ES2308807T3 - Procedimiento y kit para la identificacion de cepas de bacterias resistentes a antibioticos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la identificación de una resistencia a antibióticos en bacterias, presentando el procedimiento las siguientes etapas: (a) aislar ADN de bacterias (b) hibridar el ADN obtenido en la etapa (a) con al menos una sonda de ADN específica para secuencias sensibles a antibióticos y al menos una sonda de ADN específica para secuencias resistentes a antibióticos.
Description
Procedimiento y kit para la identificación de
cepas de bacterias resistentes a antibióticos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento y a un kit para la identificación de cepas de
bacterias resistentes a antibióticos.
La aparición de cepas de bacterias resistentes a
antibióticos, especialmente de cepas de estreptococos, representa
un problema creciente. Hasta la fecha se han realizado pruebas de
susceptibilidad a antibióticos de modo que se han aislado
bacterias, se ha sembrado un cultivo para definir la concentración
mínima inhibitoria de antibióticos en una prueba biológica. Este
procedimiento exige por lo menos de 1 a 2 días. En el plazo de este
espacio de tiempo no puede realizarse un tratamiento de manera
dirigida y por tanto tampoco de manera óptima. Por tanto existe una
necesidad de una identificación más rápida de resistencias
existentes.
El documento WO 92/04458 describe un
procedimiento y un kit para el reconocimiento de elementos
genéticos, que están asociados a la resistencia a antibióticos.
Para esto se amplifica un ácido nucleico aislado con diferentes
cebadores y se híbrida y se detecta con sondas de ADN que son
específicas para secuencias resistentes a antibióticos. Entre otras
se describe la resistencia a cefotaxima de Streptococcus
pneumoniae mediante PBP2x mutado.
El documento WO 96/08582 da a conocer un método
para estimar la resistencia bacteriana frente a antibióticos de
\beta-lactama. Para esto se pone en contacto el
ADN bacteriano con una sonda que se hibrida específicamente con el
gen de resistencia a antibióticos bacteriano.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar otros agentes y procedimientos con los que pueden
someterse a ensayo cepas de bacterias, especialmente cepas de
estreptococos, de manera rápida y fiable para determinar las
resistencias a antibióticos existentes.
Este objetivo se soluciona mediante los objetos
indicados en las reivindicaciones.
La invención se describe a continuación mediante
la resistencia a penicilina de Streptococcus pneumoniae. Sin
embargo, este principio también es válido en general de manera
correspondiente para bacterias y para resistencias frente a otros
antibióticos. A modo de ejemplo se mencionan neisserias y cepas de
MRSA (Staphylococcus aureus resistente a meticilina), que no
producen ninguna \beta-lactamasa.
Todas las cepas de S. pneumoniae
resistentes a penicilina tienen proteínas diana para penicilina
modificadas (proteínas de unión a penicilina, PBP). Las secuencias
de ADN de genes, que desempeñan un papel decisivo en el desarrollo
de la resistencia a penicilina en Streptococcus pneumoniae,
se han determinado mientras tanto en varias cepas de estreptococos
resistentes a penicilina. Se identificaron tres genes en los que
aparecen diferencias en el desarrollo de una resistencia a
penicilina entre cepas sensibles y resistentes: PBP2x, PBP1a y
PBP2b.
Una comparación de las secuencias de ADN señala,
dentro de los genes, regiones que están presentes en todas las
cepas de S. pneumoniae sensibles, pero están modificadas en
cepas resistentes. En este contexto se remite a la figura 1, en la
que se muestra que las cepas resistentes se diferencian más o menos
claramente de la cepa R6 sensible en el gen PBP2x, pero también
presentan diferencias entre sí.
Debido al conocimiento anterior de que hay
diferencias entre cepas resistentes y sensibles a penicilina dentro
de determinados genes, la solicitante desarrolló sondas de ADN con
las que pueden diferenciarse cepas sensibles y resistentes. En este
contexto se remite a la figura 4. Las sondas que son específicas
para secuencias sensibles discriminan genes que codifican para
variantes de PBP poco afines que son responsables de la resistencia
a penicilina. Las sondas que son específicas para secuencias
resistentes reaccionan con una clase de variantes de PBP que se
producen muy a menudo y pueden usarse también para fines
epidemiológicos.
La solicitante identificó las siguientes sondas
de ADN:
- a)
- Sondas específicas con respecto a la sensibilidad para PBP2x. Los números de la columna "Nucleótido" se refieren a los nucleótidos de la secuencia publicada (Laible et al., Mol. Microbiol. 5, págs. 1993-2002 (1991)). Los números entre paréntesis se refieren al codón y a la posición (1, 2 ó 3) en el codón del gen estructural. El número de bases en el nucleótido se indica con "mero"
\vskip1.000000\baselineskip
- b)
- Sondas específicas con respecto a la resistencia para PBP2x (tal como anteriormente; las secuencias entre paréntesis corresponden a los tramos correspondientes en las cepas sensibles)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- c)
- Sondas específicas con respecto a la sensibilidad para PBP1a (los números se refieren a los nucleótidos de la secuencia publicada del gen estructural; Martin et al., EMBO J. 11, págs. 3831-3836 (1992))
\vskip1.000000\baselineskip
- d)
- Sondas específicas con respecto a la resistencia para PBP1a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- e)
- Sondas específicas con respecto a la sensibilidad para PBP2b (los números se refieren a los nucleótidos de la secuencia publicada del gen estructural; Hakenbeck, R., Matrin, C., Dowsen, C., Grebe, T., J. Bacteriol. 176, págs. 5574-5577 (1996))
\vskip1.000000\baselineskip
- N = cualquier nucleótido
Las sondas anteriores o las que se difieren de
las mismas por uno o varios nucleótidos, preferiblemente hasta 4
nucleótidos, son adecuas de la mejor manera para someter a ensayo
cepas de Streptococcus pneumoniae desconocidas para
determinar resistencias frente a penicilina.
Para esto se separan por centrifugación
bacterias según la invención de una muestra y en el caso de S.
pneumoniae, se amplifican los genes de PBP (los determinantes
de resistencia) directamente por PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) tal como se describe en la bibliografía (Grebe y
Hakenbeck (1996), Antimicrob. Agents Chemother. 40, págs.
829-834). La ventaja en el caso de S.
pneumoniae consiste en que tiene lugar rápidamente una lisis
inducida por detergente y con esto puede tener lugar una PCR sin
preparaciones de ADN laboriosas. Dado que no se consigue esta etapa
en otros estreptococos, con esta etapa sólo se amplifica
específicamente ADN de pneumococos. Alternativamente se aísla ADN
bacteriano (cromosómico y/o extracromosómico) según métodos
convencionales. Este ADN se hibrida con al menos una sonda
específica con respecto a la sensibilidad y con al menos una sonda
específica con respecto a la resistencia en condiciones
convencionales, que el experto conoce de suficientemente (véase,
por ejemplo Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor, N.Y.: Cold Spring Habor Laboratory). Preferiblemente, la
hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas, tales como por
ejemplo 20ºC por debajo del punto de fusión del ADN que se hibrida.
Los oligonucleótidos se seleccionan preferiblemente de modo que
tengan temperaturas de fusión similares y por consiguiente varios
puedan someterse a pruebas en la misma mezcla de hibridación con las
mismas condiciones (véase la figura 2). Preferiblemente, los
oligonucleótidos se presentan marcados (P^{32}, S^{35}, sistema
biotina/avidina; marcado con dioxigenina (DIG); marcado con
fluoresceína) y se hibridan frente a ADN inmovilizado.
Alternativamente, los oligonucléotidos se presentan sin marcar en
una micromatriz de oligonucleótidos y el ADN que va a hibridarse se
obtiene por PCR y se marca en la amplificación.
A partir del resultado de la hibridación puede
deducirse si la cepa desconocida es sensible a antibióticos o no.
En la hibridación se usará, según el gen de resistencia, al menos
una sonda específica con respecto a la sensibilidad y una sonda
específica con respecto a la resistencia. Sin embargo, de manera
ventajosa, el ADN de la cepa desconocida se hibrida sucesivamente
con varias sondas específicas con respecto a la sensibilidad y
específicas con respecto a la resistencia, dado que una estimación
de la resistencia por medio de sólo una combinación de sondas
específicas con respecto a la sensibilidad y sondas específicas con
respecto a la resistencia puede tener errores y más bien sólo puede
servir como una estimación a grosso modo. Esto sirve especialmente
para el caso de las resistencias a penicilina en pneumococos y
neisserias.
Las condiciones de hibridación preferidas se
ajustan al contenido en AT y a la longitud de los oligonucleótidos.
La elección de las condiciones adecuadas puede realizarla el experto
con sus conocimientos técnicos. Así se utilizan por ejemplo
10-100 ng/ml de oligonucléotido marcado para PBP2x
(véase anteriormente) a una temperatura de hibridación de 45º-60ºC
al menos durante 5 horas, preferiblemente durante la noche, en
disolución de hibridación de SSC.
Los oligonucleótidos pueden usarse también como
cebador para PCR, para montar con esto una prueba de PCR (véase la
figura 3). En esta prueba puede prescindirse de la hibridación que
requiere algo más de tiempo, sin embargo deben usarse varias PCR
por cepa. Este método es adecuado sobre todo para fines
epidemiológicos.
El hecho de que se conozcan menos sondas para
PBP1a y especialmente para PBP2b, resulta del hecho de que en PBP1a
y especialmente en PBP2b son importantes regiones del gen más
pequeñas para la resistencia y por tanto también sólo las regiones
más pequeñas presentan una variación de secuencia.
La invención se refiere además a un kit para
realizar el procedimiento anterior. Este kit comprende agentes para
aislar ADN de bacterias o para amplificar por PCR determinantes de
resistencia específicos, sondas de ADN específicas con respecto a
la sensibilidad y sondas de ADN específicas con respecto a la
resistencia (liofilizadas o como micromatriz de oligonucleótidos),
reactivos, disoluciones, tampones así como agentes para hibridar y
para detectar posteriormente el ADN hibridado. Las sondas de ADN
específicas con respecto a la sensibilidad y las sondas de ADN
específicas con respecto a la resistencia son preferiblemente las
enumeradas anteriormente.
La presente invención presenta la ventaja de que
en el plazo del menor tiempo posible, es decir en el plazo de pocas
horas, pueden valorarse bacterias, especialmente pneumococos, con
respecto a la resistencia a antibióticos. Esto permite a
continuación un tratamiento dirigido y eficaz de pacientes
enfermos.
La invención se describe además mediante las
figuras que muestran:
La figura 1 muestra la comparación de tramos de
gen del gen PBP2x de Streptococcus pneumoniae entre cepas
resistentes y sensibles a penicilina; codón
85-750
R6: cepa sensible a penicilina
otras: cepas resistentes a penicilina
La figura 2 muestra la hibridación en una matriz
de oligonucleótidos
La distribución de las sondas en la matriz se
indica en el primer bloque de la figura. Los números (1) a (8) o
(I) a (IV) corresponden a la numeración de las sondas indicadas
anteriormente para PBP2x.
- A)
- Cepa R6, una cepa de laboratorio de S. pneumoniae sensible y representante de otras cepas sensibles: se reconocen todos los oligonucleótidos específicos con respecto a la sensibilidad (nº 1-8), mientras que no se conocen los cuatro oligonucleótidos específicos con respecto a la resistencia (I-IV).
- B)
- Cepa 2349, cuyo gen PBP2x pertenece a una clase de genes PBP2x que se produce muy a menudo y de manera global de pneumococos resistentes. Sólo se reconoce uno de los oligonucleótidos específicos con respecto a la sensibilidad, dado que la secuencia modificada no solapa la región en 3' del gen. No se hibridan los otros oligonucleótidos específicos con respecto a la sensibilidad (nº 2-8). Se hibridan los oligonucleótidos específicos con respecto a la resistencia (I-IV).
- C)
- Cepa J19, una cepa resistente con un PBP2x, que sólo tiene secuencias que corresponden sólo parcialmente con el de la cepa 2349. No reacciona uno de los oligonucleótidos específicos con respecto a la resistencia (III).
- D)
- Cepa Pn12, una cepa resistente de Papúa, cuyo PBP2x presenta una secuencia poco común. No reaccionan cinco de los oligonucleótidos específicos con respecto a la sensibilidad, una prueba de que el PBP2x no presenta ninguna secuencia sensible de manera continua (y por tanto proporciona resistencia). Sin embargo, tampoco reacciona ninguno de los oligonucleótidos específicos con respecto a la resistencia, lo que indica que una secuencia poco común también se encuentra en la región del gen "resistente". Cepas como éstas representan la excepción, sin embargo pueden detectarse claramente a raíz de la selección sobre todo cuando se utilizan oligonucleótidos adicionales que son específicos para otras PBP.
\newpage
La figura 3 muestra el resultado de reacciones
de PCR para amplificar ADN de R6 de S. pneumoniae como una
capa sobre un gel de agarosa. Como cebadores para PCR se utilizaron
las sondas para PBP2x indicadas con (1) a (7) anteriores como
"cebador directo" así como respectivamente la sonda (8) como
"cebador inverso". Como controles se realizaron PCR con las
sondas (I) como cebador directo y (IV) como cebador inverso o (II)
como cebador directo y (IV) como cebador inverso. M = marcador de
tamaño
Sobre el gel mostrado se reconoce claramente que
sólo las sondas específicas con respecto a la sensibilidad producen
una amplificación mientras que no tiene lugar ninguna con las sondas
específicas con respecto a la resistencia.
La figura 4 (a) - (i) Determinación de las
sondas según la invención mediante comparaciones de secuencias
La invención se describe además mediante un
ejemplo.
Se inoculan bacterias de la cepa R6 de S.
pneumoniae en medio de infusión de
cerebro-corazón (BHI) y se dejan crecer durante la
noche a 37ºC. Se separan por centrifugación las células y se lisan
mediante la resuspensión del sedimento en 10 \mul de tampón
Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, Triton-X100 al 0,05%. Por
cada 1 \mul de la suspensión celular se usan 20 \mul de mezcla
de PCR (0,2 \mul de Taq-Polimerasa, cebadores de
oligonucleótidos 1 pM cada uno, 2 \mul de tampón para PCR 10X,
MgCl_{2} 4-6 mM). Para la reacción de PCR son
suficientes 25 ciclos con 5 s de apareamiento a 96ºC, 5 s de
apareamiento a 52ºC, 10 s de extensión a 72ºC.
En las reacciones de PCR (véanse las condiciones
anteriormente) se usan las siguientes combinaciones de
cebadores:
Las denominaciones de las sondas corresponden a
los números indicados anteriormente en el caso de las secuencias
para PBP2x.
Alícuotas de 4 \mul cada una de las reacciones
de PCR se aplicaron sobre un gel de agarosa al 1,5% y se separaron
electroforéticamente. El resultado se muestra en la figura 3. A
partir de esto se deduce que R6 es una cepa sensible.
Se amplifica ADN de bacterias de R6 de S.
pneumoniae con cebadores habituales (Grebe y Hakenbeck (1996),
Antimicrob. Agents Chemotherap. 40, págs. 829-834)
en una reacción de PCR (véanse las condiciones anteriormente). Se
desnaturaliza mediante calentamiento el ADN amplificado por PCR (2
min. a 96ºC, posteriormente a 4ºC), se aplican respectivamente 2
\mul del mismo por muestra sobre una membrana de nailon. El ADN se
fija sobre la membrana mediante irradiación con luz UV de onda
larga, se saturan sitios de unión no específicos a 60ºC en
disolución de hibridación previa (6x SSC, 5x solución de Denhardt,
SDS al 0,1%, tampón fosfato de Na 50 mM, pH 6,5, ADN de esperma de
arenque 0,1 mg/ml) con agitación ligera durante 5 h. La hibridación
con las sondas de oligonucleótidos específicas con respecto a la
sensibilidad para PBP2x (1) a (8) o las sondas específicas con
respecto a la resistencia (I) a (IV) tiene lugar en tampón de
hibridación (tal como la disolución de hibridación previa, sin
embargo con una sonda de oligonucleótidos 50 ng/ml) durante la noche
a aproximadamente 50ºC. El filtro se lava 2 x 5 min. a temperatura
ambiente con 2x SSC/SDS al 0,1% a 55ºC. Se tiñen las muestras con
conjugado anti-DIG-AP según las
indicaciones del fabricante (Boehringer Mannheim). También en este
caso se muestra que sólo las sondas específicas con respecto a la
sensibilidad producen una hibridación, lo que indica que la cepa R6
de S. pneumoniae es una cepa sensible a penicilina.
Metódicamente se procede tal como anteriormente
en B1), sin embargo con la diferencia de que los oligonucleótidos
se presentan como matriz acabada y el ADN que va a hibridarse por
PCR debe marcarse por medio de DIG o nucleótidos marcados con
fluorescencia. El principio de la hibridación de micromatrices de
"alta densidad" se describe en "Nature Biotechnology 14,
págs. 1675-1680, 1996". El resultado de este
ensayo se muestra en la figura 2 A.
Claims (9)
1. Procedimiento para la identificación de una
resistencia a antibióticos en bacterias, presentando el
procedimiento las siguientes etapas:
- (a)
- aislar ADN de bacterias
- (b)
- hibridar el ADN obtenido en la etapa (a) con al menos una sonda de ADN específica para secuencias sensibles a antibióticos y al menos una sonda de ADN específica para secuencias resistentes a antibióticos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
siendo las bacterias Streptococcus pneumoniae.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
siendo la resistencia a antibióticos una resistencia a
penicilina.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, seleccionándose las sondas específicas para
secuencias sensibles a antibióticos de los siguientes
oligonucleótidos o diferenciándose de los mismos por uno o varios
nucleótidos y siendo específicas para secuencias sensibles a
antibióticos:
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, seleccionándose las sondas específicas para
secuencias resistentes a antibióticos de los siguientes
oligonucleótidos o diferenciándose de ellos por uno o varios
nucleótidos y siendo específicas para secuencias resistentes a
antibióticos:
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, estando marcadas las sondas
radiactivamente.
7. Kit para la identificación de cepas de
bacterias resistentes a antibióticos que presenta agentes para
aislar ADN de bacterias o para amplificar por PCR determinantes de
resistencia específicos, sondas de ADN específicas para secuencias
sensibles a antibióticos y sondas de ADN específicas para secuencias
resistentes a antibióticos, reactivos, disoluciones, tampones así
como agentes para hibridar y para detectar posteriormente el ADN
hibridado.
8. Kit según la reivindicación 7,
seleccionándose las sondas específicas para secuencias sensibles a
antibióticos de los siguientes oligonucleótidos o diferenciándose
de ellos por uno o varios nucleótidos y siendo específicas para
secuencias sensibles a antibióticos:
9. Kit según la reivindicación 7 u 8,
seleccionándose las sondas específicas para secuencias resistentes a
antibióticos de los siguientes oligonucleótidos o diferenciándose
de ellos por uno o varios nucleótidos y siendo específicas para
secuencias resistentes a antibióticos:
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