PL192022B1 - Nowy genetyczny marker do analizy materiału genetycznego, oligonukleotydowe startery, sposób oraz zestaw do analizy materiału genetycznego - Google Patents

Abstract

Nowy genetyczny marker do analizy materiału genetycznego oparty na polimorfizmie DNA, znamienny tym, że jest nim polimorficzny fragment DNA z położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, o sekwencji X[(GAA) i/lub (GAG) i/lub (CAA)]nZ, gdzie X oznacza fragment z pozycji 1-57 sekwencji przedstawionej na fig. 3, Z oznacza fragment z pozycji 157-192 sekwencji przedstawionej na fig. 3, a n wynosi 31-46 trójnukleotydowych powtórek lub część tego fragmentu posiadająca polimorficzny region.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy genetyczny marker do analizy materiału genetycznego, oligonukleotydowe startery, sposób oraz zestaw do analizy materiału genetycznego (DNA), zwłaszcza do porównywania fragmentów DNA, np. przy identyfikacji osobniczej.

Analiza materiału genetycznego na podstawie różnic w budowie DNA (polimorfizmów) spowodowanych delecją, insercją lub podstawieniem nukleotydu znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach.

W ostatnich latach jako markery genetyczne do porównywania fragmentów DNA, np. przy identyfikacji osobniczej, zaczęto wykorzystywać polimorficzne regiony ludzkiego genomu zawierające krótkie kilkunukleotydowe powtórki, tzw. STR (short tandem repeats) [Litt, M. i Luthy, J.A. (1989), Am. J. Hum. Genet. 44, str. 397-401].

Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR) umożliwia powielenie danego polimorficznego fragmentu DNA zawierającego krótkie kilkunukleotydowe powtórki [Saiki, R.K.i wsp.,(1988), Science 238, str. 487-491]. Ze względu na wielkość produktów reakcji PCR (100-300 par nukleotydów), łatwych do analizy, oraz znikomą ilość potrzebnej do badania próbki biologicznej, metoda ta jest szeroko stosowana zarówno w medycynie sądowej i kryminologii, jak i w diagnozowaniu chorób uwarunkowanych genetycznie [Edwards, A. i wsp., (1991), Ara.J.Hum.Genet. 49, str. 746-756; Edwards, A. i wsp., (1992), Genomics 12, str. 241-253; Gill, P.i wsp., (1992), Electrophoresis 13, str. 173-175; Kimpton, C.P.i wsp., (1993), PCR Methods Appl. 3, str.13-22; Caskey, C.T. i wsp., (1992) Science 256, str.784-789; Fregeau, C.J. i R.M. Fourney, (1993), BioTechniques 15, str. 100-119; Huang, T.H. i wsp., (1991) Am.J.Hum.Genet. 49, str. 1312-1319; Martin, J.B.,(1993), Science 262, str. 674-676].

Reakcję PCR prowadzi się przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów zdolnych do wykrycia określonego polimorfizmu, przy czym sekwencje starterów mają kluczowe znaczenie dla powodzenia metody. Startery wiążą się z sekwencjami ograniczającymi zmienny region na przeciwległych łańcuchach DNA i stanowią miejsce inicjacji syntezy produktu wydłużania w obecności czynnika wywołującego polimeryzację oraz nukleotydów.

Jednak nie każdy polimorficzny region ludzkiego genomu nadaje się do stosowania jako marker genetyczny przy identyfikacji osobniczej.

Znanymi polimorficznymi regionami ludzkiego genomu, stosowanymi jako standardowe markery genetyczne są: HUMVWFA31/A, HUMTH01, HUMF13A1 oraz HUMFES/FPS.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr5468610 przedstawiono sposób wykrywania różnic w materiale genetycznym polegający na powieleniu w reakcji PCR fragmentów: a) ludzkiego genu CTLA-4 wykazującego polimorfizm ilości powtórek (AT)n, b) ludzkiego genu hormonu wzrostu wykazującego polimorfizm ilości powtórek (GAAA)n oraz c) ludzkiego pseudogenu związanego z cytoplazmatyczną beta-aktyną wykazującego polimorfizm ilości powtórek G(AAA)n. Ujawniono także sekwencje oligonukleotydowych starterów zdolnych do wykrycia tego polimorfizmu.

Produkty PCR analizuje się pod kątem podobieństw lub różnic, np. metodą elektroforetyczną. Porównanie produktów powielania ułatwia stosowanie wzorca długości, składającego się z alleli danego fragmentu DNA, których obrazem (po wizualizacji) jest tzw. drabina alleli.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 599 666 znany jest zestaw do analizy krótkich powtarzających się sekwencji zawierający drabinę alleli dla takich miejsc ludzkiego genomu jak: HUMCSF1PO, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMLPL, HUMVWFA31 oraz HUMHPRTB.

Ciągle poszukuje się nowych, szybkich i czułych metod analizy DNA, pozwalających na dokładną analizę próbek o znikomej ilości.

Obecnie znaleziono i wyizolowano nowy marker genetyczny.

Marker według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest nim polimorficzny fragment DNA z położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, o sekwencji X[(GAA) i/lub (GAG) i/lub (CAA)]nZ, gdzie X oznacza fragment z pozycji 1-57 sekwencji przedstawionej na fig. 3, Z oznacza fragment z pozycji 157-192 sekwencji przedstawionej na fig. 3, a n wynosi 31-46 trójnukleotydowych powtórek lub część tego fragmentu posiadająca polimorficzny region.

Marker jest ograniczony sekwencjami korzystnych specyficznych dla niego starterów przedstawionymi na fig.1i 2lub komplementarnymi.

Marker według wynalazku ma co najmniej 16 alleli. Ich długość może wynosić 186 do 231 par nukleotydów.

PL 192 022 B1

Nowy polimorficzny region znajduje się w miejscu oznaczonym w Banku Genów AC002410

46067-46258 [ Graves T., Hinds K., Sutterer C., Biewald T;(1997). Dane niepublikowane].

Sekwencja tego regionu ludzkiego genomu jest znana, ale znaleziony polimorfizm, nowe allele oraz para starterów specyficznych dla tego polimorfizmu nie były dotychczas opisane ani sugerowane.

Nowy polimorficzny region jest w niniejszym opisie i zastrzeżeniach oznaczany HUMCLAC.

Nowy polimorficzny marker genetyczny pozwala na analizę DNA przy zastosowaniu polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) zarówno za pomocą analizy długości produktów PCR, jak i analizy ich sekwencji nukleotydowych.

Na podstawie przeprowadzonych badań populacji obejmującej 200 ludzi nieoczekiwanie stwierdzono występowanie aż 16 alleli, tj. różnych wariantów długości badanego regionu DNA. Długości otrzymywanych w reakcji PCR fragmentów wynoszą od 186 do 231 par nukleotydów. Alleleomawianego regionu ludzkiego genomu różnią się między sobą ilością powtórek (GAA)n, czyli o trzy pary nukleotydów. W omawianym regionie występują również powtórki (GAG)n i (CAA)n. Tak duża różnorodność alleli powoduje, że ilość możliwych ludzkich genotypów ze względu na obecność omawianego regionu wynosi 136, podczas gdy dla znanych ze stanu techniki standardowych markerów wartość ta wynosi odpowiednio: HUMVWFA31/A-45, HUMTH01-28, HUMF13A1-120, HUMFES/FPS-28.

Nowe sekwencje genetycznego markera podano na fig. 4 ifig.5.

Wynalazek dotyczy także starterów specyficznych dla nowego markera.

Oligonukleotydowe startery według wynalazku mają sekwencje przedstawione na fig. 1oraz na fig. 2.

Startery syntetyzuje się znanymi metodami. Mogą one także pochodzić ze źródeł naturalnych.

Sposób analizy materiału genetycznego na podstawie polimorfizmu fragmentu DNA zawartego w badanym materiale, który to fragment powiela się w polimerazowej reakcji łańcuchowej z zastosowaniem pary oligonukleotydowych starterów zdolnych do wykrycia tego polimorfizmu, polega według wynalazku na tym, że w polimerazowej reakcji łańcuchowej powiela się fragment DNA z położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, wykazujący polimorfizm ilości powtórek (GAA)n i/lub (GAG)n i/lub (CAA)n, z zastosowaniem pary oligonukleotydowych starterów zdolnych do wykrycia tego polimorfizmu, o sekwencjach przedstawionych na fig. 1oraz na fig. 2, a następnie charakteryzuje się produkt lub produkty powielania.

Sposobem według wynalazku można analizować bardzo niewielkie ilości genomowego DNA z dowolnego źródła, np. z materiału biologicznego w postaci zaschniętych plam krwi, śliny, cebulek włosa, i innych próbek tkanek, płynów lub wydzielin ustrojowych. Metoda pozwala na powielenie żądanego fragmentu nawet wówczas, gdy fragment ten nie został oczyszczony i jest obecny w próbce tylko w jednej kopii. Przed powielaniem genomowy DNA na ogół wyodrębnia się z materiału biologicznego.

Podstawowe warunki polimerazowej reakcji łańcuchowej PCR omówiono np. w publikacji Mullis K. i wsp. Biotechnology, 24 17-27 (1992).

W reakcji PCR oprócz badanego DNA i pary starterów (w nadmiarze w stosunku do wyjściowego DNA) stosuje się trójfosforany dezoksyrybonukleotydów (dNTP) naturalne bądź ich analogi oraz polimerazę DNA. Odpowiednie są polimerazy termostabilne dostępne w handlu, choć mogą być także użyte ich zmodyfikowane formy. Zazwyczaj reakcja PCR składa się z etapów: denaturacji, hybrydyzacji starterów i polimeryzacji. Otrzymane produkty stają się matrycami w następnych cyklach PCR. Etapy (cykle) powtarza się taką ilość razy, jak jest to pożądane. Reakcja PCR umożliwia ekspotencjalną amplifikację specyficznych fragmentów DNA. Przykładowo po 25 do 35 cyklach w mieszaninie reakcyjnej są w większości powielane fragmenty o żądanej długości. Temperatury w poszczególnych etapach i czasy ich trwania mogą zależeć od ilości próbki, długości fragmentu i odczynników.

Po zakończeniu reakcji powielania produkt(y) charakteryzuje się przy użyciu znanych technik, np. przez określenie długości, korzystnie metodą elektroforezy.

Długości otrzymywanych w reakcji PCR fragmentów omawianego polimorfizmu wynoszą od 186 do 231 par zasad. Takie fragmenty mogą być łatwo rozdzielane podczas elektroforezy w żelu poliakryloamidowym i analizowane po uwidocznieniu np. za pomocą barwienia, przykładowo metodą srebrową [Sanguinetti, C. J. i wsp., (1997), BioTechniques 17, str.915-919].

Do oceny długości produktów powielania można stosować wzorzec długości specyficzny dla polimorfizmu występującego w nowym regionie HUMCLAC.

Produkty powielania można także charakteryzować przez określenie sekwencji nukleotydowych.

PL 192 022 B1

Charakteryzując otrzymane produkty, można je porównać z powielonymi jednocześnie lub oddzielnie fragmentami DNA pochodzącymi od jednego lub więcej osobników w celu stwierdzenia, czy występują różnice długości lub różnice spowodowane podstawieniem nukleotydu. Różnica w produkcie amplifikacji pozwala na rozróżnienie lub identyfikację osobników.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do analizy materiału genetycznego, który zawiera wzorzec składający się co najmniej z dwu alleli położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, o sekwencjach wybranych spośród sekwencji X[(GAA) i/lub (GAG) i/lub (CAA)]nZ, gdzie X oznacza fragment z pozycji 1-57 sekwencji przedstawionej na fig. 3, Z oznacza fragment z pozycji 157-192 sekwencji przedstawionej na fig. 3, a n wynosi 31-46 trójnukleotydowych powtórek lub z ich części posiadających polimorficzny region.

Wzorzec może zawierać dwa lub więcej alleli, np. wybranych spośród alleli o długości od 186 do 231 par zasad. Korzystne jest takie dobranie alleli, aby obejmowały cały zakres polimorfizmu.

Wzorzec otrzymuje się przez zmieszanie powielonych alleli. Po rozdzieleniu alleli pod względem wielkości, np. na drodze elektroforezy, i detekcji (uwidocznieniu) rozdzielonych produktów otrzymuje się wzorzec w postaci drabiny alleli. Przed zmieszaniem allele można wyizolować i ewentualnie oczyścić.

Metody detekcji drabiny alleli mogą obejmować barwienie, np. metodą srebrową, techniki fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioizotopowe, enzymatyczne i ich kombinacje.

W celu przypisania fragmentom DNA o określonej wielkości konkretnej ilości powtórek, wybrane pojedyncze fragmenty wycina się z żelu, izoluje i sekwencjonuje znanym sposobem.

Sekwencje 2 alleli polimorficznego regionu HUMCLAC są przedstawione na fig. 4 i fig. 5.

Figura 7 przedstawia fotografię wzorca (drabiny alleli) składającego się z 14 alleli. Drabinę pokazują ścieżki oznaczone 1, 4, 8 i 12. Zakres wzorca: 186-225 par zasad. Każda z pozostałych linii obrazu elektroforetycznego (2-3, 5-7, 9-11) zawiera przykładowe allele omawianego polimorfizmu charakterystyczne dla jednego badanego człowieka.

Zestaw może ewentualnie także zawierać jeden starter lub parę oligonukleotydowych starterów o sekwencjach przedstawionych na fig. 1oraz na fig. 2 ( w jednym lub osobnych pojemnikach), a w razie potrzeby również załączoną instrukcję.

Wzorzec pozwala na szybką, niezawodną charakterystykę produktów PCR bez potrzeby obliczeń lub dodatkowych analiz.

Wynalazek znajduje zastosowanie w medycynie sądowej i kryminologii, a także w diagnozowaniu chorób uwarunkowanych genetycznie.

Charakterystykę nowego markera genetycznego podano w tabeli 1.

Tabela 1

Para starterów	CLACP-fig. 1; CLACM-fig. 2
Lokalizacja	chromosom 7p15p21
Heterozygotyczność	90,9%
Wartość PIC (zawartość informacji)	0,90
Ilość alleli	16
Rozmiar alleli (pary zasad)	186-231
Powtórki	(GAA)n, (CAA)n, (GAG)n

W tabeli 2 podano rozmiar 16 alleli i pasmo danego allelu we wzorcu.

PL 192 022 B1

T ab el a 2

Allel	Pasmo we wzorcu	Rozmiar (pary zasad)	Allel	Pasmo we wzorcu	Rozmiar (pary zasad)
1	1	186	9	9	210
2	2	189	10	10	213
3	3	192	11	11	216
4	4	195	12	12	219
5	5	198	13	13	222
6	6	201	14	14	225
7	7	204	15	15	228
8	8	207	16	16	231

Przydatność znalezionego polimorfizmu do identyfikacji osobniczej potwierdza także rozkład względnych częstości występowania różnych alleli przedstawiony na fig. 8 i w tabeli 3, gdzie: K - dane dla kobiet, M - dane dla mężczyzn, K+M - suma danych dla kobiet i mężczyzn.

T ab el a 3

Względne częstości występowania alleli polimorficznego regionu HUMCLAC.

Nr pasma	K+M	K	M	Nr pasma	K+M	K	M
1,00	0,0147	0,0184	0,0074	9,00	0,1201	0,1103	0,1397
2,00	0,0049	0,0000	0,0147	10,00	0,0833	0,0846	0,0809
3,00	0,0588	0,0662	0,0441	11,00	0,1569	0,1434	0,1838
4,00	0,0662	0,0809	0,0368	12,00	0,0662	0,0735	0,0515
5,00	0,0931	0,0919	0,0956	13,00	0,0662	0,0735	0,0515
6,00	0,0882	0,1103	0,0441	14,00	0,0147	0,0037	0,0368
7,00	0,0588	0,0478	0,0809	15,00	0,0123	0,0110	0,0147
8,00	0,0907	0,0846	0,1029	16,00	0,0049	0,0000	0,0147

Figura 6 przedstawia porównanie wybranych sekwencji nukleotydowych sklonowanych polimorficznych fragmentów DNA pochodzących z polimorficznego regionu HUMCLAC. CLAC jest fragmentem DNA, którego sekwencję wyszukano w Banku Genów i przedstawiono na fig. 3.

CLAC 152 jest fragmentem DNA pochodzącym z próbki nr 152-krótszy allel (fig. 4), któremu we wzorcu przypisano pasmo 9.

CLAC 154 jest fragmentem DNA pochodzącym z próbki nr 154-dłuższy allel (fig. 5), któremu we wzorcu przypisano pasmo 11.

Wyżej wymienione fragmenty: CLAC 152 i CLAC 154 otrzymano metodą PCR, powielając DNA odpowiednich próbek za pomocą starterów CLACP (fig. 1) i CLACM (fig. 2). Sekwencje starterów zaciemniono. Sekwencje konserwatywne zaznaczono gwiazdką.

Analiza powyższych danych wykazała, że badane fragmenty DNA zawierają różną ilość krótkich kilkunukleotydowych powtórek (GAA)n i/lub (CAA)n i/lub (GAG)n charakterystycznych dla omawianego polimorfizmu. W obrębie tego regionu DNA znajdują się także sekwencje konserwatywne, których obecność umożliwia określenie miejsca występowania zmian w ilości powtórek danego allelu w stosunku do innych alleli. W związku z tym nie można zakładać, że allele charakteryzujące się tą samą długością powielanego metodą PCR fragmentu mają identyczną sekwencję nukleotydową. Oznacza to również, że znaleziony polimorficzny region HUMCLAC ludzkiego genomu niesie dużo więcej informacji niż wynikałoby to z samego rozkładu długości alleli charakterystycznych dla danego osobnika. Uzyskane wyniki są zgodne z danymi literaturowymi dotyczącymi innych polimorficznych regionów

PL 192 022 B1 ludzkiego genomu wykorzystywanych do rutynowo prowadzonych badań identyfikacyjnych [Glock, B.

i wsp., (1995), Forensic Sci.Int.78, str. 125-130; Walsh, P.S. i wsp.,(1996), Nucleic Acid Res. 24, str. 2807-2812].

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia sekwencję startera CLACP; fig. 2 przedstawia sekwencję startera CLACM; fig.3 przedstawia sekwencję AC002410 46067-46258 wyszukaną w bazie danych; fig. 4 i fig. 5 przedstawiają sekwencje alleli polimorficznego regionu HUMCLAC; fig. 6 przedstawia porównanie sekwencji według fig. 3 - fig. 5; fig. 7 przedstawia fotografię wzorca długości w postaci drabiny alleli (ścieżki 1, 4, 8, 12), ścieżki 2-3, 5-7, 9-11 ukazują allele omawianego polimorfizmu charakterystyczne dla 8 losowo wybranych osób; fig. 8 przedstawia rozkład długości polimorficznych fragmentów DNA w regionie HUMCLAC.

Niżej podane przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Genetyczny marker znaleziono i wyizolowano z DNA otrzymanego z krwi 200 losowo wybranych ludzi metodą opisaną w przykładzie III. Charakterystykę nowego markera i jego alleli podano w tabelach 1-3.

Przykład II. Synteza oligonukleotydowych starterów.

W automatycznym syntetyzerze DNA, znaną metodą w fazie stałej, zsyntetyzowano parę oligonukleotydowych starterów:

CLACP o sekwencji 5' GGGCAAGACCCTGTGAAAGA; (fig. 1)

CLACM o sekwencji 5' TCTGAGCACTCACAAAGCGG; (fig. 2)

Zsyntetyzowane startery mają zdolność do wykrycia i powielania polimorficznego fragmentu DNA z regionu HUMCLAC, co wykazano w przykładzie III.

Pr zykład III. Analiza materiału genetycznego

A. Izolowanie DNA.

Materiał biologiczny otrzymano izolując DNA z krwi obwodowej 200 losowo wybranych osób. Do izolacji używano zestawu Epicentre Technologies (Master Pure TM Genomic DNA Purification Kit, Katalog No MG71100). Preparaty DNA dodatkowo odbiałczano za pomocą fenolu, a następnie mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku objętościowym 24:1), wytrącano 98% etanolem i rozpuszczano w TE(1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 7,4). Otrzymane preparaty ludzkiego DNA charakteryzowano za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym.

B. Powielanie polimorficznego fragmentu HUMCLAC metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej PCR.

Mieszaniny reakcyjne zawierały: 20 ng badanego ludzkiego DNA; trójfosforany dezoksyrybonukleotydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) o stężeniu 100 mM każdego; Tris HCl pH 8,6 o stężeniu 20 mM; MgCl2 o stężeniu 2,5 mM; KCl o stężeniu 50 mM; żelatynę o stężeniu 0,01% oraz 50 pM startera CLACP; 50 pM startera CLACM; 2U polimerazy DNA z Thermus aquaticus (TERPOL, Sieradz). Reakcję prowadzono w 500 ml probówkach. Powielanie z wykorzystaniem metody PCR prowadzono w aparacie firmy Eppendorf (Master Cycler 5330) bez pokrywy grzejnej. Przed przystąpieniem do reakcji do każdej probówki z mieszaniną reakcyjną dodawano 1 kroplę oleju parafinowego (SIGMA). Zastosowano następujące warunki PCR:

95°C - 2 minuty

72°C - 1 minuta, na tym etapie dodawano polimerazę Taq.

cykli:

94°C - 30 sekund

62°C - 30 sekund

72°C - 30 sekund etap wydłużonej syntezy: 72°C- 2 minuty.

C. Przygotowanie próbek do rozdziału w denaturującym żelu poliakryloamidowym.

Po przeprowadzeniu powielania metodą PCR z każdej probówki pobierano 10 ml produktu i mieszano z 10 ml buforu denaturującego o składzie: 10 mM NaOH, 95% formamid, 0,05% błękit bromofenolowy i 0,05% barwnik xylene cyanole FF (C25H27N2O6S2Na). Następnie próbki denaturowano w 95°C przez 2 minuty i natychmiast schładzano w łaźni lodowej. Na żel poliakryloamidowy nanoszono6 ml tak przygotowanej próbki.

D. Rozdział elektroforetyczny polimorficznych fragmentów HUMCLAC.

Elektroforezę prowadzono w 6% denaturującym żelu poliakryloamidowym (akryloamid:bisakryloamid 19:1; 7M mocznik; 0,5 TBE) w buforze 0,5 TBE (1xTBE-0,089M Tris, 0,089M kwas borowy, 0,002M EDTA pH 8,3). Stosowano żele o wymiarach: 220mm:180mm:1mm (długość:szeroPL 192 022 B1 kość:grubość). Rozdział elektroforetyczny prowadzono za pomocą aparatów do elektroforezy pionowej, przy stałej mocy 20W i 50°C. Elektroforezę przerwano, gdy barwnik xylene cyanole FF (wolniej wędrujący) przeszedł dwa razy po 12 cm.

E. Barwienie żeli.

Zastosowano barwienie srebrem (Sanguinetti et al. 1997) według poniższej procedury.

Inkubacja: 3 minuty w roztworze 10% etanolu i 0,5% kwasu octowego, 7 minut w roztworze 10% etanolu, 0,5% kwasu octowego i 0,2% azotanu srebra; dwukrotne płukanie żelu wodą dejonizowaną.

Inkubacja: w roztworze 3% zasady sodowej i 0,5% formaldehydu do pojawienia się obrazu, a następnie 5 minut w roztworze 10% etanolu i 0,5% kwasu octowego i 10 minut w roztworze 2,5% gliceryny.

Tak wybarwiony żel suszono pomiędzy dwoma warstwami celofanu.

G. Odczytywanie wyników.

Każdy z dwóch alleli charakterystycznych dla danego osobnika porównywano z wzorcem, który stanowiła drabina alleli przedstawiona na fig. 7 ( ścieżki 1, 4, 8i 12)i przypisano im odpowiedni numer pasma we wzorcu. Dane zapisywano w postaci dwóch liczb odpowiadających numerom alleli we wzorcu. Fig. 7 ilustruje przydatność zastosowania omawianego fragmentu do identyfikacji osobniczej. Ścieżki 2-3, 5-7 i 9-11 zawierają allele tego polimorfizmu 8 wybranych ludzi. Każda ścieżka ukazuje indywidualny obraz polimorfizmu HUMCLAC charakterystyczny dla danego człowieka.

P r zyk ł a d IV. Konstrukcja wzorca (drabiny alleli).

Wzorzec długości polimorficznych fragmentów HUMCLAC otrzymano mieszając powielone fragmenty DNA tak dobrane, aby obejmowały 14 alleli omawianego polimorfizmu: 186-225 par zasad. Zmieszane próbki odbiałczano fenolem, a następnie mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku objętościowym 24:1), strącano 98% etanolem i rozpuszczano w TE. Elektroforezę prowadzono analogicznie jak w przykładzie III.

Figura 7 przedstawia fotografię zabarwionego żelu. Ścieżki 1, 4, 8 i 12 pokazują drabinę alleli. Z lewej strony podano numer allelu, który odpowiada numerowi pasma we wzorcu zgodnie z tabelą 2, z której można odczytać także długość danego allelu.

W celu przypisania fragmentom DNA o określonej wielkości konkretnej ilości powtórek kilkunukleotydowych sekwencji, wybrane pojedyncze fragmenty wycinano z żelu poliakryloamidowego, izolowano, ligowano z plazmidem pUC18 i transformowano komórki kompetentne Escherichia coli NM522. Z transformantów izolowano plazmidy zawierające wklonowany fragment CLAC i sekwencjonowano je używając aparatu ABI373. Sekwencje 2 fragmentów przedstawiono na fig. 4-5.

P r zyk ł a dy V -VII. Sporządzono następujące zestawy do analizy materiału genetycznego.

Zestaw I zawiera wzorzec długości składający się z 14 alleli polimorficznego regionu HUMCLAC. Są to allele 1, 2-14 według tabeli 2, które po elektroforetycznym rozdzieleniu tworzą drabinę przedstawioną na fig. 7, ścieżki 1, 4, 8,12.

Zestaw II zawiera wzorzec długości analogiczny jak w zestawie I oraz parę oligonukleotydowych starterów CLACP i CLACM w osobnych pojemnikach.

Zestaw III zawiera wzorzec długości składający się z allelu 9 i 11 (według tabeli 2), o sekwencjach przedstawionych na fig. 4 i fig. 5. Drabina otrzymana po rozdzieleniu alleli metodą elektroforezy madwa pasma 9 i 11.

Claims (17)

1. Nowy genetyczny marker do analizy materiału genetycznego oparty na polimorfizmie DNA, znamienny tym, że jest nim polimorficzny fragment DNA z położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, o sekwencji X[(GAA) i/lub (GAG) i/lub (CAA)]nZ, gdzie X oznacza fragment z pozycji 1-57 sekwencji przedstawionej na fig. 3, Z oznacza fragment z pozycji 157-192 sekwencji przedstawionej na fig. 3, a n wynosi 31-46 trójnukleotydowych powtórek lub część tego fragmentu posiadająca polimorficzny region.

2. Marker według zastrz. 1, znamienny tym, że jest ograniczony sekwencjami specyficznych dla niego starterów przedstawionymi na fig. 1 i 2 lub komplementarnymi.

3. Marker według zastrz. 1, znamienny tym, że ma co najmniej 16 alleli.

4. Marker według zastrz. 3, znamienny tym, że allele mają długość 186 do 231 par nukleotydów.

PL 192 022 B1

5. Marker według zastrz. 1, znamienny tym, że ma sekwencję przedstawioną na fig. 4 lub na fig. 5.

6. Oligonukleotydowe startery o sekwencjach przedstawionych na fig.1 oraz na fig. 2.

7. Sposób analizy materiału genetycznego na podstawie polimorfizmu fragmentu DNA zawartego w badanym materiale, który to fragment powiela się w polimerazowej reakcji łańcuchowej z zastosowaniem pary oligonukleotydowych starterów zdolnych do wykrycia tego polimorfizmu, znamienny tym, że w polimerazowej reakcji łańcuchowej powiela się fragment DNA z położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, wykazujący polimorfizm ilości powtórek (GAA)n i/lub (GAG)n i/lub (CAA)n, z zastosowaniem pary oligonukleotydowych starterów zdolnych do wykrycia tego polimorfizmu o sekwencjach przedstawionych na fig. 1 i fig. 2, po czym charakteryzuje się produkt lub produkty powielania.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że produkt lub produkty powielania charakteryzuje się przez określenie długości.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że długość określa się metodą elektroforezy.

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że produkt lub produkty powielania charakteryzuje się za pomocą wzorca długości specyficznego dla polimorfizmu występującego w regionie HUMCLAC.

11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że produkt lub produkty powielania charakteryzuje się przez analizę sekwencji nukleotydowej.

12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że produkt lub produkty powielania porównuje się z amplifikowanymi jednocześnie lub oddzielnie fragmentami pochodzącymi od jednego lub więcej osobników, a różnicę stosuje się do ich rozróżnienia lub identyfikacji.

13. Zestaw do analizy materiału genetycznego, zawierający wzorzec składający się z alleli polimorficznego regionu, znamienny tym, że wzorzec składa się co najmniej z dwu alleli położonego na chromosomie 7 regionu HUMCLAC ludzkiego genomu, o sekwencjach wybranych spośród sekwencji X[(GAA) i/lub (GAG) i/lub (CAA)]nZ, gdzie X oznacza fragment z pozycji 1-57 sekwencji przedstawionej na fig. 3, Z oznacza fragment z pozycji 157-192 sekwencji przedstawionej na fig. 3, a n wynosi 3146 trójnukleotydowych powtórek lub z ich części posiadających polimorficzny region.

14. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że wzorzec po uwidocznieniu ma postać drabiny alleli.

15. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że wzorzec zawiera allele wybrane spośród alleli o długości od 186 do 231 par zasad.

16. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że allele mają sekwencje wybrane spośród sekwencji przedstawionych na fig. 4 i fig. 5.

17. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że dodatkowo zawiera jeden lub parę oligonukleotydowych starterów o sekwencjach przedstawionych na fig. 1 oraz na fig. 2.