DE60311330T2

DE60311330T2 - Genetisches Verfahren zur Vorhersage des Glaukomarisikos

Info

Publication number: DE60311330T2
Application number: DE60311330T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Kobe Kouchi; Akinori Kobe Masago; Takayuki Kobe Takahata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-07-29
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2023-07-30
Also published as: EP1647603A3; EP1388590B1; DE60304518D1; EP1388590A2; DE60304518T2; EP1647603B1; DE60311330D1; EP1388590A3; ATE323181T1; ATE351926T1; EP1647603A2; US20040091914A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Assay-Verfahren für ein Glaukom-relevantes Gen im Feld klinischer Tests, und ein Assay-Verfahren zur Vorhersage des Risikos eines Ausbruchs des Glaukoms unter Verwendung einer Mutation (von Mutationen) im Gen als Marker. Insbesondere betrifft die Erfindung ein genetisches Assay-Verfahren, in dem zum Beispiel eine Mutation in dem Gens, das für Optineurin kodiert (im Folgenden als „OPTN" bezeichnet) und von dem bekannt ist, dass es ein Glaukom-relevantes Gen ist, nachgewiesen wird. Das Glaukom wird dabei unter Verwendung der nachgewiesenen Anomalie als ein Marker, vorhergesagt, d. h. eine Mutation einer Base oder von Basen an einer spezifischen Position oder spezifischen Positionen im Gen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Assay-Verfahren zur Vorhersage der Möglichkeit eines zukünftigen Ausbrechens des Glaukoms in einem Individuum.
Das Glaukom ist eine Erkrankung, bei der es schwierig ist, den Humor aquosus aus dem Auge abzuleiten und als ein Ergebnis davon steigt der Augeninnendruck an, was zu einem Verfall der Augenfunktionen führt. Wenn ein glaukomatöses Auge nicht behandelt wird, wird das Sichtfeld des Auges kleiner oder das Augenlicht baut ab, was schließlich zum Verlust des Augenlichts führt. Es gibt auch Fälle, wo der Augeninnendruck normal ist, aber der Sehnerv beschädigt ist.
Das Glaukom wird in 5 Erkrankungstypen unterteilt wie zum Beispiel primäres Glaukom mit offenem Winkel (Primary Open Angle Glaucoma (POAG)), Glaukom mit normalem Augeninnendruck (Normal Ocular Tension Glaucoma (NTG)), primäres Glaukom mit verschlossenem Winkel (Primary Closing Angle Glaucoma (PCAG)), angeborenes Glaukom und sekundäres Glaukom. Innerhalb der 20 % an Glaukomfällen, die genetische Ursachen haben, findet man in den meisten Fällen POAG. Gemäß einer landesweiten epidemiologischen Studie, die von der japanischen Augenarztgesellschaft, eine juristische Person, durchgeführt wurde, sind 3,56 % der Bevölkerung der 40 jährigen oder älteren Glaukompatienten.
Der Hauptrisikofaktor für Glaukom ist die familiäre Anamnese und es liegt sehr nahe, dass der Ausbruch des Glaukoms eine genetische Basis hat. Im U.S. Patent Nr. 5,789,169 (Nguyen et al.), das am 17. Mai 1996 eingereicht wurde, wird ein Gen, das für TIGR-Protein kodiert (Trabekelwerk-induzierte Glukokortikoidreaktion; trabecular meshwork-induced glucocorticoid response) als Glaukom-relevantes Gen offenbart. Das TIGR-Gen ist auch als das MYOC-Gen bekannt. Das U.S. Patent Nr. 5,789,169 (Nguyen et al.) offenbart auch die cDNA-Sequenz, die für das TIGR-Protein kodiert, das Protein selbst, Moleküle, die an das Protein gebunden sind und das Nukleinsäuremolekül, das für die gebundenen Moleküle kodiert. Das Patent stellt ferner ein Verfahren und ein Reagenz zur Verfügung, um das Glaukom, und mit dem Glaukom in Zusammenhang stehende Erkrankungen sowie andere Erkrankungen wie Erkrankungen der Herzblutgefäße, Immunerkrankungen und Erkrankungen, die durch die Expression und Aktivität des Proteins beeinflusst werden zu diagnostizieren. Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Diagnose des Glaukom in einem Individuum indem das Vorliegen einer Mutation im CYP1B1-Gen, einem der Glaukom-relevanten Gene, das als Marker für das Glaukom verwendet werden kann (internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 98/36098 A1), nachgewiesen wird. Außerdem identifizierten Rezaie, T. et al. das OPTN (Optineurin)-Gen als Glaukom-verursachendes Gen, das bekannt ist als GLC1E (Science, Feb. 8, 2002; 295(5557):1077-9). Das OPTN-Gen (Genbankeintrag NM_021980) war bisher bekannt als FIP2-Gen. Das bedeutet jedoch, dass in diesen Publikationen die Vorhersage des Risikos eines zukünftigen Ausbrechens des Glaukoms nicht offenbart ist.
Auf der anderen Seite wird in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 01/88120 A1 ein Verfahren zum Nachweis einer Mutation an Position -153 im Promotorbereich des MYOC-Gens offenbart. Es ist auch beschrieben, dass das Verfahren als Durchmusterungsverfahren nach Glaukom für einen Patienten verwendet werden kann, der/die die Angst hat, Teil einer Familienlinie zu sein, die ein erbliches Risiko für Glaukom hat, oder der/die ein Glaukomträger ist ohne Symptome entwickelt zu haben.
Das OPTN-Gen ist jedoch in WO 01/88120 A1 nicht offenbart. Da sich ein Glaukom langsam entwickelt, ist ein besseres Verfahren zur Frühdiagnose oder zur effektiveren Vorhersage der Möglichkeit eines Ausbrechens des Glaukoms wünschenswert, so dass Präventivmaßnahmen oder Maßnahmen zur Linderung des Glaukoms unternommen werden können, bevor ein ernsthafter Schaden am Sehnerv verursacht wird.
Wenn Individuen mit einem genetischen Risiko ein Glaukom zu entwickeln identifiziert werden können, und eine Untersuchung auf Glaukom auf solche Individuen konzentriert werden kann, so denkt man, dass der frühe Nachweis und die frühe Behandlung des Glaukoms effizient durchgeführt werden kann. Bezüglich einer solchen Situation ist es der Zweck dieser Erfindung, ein Assay-Verfahren zur Verfügung zu stellen, für Gene, die verwendet werden können, um wirksam das Risiko eines Ausbrechens des Glaukoms auf Basis der Untersuchung der Beziehung zwischen Glaukom-relevanten Genen und dem Ausbrechen des Glaukoms vorherzusagen.
Die Erfinder, die feststellten, dass das Ausbrechen des Glaukoms im Zusammenhang steht mit einer Mutation eines Gens (von Genen), analysierten die Gensequenz des kodierenden Bereichs des OPTN-Gens von Glaukompatienten und Nicht-Patienten und versuchten, diese zu untersuchen. Als Ergebnis fanden die Erfinder heraus, dass die Frequenzen einer Mutation, die für das (die) Gen(e) beobachtet wurde(n) sich deutlich zwischen der Patientengruppe und der Nicht-Patientengruppe unterscheiden. Außerdem fanden die Erfinder heraus, dass die Ausbruchsrate für Glaukom statistisch signifikant davon abhängt, ob die Mutation im Vergleich zur Ausbruchsrate der allgemeinen Gruppe vorliegt oder nicht, und die Erfinder vervollständigten daher die Erfindung.
Das bedeutet, die vorliegende Erfindung stellt Folgendes zur Verfügung:

1. Ein Genassay-Verfahren umfassend die Schritte: Nachweisen einer Substitution von A durch G an Position 898 im kodierenden Bereich des Optineurin (OPTN)-Gens in einer Probe, die von einem menschlichen Patienten erhalten wurde, wobei das OPTN-Gen eine Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 1 bezeichnet hat; und Vorhersagen eines zukünftigen Ausbrechens des Glaukoms im Patienten unter Verwendung der Mutation als Indikator.
2. Gen-Verfahren nach Punkt 1, wobei die Substitution mittels eines Oligonukleotids nachgewiesen wird, das ein Hybrid an einer bestimmten Position im kodierenden Bereich des OPTN-Gens bilden kann.
3. Ein Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) ein durch SEQ ID NR: 27 dargestelltes Oligonukleotid; (2) einer komplementären Kette zu einem Oligonukleotid gemäß (1); (3) ein durch SEQ ID NR: 28 dargestelltes Oligonukleotid; und (4) einer komplementären Kette zu einem Oligonukleotid gemäß (3).
4. Ein Genassay-Verfahren zum Vorhersagen eines zukünftigen Ausbruchs eines Glaukoms, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Isolieren eines Polynukleotids aus einer Probe, die von einem menschlichen Patienten erhalten wurde, (b) Durchführen eines Nukleinsäureamplifikationsprozesses mit diesem Polynukleotid unter Verwendung wenigstens eines Oligonukleotids nach Punkt 3; (c) Nachweisen einer Substitution von A durch G an Position 898 im kodierenden Bereich eines Glaukom-relevanten Gens mit einer Nukleinsäuresequenz wie sie in SEQ ID Nr: 1 bezeichnet ist; und (d) Vorhersagen eines zukünftigen Ausbruchs eines Glaukoms in dem Patienten unter Verwendung der Mutation als Indikator.
5. Das Genassay-Verfahren gemäß Punkt 1 oder 4, wobei das Glaukom ein primäres Glaukom mit offenem Winkel und/oder ein Glaukom mit normalem Augeninnendruck ist.
6. Ein Assay-Reagenz oder ein Assay-Reagenz-Kit umfassend ein Oligonukleotid nach Punkt 3.
7. Das Genassay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Glaukom ein primäres Glaukom mit offenem Winkel und/oder ein Glaukom mit normalem Augeninnendruck ist.
8. Das Genassay-Verfahren nach Punkt 1, wobei die Mutation mittels eines Oligonukleotids nachgewiesen wird, das ein Hybrid an einer bestimmten Position im kodierenden Bereich des OPTN-Gens bilden kann.
9. Ein Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) einem Oligonukleotid bestehend aus einer Basensequenz, die durch SEQ ID Nrn: 27 und 28 repräsentiert wird; (2) einer komplementären Kette eines Oligonukleotids nach (1).
10. Ein Genassay-Verfahren zum Vorhersagen eines zukünftigen Ausbruchs eines primären Glaukoms mit offenem Winkel und/oder eines Glaukoms mit normalem Augeninnendruck, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Isolieren eines Polynukleotids aus einer Probe von einem Patienten, der im Verdacht steht eine Mutation in einem Glaukom-relevanten Gen zu haben, (b) Durchführen eines Nukleinsäureamplifikationsprozesses mit diesem Polynukleotid unter Verwendung wenigstens eines Oligonukleotids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) einem Oligonukleotid bestehend aus einer Basensequenz, die durch SEQ ID Nrn: 27 und 28 repräsentiert wird; (2) einer komplementären Kette eines Oligonukleotids nach (1). (c) Nachweisen einer Mutation mindestens einer Base im kodierenden Bereich eines Glaukom-relevanten Gens; und (d) Vorhersagen eines zukünftigen Ausbruchs eines primären Glaukoms mit offenem Winkel und/oder eines Glaukoms mit normalem Augeninnendruck unter Verwendung der Mutation als Indikator.
11. Ein Assay-Reagenz oder ein Assay-Reagenz-Kit umfassend ein Oligonukleotid nach Punkt 9.

1 zeigt die Struktur des OPTN-Gens (Beispiel 1);
2 zeigt die Struktur des Exon 4 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
3 zeigt die Struktur des Exon 5 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
4 zeigt die Struktur des Exon 6 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
5 zeigt die Struktur des Exon 7 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
6 zeigt die Struktur des Exon 8 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
7 zeigt die Struktur des Exon 9 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
8 zeigt die Struktur des Exon 10 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
9 zeigt die Struktur des Exon 11 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
10 zeigt die Struktur des Exon 12 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
11 zeigt die Struktur des Exon 13 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
12 zeigt die Struktur des Exon 14 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
13 zeigt die Struktur des Exon 15 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1);
14 zeigt die Struktur des Exon 16 des OPTN-Gens und den Bezug der Positionen zwischen ihm und seinem entsprechenden Primer (Beispiel 1).
Die Erfinder bestimmten die kodierende Sequenz im kodierenden Bereich jedes Exons, das ein Glaukom-relevantes Gen festlegte, und das aus der Grundsequenz, die in SEQ ID NR:1 gekennzeichnet ist, besteht. Im Verlauf dieser Bestimmung wurde bestätigt, dass im Vergleich zwischen der Glaukompatientengruppe und der Nicht-Patientengruppe genetische Polymorphismen mit einer unterschiedlichen Frequenz im kodierenden Bereich des Gens auftreten. Außerdem hängt die Ausbruchsrate des Glaukoms davon in statistisch signifikanter Art und Weise im Vergleich zur Rate davon in der allgemeinen Gruppe ab. Die Erfindung setzt sich ausgehend von den oben erwähnten neuen Entdeckungen zusammen.
[Glaukom-relevante Gene]
Als ein Beispiel für die Glaukom-relevanten Gene kann das OPTN (Optineurin)-Gen bezeichnet werden. Die Struktur und die kodierende Sequenz des Optineurin-Gens sind wie in 1 gezeigt und wie in Tabelle 1 aufgeführt und es gibt, zum Beispiel zu transkribierende und in Protein zu translatierende Bereiche, und Nicht-translatierte Bereiche sowie andere Elemente. Die Basenpositionen des OPTN-Gens stimmen mit den Basennummern wie sie in SEQ ID NR:1 definiert sind, überein (Genbankeintragnummer AF420371, AF420372 und AF420373 ). Das OPTN-Protein enthält 13 Exons. Die Sequenz eines jeden Exons und seine Lage ist angegeben durch SEQ ID NR:2 für Exon 4, durch SEQ ID NR:3 für Exon 5, durch SEQ ID NR:4 für Exon 6, durch SEQ ID NR:5 für Exon 7, durch SEQ ID NR:6 für Exon 8, durch SEQ ID NR:7 für Exon 9, durch SEQ ID NR:8 für Exon 10, durch SEQ ID NR:9 für Exon 11, durch SEQ ID NR:10 für Exon 12, durch SEQ ID NR:11 für Exon 13, durch SEQ ID NR:12 für Exon 14, durch SEQ ID NR:13 für Exon 15, durch SEQ ID NR:14 für Exon 16. Die Übereinstimmung zwischen der Basensequenz des OPTN-Gens, dargestellt durch die Sequenz wie sie durch SEQ ID NR:1 bezeichnet wird, und der Basensequenz eines jeden Exons, wie sie dargestellt werden durch die Sequenzen bezeichnet durch SEQ ID NR 2-14, ist wie folgt. Die Positionen 501-666 in SEQ ID NR:2 entsprechen den Positionen 1-166 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-703 in SEQ ID NR:3 entsprechen den Positionen 167-369 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-683 in SEQ ID NR:4 entsprechen den Positionen 370-552 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-574 in SEQ ID NR:5 entsprechen den Positionen 553-626 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-653 in SEQ ID NR:6 entsprechen den Positionen 627-779 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-603 in SEQ ID NR:7 entsprechen den Positionen 780-882 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-616 in SEQ ID NR:8 entsprechen den Positionen 883-998 von SEQ ID NR:1, die Positionen 501-650 in SEQ ID NR:9 entsprechen den Positionen 999-1148 in SEQ ID NR:1, die Positionen 501-594 in SEQ ID NR:10 entsprechen den Positionen 1149-1242 in SEQ ID NR:1, die Positionen 501-659 in SEQ ID NR:11 entsprechen den Positionen 1243-1401 in SEQ ID NR:1, die Positionen 501-631 in SEQ ID NR:12 entsprechen den Positionen 1402-1532 in SEQ ID NR:1, die Positionen 501-580 in SEQ ID NR:13 entsprechen den Positionen 1533-1612 in SEQ ID NR:1, die Positionen 501-622 in SEQ ID NR:14 entsprechen den Positionen 1613-1734 in SEQ ID NR:1.
[Genmutation]
Eine Mutation in dem Glaukom-relevanten Gen für den Nachweis in der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Substitution einer Base an (einer) spezifischen Position(en) in der Basensequenz des OPTN-Gens. Die „spezifische Position" bezieht sich auf Position 898 der durch SEQ ID NR:1 bezeichneten Basensequenz.
Als detaillierte Substitution von Basen an spezifischen Positionen in der Erfindung sei eine Substitution von A für G an Position 898 in der Basensequenz bezeichnet durch SEQ ID NR:1 erwähnt.
[Assay-Verfahren]
Im Verfahren um die Mutation eines Glaukom-relevanten Gens abzuschätzen ist das Verfahren nicht beschränkt bezüglich des Nachweises der spezifischen Mutation des OPTN-Gens, wie hier offenbart ist, sondern verschiedene momentan bekannte Verfahren oder Verfahren, die in der Zukunft bekannt sein werden, können für den Nachweis einer relevanten Mutation verwendet werden.
Um auf die Anwesenheit einer Mutation, wie sie in dieser Erfindung offenbart ist, im OPTN-Gen eines Patienten zu prüfen, können verschiedene Verfahren zur Analyse der Basensequenzen, die die Position (die Positionen) einer möglichen Mutation enthalten, verwendet werden. Als jene Verfahren können beispielsweise das Southern Hybridisierungsverfahren, Dot Hybridisierungsverfahren (siehe J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975) etc.), Dideoxy-Basensequenz-Bestimmungsverfahren (Sanger-Verfahren), die verschiedenen Nachweisverfahren in Kombination mit DNA-Amplifizierungsansätzen [beispielsweise PCT-Restriktionsfragment Längenpolymorphismus-Analyse-Verfahren (RFLP), PCR-Einzel-Kette-höhere-Ordnung-Strukturpolymorphismus-Analyse-Verfahren (siehe Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:2766-2770 (1989) etc.), PCR-Sequenz-spezifische Oligonukleotidverfahren (SSO), Allel-spezifisches Oligonukleotidverfahren unter Verwendung von PCR-SSO- und Dot Hybrdisierungsverfahren (siehe Nature, 324:163-166 (1986) etc.)] angewandt werden. Für die Position(en) der nachzuweisenden Genmutation, wie sie in dieser Erfindung offenbart und identifiziert wird, kann der Fachmann die Mutation mit Hilfe bekannter Verfahren nachweisen.
[Zubereitung einer Probe für die Messung]
Um das OPTN-Gen eines Patienten zu analysieren, kann die zuzubereitende Probe für das Assay-Verfahren der Erfindung jede biologische Probe sein, die das OPTN-Gen des Patienten enthält, beispielsweise Gewebe, das vom lebenden Körper gewonnen wurde, Gewebe, das in einer Operation herausgeschnitten wurde und Gewebe aus der Mucosa-Membran der Mundhöhle, Blut, Serum, Exkremente, ejakulierter Samen, ausgehustetes Sputum, Speichel, Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, Haar etc. sein, ist aber nicht speziell darauf beschränkt. Beispielsweise kann das OPTN-Gen, das mittels eines bekannten Genextraktionsverfahrens wie dem Phenolchloroform-Verfahren aus einer biologischen Probe wie einem Gewebe, das mittels eines Mixers zermalmt worden war, extrahiert wurde, als zu untersuchende Probe verwendet werden. Außerdem kann das extrahierte OPTN-Gen als eine zu untersuchende Probe zubereitet werden durch Amplifizierung und Konzentrierung dessen.
Die zu untersuchende Probe kann entweder DNA voller Länge des OPTN-Gens oder ein DNA-Fragment (ein Teil der Volllängen-DNA) sein. Wenn ein DNA-Fragment untersucht wird, ist es bevorzugt, wenn das Fragment den kompletten oder einen Teil des kodierenden Bereichs von wenigstens einem (1) vorzugsweise zwei (2) oder mehr und noch bevorzugter drei (3) oder mehr Exons einschließt. Es gibt keine Begrenzung für das DNA-Fragment bezüglich seiner Basenlänge, so lange es für den Nachweis einer Genmutation verwendbar ist, d. h. so lang es eine Länge hat, die für die Messung als Proben-DNA, die für die Untersuchung einer Basenmutation zubereitet wurde, zugänglich ist. Als Basenlänge einer solchen DNA kann eine Länge von um zehn (10) oder mehr Basen und vorzugsweise um 20 oder mehr Basen ausgewählt werden. Im Allgemeinen wird eine Länge von um 100-1000 Basen und vorzugsweise um 200-300 Basen ausgewählt.
Außerdem kann die zu untersuchende Probe entweder DNA oder ein DNA-Transkriptionsprodukt sein. Insbesondere kann die Probe entweder eine Boten-RNA (mRNA) sein, die von DNA transkribiert wurde, cDNA, die im Anschluss wurde von der mRNA revers transkribiert, oder andere komplementäre DNA sein. Alle der verschiedenen Schritte, die im Nachweis-Verfahren für die Genmutation der Erfindung angewandt werden können, wie beispielsweise die Synthese von DNA oder eines DNA-Fragments; Enzymbehandlung mit dem Zweck des Schneidens, Entfernens, Hinzufügens oder Koppelns von DNA, Isolieren, Reinigen, Duplizieren und Selektieren von DNA; und Amplifizierung eines DNA-Fragments können gemäß konventioneller Verfahren durchgeführt werden (siehe Verfahren für Experimente in der molekularen Genetik, Kyouritsu Shuppan Co., LTD., 1983, etc.). Diese Schritte können nach Bedarf gemäß konventioneller Vorgehensweise modifiziert werden.
Die Amplifizierung von Nukleinsäuren um eine zu untersuchende Probe zuzubereiten, kann beispielsweise gemäß einem PCR-Verfahren oder einer ihrer Verfahrensvarianten (siehe PCR-Technologie, Takara Shuzo Co., Ltd., 1990, etc.) umgesetzt werden. In diesem Fall wird geeigneterweise ein Oligonukleotid, das in der Lage ist, spezifisch ein Hybrid an einem Teil eines Glaukom-relevanten Gens auszubilden, insbesondere ein Oligonukleotid mit Primer-Funktion, ausgewählt, so dass es spezifisch ein gewünschtes DNA-Fragment mit wenigstens einer (1) oder mehreren der oben in Bezug auf die Mutation erwähnten spezifischen Positionen amplifiziert.
[Oligonukleotid mit Primer-Funktion]
Als Oligonukleotid mit Primer-Funktion kann ein Oligonukleotid wie beispielsweise (1) ein Oligonukleotid umfassend eine Basensequenz wie sie durch SEQ ID NR: 27 oder 28 angegeben ist, (2) eine komplementäre Kette zu einem Oligonukleotid, wie es oben für (1) beschrieben ist, (3) verwendet werden.
Ein Oligonukleotid selbst kann entworfen werden mittels bekannter Verfahren, d. h. beispielsweise kann es chemisch synthetisiert werden. Es ist auch möglich natürliche Ketten von Nukleinsäuren unter Verwendung von Restriktionsenzymen etc. zu schneiden, natürliche Nukleinsäureketten zu modifizieren oder Ketten zu koppeln oder zu schneiden, so dass die natürliche Nukleinsäure sich aus einer der oben erwähnten Basensequenzen zusammensetzt. Insbesondere können Oligonukleotide unter Verwendung eines Oligonukleotidsytheseapparats (hergestellt von Applied Biosystems, Expedite Model 8909 DNA Synthesizer) etc. synthetisiert werden. Außerdem können bekannte Herstellungsverfahren als Syntheseverfahren für Oligonukleotide mit einer (1) bis zu mehreren abgeänderten Basen wie beispielsweise durch Substitution, Deletion, Insertion oder Addition verwendet werden. Die Synthese kann ausgeführt werden beispielsweise unter Verwendung des Teil-spezifischen Mutationseinführungsverfahrens, des homologen Genrekombinationsverfahrens, des Primerelongationverfahrens und des Polymerasekettenreaktionsverfahrens (PCR) oder unter Verwendung einer Vielzahl dieser Verfahren in Kombination. Außerdem kann die Synthese gemäß den Verfahren ausgeführt werden wie sie zum Beispiel in Molecular Cloning; Laboratory Manual, Zweite Auflage, herausgegeben von Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Labo Manual Genetic Engineering, herausgegeben von Masami Matsumura, Maruzen Co., Ltd., 1988; PCR Technology, The Principle and Application of DNA Amplification, herausgegeben von Ehrlich, HE., Stockton Press, 1989, etc., beschrieben sind. Außerdem kann eine modifizierte Version eines der oben erwähnten Verfahren verwendet werden, beispielsweise eine Technik nach Ulmer (Science (1983) 219:666).
Allgemein bekannte Bedingungen können als stringente Bedingungen für die Hybridsierung ausgewählt werden und als ein Beispiel dafür nach Hybridisierung über Nacht bei 42°C in einer Lösung enthaltend 50 % Formamid, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5X Denharts Lösung, 10 %-Dextranschwefelsäure und 20 μg/ml DNA, ein primärer Waschschritt in 2X SSC·0,1 % SDS auf Raumtemperatur und ein zweiter Waschschritt in 0,1X SSC·0,1 % SDS.
[Nachweis einer Mutation einer Gen-DNA]
Eine DNA-Mutation kann beispielsweise durch Bestimmung der Basensequenz des OPTN-Gens, das in der zu untersuchenden Probe enthalten ist, unter Verwendung des Sanger-Verfahrens nachgewiesen werden.
Unter Verwendung eines einkettigen Ziel OPTN-Gens, das mit einem komplementären Oligonukleotid als Primer hybridisiert, wird eine komplementäre Kette mit DNA-Polymerase in Richtung von der 5'- zur 3'-Position synthetisiert. Das als Primer verwendete Oligonukleotid ist beispielsweise ein Oligonukleotid wie oben beschrieben.
Eine komplementäre Kette wird durch Zusatz einer kleiner Menge an Didesoxyribonukleotidtriphosphorsäure (ddNTP) zu jeder Base zusätzlich zu vier (4) Arten von Desoxyribonukleotidtriphosphorsäure (dNTP) als Substrate für die Reaktion synthetisiert. ddNTP ist ein Analogon (analoge Substanz) mit einer -H-Gruppe an der 3'-Position einer Desoxyribose anstelle einer -OH-Gruppe. Wenn einmal das ddNTP anstelle des dNTP verwendet wurde, wird die komplementäre Kette nicht weiter synthetisiert und die DNAs mit verschiedenen Längen werden erhalten. Im Reaktionssystem kann die synthetisierte DNA durch Zusatz von beispielsweise einem Primer oder dNTP, der/das mit einer chemilumineszierenden Substanz oder einem radioaktiven Isotop markiert ist, markiert werden. Dann kann die Basesequenz durch Elektrophorese der Reaktionsprodukte mit denaturiertem Polyacrylamid bestimmt werden.
Als DNA-Polymerasen, die im Sanger-Verfahren verwendet werden, kann beispielsweise das Klenow-Enzym, der T7-Phage und thermophile-aus Bakterien stammende-DNA-Polymerasen aufgelistet werden. Die Exonukleaseaktivität dieser DNA-Polymerasen wird im Allgemeinen über einen gentechnischen Ansatz entfernt. Zunächst wurden die Zielgene in Form einer Einzelkette nach dem Sanger-Verfahren verwendet, aber momentan wird oft ein Verfahren verwendet, indem ein doppelkettiges Plasmid wie es ist mit Alkali denaturiert wird und im Nachweisverfahren verwendet wird.
Sequenzreaktionen können mittels des Sanger-Verfahrens oder eines Zyklussequenzierverfahrens ausgeführt werden. Das Zyklussequenzierverfahren ist ein Verfahren, das durch die Kombination des Sanger-Verfahrens und des PCR-Verfahrens gebildet wird. In diesen Verfahren muss die DNA nicht einzelkettige DNA sein. Die Reaktion wird mit DNA, einer Art von Primern, dNTPs, ddNTPs und Hitze-beständiger DNA-Polymerase im Reaktionssystem ausgeführt. Es ist in soweit genauso wie das Sanger-Verfahren, als das während der PCR-Reaktion ddNTPs aufgenommen werden, die Elogation abgebrochen wird, und als Ergebnis DNA mit denselben Basen an der 3'-terminal gelegenen Position synthetisiert wird. Als Sequenzierreaktionen für automatische Sequenzierer gibt es das Farbstoff-Primer-Verfahren, in dem der Primer mit einem Fluorophor markiert ist, das Farbstoff-Terminator-Verfahren, in dem ddNTP mit einem Fluorophor markiert ist, das interne-Markierung-Verfahren, in dem das dNTP-Substrat markiert ist, etc.
[Assay-Reagenz und Assay-Reagenz-Kit]
Die Erfindung schließt auch ein Assay-Reagenz und einen Assay-Reagenz-Kit ein, der für das Gen-Assay-Verfahren zur Vorhersage von Glaukom verwendet wird. Das Assay-Reagenz kann jedes der verschiedenen Reagenzien sein, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden wie beispielsweise einen Primer für die Amplifikation der zu untersuchenden Probe, einen Primer zur Bestimmung der Basensequenzen der zu untersuchenden Probe, verschiedene Polymerasen, Basensubstrate, Markierungsmaterialien, etc. Der Assay-Reagenz-Kit kann jeder Kit sein, indem mindestens zwei (2) der Reagenzien, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, vorliegen.
[Beispiele]
Die Erfindung wird spezifisch mit Bezug auf die Beispiele beschrieben werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf jene Beispiele beschränkt.
[Beispiel 1]
DNA-Analyse des OPTN-Gens
(1) DNA-Extraktion
Blut, das von einem Patienten zur Verfügung gestellt wurde, wurde gemäß einem konventionellen Verfahren verarbeitet und die DNA wurde aus einer eukaryotischen Zelle extrahiert. Unter Verwendung eines Kit-Produkts namens „Dr. GenTLE^TM (für Blut) (hergestellt von Takara Shuzo co., Ltd.,)" als DNA-Extraktionskit wurde DNA gemäß dem in der Bedienungsanleitung des Produkts zur Verfügung gestellten Protokolls extrahiert.
(2) Amplifikation der DNA-Matrize
Unter Verwendung der erhaltenen DNA-Extraktionslösung als Matrize wurde das OPTN-Gen in einer PCR unter Verwendung eines Kit-Produkts namens „LATaq (hergestellt von Applied Biosystems)", einem Kit für die PCR-Amplifikation, amplifiziert.
Die Sequenz eines jeden Exons von Exon 4 bis Exon 16 ist im Genbankeintrag Nr. NT_031849 offenbart und jede Sequenz ist dargestellt durch die Basensequenz des Bereichs, der wie folgt durch die Sequenzen, die durch SEQ ID NRN. 2 bis 14 bezeichnet sind, beschrieben wird.
Exon 4: SEQ ID NR:2, Positionen 501-666
Exon 5: SEQ ID NR:3, Positionen 501-703
Exon 6: SEQ ID NR:4, Positionen 501-683
Exon 7: SEQ ID NR:5, Positionen 501-574
Exon 8: SEQ ID NR:6, Positionen 501-653
Exon 9: SEQ ID NR:7, Positionen 501-603
Exon 10: SEQ ID NR:8, Positionen 501-616
Exon 11: SEQ ID NR:9, Positionen 501-650
Exon 12: SEQ ID NR:10, Positionen 501-594
Exon 13: SEQ ID NR:11, Positionen 501-659
Exon 14: SEQ ID NR:12, Positionen 501-631
Exon 15: SEQ ID NR:13, Positionen 501-580
Exon 16: SEQ ID NR:14, Positionen 501-622
Ein Oligonukleotid, wie es durch jede der Basensequenzen dargestellt ist, die durch SEQ ID NRN:15 bis 40 bezeichnet sind, wurden verwendet, um jedes Exon zu amplifizieren. Der Bezug der Positionen zwischen jedem Primer und jedem Exon ist in den 2 bis 14 gezeigt. Jeder Antisense-Primer besteht jedoch aus Sequenzen, die von einer komplementären Kette der Sequenzen ausgehen, wie sie durch SEQ ID NR:2 bis 14 bezeichnet sind.
Primer für Exon 4
Normale Kette, SF4, SEQ ID NR:15; Bereich = SEQ ID NR:2, die Positionen 337-359 Invertierte Kette, SR4, SEQ ID NR:16; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:2, Positionen 828-852.
Primer für Exon 5
Normale Kette, SF5, SEQ ID NR:17; Bereich = SEQ ID NR:3, die Positionen 304-323 Invertierte Kette, SR5, SEQ ID NR:18; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:3, Positionen 858-878.
Primer für Exon 6
Normale Kette, SF6, SEQ ID NR:19; Bereich = SEQ ID NR:4, die Positionen 302-321 Invertierte Kette, SR6, SEQ ID NR:20; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:4, Positionen 850-875.
Primer für Exon 7
Normale Kette, SF7, SEQ ID NR:21; Bereich = SEQ ID NR:5, die Positionen 261-280 Invertierte Kette, SR7, SEQ ID NR:22; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:5, Positionen 765-784.
Primer für Exon 8
Normale Kette, SF8, SEQ ID NR:23; Bereich = SEQ ID NR:6, die Positionen 349-367 Invertierte Kette, SR8, SEQ ID NR:24; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:6, Positionen 967-988.
Primer für Exon 9
Normale Kette, SF9, SEQ ID NR:25; Bereich = SEQ ID NR:7, die Positionen 244-263 Invertierte Kette, SR9, SEQ ID NR:26; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:7, Positionen 750-769.
Primer für Exon 10
Normale Kette, SF10, SEQ ID NR:27; Bereich = SEQ ID NR:8, die Positionen 251-269 Invertierte Kette, SR10, SEQ ID NR:28; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:8, Positionen 765-786.
Primer für Exon 11
Normale Kette, SF11, SEQ ID NR:29; Bereich = SEQ ID NR:9, die Positionen 325-344 Invertierte Kette, SR11, SEQ ID NR:30; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:9, Positionen 834-853.
Primer für Exon 12
Normale Kette, SF12, SEQ ID NR:31; Bereich = SEQ ID NR:10, die Positionen 354-380 Invertierte Kette, SR12, SEQ ID NR:32; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:10, Positionen 800-820.
Primer für Exon 13
Normale Kette, SF13, SEQ ID NR:33; Bereich = SEQ ID NR:11, die Positionen 333-350 Invertierte Kette, SR13, SEQ ID NR:34; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:11, Positionen 858-878.
Primer für Exon 14
Normale Kette, SF14, SEQ ID NR:35; Bereich = SEQ ID NR:12, die Positionen 268-287 Invertierte Kette, SR14, SEQ ID NR:36; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:12, Positionen 875-895.
Primer für Exon 15
Normale Kette, SF15, SEQ ID NR:37; Bereich = SEQ ID NR:13, die Positionen 326-349 Invertierte Kette, SR15, SEQ ID NR:38; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:13, Positionen 735-754.
Primer für Exon 16
Normale Kette, SF16, SEQ ID NR:39; Bereich = SEQ ID NR:14, die Positionen 299-318 Invertierte Kette, SR16, SEQ ID NR:40; Bereich = die komplementäre Sequenz von SEQ ID NR:14, Positionen 797-814.
Die PCR-Reaktion wurde so ausgeführt, dass ein Heizzyklus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C 30 Mal wiederholt wurde.
(3) Bestimmung der Basensequenz eines DNA-Fragments für jedes Exon
Die Basensequenz des DNA-Fragments, das durch die oben erwähnte PCR für jedes Exon erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenzierers ABI Prism 3100 (hergestellt von Applied Biosystems) gemäß dem in der Bedienungsanleitung des Sequenzierers zur Verfügung gestelhten Protokolls bestimmt. In diesem Verfahren wurden die zyklischen Sequenzierreaktionen entweder mit einem Vorwärtsprimer oder einem Rückwärtsprimer aus den Primern, die für die PCR-Reaktion für jedes Exon verwendet wurden, ausgeführt.
(4) Bestimmung der Basensequenz eines DNA-Fragments für jedes Exon in der Kontrollgruppe
Außerdem wurde Blut, das von einer Gruppe von Nicht-Patienten, die sich freiwillig als Kontrollgruppe zur Verfügung gesteht hatten, erhalten worden war, gemäß dem oben erwähnten Vorgehen verarbeitet und die Basensequenz, die in der Nicht-Patientengruppe dominant ist, wurde für ein DNA-Fragment eines jeden Exons bestimmt.
[Beispiel 2]
(1) Analyse des Polymorphismus der Basensequenz des OPTN-Gens
Blut, das von einem Patienten erhalten wurde, für den ein medizinisches Institut diagnostiziert hatte, dass er ein Glaukom mit offenem Winkel hat, wurde gemäß dem Vorgehen, wie es oben im Beispiel verwendet wurde, verarbeitet. Dann wurde die Basensequenz des darin enthaltenen OPTN-Gens untersucht und die Sequenz wurde mit der Grundsequenz der Nicht-Patientengruppe verglichen.
Tabelle 1 zeigt das Ergebnis des oben Erwähnten. Die erste Zeile in Tabelle 1 führt die Exon Nrn. auf, die zweite Zeile führt die SEQ ID NRN, die jedes Exon darstellen, auf, die dritte Zeile führt die Basenpositionen in jeder Sequenz auf und die vierte Zeile führt die Basenveränderungen, die als Mutation nachgewiesen wurden, auf.
Als Ergebnis wurde an Basenposition 567 in SEQ ID NR:5, d.h. der Basenposition 619 der SEQ ID NR:1 und der Basenposition 516 in SEQ ID NR:8, d.h. der Basenposition 898 in SEQ ID NR:1 nur für die Patientengruppe eine Mutation erkannt und keine Mutation in der Nicht-Patientengruppe erkannt. Tabelle 1
Wie dargelegt wurde, ist die Offenbarung, die bezüglich der Genmutation gemäß der Erfindung erhalten wurde, nützlich zur Vorhersage eines zukünftigen Ausbrechens des Glaukoms. Wenn das zukünftige Ausbrechen insbesondere von Glaukom mit offenem Winkel durch Nachweis einer Mutation im OPTN-Gen mittels eines erfindungsgemäßen Gen-Assay-Verfahrens vorhergesagt werden kann, ist es möglich, den Ausbruch der Erkrankung zu verhindern oder die Erkrankung frühzeitig zu behandeln. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Genassay-Verfahren, umfassend die Schritte: Nachweisen des Ersatzes von A für G an Position 898 im codierenden Bereich eines Optineurin (OPTN)-Gens in einer Probe, die von einem menschlichen Individuum erhalten wurde, wobei das OPTN-Gen eine wie in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleinsäuresequenz hat; und Vorhersagen der zukünftigen Entstehung eines Glaukoms im Individuum unter Verwendung der Mutation als Indikator.
Genassay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ersatz unter Verwendung eines Oligonucleotids nachgewiesen wird, das ein Hybrid an einer spezifischen Position des codierenden Bereichs des OPTN-Gens bilden kann.
Oligonucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) einem Oligonucleotid wie in SEQ ID NO: 27 dargestellt; (2) einer komplementären Kette eines Oligonucleotids gemäß (1); (3) einem Oligonucleotid wie in SEQ ID NO: 28 dargestellt; und (4) einer komplementären Kette eines Oligonucleotids gemäß (3).
Genassay-Verfahren zum Vorhersagen der zukünftigen Entstehung eines Glaukoms, umfassend die Schritte: (a) Isolieren eines Polynucieotids aus einer Probe, die von einem menschlichen Individuum erhalten wurde; (b) Durchführen eines Nucleinsäureamplifikationsverfahrens mit dem Polynucleotid unter Verwendung eines Oligonucleotids nach Anspruch 3; (c) Nachweisen eines Ersatzes von A für G an Position 898 im codierenden Bereich eines mit Glaukom in Beziehung stehenden Gens mit einer Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 angegeben; und (d) Vorhersagen der zukünftigen Entstehung eines Glaukoms in dem Individuum unter Verwendung der Mutation als Indikator.
Genassay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Glaukom ein primäres Offenwinkelglaukom und/oder ein Glaukom mit normalem Augeninnendruck ist.
Nachweisreagenz oder Nachweisreagenzkit umfassend das Oligonucleotid nach Anspruch 3.