlišné molekuly nukleových kyselín., t. j. pri jednej reakcii sú súčasne amplifikované pomocou rôznych primérov rôznorodé sekvencie.
Pod „microarray-om“ sa rozumie nosič, na ktorom je vo vysokej hustote imobilizované veľké množstvo sond, takže môže byť za rovnakých podmienok súčasne hybridizovaný veľký počet molekúl nukleových kyselín. Microarray-e sa zvyčajne používajú na detekciu molekúl DNA; už ale existujú aj Microarray-e na dôkaz bielkovín. S pomocou microarray-ov sa podstatne zjednodušila in vitro DNA diagnóza, na jedenkrát sa dajú veľmi rýchlo zrealizovať komplexné vyšetrenia, keďže na relatívne malom microarray-i je možné imobilizovať niekoľko tisíc vytvorených oligonukleotidov. Hybridizácia na microarray-i umožňuje napríklad súčasné skúmanie mnoho tisíc génov. Na detekciu nukleotidových sekvencií sa už používa celý rad rôznych microarray-ov, pričom odborník si môže vybrať rôzne parametre zo širokej oblasti (pozri napr. Lockhart a kol., Náture Biotechnology Vol. 14, December 1996, strana 1675 - 1679).
V rámci predloženého vynálezu sa môže samozrejme prispôsobovať a meniť napr. materiál, veľkosť, štruktúra atď. microarray-a vzhľadom na počet, dĺžku a sekvenciu imobilizovaných sond.
Molekula nukleovej kyseliny sa jednak dá iba detegovať, t. j. zistiť, či je vo vzorke, pričom toto zistenie poskytuje výsledok ANO/NIE. Podľa vynálezu je však možné aj kvantifikovať množstvo molekúl nukleových kyselín, pričom toto sa dá uskutočniť vysoko špecificky na základe použitého microarray-a. Odborník môže pritom zvoliť akúkoľvek známu metódu na detekciu; napr. chemickú, enzymatickú, fyzikálnochemickú alebo antigénovo-protilátkovú. Pritom môže byť nukleová kyselina určená na detekciu označená, napr. rádioaktívnou alebo chemiluminiscenčnou molekulou. Tieto detekčné metódy sú odborníkom veľmi dobre známe, takže sa nimi nebudeme podrobne zaoberať. Výber danej metódy závisí od molekúl nukleových kyselín určených na detekciu a od toho, či má byť produkt iba detegovaný alebo má byť určené aj jeho množstvo.
Sondy sa vyrábajú podľa známych metód.
Čím menej sa odlišujú medzi sebou teploty topenia sond, o to špecifickejšie môžu byť molekuly nukleových kyselín detegované, keďže na základe toho sa dajú nastaviť podmienky hybridizácie, ktoré umožňujú veľmi špecifickú hybridizáciu, nie však hybridizáciu neúplne komplementárnych sekvencií, čím sa zníži resp. úplne vylúči nebezpečenstvo chybne-negatívnych, ale aj chybne-pozitívnych výsledkov.
Môžu sa pritom zvoliť priméry a sondy na amplifikáciu molekúl nukleových kyselín s dlhšou sekvenciou, ako je hybridizačná sekvencia, t. j. tá sekvencia, ktorá so sondami hybridizuje. Môže byť však amplifikovaná iba hybridizačná sekvencia, t. j. molekula nukleovej kyseliny pozostáva vtedy len zo sekvencie, s ktorou hybridizujú zodpovedajúce sondy.
Výhodné je podľa vynálezu detegovať v jednej vzorke simultánne prinajmenšom 6, výhodnejšie aspoň 8, obzvlášť výhodne aspoň 12 navzájom od seba odlišných molekúl nukleových kyselín. Počet navzájom od seba odlišných molekúl nukleových kyselín, ktoré môžu byť detegované vo vzorke, závisí vždy od špecifického prípadu, pričom smerom nahor nie je vlastne limitovaný.
Obzvlášť žiadaná je detekcia molekúl nukleových kyselín, ktoré sa nachádzajú v génoch spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká. Je známy veľký počet génov spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká, pričom sa na ich detekciu spravidla využívajú zdĺhavé a nespoľahlivé metódy - mikrobiologické testy rastu na živných médiách obsahujúcich antibiotiká a následné určovanie prežitia schopných zárodkov. Hoci sú už opísané metódy na identifikáciu rezistencií na antibiotiká pomocou amplifikácie génov a následnej hybridizácie (pozri WO 98/48041 A2), nebolo možné súčasne testovať jednu vzorku na viac génov rezistentných na antibiotiká bez toho, aby sa znížila špecifita. Na základe predkladanej metódy bude teraz možné detegovať neobmedzený počet rezistencií na antibiotiká v jednej vzorke, čo bude dôležité predovšetkým v nemocniciach, keďže práve tam dochádza k hromadeniu kmeňov baktérií rezistentných na antibiotiká. Všetky štandardné metódy izolácie DNA fungujú. V každom prípade by sa malo zabezpečiť, aby boli tiež purifikované menšie molekuly (ako napr. plazmidy), aby sa nestratili epizomálne kódované rezistencie.
Ako molekuly nukleových kyselín sú volené časti sekvencii z génov spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká, ktoré sú vždy pre daný gén špecifické a nevyskytujú sa v iných génoch. Týmto spôsobom sa dajú ešte viac redukovať chybne-pozitívne výsledky testov.
Používajú sa predovšetkým gény rezistentné na antibiotiká zo skupiny génov pre beta-laktamázu blaZ, chloramfenikolacetyltransferázu, fosB proteín, adenínmetylázu ermC, aacA-aphD aminoglykozidovú rezistenciu, 3'5'-aminoglykozidfosfotransferázu aphA-3, mecR, penicilín viažuci proteín PBP2', aminoglykozid-3'-adenyltransferázu aadA, proteín tetracyklínovej rezistencie tetC, DHFR DfrA a D-Ala:D-Ala ligázu vanB. Toto sú často sa vyskytujúce rezistencie na antibiotiká spôsobujúce veľké medicínske problémy a preto je dôležité poskytnúť rýchlu a vysoko špecifickú testovaciu metódu práve pre tieto rezistencie. Pritom je obzvlášť vítané, že všetky tieto vymenované rezistencie na antibiotiká môžu byť testované súčasne v jednej vzorke, t. j. molekuly nukleových kyselín, z ktorých je každá vždy špecifická pre jednu z týchto rezistencií, sú súčasne amplifikované pri jednej multiplexovej PCR a následne hybridizované so sondami na microarrayi. Prinajmenšom jedna sonda je pritom špecifická pre jednu molekulu nukleovej kyseliny a tým pre jednu rezistenciu na antibiotikum.
Hybridizáciu je vhodné uskutočňovať pri teplote 30 - 80 °C, výhodne pri teplote 40 - 70 °C a obzvlášť výhodne pri 55 - 65 °C. Nastavená teplota hybridizácie závisí od teploty topenia danej sondy a dá sa vypočítať a nastaviť pre každú hybridizáciu podľa vynálezu, pričom je obzvlášť dôležité, aby sa počas jej trvania udržovala konštantná teplota. Ukázalo sa, že je v rámci predkladanej metódy obzvlášť výhodné nastavovať teploty medzi 55 a 65 °C, keďže sa v tejto škále nachádzajú teploty topenia sond, ktoré sú vzhľadom na predkladaný spôsob najvhodnejšie, predovšetkým ohľadom na špecifitu a dĺžku.
Na dosiahnutie obzvlášť presnej detekcie je výhodné uskutočňovať hybridizáciu za veľmi striktných podmienok. To znamená nastaviť podmienky hybridizácie tak, aby zaručili hybridizáciu vysoko komplementárnych sekvencii, ale nie sekvencii, ktoré sa v niektorých nukleotidoch odlišujú. Pritom je obzvlášť výhodné, keď sa zvolia podmienky hybridizácie tak, že sa navzájom viažu len úplne komplementárne sekvencie, nie však sekvencie, ktoré sa odlišujú, čo i len v jednom nukleotide. Vtedy sa ponúka metóda, ktorá zaručuje vysoko špecifickú detekciu molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke a zároveň nevedie k žiadnym chybnepozitívnym výsledkom. Vysoko striktné podmienky sa nastavia voľbou teploty a koncentrácie iónov v reakčnej zmesi. Môže sa nastaviť napríklad teplota hybridizácie o 5 až 10 °C menšia, ako je teplota topenia sond; resp. sa zvolí pufor podľa želanej iónovej koncentrácie, resp. hodnota pH v závislosti od teploty hybridizácie.
Výhodne sa pri multiplexovej PCR použijú označené priméry. Tým bude zaručené označkovanie amplifikovaných produktov PCR, po hybridizácii sa budú dať detegovať. Ako je opísané, označenie môže byť vo forme molekuly - chemicky, fyzikálno-chemicky alebo enzymaticky detegovateľného signálu, ktorý sa dá zistiť a kvantifikovať napr. prostredníctvom farebnej reakcie, merania fluorescencie, luminiscencie, rádioaktivity atď.
Pre obzvlášť špecifický postup je pritom výhodné, keď sa hybridizácia uskutoční až po oddelení „+“ a vlákien. Tým sa zabráni, aby sa vlákna, ktoré majú so sondami identické sekvencie, viazali kompetetívne t. j. namiesto týchto sond na detegované jednovláknové molekuly, čo by viedlo predovšetkým pri kvantitatívnej detekcii k chybným výsledkom. Oddelením „+“ a vlákien zostanú v hybridizačnej zmesi iba vlákna, ktoré sú so sondami komplementárne.
Je pritom obzvlášť výhodné, aby boli po multiplexovej PCR odstránené „+“ vlákna majúce so sondami identické sekvencie. Týmto spôsobom zostanú v hybridizačnej zmesi iba vlákna majúce so sondami komplementárne sekvencie, takže hneď následne môže byť uskutočnená hybridizácia.
Obzvlášť výhodný spôsob oddelenia sa vyznačuje tým, že sa použijú priméry pre elongáciu „+“ vlákien, ktoré sú výhodne na svojich 5'koncoch viazané na nejakú látku, predovšetkým aspoň na molekulu biotínu, ktorá zabezpečí oddelenie „+“ vlákien. Tým môžu byť vlákna „+“ zmenené už pri PCR amplifikácii, takže bude špecificky zaručené ich úplné odlúčenie a to bez toho, aby bolo nutné do metódy zapracovať ďalšie medzikroky. Zároveň sa predíde tomu, aby boli odstránené aj vlákna. Biotín sa pritom hodí obzvlášť dobre, pretože sa dá ľahko naviazať na DNA a dá sa špecificky oddeliť.
Na to je obzvlášť výhodné, keď sa molekuly biotínu naviažu na priméroch určených na elongáciu „+“ vlákna, pričom sa po multiplexovej PCR „+“ vlákna oddelia prostredníctvom streptavidínu naviazaného na guľôčky. Pomocou guľôčok sa dosiahne, že streptavidín je vo vzorke nanesený na veľkej ploche, čím na seba kompletne naviaže molekuly biotínu. Ďalej sa použitím guľôčok zabezpečí, že zlúčenina streptavidín-biotín sa zo vzorky znova oddelí. Guľôčky na to použité sú všeobecne známe a môžu byť vyrobené napríklad zo skla prípadne s magnetickým jadrom.
Výhodne sa po hybridizácii predradí krok čistenia. Tým sa z hybridizačnej zmesi odstránia látky, ktoré by mohli pôsobiť pri hybridizácii rušivo, pričom čistenie sa dá eventuálne uskutočňovať počas alebo po oddelení „+“ vlákien. Čistenie sa môže vykonať napríklad zrážaním DNA a jej opätovným získaním v pufri.
Podľa ďalšieho aspektu sa týka predkladaný vynález microarray-a na hybridizáciu produktov multiplexovej PCR podľa opísaného spôsobu podľa vynálezu, pričom sú na jeho povrchu naviazané prinajmenšom 2, výhodne aspoň 6 a obzvlášť výhodne aspoň 12 sond, ktoré hybridizujú vždy špecificky s navzájom odlišnými molekulami nukleových kyselín určenými na detekciu a majú teploty topenia, ktoré sa odlišujú maximálne o 2 °C, výhodne najviac o 1 °C. Pre microarray a sondy platia takisto uvedené definície vzťahujúce sa na spôsob. Počet sond viazaných na microarray-i závisí pritom opäť od počtu molekúl nukleových kyselín, ktoré je potrebné detegovať, pričom môžu byť na microarray-i kvôli negatívnemu testu samozrejme naviazané aj doplnkové sondy, ktoré nebudú s molekulami nukleových kyselín určených na detekciu hybridizovať. Ako je už uvedené, je dôležité, aby sa teploty topenia sond odlišovali navzájom iba maximálne o 2 °C, výhodne najviac 1 °C, čím sa zabezpečí, že prebehne hybridizácia, pri ktorej budú špecificky a kvalitne hybridizovať všetky molekuly nukleovej kyseliny so sekvenciami komplementárnymi k sondám.
Výhodné sú sondy viazané na povrchu microarray-a v spot-och s priemerom od 100 až 500 pm, výhodne 200 až 300 pm a obzvlášť výhodne 240 pm. Ukázalo sa, že spot-y s týmto priemerom sú vhodné na opísaný spôsob podľa vynálezu obzvlášť dobre, pričom detekcia nasledujúca po hybridizácii poskytuje nanajvýš jasné a nespochybniteľné výsledky. Každý spot pritom predstavuje jeden druh sondy t. j. sondy s rovnakou sekvenciou. Je samozrejme možné uskutočniť na microarray-i aj paralelné pokusy s viacerými spot-mi s rovnakým druhom sondy.
Ďalej je výhodné, keď sú spot-y navzájom vzdialené 100 až 500 pm, výhodne 200 až 300 pm a ideálne 280 pm. Týmto bude zaručené, že na microarray-i bude umiestnený maximálny počet spot-ov, pričom však súčasne bude možné jednoznačne rozlíšiť pri detekcii jednotlivé spot-y a tým molekuly nukleových kyselín určených na detekciu s naviazanými sondami.
Výhodne je microarray vyrobený zo skla, syntetického materiálu resp. z membrány. Tieto materiály sa ukázali na výrobu microarray-ov obzvlášť vhodné.
Je obzvlášť výhodné, keď sú sondy naviazané na povrchu microarray-a kovalentne. Tým je zaručená pevná väzba sondy na microarray a počas hybridizovania a vymývania nepríde k jej rozrušeniu -1, j. k chybnému výsledku. Ak je microarray vyrobený napr. z naneseného skla, môžu primáme aminoskupiny reagovať s voľným aldehydovými skupinami na povrchu skla za vzniku Schiffovej bázy.
Ukázalo sa byť výhodné mať sondy s hybridizačnou sekvenciou dlhou v rozsahu 15 až 25, výhodne 20 nukleotidov. Pojem „hybridizačná sekvencia“, ako je už opísané, predstavuje sekvenciu, s ktorou hybridizujú molekuly nukleových kyselín určené na detekciu. Sondy môžu byť samozrejme dlhšie, ako je hybridizačná sekvencia, pričom by však mohlo so vzrastajúcou dĺžkou sondy dochádzať k neželaným väzbám s inými molekulami nukleových kyselín, čo by znehodnocovalo výsledok. Preto je výhodné, aby sondy - okrem častí, ktoré sú potrebné pre väzbu na povrch microarray-a - tvorila iba hybridizačná sekvencia. Ako vhodná sa ukázala byť dĺžka od 15 do 25, výhodne 20 nukleotidov, pretože v tomto dĺžkovom rozpätí sa dá prostredníctvom opísaného spôsobu nájsť hybridizačná sekvencia s potrebnou teplotou topenia. Táto dĺžka je dostačujúca, aby umožnila špecifickú väzbu a aby zamedzila riziku, že sa náhodou vyskytnú aj iné molekuly DNA s tou istou sekvenciou, ako majú molekuly nukleových kyselín určené na detekciu.
Uprednostňujú sa sondy, ktoré majú na svojom 5'- konci sekvenciu dT10, prostredníctvom ktorej sa dajú viazať na microarray. Tým je zabezpečená dostatočná vzdialenosť medzi microarray-om a hybridizačnou sekvenciou, takže táto je potom neobmedzene prístupná pre molekulu nukleovej kyseliny. Počet Tm býva napr. 5 až 15, výhodne 10.
Na simultánnu detekciu génov spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká je vhodné, keď majú sondy ako hybridizačnú sekvenciu len jednu sekvenciu vybranú zo skupiny: Nr. 25, Nr. 26, Nr. 27, Nr. 28, Nr. 29, Nr. 30, Nr. 31, Nr. 32, Nr. 33, Nr. 34, Nr. 35 a Nr. 36. Tieto sekvencie sú prítomné v génoch spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká, vyskytujú sa obzvlášť často v bakteriálnych kmeňoch a sú medicínsky dôležité. Sú to gény spôsobujúce rezistenciu na antibiotiká: beta-laktamáza bíaZ, chloramfenikol acetyltransferáza, proteín fosB, adenínmetyláza ermC, aacA-aphD aminoglykozidová rezistencia, 3'5'- aminoglykozidfosfotransferáza aphA-3, mecR, proteín viažuci penicilín PBP2', aminoglykozid-3'-adenyltransferáza aadA, proteín tetracyklínovej rezistencie tetC, DHFR DfrA a D-Ala:D-Ala ligáza vanB a majú teploty topenia, ktoré sa navzájom líšia nanajvýš o asi 1 °C.
Podľa ďalšieho aspektu sa predkladaný vynález týka set-u na hybridizáciu produktov multiplexovej PCR podľa opísaného spôsobu, pričom zahŕňa prinajmenšom 2, výhodne 6 a ideálne aspoň 12 sond, ktoré hybridizujú vždy špecificky s rôznymi molekulami nukleových kyselín určených na detekciu a majú teploty topenia, ktoré sa navzájom (tiež od iných molekúl sond/párov nukleových kyselín určených na detekciu v set-e) odlišujú o maximálne 2 °C, výhodne iba o 1 °C. Sondy môžu byť rozpustené v pufri. Ďalej môžeme za súčasť set-u pokladať viac nádržiek, pričom v jednej nádržke sú sondy s rovnakou sekvenciou; takže sa dajú nanášať na microarray na daný spot sondy s rovnakou sekvenciou. Je však samozrejme možné mať v jednej nádržke aj sondy s dvoma alebo viacerými navzájom odlišnými sekvenciami.
Uprednostňujú sa sondy, ktoré hybridizujú v rozpätí od 15 do 25, ideálne 20 nukleotidov.
Ďalej je vhodné, aby mali sondy na svojom 5 konci sekvenciu dT, pričom počet T,„ je od 5 do 15, napr.
10.
Je obzvlášť výhodné, aby mali sondy vždy v úseku hybridizácie sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny: Nr. 25, Nr. 26, Nr. 27, Nr. 28, Nr. 29, Nr. 30, Nr. 31, Nr. 32, Nr. 33, Nr. 34, Nr. 35 a Nr. 36.
Podľa ďalšieho aspektu sa predložený vynález týka kit-u na simultánnu detekciu prinajmenšom dvoch navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke, pričom zahŕňa:
- microarray (podľa vynálezu), tak ako je opísaný,
- prinajmenšom jednu nádržku s primérmi na špecifickú amplifikáciu molekúl nukleových kyselín určených na detekciu a
- prípadne set (podľa vynálezu), tak ako je opísaný.
Nádržka môže pritom obsahovať priméry s tou istou sekvenciou, ale aj primérový pár na amplifikáciu molekuly nukleovej kyseliny alebo konečne aj viaceré páry primérov na amplifikáciu viacerých navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín, pričom by však priméry mali byť k dispozícii v určitej koncentrácii. Kit môže samozrejme obsahovať ďalej návod na použitie s protokolom na realizáciu vyššie opísaného spôsobu ako aj prípadne ďalšie pufre, soli, roztoky atď., ktoré sú nutné na amplifikáciu, hybridizáciu, resp. detekciu.
Microarray môže mať pritom už na sebe imobilizované sondy. Set obsahujúci sondy môže byť predložený oddelene od microarray-a (za predpokladu, že microarray je čistý, t. j. nenesie naviazané sondy); môže byť ale predložený ako integrovaná zložka microarray-a.
Kit obsahuje výhodne prinajmenšom jednu nádržku aspoň s jednou molekulou nukleovej kyseliny určenou na detekciu ako pozitívnu vzorku. Aj tu môže obsahovať nádržka molekuly nukleovej kyseliny s rovnakou sekvenciou, pričom jeden kit môže obsahovať viaceré nádržky a je možné dať do jednej nádržky molekuly nukleových kyselín s viacerými navzájom odlišnými sekvenciami. Keď je kit určený napr. na detekciu génov spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká, môže mať ako pozitívnu vzorku molekulu nukleovej kyseliny so sekvenciami, ako je hybridizačná sekvencia SEQ ID Nr. 25 až po SEQ ID Nr. 36.
Je obzvlášť výhodné, keď kit ďalej obsahuje nádržku so streptavidínom naviazaným na guľôčkach. Toto umožňuje oddelenie amplifikovaných „+“ a „-“ vlákien v prípade, že „+“ alebo vlákno je naviazané na biotín; napr. použitím biotínu naviazaného na primér.
Vynález bude následne bližšie opísaný pomocou uvedených príkladov ako aj obrázkov, na ktoré sa však neobmedzuje.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Jednotlivé obrázky opisujú:
obr. 1 oddelenie produktov PCR všetkých dvanástich ABR target-ov prostredníctvom gélovej elektroforézy; obr. 2 náčrt microarray ABR chip-ov; obr. 3 schému priebehu pokusu;
obr. 4 zobrazenia kontrolnej hybridizácie na ABR chip-e a obr. 5 výsledok ABR-chip-detekcie po multiplexovej amplifikácii.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Génová syntéza referenčných - „ABR Targets“
In vitro bol prostredníctvom génovej syntézy vyrobený celý rad sekvencií spôsobujúcich rezistenciu na antibiotiká - (ABR), pretože buď neboli k dispozícii „type strains“, alebo práca s organizmami, ktoré prichádzali do úvahy, nebola možná z bezpečnostných dôvodov („bio safety level“ 2 alebo viac). V tabuľke 1 sú zhrnuté všetky ”Targets” a je k ním priradené číslo (Nr.), pričom „control“ rezistencie vektorov sú odvodené a slúžia v prvom rade na overenie chip-ov. Pre tieto target-y sú k dispozícii na ABR-chip-prototypoch sondy.
Tabuľka 1
Nr. Rezistencia na antibiotikum Druh „Target“ (Gén rezistencie)
8 Ampicilín (kontrola) S. Aureus, E. faecalis Beta-laktamáza blaZ
9 Chloramfenikol (kontrola) Bacillus sp. Corynebacterium sp. Chloramfenikolacetyl-transferáza
11 Forsformycín S. epidermidis, Staphylococcus sp. FosB protein
7 Erytromycín Staphylococcus sp. Adenínmetyláza ermC
12 Gentamycín S. aureus aacA-aphD gén amylo-glykozidovej rezistencie
2 Kanamycín S. aureus, S. faecalis, E. faecalis 3 '5 '-aminoglykozidfosfo-transferáza aphA-3
3 Meticilín S. aureus mecR
1 Penicilín S. aureus Protein viažuci penicilín PBP2'
5 Streptomycín, Spectinomycín Salmonella Aminoglykozid-3'-adenyltransferáza aadA
10 Tetracyklín (kontrola) Salmonella sp. Protein spôsobujúci tetracyklínovú rezistenciu tetC
4 Trimetoprim S. aureus DHFRDfrA
6 V ancomycín-V anB-typ Enterococcus, Streptococ- cus D-Ala:D-Ala ligáza vanB
Tabuľka 2 ukazuje sekvencie PCR primérov a dĺžku produktov PCR, ktoré boli vyvinuté pre prototyp; na obr. 1 je vidieť všetkých 12 produktov PCR po agarózovej gélovej elektroforéze.
Tabuľka 2
Nr. Meno PCR Primér (SEQ ID Nr.) Produkt PCR
1 PBP2 1+2 423 bp
2 KanR 3+4 532 bp
3 MecR 5+6 517 bp
4 DhfrA 7+8 279 bp
5 StrR 9+10 549 bp
6 VanR 11+12 498 bp
7 MlsR 13+14 564 bp
8 AmpR 15+16 219 bp
9 CmR 17+18 247 bp
10 TetR 19+20 245 bp
11 FosB 21+22 304 bp
12 AacA 23+24 497 bp
Príklad 2
Microarray Design
Pre všetky molekuly nukleových kyselín - pre všetky gény spôsobujúce rezistenciu na antibiotiká, ktoré prichádzali do úvahy, boli pomocou štandardných bioinformačných metód vypočítané vysoko špecifické DNA-sondy. Všeobecne sa používal softvér „Gene Runner 3.0“ (© 1994, Hastings Software, Inc,); pre PCR a Hyb Primer Selection „Primer 3“, Steve Rozen a Helen J. Skaletsky (1998) Primer 3; pre homologické hľadanie a Datebank cross-checks: „Fasta 3“, W.R. Pearson a D. J. Lipman (1998), „Improved Tools for Biolo15 gical Sequence Analysis“, PNAS 85: 2444-2448, W. R. Pearson (1990) „Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA“, Methods in Enzymology 183: 63-98; pre alignments: „ClustalX 1.8“, Thomson, J.D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. (1997), The ClustalX Windows interface: ílexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acid Research, 24:4876-4882. Pozornosť sa kládla predovšetkým nato, aby sa vylúčili potencionálne krížové hyb20 ridizácie s inými možnými ABR target-mi. Aby sa predišlo chybnej hybridizácií jednotlivých sond s „cudzími“ sekvenciami, boli použité aj extenzívne EMBL a rešerše z informačných a génových bánk. Aby sa zaručili optimálne podmienky pri hybridizácii s produktmi dsPCR, sú sondy lokalizované v PCR-fragmentoch, v oblastiach bohatých na A/T. V tomto prípade znamenajú optimálne podmienky, že hybridizácie sú vo všeobecnosti efektívnejšie, ak sonda „spoznáva“ úsek dsDNA, ktorý lepšie denaturuje (napr. kvôli oblasti boha25 tej na A/T).
Každá sonda má hodnotu Ts 65 °C ± 1 a na 5 'konci extra dT 10 sekvenciu - spacer medzi povrchom chip-u a hybridizačnou sekvenciou (pozri tabuľku 3). Všetky oligonukleotidy boli syntetizované s 5'(CH2)6-NH2 modifikáciou a vyčistené prostredníctvom „reversed phase chromatography“ HPLC protokolu. Sondy sú nastavené na koncentráciu 1 mM a uchovávajú sa v MT-platniach pri teplote -20 °C.
Tabuľka 3
Nr. Meno Sekvencia (SEQ ID Nr.) T 1 m
1 PBP2 25 64,8 °C
2 KanR 26 65,1 °C
3 MecR 27 64,8 °C
4 DhfrA 28 65,5 °C
5 StrR 29 63,7 °C
6 VanB 30 64,4 °C
7 MlsR 31 64,9 °C
8 AmpR 32 65,4 °C
9 CmR 33 64,9 °C
10 TetR 34 65,9 °C
11 FosB 35 64,2 °C
12 AacA 36 65,0 °C
Co BSreverse 37 65,9 °C
hCo AT-M33 38 65,3 °C
Príklad 3
Array Layout
Sondy sú kovalentne naviazané na povrchu skla; 5' primáme aminoskupiny reagujú s voľnými aldehydovými skupinami na povrchu skla za vzniku Schiffovej bázy (Sibylated Slides”, CEL Associates). Sondy sú nanesené na sklenený nosič prostredníctvom spotter-a (Affymetrix 417 Arrayer). Spott-protokoly boli pritom optimalizované na dobrú reprodukovateľnosť a konzistenciu spot-ov. Spot-ovanie prebehlo v 3x SSC 0,1% SDS s hits/dot. Spot-y majú priemer približne 240 pm a sú nanášané na microarray vo vzdialenosti 280 pm od seba. Každý spot má vždy dve repliky. Kvôli overeniu chip-ov sú nanesené v typickom vzore („guide dots“) kontrolné sondy (Bluescript polylinker Sequenz) a negatívne kontroly (Leerwerte, sog. „buffer dots“).
Obr. 2 ukazuje Array Layout ABR chip-u. Pozícia 12 ABR targetov je označená jednotlivými číslami (Nr.). „Guide dots“ sú čierne, „buffer dots“ biele a pozícia heterológnych kontrol je označená šedou.
Príklad 4
Overenie chip-ov a kontrolná hybridizácia
Hybridizačné podmienky boli v prvom rade optimalizované na microarray pomocou set-ον kontrolných sond. Šesť spot-ov na microarray-i obsahuje jednu kontrolnú sondu so špecifickou B S polylinkerovou sekvenciou. Hybridizácia sa uskutočnila v objeme 7 pm s 3'koncovým Cy5-dCTP oligonukleotidom (BSrevco, 5 'AAGCTCACTGGCCGTCGTTTTAAA SEQ ID Nr. 39) v SSARC-pufri, pod skleneným krytom s rozmermi 15x15 mm (225 mm2), jednu hodinu pri teplote 55 °C.
Chip bol premytý prostredníctvom štandardných protokolov (2 x SSC 0,1 % SDS, potom s 0,2 x SSC 0,1 % SDS, potom s 0,2 x SSC a nakoniec s 0,1 x SSC; vždy 2 min.). Sklenený nosič bol ďalej oskenovaný v konfokálnom fluorescenčnom skeneri (Affymetrix 418 Array Scanner) s vhodným výkonom laseru a vhodnými nastaveniami PMT napätí.
Na obr. 3 je zobrazená kontrolná hybridizácia na ABR chip-e. Vidieť je výsledok celkovo 12 samostatne prevedených hybridizačných experimentov, vždy s jedným so špecifických target-ov (Nr. 1 bis Nr. 12) s kontrolami „guide dot“ (zľava doprava vždy Nr. 1 až Nr. 3, Nr. 4 až Nr. 6, Nr. 7 až Nr. 9 a Nr. 10 až Nr. 12).
Príklad 5
Pilotné štúdie s ABR-chip-prototypom
V prvom teste funkcie ABR chip-ov boli vyrobené dve zmesi vzoriek („MixA“ a „MixB“) vždy z troch rôznych ABR target-ov a dvoch kontrolných target-ov (Ampicilín Nr. 8 a tetracyklín Nr. 10): „MixA“ obsahuje okrem kontrolných target-ov kanamycín (aphA-3 Nr. 2), trimetroprim (dhfrA Nr. 4) a gentamycín (aacA Nr. 12). „MixB“ obsahuje okrem kontrolných target-ov vancomycín (vanB Nr. 6), erytromycín (ermC Nr. 7) a fosfomycín (fosB Nr. 11). Pritom boli použité syntetické „templáty“, aby bolo možné nastaviť ich čo najpresnejšie množstvá. Nasledovná multiplexová amplifikácia sa uskutočňovala za štandardných podmienok v 35 cykloch, pričom boli priméry (identické so sondami) na amplifikáciu „+“ vlákien naviazané na molekuly biotínu. Priméry pre „-“ vlákna, majúce k sondám komplementárne sekvencie, boli naviazané na 5'Cy-5 makromolekuly: Reakčná usadenina bola vyčistená, jednovlákna izolované prostredníctvom alkalickej denaturácie na Dynabeads a hybridizované jednu hodinu pri teplote 55 °C na array-och prototypu ABR v pufri SSARC (pozri obr. 4):
A) PCR (Kontroly v usadenine) • Objem 25 μΐ:
1,0 μΐ template (3 fmol/μΐ)
1,0 μΐ Primerplus (25 μΜ) 5'-Biotin [VBC-GENOMICS]
1,0 μΐ Primer mínus (25 μΜ) 5'-Cy5 [VBC-GENOMICS]
2,5 μΐ HotStar™ Pufor (10x) [Qiagen]
0,5 μΐ dNTPs (10 mM) [Roche]
0,1 μΐ HotStar™ Taq DAN Polymeráza [Qiagen] ad 25 μΐ s aqua bidest.
• Cyklovanie: 15 min 95 °C 30 x [30 sec 95 °C 20 sec 60 °C 40 sec 72 °C] 10 min 72 °C • Čistenie PCR-usadeniny prostredníctvom QIAquick™ PCR-purifikačného kit-u.
B) Multiplexová PCR • Objem 50 μΐ:
X μΐ template (x fmol/μΐ)
6,0 μΐ Primer cocktail” plus (je 25 μΜ) 5'-Biotín [VBC-GENOMICS]
6,0 μΐ Primer cocktail” mínus (je 25 μΜ) 5 '-Cy5 [VBC-GENOMICS]
5,0 μΐ HotStar™ Pufor (10 x) [Qiagen]
1,0 μΐ dNTPs (10 mM) [Roche]
0,2 μΐ HotStar™ Taq DNA Polymeráza [Qiagen] ad 50 μΐ s aqua bidest.
• Cyklovanie: 15 min 95 °C 35 x [30 sec 95 °C 20 sec 55 °C 40 sec 72 °C] 10 min 72 °C • Čistenie PCR-usadeniny prostredníctvom QIAquick™ PCR-purifikačného kit-u.
C) Single-strand izolácia • 20 μΐ Dynabeads (10 pg/pl) [Roche] 2 x s 200 μΐ 1 x vymyť s TS-pufrom.
• dať do 8 μΐ 6 x TS-pufra • inkubovať 30 min pri teplote 37 °C so 40 μΐ PCR-usadeniny • Dynabeads vymyť 2 x s 200 μΐ 1 x TS-pufrom • DNA 2 x denaturovať 5 min s 20 μΐ 0,2 M NaOH pri RT • Zrážať s 120 μΐ 90% EtOH/0,3 M NaOAC (20 min -20 °C, 30 min pri 16500 rpm 4 °C) • Peletu vymyť s 70% EtOH, vysušiť a dať do 14 μΐ SSARC-pufra
D) Hybridizácia • Denaturovať 3 min 7 μΐ hybridizačnej vzorky v SSARC-pufri s 0,1 μΐ BSrevco-Cy5 (1 μΜ) pri 98 °C a hneď dať na ľad.
• Hybridizovať 1 h pri 55 °C pod skleneným krytom s rozmermi 15x15 mm • Vymyť Slide (2 x SCC 0,1% SDS 5 min RT, 0,2 x SSC 5 min RT, 0,2 x SSC 5 min RT, 0,1 x SSC 2 min RT) • Skenovať Slide
E) Pufor • TS-pufor: 100 mM Tris-Cl, pH 7,6, 150 mM NaCl; autoklavírovať • SSARC-pufor: 4 x SSC, 0,1% (w/v) Sarkkozyl; 0,2 pm filtrovať • SSC-pufor: 20 x: 3 M NaCl, 0,3 M 3-nátriumcitrátu (dihydrát), pH 7,0
Chip-y boli premyté a oskenované.
Obr. 5 ukazuje multiplexovú amplifikáciu a následnú ABR-chip-detekciu dvoch odlišných syntetických target-ov a dvoch kontrolných target-ov, vľavo „MixA“, vpravo „MixB“. Vidieť sú aj „false color“ fluorescenčného skenu, vždy pod negatívom so správnymi priradeniami ABR target-ov. Ako je vidieť z obrázka číslo 5, je možné jednoznačné priradenie správnych target-ov v dvoch rôznych zmesiach vzoriek. To ukazuje, že súbežná detekcia 12-tich molekúl nukleových kyselín podľa predkladaného spôsobu vedie k jednoznačným výsledkom.
Protokol sekvencií <110> Ôsterreichisches Forschungszentrum Seibersdorf <120> Detekcia rezistencií na antibiotiká <130> Gény spôsobujúce rezistenciu na antibiotiká <140>
<141>
<160> 39 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 1 gaccgaaaca atgtggaatt gg 22 <210>2 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400>2 gccatcttca tgttggagct ttt 23 <210> 3 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400>3 tgtggaacgg gaaaaggaca 20 <210>4 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 4 cccgatatcc tccctgatcg 20 <210>5 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400>5 gcgttaatgg cattcgacca 20 <210>6 <211>20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 6 tttcgccatt cgcattgtct 20 <210>7 <211> 24 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 7 tttcaccatg aaggggtaga tgtt 24 <210>8 <211> 25 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 8 tttccctttt ctacgcacta aatgt 25 <210>9 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 9 tccagaacct tgaccgaacg 20 <210> 10 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 10 gtcattgcgc tgccattctc 20 <210> 11 <211>20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 11 agtctccccg ccatattctc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 12 gccgacaatc aaatcatcct 20 <210> 13 <211> 21 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 13 tgaaatcggc tcaggaaaag g 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 14 cgtcaattcc tgcatgtttt aag 23 <210> 15 <211>20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 15 gtgtcgccct tattcccttt 20 <210> 16 <211>20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 16 ataataccgc gccacatagc 20 <210> 17 <211>25 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 17 gcctttttaa agaccgtaaa gaaaa 25 <210> 18 <211> 25 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 18 ccacatcttg cgaatatatg tgtag 25 <210> 19 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 19 gtcactatgg cgtgctgcta 20 <210> 20 <211> 20 <212>DNA <213 > Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 20 ggtgatgtcg gcgatatagg 20 <210> 21 50 <211>24 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400>21 acagagatat tttaggggct gaca 24 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 22 cttctaaact tcctgtatgc aattct 26 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 23 agagccttgg gaagatgaag tt 22 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Primér <400> 24 gccacactat cataaccact accg 24 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie:
Oligonukleotid <400> 25 ggcatcgttc caaagaatgt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie:
Oligonukleotid <400> 26 gaaagctgcc tgttccaaag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 27 gaagcaaatg gatggttcgt <210>28 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 28 tcgaaaactg ggaagtcgaa <210> 29 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 29 attgttgtgc acgacgacat <210>30 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 30 ggtgcgatac agggtctgtt <210> 31 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400>31 caaaacgctc attggcatta <210>32 <211>20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 32 tttgccttcc tgtttttgct <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 33 accgttttcc atgagcaaac <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 34 cccgtcctgt ggatcctcta <210> 35 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 35 gttgaaagtg agacctcggc <210> 36 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400> 36 tgccacaaat gttaaggcaa <210> 37 <211> 19 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie:
Oligonukleotid <400> 37 aaaacgacgg ccagtgagc 19 <210>38 <211> 21 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie:
Oligonukleotid <400> 38 ttttaccgac atggtacctg g 21 <210> 39 <211> 24 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie:
Oligonukleotid <400> 39 aagctcactg gccgtcgttt taaa 24

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob simultánnej detekcie aspoň šesť navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín obsiahnutých v génoch rezistentných proti antibiotikám, v jednej vzorke, pričom v prvom kroku sa uskutoční multiplexová PCR a v druhom kroku sa uskutoční hybridizácia so sondami imobilizovanými na microarray-i s amplifikovanými sekvenciami a následne sa detegujú prípadne kvantifikujú hybridizované produkty PCR, pričom sondy použité pri hybridizácii, vždy špecificky hybridizujúce s navzájom rôznymi amplifikovanými sekvenciami molekúl nukleových kyselín majú teploty topenia, ktoré sa odlišujú navzájom od seba o maximálne 2 °C, výhodne iba o 1 °C.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa simultánne v jednej vzorke deteguje aspoň 8 navzájom od seba odlišných molekúl nukleových kyselín.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 2,vyznačujúci sa tým, že sa v jednej vzorke deteguje aspoň 12 navzájom od seba odlišných molekúl nukleových kyselín.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že gény spôsobujúce rezistenciu na antibiotiká sú vybrané zo skupiny génov pre: beta-laktamázu blaZ, chloramfenikolacetyltransferázu, protein fosB, adenínmetylázu ermC, aacA-aphD aminoglykozidovú rezistenciu, 3 '5 '-aminoglykozid-fosfo-transferázu aphA-3, mecR, protein viažuci penicilín PBP2', aminoglykozid-3'-adenyltransferázu aadA, protein tetracyklínovej rezistencie tetC, DHFR DfrA a D-Ala:D-Ala ligázu vanB.
  5. 5. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 4,vyznačujúci sa tým, že hybridizácia sa uskutočňuje pri 30 - 80 °C, výhodne pri 40 - 70 °C a obzvlášť výhodne pri 55 - 65 °C.
  6. 6. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že hybridizácia sa uskutočňuje za vysoko striktných podmienok.
  7. 7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že multiplexová PCR sa uskutočňuje s primérmi, ktoré sú označené.
  8. 8. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že hybridizácia sa uskutočňuje po oddelení jednotlivých „+“ a vlákien.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že jednotlivé „+“ vlákna, ktoré majú identické sekvencie so sondami, sa po multiplexovej PCR oddelia.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že na elongáciu jednotlivých „+“ vlákien sú použité priméry, ktoré majú naviazanú výhodne na svojom 5konci látku, obzvlášť aspoň jednu molekulu biotínu, ktorá zabezpečí oddelenie jednotlivých „+“ vlákien.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že molekuly biotínu sú naviazané na priméry pre elongáciu jednotlivých „+“ vlákien, pričom sú jednotlivé „+“ vlákna po multiplexovej PCR oddelené prostredníctvom streptavidínu, naviazaného na guľôčky.
  12. 12. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 11,vyznačujúci sa tým, že hybridizácii predchádza čistenie.
  13. 13. Microarray na hybridizáciu multiplexových produktov PCR podľa jedného z nárokov 1 až 12, vyznač u j ú c i sa tým, že aspoň 6, výhodne aspoň 8, obzvlášť výhodne aspoň 12 sond špecificky hybridizuje so vždy navzájom od seba odlišnými detegovateľnými amplifikovanými sekvenciami molekúl nukleových kyselín obsiahnutých v génoch rezistentných proti antibiotikám, je naviazaných na jeho povrchu a má teploty topenia odlišujúce sa navzájom od seba maximálne o 2 °C, výhodne najviac o 1 °C.
  14. 14. Microarray podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že sondy sú naviazané na jeho povrchu v spotoch s priemerom od 100 do 500 pm, výhodne 200 až 300 pm a obzvlášť výhodne 240 pm.
  15. 15. Microarray podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že vzdialenosti medzi spotmi sú od 100 do 500 pm, výhodne 200 až 300 pm a obzvlášť výhodne 280 pm.
  16. 16. Microarray podľa jedného z nárokov 13 až 15, vyznačujúci sa tým, že je vyrobený zo skla, syntetického materiálu resp. z membrány.
  17. 17. Microarray podľa jedného z nárokov 13 až 16, vyznačujúci sa tým, že sondy sú kovalentne viazané na jeho povrchu.
  18. 18. Microarray podľa jedného z nárokov 13 až 17, vyznačujúci sa tým, že sondy majú hybridizačnú sekvenciu zahŕňajúcu 15 až 25 nukleotidov, výhodne 20 nukleotidov.
  19. 19. Microarray podľa jedného z nárokov 13 až 18, vyznačujúci sa tým, že sondy majú na svojom 5 'konci dT sekvenciu, cez ktorú sú na microarray viazané.
  20. 20. Microarray podľa nároku 19 alebo 20, vyznačujúci sa tým, že sondy majú hybridizačnú sekvenciu, ktorá bola vybratá zo skupiny: Nr. 25, Nr. 26, Nr. 27, Nr. 28, Nr. 29, Nr. 30, Nr. 31, Nr. 32, Nr. 33, Nr. 34, Nr. 35 a Nr. 36.
  21. 21. Set na hybridizáciu produktov multiplexovej PCR podľa spôsobu podľa nárokov 1 až 12, v y z n a čujúci sa tým, že obsahuje aspoň 6, výhodne aspoň 8 a obzvlášť výhodne aspoň 12 sond, ktoré hybridizujú vždy špecificky s navzájom odlišnými amplifikovanými sekvenciami molekúl nukleových kyselín určenými na detekciu a majú teploty topenia, ktoré sa navzájom od seba odlišujú maximálne o 2 °C, výhodne iba o 1 °C.
  22. 22. Set podľa nároku 21,vyznačujúci sa tým, že sondy majú hybridizačný úsek zahŕňajúci 15 až 25 nukleotidov, výhodne 20 nukleotidov.
  23. 23. Set podľa nároku 21 alebo 22, vyznačujúci sa tým, že sondy majú na svojom 5 'konci vždy sekvenciu dT.
  24. 24. Set podľa nároku 22 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že sondy majú vždy vo svojej hybridizačnej oblasti sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny: Nr. 25, Nr. 26, Nr. 27, Nr. 28, Nr. 29, Nr. 30, Nr. 31, Nr. 32, Nr. 33, Nr. 34, Nr. 35 a Nr. 36.
  25. 25. Kit na simultánnu detekciu aspoň dvoch navzájom odlišných molekúl nukleových kyselín v jednej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa
    - microarray podľa niektorého z nárokov 13 až 20,
    - aspoň jednu nádržku s primármi pre špecifickú amplifikáciu molekúl nukleových kyselín určených na detekciu a
    - prípadne set podľa niektorého z nárokov nároku 21 až 24.
  26. 26. Kit podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje aspoň jednu nádržku aspoň s jednou molekulou nukleovej kyseliny určenou na detekciu ako pozitívnu vzorku.
  27. 27. Kit podľa nároku 25 alebo 26, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ďalej nádržku so streptavidínom naviazaným na guľôčky.
SK1083-2003A 2001-03-02 2002-03-01 Spôsob stanovenia molekúl nukleových kyselín SK287793B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0033701A AT410444B (de) 2001-03-02 2001-03-02 Verfahren zur detektion von nukleinsäuremolekülen
PCT/AT2002/000060 WO2002070736A2 (de) 2001-03-02 2002-03-01 Verfahren zur detektion von nukleinsäuremolekülen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK10832003A3 SK10832003A3 (sk) 2004-05-04
SK287793B6 true SK287793B6 (sk) 2011-10-04

Family

ID=3672000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1083-2003A SK287793B6 (sk) 2001-03-02 2002-03-01 Spôsob stanovenia molekúl nukleových kyselín

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20050196756A1 (sk)
EP (1) EP1366195B1 (sk)
JP (2) JP2004520838A (sk)
KR (1) KR100892184B1 (sk)
AT (1) AT410444B (sk)
AU (1) AU2002238274B2 (sk)
CA (1) CA2439531A1 (sk)
CZ (1) CZ20032665A3 (sk)
DE (1) DE50204680D1 (sk)
DK (1) DK1366195T3 (sk)
ES (1) ES2252427T3 (sk)
HU (1) HUP0303377A3 (sk)
NO (1) NO20033884L (sk)
PL (1) PL365022A1 (sk)
SK (1) SK287793B6 (sk)
WO (1) WO2002070736A2 (sk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003144153A (ja) * 2001-11-09 2003-05-20 Gifu Univ 遺伝子検出方法、遺伝子検出用プライマー、ｄｎａマイクロアレイ及び遺伝子検出用キット
KR100619189B1 (ko) * 2004-10-08 2006-08-31 굿젠 주식회사 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법
EP1674583A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-28 Eppendorf Array Technologies SA Method and kit for the detection of a large number of genes related to antibiotic resistance in microorganisms
US20070059714A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-15 Birgit Strommenger Detection of presence and antibiotic susceptibility of enterococci
AT504194B1 (de) * 2006-09-07 2008-07-15 Oesterr Rotes Kreuz Bakteriennachweis
EP2270203A1 (en) 2009-06-29 2011-01-05 AIT Austrian Institute of Technology GmbH Oligonucleotide hybridization method
US9617589B2 (en) 2012-05-25 2017-04-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
RU2015122794A (ru) * 2012-11-15 2017-01-10 Молекуляр Детекшн Израиль Лтд. Реакционные смеси для пцр и способы применения
JP6949816B2 (ja) 2015-07-22 2021-10-13 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 空間的に分離してビーズを保持するビーズウェル形状及びシグナル検出セグメントを有する流体デバイス並びに関連する方法
CA3037217A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Analysis system and method for testing a sample
MX2019003926A (es) * 2016-10-07 2019-06-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Metodo y sistema de analisis para analizar una muestra.
JP2019537706A (ja) * 2016-10-07 2019-12-26 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ サンプルを検査するための方法及び分析システム

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8172787A (en) * 1986-10-30 1988-05-25 Synergen Biologicals, Inc. Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same
AU4216689A (en) * 1988-08-11 1990-03-05 California Biotechnology, Inc. Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5491225A (en) * 1991-12-19 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. PCR primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US6045996A (en) * 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6063566A (en) * 1994-05-13 2000-05-16 The Scripps Research Institute Catalytic RNA molecules
US6150093A (en) * 1994-08-18 2000-11-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated Kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US6001564A (en) * 1994-09-12 1999-12-14 Infectio Diagnostic, Inc. Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5702895A (en) * 1995-01-19 1997-12-30 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Method and kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US5994066A (en) * 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5627054A (en) * 1996-04-05 1997-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Competitor primer asymmetric polymerase chain reaction
GB9902970D0 (en) * 1999-02-11 1999-03-31 Zeneca Ltd Novel matrix
GB9904804D0 (en) * 1999-03-02 1999-04-28 King S College London Identification of bacteria
CN1117161C (zh) * 1999-09-24 2003-08-06 东南大学 高密度基因芯片的制作方法

Also Published As

Publication number Publication date
CZ20032665A3 (cs) 2005-02-16
ATA3372001A (de) 2002-09-15
WO2002070736A8 (de) 2003-01-23
KR100892184B1 (ko) 2009-04-07
HUP0303377A3 (en) 2005-12-28
EP1366195A2 (de) 2003-12-03
DK1366195T3 (da) 2006-03-13
US20050196756A1 (en) 2005-09-08
AT410444B (de) 2003-04-25
JP2011101652A (ja) 2011-05-26
KR20030092009A (ko) 2003-12-03
JP2004520838A (ja) 2004-07-15
HUP0303377A2 (hu) 2004-01-28
WO2002070736A3 (de) 2003-09-12
SK10832003A3 (sk) 2004-05-04
EP1366195B1 (de) 2005-10-26
US20100317535A1 (en) 2010-12-16
PL365022A1 (en) 2004-12-27
ES2252427T3 (es) 2006-05-16
DE50204680D1 (de) 2005-12-01
WO2002070736A2 (de) 2002-09-12
NO20033884L (no) 2003-10-28
AU2002238274B2 (en) 2007-06-28
CA2439531A1 (en) 2002-09-12
NO20033884D0 (no) 2003-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100317535A1 (en) Methods and Compositions For Detecting Nucleic Acid Molecules
JP4860869B2 (ja) 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
CA2840558C (en) Methods of detecting gene fusions using first and second nucleic acid probes
EP2476760A1 (en) Method for analyzing nucleic acid mutation using array comparative genomic hybridization technique
KR20070011354A (ko) 취약 ｘ염색체 증후군과 같은 ｓｔｒｐ의 검출 방법
EP1096024A1 (en) Method and kit for the screening and/or the quantification of multiple homologous nucleic acid sequences on arrays
EP1612282B1 (en) Probe set and substrate for detecting nucleic acid
EP1169474A1 (en) Olignucleotide array and methods of use
US9175339B2 (en) Method for detection of target nucleic acid
CN110719957A (zh) 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒
US6692915B1 (en) Sequencing a polynucleotide on a generic chip
CA2318371A1 (en) Method for the detection of nucleic acid sequences
US20090275028A1 (en) Method of detecting target nucleic acid
WO2016038351A1 (en) Methods of detection of multidrug resistant bacteria
JP2006042641A (ja) ゲノムｄｎａのメチル化検出方法
US20120196765A1 (en) Method for detection or analysis of target sequence in genomic dna
TW202204635A (zh) 銀色葡萄球菌之檢測用之引子組及探針
US20040235021A1 (en) Authentication of biologic materials using DNA-DNA hybridization on a solid support
EP1136566A1 (en) Method and kit for detection and/or quantification of homologus nucleotide sequences on arrays
JP2001299354A (ja) マイコバクテリウム属細菌検出用核酸
JP5378724B2 (ja) 発現ｍＲＮＡ識別方法
EP2126138A1 (en) Dna chip for detection of staphylococcus aureus
EP1113080A2 (en) Personal gene library
JP2004201635A (ja) ｎｅｓｔｅｄＰＣＲで複数種の微生物に対する増幅を共通条件で同時に行う方法
JP2002034599A (ja) １塩基多型を検出する方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20120301