DE3503978A1

DE3503978A1 - Verfahren zur frueherkennung von pflanzenkrankheiten

Info

Publication number: DE3503978A1
Application number: DE19853503978
Authority: DE
Inventors: Detlev Prof.Dr. 4000 Düsseldorf Riesner; Jürgen Dipl.-Biol. Dr. Schumacher
Original assignee: Individual
Current assignee: SCHUMACHER, JUERGEN, DIPL.-BIOL. DR., 4006 ERKRATH
Priority date: 1984-08-01
Filing date: 1985-02-06
Publication date: 1986-02-06
Also published as: AU4723185A; EP0191059A1; WO1986000934A1

Description

Verfahren zur Früherkennung von Pflanzenkrankheiten
Bei der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Nukleinsäureextrakte aus gesunden und kranken Pflanzen miteinander verglichen werden und aus dem Auftreten oder der Abwesenheit bestimmter Nukleinsäuremoleküle auf den Gesundheitszustand der Pflanzen geschlossen werden kann.
Die Früherkennung von Pflanzenkrankheiten ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Land- und Forstwirtschaft. In den letzten zehn Jahren wurden in Mitteleuropa zunehmend neuartige Erkrankungen an Waldbäumen beobachtet, die unter dem Begriff "Waldsterben" bekannt geworden sind. Trotz verstärkter Forschungen auf diesem Gebiet ist die Ursache der Erkrankungen und damit natürlich eine mögliche Therapie nicht eindeutig bekannt. Die Hauptschuld am Waldsterben wird zur Zeit der Luftverschmutzung gegeben. Hauptsächlich der saure Regen sowie hohe Konzentrationen an Ozon und Stickoxyden werden für die Erkrankungen verantwortlich gemacht. In zunehmendem Maße werden auch Infektionseinflüsse z.B. durch Pilze und Viren als mögliche Ursachen diskutiert.
Die Verluste durch Waldschäden wachsen mittlerweile in erschreckende Höhe. Von den insgesamt über 7 Millionen Hektar Waldfläche in der Bundesrepublik sind inzwischen etwa 40% geschädigt, das entspricht einem Vermögenswert von ungefährt 70 Milliarden DM. Die Tendenz ist weiter steigend. Damit sind auch die Arbeitsplätze der 800.000 in der Forstwirtschaft Beschäftigten gefährdet. In absehbarer Zeit wird kein gesunder Baum mehr gefällt werden können, da zunächst die erkrankten Bäume herausgeschlagen werden müssen. Die Auswirkungen dieser Entwicklung auf die Holzwirtschaft sind noch nicht abzusehen.
Im Bereich der Landwirtschaft werden Infektionskrankheiten immer schwerwiegender. Dies ist unter anderem eine Folge des Anbaus hochveredelter Sorten in Monokulturen. Aktuelle Beispiele sind Pilzkrankheiten bei Getreide, Viruskrankheiten bei Kartoffel, Zuckerrübe und Obstbäumen.
Um Schadenserhebungen bei Walderkrankungen durchzuführen sowie Aussagen über Art und Weise der Ausbreitung der Krankheit zu erhalten, ist es notwendig, in bestimmten Zeitintervallen den Zustand der Bäume zu überprüfen. Hierzu werden die Baumbestände von Forstbeamten in Augenschein genommen und in drei Schadstufen eingeteilt. Kriterien für die Beurteilung stellen dabei z.B. der Benadelungs- und Belaubungszustand der Kronen, Verfärbung von Nadeln und Blättern, sogenannte Angsttriebe sowie Veränderungen von Stamm und Rinde dar. Da die Symptomausprägung aber nur in den wenigsten Fällen eindeutig ist, muß die Einteilung in die Schadstufen subjektiv erfolgen. Auch eine Beurteilung des Waldzustandes aus der Luft mit Hilfe von Infrarotaufnahmen ist nicht ausreichend. Jüngere Bäume können mit dieser Technik z.B. nicht beurteilt werden. Gerade bei solchen Bäumen wäre eine objektive Beurteilung wünschenswert. Könnte man bereits bei Setzlingen erkennen, ob sie erkrankt sind, so könnte man sie rechtzeitig durch gesunde Pflanzen ersetzen ohne weiteren nutzlosen Kultivierungsaufwand.
Die Diagnose von Krankheiten bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen kann durch die Beurteilung der Symptomausprägung an den Pflanzen direkt oder nach übertragung der Krankheit auf Testpflanzen erfolgen. Dieses Verfahren ist langwierig und subjektiven Einflüssen unterworfen. Durch geschultes Personal unter Verwendung von erheblichem apparativen Aufwand wie Mikroskop oder Elektronenmikroskop sind Diagnosen auch möglich. Die neueren immunologischen Verfahren, die hauptsächlich bei Viruserkrankungen Anwendung finden, setzen eine gute Charakterisierung der Krankheitserreger voraus und werden oft durch die Pflanzeninhaltsstoffe in ihrer Aussagekraft stark beeinträchtigt.
Gegenstand der vorgestellten Erfindung ist ein gelelektrophoretisches Verfahren, womit unter anderem eine sichere Unterscheidung zwischen kranken und gesunden Bäumen sehr frühzeitig möglich ist. Eine solche gelelektrophoretische Untersuchung ist beispielhaft in Figur 1 dargestellt. Hierzu wurden jeweils 1 g Kiefernnadeln von einem augenscheinlich gesunden bzw. kranken Baum in einem Tris-HCL Puffer bei pH 8,0 und einer Ionenstärke von 100 mM in Gegenwart von 2% SDS und 25 mM Mercaptoethanol zusammen mit Phenol und Chloroform in einem Ultra Turrax homogenisiert. Nach Filtration und Reextraktion mit Phenol/Chloroform wurde die Nukleinsäure aus dem Pflanzenextrakt durch Zugabe von Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde in 200 ijl Elektrophoresepuffer gelöst. Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte in einer zweidimensionalen 5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese, wobei sie zunächst unter denaturierenden Bedingungen bei 8 M Harnstoff und 50°C und dann in der 2. Dimension ohne Harnstoff bei 209C liefen. Das Gel wurde anschließend mit Silber-Nitrat gefärbt. Deutlich ist in der Probe des erkrankten Baumes (Fig. 1b) die durch den Pfeil markierte Bande zusäzlich zu den Banden der Probe des gesunden Baumes (Fig. la) erkennbar. Oberraschenderweise zeigte sich, daß diese zusätzlichen Nukleinsäuren unabhängig vom Standort und Alter der Kiefern in allen vom "Waldsterben" betroffenen Bäumen nachgewiesen werden können. Ebenfalls deutliche Unterschiede im Bandenmuster nach der zweidimensionalen Gelelektrophorese konnten inzwischen auch bei erkrankten Fichten und Buchen gefunden werden.
In ähnlicher Weise kann das Verfahren auf die Diagnose von Krankheiten landwirtschaftlicher Nutzpflanzen angewendet werden. Beispiele hierfür sind Viruskrankheiten, welche bei Getreide, Kartoffel, Zuckerrüben, Obstbäumen und Weinreben auftreten. Das beschriebene Verfahren wurde bisher erfolgreich bei der Rizomania-Krankheit von Zuckerrüben, die durch das Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) hervorgerufen wird, und bei der Adernvergilbung von Äpfeln, die durch nicht charakterisierte Viren hervorgerufen wird, angewendet. Durch das weiter unten beschriebene Verfahren der Extraktion mit Hilfe eines wäßrigen Zweiphasensystems ist die durch die Krankheit verursachte zusätzliche Nukleinsäurebande bereits in der eindimensionalen Gelelektrophorese sichtbar. Das Ergebnis ist durch Fig. 2 belegt; die zusätzliche Band in der Probe der kranken Pflanze (linke Seite) Im Vergleich zur Probe der gesunden Pflanze (rechte Seite) ist durch einen Pfeil markiert.
Mit Hilfe des erwähnten Zweiphasensystems kann die Extraktion der Nukleinsäuren mit großem Vorteil durchgeführt werden. Dazu werden die durch Zugabe von Ethanol gefällten Nukleinsäuren in 8 Teilen H20 gelöst und mit 21 Teilen 30% (w/w) Kaliumphosphat und 11 Teilen 30% (w/w) Polyethylenglykol 6000 gemischt. Zur Phasentrennung wird die Lösung kurz zentrifugiert. Die Nukleinsäuren befinden sich quantitativ in der unteren, der Salzphase, aus der sie mit 0,1Z Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) für 30 min auf Eis ausgefällt werden. Der Cetyltrimethylammoniumbromid-Niederschlag wird zweimal mit 70Xigem Ethanol gewaschen, getrocknet und in H20 aufgenommen. Die Reinigung der Nukleinsäuren von den störenden Pflanzeninhaltsstoffen ist dabei so effektiv, daß Unterschiede im Nukleinsäuremuster bereits in der eindimensionalen Gelelektrophorese sichtbar werden (s. Fig. 2). Die Verwendung der Extraktion mit Hilfe des wäßrigen Zweiphasensystems erspart bei allen Folgeschritten zusätzliche Reinigungsprozeduren.
Es ist durchaus möglich, die Untersuchungen auf eine bestimmte RNA bzw.
Nukleinsäuresequenz nicht nur gelelektrophoretisch, sondern auch mit Hilfe moderner molekularer Hybridisierungstechniken durchzuführen.
Findet sich dann in Blatt- oder Nadel proben eine solche Nukleinsäure, wie im vorgestellten Beispiel die zusätzliche RNA in Kieferngewebe, so kann davon ausgegangen werden, daß der Baum erkrankt ist, auch wenn eine sichtbare Symptomausprägung noch nicht stattgefunden hat. Damit erlaubt der Test eine objektive Früherkennung und Kartierung der Schäden Bäume können rechtzeitig gefällt werden, bevor eine Minderung der Holzqualität, bedingt durch die Krankheit, eingesetzt hat. Resistente oder resistentere Bäume können frühzeitig erkannt werden. Der Test ist zudem sehr einfach und schnell durchzuführen und eignet sich für Reihenuntersuchungen einiger Hundert Bäume pro Tag pro untersuchende Person.

Claims

PAT ENTANSP RO CHE 1. Verfahren zur Erkennung von Pflanzenkrankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß Unterschiede im Nukleinsäuremuster zwischenkranken und gesunden Pflanzen zur Erkennung ausgenutzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Erkennung von Waldschäden dient und Unterschiede im Nukleinsäuremuster zwischen kranken und gesunden Bäumen zur Erkennung ausgenutzt werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede vor Ausprägung der Krankheitssymptome ausgenutzt werden können.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede gelelektrophoreti sch nachgewiesen werden können.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede mit Hilfe einer zweidimensionalen Gelelektrophorese in Verbindung mit einer Silberfärbung nachgewiesen werden können.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede mit Hilfe molekularer Hybridisierungstechniken nachgewiesen werden können.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede mit Hilfe der Dot-Blot-Hybridisierung nachgewiesen werden können.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Anwendung kommmende Hybridisierungsprobe die komplementäre Sequenz einer der Banden darstellt, die in der kranken Pflanze anwesend, in der gesunden Pflanze abwesend ist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Extraktion der Nukleinsäure aus den Pflanzen ein wässriges Zweiphasensystem benutzt wird.