KR102158673B1

KR102158673B1 - 양극성장애 환자의 계절성 또는 일주기 변화 진단을 위한 단일염기다형성 마커를 이용한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR102158673B1
Application number: KR1020190045620A
Authority: KR
Inventors: 홍경수; 양소영; 백지현; 조은영
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2020-09-22

Abstract

본 발명은 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 양극성장애(bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로 어레이 및 상기 마커를 이용한 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명의 AANAT , ASMT , MTNR1a 및 MTNR1b 유전자는 멜라토닌 합성 및 신호전달 관련 유전자들로, 양극성장애 환자의 내적표현형 중 계절성(seasonality) 및 일주기 선호도(circadian preference)와 유의한 연관성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 AANAT , ASMT , MTNR1a 및 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(SNP)은 유전생물학적 근거에 기초한 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단 마커로 활용될 수 있다.

Description

양극성장애 환자의 계절성 또는 일주기 변화 진단을 위한 단일염기다형성 마커를 이용한 정보 제공 방법{A method for providing information for seasonality or circadian preference in bipolar disorder using single nucleotide polymorphisms}

본 발명은 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 양극성장애(bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로 어레이 및 상기 마커를 이용한 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

양극성장애(Bipolar Disorder)는 조증 또는 우울증의 양 극단의 기분 변화를 보이는 기간과 정상적인 기분을 보이는 기간이 번갈아 나타나는 정신의학과적 질환으로, 자살사망위험도가 일반인구보다 20배 높고 재발성의 만성 경과를 나타내는 심각한 질환이며, 유병률이 1% 내외로 의학적 질환 중에서 치료비용이 가장 높다.

양극성장애의 가장 큰 현상학적 특징은 주기성(periodicity)이라고 할 수 있는데, 외부 환경이나 생체 조건의 '주기성'에 대응하는 '생체 시계' 및 '생체 리듬의 동조성(synchronicity)'이 적응적이지 못하고 쉽게 '비동조화(desynchronization)'에 빠지면서 수면, 식사, 자율신경기능 등에 변화를 일으키고, 나아가 기분과 활력 및 인지기능에 변화를 초래하는 것이 양극성장애 발병기전에 중요한 가설로 여겨지고 있다.

양극성장애는 조현병과 함께 정신의학과적 질환의 대표 복합유전질환(complex genetic disorder)에 해당하여, 유전율(heritability)이 80% 내외로 유전적 소인이 강하게 작용하는 것으로 알려져 왔으나, 소인 유전자 규명은 아직 밝혀지지 않은 상태이다. 이에, 최근 정신과학 유전연구에서는 질환의 유전적 소인을 규명하기 위해 질환의 유무 자체 보다는 병과 관련되면서 유전성을 띄는 질병 지표인 “내적표현형(endophenotype)”에 주목하여, 발병 과정에 관여하는 다양한 수준의 현상학적, 생물학적 지표들과 관련된 유전자들을 개별적으로 분석하는 접근법을 취하고 있다. 그러나, 양극성장애의 내적표현형 규명에 대한 연구는 전세계적으로 아직 초기단계에 머물고 있는 실정이다.

멜라토닌은 인간의 수면 및 각성의 패턴을 조절하는 신경호르몬(neurohormone)으로, '어둠의 호르몬'이라고도 불린다. 멜라토닌 생합성경로에 관여하는 효소로 AANAT (arylalkylamine N-acetyltransferase, 아릴알킬아민 N-아세틸트랜스퍼라제), ASMT (acetylserotonin O-methyltransferase, 아세틸세로토닌 O-메틸트랜스퍼라제), MTNR1a(melatonin receptor 1a, 멜라토닌 수용체 1a) 및 MTNR1b(melatonin receptor 1b, 멜라토닌 수용체 1b) 유전자가 알려져 있다. 밤시간 동안 증가된 노르에피네프린(norepinephrine)은 낮과 밤의 명암길이, 계절의 일조시간 변화 등 빛의 변화를 감지하는 뇌의 송과선(pineal gland)을 자극하는데, 이는 AANAT의 활성화로 이어진다. AANAT는 세로토닌을 N-아세틸세로토닌(N-acetylserotonin)으로 전환시키는 멜라토닌 생합성 경로의 핵심조절효소이며, 이 때 전환된 N-아세틸세로토닌이 ASMT에 의해 멜라토닌으로 전환된다. 한편, MTNR1a 유전자에 의해 암호화 되는 MT1 멜라토닌 수용체는 뉴런의 발화(firing)를 조절하고, MTNR1b 유전자에 의해 암호화 되는 MT2 멜라토닌 수용체는 시교차 상핵(suprachiasmatic nucleus)에서의 뉴런 발화에 있어서 주기적 리듬의 위상이동(phase shift)에 영향을 준다고 알려져 있다.

멜라토닌은 양극성장애의 병인학에 직접 또는 간접적으로 연관이 있는 것으로 알려져 있으나, 다수의 유전연구를 통한 멜라토닌 관련 유전자와 양극성장애의 연관성은 아직까지 확인된 바가 없다. 뿐만 아니라, 멜라토닌계 경로에 초점을 맞춘 양극성장애에 대한 일부 후보유전자 연구가 수행된 바 있으나 일관되지 않은 결과를 보였고, 이는 양극성장애가 본질적으로 복합유전질환에 해당되기 때문인 것으로 생각된다.

따라서, 양극성장애의 타당한 질병지표를 확립하고, 멜라토닌 관련 유전자와의 유전적 연합에 대한 연구를 통해 양극성장애 및 이의 임상특질을 정확하게 예측 및 진단하는 방법이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 양극성장애 환자를 대상으로 조사한 여러 생애 임상특질 가운데 계절성(seasonality, 기분과 행동의 계절에 따른 변화) 및 일주기 선호도 (circadian preference)를 내적표현형으로 하여, 이와 멜라토닌계 유전자와의 연관성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 마커를 포함하는 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로 어레이 및 상기 마커를 이용한 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AANAT, ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(SNPs) 마커를 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder) 의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder) 의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 마이크로 어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 AANAT , ASMT , MTNR1a 및 MTNR1b 유전자는 멜라토닌 합성 및 신호전달 관련 유전자들로, 양극성장애 환자의 내적표현형 중 계절성(seasonality) 및 일주기 선호도(circadian preference)와 유의한 연관성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 AANAT , ASMT , MTNR1a 및 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(SNP)은 유전생물학적 근거에 기초한 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단 마커로 활용될 수 있다.

도 1은 AANAT 유전자 단일염기다형성(SNP)의 유전자 내에서의 위치를 표시한 도이다.

본 발명은 AANAT, ASMT, MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 (SNP) 마커를 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 명세서에서, 용어 “단일염기다형성”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체 (individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNP들은 두 개의 대립유전자를 가진다. 한 집단(population) 내에서, SNP는 소대립 유전자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도) 정보를 통해 코호트 내 유전연합분석의 대상이 될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "다형성"은 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 “대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다(예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")이다. 또한, 용어 "유전자형(genotype)"은 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다.

본 명세서에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 발명 가능성을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 특히 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단에 유용하다. 본 발명의 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 SNP가 이러한 지표 기능을 하므로 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단 인자로 이용할 수 있다. 즉, 상기 유전자들의 다형성 측정은 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도를 진단하는 데 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.

양극성장애는 조증기-우울기가 주기적으로 나타나고, 생체 주기와 관련된 수면-각성, 식이(eating), 에너지 및 활력 등에서 이상 소견을 보이며, 질병 경과에 계절, 호르몬, 일중 생활 리듬 등 주기성을 띄는 환경이나 생체 조건의 변화가 큰 영향을 미친다는 점에서 생체리듬의 '주기성(periodicity)'과 관련이 깊은 질환이다. 특히, 계절성(seasonality), 일주기 선호도(circadian preference) 등의 주기성의 이상은 양극성 장애의 중요한 특징이며, 일반 인구에서도 나타날 수 있어서 유전적 근거가 있는 것으로 추정된다(Madden et al., 1996; Koskenvuo et al., 2007).

본 발명에서, 용어 “계절성”은 생체 주기 중 계절에 따라 기분이나 행동이 변화하는 것을 의미하며, 정신과 임상에서 계절성은 흔히 우울증과 관계 깊은 것으로 알려져 있고, 매년 같은 시기에 우울증이 반복적으로 나타나는 병은 계절성 정동장애(seasonal affective disorder, SAD)라고 명명된다. 계절성은 양극성장애의 생애에 걸친 특질(lifetime trait)로, 생체 리듬 및 주기성의 이상을 반영하는 현상학적, 생물학적 질병 지표로서 양극성장애 유전연구에서 중요한 내부표현형(endophenotype) 후보가 된다.

본 발명에서, 용어 “일주기 선호도”는 아침형, 저녁형 인간을 결정하는 일주기성 인자를 의미한다. 인간은 하루 중 활동 또는 취침 시각에 대한 선호에 따라 아침형과 저녁형으로 나누어지며, 이러한 유형의 차이는 태양광에 노출되는 시간에 따른 멜라토닌 분비의 변화에 인한 것으로 알려져 있다. 일주기 특성은 수면 형태뿐만 아니라 신체적, 사회적으로도 영향을 미쳐, 충분한 수면시간을 확보하지 못하면 정서적 불안정, 신경인지 능력저하, 사회 기능 저하 등 여러 부작용이 발생할 수 있다. 일주기 선호와 성격 특성에 관한 기존의 연구들에 따르면 아침형은 저녁형에 비해 성실하고, 저녁형은 적응능력이 떨어지는 기질을 가지는 경향이 많고, 주요우울증, 계절정동장애가 더 많다고 알려져 있다. 특히, 양극성장애에서 저녁형 주기 특성이 유의미하게 많이 관찰된다는 보고들이 있으며(Hatonen et al., 2008; Mansour et al, 2005), 수면-각성 주기의 이상이 환자의 발병하지 않은 형제자매에서도 나타나는 특징임을 볼 때, 일주기 선호도는 양극성장애 유전연구에서 중요한 내부표현형 후보가 된다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에서는, 조증과 우울증 삽화가 반복적으로 나타나는 양극성장애의 내부표현형으로서 상기 “계절성”과 “일주기 선호도”를 선택하여 그 정도 및 현상학적 양상과 멜라토닌 관련 유전자와의 연합 정도를 분석하였다.

특히, 본 발명은 상기 AANAT , ASMT , MTNR1a 및 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성과 양극성장애 환자의 내적표현형과의 연관성을 분석하여, 본질적으로 복합유전질환에 해당하는 양극성장애의 내적표현형인 중 계절성 또는 일주기 선호도를 타당한 질병지표로 확립하고, 상기 표현형질과 단일염기다형성과의 연관성을 최초로 밝혀 이를 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단 용도로 사용한 것에 기술적 핵심이 있다.

본 발명에 있어서, AANAT는 arylalkylamine N-acetyltransferase(AANAT) 단백질을 발현시키는 유전자로, 수면과 일주기 리듬을 조절하고, 멜라토닌 생합성 촉진에 중요한 기능을 하는 효소로 알려져 있다. ASMT는 Acetylserotonin O-methyltransferase(ASMT) 단백질을 발현시키는 유전자로, AANAT와 함께 세로토닌에서 멜라토닌 생합성에 관여하는 효소이다. MTNR1a(melatonin receptor 1a) 및 MTNR1b(melatonin receptor 1b)는 멜라토닌 수용체 유전자이다. 따라서, 본 발명은 멜라토닌 합성 및 신호전달에 관여하는 상기 4개 유전자를 후보 유전자로 선정하고, 상기 유전자의 계절성 또는 일주기 선호도와의 연합 여부를 분석하였으며, 4개 유전자 내 연관성을 보이는 SNPs를 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단 마커로 할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위해 사용하는 17q25.1에 존재하는 AANAT 유전자의 경우, 단일염기다형성 마커로 rs495055, rs9896887, rs116879618, rs77537806, rs3744044을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 발현조절 부위로 추정되는 5' 부위에 위치하는 rs9896887 및 rs116879618을 단일염기다형성 마커로 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 인간 17번 염색체의 74,448,849번째 C/T 염기가 존재하는 rs116879618 (C/T)를 사용할 수 있다. 상기 마커들에서 계절성 또는 일주기 선호도와의 관계에서 (+)의 방향으로 유의하게 연관이 시사되었다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시 예에서는 상기 rs9896887은 계절성 및 일주기 선호도와 열성유전모델 하에서 유의한 연관성을 보임을 확인하였다. 특히, rs116879618은 다중 테스트 수정 후에도 유의성이 남아있어 계절성과 강한 연관성을 나타냄을 확인하였다.

Xp22.33 및 Yp11.2에 존재하는 ASMT 유전자의 경우, 단일염기다형성 마커로 rs17149149, rs62593301, rs28675287, rs4521942, rs4639690, rs4933063을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인트론 3 위의 rs62593301 또는 인트론 8 위의 rs4639690을 단일염기다형성 마커로 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 rs4639690 (A/G)를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 rs62593301 및 rs4639690이 열성유전모델 하에서 계절성과 유의한 연관성을 보임을 확인하였다.

4q35.2에 존재하는 MTNR1a 유전자의 경우, 단일염기다형성 마커로 rs28611030, rs7440284, rs1800884, rs34532313, rs116952947, rs6820205, rs13140444, rs149982127, rs4862706, rs1800885, rs76691596, rs6858707, rs13131052을 사용할 수 있고, 바람직하게는 유의하게 연관을 시사하는 첫번째 엑손의 rs1800885, 인트론에 위치한 rs6820205 또는 5' 부위에 위치하는 rs76691596을 단일염기다형성 마커로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 rs1800885 (C/T)를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 rs1800885(CGG [Arginine] > TGG [Tryptophan])가 계절성에 대하여 우성유전모델 하에서 유의한 연관성을 보이며, rs6820205 또는 rs76691596는 우성유전모델 하에서 일주기 선호도와 유의한 연관성을 보임을 확인하였다.

11q14.3에 존재하는 MTNR1b 유전자의 경우, 단일염기다형성 마커로 rs75715438, rs75153006, rs4753426, rs10830963, rs3781637, rs148736119, rs76309303, rs1447350, rs12225378, rs1447352를 사용하고, 바람직하게는 발현조절 부위로 추정되는 5' 부위의 1.7kb 내에 연속으로 위치한 세 변이 rs75715438, rs75153006 및 rs4753426과 인트론 2에 위치한 rs3781637을 단일염기다형성 마커로 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637이 각각 우성유전, 열성유전, 열성유전, 열성유전 하에서 일주기 선호도와 유의한 연관성을 보임을 확인하였다.

바람직하게는, 본 발명의 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커는 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커인 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 가장 바람직하게는, 상기 단일염기다형성 마커는 인간 17번 염색체의 74,448,849번째 C/T 염기가 존재하는 AANAT 유전자 내 rs116879618 단일염기다형성 부위로, 계절성 또는 일주기 선호도, 그 중에서도 특히 계절성과 가장 높은 연관성을 보임을 특징으로 할 수 있다.

상기 제제는 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커와 혼성화될 수 있는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)일 수 있다.

본 발명에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 상기 혼성화는 SNP 마커를 검출 또는 증폭을 통해 구현될 수 있다. 상기 프로브는 유전자의 변이부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 혼성화를 통해 검출 가능한 신호를 발생할 수 있는 앱타머 또는 상보적인 폴리뉴클레오타이드 등을 포함할 수 있다.

상기 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 해당 단일염기다형성 관련 논문이나 정보지에 알려져 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환,및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 DNA 칩 키트로, 본 발명에 따른 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 증폭을 통해 확인하고 진단을 예측할 수 있다.

본 발명의 키트에는 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위하여 선택적으로 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 SNP 마커를 인지하는 프로브 또는 증폭할 수 있는 프라이머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 마이크로 어레이를 제공한다.

상기 마이크로 어레이는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명에 따른 단일염기다형성 마커의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로 어레이로 이루어진다. 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로 어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 하며, 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 수행될 수 있다.

본 발명의 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로 어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로 어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 시료는 혈액으로부터 추출된 DNA(핵산)일 수 있다. 시료는 검출에 사용하기 전 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함하는 방법으로 전처리 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 단계의 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커는 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다.

즉, 본 발명은 AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 (SNP)과 양극성장애의 내부표현형인 계절성 및/또는 일주기 선호도와의 연합을 통해, 본 발명에 따른 단일염기다형성 마커가 양극성장애의 내부표현형 발현에 영향을 주는 것을 확인하였고, 이를 통해 상기 단일염기다형성 마커를 이용한 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단 및 진단을 위한 정보 제공이 가능함을 확인하였다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 단일염기다형성 분석을 위한 표현형의 결정

1-1 단일염기다형성(SNP) 분석을 위한 피험자모집

환자군은 삼성서울병원 및 분당 서울대병원에서 모집하였다. DSM-IV에 근거하여 양극성장애로 진단받은 안정기 환자 324명 중, 양극성장애 1형(BD-I)은 182명, 양극성장애 2형(BD-II)은 134명, 달리 분류되지 않는 양극성장애(BD-NOS)는 8명이었으며, 2012년 3월부터 2014년 1월까지 임상 심리사 또는 자기보고 체크리스트를 통해 18세 이상 60세 이하의 지원자들로 구성하였다. 정신병, 정신 지체, 약물 남용 또는 의학적 병력이 있는 사람들은 제외하였다. 사회적 리듬이 생물학적 리듬에 깊게 영향을 미칠 수 있기 때문에 야간 근무자도 피실험자에서 제외하였다. 연구에 대한 철저한 설명을 한 후 모든 피험자로부터 동의서를 받았으며, 삼성 서울 병원 및 분당 서울대병원의 기관 검토위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받아 실시하였다.

1-2. 표현형 (Phenotype)의 결정

상기 피험자들을 대상으로 계절성 특성 및 일주기 선호도를 분석하였다. 각 행동학적 변인은 각각 계절성 변화 평가 설문(Seasonal Pattern Assessment Questionnaire, SPAQ) 및 아침형 조합 척도(Korean version of Composite Scale of Morningness, CSM) 를 통해 평가하였다.

SPAQ는 수면시간, 사회 활동, 기분, 체중, 식욕 및 활력의 계절적 변화를 측정하기 위한 6가지 항목을 포함하며, 한국어로 번역된 SPAQ의 한국어 버전을 원저자의 허락 하에 사용하였다. 개별 항목 점수의 합계는 0 점(변화 없음)에서 4 점(극도의 강한 변화)까지의 5 점 척도로, 총 계절성 점수(global seasonality score, GSS)를 나타내는 데 사용하였다. Kasper et al.(1989)에 따라, GSS가 9 또는 그 이상이면 적어도 가벼운 정도의 계절적 변화로 인한 정동장애를 가지고, GSS가 11 또는 그 이상이면 계절적 변화로 인한 심각한 정동장애를 가지는 것으로 평가하였다 (점수는 0점(불편한 없음)에서 5점(매우 불편함) 까지의 6점 척도로 하였다). CSM은 피실험자들이 수면, 기상, 그리고 활동의 수행을 선호하는 시간에 관한 13가지 질문을 포함하며, 13개 항목들 중 3가지 항목은 5점 척도, 나머지 10가지 항목들은 4점 척도로 총점은 13에서 55점이다. 점수가 높을수록 아침형이며 낮을수록 저녁형에 해당된다.

본 발명자들은 상기 척도로 측정된 '계절성(seasonality)' 및 '저녁형(eveningness)'을 일상 생활과 생체적 기능에 일주기, 계절적 변화가 미치는 영향을 평가하는 이분법적 표현형으로 결정하고, 이후 실시예에서 내부표현형으로 사용하였으며, 분석된 모든 피험자의 인구학적 및 유전자 표현형의 특징을 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

피험자들의 인구학적 및 유전자 표현형의 특징

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 계절성을 보이는 환자는 연령이 낮았고(p=0.04) 양극성장애 유형간 차이는 없었다. 저녁형 환자는 연령이 훨씬 더 낮았고(p<0.001), 미혼이며(p=0.003) 유형간 차이는 없음을 확인하였다.

실시예 2. SNP의 선택 및 유전형질분석( genotyping )

제조사의 지시에 따라 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 말초 혈액 백혈구에서 게놈 DNA를 분리하였다. 유전자형(genotype) 데이터는 한국인의 특징적인 유전체를 대표하는 유전변이(SNPs) 약 83만개로 구성된 Korea Biobank Array Chip(K-CHIP) 버전 1.0을 사용하여 생산되었다(국립보건연구원). K-CHIP의 분석은 Axiom^® 2.0 Reagent Kit(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었으며, 여기에는 증폭(amplification), 단편화(fragmentation), 혼성화(hybridization) 및 연결(ligation)이 포함된다. 결과를 확인하기 위하여 Genotyping Console™ Software(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 통해 반응 생성물을 염색 및 이미징화하여 유전자형을 분석하였다. QC 분석 수행 후, ~79만개 SNP에 대한 유전자형 데이터를 얻었다.

MTNR1a , MTNR1b , AANAT , ASMT는 멜라토닌 생합성 및 신호전달 경로에 관여하는 유전자로 알려져 있다. 따라서, 상기 4개의 멜라토닌 관련 유전자를 양극성장애의 내부표현형(계절성, 일주기 선호도)과 관련된 후보 유전자로 선정하고 SNP 분석을 수행하였다.

각 유전자의 암호화 서열(coding sequence)의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에서 10kb 내의 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)을 사용하여 발현조절 부위뿐만 아니라 엑손(exonic) 및 인트론(intronic) 영역도 분석하였다. 그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 MTNR1a , MTNR1b, AANAT 유전자는 상염색체(autosome)에 존재하고, ASMT 유전자는 성염색체의 허위상염색체 영역(pseudoautosomal region 1, PAR1)에 존재함을 확인하였다.

[표 2]

멜라토닌 관련 유전자 SNP의 특성

QC 분석 후, MAF(minor allele frequencies, 소대립 유전자 빈도) 1% 이상, genotype call rate > 97%인 상기 SNP 34개를 이후 분석에 사용하였다.

Array Chip을 사용한 유전형 분석의 신뢰도를 확인하기 위해 모든 SNP에 대하여 cluster plot을 작성하고, 각 유전자에서 가장 높은 MAF를 나타낸 4개 SNP(rs34532313 on MTNR1a, rs10830963 on MTNR1b, rs9896887 on AANAT, rs4639690 on ASMT)에 대하여 ABI PRISM^® BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하는 시퀀싱 반응으로 48 개의 무작위 샘플에 대해 다시 유전형질분석을 수행하였다. 서열 분석과 array chip 분석 사이의 유전형 데이터 일치율은 99.5%로 높은 것을 확인하였다.

실시예 3. SNP의 선택 및 유전형질분석을 위한 자료의 통계 분석

유전형 분석을 위해 Fisher의 정확검정(Fisher's exact test)을 통해 유전자형 빈도에 대한 Hardy-Weinberg 평형 만족 여부를 조사하였고, 연구 대상인 단일염기다형성이 모두 평형상태인 것을 확인하고 통계분석에 포함시켰다. 선택된 SNP와 각 내적표현형 간의 유전자형 빈도에 대한 연합을 알아보기 위해 로지스틱 회기 분석을 사용하였고 성별과 연령을 공변수로 추가하였다. 연합 분석의 유전 방식으로는 각 SNP의 소대립 유전자(minor alleles)를 기준으로 부가성(additive), 우성(dominant) 및 열성(recessive)을 적용하였고, 가장 낮은 Akaike Information Criterion(AIC) 값을 갖는 유전모델을 최적 모델로 채택하였다. 또한, 다수의 독립적 검증 시행으로 인한 제1형 오류를 극복하기 위해 Bonferroni 검정을 적용하였다. 두 유전자 간의 유의한 유전자간 상호작용을 찾기 위하여 성별과 연령을 공변수로 하고, 서로 다른 2개 유전자 SNP 간의 상호작용 계수를 활용한 로지스틱 회귀분석을 수행하였다. 이 분석에는 각 내부표현형과 유의한 연관성이 있는 SNP만 포함하였으며, 위에서 설명한 단일 SNP 분석에서와 같이 부가성, 우성 및 열성 유전모델 및 FDR 보정을 적용하였다. 모든 통계분석에는 R 프로그램(v.3.2.2) 및 PLINK software(v.1.9)를 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

계절성 및 일주기 선호와 관련된 SNP(p<0.05)

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, AANAT의 2가지 SNP인 rs9896887(GSS: p=0.045, CSM: p=0.025), rs116879618(GSS: p=0.016, seasonality: p=0.0004), ASMT의 2가지 SNP인 rs62593301(GSS: p=0.040), rs4639690(GSS: p=0.011, seasonality: p=0.006), MTNR1a의 3가지 SNP인 rs6820205(CSM: p=0.036), rs1800885(seasonality: p=0.032), rs76691596(CSM: p=0.029), MTNR1b의 4가지 SNP인 rs75715438(CSM: p=0.014), rs75153006(CSM: p=0.003), rs4753426(CSM: p=0.019), rs3781637(CSM: p=0.031)에서 각 단일염기다형성과 GSS, 계절성 및/또는 일주기 선호도와의 유의한 연관성을 확인하였다.

특히, AANAT의 SNP인 rs9896887은 계절성 및 일주기 선호도와 열성유전모델 하에서 유의한 연관성을 보임을 확인하였고, rs116879618은 다중 테스트 수정(X34) 후에도 p=0.0004로(Bonferroni Correction 후 p=0.0136) 계절성과 강한 연관성을 나타냄을 확인하여 이 변이의 주요 대립인자가 계절성에 대하여 유의하게 영향을 미치고 있음을 확인하였다. AANAT 유전자 단일염기다형성(SNP)의 유전자 내에서의 위치를 도 1에 나타내었다.

ASMT는 인트론 3 위의 rs62593301 또는 인트론 8 위의 rs4639690의 2개 SNP가 열성유전모델 하에서 계절성에 대하여 유의한 연관성을 가짐을 확인하였다.

MTNR1a는 첫번째 엑손의 rs1800885이 우성유전모델 하에서 계절성에 대하여 유의한 연관성을 가지며, 인트론에 위치한 rs6820205 또는 5' 부위에 위치하는 rs76691596의 2개 SNP가 우성유전모델 하에서 일주기 선호도와 유의한 연관성을 가짐을 확인하였다.

MTNR1b는 발현조절 부위로 추정되는 5' 부위의 1.7kb 내에 연속으로 위치한 세 변이 rs75715438, rs75153006 및 rs4753426과 인트론 2에 위치한 rs3781637의 4개 SNP가 각각 우성유전, 열성유전, 열성유전, 열성유전 하에서 일주기 선호도와 유의한 연관성을 보임을 확인하였다.

따라서, 상기 결과로 확인한 바와 같이, AANAT , ASMT , MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성인 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637가 양극성장애의 내부표현형인 계절성 및/또는 일주기 선호도와 유의한 상관관계를 가지는바, 이를 통해 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도를 진단할 수 있는 소인 유전자로서 상기 단일염기다형성 부위를 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.

Claims

AANAT(arylalkylamine N-acetyltransferase), ASMT(Acetylserotonin O-methyltransferase), MTNR1a(melatonin receptor 1a) 또는 MTNR1b(melatonin receptor 1b) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커인 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 양극성장애(bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단일염기다형성 마커는 인간 17번 염색체의 74,448,849번째 C/T 염기가 존재하는 AANAT 유전자 내 rs116879618 단일염기다형성 부위인 것을 특징으로 하는, 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 단일염기다형성 마커 조성물.
제1항의 AANAT, ASMT, MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커인 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 제제는 AANAT, ASMT, MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커인 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커와 혼성화될 수 있는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는, 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 조성물.
제4항의 진단용 조성물을 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 양극성장애의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 키트.
제4항의 진단용 조성물을 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단용 마이크로 어레이.
(a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 AANAT, ASMT, MTNR1a 또는 MTNR1b 유전자의 단일염기다형성 마커인 rs9896887, rs116879618, rs62593301, rs4639690, rs6820205, rs1800885, rs76691596, rs75715438, rs75153006, rs4753426 및 rs3781637로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는 양극성장애 (bipolar disorder)의 계절성 또는 일주기 선호도 진단을 위한 정보 제공 방법.
삭제