ES2252427T3 - Procedimiento para la deteccion de moleculas de acido nucleico. - Google Patents

Procedimiento para la deteccion de moleculas de acido nucleico.

Info

Publication number
ES2252427T3
ES2252427T3 ES02704467T ES02704467T ES2252427T3 ES 2252427 T3 ES2252427 T3 ES 2252427T3 ES 02704467 T ES02704467 T ES 02704467T ES 02704467 T ES02704467 T ES 02704467T ES 2252427 T3 ES2252427 T3 ES 2252427T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
probes
hybridization
microarray
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02704467T
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Schmidt
Axel Mundlein
Martin Huber
Hans Kroath
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AIT Austrian Institute of Technology GmbH
Original Assignee
Austrian Research Centers GmbH ARC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Austrian Research Centers GmbH ARC filed Critical Austrian Research Centers GmbH ARC
Application granted granted Critical
Publication of ES2252427T3 publication Critical patent/ES2252427T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

Procedimiento para la detección simultánea de al menos seis moléculas de ácido nucleico distintas entre sí que están contenidas en genes de resistencia a antibióticos en una muestra, en el que en una primera etapa se lleva a cabo una PCR múltiplex y en una segunda etapa una reacción de hibridación de sondas inmovilizadas sobre una micromatriz con las secuencias amplificadas, tras de lo cual se detectan los productos de PCR hibridados y eventualmente se cuantifican, en el que las sondas utilizadas para la reacción de hibridación que hibridan específicamente con las secuencias amplificadas distintas entre sí de las moléculas de ácido nucleico respectivas, presentan temperaturas de fusión que difieren entre sí como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC.

Description

Procedimiento para la detección de moléculas de ácido nucleico.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección simultánea de al menos dos moléculas de ácido nucleico distintas entre sí en una muestra, en el que en una primera etapa se lleva a cabo una PCR múltiplex y en una segunda etapa una reacción de hibridación con sondas inmovilizadas sobre una micromatriz, tras de lo cual se detectan los productos de PCR hibridados y eventualmente se cuantifican, así como a una micromatriz y a un conjunto para la hibridación de productos de PCR múltiplex y a un kit para la detección simultánea de al menos dos moléculas de ácido nucleico distintas entre sí en una muestra.
La detección de moléculas de ácido nucleico en una muestra se lleva a cabo en los ámbitos más distintos, por ejemplo, en medicina, en control de calidad, investigación, etc. A este respecto, a menudo es necesario detectar en una muestra al menos dos moléculas de ácido nucleico diferentes entre sí, a menudo 20, 50, 100 ó más. A este respecto, es deseable por razones de tiempo y costes detectar simultáneamente las moléculas de ácido nucleico distintas en una muestra. Una serie de documentos se refieren a la detección de moléculas de ácido nucleico y a distintos procedimientos publicados para la realización de la detección:
En el documento US 5.994.066, se describe un procedimiento para la detección de bacterias o bien resistencias a antibióticos en muestras biológicas. Según un primer procedimiento, se lleva a cabo una PCR múltiplex para la detección simultánea de varias resistencias a antibióticos. Como ejemplos para la detección de los productos amplificados se citan electroforesis en gel de agarosa, polarización de fluorescencia y detección mediante marcaje fluorescente. Como un segundo procedimiento adicional de detección de las secuencias buscadas en muestras, se describe un procedimiento de hibridación en el que la hibridación se lleva a cabo a 65ºC y la hibridación de una muestra con el ADN diana específico muestra una alta medida de igualdad entre ambas secuencias nucleotídicas.
En el documento US 6045996, se describe un procedimiento para la hibridación de una secuencia nucleotídica sobre una micromatriz. Como temperatura de hibridación, se dan temperaturas entre 20 y 75ºC. Como ejemplos de nucleótidos diana, se citan productos de amplificación de una PCR múltiplex.
Según el documento US 5614388, se amplifican mediante PCR secuencias nucleotídicas específicas, tras de lo cual se detectan los productos de amplificación mediante hibridación. Como forma de realización preferida, se lleva a cabo una PCR múltiplex. La detección puede realizarse específicamente a este respecto mediante el ajuste de condiciones más rigurosas. Como condiciones de hibridación más rigurosas se dan temperaturas que permiten una hibridación específica. Como ejemplo de una temperatura de hibridación, se dan 50 a 55ºC.
El documento US 5846783 se refiere a un procedimiento para la detección de secuencias nucleotídicas, en el que se lleva a cabo una detección mediante hibridación después de una PCR múltiplex. Por ejemplo, la hibridación se lleva a cabo a una temperatura de 55ºC.
El documento WO 98/48041 A2 se refiere a un procedimiento para la identificación de cepas bacterianas resistentes a antibióticos, en el que los genes se amplifican mediante PCR y se detectan con sondas de hibridación. A este respecto, la hibridación debe llevarse a cabo en condiciones rigurosas, aproximadamente 20ºC por debajo del punto de fusión del ADN de hibridación. Los oligonucleótidos se seleccionan preferiblemente de modo que tengan temperaturas de fusión similares, y por tanto puedan ensayarse varios genes en la misma preparación de hibridación con las mismas condiciones. Como ejemplo, se describe además la hibridación sobre una micromatriz de oligonucleótidos. Como temperatura de hibridación, se da una temperatura de 45 a 60ºC.
Estos procedimientos anteriormente citados presentan sin embargo todas las desventajas de que están limitados respecto a la especificidad y al número máximo de moléculas de ácido nucleico detectables simultáneamente. En algunos de dichos procedimientos, se lleva a cabo en una primera etapa una PCR múltiplex, mediante la que se garantiza la amplificación simultánea de varias secuencias nucleotídicas. La posterior detección de las distintas secuencias nucleotídicas es sin embargo problemática, ya que según este procedimiento no es posible detectar específicamente un número grande de secuencias nucleotídicas simultáneamente. En caso de llevarse a cabo una reacción de hibridación después de la reacción PCR, deben ajustarse para cada secuencia nucleotídica condiciones de hibridación rigurosas específicas, en las que para secuencias más cortas se ajusta una temperatura menor que para secuencias más largas, véase por ejemplo el documento US 6045996, mediante las que, sin embargo, se reduce el número posible de secuencias nucleotídicas detectables simultáneamente. En el documento WO 98/48041 A2 se propone, por ejemplo, seleccionar oligonucleótidos que tengan temperaturas de fusión similares, de modo que puedan ensayarse varios genes en la misma preparación de hibridación, en la que sin embargo se ensayan como máximo ocho oligonucleótidos sobre una
matriz.
Estos procedimientos no son por tanto adecuados para la realización de procedimientos de detección de varias o muchas moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, para la detección de resistencias a antibióticos. Para dichos procedimientos de detección no es suficiente un procedimiento que esté limitado a una detección simultánea de solamente unos pocos oligonucleótidos y en la práctica, especialmente para ensayos de grupos, consume demasiado esfuerzo y tiempo.
En el documento WO 00/47767 A, el documento CN 1252452 A y el documento WO 00/52203, se describen micromatrices sobre las que se inmovilizan oligonucleótidos que presentan temperaturas de fusión esencialmente iguales o muy similares. En el documento WO 00/52203, se identifican distintas bacterias en una muestra mediante amplificación de un intervalo determinado del ADNr de 23S, y el producto amplificado se determina mediante hibridación con sondas oligonucleotídicas, que pueden estar localizadas por ejemplo sobre un chip.
Elnifro et al., (Elnifro et al., Clinical Microbiology Reviews 13(4): 559-570 (2000)) proporciona una revisión de las posibilidades de aplicación de distintas formas especiales optimizadas para diversas configuraciones de PCR múltiplex.
Es por consiguiente cometido de la presente invención poner a disposición un procedimiento en el que pueda detectarse simultáneamente un gran número de moléculas de ácido nucleico, de modo que sea realizable un análisis de determinados oligonucleótidos o genes en una muestra rápida, económicamente y con bajo gasto de trabajo.
El procedimiento anteriormente citado para la detección de al menos seis moléculas de ácido nucleico distintas entre sí que están contenidas en genes de resistencia a antibióticos, la presente invención, está caracterizado porque las sondas utilizadas para la reacción de hibridación, que hibridan específicamente con las secuencias amplificadas de moléculas de ácido nucleico distintas entre sí respectivas, presentan temperaturas de fusión (Tm) que difieren entre sí como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC. Por ser las temperaturas de fusión de las sondas utilizadas para la reacción de hibridación distintas entre sí como máximo 2ºC, o preferiblemente como máximo 1ºC, es posible por primera vez detectar simultáneamente un gran número de moléculas de ácido nucleico en una muestra, ya que para la reacción de hibridación de todas las sondas se ajustan las mismas condiciones respecto a temperatura, pero también a concentración salina, valor de pH, etc. La temperatura de fusión Tm se define como aquella temperatura a la que (dentro de los parámetros dados como, por ejemplo, concentración salina), la mitad de todas las moléculas se encuentran en estado helicoidal.
Es posible preparar para casi todas las moléculas de ácido nucleico secuencias con una temperatura de fusión determinada:
Una posibilidad de calcular la temperatura de fusión de una secuencia es mediante el software comercial "Gene Runner 3.0" (©1994, Hastings Software, Inc.). El software permite la determinación de la Tm mediante distintos procedimientos/algoritmos. Los datos en la presente solicitud de patente son valores del denominado procedimiento de "temperatura de fusión termodinámica del vecino más cercano" según Breslauer et al. (Proc. Natl. Acad. Sciences 83: 3746-3750, "Predicting DNA duplex stability from the base sequence"). Los parámetros para el cálculo pueden ser, por ejemplo, 660 mM para la concentración salina y 7,5 pM para la concentración de muestra. Para el análisis de la Tm de varias sondas para un experimento de hibridación simultánea, no son decisivos los valores absolutos (que pueden ser mayores o menores dependiendo de la concentración de sal y ADN), sino de los procedimientos seleccionados (es decir, para sondas entre 15 y 30 bases de longitud, la "termodinámica") y de los valores de Tm de las sondas individuales en relación entre sí. De este modo, puede calcularse para las moléculas de ácido nucleico o genes para ensayar la secuencia para hibridar "secuencia de hibridación" y seleccionarse de modo que puedan prepararse sondas específicas para ella.
En el marco de la presente invención, se entienden por moléculas de ácido nucleico fragmentos de secuencia que sean por ejemplo determinados genes, partes de un gen o genoma, un ARNm o partes de un ARNm, etc.
Por el término "PCR múltiplex" se entiende en el marco de la presente invención una PCR en la que se amplifican simultáneamente al menos dos moléculas de ácido nucleico distintas entre sí, es decir, que se amplifican simultáneamente secuencias de distinto tipo en una reacción con ayuda de distintos cebadores.
Por "micromatriz" se entiende un vehículo sobre el que se inmoviliza con alta densidad un gran número de sondas, de modo que puedan hibridarse simultáneamente en las mismas condiciones un gran número de moléculas de ácido nucleico. Las micromatrices se usan convencionalmente para la detección de moléculas de ADN, pero se utilizan también micromatrices para el análisis de péptidos. Con ayuda de la micromatriz, se facilita esencialmente el diagnóstico de ADN in vitro, de modo que pueden llevarse a cabo análisis complejos muy rápidamente un una sola etapa de trabajo, ya que pueden inmovilizarse varios miles de oligonucleótidos específicamente formados sobre la relativamente pequeña micromatriz. La hibridación sobre una micromatriz garantiza, por ejemplo, el análisis simultáneo de muchos miles de genes. Se utiliza ya una serie de distintas micromatrices para la detección de secuencias nucleotídicas, en la que pueden seleccionarse los distintos parámetros por el experto en un amplio intervalo (véase, por ejemplo, Lockhart et al., Nature Biotechnology vol. 14, diciembre 1996, páginas 1675-1679).
En el marco de la presente invención, pueden adaptarse y alterarse por supuesto, por ejemplo, el material, el tamaño, la construcción, etc. de la micromatriz a las sondas para inmovilizar respecto al número, longitud y secuencia.
Es posible detectar por un lado solamente las moléculas de ácido nucleico, es decir, analizar si están presentes en una muestra, proporcionando este análisis un resultado SÍ/NO. Pero también es posible según la invención cuantificar la cantidad de molécula de ácido nucleico en la muestra, pudiendo llevarse a cabo esto con alta especificidad a causa del uso de la micromatriz. A este respecto, puede utilizarse cualquier procedimiento de detección conocido por el experto, por ejemplo pueden utilizarse procedimientos químicos, enzimáticos, fisicoquímicos o de unión antígeno-anticuerpo. A este respecto, pueden marcarse los ácidos nucleicos para detectar, por ejemplo, con una molécula radiactiva, fluorescente o quimioluminiscente. Estos procedimientos de detección son muy bien conocidos por el experto, así que no se entra aquí en detalles sobre ellos, dependiendo la selección del procedimiento respectivo de las moléculas de ácido nucleico para detectar y de si el producto debe detectarse solamente o cuantificarse.
La preparación de las sondas se realiza según un procedimiento en sí conocido.
Cuanto menos difieran las temperaturas de fusión de las sondas entre sí, pueden detectarse moléculas de ácido nucleico más específicas, ya que pueden ajustarse de esta manera las condiciones de hibridación para garantizar solamente una hibridación muy específica, pero no una hibridación de secuencias no completamente complementarias, con lo que se reduce el riesgo de resultados falsos positivos, pero también de falsos negativos, o se elimina totalmente.
Los cebadores y las sondas pueden seleccionarse a este respecto de modo que se amplifiquen las moléculas de ácido nucleico que presenten una secuencia más larga que la secuencia de hibridación, es decir, aquella secuencia que hibride con las sondas. Sin embargo, puede amplificarse también solamente la secuencia de hibridación, es decir, que la molécula de ácido nucleico compuesta sólo por la secuencia hibride con la de las sondas correspondientes.
Preferiblemente, se detectan simultáneamente según la invención al menos 6, preferiblemente al menos 8, de forma especialmente preferida al menos 12 moléculas de ácido nucleico distintas entre sí en una muestra. El número de moléculas de ácido nucleico distintas entre sí que se detectan en la muestra depende respectivamente del caso específico, en el que anteriormente no se ponen expresamente límites.
De forma especialmente preferida, se detectan moléculas de ácido nucleico que están contenidas en genes de resistencia a antibióticos. Es conocido un gran número de genes de resistencia a antibióticos, en los que los procedimientos de detección se llevan a cabo generalmente mediante ensayos de crecimiento microbiológico largos y propensos a errores sobre medios nutritivos que contienen antibióticos y la posterior determinación de los gérmenes capaces de sobrevivir. Aunque se han descrito ya procedimientos para la identificación de resistencias a antibióticos con ayuda de amplificaciones génicas y posterior hibridación (véase el documento WO 98/48041 A2), no ha sido posible ensayar simultáneamente una muestra de varios genes de resistencia a antibióticos sin reducir la especificidad. Con el procedimiento según la invención, es ahora posible detectar un número ilimitado de genes de resistencia a antibióticos en una muestra, lo que es especialmente importante en el campo hospitalario, ya que aquí aparece una acumulación de cepas bacterianas resistentes a antibióticos. Todos los procedimientos de aislamiento de ADN estándar son funcionales. En cualquier caso, debe asegurarse que las moléculas pequeñas (como por ejemplo plásmidos) se copurifican, para no perder resistencias codificadas episomialmente.
Como moléculas de ácido nucleico, se seleccionan a este respecto partes de secuencia de los genes de resistencia a antibióticos que sean específicas del gen respectivo y no aparezcan en otros genes. De este modo, pueden evitarse los resultados falsos positivos aún mejor.
A este respecto, los genes de resistencia a antibióticos se seleccionan preferiblemente del grupo compuesto por los genes de beta-lactamasa blaZ, cloranfenicol acetiltransferasa, la proteína fosB, la adenina metilasa ermC, resistencia a aminoglicósido aacA-aphD, 3',5'-aminoglicósido fosfotransferasa aphA-3, mecR, la proteína de unión a penicilina PBP2', la aminoglicósido-3'-adeniltransferasa aadA, la proteína de resistencia a tetraciclina tetC, DHFR DfrA y la ligasa D-Ala:D-Ala vanB. Estas son resistencias a antibióticos de aparición frecuente que causan grandes dificultades médicas, y es por tanto especialmente importante poner a disposición un procedimiento de ensayo rápido y de alta especificidad para estas resistencias a antibióticos. A este respecto, es especialmente conveniente cuando todas estas resistencias a antibióticos citadas se ensayan simultáneamente en una muestra, es decir, que las moléculas de ácido nucleico que son respectivamente específicas de cada uno de estos genes de resistencia a antibióticos se amplifican simultáneamente en una PCR múltiplex y a continuación hibridan en una micromatriz con sondas, en la que al menos respectivamente una sonda es específica de una molécula de ácido nucleico y por tanto de un gen de resistencia a antibióticos.
A este respecto, es especialmente conveniente cuando la reacción de hibridación se lleva a cabo a 30-80ºC, preferiblemente a 40-70ºC, de forma especialmente preferida a 55-65ºC. La temperatura de hibridación para ajustar depende de la temperatura de fusión de las sondas y puede calcularse y ajustarse para cada reacción de hibridación según la invención, siendo especialmente importante que la temperatura se mantenga constante durante la reacción de hibridación. Se ha mostrado que es especialmente conveniente para el presente procedimiento ajustar las temperaturas a entre 55 y 65ºC, ya que en este intervalo de temperatura las sondas presentan temperaturas de fusión que son especialmente bien adecuadas para el presente procedimiento, especialmente respecto a especificidad y longitud.
Para una detección especialmente exacta, es ventajoso cuando la reacción de hibridación se lleva a cabo en condiciones de alto rigor. Esto significa que se ajustan condiciones de hibridación que garantizan una hibridación de secuencias de alta complementariedad, pero no de secuencias que se diferencian en unos pocos nucleótidos. A este respecto, es especialmente ventajoso cuando se seleccionan condiciones de hibridación en las que se unen entre sí sólo secuencias completamente complementarias, pero no secuencias que se diferencien entre sí solamente en algunos nucleótidos. De este modo, se pone a disposición un procedimiento que garantiza una detección de alta especificidad de moléculas de ácido nucleico en una muestra y que no conduce a falsos resultados positivos. Las condiciones de alto rigor se ajustan mediante la selección de la temperatura y la fuerza iónica en la mezcla de reacción. Por ejemplo, la temperatura de hibridación se ajusta a 5 a 10ºC por debajo de la temperatura de fusión de las sondas; o los tampones se seleccionan según la fuerza iónica o el valor de pH deseados dependiendo de la temperatura de hibridación.
Preferiblemente, se lleva a cabo la PCR múltiplex con cebadores que están marcados. De esta manera, se garantiza que los productos de PCR amplificados presenten un marcaje que pueda detectarse después de la reacción de hibridación. El marcaje puede estar contenido a este respecto, como ya se ha descrito, en una molécula, y ser una señal química, fisicoquímica o enzimática detectable que puede determinarse y cuantificarse, por ejemplo, mediante una reacción de coloración mediante la medida de la fluorescencia, luminiscencia, radiactividad, etc.
Para un procedimiento especialmente específico, es conveniente a este respecto que la reacción de hibridación se lleve a cabo después de la separación de las cadenas "+" y "-". De esta manera, se impide que las cadenas que presenten una secuencia idéntica a una de las sondas se unan de modo competitivo con esta sonda en las moléculas monocatenarias a detectar, lo que conduciría especialmente en una detección cuantitativa a resultados falseados. Mediante la separación de las cadenas individuales "+" y "-", están presentes solamente las cadenas individuales complementarias de las sondas en la mezcla de hibridación.
A este respecto, es especialmente ventajoso que las cadenas individuales "+" que presentan secuencias idénticas a las sondas se separen mediante PCR múltiplex. De esta manera, quedan las cadenas individuales "-" que presentan secuencias complementarias con las sondas en la mezcla de hibridación, de modo que puede llevarse a cabo justo a continuación la reacción de hibridación.
Un procedimiento de separación especialmente ventajoso se caracteriza porque se utilizan cebadores para la elongación de las cadenas individuales "+" que están acoplados, preferiblemente en su terminación 5', respectivamente a una sustancia, especialmente al menos una molécula de biotina, que garantiza la separación de las cadenas individuales "+". De esta manera, pueden alterarse ya en la etapa de amplificación de la PCR las cadenas individuales "+", de modo que se garantice específicamente su separación completa sin tener que incorporar etapas intermedias adicionales en el procedimiento. Así, se elimina el peligro de que se separen también las cadenas individuales "-". La biotina es especialmente adecuada a este respecto, ya que puede acoplarse fácilmente a una secuencia de ADN y puede separarse específicamente.
Para ello, es especialmente conveniente que las moléculas de biotina se acoplen a los cebadores para la elongación de las cadenas individuales "+", separándose después de la PCR múltiplex las cadenas individuales "+" mediante estreptavidina unida a bolitas. Mediante las bolitas, se consigue introducir una gran superficie de estreptavidina en la muestra, con lo que las moléculas de biotina se unen completamente a la estreptavidina. Además, mediante el uso de las bolitas se garantiza que el compuesto estreptavidina-biotina se separe de nuevo de la muestra. Las bolitas así usadas son en sí conocidas y pueden prepararse, por ejemplo, a partir de vidrio o con un núcleo magnético.
Preferiblemente, se agrega después de la etapa de hibridación una etapa de purificación. De esta manera, pueden separarse de la mezcla de hibridación sustancias que posiblemente pudieran estorbar en la hibridación, realizándose la etapa de purificación eventualmente durante o después de la separación de las cadenas individuales "+". La purificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante precipitación del ADN y resuspensión del ADN en un tampón.
Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una micromatriz para la hibridación de productos de PCR múltiplex según uno de los procedimientos según la invención descritos anteriormente, en la que están unidas a su superficie 6, preferiblemente al menos 8, de forma especialmente preferida al menos 12 sondas, que respectivamente hibridan específicamente con las secuencias amplificadas a detectar, distintas entre sí, de moléculas de ácido nucleico que están contenidas en genes de resistencia a antibióticos, y presentan temperaturas de fusión que difieren como máximo entre sí 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC. Con respecto a la micromatriz y las sondas, son válidas de nuevo las definiciones ya dadas anteriormente para el procedimiento. A este respecto, el número de sondas unidas a la micromatriz depende de nuevo del número de moléculas de ácido nucleico a detectar, pudiendo estar unidas a la micromatriz por supuesto también como ensayo negativo sondas adicionales que no hibridan con las moléculas de ácido nucleico a detectar. Es importante, como ya se ha descrito anteriormente, que las temperaturas de fusión de las sondas difieran solamente entre sí como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC, con lo que se garantiza que puedan ajustarse condiciones para la reacción de hibridación en las que todas las moléculas de ácido nucleico que presenten
una secuencia que sea complementaria con la de las sondas hibriden tanto específica como fuertemente con las sondas.
Preferiblemente, las sondas están unidas en depósitos con un diámetro de 100 a 500 \mum, preferiblemente 200 a 300 \mum, de forma especialmente preferida 240 \mum a la superficie de la micromatriz. Se ha mostrado que los depósitos con este diámetro son especialmente bien adecuados para el procedimiento según la invención descrito anteriormente, proporcionando una detección posterior a la acción de hibridación de resultados especialmente claros e inequívocos. A este respecto, un depósito representa respectivamente un tipo de sondas, es decir, sondas con la misma secuencia. Por supuesto, también es posible proporcionar varios depósitos con el mismo tipo de sonda sobre la micromatriz como ensayos paralelos.
Además, es ventajoso cuando los depósitos presentan una distancia entre sí de 100 a 500 \mum, preferiblemente de 200 a 300 \mum, de forma especialmente preferida 280 \mum. De este modo, se garantiza que se proporciona el número máximo de depósitos sobre la micromatriz, pudiendo diferenciarse claramente sin embargo simultáneamente en el procedimiento de detección entre los distintos depósitos y por tanto sondas y las moléculas de ácido nucleico para detectar unidas.
Preferiblemente, la micromatriz está preparada con vidrio, un material sintético o una membrana. Estos materiales se han mostrado especialmente adecuados para micromatrices.
Es especialmente conveniente que las sondas estén unidas covalentemente a la superficie de la micromatriz. De este modo, se garantiza una unión fuerte de las sondas a la micromatriz sin llegar en el transcurso de las etapas de hibridación y lavado a una rotura de la unión sondas-micromatriz, y así a un resultado falseado. En caso de que la micromatriz esté preparada, por ejemplo, a partir de vidrio recubierto, los grupos amino primarios pueden reaccionar con los grupos aldehído libres de la superficie de vidrio formando una base de Schiff.
Se ha mostrado conveniente que las sondas presenten una secuencia de hibridación que comprenda 15 a 25, preferiblemente 20 nucleótidos. Por secuencia de hibridación se entiende la secuencia como ya se ha descrito anteriormente, que hibrida con la de las moléculas de ácido nucleico para detectar. Por supuesto, pueden construirse sondas más largas que la secuencia de hibridación, en las que sin embargo el aumento de longitud adicional de la sonda podría realizar una unión indeseada con otras moléculas de ácido nucleico, lo que falsearía los resultados. Por tanto, es ventajoso cuando las sondas, además de las partes que son necesarias para la unión a la superficie de la micromatriz, están compuestas solamente por la secuencia de hibridación. La longitud de 15 a 25, preferiblemente 20 nucleótidos, se ha mostrado a este respecto conveniente, ya que en este intervalo de longitud es posible encontrar secuencias de hibridación con el procedimiento anteriormente descrito que presentan la temperatura de fusión necesaria. Esta longitud es suficiente para posibilitar una unión específica y para eliminar el peligro de que también otras moléculas de ADN presenten por casualidad la misma secuencia que las moléculas de ácido nucleico para detectar.
Preferiblemente, las sondas presentan en su terminación 5' respectivamente una secuencia dT10, por la que pueden unirse a la micromatriz. De esta manera, la distancia entre la micromatriz y la secuencia de hibridación es suficiente para que ésta sea accesible para las moléculas de ácido nucleico sin impedimentos. El número de Tm asciende, por ejemplo, de 5 a 50, preferiblemente a 10.
Para la detección simultánea de genes de resistencia a antibióticos es conveniente que las sondas presenten como secuencia de hibridación una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las nº 25, nº 26, nº 27, nº 28, nº 29, nº 30, nº 31, nº 32, nº 33, nº 34, nº 35 y nº 36. Estas secuencias se hallan en genes de resistencia a antibióticos que aparecen con especial frecuencia en cepas bacterianas y son importantes médicamente. Estos son los genes de resistencia a antibióticos de beta-lactamasa blaZ, cloranfenicol acetiltransferasa, la proteína fosB, la adeninmetilasa ermC, resistencia a aminoglicósido aacA-aphD, 3',5'-aminoglicósidofosfotransferasa aphA-3, mecR, la proteína de unión a penicilina PBP2', la aminoglicósido-3'-adeniltransferasa aadA, la proteína de resistencia a tetraciclina tetC, DHFR DfrA y la liga-
sa D-Ala:D-Ala vanB, y presentan temperaturas de fusión que difieren entre sí como máximo aproximadamente 1ºC.
Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un conjunto para la hibridación de productos de PCR múltiplex según uno de los procedimientos según la invención descritos anteriormente, que comprende al menos 6, preferiblemente al menos 8, de forma especialmente preferida al menos 12 sondas, que respectivamente hibridan específicamente con las secuencias amplificadas a detectar, distintas entre sí, de moléculas de ácido nucleico, y presentan temperaturas de fusión que difieren entre sí (o sea de los otros pares moléculas de sonda/ácido nucleico para detectar en el conjunto respectivamente) como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC. Las sondas pueden disolverse a este respecto en un tampón. Además, el conjunto puede presentar varios recipientes, en los que se proporcionan sondas con igual secuencia por cada recipiente. De esta manera, es posible aplicar sondas con la misma secuencia sobre la micromatriz por cada depósito. Por supuesto, es también posible sin embargo proporcionar en un recipiente sondas con dos o más secuencias distintas entre sí.
Preferiblemente, las sondas presenten una zona de hibridación que comprende 15 a 25, preferiblemente 20 nucleótidos.
Además, es conveniente que las sondas presenten en su terminación 5' respectivamente una secuencia dT, en la que el número de Tm asciende preferiblemente a entre 5 y 15, por ejemplo 10.
Es especialmente ventajoso que las sondas presenten respectivamente en su zona de hibridación una secuencia seleccionada del grupo compuesto por las nº 25, nº 26, nº 27, nº 28, nº 29, nº 30, nº 31, nº 32, nº 33, nº 34, nº 35 y nº 36.
Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un kit para la detección simultánea de al menos dos moléculas de ácido nucleico distintas entre sí en una muestra, que comprende
-
una micromatriz según la invención como se describe anteriormente,
-
al menos un recipiente con cebadores para la amplificación específica de las moléculas de ácido nucleico a detectar, y
-
eventualmente un conjunto según la invención como se describe anteriormente.
A este respecto, un recipiente puede comprender cebadores con la misma secuencia, pero también un par de cebadores para amplificación de una molécula de ácido nucleico o por último también varios pares de cebadores para la amplificación de varias moléculas de ácido nucleico distintas entre sí, en el que el cebador debe estar presente sin embargo a una concentración determinada. Por supuesto, el kit puede presentar además instrucciones de uso con un protocolo para la realización del procedimiento según la invención descrito anteriormente, así como los eventuales tampones, sales, soluciones adicionales, etc. que sean necesarios para la reacción de amplificación, la reacción de hibridación o la detección.
La micromatriz puede presentar a este respecto sondas ya inmovilizadas. El conjunto que comprende las sondas puede presentarse a este respecto separadamente de la micromatriz (en el caso de que la micromatriz esté vacía, es decir, que no presente sondas unidas), pero puede ser también un componente integrado de la micromatriz.
Preferiblemente, el kit comprende además al menos un recipiente con al menos una molécula de ácido nucleico para detectar como muestra positiva. También aquí puede presentar de nuevo un recipiente moléculas de ácido nucleico con la misma secuencia, siendo posible que en el kit se proporcionen varios recipientes, pero siendo también posible proporcionar en un recipiente moléculas de ácido nucleico con varias secuencias distintas entre sí. En caso de que el kit se proporcione, por ejemplo, para la detección de genes de resistencia a antibióticos, el kit puede proporcionar como muestra positiva moléculas de ácido nucleico con las secuencias de secuencia de hibridación SEC Nº ID 25 a SEC Nº ID 36.
Es especialmente conveniente si el kit comprende además un recipiente con estreptavidina unida a bolitas. Esto posibilita una separación de las cadenas individuales amplificadas "+" y "-"; por ejemplo, en el caso que la cadena individual "+" o "-" esté acoplada a biotina, utilizando un cebador acoplado a biotina.
La invención se ilustra con detalle a continuación mediante el ejemplo citado, así como las figuras, a los que sin embargo no debe limitarse. Se muestra: la Fig. 1 la separación de los productos de PCR de las 12 dianas ABR mediante electroforesis en gel; la Fig. 2 la disposición de micromatriz del chip ABR; la Fig. 3 el esquema del desarrollo del ensayo; la Fig. 4 una representación de la hibridación de control sobre el chip ABR; y la Fig. 5 el resultado de la detección del chip ABR después de amplificación múltiplex.
Ejemplo 1. Síntesis génica de "dianas ABR" de referencia
Se preparó una serie de secuencias de resistencia a antibióticos (ABR) mediante síntesis génica in vitro, ya que las "cepas tipo" no estaban disponibles o bien no era posible trabajar con los organismos tenidos en cuenta por razones de seguridad ("nivel de bioseguridad" 2 o superior). En la tabla 1, están resumidas todas las "dianas" y se les proporciona un número (nº), en la que las resistencias "control" derivan de vectores y sirven en primer lugar para la validación del chip. Para estas dianas, están presentes sondas sobre el prototipo de chip ABR.
TABLA 1
Nº Resistencia a antibióticos Especie "Diana" (gen de resistencia)
8 Ampicilina (control) S. aureus, E. faecalis Beta-lactamasa blaZ
9 Cloranfenicol (control) Bacillus sp., Cloranfenicol acetiltransferasa
Corynebacterium sp.
11 Fosforomicina S. epidermidis, Staphylococcus sp. Proteína fosB
7 Eritromicina Staphylococcus sp. Adeninmetilasa ermC
12 Gentamicina S. aureus Gen de resistencia a
aminoglicósido aacA-aphD
2 Kanamicina S. aureus, S. faecalis, 3',5'-aminoglicósido
E. faecalis fosfotransferasa aphA-3
3 Meticilina S. aureus mecR
1 Penicilina S. aureus Proteína de unión a
penicilina PBP2'
5 Estreptomicina, Salmonella Aminoglicósido-3-
espectinomicina adeniltransferasa aadA
10 Tetraciclina (control) Salmonella spp. Proteína de resistencia a
tetraciclina tetC
4 Trimetoprima S. aureus DHFR DfrA
6 Vancomicina de tipo Enterococcus, Ligasa D-Ala:D-Ala van B
VanB Streptococcus
La Tabla 2 indica las secuencias del cebador de PCR y la longitud de los productos de PCR que se han desarrollado para el prototipo, en la Fig. 1 se observan los 12 productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa.
TABLA 2
Nº Nombre Cebador de PCR (SEC Nº ID) Producto PCR
1 PBP2 1+2 423 pb
2 KanR 3+4 532 pb
3 MecR 5+6 517 pb
4 DhfrA 7+8 279 pb
5 StrR 9+10 549 pb
6 VanB 11+12 498 pb
7 MlsR 13+14 564 pb
8 AmpR 15+16 219 pb
9 CmR 17+18 247 pb
10 TetR 19+20 245 pb
11 FosB 21+22 304 pb
12 AacA 23+24 497 pb
2. Diseño de micromatriz
Se analizaron para cada molécula de ácido nucleico puesta a disposición (PCR) sondas de ADN de alta especificidad de los genes de resistencia a antibióticos (ABR) tenidos en cuenta mediante procedimientos bioinformáticos estándar. En general, se usó el software "Gene Runner 3.0" (© 1994, Hastings Software, Inc.), para la selección de cebadores para PCR e hibridación se usó "Primer 3", Steve Rozen & Helen J. Skaletsky (1998) Primer 3, para la búsqueda de homología y las comprobaciones cruzadas de bancos de datos: "Fasta3", W.R. Pearson y D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, W.R. Pearson (1990), "Rapid and Sensitive Sequencie Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183, 63-98, para alineamientos: "ClustalX 1.8", Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. y Higgins, D.G. (1997) y la interfaz de Windows ClustalX: "Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools", Nucleic Acids Research, 24: 4876-4882. A este respecto, se reparó especialmente en que pudieran evitarse las hibridaciones cruzadas potenciales con otras posibles dianas ABR. A este respecto, se emplearon también extensas búsquedas en los bancos de datos EMBL y GenBank para asegurar que las respectivas sondas no permitieran hibridaciones defectuosas con secuencias "extrañas". Las sondas están localizadas en las regiones más ricas en A/T de los fragmentos de PCR para garantizar condiciones óptimas en la hibridación con productos de PCR bc. Condiciones óptimas significa en este caso que las hibridaciones son generalmente más eficaces cuando la sonda "reconoce" un intervalo en el ADNbc que se desnaturaliza más fácilmente (por ejemplo, porque está en una región más rica en A/T).
Cada sonda tiene un valor de Tm de 65±1ºC y posee una secuencia dT10 extra en la terminación 5' como espaciador entre la superficie del chip y la secuencia de hibridación (véase la Tabla 3). Todos los oligonucleótidos se sintetizaron con una modificación 5'-(CH_{2})_{6}-NH_{2} y se purificaron mediante un protocolo de HPLC de "cromatografía en fase inversa". Las sondas se ajustan a una concentración de 1 mM y se conservan en placas MT a -20ºC.
TABLA 3
N^{o} Nombre Secuencia (SEC N^{o} ID) Tm
1 PBP2 25 64,8ºC
2 KanR 26 65,1ºC
3 MecR 27 64,8ºC
4 DhfrA 28 65,5ºC
5 StrR 29 63,7ºC
6 VanB 30 64,4ºC
7 MlsR 31 64,9ºC
8 AmpR 32 65,4ºC
9 CmR 33 64,9ºC
10 TetR 34 65,9ºC
11 FosB 35 64,2ºC
12 AacA 36 65,0ºC
Co Bsinverso 37 65,9ºC
hCo AT-M33 38 65,3ºC
3. Disposición de matriz
Las sondas están unidas covalentemente a la superficie de vidrio, a este respecto, los grupos amino primarios 5' reaccionan con los grupos aldehído libres de la superficie de vidrio formando una base de Schiff ("Silylated Slides", CEL Associates). Las sondas se aplicaron al vehículo de vidrio mediante un sistema de deposición (Affymetrix 417 Arrayer). A este respecto, se optimizaron los protocolos de deposición para una buena reproducibilidad y consistencia de depósito. Se realizó la deposición en 3 x SSC, 0,1% de SDS con impactos/punto. Los depósitos tienen un diámetro de aproximadamente 240 \mum y están aplicados con una distancia de depósito a depósito de 280 \mum sobre la micromatriz. De cada depósito hay dos réplicas. Para la validación del chip se aplican sondas de control (secuencia poliengarce de Bluescript) en un patrón típico ("puntos guía") y controles negativos (valores de blanco, los denominados "puntos de tampón").
La Fig. 2 muestra una disposición de matriz del chip ABR. La posición de las 12 dianas ABR está indicada con los números respectivos (nº). Los "puntos guía" son negros, los "puntos de tampón" blancos, y la posición de los controles heterólogos se marca en gris.
4. Validación de chip e hibridación de control
Se optimizaron las condiciones de hibridación en primer lugar con ayuda del conjunto de sondas de control sobre la micromatriz. Seis depósitos sobre la micromatriz contenían una sonda de control con una secuencia específica del poliengarce BS. La hibridación se llevó a cabo en un volumen de 7 \mul con un oligonucleótido marcado con Cy5-dCTP 3'-terminal (BSrevco, 5' AAGCTCACTGGCCGTCGTTTTAAA, SEC Nº ID 39) en tampón SSARC bajo una cubierta de vidrio de 15 x 15 mm (2,25 mm^{2}) durante 1 hora a 55ºC.
Se lavó el chip mediante protocolos estándar (2 x SSC, 0,1% de SDS, después con 0,2 x SSC, 0,1% de SDS, después con 0,2 x SSC y finalmente con 0,1 x SSC durante 2 minutos respectivamente). Se sometió después a barrido el vehículo de vidrio en un escáner de fluorescencia confocal (Affymetryx 417 Array Scanner) con la potencia láser adecuada y los ajustes de tensión PMT adecuados.
En la Fig. 3 se muestra la hibridación de control sobre el chip ABR. Ha de observarse el resultado de en total 12 experimentos de hibridación realizados individualmente con cada una de las dianas específicas (nº 1 a nº 12) con los controles de "puntos guía" (de izquierda a derecha, respectivamente, nº 1 a 3, nº 4 a nº 6, nº 7 a nº 9 y nº 10 a nº 12).
5. Estudios piloto con el prototipo de chip ABR
Se prepararon en un primer ensayo funcional del chip ABR dos mezclas de muestra distintas ("mezcla A" y "mezcla B") a partir de tres dianas ABR distintas y dos dianas control respectivamente (ampicilina nº 8 y tetraciclina nº 10); la "mezcla A" contenía además de la diana control kanamicina (aphA-3 nº 2), trimetroprima (dhfrA nº 4) y gentamicina (aacA nº 12), la "mezcla B" contenía además de la diana control vancomicina (vanB nº 6), eritromicina (ermC nº 7) y fosfomicina (fosB nº 11). A este respecto, se usaron los "moldes" sintéticos para posibilitar un ajuste lo más exacto posible de las cantidades de "molde". Se realizó la amplificación múltiplex en condiciones de PCR estándar en 35 ciclos, acoplándose los cebadores para la amplificación de las cadenas individuales "+" que son idénticas a las sondas con moléculas de biotina. Los cebadores para las cadenas individuales "-" que presenten secuencias complementarias con las sondas se acoplaron con moléculas marcadoras 5' Cy-5: la preparación de reacción se purificó, se aislaron las cadenas individuales mediante desnaturalización alcalina en Dynabeads y se hibridó en tampón SSARC durante 1 hora a 55ºC sobre la matriz prototipo de ABR (véase la Fig. 4).
A) PCR (Controles en la preparación individual)
\bullet
25 \mul de volumen:
1,0 \mul de molde (3 fmol/\mul)
1,0 \mul de cebador más (25 \muM) 5'-biotina [VBC-GENOMICS]
1,0 \mul de cebador menos (25 \muM) 5'-Cy5 [VBC-GENOMICS]
2,5 \mul de tampón HotStar™ (10x) [Qiagen]
0,5 \mul de dNTP (1 mM) [Roche]
0,1 \mul de ADN polimerasa Taq HotStar™ [Quiagen]
hasta 25 \mul con agua bidestilada.
\bullet
Ciclación: 15 min a 95ºC 30 x [30 s a 95ºC, 20 s a 60ºC, 40 s a 72ºC], 10 min a 72 ºC
\bullet
Purificación de la preparación de PCR mediante el kit de purificación por PCR QIAquick™.
B) PCR múltiplex
\bullet
50 \mul de volumen:
x \mul de molde (x fmol/\mul)
6,0 \mul de "cóctel" de cebadores más (25 \muM cada uno) 5'-biotina [VBC-GENOMICS]
6,0 \mul de "cóctel" de cebadores menos (25 \muM cada uno) 5'-Cy5 [VBC-GENOMICS[
5,0 \mul de tampón HotStar™ (10x) [Qiagen]
1,0 \mul de dNTP (10 mM) [Roche]
0,2 \mul de ADN polimerasa Taq HotStar™ [Qiagen]
hasta 50 ml con agua bidestilada.
\bullet
Ciclación: 15 min a 95ºC 35 x [30 s a 95ºC, 20 s a 55ºC, 40 s a 72ºC], 10 min a 72ºC.
\bullet
Purificación de la preparación de PCR mediante el kit de purificación por PCR QIAquick™.
C) Aislamiento de cadena simple
\bullet
Se lavan 20 \mul de Dynabeads (10 \mug/\mul) [Roche] 2 x con 200 \mul de 1 x tampón TS,
\bullet
se incorporan a 8 \mul de 6 x tampón TS,
\bullet
se incuba con 40 \mul de la preparación PCR durante 30 min a 37ºC,
\bullet
se lavan las Dynabeads 2 x con 200 \mul de 1 x tampón TS,
\bullet
se desnaturaliza el ADN 2 x con 20 \mul de NaOH 0,2 N durante 5 min a TA,
\bullet
se precipita con 120 \mul de 90% de EtOH/AcONa 0,3 M (20 min a –20ºC, 30 min a 16.500 rpm, 4ºC),
\bullet
Se lava el sedimento con EtOH al 70%, se seca y se incorpora a 14 \mul de tampón SSARC,
D) Hibridación
\bullet
Se desnaturalizan 7 \mul de sonda de hibridación en tampón SSRC con 0,1 \mul de BSrevco-Cy5 (1 \muM) durante 3 min a 98ºC, y se dispone inmediatamente en hielo,
\bullet
se hibrida durante 1 h a 55ºC bajo una cubierta de vidrio de 15 x 15 mm,
\bullet
se lava el portaobjetos (2 x SSC, 0,1% de SDS durante 5 min a TA, 0,2 x SSC durante 5 min a TA, 0,2 x SSC durante 5 min a TA, 0,1 x SSC durante 2 min a TA),
\bullet
se barre el portaobjetos.
E) Tampón
\bullet
Tampón TS: Tris-Cl 100 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, sometido a autoclave,
\bullet
Tampón SSARC: 4 x SSC, 0,1% (p/v) de Sarkosyl, filtrado por 0,2 \mum,
\bullet
Tampón SSC: 20 x: NaCl 3 M, citrato trisódico 0,3 M (dihidratado), pH 7,0
Se lavaron los chips y se sometieron a barrido.
La Fig. 5 muestra una amplificación múltiplex y posterior detección en chip ABR de dos dianas sintéticas distintas y dos dianas control, a la izquierda la "mezcla A" y a la derecha la "mezcla B". Se observan figuras de "falso color" del barrido de fluorescencia, respectivamente en negativo con la disposición correcta de las dianas ABR. Como se observa en la Fig. 5, es posible una disposición inequívoca de las dianas correctas en las dos mezclas de muestra distintas. Esto muestra que la detección simultánea de 12 moléculas de ácido nucleico según el procedimiento según la invención conduce a resultados inequívocos.
<110> Österreichisches Forschungszentrum Seibersdorf
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección de genes de resistencia a antibióticos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Gen de resistencia a antibióticos
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaccgaaaca atgtggaatt gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccatcttca tgttggagct ttt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtggaacgg gaaaaggaca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgatatcc tccctgatcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgttaatgg cattcgacca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttcgccatt cgcattgtct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttcaccatg aaggggtaga tgtt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttccctttt ctacgcacta aatgt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagaacct tgaccgaacg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcattgcgc tgccattctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtctccccg ccatattctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgacaatc aaatcatcct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaaatcggc tcaggaaaag g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcaattcc tgcatgtttt aag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtcgccct tattcccttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataataccgc gccacatagc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcctttttaa agaccgtaaa gaaaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacatcttg cgaatatatg tgtag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcactatgg cgtgctgcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgatgtcg gcgatatagg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagagatat tttaggggct gaca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttctaaact tcctgtatgc aattct 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagccttgg gaagatgaag tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccacactat cataaccact accg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcatcgttc caaagaatgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaagctgcc tgttccaaag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagcaaatg gatggttcgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgaaaactg ggaagtcgaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attgttgtgc acgacgacat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgcgatac agggtctgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaaacgctc attggcatta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgccttcc tgtttttgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgttttcc atgagcaaac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgtcctgt ggatcctcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgaaagtg agacctcggc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgccacaaat gttaaggcaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacgacgg ccagtgagc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttaccgac atggtacctg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagctcactg gccgtcgttt taaa 
\hfill
24

Claims (27)

1. Procedimiento para la detección simultánea de al menos seis moléculas de ácido nucleico distintas entre sí que están contenidas en genes de resistencia a antibióticos en una muestra, en el que en una primera etapa se lleva a cabo una PCR múltiplex y en una segunda etapa una reacción de hibridación de sondas inmovilizadas sobre una micromatriz con las secuencias amplificadas, tras de lo cual se detectan los productos de PCR hibridados y eventualmente se cuantifican, en el que las sondas utilizadas para la reacción de hibridación que hibridan específicamente con las secuencias amplificadas distintas entre sí de las moléculas de ácido nucleico respectivas, presentan temperaturas de fusión que difieren entre sí como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se detectan simultáneamente al menos 8 moléculas de ácido nucleico distintas entre sí en una muestra.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se detectan al menos 12 ácidos nucleicos distintos entre sí en una muestra.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque los genes de resistencia a antibióticos se seleccionan del grupo compuesto por genes de beta-lactamasa blaZ, cloranfenicol acetiltransferasa, la proteína fosB, la adeninmetilasa ermC, resistencia a aminoglicósido aacA-aphD, 3',5'-aminoglicósidofosfotransferasa aphA-3, mecR, la proteína de unión a penicilina PBP2', la aminoglicósido-3'-adeniltransferasa aadA, la proteína de resistencia a tetraciclina tetC, DHFR DfrA y la ligasa D-Ala:D-Ala vanB.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reacción de hibridación se lleva a cabo a 30-80ºC, preferiblemente a 40-70ºC, de forma especialmente preferida a 55-65ºC.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la reacción de hibridación se lleva a cabo en condiciones de alto rigor.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se lleva a cabo la PCR múltiplex con cebadores que están marcados.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la reacción de hibridación se lleva a cabo después de la separación de las cadenas individuales "+" y "-".
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque las cadenas individuales "+" que presentan secuencias idénticas a las sondas se separan después de la PCR múltiplex.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se utilizan cebadores para la elongación de las cadenas individuales "+" que están acoplados respectivamente, preferiblemente en su terminación 5', con una sus-
tancia, especialmente al menos una molécula de biotina, que garantiza la separación de las cadenas individuales "+".
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque las moléculas de biotina se acoplan con los cebadores para la elongación de las cadenas individuales "+", en el que después de la PCR múltiplex se separan las cadenas individuales "+" mediante estreptavidina unida a bolitas.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque a la etapa de hibridación le precede una etapa de purificación.
13. Micromatriz para hibridación de productos de PCR múltiplex según el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque están unidas a su superficie al menos 6, preferiblemente al menos 8, de forma especialmente preferida al menos 12 sondas, que respectivamente hibridan específicamente con las secuencias amplificadas a detectar, distintas entre sí, de moléculas de ácido nucleico que están contenidas en genes de resistencia a antibióticos, y presentan temperaturas de fusión que difieren entre sí como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC.
14. Micromatriz según la reivindicación 13, caracterizada porque las sondas están unidas a la superficie de la micromatriz en depósitos con un diámetro de 100 a 500 \mum, preferiblemente de 200 a 300 \mum, de forma especialmente preferida 240 \mum.
15. Micromatriz según la reivindicación 14, caracterizada porque los depósitos presentan una distancia entre sí de 100 a 500 \mum, preferiblemente de 200 a 300 \mum, de forma especialmente preferida 280 \mum.
16. Micromatriz según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque se prepara a partir de vidrio, un material sintético o una membrana.
17. Micromatriz según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizada porque las sondas están unidas covalentemente a la superficie de la micromatriz.
18. Micromatriz según una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizada porque las sondas presentan una secuencia de hibridación que comprende 15 a 25, preferiblemente 20 nucleótidos.
19. Micromatriz según una de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizada porque las sondas presentan en su terminación 5' respectivamente una secuencia dT por la que están unidas a la micromatriz.
20. Micromatriz según las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizada porque las sondas presentan como secuencia de hibridación una secuencia que se selecciona del grupo compuesto por las nº 25, nº 26, nº 27, nº 28, nº 29, nº 30, nº 31, nº 32, nº 33, nº 34, nº 35 y nº 36.
21. Conjunto para la hibridación de productos de PCR múltiplex según el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende al menos 6, preferiblemente al menos 8, de forma especialmente preferida al menos 12 sondas, que respectivamente hibridan específicamente con las secuencias amplificadas a detectar, distintas entre sí, de moléculas de ácido nucleico, y presentan temperaturas de fusión que difieren entre sí como máximo 2ºC, preferiblemente como máximo 1ºC.
22. Conjunto según la reivindicación 21, caracterizado porque las sondas presentan una zona de hibridación que comprende 15 a 25, preferiblemente 20 nucleótidos.
23. Conjunto según la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque las sondas presentan en su terminación 5' respectivamente una secuencia dT.
24. Conjunto según la reivindicación 22 ó 23, caracterizado porque las sondas presentan en su zona de hibridación una secuencia que se selecciona del grupo compuesto por las nº 25, nº 26, nº 27, nº 28, nº 29, nº 30, nº 31, nº 32, nº 33, nº 34, nº 35 y nº 36.
25. Kit para la detección simultánea de al menos dos moléculas de ácido nucleico distintas entre sí en una muestra, caracterizado porque comprende
-
una micromatriz según una de las reivindicaciones 13 a 20,
-
al menos un recipiente con cebadores para la amplificación específica de la molécula de ácido nucleico a detectar, y
-
eventualmente un conjunto según una de las reivindicaciones 21 a 24.
26. Kit según la reivindicación 25, caracterizado porque comprende además al menos un recipiente con al menos una molécula de ácido nucleico para detectar como muestra positiva.
27. Kit según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque comprende además un recipiente con estreptavidina unida a bolitas.
ES02704467T 2001-03-02 2002-03-01 Procedimiento para la deteccion de moleculas de acido nucleico. Expired - Lifetime ES2252427T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ATA337/2001 2001-03-02
AT0033701A AT410444B (de) 2001-03-02 2001-03-02 Verfahren zur detektion von nukleinsäuremolekülen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2252427T3 true ES2252427T3 (es) 2006-05-16

Family

ID=3672000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02704467T Expired - Lifetime ES2252427T3 (es) 2001-03-02 2002-03-01 Procedimiento para la deteccion de moleculas de acido nucleico.

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20050196756A1 (es)
EP (1) EP1366195B1 (es)
JP (2) JP2004520838A (es)
KR (1) KR100892184B1 (es)
AT (1) AT410444B (es)
AU (1) AU2002238274B2 (es)
CA (1) CA2439531A1 (es)
CZ (1) CZ20032665A3 (es)
DE (1) DE50204680D1 (es)
DK (1) DK1366195T3 (es)
ES (1) ES2252427T3 (es)
HU (1) HUP0303377A3 (es)
NO (1) NO20033884L (es)
PL (1) PL365022A1 (es)
SK (1) SK287793B6 (es)
WO (1) WO2002070736A2 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003144153A (ja) * 2001-11-09 2003-05-20 Gifu Univ 遺伝子検出方法、遺伝子検出用プライマー、ｄｎａマイクロアレイ及び遺伝子検出用キット
KR100619189B1 (ko) * 2004-10-08 2006-08-31 굿젠 주식회사 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법
EP1674583A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-28 Eppendorf Array Technologies SA Method and kit for the detection of a large number of genes related to antibiotic resistance in microorganisms
US20070059714A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-15 Birgit Strommenger Detection of presence and antibiotic susceptibility of enterococci
AT504194B1 (de) * 2006-09-07 2008-07-15 Oesterr Rotes Kreuz Bakteriennachweis
EP2270203A1 (en) 2009-06-29 2011-01-05 AIT Austrian Institute of Technology GmbH Oligonucleotide hybridization method
WO2013176767A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
WO2014076706A1 (en) * 2012-11-15 2014-05-22 Syntezza Molecular Detection Israel Ltd. Pcr reaction mixtures and methods of using same
CN108025304B (zh) 2015-07-22 2022-01-21 北卡罗来纳-查佩尔山大学 含有具有空间分离的珠保留和信号检测段的珠孔几何结构的流体装置和相关方法
CA3037217A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Analysis system and method for testing a sample
CN109789409A (zh) 2016-10-07 2019-05-21 勃林格殷格翰维特梅迪卡有限公司 用于测试样品的方法和分析系统
ES2875790T3 (es) * 2016-10-07 2021-11-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Método y sistema de análisis para probar una muestra

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02501027A (ja) * 1986-10-30 1990-04-12 シナージェン　バイオロジカルズ，インコーポレイティド 組換えｄｎａ法により生産されるヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターおよびその生産方法
WO1990001540A1 (en) * 1988-08-11 1990-02-22 California Biotechnology Inc. Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5491225A (en) * 1991-12-19 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. PCR primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US6045996A (en) * 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6063566A (en) * 1994-05-13 2000-05-16 The Scripps Research Institute Catalytic RNA molecules
US6150093A (en) * 1994-08-18 2000-11-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated Kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US6001564A (en) * 1994-09-12 1999-12-14 Infectio Diagnostic, Inc. Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5702895A (en) * 1995-01-19 1997-12-30 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Method and kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US5994066A (en) * 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5627054A (en) * 1996-04-05 1997-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Competitor primer asymmetric polymerase chain reaction
GB9902970D0 (en) * 1999-02-11 1999-03-31 Zeneca Ltd Novel matrix
GB9904804D0 (en) * 1999-03-02 1999-04-28 King S College London Identification of bacteria
CN1117161C (zh) * 1999-09-24 2003-08-06 东南大学 高密度基因芯片的制作方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1366195B1 (de) 2005-10-26
HUP0303377A3 (en) 2005-12-28
EP1366195A2 (de) 2003-12-03
NO20033884D0 (no) 2003-09-02
WO2002070736A3 (de) 2003-09-12
CZ20032665A3 (cs) 2005-02-16
AU2002238274B2 (en) 2007-06-28
US20100317535A1 (en) 2010-12-16
SK287793B6 (sk) 2011-10-04
WO2002070736A2 (de) 2002-09-12
JP2004520838A (ja) 2004-07-15
DE50204680D1 (de) 2005-12-01
US20050196756A1 (en) 2005-09-08
KR100892184B1 (ko) 2009-04-07
NO20033884L (no) 2003-10-28
PL365022A1 (en) 2004-12-27
HUP0303377A2 (hu) 2004-01-28
KR20030092009A (ko) 2003-12-03
DK1366195T3 (da) 2006-03-13
SK10832003A3 (sk) 2004-05-04
AT410444B (de) 2003-04-25
JP2011101652A (ja) 2011-05-26
WO2002070736A8 (de) 2003-01-23
CA2439531A1 (en) 2002-09-12
ATA3372001A (de) 2002-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2273371T3 (es) Metodo de amplificacion de acido nucleico basado en ramificacion extension (rami) y transcripcion in vitro.
ES2374954T3 (es) Variaciones genéticas asociadas con tumores.
CN107208086A (zh) 基因组探针
ES2773313T3 (es) Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle
US20100317535A1 (en) Methods and Compositions For Detecting Nucleic Acid Molecules
KR20070011354A (ko) 취약 ｘ염색체 증후군과 같은 ｓｔｒｐ의 검출 방법
KR20020008195A (ko) 폴리뉴클레오티드 서열 변형의 미세배열-기초 분석
US9175339B2 (en) Method for detection of target nucleic acid
CN110719957A (zh) 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒
JP4972104B2 (ja) 病原体の同定のためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ
CN102741409A (zh) 等位基因梯基因座
JP2006514826A (ja) 核酸を分析するためのラボ・オン・チップシステム
CN108374042A (zh) 离子激流基因组测序
EP1160333A2 (en) Oligonucleotides and method for detection of mecA gene of methicillin-resistant staphylococcus aureus
KR20130029748A (ko) ＩＬ28Ｂ(ｒｓ8099917)와 ＩＴＰＡ(ｒｓ1127354)의 변이를 검출하는 방법
CN110546274A (zh) minor BCR-ABL1基因的检测方法
US20120196765A1 (en) Method for detection or analysis of target sequence in genomic dna
KR100468317B1 (ko) 단일가닥 환형 분자를 탐침 ｄｎａ로 이용하는 ｄｎａ 칩
KR101338292B1 (ko) Ａ형 간염 바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응 효소면역 측정법
ES2308807T3 (es) Procedimiento y kit para la identificacion de cepas de bacterias resistentes a antibioticos.
JP6810559B2 (ja) 環状型一本鎖核酸、およびその調製方法と使用方法
JP2004147503A (ja) 核酸の高感度検出法
US20090075285A1 (en) Primer kit
JP2004057058A (ja) プレボテラ・インターメディアの検出方法
JP2004147501A (ja) Ｄｎａの高感度検出法