ES2875790T3 - Método y sistema de análisis para probar una muestra - Google Patents

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Abstract

Método para analizar una muestra biológica en particular (P), en el que los productos de amplificación (V) se forman a partir de analitos (A) de la muestra (P), en el que los productos (V) de amplificación están enlazados a las moléculas (M) de captura correspondientes de un aparato (113) sensor que comprende un compartimento (118) de sensor y los productos (V) de amplificación unidos se detectan o identifican en un proceso de detección, caracterizado porque un primer grupo de productos (V1) de amplificación de al menos un primer analito (A1) y un segundo grupo de productos (V2) de amplificación de al menos un segundo analito (A2) están unidos en el compartimento (118) del sensor a las correspondientes moléculas (M) de captura a diferentes temperaturas de hibridación (TH), y porque el primer grupo y el segundo grupo se alimentan al compartimento (118) del sensor y se enlazan a las correspondientes moléculas de captura (M) en sucesión

Description

DESCRIPCIÓN
Método y sistema de análisis para probar una muestra
La presente invención se relaciona con un método y con un sistema de análisis de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Preferiblemente, la presente invención trata sobre el análisis y prueba de una muestra, en particular de un ser humano o animal, de forma particularmente preferible para el análisis y diagnóstico, por ejemplo, con respecto a la presencia de enfermedades y/o patógenos y/o para determinar conteos sanguíneos, anticuerpos, hormonas, esteroides o similares. Por lo tanto, la presente invención se encuentra en particular dentro del campo de la bioanalítica. Opcionalmente, también se puede analizar una muestra de alimento, una muestra ambiental u otra muestra, en particular para análisis ambientales o seguridad alimentaria y/o para detectar otras sustancias.
En particular, por medio de la presente invención, se puede determinar o detectar al menos un analito (analito objetivo) de una muestra, preferiblemente un producto de ácido nucleico, tal como una secuencia de ácido nucleico particular. En particular, la muestra puede analizarse para determinar cualitativa o cuantitativamente al menos un analito, por ejemplo, para que sea posible detectar una enfermedad y/o patógeno.
La presente invención trata en particular de lo que se conoce como sistemas de punto de atención, es decir, de sistemas, dispositivos y otros aparatos, y trata de métodos para llevar a cabo pruebas a una muestra en el sitio de muestreo y/o de forma independiente o lejana a un laboratorio central o similares.
El documento US 5,096,669 divulga un sistema de punto de atención para analizar una muestra biológica, en particular una muestra de sangre. El sistema comprende un cartucho de un solo uso y un dispositivo de análisis. Una vez recibida la muestra, se inserta el cartucho en el dispositivo de análisis para llevar a cabo la prueba. El cartucho comprende un sistema microfluídico y un aparato sensor que comprende electrodos, el aparato se calibra por medio de un líquido de calibración y luego se usa para analizar la muestra.
Además, el documento WO 2006/125767 A1 divulga un sistema de punto de atención para el análisis integrado y automatizado de ADN o proteínas, que comprende un cartucho de un solo uso y un dispositivo de análisis para procesar y evaluar de forma totalmente automática análisis de diagnóstico molecular utilizando el cartucho de un solo uso. El cartucho está diseñado para recibir una muestra, en particular sangre, y en particular permite la rotura celular, la PCR y la detección de productos de amplificación por PCR, que se enlazan para capturar moléculas y se proporcionan con una enzima marcada, para que sea posible detectar productos de amplificación de PCR enlazados o secuencias nucleicas como analitos objetivo en lo que se conoce como un proceso cíclico de reducción-oxidación. El documento US 2014/0377852 A1 divulga un dispositivo microfluídico para realizar ensayos de proteínas y/o ensayos de ácidos nucleicos, en el que se utilizan nano-reactores de vidrio formados por tubos de micro-longitud funcionalizados para la detección óptica. Los nano-reactores de vidrio pueden estar provistos de capturas complementarias a una secuencia de interés. Se pueden utilizar múltiples poblaciones diferentes de nano-reactores de vidrio, específicas para diferentes poblaciones diana de ADN.
El problema abordado por la presente invención es proporcionar un método mejorado y un sistema de análisis mejorado para probar una muestra, con pruebas eficientes, rápidas, confiables y/o rentables de la muestra y/o medición o detección de diferentes analitos haciéndolo posible o siendo asistido.
El problema anterior se resuelve mediante un método de acuerdo con la reivindicación 1 o mediante un sistema de análisis de acuerdo con la reivindicación 14. Los desarrollos ventajosos son objeto de las reivindicaciones dependientes.
Un aspecto de la presente invención implica enlazar las diferentes secuencias de ácidos nucleicos y/o productos de una muestra a las correspondientes moléculas de captura a diferentes temperaturas de hibridación, y/o variar la temperatura de hibridación de analitos y/o productos de amplificación preferiblemente amplificados con el fin de enlazar para capturar moléculas, en particular sobre o en un aparato sensor, y/o enlazar diferentes analitos preferiblemente amplificados y/o productos de amplificación en sucesión a diferentes temperaturas de hibridación. De forma particularmente preferible, un primer grupo de productos de amplificación, en particular de un primer analito, un segundo grupo de otros productos de amplificación, en particular de un segundo analito, y un tercer grupo opcional de otros productos de amplificación, en particular de un tercer analito, se enlazan a las correspondientes moléculas de captura del aparato sensor a diferentes temperaturas de hibridación.
Preferiblemente, el aparato sensor comprende un compartimento de sensor y los productos de amplificación y/o diferentes grupos están enlazados en el (mismo) compartimento de sensor a las moléculas de captura correspondientes a diferentes temperaturas de hibridación. Esto permite en particular una realización y/o detección o identificación muy compacta y simple de una multiplicidad de analitos, productos de amplificación y/o grupos por medio de o dentro de un aparato sensor o compartimento sensor.
Los analitos y/o productos de amplificación unidos a diferentes temperaturas de hibridación se detectan preferiblemente en un proceso de detección único o común.
De forma particularmente preferible, el aparato sensor se usa solo una vez para un proceso de detección de dichos analitos y/o productos de amplificación, teniendo lugar preferiblemente la determinación electroquímica en particular simultáneamente para todos los productos de amplificación enlazados. Esto permite llevar a cabo pruebas muy rápidas y eficientes.
Se propone que diferentes analitos y/o productos de amplificación de diferentes analitos pueden unirse de manera muy eficiente en sucesión mediante temperaturas de hibridación, a moléculas de captura preferiblemente inmovilizadas, de forma particularmente preferible en o en un aparato sensor, para que sea posible medir y/o determinar o detectar un número particularmente grande de productos de amplificación diferentes al mismo tiempo, en particular en un proceso de detección único o común.
En el contexto de la presente invención, por lo tanto, es posible probar analitos y/o productos de amplificación, que se producen y/o amplifican en paralelo y tienen diferentes temperaturas de hibridación, en un solo proceso de detección y al mismo tiempo con alta especificidad.
Preferiblemente, diferentes analitos y/o productos de amplificación o grupos de los mismos se producen inicialmente, en particular simultáneamente y/o en paralelo, mediante una reacción de amplificación, en particular PCR, preferiblemente en diferentes cámaras de PCR y/o cavidades de reacción, y luego se unen a las moléculas de captura en sucesión a diferentes temperaturas de hibridación.
En particular, está previsto que el primer, segundo y tercer grupo opcional se produzcan en diferentes cavidades de reacción. Sin embargo, también puede estar previsto que los analitos se amplifiquen mediante una reacción de amplificación, en particular PCR, en una cámara de PCR común y/o cavidad de reacción, y/o que los productos de amplificación se produzcan en una cavidad de reacción común, y la posterior hibridación con las moléculas de captura se lleva a cabo a diferentes temperaturas de hibridación, en particular decrecientes.
Preferiblemente, una pluralidad de reacciones de amplificación, en particular PCR, se ejecutan simultáneamente, en paralelo o independientemente entre sí durante la prueba.
Preferiblemente, se proporcionan o llevan a cabo diferentes reacciones de amplificación, en particular PCR con diferentes cebadores.
Dentro del sentido de la presente invención, las reacciones de amplificación son en particular reacciones biológicas moleculares en las que se amplifica/copia un analito y/o en las que se producen productos de amplificación, en particular productos de ácido nucleico, de un analito. De forma particularmente preferible, las PCR son reacciones de amplificación dentro del significado de la presente invención.
“PCR” significa reacción en cadena de la polimerasa y es un método de biología molecular mediante el cual ciertos analitos, en particular porciones de ARN o ADN, de una muestra se amplifican, preferiblemente en diversos ciclos, utilizando polimerasas o enzimas, en particular para luego probar y/o detectar los productos de amplificación o productos de ácido nucleico. Si el ARN está destinado a ser probado y/o amplificado, antes de que se lleve a cabo la PCR, se produce un ADNc a partir del ARN, en particular utilizando transcriptasa inversa. El ADNc se utiliza como una plantilla para la posterior PCR.
Preferiblemente, durante una PCR, primero se desnaturaliza una muestra mediante la adición de calor para separar las cadenas de ADN o ADNc. Preferiblemente, los cebadores o nucleótidos se depositan luego en las cadenas individuales separadas de ADN o ADNc, y una secuencia de ADN o ADNc deseada se replica por medio de polimerasa y/o la cadena faltante se reemplaza por medio de polimerasa. Este proceso se repite preferiblemente en una pluralidad de ciclos hasta que esté disponible la cantidad deseada de la secuencia de ADN o ADNc.
Para la PCR, se utilizan preferiblemente cebadores marcadores, es decir, cebadores que (adicionalmente) producen un marcador o una etiqueta, en particular biotina, en el analito amplificado. Esto permite o facilita la detección. Preferiblemente, los cebadores usados están biotinilados y/o comprenden o forman en particular biotina enlazada covalentemente como la etiqueta.
El sistema de análisis propuesto para probar una muestra biológica en particular comprende preferiblemente un aparato sensor para detectar secuencias de ácido nucleico y/o en particular analitos amplificados y/o productos de amplificación, el aparato sensor preferiblemente comprende moléculas de captura inmovilizadas para unir las secuencias, analitos y/o productos de amplificación.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, que también puede implementarse de forma independiente, las moléculas de captura tienen diferentes temperaturas de hibridación y/o las moléculas de captura están diseñadas para hibridar con las correspondientes secuencias, analitos y/o productos de amplificación a diferentes temperaturas de hibridación. Esto da lugar a las correspondientes ventajas.
Preferiblemente, el aparato sensor comprende un compartimento sensor, en el que las moléculas de captura están dispuestas o inmovilizadas en el (mismo) compartimento sensor del aparato sensor de modo que los diferentes analitos, productos de amplificación y/o grupos se puedan unir dentro del (mismo) aparato sensor o compartimento sensor a diferentes temperaturas de hibridación. Esto permite, en particular, una realización y/o detección o identificación muy compacta y sencilla de una multiplicidad de analitos, productos de amplificación y/o grupos por medio de o dentro de un aparato sensor o compartimento sensor.
La temperatura de hibridación es preferiblemente la temperatura (promedio) a la que un analito (amplificado), en particular porciones de ARN o ADN, y/o un producto de amplificación, se enlaza a las correspondientes moléculas de captura y/o se hibrida con las correspondientes moléculas de captura.
La temperatura de hibridación óptima es preferiblemente la temperatura a la que se maximiza el número de productos de amplificación enlazados a las correspondientes moléculas de captura y/o se minimiza el número de productos de amplificación unidos entre sí.
Preferiblemente, la temperatura de hibridación (óptima) varía para diferentes analitos y/o productos de amplificación.
Un grupo de diferentes analitos y/o productos de amplificación preferiblemente solo incluye, al menos sustancialmente, analitos y/o productos de amplificación que tienen temperaturas de hibridación similares (óptimas). Por lo tanto, esto da como resultado una temperatura de hibridación promedio y/o óptima del grupo o un intervalo de temperatura de temperaturas de hibridación (óptimas). A esta temperatura o en este intervalo de temperatura del grupo - ambos también denominados “temperatura de grupo” para abreviar - el número total de analitos y/o productos de amplificación en este grupo que están enlazados a las moléculas de captura es (probablemente sea) máximo. El intervalo de temperatura es preferiblemente menor de 8 °C, en particular menor de 5 °C.
Preferiblemente, se forman diferentes grupos que tienen diferentes temperaturas de grupo. Las temperaturas de grupo preferiblemente difieren o están espaciadas entre sí en aproximadamente 1 °C o más, preferiblemente al menos 2 °C, en particular en más de 3 °C.
En particular, la temperatura de grupo de un primer grupo es mayor que la temperatura de grupo de un segundo grupo.
Preferiblemente, la temperatura de hibridación (óptima) varía dependiendo del contenido de GC del ADN o ADNc, la longitud del ADN o ADNc, el punto de fusión o temperatura de fusión de la secuencia de ADN o ADNc y/o el acondicionamiento o concentración de sal del disolvente, medio ambiente y/o tampón.
El punto de fusión o la temperatura de fusión es preferiblemente la temperatura a la cual o a partir de la cual se desnaturaliza el ADN o ADNc y/o las cadenas de ADN o ADNc de doble cadena se separan entre sí. El punto de fusión o temperatura de fusión depende preferiblemente del contenido de GC del ADN o ADNc, la longitud del ADN o ADNc y/o el acondicionamiento o concentración de sal del disolvente, medio ambiente y/o tampón. Preferiblemente, el punto de fusión o temperatura de fusión es al menos 85 °C o 90 °C, de forma particularmente preferible 92 °C o 94 °C, y/o como máximo 99 °C o 98 °C, de forma particularmente preferible como máximo 97 °C o 96 °C.
Preferiblemente, la temperatura de hibridación es menor que el punto de fusión o la temperatura de fusión, preferiblemente en al menos 2 °C o 5 °C, de forma particularmente preferible 8 °C o 10 °C, en particular 15 °C o 20 °C o más.
Las moléculas de captura son en particular sondas de oligonucleótidos, que preferiblemente están inmovilizadas sobre el sensor, la matriz de sensores y/o los electrodos preferiblemente mediante un espaciador, en particular un espaciador C6. La formación de estructuras que interrumpen la hibridación, por ejemplo, las estructuras horquilla pueden prevenirse mediante la unión preferida de las moléculas de captura mediante espaciadores.
En el sentido de la presente invención, el término “moléculas detectoras” se entiende preferiblemente como moléculas que se enlazan específicamente al marcador o etiqueta de los cebadores utilizados para amplificar los analitos y/o analitos o productos de amplificación proporcionados con los mismos, y así permitir detección de los mismos.
En particular, las moléculas detectoras pueden ser conjugados de enzimas y/o inmunoconjugados, que se enlazan específicamente al marcador o etiqueta, en particular biotina, y comprenden una enzima reportera para convertir un sustrato.
En el contexto de la presente invención, las moléculas detectoras se basan preferentemente en estreptavidina, que tiene una alta afinidad por la biotina, y/o fosfatasa alcalina, que puede convertir monoésteres de fosfato no reactivos en moléculas electroquímicamente activas y fosfato.
Preferiblemente, se usa un sistema de detección, donde el marcador se basa en biotina y donde las moléculas detectoras se basan en estreptavidina/fosfatasa alcalina. Sin embargo, también se pueden usar otras moléculas detectoras.
El sistema de análisis es en particular portátil, móvil y/o es un sistema de punto de atención y/o se puede utilizar en particular en el lugar de muestreo y/o fuera de un laboratorio central.
El sistema de análisis comprende preferiblemente un dispositivo de análisis y/o al menos un cartucho para analizar la muestra.
El término “dispositivo de análisis” se entiende preferiblemente como un instrumento que es en particular móvil y/o puede usarse en el sitio, y/o que está diseñado para probar y/o analizar química, biológica y/o físicamente una muestra o un componente de la misma, preferiblemente en y/o por medio de un cartucho. En particular, el dispositivo de análisis controla la prueba de la muestra en el cartucho.
De forma particularmente preferible, el dispositivo de análisis está diseñado para recibir el cartucho o para conectar dicho cartucho.
El término “cartucho” se entiende preferiblemente como un aparato o unidad estructural diseñado para recibir, almacenar, tratar física, química y/o biológicamente y/o preparar y/o medir una muestra, preferiblemente con el fin de hacerlo posible para detectar, identificar o determinar al menos un analito de la muestra.
Un cartucho dentro del significado de la presente invención comprende preferiblemente un sistema de fluido que tiene una pluralidad de canales, cavidades y/o válvulas para controlar el flujo a través de los canales y/o cavidades.
En particular, dentro del significado de la presente invención, un cartucho está diseñado para ser al menos sustancialmente plano y/o similar a una tarjeta, en particular está diseñado como una tarjeta (micro) fluídica y/o está diseñado como un cuerpo principal o recipiente que preferiblemente se puede cerrar y/o dicho cartucho se puede insertar y/o conectar en un dispositivo de análisis propuesto cuando contiene la muestra.
Los aspectos y características de la presente invención mencionados anteriormente, y los aspectos y características de la presente invención que resultarán evidentes a partir de las reivindicaciones y la siguiente descripción pueden implementarse en principio independientemente entre sí, pero también en cualquier combinación u orden.
Otros aspectos, ventajas, características y propiedades de la presente invención resultarán evidentes a partir de las reivindicaciones y la siguiente descripción de una realización preferida con referencia a los dibujos, en los que: La Figura 1 es una sección esquemática a través de un sistema de análisis propuesto o dispositivo de análisis que comprende un cartucho propuesto recibido en el mismo;
La Figura 2 es una vista esquemática del cartucho;
La Figura 3 es una vista frontal esquemática de un aparato sensor propuesto del sistema de análisis y/o cartucho; La Figura 4 es un detalle ampliado de la Figura 3 que ilustra un campo sensor del aparato sensor;
La Figura 5 es una vista posterior esquemática del aparato sensor;
La Figura 6 es una vista esquemática en sección del aparato sensor; y
La Figura 7 es una curva o perfil esquemático de la temperatura de la muestra y/o de los productos de amplificación en función de la posición en el cartucho.
En las Figuras, que son sólo esquemáticas y a veces no a escala, se utilizan los mismos signos de referencia para piezas y componentes iguales o similares, consiguiéndose propiedades y ventajas correspondientes o comparables, aunque no se describan repetidamente.
La Figura 1 es una vista muy esquemática de un sistema 1 de análisis propuesto y un dispositivo 200 de análisis para probar una muestra biológica P en particular, preferiblemente por medio de o en un aparato o cartucho 100.
La Figura 2 es una vista esquemática de una realización preferida del aparato o cartucho 100 propuesto para probar la muestra P. El aparato o cartucho 100 en particular forma una unidad manual, y en lo que sigue se denomina simplemente cartucho.
El término “muestra” se entiende preferiblemente que significa el material de muestra que se va a ensayar, que se toma en particular de un ser humano o animal. En particular, dentro del significado de la presente invención, una muestra es un fluido, tal como saliva, sangre, orina u otro líquido, preferiblemente de un ser humano o animal, o un componente del mismo. En el sentido de la presente invención, una muestra puede tratarse previamente o prepararse si es necesario, o puede provenir directamente de un ser humano o animal o similar, por ejemplo. Opcionalmente también se puede probar una muestra de alimento, muestra ambiental u otra muestra, en particular para análisis ambiental, seguridad alimentaria y/o para detectar otras sustancias, preferiblemente sustancias naturales, pero también agentes de guerra biológica o química, venenos o similares.
Preferiblemente, el sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis controla la prueba de la muestra P en particular en o sobre el cartucho 100 y/o se usa para evaluar la prueba o la recolección, procesamiento y/o almacenamiento de valores medidos de la prueba.
Mediante el sistema 1 de análisis propuesto o el dispositivo 200 de análisis o mediante el cartucho 100 y/o utilizando el método propuesto para analizar la muestra P, preferiblemente un analito A de la muestra P, en particular un producto de ácido nucleico, se puede determinar, identificar o detectar una cierta secuencia de ácido nucleico, o de forma particularmente preferida una pluralidad de analitos A de la muestra P. Dichos analitos se detectan y/o miden en particular no solo cualitativamente, sino de forma particularmente preferible también cuantitativamente.
Por lo tanto, la muestra P se puede analizar en particular para determinar cualitativa o cuantitativamente al menos un analito A, por ejemplo, para que sea posible detectar una enfermedad y/o patógeno o para determinar otros valores, que son importantes para diagnósticos, por ejemplo.
De forma particularmente preferible, una prueba de biología molecular es posible mediante el sistema 1 de análisis y/o el dispositivo 200 de análisis y/o mediante el cartucho 100.
De forma particularmente preferible, se hace posible y/o se lleva a cabo un ensayo molecular y/o PCR, en particular para detectar ADN y/o ARN, es decir, productos y/o secuencias de ácidos nucleicos.
Preferiblemente, la muestra P o los componentes individuales de la muestra P o los analitos A pueden amplificarse si es necesario, en particular mediante PCR, y probarse, identificarse o detectarse en el sistema 1 de análisis, dispositivo 200 de análisis y o en el cartucho 100. Preferiblemente, se producen así productos de amplificación V del analito A o analitos A.
Los analitos A y/o los productos V de amplificación de la muestra P, en particular los productos de ácido nucleico, que se amplifican en particular mediante PCR, en particular tienen una longitud de al menos 20 o 50, particularmente preferiblemente 80 o 100, y/o como máximo 300 o 280, particularmente preferiblemente 250 o 220, nucleótidos. Sin embargo, también puede estar previsto que se produzcan productos de amplificación V más cortos o más largos, en particular mediante PCR.
A continuación, se dan primero más detalles sobre una construcción preferida del cartucho 100, con características del cartucho 100 que preferiblemente también representan directamente características del sistema 1 de análisis, en particular incluso sin ninguna explicación explícita adicional.
El cartucho 100 es preferiblemente, al menos sustancialmente, llano, plano y/o en forma de placa y/o en forma de tarjeta.
El cartucho 100 comprende preferiblemente un cuerpo 101 principal al menos sustancialmente plano, plano, en forma de placa y/o similar a una tarjeta, en particular, el cuerpo 101 principal está hecho y/o moldeado por inyección de material plástico, particularmente preferiblemente polipropileno.
El cartucho 100 comprende preferiblemente al menos una película o cubierta 102 para cubrir el cuerpo 101 principal y/o cavidades y/o canales formados en el mismo al menos en parte, en particular en la parte frontal 100A, y/o para formar válvulas o similares, como se muestra con líneas discontinuas en la Figura 2.
El sistema 1 de análisis o cartucho 100 o el cuerpo 101 principal del mismo, en particular junto con la cubierta 102, preferiblemente forma y/o comprende un sistema 103 fluídico, denominado en lo sucesivo sistema 103 de fluido. El cartucho 100 y/o el sistema 103 de fluido del mismo está preferiblemente al menos sustancialmente orientado verticalmente en la posición operativa y/o durante la prueba, en particular en el dispositivo 200 de análisis, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. En particular, el plano principal o extensión de la superficie del cartucho 100 se extiende así al menos sustancialmente verticalmente en la posición operativa.
El cartucho 100 y/o el sistema 103 de fluido comprenden preferiblemente una pluralidad de cavidades, en particular al menos una cavidad 104 receptora, al menos una cavidad 105 dosificadora, al menos una cavidad 106 intermedia, al menos una cavidad 107 de mezcla, al menos una cavidad 108 de almacenamiento, al menos una cavidad 109 de reacción, al menos una cavidad 110 intermedia de control de temperatura y/o al menos una cavidad 111 de recolección, como se muestra en la Figura 1.
El cartucho 100 y/o el sistema 103 de fluido también comprende preferiblemente al menos un aparato 112 de bomba y/o al menos un aparato 113 sensor.
Algunas, la mayoría o todas las cavidades están formadas preferiblemente por cámaras y/o canales u otras depresiones en el cartucho 100 y/o el cuerpo 101 principal, y de forma particularmente preferible están cubiertas o cerradas por la película o cubierta 102. Sin embargo, también son posibles otras soluciones estructurales
En el ejemplo mostrado, el cartucho 100 o el sistema 103 de fluido comprende preferiblemente dos cavidades 105A y 105B dosificadoras, una pluralidad de cavidades 106A a 106G intermedias, una pluralidad de cavidades 108A a 108E de almacenamiento y/o una pluralidad de cavidades 109 de reacción, que preferiblemente se pueden cargar independientemente entre sí, en particular una primera cavidad 109A de reacción, una segunda cavidad 109B de reacción y una tercera cavidad 109c de reacción opcional, como puede verse en la Figura 2.
La o las cavidades 109 de reacción se utilizan en particular para llevar a cabo una reacción de amplificación, en particular PCR, o varias reacciones de amplificación, preferiblemente diferentes, en particular PCR. Es preferible llevar a cabo varias PCR, preferiblemente diferentes, es decir, PCR que tienen diferentes combinaciones de cebadores o pares de cebadores, en paralelo y/o independientemente y/o en diferentes cavidades 109 de reacción.
Los productos V de amplificación y/u otras porciones de la muestra P que se forman en una o más cavidades 109 de reacción pueden conducirse o alimentarse al aparato 113 sensor conectado, en particular por medio del aparato 112 de bomba.
El aparato 113 sensor se utiliza en particular para detectar, de forma particularmente preferible cualitativa y/o cuantitativamente determinante, el analito A o los analitos A de la muestra P, en este caso de forma particularmente preferible los productos V de amplificación de los analitos A. Alternativa o adicionalmente, sin embargo, también se pueden recopilar o determinar otros valores.
En particular, el aparato 112 de bomba comprende o forma una parte elevada en forma de tubo o en forma de perla, en particular por medio de la película o cubierta 102, de forma particularmente preferible en la parte posterior del cartucho, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1.
El cartucho 100, el cuerpo 101 principal y/o el sistema 103 de fluido comprenden preferiblemente una pluralidad de canales 114 y/o válvulas 115, como se muestra en la Figura 2.
Por medio de los canales 114 y/o válvulas 115, las cavidades 104 a 111, el aparato 112 de bomba y/o el aparato 113 sensor pueden estar conectados temporalmente y/o permanentemente y/o separados entre sí, según se requiera y/u opcional o selectivamente, en particular de modo que sean controlados por el sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis.
Las cavidades 104 a 111 están preferiblemente unidas fluídicamente por una pluralidad de canales 114. De forma particularmente preferible, cada cavidad está unida o conectada por al menos dos canales 114 asociados, con el fin de hacer posible que el fluido llene, fluya a través y/o drene desde las respectivas cavidades según sea necesario. El transporte de fluido o el sistema 103 de fluido preferiblemente no se basa en fuerzas capilares, o no se basa exclusivamente en dichas fuerzas, sino que en particular se basa esencialmente en los efectos de la gravedad y/o fuerzas de bombeo y/o fuerzas de compresión y/o fuerzas de succión que surgen, que son generadas de forma particularmente preferible por la bomba o el aparato 112 de bomba. En este caso, los flujos de fluido o el transporte de fluido y la dosificación se controlan abriendo y cerrando las válvulas 115 y/o accionando en consecuencia la bomba o el aparato 112 de bomba, en particular por medio de un accionamiento 202 de bomba del dispositivo 200 de análisis. Preferiblemente, cada una de las cavidades 104 a 110 tiene una entrada en la parte superior y una salida en la parte inferior en la posición de funcionamiento. Por lo tanto, si es necesario, solo se puede eliminar el líquido de las respectivas cavidades a través de la salida.
En particular, las cavidades que contienen líquido, de forma particularmente preferible la cavidad/cavidades 108 de almacenamiento, la cavidad 107 de mezcla y/o la cavidad 104 receptora, están dimensionadas cada una de manera que, cuando dichas cavidades se llenen de líquido, burbujas de gas o el aire que potencialmente puede formarse, se elevan hacia arriba en la posición de funcionamiento, de modo que el líquido se acumula por encima de la salida sin burbujas. Sin embargo, aquí también son posibles otras soluciones.
Preferiblemente, al menos una válvula 115 está asignada a cada cavidad, el aparato 112 de bomba y/o el aparato 113 sensor y/o está dispuesto corriente arriba de las respectivas entradas y/o corriente abajo de las respectivas salidas. Preferiblemente, las cavidades 104 a 111 o secuencias de cavidades 104 a 111, a través de las cuales el fluido fluye en serie o en sucesión, por ejemplo, pueden liberarse selectivamente y/o el fluido puede fluir selectivamente a través de ellas mediante la activación de las válvulas 115 asignadas, y/o dichas cavidades se pueden conectar fluídicamente al sistema 103 de fluidos y/o a otras cavidades.
En particular, las válvulas 115 están formadas por el cuerpo 101 principal y la película o cubierta 102 y/o están formadas de otra manera, por ejemplo, por capas adicionales, depresiones o similares.
De forma particularmente preferible, se proporcionan una o más válvulas 115A que preferiblemente están herméticamente cerradas inicialmente o durante el almacenamiento, de forma particularmente preferible para sellar líquidos o reactivos líquidos F, ubicados en las cavidades 108 de almacenamiento, y/o el sistema 103 de fluidos desde la cavidad 104 receptora abierta de una manera estable al almacenamiento.
Preferiblemente, una válvula 115A inicialmente cerrada está dispuesta corriente arriba y corriente abajo de cada cavidad 108 de almacenamiento. Preferiblemente, dichas válvulas sólo se abren, en particular automáticamente, cuando el cartucho 100 se está utilizando realmente y/o mientras se inserta el cartucho 100 en el dispositivo 200 de análisis.
Una pluralidad de válvulas 115A, en particular tres válvulas en este caso, se asignan preferiblemente a la cavidad 104 receptora cuando se proporciona una conexión 104D intermedia opcional además de una entrada 104B y una salida 104C, por ejemplo, para que sea posible, opcionalmente, descargar o eliminar un sobrenadante de la muestra P, como suero sanguíneo o similar. Dependiendo del uso, en adición a la válvula 115A en la entrada 104B, entonces preferiblemente sólo se abre la válvula 115A en la salida 104C o en la conexión 104D intermedia.
Las válvulas 115A asignadas a la cavidad 104 receptora sellan el sistema 103 de fluido y/o el cartucho 100 en particular fluídicamente y/o hermética a los gases hasta que se inserta la muestra P y la cavidad 104 receptora o una conexión 104A de la cavidad 104 receptora está cerrada.
Como alternativa o en adición a las válvulas 115A (que están inicialmente cerradas), se proporcionan preferiblemente una o más válvulas 115B que no están cerradas de manera estable al almacenamiento y/o que están abiertas inicialmente y/o que pueden cerrarse mediante accionamiento. Estas válvulas se utilizan en particular para controlar los flujos de fluido durante la prueba.
El cartucho 100 se diseña preferiblemente como una tarjeta de microfluidos y/o el sistema 103 de fluidos se diseña preferiblemente como un sistema de microfluidos. En la presente invención, el término “microfluídico” se entiende preferiblemente que significa que los volúmenes respectivos de cavidades individuales, algunas de las cavidades o todas las cavidades 104 a 111 y/o canales 114 son, por separado o acumulativamente, menores que 5 ml o 2 ml, de forma particularmente preferida menos de 1 ml u 800 pl, en particular menos de 600 pl o 300 pl, más particularmente preferiblemente menos de 200 pl o 100 pl.
De forma particularmente preferible, se puede introducir una muestra P con un volumen máximo de 5 ml, 2 ml o 1 ml en el cartucho 100 y/o en el sistema 103 de fluido, en particular en la cavidad 104 receptora.
Los reactivos y líquidos que se introducen o suministran preferiblemente antes del ensayo en forma líquida como líquidos o reactivos líquidos F y/o en forma seca como reactivos secos S son necesarios para analizar la muestra P, como se muestra en la vista esquemática de acuerdo con la Figura 2.
Además, otros líquidos F, en particular en forma de tampón de lavado, disolvente para reactivos secos S o un sustrato SU, por ejemplo, para formar moléculas de detección y/o un sistema de reducción-oxidación, también son preferiblemente necesarios para la prueba, el proceso de detección y/o para otros fines y, en particular, se proporcionan en el cartucho 100, es decir, se introducen igualmente antes del uso, en particular antes de la entrega. En algunos puntos a continuación, no se hace una distinción entre reactivos líquidos y otros líquidos y, por lo tanto, las explicaciones respectivas también son aplicables mutuamente en consecuencia.
El sistema 1 de análisis o el cartucho 100 contienen preferentemente todos los reactivos y líquidos necesarios para llevar a cabo una o más reacciones de amplificación o PCR y/o para llevar a cabo la prueba, por lo que, de forma particularmente preferible, sólo es necesario recibir la muestra P opcionalmente pretratada.
El cartucho 100 y/o el sistema 103 de fluido comprenden preferiblemente una derivación 114A que puede usarse opcionalmente, para que sea posible, si es necesario, conducir o transportar la muestra P o componentes de la misma más allá de las cavidades 109 de reacción y, mediante la derivación de la cavidad 110 de control de temperatura intermedia opcional, también directamente al aparato 113 sensor, y/o para que sea posible transportar o bombear líquidos o reactivos líquidos F2-F5 fuera de las cavidades 108B-108E de almacenamiento en el aparato 113 sensor, en particular en la dirección opuesta a los analitos A y/o productos de amplificación V, cuando la derivación 114A está abierta, más específicamente cuando la válvula 115B de la derivación 114A está abierta.
El cartucho 100 o el sistema 103 de fluido o los canales 114 comprenden preferiblemente porciones 116 de sensor u otros aparatos para detectar frentes de líquido y/o flujos de fluido.
Se observa que diversos componentes, tales como los canales 114, las válvulas 115, en particular las válvulas 115A que están inicialmente cerradas y las válvulas 115B que están inicialmente abiertas, y las porciones 116 de sensor en la Figura 2 están, por razones de claridad, solamente marcadas en algunos casos, pero se utilizan los mismos símbolos en la Figura 2 para cada uno de estos componentes.
La cavidad 111 de recolección se utiliza preferiblemente para recibir los reactivos y líquidos en exceso o usados y los volúmenes de la muestra. Preferiblemente, se le dan las dimensiones grandes adecuadas y/o sólo se le proporciona entradas o accesos, en particular de modo que los líquidos no se puedan extraer o bombear nuevamente en la posición de funcionamiento.
La cavidad 104 receptora comprende preferiblemente una conexión 104A para introducir la muestra P. Después de que la muestra P se haya introducido en la cavidad 104 receptora, dicha cavidad y/o la conexión 104A se cierran. A continuación, el cartucho 100 se puede insertar en el dispositivo 200 de análisis propuesto y/o recibirlo, como se muestra en la Figura 1, con el fin de analizar la muestra P. Alternativamente, la muestra P también podría introducirse más tarde.
La Figura 1 muestra el sistema 1 de análisis en un estado listo para usar para llevar a cabo una prueba en la muestra P recibida en el cartucho 100. En este estado, el cartucho 100 está por lo tanto ligado a, recibido por y/o insertado en el dispositivo 200 de análisis.
A continuación, algunas características y aspectos del dispositivo 200 de análisis se explican primero con mayor detalle. Las características y aspectos relacionados con dicho dispositivo son preferiblemente también características y aspectos directamente del sistema 1de análisis propuesto, en particular incluso sin ninguna explicación explícita adicional.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente un soporte o receptáculo 201 para montar y/o recibir el cartucho 100.
Preferiblemente, el cartucho 100 está separado o aislado fluídicamente, en particular hidráulicamente, del dispositivo 200 de análisis. En particular, el cartucho 100 forma un sistema 103 fluídico y/o hidráulico preferiblemente independiente y en particular cerrado para la muestra P y los reactivos y otros líquidos.
Preferiblemente, el dispositivo 200 de análisis está diseñado para accionar el aparato 112 de bomba y/o las válvulas 115, para tener un efecto térmico y/o para detectar datos medidos, en particular por medio del aparato 113 sensor y/o las porciones 116 de sensor.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente un accionamiento 202 de bomba, estando diseñado el accionamiento 202 de bomba en particular para accionar mecánicamente el aparato 112 de bomba.
Preferiblemente, un accionamiento 202 de bomba se puede rotar con el fin de deprimir axialmente de manera rotacional la porción preferiblemente elevada en forma de perla del aparato 112 de bomba. De forma particularmente preferida, el accionamiento 202 de bomba y el aparato 112 de bomba juntos forman una bomba, en particular, a modo de bomba de manguera o bomba peristáltica y/o bomba dosificadora, para el sistema 103 de fluido y/o el cartucho 100.
De forma particularmente preferible, la bomba se construye como se describe en el documento DE 102011 015 184 B4. Sin embargo, también son posibles otras soluciones estructurales.
Preferiblemente, la capacidad y/o la velocidad de descarga de la bomba se puede controlar y/o se puede cambiar la dirección de transporte de la bomba y/o el accionamiento 202 de la bomba. Preferiblemente, el fluido se puede bombear hacia adelante o hacia atrás según se desee.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprenden preferiblemente un aparato 203 de conexión para, en particular, conectar eléctrica y/o térmicamente el cartucho 100 y/o el aparato 113 sensor.
Como se muestra en la Figura 1, el aparato 203 de conexión comprende preferiblemente una pluralidad de elementos 203A de contacto eléctrico, estando el cartucho 100, en particular el aparato 113 sensor, preferiblemente conectado o conectable eléctricamente al dispositivo 200 de análisis por los elementos 203A de contacto.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente uno o más aparatos 204 de control de temperatura, en particular elementos calefactores o elementos Peltier, para controlar la temperatura del cartucho 100 y/o tener un efecto térmico sobre el cartucho 100, en particular para calefacción y/o enfriamiento.
Los aparatos 204 de control de temperatura individuales, algunos de estos aparatos o todos estos aparatos se pueden colocar preferiblemente contra el cartucho 100, el cuerpo 101 principal, la cubierta 102, el aparato 113 sensor y/o cavidades individuales y/o puede acoplarse térmicamente a éste y/o integrarse en éste y/o en particular puede ser operado o controlado eléctricamente por el dispositivo 200 de análisis. En el ejemplo mostrado, se proporcionan en particular aparatos 204A, 204B y/o 204C de control de temperatura.
Preferiblemente, el aparato 204A de control de temperatura, denominado en lo sucesivo aparato 204A de control de temperatura de reacción, está asignado a la cavidad 109 de reacción o a una pluralidad de cavidades 109 de reacción, en particular, para que sea posible llevar a cabo una o más reacciones de amplificación y/o PCR en éste.
Preferiblemente, las cavidades 109 de reacción están controladas por temperatura de manera simultánea y/o uniforme, en particular, por medio de un aparato 204A de control de temperatura de reacción común o dos aparatos 204A de control de temperatura de reacción.
De forma particularmente preferible, la cavidad/cavidades de reacción 109 se pueden controlar por temperatura desde dos lados diferentes y/o por medio de dos o los aparatos 204A de control de temperatura de reacción que están dispuestos preferiblemente en lados opuestos.
Alternativamente, para las cavidades 109 de reacción, cada cavidad 109 de reacción puede controlar la temperatura de forma independiente y/o individual.
El aparato 204B de control de temperatura, denominado en lo sucesivo aparato 204B intermedio de control de temperatura, se asigna preferiblemente a la cavidad 110 intermedia de control de temperatura y/o está diseñado para controlar la temperatura de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura o un fluido ubicado en la misma, en particular, los productos de amplificación V, preferiblemente a una temperatura de precalentamiento TV.
La cavidad 110 intermedia de control de temperatura y/o el aparato 204B de control de temperatura están preferiblemente dispuestos corriente arriba o (inmediatamente) antes del aparato 113 sensor, en particular, para que sea posible controlar la temperatura o precalentar, de una manera deseada, los fluidos a alimentar al aparato 113 sensor, en particular analitos A y/o productos V de amplificación, de forma particularmente preferible inmediatamente antes de que dichos fluidos sean alimentados.
De forma particularmente preferible, la cavidad 110 intermedia de control de temperatura y/o el aparato 204B de control de temperatura están diseñados o destinados a desnaturalizar la muestra P o los analitos A y/o los productos V de amplificación producidos, y/o dividir cualesquiera analitos A de doble cadena y/o productos V de amplificación en cadenas simples y/o para contrarrestar la unión prematura y/o la hibridación de los productos V de amplificación, en particular mediante la adición de calor.
La cavidad 110 intermedia de control de la temperatura es preferiblemente alargada y/o está diseñada como un canal que es en particular sinuoso o serpenteante y/o plano en sección transversal. Ventajosamente, se obtiene así un tiempo de retención suficientemente largo del fluido y o un acoplamiento térmico suficientemente grande con el fluido en la cavidad intermedia 110 de control de temperatura para lograr el control de temperatura deseado, por ejemplo, sin cambiar la velocidad de flujo o también mientras el fluido fluye a través de dicha cavidad. Sin embargo, también son posibles aquí otras soluciones, en particular aquellas en las que se detiene el flujo de fluido en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Preferiblemente, la longitud de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura es de al menos 10 mm o 15 mm, de forma particularmente preferible al menos 20 mm o 25 mm, en particular 30 mm o 40 mm, y/o como máximo 80 mm o 75 mm, de forma particularmente preferible como máximo 70 mm o 65 mm, en particular como máximo 60 mm. Preferiblemente, la cavidad 110 intermedia de control de temperatura tiene un volumen de al menos 10 pl o 20 pl, de forma particularmente preferible de al menos 25 pl o 30 pl, y/o como máximo 500 pl o 400 pl, de forma particularmente preferible como máximo 350 pl o 300 pl.
La cavidad 110 intermedia de control de temperatura comprende una entrada 110A y una salida 110B, una válvula 115, en particular una válvula 115A inicialmente abierta, que se asigna preferiblemente a (cada una de) la entrada 110A y/o la salida 110B, como se muestra en la Figura 1. De esta manera, se puede controlar el flujo del fluido a través de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura. Por ejemplo, es así posible controlar la temperatura de un fluido que fluye a través de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura mientras fluye a través y/o para inicialmente llenar la cavidad 110 intermedia de control de temperatura con un fluido a ser controlado por temperatura y para cerrar la válvula 115A del lado de entrada y/o del lado de salida con el fin de detener el fluido en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura con el propósito de control de temperatura y para sólo posteriormente pasar dicho fluido.
Preferiblemente, la cavidad 110 intermedia de control de temperatura está dispuesta (fluídicamente) entre la cavidad/cavidades 109 de reacción y el aparato 113 sensor y/o (todas) las cavidades 109 de reacción están fluídicamente conectadas o son conectables al aparato 113 sensor, de forma preferiblemente exclusiva, por medio de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Preferiblemente, la cavidad 110 intermedia de control de temperatura está dispuesta más cerca del aparato 113 sensor que de la cavidad/cavidades 109 de reacción. En particular, la distancia o trayectoria de flujo entre la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, en particular la salida 110B del mismo, y el aparato 113 sensor es más corta que la distancia o trayectoria de flujo entre la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, en particular la entrada 110A del mismo, y la cavidad/cavidades 109 de reacción.
La cavidad 110 intermedia de control de temperatura está diseñada preferiblemente para controlar activamente la temperatura, de forma particularmente preferible, para calentar fluidos, en particular, los productos de amplificación V, preferiblemente hasta un punto de fusión o temperatura de fusión, como se explica con mayor detalle a continuación. El aparato 204B intermedio de control de temperatura asignado a la cavidad 110 intermedia de control de temperatura está diseñado preferiblemente para controlar (activamente) la temperatura, en particular calentar, la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Preferiblemente, el aparato 204B intermedio de control de temperatura comprende un elemento calefactor, en particular una resistencia calefactora o un elemento Peltier, o está formado por éste.
El aparato 204B intermedio de control de temperatura es preferiblemente plano y/o tiene una superficie de contacto que es preferiblemente alargada y/o rectangular que permite la transferencia de calor entre el aparato 204B intermedio de control de temperatura y la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Preferiblemente, el aparato 204B intermedio de control de temperatura puede colocarse externamente contra, en particular presionado contra, el cartucho 100, el cuerpo 101 principal y/o la cubierta 102, en la región de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura o en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, preferiblemente sobre toda la superficie de la misma.
En particular, el dispositivo 200 de análisis comprende el aparato 204B intermedio de control de temperatura. Sin embargo, también son posibles otras soluciones estructurales en las que el aparato 204B intermedio de control de temperatura está dispuesto en el cartucho 100 o integrado en el cartucho 100, en particular, en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Preferiblemente, el sistema 1 de análisis, el dispositivo 200 de análisis y/o el cartucho 100 y/o uno o cada aparato 204 de control de temperatura comprenden/comprenden un detector de temperatura y/o un sensor de temperatura (no mostrado), en particular con el fin de hacer posible controlar y/o controlar por retroalimentación la temperatura. Uno o más sensores de temperatura pueden, por ejemplo, asignarse a las porciones 116 de sensor y/o a porciones de canal o cavidades individuales, es decir, pueden acoplarse térmicamente a las mismas.
De forma particularmente preferible, se asigna un sensor de temperatura a cada aparato 204A, 204B y/o 204C de control de temperatura, por ejemplo, para medir la temperatura de los respectivos aparatos 204 de control de temperatura y/o las superficies de contacto de los mismos.
El aparato 204C de control de temperatura denominado en lo sucesivo como aparato 204C de control de temperatura sensor, está en particular asignado al aparato 113 de sensor y/o está diseñado para controlar la temperatura de los fluidos ubicados en o sobre el aparato 113 sensor en particular los analitos A y/o los productos V de amplificación, reactivos o similares, de una manera deseada, preferiblemente a una temperatura de hibridación TH.
El aparato 204C de control de temperatura del sensor comprende, preferiblemente, un elemento calefactor, en particular, una resistencia calefactora o un elemento Peltier, o está formado por éste.
El aparato 204C de control de temperatura de sensor es preferiblemente plano y/o tiene una superficie de contacto que es preferiblemente rectangular y/o corresponde a las dimensiones del aparato 113 sensor, permitiendo la superficie de contacto la transferencia de calor entre el aparato 204C de control de temperatura de sensor y el aparato 113 sensor.
Preferiblemente, el dispositivo 200 de análisis comprende el aparato 204C de sensor de control de temperatura. Sin embargo, también son posibles otras soluciones estructurales en las que el aparato 204C de control de temperatura de sensor está integrado en el cartucho 100, en particular en el aparato 113 sensor.
De forma particularmente preferible, el aparato 203 de conexión comprende el aparato 204C de control de temperatura de sensor, y/o el aparato 203 de conexión junto con el aparato 204C de control de temperatura de sensor puede estar conectado, en particular presionado contra, el cartucho 100, en particular el aparato 113 sensor.
De forma más particularmente preferible, el aparato 203 de conexión y el aparato 204C de control de temperatura de sensor (juntos) se pueden mover hacia y/o en relación con el cartucho 100, en particular, el aparato 113 sensor, y/o pueden colocarse contra dicho cartucho, preferiblemente para acoplar tanto eléctrica como térmicamente el dispositivo 200 de análisis al cartucho 100, en particular, el aparato 113 sensor o el soporte 113D del mismo.
Preferiblemente, el aparato 204C de control de temperatura de sensor está dispuesto centralmente en el aparato 203 de conexión o un soporte del mismo y/o está dispuesto entre los elementos 203A de contacto.
En particular, los elementos 203A de contacto están dispuestos en una región de borde del aparato 203 de conexión o un soporte del mismo, o están dispuestos alrededor del aparato 204C de control de temperatura de sensor, preferiblemente de tal manera que el aparato 203 de conexión está conectado o es conectable al aparato 113 sensor de forma térmica en el centro y eléctricamente en el exterior o en la región del borde. Sin embargo, aquí también son posibles otras soluciones.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente uno o más accionadores 205 para accionar las válvulas 115. De forma particularmente preferible, se proporcionan diferentes (tipos o grupos de) accionadores 205A y 205B que se asignan a los diferentes (tipos o grupos de) válvulas 115A y 115B para accionar cada una de dichas válvulas, respectivamente.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente uno o más sensores 206. En particular, los sensores 206A están diseñados o destinados a detectar frentes de líquido y/o flujos de fluido en el sistema 103 de fluido. De forma particularmente preferible, los sensores 206A están diseñados para medir o detectar, por ejemplo, óptica y/o capacitivamente, un frente de líquido y/o la presencia, la velocidad, el caudal másico/caudal volumétrico, la temperatura y/u otro valor de un fluido en un canal y/o una cavidad, en particular, en una porción 116 de sensor asignada respectivamente, que está formada en particular por una porción de canal plano y/o porción de canal ensanchada del sistema 103 de fluido.
De forma particularmente preferible, las porciones 116 de sensor están cada una orientadas y/o incorporadas en el sistema 103 de fluido y/o el fluido fluye contra o a través de las porciones 116 de sensor de modo que, en la posición de funcionamiento del cartucho 100, el fluido fluye a través de las porciones 116 de sensor en la dirección vertical y/o de abajo hacia arriba, con el fin de hacer posible o más fácil detectar líquido de forma fiable.
Alternativa o adicionalmente, el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente (otros o adicionales) sensores 206B para detectar la temperatura ambiente, temperatura interna, humedad atmosférica, posición y/o alineación, por ejemplo, por medio de un sensor GPS, y/o la orientación y/o inclinación del dispositivo 200 de análisis y/o el cartucho 100.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente un aparato 207 de control, en particular que comprende un reloj interno o base de tiempo para controlar la secuencia de una prueba y/o para recolectar, evaluar y/o emitir o proporcionar valores medidos, en particular, del aparato 113 sensor, y/o de los resultados de las pruebas y/u otros datos o valores.
El aparato 207 de control preferiblemente controla o controla por retroalimentación el accionamiento 202 de bomba, los aparatos 204 de control de temperatura y/o los accionadores 205, en particular teniendo en cuenta o dependiendo de la prueba deseada y/o los valores medidos del aparato 113 sensor y/o los sensores 206.
Generalmente, se observa que el cartucho 100, el sistema 103 de fluido y/o el transporte de fluido no operan preferiblemente sobre la base de fuerzas capilares, sino al menos esencialmente o principalmente bajo los efectos de la gravedad y/o el efecto de la bomba o aparato 112 de bombeo
En la posición de funcionamiento, los líquidos de las respectivas cavidades son preferiblemente removidos, en particular drenados, a través de la salida que se encuentra en la parte inferior en cada caso, siendo posible que el gas o el aire fluyan y/o se bombeen a las respectivas cavidades a través de la entrada que se encuentra, en particular, en la parte superior. En particular, los vacíos relevantes en las cavidades pueden así evitarse o al menos minimizarse cuando se transportan los líquidos.
Los flujos de fluido se controlan en particular activando en consecuencia la bomba o el aparato 112 de bombeo y accionando las válvulas 115.
De forma particularmente preferible, el accionamiento 202 de bomba comprende un motor paso a paso, o un accionamiento calibrado de otra manera, de modo que se pueda lograr la dosificación deseada, al menos en principio, por medio de una activación apropiada.
Adicional o alternativamente, los sensores 206A se usan preferiblemente para detectar frentes de líquido o flujos de fluido, en particular, en cooperación con las porciones 116 de sensor asignadas, con el fin de lograr la secuencia fluídica deseada y la dosificación deseada controlando en consecuencia la bomba o el aparato 112 de bomba y, en consecuencia, activando las válvulas 115.
Opcionalmente, el sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprenden un aparato 208 de entrada, tal como un teclado, una pantalla táctil o similar, y/o un aparato 209 de visualización, tal como una pantalla.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente al menos una interfaz 210, por ejemplo, para controlar, comunicar y/o enviar datos medidos o resultados de pruebas y/o para conectar con otros dispositivos, tales como una impresora, una fuente de alimentación externa o similar. Esta puede ser, en particular, una interfaz 210 cableada o inalámbrica.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprende preferiblemente una fuente 211 de alimentación, preferiblemente una batería o un acumulador, que en particular está integrado y/o conectado o es conectable externamente.
Preferiblemente, se proporciona un acumulador integrado como fuente 211 de alimentación y se (re)carga mediante un dispositivo de carga externo (no mostrado) a través de una conexión 211A y/o es intercambiable.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis comprenden preferiblemente un alojamiento 212, estando todos los componentes y/o algunos o todos los aparatos integrados preferiblemente en el alojamiento 212. De forma particularmente preferible, el cartucho 100 se puede insertar o deslizar en el alojamiento 212, y/o puede ser recibido por el dispositivo 200 de análisis, a través de una abertura 213 que en particular puede ser cerrada, tal como una ranura o similar.
El sistema 1 de análisis o el dispositivo 200 de análisis es preferiblemente portátil o móvil. De forma particularmente preferible, el dispositivo 200 de análisis pesa menos de 25 kg o 20 kg, de forma particularmente preferible menos de 15 kg o 10 kg, en particular menos de 9 kg o 6 kg.
A continuación, se dan más detalles sobre una construcción preferida del aparato 113 sensor con referencia de la Figura 3 a la Figura 6.
El aparato 113 sensor permite preferiblemente la medición electroquímica y/o el ciclo de reducción-oxidación.
En particular, el aparato 113 sensor está diseñado para identificar, detectar y/o determinar analitos A (idénticos o diferentes) unidos para capturar moléculas M o productos derivados de las mismas, en particular productos V de amplificación del analito A o diferentes analitos A.
El aparato 113 sensor comprende preferiblemente un conjunto 113A de sensores que comprende una pluralidad de regiones de sensores o campos 113B de sensores, como se muestra esquemáticamente en la Figura 3, que muestra esquemáticamente el lado de medición del aparato 113 sensor y/o el conjunto 113A de sensores. La Figura 4 es un detalle ampliado de la Figura 3. La Figura 5 muestra un lado de conexión y la figura 6 es una sección esquemática a través del aparato 113 sensor.
Preferiblemente, el aparato 113 sensor o el conjunto 113A de sensores comprenden más de 10 o 20, de forma particularmente preferible más de 50 u 80, en particular más de 100 o 120 y/o menos de 1000 u 800 campos 113B de sensores.
Preferiblemente, el aparato 113 sensor o el conjunto 113A de sensores comprende una pluralidad de electrodos 113C. Preferiblemente, al menos dos electrodos 113C están dispuestos en cada región de sensor o campo 113B de sensor. En particular, al menos dos electrodos 113C forman en cada caso un campo 113B sensor.
Los electrodos 113C son preferiblemente hechos de metal, en particular de metales nobles, como platino u oro, y/o dichos electrodos están revestidos, en particular de tioles.
Preferiblemente, los electrodos 113C tienen forma de dedos y/o encajan entre sí, como puede verse en el detalle ampliado de un campo 113B de sensor de acuerdo con la Figura 4. Sin embargo, también son posibles otras soluciones o disposiciones estructurales.
El aparato 113 sensor comprende preferiblemente un soporte 113D, en particular un chip, estando los electrodos 113C dispuestos preferiblemente sobre el soporte 113D y/o estando integrados en el soporte 113D.
El lado de medición comprende los electrodos 113C y/o es el lado que mira hacia el fluido, la muestra P, los productos de amplificación V y/o un compartimento de sensor, y/o es el lado del aparato 113 sensor y/o el soporte 113D que comprende moléculas de capturan M (como se muestra en la Figura 6) a las que se unen los analitos A y/o los productos de amplificación V.
El lado de conexión del aparato 113 sensor y/o el soporte 113D están preferiblemente opuestos al lado de medición y/o es el lado que mira en dirección opuesta al fluido, la muestra P y/o el producto de amplificación V.
De forma particularmente preferible, el lado de medición y el lado de conexión del aparato 113 sensor y/o el soporte 113D forman cada uno un lado plano del soporte 113D plano y/o en forma de placa en particular.
El aparato 113 sensor, en particular el soporte 113D, comprende preferiblemente una pluralidad de, en este caso ocho, contactos eléctricos o superficies 113E de contacto, estando los contactos 113E dispuestos preferiblemente en el lado de conexión y/o formando el lado de conexión, como se muestra en la Figura 5.
Preferiblemente, el aparato 113 sensor puede contactarse en el lado de conexión y/o por medio de los contactos 113E y/o puede conectarse eléctricamente al dispositivo 200 de análisis. En particular, puede establecerse una conexión eléctrica entre el cartucho 100, en particular el aparato 113 sensor, y el dispositivo 200 de análisis, en particular el aparato 207 de control, conectando eléctricamente los contactos 113E a los elementos 203A de contacto.
Preferiblemente, los contactos 113E están dispuestos lateralmente, en la región del borde y/o en una vista de planta o proyección alrededor de los electrodos 113C y/o el conjunto 113A de sensores, y/o los contactos 113E se extienden hasta la región borde del aparato 113 sensor, en particular de tal manera que el soporte 113D pueda contactarse eléctricamente, preferiblemente por medio del aparato 203 de conexión o los elementos 203A de contacto, que como ya se explicó, lateralmente, en la región del borde y/o alrededor del aparato 204C de control de temperatura de sensor, que preferiblemente se puede colocar en el centro o en el medio del soporte 113D.
Preferiblemente, los campos 113B de sensor están separados entre sí, como se muestra en la vista esquemática de la Figura 6. En particular, el aparato 113 sensor comprende barreras o particiones entre cada uno de los campos 113B de sensores, que preferiblemente están formados por una capa 113F hidrófoba en particular que tiene los correspondientes huecos para los campos 113B de sensores. Sin embargo, también son posibles otras soluciones estructurales.
El cartucho 100 y/o el aparato 113 sensor comprenden o forman un compartimento 118 de sensor. En particular, el compartimento 118 de sensor está formado entre el conjunto 113A de sensores, el aparato 113 sensor y/o el soporte 113D, o entre el lado de medición sobre un lado y una cubierta 117 del sensor sobre el otro lado.
El aparato 113 sensor define preferiblemente el compartimento 118 de sensor por medio de su lado de medición y/o el conjunto 113A de sensores. Por lo tanto, los electrodos 113C están en el compartimento 118 del sensor.
Preferiblemente, el cartucho 100 y/o el aparato 113 sensor comprenden la cubierta 117 del sensor, estando definido o delimitado el compartimiento 118 del sensor en particular por la cubierta 117 del sensor en el lado plano.
De manera particularmente preferida, la cubierta 117 del sensor se puede bajar sobre las particiones y/o la capa 113F para la medición real.
El aparato 113 sensor o el compartimento 118 de sensor están conectados fluídicamente al sistema 103 de fluido, en particular a la cavidad/cavidades de reacción 109, preferiblemente mediante conexiones, como una entrada 119 y una salida 120, de modo que la muestra (tratada) P, los analitos A o los productos de amplificación V pueden admitirse en el lado de medición del aparato 113 sensor o conjunto de sensores 113A.
Por lo tanto, el compartimento 118 de sensor se puede cargar con fluidos y/o dichos fluidos pueden fluir a través del mismo.
El aparato 113 sensor comprende preferiblemente una pluralidad de, en particular, diferentes moléculas de captura M, diferentes moléculas de captura M preferiblemente dispuestas y/o inmovilizadas en el (mismo) compartimiento 118 de sensor y/o en o sobre diferentes campos 113B de sensores y/o preferiblemente asignados a diferentes campos 113B de sensores.
De forma particularmente preferible, los electrodos 113C están provistos de moléculas M de captura, en este caso a través de enlaces B, en particular enlaces tiol, en particular para unir y/o detectar o identificar analitos A y/o productos V de amplificación.
Preferiblemente, se proporcionan diferentes moléculas M1 a M3 de captura para los diferentes campos 113B de sensores y/o los diferentes pares de electrodos y/o electrodos 113C, con el fin de unir específicamente diferentes analitos A y/o productos V de amplificación, en la Figura 6 los productos V1 a V3 de amplificación, en los campos 113B de sensores.
Particularmente preferiblemente, el aparato 113 sensor o el conjunto 113A de sensores permiten que los productos V de amplificación enlazados en cada campo 113B de sensores se determinen cualitativa o cuantitativamente.
Preferiblemente, el aparato 113 sensor comprende moléculas M de captura que tienen diferentes temperaturas de hibridación TH, preferiblemente para enlazar los productos V de amplificación a las correspondientes moléculas M de captura a diferentes temperaturas de hibridación TH.
Preferiblemente, las diferentes moléculas de captura M que tienen diferentes temperaturas de hibridación TH están dispuestas o inmovilizadas en o dentro del (mismo) compartimento 118 de sensor del aparato 113 sensor. Esto permite en particular una realización y/o detección muy compacta y simple o identificación de una multiplicidad de analitos A, productos de amplificación V y/o grupos por medio de o dentro de un aparato 113 sensor o compartimento 118 de sensor.
Para lograr la hibridación a las diferentes temperaturas de hibridación TH, la temperatura del aparato 113 sensor, en particular de los electrodos 113C, el soporte 113D, el compartimento 118 de sensor y/o la cubierta 117 del sensor, se puede controlar o ajustar, en al menos indirectamente, preferiblemente por medio del dispositivo 200 de análisis, en particular el aparato 204B y/o 204C de control de temperatura de sensor, como ya se ha explicado.
Preferiblemente, el aparato 204C de control de temperatura de sensor se usa para controlar la temperatura del compartimiento 118 de sensor, en este caso al estar en contacto con el lado de conexión, en particular de tal modo que se alcance la temperatura de hibridación TH deseada o requerida en el lado de medición, en el compartimento 118 del sensor y/o en el fluido.
Preferiblemente, en el estado operativo, el aparato 204C de control de temperatura de sensor descansa sobre el soporte 113D de manera plana y/o centralmente y/o de manera que esté opuesto al conjunto 113A de sensores y/o descansa sobre uno o más contactos 113E al menos en parte. Esto hace posible controlar de forma especialmente rápida y eficiente la temperatura del compartimento 118 del sensor y/o de los productos V de amplificación.
El aparato 113 sensor, en particular el soporte 113D, comprende preferiblemente al menos uno, preferiblemente una pluralidad de circuitos electrónicos o integrados, los circuitos en particular están diseñados para detectar corrientes o voltajes eléctricos que se prefieren en los campos 113B de sensores de acuerdo con el principio de ciclo reducciónoxidación.
De forma particularmente preferible, las señales de medición de los diferentes campos 113B de sensores son recogidas o medidas por separado por el aparato 113 sensor y/o los circuitos.
De forma particularmente preferible, el aparato 113 sensor y/o los circuitos integrados convierten directamente las señales de medición en señales o datos digitales, que pueden ser leídos en particular por el dispositivo 200 de análisis. De forma particularmente preferible, el aparato 113 sensor y/o el soporte 113D se construyen como se describe en la EP 1636 599 B1.
A continuación, una secuencia preferida de una prueba o análisis que utilizan el sistema 1 de análisis propuesto y/o el dispositivo 200 de análisis y/o el cartucho 100 propuesto y/o de acuerdo con el método propuesto se explica con mayor detalle por medio de ejemplo.
El sistema 1 de análisis, el cartucho 100 y/o el dispositivo 200 de análisis están diseñados preferiblemente para llevar a cabo el método propuesto.
Durante el método propuesto para analizar una muestra P, al menos un analito A de la muestra P es preferiblemente amplificado o copiado, en particular mediante PCR. El analito A amplificado y/o los productos de amplificación V producidos de esta forma se enlazan y/o hibridan a continuación con las correspondientes moléculas M de captura. A continuación, se detectan los productos V de amplificación enlazados, en particular mediante medición electrónica. El método puede usarse en particular en el campo de la medicina, en particular la medicina veterinaria, para detectar enfermedades y/o patógenos.
En el contexto del método de acuerdo con la invención, una muestra P que tiene al menos un analito A sobre la base de un fluido o un líquido del cuerpo humano o animal, en particular sangre, saliva u orina, normalmente se introduce primero en la cavidad 104 receptora a través de la conexión 104A, con el fin de detectar enfermedades y/o patógenos, siendo posible para la muestra P ser pretratada.
Una vez que se ha recibido la muestra P, la cavidad 104 receptora y/o la conexión 104A de la misma se cierran fluídicamente, en particular de manera hermética a los líquidos y/o a los gases.
Preferiblemente, el cartucho 100 junto con la muestra P se enlaza o conecta entonces al dispositivo 200 de análisis, en particular se inserta o desliza en el dispositivo 200 de análisis.
La secuencia del método, en particular el flujo y transporte de los fluidos, el mezclado y similares, se controlan mediante el dispositivo 200 de análisis o el aparato 207 de control, en particular consecuentemente activando y accionando el accionamiento 202 de bomba o el aparato 112 de bomba y o los accionadores 205 o válvulas 115. Preferiblemente, la muestra P, o algo de o un sobrenadante de la muestra P, se retira de la cavidad 104 receptora a través de la salida 104C y/o la conexión 104D intermedia y se alimenta a la cavidad 107 de mezcla de manera medida. Preferiblemente, la muestra P en el cartucho 100 se dosifica, en particular en o por medio de la primera cavidad 105A dosificadora y/o la segunda cavidad 105B dosificadora, antes de ser introducida en la cavidad 107 de mezcla. Aquí, en particular, las porciones 116 de sensor de corriente arriba y/o corriente abajo se utilizan junto con los sensores 206 asignados con el fin de hacer posible la medición deseada. Sin embargo, también son posibles otras soluciones. En la cavidad 107 de mezcla, la muestra P se prepara para análisis adicional y/o se mezcla con un reactivo, preferiblemente con un reactivo líquido F1 de una primera cavidad 108A de almacenamiento y/o con uno o más reactivos secos S1, S2 y/o S3, que se proporcionan preferiblemente en la cavidad 107 de mezcla.
Los reactivos líquidos y/o secos se pueden introducir en la cavidad 107 de mezcla antes y/o después de la muestra P. En el ejemplo mostrado, los reactivos secos S1 a S3 se introducen preferiblemente en la cavidad 107 de mezcla previamente y opcionalmente se disuelven por la muestra P y/o el reactivo líquido F1.
El reactivo líquido F1 puede ser en particular un reactivo, en particular una mezcla maestra de PCR, para la reacción de amplificación o PCR. Preferiblemente, la mezcla maestra de PCR contiene agua libre de nucleasas, enzimas para llevar a cabo la PCR, en particular al menos una ADN polimerasa, nucleósido trifosfatos (NTP), en particular desoxinucleótidos (dNTP), sales, en particular cloruro de magnesio y/o tampones de reacción.
Los reactivos secos S1, S2 y/o S3 pueden igualmente ser reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación o PCR, que se encuentran en forma seca, en particular liofilizada. Preferiblemente, los reactivos secos S1, S2 y/o S3 se seleccionan en particular entre enzimas liofilizadas, preferiblemente ADN polimerasas, NTP, dNTP y/o sales, preferiblemente cloruro de magnesio.
La disolución o mezcla en la cavidad 107 de mezcla tiene lugar o es asistida en particular por la introducción y/o insuflación de gas o aire, en particular desde el fondo. Esto se lleva a cabo en particular bombeando en consecuencia gas o aire en el circuito por medio de la bomba o el aparato 112 de bombeo.
Posteriormente, un volumen deseado de la muestra P que es mezclada y/o pretratada en la cavidad 107 de mezcla preferiblemente se alimenta a una o más cavidades 109 de reacción, de forma particularmente preferible a través de (respectivamente) una de las cavidades 106A a 106C intermedias opcionales, corriente arriba y/o con diferentes reactivos o cebadores, en este caso reactivos secos S4 a S6, agregándose o disolviéndose.
De forma particularmente preferible, la muestra P (premezclada) se divide en varias porciones de muestra, preferiblemente de igual tamaño, y/o se divide entre las cavidades 106A a 106C intermedias y/o las cavidades 109 de reacción, preferiblemente de manera uniforme y/o en porciones de muestra de igual tamaño.
Diferentes reactivos, en el presente caso reactivos secos S4 a S6, de forma especialmente preferente cebadores, en particular los necesarios para la PCR o PCR, en particular grupos de cebadores diferentes en este caso, son preferiblemente añadidos a la muestra (pretratada) P en las cavidades 106A a 106C intermedias y/o las diferentes cavidades 109 de reacción, respectivamente.
Los cebadores en los diferentes grupos difieren en particular en términos de las temperaturas de hibridación de los productos de amplificación V producidos por los respectivos cebadores. Como resultado, en particular se producen las diferentes temperaturas de grupo de los grupos de analitos A y/o productos de amplificación V, como ya se mencionó al principio.
De manera particularmente preferible, los cebadores marcadores se utilizan en el sentido ya especificado al principio. En la realización mostrada, los reactivos o cebadores S4 a S6 están contenidos en las cavidades 106A a 106C intermedias. Sin embargo, también son posibles otras soluciones, en particular aquellas en las que los reactivos o cebadores S4 a S6 están contenidos en las cavidades 109 de reacción.
De acuerdo con una realización preferida, las cavidades 106A a 106C intermedias contienen cada una cebadores para amplificar/copiar un analito A, preferiblemente dos diferentes analitos A, y más preferiblemente tres diferentes analitos A. Sin embargo, también es posible amplificar/copiar cuatro o más analitos A diferentes por cavidad 109 de reacción. De forma particularmente preferible, las cavidades 109 de reacción se llenan sucesivamente con un volumen especificado de la muestra (pretratada) P o con las respectivas porciones de muestra a través de las cavidades 106A a 106C intermedias que están dispuestas cada una corriente arriba. Por ejemplo, la primera cavidad 109A de reacción se llena con un volumen especificado de la muestra pretratada P antes de que la segunda cavidad 109B de reacción y/o la segunda cavidad 109B de reacción se llene con ella antes de la tercera cavidad 109C de reacción.
En las cavidades 109 de reacción, las reacciones de amplificación o PCR se llevan a cabo para copiar/amplificar los analitos A. Esto se lleva a cabo en particular mediante el (los) aparato(s) 204A de control de la temperatura de reacción asignados, preferiblemente comunes, y/o preferiblemente de forma simultánea para todas las cavidades 109 de reacción, es decir, en particular utilizando los mismos ciclos y/o temperatura (curvas/perfiles).
La PCR o las PCR se llevan a cabo en base a protocolos o perfiles de temperatura que son esencialmente conocidos por un experto en la técnica. En particular, la mezcla o el volumen de muestra situado en las cavidades 109 de reacción se calienta y enfría preferiblemente cíclicamente.
Preferiblemente, los productos de ácido nucleico se producen a partir de los analitos A como productos de amplificación V en la cavidad/cavidades 109 de reacción.
Durante el pretratamiento, la reacción y/o la PCR o la amplificación, se produce directamente una etiqueta L (en cada caso) y/o se liga a los productos de amplificación V. Esto se consigue en particular utilizando cebadores correspondientes, preferiblemente biotinilados. Sin embargo, la etiqueta L también se puede producir y/o enlazar a los productos de amplificación V por separado o más tarde, opcionalmente también solo en el compartimento 118 del sensor y/o después de la hibridación.
La etiqueta L se utiliza en particular para detectar productos V de amplificación enlazados. En particular, la etiqueta L puede detectarse o la etiqueta L puede identificarse en un proceso de detección, como se explica con mayor detalle a continuación.
De acuerdo con la invención, es posible realizar una pluralidad de reacciones de amplificación o PCR en paralelo y/o independientemente entre sí utilizando diferentes cebadores S4 a S6 y/o pares de cebadores, de manera que un gran número de (diferentes) analitos A pueden copiarse o amplificarse en paralelo y analizarse posteriormente.
En particular, analitos A1 idénticos o diferentes se amplifican en la primera cavidad 109A de reacción, los analitos A2 idénticos o diferentes se amplifican en la segunda cavidad 109B de reacción y los analitos A3 idénticos o diferentes se amplifican en la tercera cavidad 109C de reacción, preferiblemente mediante reacciones de amplificación, en particular las PCR, que se ejecutan en paralelo.
De forma particularmente preferible, los analitos A1 a A3 son diferentes entre sí, en particular de tal modo que un gran número de analitos A diferentes pueden amplificarse y/o analizarse mediante el método. Preferiblemente, más de 2 o 4, de forma particularmente preferible más de 8 u 11, en particular más de 14 o 17, los analitos A se pueden probar y/o amplificar, en particular al mismo tiempo.
En particular, se forman y/o producen una pluralidad de grupos de productos de amplificación V de los analitos A, preferiblemente en paralelo y/o independientemente entre sí y/o en las cavidades 109 de reacción. Por lo tanto, por ejemplo, se forma y/o produce un primer grupo de productos de amplificación V1 de los analitos A1 en la primera cavidad 109A de reacción, se forma y/o produce un segundo grupo de productos de amplificación V2 de los analitos A2 en la segunda cavidad 109B de reacción, y se forma y/o produce un tercer grupo de productos de amplificación V3 de los analitos A3 en la tercera cavidad 109C de reacción opcional.
De forma particularmente preferible, se forman grupos de analitos (amplificados) A y/o productos de amplificación V que tienen diferentes temperaturas de grupo en el sentido mencionado al principio. Por lo tanto, los grupos tienen preferiblemente diferentes temperaturas de hibridación (óptimas) TH y/o intervalos de temperaturas de hibridación. Preferiblemente, diferentes grupos de analitos A y/o productos de amplificación V, es decir, en particular productos y/o secuencias de ácidos nucleicos, se amplifican y/o forman así para la prueba, siendo posible que los diferentes grupos sean en particular amplificados y/o formados y/o proporcionados en las diferentes cámaras 109A a 109C de reacción, pero alternativamente también de manera diferente.
Después de llevar a cabo la PCR y/o la amplificación, los correspondientes volúmenes de fluido y/o los productos de amplificación V y/o los grupos se conducen fuera de las cavidades de reacción 109 en sucesión al aparato 113 sensor y/o al compartimento 118 de sensor, en particular a través de una cavidad 106E, 106F o 106G intermedia específica de grupo y/o separada (respectivamente) y/o a través de la opcional (común) cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Las cavidades 106E a 106G intermedias pueden contener más reactivos, en este caso reactivos secos S9 y S10, respectivamente, para preparar los productos de amplificación V para la hibridación, por ejemplo, un tampón, en particular un tampón s Sc , y/o sales para acondicionamiento adicional. Sobre esta base, se puede llevar a cabo un acondicionamiento adicional de los productos de amplificación V, en particular para mejorar la eficacia de la hibridación posterior (unión a las moléculas de captura M). De manera particularmente preferida, el pH de la muestra P se ajusta u optimiza en las cavidades 106E a 106G intermedias y/o por medio de los reactivos secos S9 y S10.
Preferiblemente, la muestra P o los analitos A y/o los productos de amplificación V o los grupos así formados están, en particular inmediatamente antes de ser alimentados al aparato 113 sensor y/o entre las cavidades 109 de reacción y el aparato 113 sensor, activamente controlados por temperatura (en particular por adelantado y/o antes de ser controlados por temperatura en el aparato 113 sensor), preferiblemente precalentados, en particular por medio de y/o en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura y/o por medio del aparato 204B de control de temperatura intermedio.
Preferiblemente, los grupos y/o analitos A o productos de amplificación V de las cavidades de reacción individuales 109 son activamente controlados por temperatura (en particular por adelantado y/o antes de ser controlados por temperatura en el aparato 113 sensor) y/o alimentados a la cavidad 110 intermedia de control de temperatura en sucesión. Los grupos se alimentan en particular al aparato 113 sensor y/o al compartimento 118 de sensor en sucesión sometido a control de temperatura, en particular por adelantado y/o antes de ser controlado por temperatura en el aparato 113 sensor.
La Figura 7 muestra una curva o perfil esquemático ejemplar para la temperatura T de la muestra P en función de la posición X en o sobre el cartucho 100.
La muestra P se alimenta preferiblemente al cartucho 100 y/o la cavidad 104 receptora a o con una temperatura ambiente TU, por ejemplo, de aproximadamente 20 °C. Las reacciones de amplificación se llevan a cabo luego en las cavidades 109 de reacción, la muestra P preparada preferiblemente se calienta y enfría cíclicamente (no mostrada en la Figura 7).
Como ya se ha explicado, se producen preferiblemente una pluralidad de grupos que tienen en particular diferentes analitos A y/o productos de amplificación V y/o temperaturas de grupo o temperaturas de hibridación TH.
Los grupos y/o productos de amplificación V se alimentan entonces preferiblemente a las cavidades 106E a 106G intermedias asignadas y/o a la cavidad 110 intermedia de control de temperatura subsiguiente, preferiblemente en sucesión.
Preferiblemente, los grupos y/o productos de amplificación V se enfrían a diferentes velocidades y/o continuamente en las cavidades 109 de reacción, y/o los grupos y/o productos de amplificación V salen de las cavidades 109 de reacción en sucesión y/o a diferentes temperaturas, como se muestra esquemáticamente en la Figura 7. Sin embargo, también son posibles otras variantes de método en las que los grupos y/o productos de amplificación V también se controlan y/o mantienen a una temperatura controlada en las cavidades 109 de reacción después del final de la PCR, preferiblemente de tal forma que los grupos y/o productos de amplificación V abandonen las cavidades 109 de reacción a la misma temperatura.
Preferiblemente, los grupos y/o productos V de amplificación se enfrían en el camino hacia la cavidad 110 intermedia de control de temperatura. En este proceso, los grupos y/o productos de amplificación V pueden enfriarse de manera particularmente significativa y/o adicionalmente en las cavidades intermedias 106B a 106G absorbiendo los reactivos S9 y S10 contenidos en dichas cavidades, como se muestra en la Figura 7 mediante un salto en la curva de temperatura o perfil de temperatura entre las cavidades 109 de reacción y la entrada 110A de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, y/o en las cavidades 106 de reacción.
Preferiblemente, los grupos y/o productos de amplificación V tienen diferentes temperaturas de entrada TE en la entrada 110A de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, como se muestra en la Figura 7 en la entrada 110A, en particular si han dejado las cavidades 109A a 109C de reacción a diferentes temperaturas. Sin embargo, las temperaturas de entrada TE también pueden ser sustancialmente idénticas.
La temperatura de entrada TE en la entrada 110A corresponde preferiblemente al menos sustancialmente a la temperatura ambiente TU o es como máximo 10 °C o 5 °C por encima de la temperatura ambiente TU. Sin embargo, la temperatura de entrada TE también puede ser más alta si es necesario.
Preferiblemente, los grupos y/o productos de amplificación V se calientan (en sucesión) en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura a una temperatura de precalentamiento TV y/o punto de fusión o temperatura de fusión, alcanzándose preferiblemente la temperatura de precalentamiento TV (en el último) en la salida 110B de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Preferiblemente, la temperatura de precalentamiento TV es más alta que la temperatura de hibridación TH, y en particular al menos tan alta como el punto de fusión o la temperatura de fusión de los respectivos grupos y/o productos V de amplificación. En particular, los grupos y/o los productos V de amplificación se calientan a la temperatura de precalentamiento TV inmediatamente antes de ser alimentados al aparato 113 sensor y/o entre las cavidades 109 de reacción y el aparato 113 sensor, en particular para desnaturalizar los grupos y/o productos V de amplificación, como ya se explicó.
Como se muestra en la Figura 7, todos los grupos y/o productos de amplificación V se calientan preferiblemente a la misma temperatura de precalentamiento TV, por ejemplo, al menos 95 °C.
Sin embargo, también son posibles otras variantes de método en las que los grupos y/o productos de amplificación V se controlan por temperatura (en particular por adelantado y/o antes de ser controlados por temperatura en el aparato 113 sensor) y/o (pre)calentados a diferentes temperaturas de precalentamiento TV. En particular, la temperatura de precalentamiento TV se puede variar para cada grupo y/o dependiendo de la temperatura de hibridación requerida TH y/o la temperatura del grupo. En particular, la temperatura de precalentamiento TV del primer grupo puede ser mayor que la temperatura de precalentamiento TV del segundo y/o tercer grupo y/o la temperatura de precalentamiento TV puede disminuir de un grupo a otro.
El punto de fusión o temperatura de fusión y/o temperatura de precalentamiento TV está preferiblemente por encima de las respectivas temperaturas de hibridación TH y/o es de al menos 70 °C u 80 °C y/o como máximo 99 °C o 96 °C, en particular de manera que los enlaces de los analitos A y/o los productos de amplificación V producidos mientras tanto se disuelvan, y/o de manera que los analitos A y/o los productos de amplificación V puedan alimentarse al aparato 113 sensor en el estado desnaturalizado y/o disuelto.
Opcionalmente, los analitos A y/o los productos de amplificación V y/o los grupos de productos de amplificación V se controlan por temperatura (en particular por adelantado y/o antes de ser controlados por temperatura en el aparato 113 sensor), en particular (pre)calentado, a la temperatura de hibridación correspondiente TH antes de ser alimentados al aparato 113 sensor, preferiblemente de modo que puedan unirse directamente a las correspondientes moléculas de captura M después de ser alimentados al aparato 113 sensor.
En una variante de método alternativo, los grupos y/o productos de amplificación V se controlan activamente por temperatura, en particular se calientan (exclusivamente) en o sobre el aparato 113 sensor, y/o se llevan a la temperatura de hibridación correspondiente TH, preferiblemente únicamente por medio del aparato 204C de control de temperatura de sensor. En particular, tanto la desnaturalización de cualquier producto de amplificación hibridado V como la hibridación (subsiguiente) de los productos de amplificación V y las moléculas de captura correspondientes M pueden tener lugar en o sobre el aparato 113 sensor. En este caso, puede omitirse el control de temperatura previo (intermedio) antes del aparato 113 sensor.
En la variante de método preferida, la muestra P y/o los grupos o analitos A y/o los productos de amplificación V son, sin embargo, en particular inmediatamente antes de ser alimentados al aparato 113 sensor y/o entre las cavidades 109 de reacción y el aparato 113 sensor, controlados activamente por temperatura (en particular por adelantado y/o antes de ser controlado por temperatura en el aparato 113 sensor) y/o llevados a la temperatura de precalentamiento TV, preferiblemente por medio del aparato 204B intermedio de control de temperatura, y, después de ser alimentados al aparato 113 sensor y/o en el aparato 113 sensor, son posteriormente y/o nuevamente controlados por temperatura (en particular después de haber sido controlados por temperatura en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura) y/o llevados a la correspondiente temperatura de hibridación TH y/o temperatura de grupo, preferiblemente por medio del aparato 204C de control de temperatura de sensor. En este caso, cualquier producto V de amplificación hibridado se desnaturaliza antes de ser alimentado hacia y/o fuera del aparato 113 sensor.
En particular, en la variante de método preferida, la muestra P y/o los grupos y/o los productos V de amplificación se llevan a las respectivas temperaturas de hibridación TH y/o temperaturas de grupo en múltiples etapas o más rápidamente después de salir de la cavidad/cavidades 109 de reacción, preferiblemente los productos de amplificación V están, en una primera etapa, controlados por temperatura, en particular en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura y/o por adelantado y/o antes de ser controlados por temperatura en el aparato 113 sensor, a una temperatura por encima de la temperatura de hibridación TH y/o a la temperatura de precalentamiento TV y/o siendo desnaturalizados en el punto de fusión o temperatura de fusión, y, en una segunda etapa, siendo posteriormente y/o nuevamente controlados por temperatura, en particular calentada y/o enfriada, a la temperatura de hibridación correspondiente TH y/o la temperatura del grupo, en particular en el aparato 113 sensor y/o después de ser controlada por temperatura en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura.
Por medio del aparato 204C de control de temperatura de sensor, el aparato 113 sensor se precalienta en particular de modo que, en particular, el enfriamiento no deseado de la muestra P que se precalienta, en este caso en la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, y/o grupos, en particular por debajo de las respectivas temperaturas de hibridación TH y/o temperaturas de grupo, puede prevenirse.
De manera particularmente preferida, el aparato 113 sensor se precalienta en cada caso al menos sustancialmente a la temperatura de hibridación TH de los respectivos analitos A y/o productos de amplificación V, y/o a las respectivas temperaturas del grupo o a una temperatura ligeramente superior o más baja. Debido a la masa térmica relativamente grande del aparato 113 sensor, la temperatura deseada y/o óptima para la hibridación se puede alcanzar (rápidamente) cuando la muestra P y/o el grupo preferiblemente más caliente se alimenta al aparato 113 sensor y/o al compartimento 118 de sensor del mismo.
Los productos V de amplificación, los productos de ácido nucleico y/o los grupos de las cavidades 109 de reacción se conducen sucesivamente al aparato 113 sensor, en particular para ser detectados o determinados en el mismo. Preferiblemente, el primer grupo y/o los productos de amplificación V1 de la primera cavidad 109A de reacción se alimentan al aparato 113 sensor y/o se unen a las correspondientes moléculas M1 de captura antes del segundo grupo y/o los productos V2 de amplificación de la segunda cavidad 109B de reacción, en particular, el segundo grupo y/o los productos V2 de amplificación de la segunda cavidad 109B de reacción están enlazados a las correspondientes moléculas M2 de captura antes del tercer grupo y/o los productos V3 de amplificación de la tercera cavidad 109C de reacción.
Después de que la muestra P y/o los productos V de amplificación se alimentan al aparato 113 sensor, los productos V de amplificación se hibridan con las moléculas M de captura.
En el contexto de la presente invención, se ha probado particularmente ventajoso hibridar los productos de amplificación V y/o los grupos de los productos de amplificación V a una temperatura de hibridación TH y/o temperatura de grupo específicamente seleccionada en cada caso.
De forma particularmente preferible, las porciones de muestra y/o los productos de amplificación V de las diferentes PCR y/o de las diferentes cavidades 109 de reacción se enlazan a las moléculas de captura M, en particular en sucesión, a diferentes temperaturas de hibridación TH y/o al disminuir las temperaturas de hibridación TH y/o temperaturas de grupo.
Preferiblemente, los analitos A y/o los productos V de amplificación en un grupo tienen cada uno una temperatura de hibridación TH similar, preferiblemente al menos sustancialmente idéntica (óptima), en la cual se enlaza a las moléculas M de captura adecuadas. Sin embargo, también es posible para los analitos A y/o los productos de amplificación V en un grupo, que cada uno tenga temperaturas de hibridación TH un poco diferentes (óptimas), es decir, un intervalo de temperaturas de hibridación, como ya se explicó al principio. Por lo tanto, esto da como resultado una temperatura de hibridación TH promedio y/o óptima del grupo o un intervalo de temperatura de temperaturas de hibridación (óptimas) para este grupo. Esta temperatura de hibridación TH del grupo o este intervalo de temperatura también se conoce como la “temperatura del grupo” para abreviar.
Los grupos y/o productos V de amplificación se pueden hibridar a una temperatura de grupo y/o temperatura de hibridación Th decreciente o creciente, preferiblemente decreciente. Si se usa una temperatura de hibridación TH decreciente, se puede evitar que los productos V de amplificación que ya están unidos se desprendan de las moléculas M de captura nuevamente debido al aumento de temperatura posterior.
De manera particularmente preferida, la temperatura del grupo y/o la temperatura de hibridación TH1 del primer grupo, los productos V1 de amplificación y/o los analitos A1 es mayor que la temperatura del grupo y/o la temperatura de hibridación TH2 del segundo grupo, los productos V2 de amplificación y/o los analitos A2, y esta temperatura es a su vez mayor que la temperatura del tercer grupo y/o la temperatura de hibridación TH3 del tercer grupo, los productos V3 de amplificación y/o los analitos A3.
Se entiende por “temperatura de hibridación” en particular la temperatura a la que, en promedio, la mayoría de los analitos A y/o productos V de amplificación en los grupos respectivos se enlazan a las moléculas M de captura adecuadas.
Las temperaturas de grupo y/o las temperaturas de hibridación TH de los diferentes grupos difieren preferiblemente en aproximadamente 1 °C o más, preferiblemente más de 3 °C, en particular más de 4 °C, más preferiblemente en aproximadamente 5 °C o más.
Preferiblemente, la temperatura del grupo y/o la temperatura de hibridación TH es de al menos 40 °C o 45 °C y/o como máximo de 75 °C o 70 °C.
Preferiblemente, la temperatura del primer grupo y/o la temperatura de hibridación TH1 del primer grupo y/o productos VI de amplificación es al menos 55 °C o 58 °C, particularmente preferiblemente al menos 60 °C o 62 °C, y/o como máximo 80 °C o 78 °C, de forma particularmente preferible como máximo 75 °C o 72 °C.
Preferiblemente, la temperatura del segundo grupo y/o la temperatura de hibridación TH2 del segundo grupo y/o los productos V2 de amplificación es de al menos 40 °C o 45 °C, de forma particularmente preferible de al menos 48 °C o 52 °C, y/o como máximo 70 °C o 65 °C, de forma particularmente preferible como máximo 60 °C o 58 °C.
Preferiblemente, la temperatura del tercer grupo y/o la temperatura de hibridación TH3 del tercer grupo y/o los productos V3 de amplificación es de al menos 35 °C o 40 °C, particularmente preferiblemente al menos 42 °C o 45 °C, y/o como máximo 65 °C o 62 °C, particularmente preferiblemente como máximo 60 °C o 55 °C.
A la temperatura del primer grupo y/o la temperatura de hibridación TH1, por ejemplo, aproximadamente 60 °C, el primer grupo se enlaza particularmente bien a las moléculas M1 de captura correspondientes o adecuadas. A la temperatura del segundo grupo y/o la temperatura de hibridación TH2, por ejemplo, aproximadamente a 55 °C, el segundo grupo se enlaza particularmente bien a las moléculas M2 de captura correspondientes o adecuadas. A la temperatura del tercer grupo y/o la temperatura de hibridación TH3, por ejemplo, aproximadamente 50 °C, el tercer grupo se enlaza particularmente bien a las moléculas M3 de captura correspondientes o adecuadas.
Como se muestra en la Figura 7, los grupos y/o productos de amplificación V se enfrían en el camino desde la cavidad 110 intermedia de control de temperatura hasta el aparato 113 sensor. Dependiendo del control de temperatura por adelantado y/o de la cavidad 110 intermedia de control de temperatura, la temperatura de precalentamiento TV y/o la temperatura que prevalece cuando el fluido ingresa al aparato 113 sensor, y/o dependiendo de la temperatura del grupo y/o la temperatura de hibridación óptima TH, puede ser necesario por lo tanto controlar la temperatura individual o todos los grupos y/o productos V de amplificación o el aparato 113 sensor en diferentes grados por medio del aparato 204C de control de temperatura de sensor.
Por ejemplo, el primer grupo y/o los productos V1 de amplificación de la primera cavidad 109A de reacción están controlados por temperatura, en particular calentados en mayor medida, o enfriados en menor medida, que el segundo grupo y/o los productos V2 de amplificación de la segunda cavidad 109B de reacción y/o el tercer grupo y/o los productos V3 de amplificación de la tercera cavidad 109C de reacción.
En particular, el control de temperatura del aparato 113 sensor, en particular del soporte 113D, está adaptado para cada grupo y/o los diferentes productos V de amplificación con el fin de alcanzar las respectivas temperaturas de grupo y/o temperaturas de hibridación TH. Por ejemplo, el aparato 113 sensor o el soporte 113D se pueden calentar (o enfriar), preferiblemente por medio del elemento Peltier o del aparato 204C de control de temperatura de sensor, a diferentes temperaturas para los diferentes grupos. Este calentamiento (o enfriamiento) se puede realizar mediante un simple control o control de retroalimentación.
En el ejemplo que se muestra, la temperatura de hibridación TH1 del primer grupo está por encima de la temperatura del primer grupo a la que entra en el aparato 113 sensor, preferiblemente de modo que el primer grupo y/o los productos V1 de amplificación de la cavidad 109A de reacción tienen que calentarse para la hibridación, por ejemplo, más de 2 °C a 5 °C.
La temperatura de hibridación TH puede, sin embargo, corresponder también a la temperatura de entrada TE o temperatura a la entrada en el aparato 113 sensor. En este caso, los grupos respectivos y/o los productos de amplificación V se mantienen a una temperatura constante en o en el aparato 113 sensor para la hibridación. En particular, el grupo y/o los productos V de amplificación ya pueden ser alimentados al aparato 113 sensor a la temperatura de hibridación correspondiente TH, como se muestra en la Figura 7 para el segundo grupo y/o los productos V2 de amplificación de la segunda cavidad 109B de reacción.
Además, es posible que la temperatura de entrada TE o la temperatura de entrada en el aparato 113 sensor sea mayor que la temperatura de hibridación TH de los respectivos grupos y/o de los productos V de amplificación. En este caso, los grupos respectivos y/o los productos V de amplificación se enfrían o (ligeramente) se controlan por temperatura en o sobre el aparato 113 sensor para la hibridación de modo que la temperatura se reduce a la temperatura de hibridación requerida TH, en particular a una velocidad especificada, como se muestra en la Figura 7 para el tercer grupo y/o los productos V3 de amplificación de la tercera cavidad 109C de reacción.
De acuerdo con la invención, se puede prever tanto que la temperatura de hibridación TH se cambie en etapas, por ejemplo, en incrementos de diversos grados Celsius y/o en incrementos de 5 °C, como que se cambie la temperatura de hibridación TH, en particular de forma reducida, continua y/o gradualmente durante la hibridación de un grupo o al menos un analito A y/o producto V de amplificación.
En otra variante del método, se puede prever que los respectivos grupos y/o productos V de amplificación en los respectivos grupos se controlen por temperatura de manera diferente, y/o se varíe la temperatura en o sobre el aparato 113 sensor para la hibridación de los productos V de amplificación en uno de los grupos, preferiblemente con el fin de unir los diferentes productos V de amplificación en los respectivos grupos a las correspondientes moléculas M de captura a diferentes temperaturas de hibridación TH respectivamente.
Una vez que la muestra P, los grupos, los analitos A y/o los productos V de amplificación se hibridan y/o se enlazan a las moléculas M de captura, sigue la detección, en particular por medio de los marcadores L preferiblemente proporcionados, o de otra manera.
A continuación, se describe con mayor detalle una variante particularmente preferida de la detección, específicamente la detección electroquímica, pero también se pueden realizar otros tipos de detección, por ejemplo, detección óptica, detección capacitiva o similares.
Después de los respectivos enlaces/ hibridaciones, preferiblemente tiene lugar un proceso de lavado opcional y/o se alimentan opcionalmente reactivos o líquidos adicionales, en particular de las cavidades 108B a 108E de almacenamiento.
En particular, se puede prever que se eliminen los residuos de la muestra y/o los productos de amplificación no enlazados V, los reactivos y/o los restos de la PCR y otras sustancias que puedan alterar el resto de la secuencia del método.
El lavado o enjuague puede tener lugar en particular usando un fluido y/o reactivo F3, en particular un tampón de lavado, de manera particularmente preferible un tampón de citrato de sodio o tampón SSC, que está contenido preferiblemente en la cavidad 108C de almacenamiento. Los analitos A no unidos y/o los productos V de amplificación, y las sustancias que podrían interrumpir la detección posterior, se retiran preferiblemente del aparato 113 sensor y/o se alimentan a la cavidad 111 de recolección mediante el tampón de lavado.
Posteriormente y/o después del proceso de lavado, de acuerdo con una variante preferida del método, tiene lugar la detección de los productos V de amplificación unidos a las moléculas M de captura.
Para detectar los productos V de amplificación unidos a las moléculas M de captura, se alimenta un reactivo F4 y/o moléculas D detectoras, en particular fosfatasa alcalina/estreptavidina, al aparato 113 sensor, preferiblemente desde la cavidad 108D de almacenamiento.
Los reactivos F4 y/o las moléculas D detectoras pueden unirse a los productos V de amplificación enlazados, en particular al marcador L de los productos V de amplificación enlazados, de forma particularmente preferible al marcador de biotina, como se muestra en la Figura 6.
En el contexto de la detección, también se puede suministrar que se alimenten reactivos F3 y/o F5 líquidos adicionales desde las cavidades 108C y/o 108E de almacenamiento al aparato 113 sensor.
Opcionalmente, posteriormente o después de que los reactivos F4 y/o las moléculas D detectoras se hayan enlazado a los productos V de amplificación y/o los marcadores L, tiene lugar un proceso (adicional) de lavado y/o enjuague, preferiblemente por medio del fluido y/o reactivo F3 y/o tampón de lavado, en particular para eliminar los reactivos F4 no enlazados y/o moléculas D detectoras del aparato 113 sensor.
Preferiblemente, un reactivo S7 y/o S8 y/o el sustrato SU para la detección, en particular desde la cavidad 106D de almacenamiento, se alimenta por último al aparato 113 sensor, preferiblemente junto con un fluido o reactivo F2 (en particular un tampón), que es adecuado para el sustrato SU, de forma particularmente preferible para disolver el reactivo S7 y/o s 8 y/o el sustrato SU, extrayéndose el fluido o reactivo F2 de la cavidad 106B de almacenamiento. En particular, el reactivo S7 y/o S8 puede formar o puede comprender el sustrato SU.
Después de añadir el sustrato SU, la cubierta 117 del sensor se baja preferiblemente para aislar los campos 113B del sensor entre sí y/o minimizar el intercambio de sustancias entre ellos.
Preferiblemente, se usa p-aminofenilfosfato (pAPP) como sustrato SU.
El sustrato SU reacciona preferiblemente sobre y/o con los productos de amplificación enlazados V y/o las moléculas D detectoras y/o permite que estos se midan electroquímicamente.
Preferiblemente, el sustrato SU se divide por las moléculas D detectoras enlazadas, en particular la fosfatasa alcalina de las moléculas D detectoras enlazadas, preferiblemente en una primera sustancia sA, tal como p-aminofenol, que es en particular electroquímicamente activa y/o el activo de reducción-oxidación, y una segunda sustancia SP, tal como el fosfato.
Preferiblemente, la primera sustancia SA o electroquímicamente activa se detecta en el aparato 113 sensor o en los campos 113B de sensor individuales mediante medición electroquímica y/o el ciclo reducción-oxidación.
De forma particularmente preferible, por medio de la primera sustancia SA, específicamente tiene lugar una reacción de reducción-oxidación en los electrodos 113C, la primera sustancia SA preferiblemente descarga electrones o recibe electrones de los electrodos 113C.
En particular, la presencia de la primera sustancia SA y/o las cantidades respectivas en los respectivos campos 113B de sensores es detectada por las reacciones reducción-oxidación asociadas. De esta manera, se puede determinar cualitativamente y en particular también cuantitativamente si y cuántos analitos A y/o productos V de amplificación están unidos a las moléculas M de captura en los respectivos campos 113B de sensores. En consecuencia, esto proporciona información sobre qué analitos A están o estuvieron presentes en la muestra P y, en particular, también proporciona información sobre la cantidad de dichos analitos A.
En particular, mediante la reacción de reducción-oxidación con la primera sustancia SA, se genera una señal de corriente eléctrica o señal de potencia en los electrodos 113C asignados, siendo detectada preferiblemente la señal de corriente o señal de potencia mediante un circuito electrónico asignado.
Dependiendo de la señal de corriente o señal de potencia de los electrodos 113C que se genera de esta manera, se determina si y/o dónde se ha producido la hibridación con las moléculas M de captura.
La medición se realiza preferiblemente una sola vez y/o para todo el conjunto 113A de sensores y/o para todos los campos 113B de sensores, en particular simultáneamente o en paralelo. En particular, los grupos enlazados y/o productos V de amplificación de todos los grupos y/o cavidades 109 de reacción se detectan, identifican o determinan simultáneamente o en paralelo en un proceso de detección único o común.
En otras palabras, los productos V de amplificación de las cavidades 109 de reacción individuales que están enlazados a temperaturas diferentes y/o específicamente seleccionadas de hibridación TH se detectan juntos y/o en paralelo, de modo que es posible una medición rápida y no obstante también se consigue una alta especificidad, en relación con la hibridación de los analitos A y/o de los productos V de amplificación con las moléculas M de captura, sobre la base de la temperatura de hibridación TH que se ajusta de forma específica en cada caso.
Sin embargo, en principio, también es posible medir una pluralidad de porciones de muestra en el aparato 113 sensor o en una pluralidad de aparatos 113 sensor en sucesión o por separado.
Los resultados de la prueba o los resultados de la medición se transmiten en particular eléctricamente al dispositivo 200 de análisis o al aparato 207 de control del mismo, preferiblemente por medio del aparato 203 de conexión eléctrica, y en consecuencia se preparan, analizan, almacenan, visualizan y/o emiten, en particular por el aparato 209 de visualización y/o la interfaz 210.
Una vez realizada la prueba, el cartucho 100 se desconecta del dispositivo 200 de análisis y/o se libera o expulsa del mismo, y en particular se desecha.
Los aspectos y características individuales de la presente divulgación y los pasos del método individuales y/o las variantes del método pueden implementarse independientemente entre sí, pero también en cualquier combinación y/u orden deseados.
Lista de signos de referencia
1 Sistema de análisis
100 Cartucho
100A Frontal
101 Cuerpo principal
102 Cubierta
103 Sistema de fluido
104 Cavidad receptora
104A Conexión
104B Entrada
104C Salida
104D Conexión intermedia
105 Cavidad dosificadora
105A Primera cavidad dosificadora
105B Segunda cavidad dosificadora
106(A-G) Cavidad intermedia
107 Cavidad de mezcla
108(A-E) Cavidad de almacenamiento
109 Cavidad de reacción
109A Primera cavidad de reacción
109B Segunda cavidad de reacción
109C Tercera cavidad de reacción
110 Cavidad intermedia de control de temperatura
110A Entrada
110B Salida
111 Cavidad de recolección
112 Aparato de bomba
113 Aparato de sensor
113A Conjunto de sensores
113B Campo de sensores
113C Electrodo
113D Soporte
113E Contacto
113F Capa
114 Canal
114A Derivación
115 Válvula
115A Válvula inicialmente cerrada
115B Válvula inicialmente abierta
116 Porción de sensor
117 Cubierta de sensor
118 Compartimiento de sensor
119 Entrada
120 Salida
200 Dispositivo de análisis
201 Receptáculo
202 Accionamiento de bomba
203 Aparato de conexión
203A Elemento de contacto
204 Aparato de control de temperatura
204A Aparato de control de temperatura de reacción 204B Aparato de control de temperatura intermedio 204C Aparato de control de temperatura de sensor 205 (válvula) Accionador
205A (válvula) Accionador para 115A
205B (válvula) Accionador para 115B
206 Sensor
206A Sensor de fluido
206B Otro sensor
207 Aparato de control
208 Aparato de entrada
209 Aparato de visualización
210 Interfaz
211 Fuente de alimentación
211A Conexión
212 Alojamiento
213 Abertura
A(1-3) Analito
B Enlace
D Molécula de detección
F(1-5) Reactivo líquido
L Etiqueta
M(1-3) Molécula de captura
P Muestra
S(1-10) Reactivo seco
SA Primera substancia
SP Segunda substancia
SU Sustrato
T Temperatura
TE Temperatura de entrada
TH(1-3) Temperatura de hibridación
TU Temperatura ambiente
TV Temperatura de precalentamiento
V(1-3) Producto de amplificación
X Posición

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Método para analizar una muestra biológica en particular (P),
en el que los productos de amplificación (V) se forman a partir de analitos (A) de la muestra (P),
en el que los productos (V) de amplificación están enlazados a las moléculas (M) de captura correspondientes de un aparato (113) sensor que comprende un compartimento (118) de sensor y los productos (V) de amplificación unidos se detectan o identifican en un proceso de detección, caracterizado porque
un primer grupo de productos (V1) de amplificación de al menos un primer analito (A1) y un segundo grupo de productos (V2) de amplificación de al menos un segundo analito (A2) están unidos en el compartimento (118) del sensor a las correspondientes moléculas (M) de captura a diferentes temperaturas de hibridación (TH), y porque el primer grupo y el segundo grupo se alimentan al compartimento (118) del sensor y se enlazan a las correspondientes moléculas de captura (M) en sucesión
2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque los productos (V1) de amplificación del primer grupo son diferentes de los productos (V2) de amplificación del segundo grupo.
3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se amplifican diferentes analitos (A) en paralelo, independientemente entre sí y/o en diferentes cavidades (109) de reacción y/o porque el primer grupo y el segundo grupo se forman en paralelo, independientemente entre sí y/o en diferentes cavidades (109) de reacción, en particular para detectar o identificar los productos de ácido nucleico y/o productos (V) de amplificación en un proceso de detección.
4. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los analitos (A) se amplifican mediante una reacción de amplificación, en particular PCR, y/o porque se obtienen productos de ácido nucleico como productos (V) de amplificación a partir de analitos (A).
5. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el aparato (113) sensor o un conjunto (113A) de sensores o su soporte (113D) se calientan a diferentes temperaturas para los diferentes grupos.
6. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los grupos se hibridan con temperatura de hibridación (TH) decreciente y/o porque la temperatura de hibridación (TH) del primer grupo es mayor que la temperatura de hibridación (TH) del segundo grupo, preferiblemente en el que el primer grupo se alimenta al aparato (113) sensor y/o se une a las correspondientes moléculas (M) de captura antes del segundo grupo.
7. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las temperaturas de hibridación (TH) de los diferentes grupos difieren en aproximadamente 1 °C o más.
8. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los grupos comprenden cada uno productos (V) de amplificación de diferentes analitos (A), preferiblemente en los que los diferentes productos (V) de amplificación del primer grupo y segundo grupo, respectivamente, se unen a las correspondientes moléculas (M) de captura a una temperatura de hibridación común (TH), respectivamente, preferiblemente en la que las temperaturas de hibridación comunes de los diferentes grupos son diferentes, preferiblemente en al menos 1 °C.
9. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los grupos y/o productos (V) de amplificación se detectan, identifican o determinan en un proceso de detección único o común.
10. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los grupos y/o productos (V) de amplificación se controlan activamente o se precalientan antes del aparato (113) sensor y/o de la hibridación, en particular de nuevo o cuando el fluido fluye a través, en particular a una temperatura por encima de la temperatura de hibridación (TH) y/o al menos a 70 °C.
11. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el aparato (113) sensor y/o los grupos y/o productos (V) de amplificación están activamente controlados por temperatura, en particular se calientan y/o enfrían a la temperatura de hibridación (TH) en o sobre el aparato (113) sensor.
12. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primer grupo se controla por temperatura, en particular se calienta, en mayor medida, o se enfría, en menor medida, que el segundo grupo.
13. Método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se adapta de manera diferente un control de temperatura o el calentamiento del aparato (113) sensor para cada grupo con el fin de alcanzar las respectivas temperaturas de hibridación (TH).
14. Sistema (1) de análisis para probar una muestra biológica en particular (P),
el sistema (1) de análisis comprende un aparato (113) sensor con un compartimento (118) de sensor que tiene moléculas (M) de captura para enlazar analitos (A) de la muestra (P) y/o productos (V) de amplificación de analitos (A) para detectar o identificar dichos analitos (A) y/o productos (V) de amplificación en un proceso de detección, caracterizado porque
el sistema (1) de análisis comprende una pluralidad de cavidades (109) de reacción para producir diferentes productos (V) de amplificación en paralelo y/o independientemente, el compartimento (118) de sensor, estando conectado fluídicamente a las cavidades (109) de reacción, y
porque las moléculas (M) de captura dispuestas en el mismo compartimento (118) de sensores tienen diferentes temperaturas de hibridación (TH) para enlazar los analitos (A) y/o productos (V) de amplificación a las correspondientes moléculas (M) de captura a las diferentes temperaturas de hibridación (TH).
15. El sistema de análisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14, caracterizado porque el sistema (1) de análisis está diseñado para llevar a cabo el método de acuerdo con uno cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
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