CN104878077A

CN104878077A - PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒

Info

Publication number: CN104878077A
Application number: CN201410071895.8A
Authority: CN
Inventors: 谭巍; 史镜宇; 王广银; 黄云坚; 马小伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明提出了一种PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒，其检测引物，包括如下序列：ACPPmRNA基因的引物设计与合成：上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’。检测试剂盒，包括：包括RT-PCR反应液、MMLV RT/Hot start Taq Mix、阳性对照以及阴性对照。利用本发明制备的PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，优于PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR组合检测试剂盒，其检测灵敏度提高至90%以上。

Description

PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒。

背景技术

ACPP（前列腺酸性磷酸酶，）是编码非特异性酪氨酸磷酸酶，在酸性（PH4-6）条件下，此酶对多种底物具有去磷酸化作用。ACPP底物包括烷基，芳基和酰基的正磷酸单酯和磷酸化蛋白质。在雄性激素的调控下前列腺上皮细胞合成ACPP，并分泌到精液中。在前列腺中ACPP mRNA的表达量是任何其他组织的100倍以上。利用ACPP抗体进行IHC染色显示在前列腺组织中细胞内和细胞间均出现很明显的免疫组化染色反应，证明ACPP是一种前列腺特异基因。ACPP蛋白能在血清中被检测出来。在病理状态下，前列腺上皮细胞会脱落进入血液和尿液中。受损的前列腺上皮细胞将释放出ACPP mRNA和蛋白质成分。自1940年以来，血清ACPP一直被作为前列腺癌的诊断标志物。但是，ACPP在前列腺癌变，特别是早期癌变中变化不大，八十年代，ACPP检测被PSA（Prostate Cancer membrane Antigen，又称KLK3）检测取代了。前列腺癌特异性基因（如PCA3mRNA）的表达已被用于前列腺癌的诊断。然而，单个基因的定量检测可能受到多方面的干扰，如：样品中前列腺上皮细胞的RNA总量以及RNA百分含量等。一些持家基因如GAPDH和肌动蛋白已被证明可用作内控。然而，他们都存在的缺陷。在前列腺癌的发展过程中GAPDH mRNA表达水平会发生变化，而肌动蛋白和TBP可在其他组织中表达，降低分析的准确性。这些问题对仅能获得少量样本的恶性肿瘤的早期检测或筛查影响很大。ACPP mRNA作为定量内控远远优于上述提到的那些内控：第一，ACPP mRNA在前列腺中有很高的表达，并能够容易且可靠地检测出来。第二，ACPP mRNA仅在前列腺上皮细胞中表达，特异性强。第三，在正常前列腺上皮细胞与前列腺肿瘤细胞中ACPP mRNA表达水平基本一致。因此，ACPP mRNA水平是一个非常好的细胞定量的内控（内参）基因，提供样品中前列腺上皮细胞含量的信息。前列腺特异性基因ACPP mRNA的定量分析提供了一个敏感的方法，可用于生物活检标本或循环系统的前列腺癌细胞样本中前列腺上皮细胞的定量检测。它可以被用来监测前列腺癌扩散到循环系统和其他器官的情况。当与其他标记物相结合时，它也可以用于前列腺癌的高度准确的筛查。

通过Northern blot法分析正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌细胞及其转移灶，PCA3基因特异性地高度表达于人类前列腺癌细胞，正常前列腺、良性前列腺增生细胞中仅少量表达。Bussemakers在56例前列腺癌患者中就发现有53例的PCA3基因强阳性，肿瘤组织与癌旁组织相比，其表达量上调10-100倍，但是肿瘤组织PSA mRNA的表达与前列腺增生组织相比没有明显差别，因此认为与PSA相比，PCA3基因是一个前列腺癌特异性很强的基因。这表明PCA3mRNA可以作为诊断前列腺癌或者判断预后的有价值的肿瘤标记物。使PCA3表达具有前列腺癌特异性的基因启动子可以为前列腺癌的基因治疗提供新的分子生物学工具。Bussemakers在前列腺癌组织中均观察到PCA3基因的表达，这表明PCA3可能是前列腺癌发生发展中的早期事件，其表达的上调可能提示肿瘤的发生，或者提示PCA3基因在前列腺癌发生发展过程中起着一定的作用。PCA3基因的表达量随着肿瘤细胞恶性程度的增加有逐渐增强的趋势，提示 PCA3基因对于前列腺癌的临床分期及病理分级有潜在价值。运用高灵敏度的RT-PCR技术，在正常人动脉、大脑、乳腺、膀胱、结肠、十二指肠、心脏、肝脏、肺、睾丸、胰腺、胎盘、精囊、肌肉、皮肤、脾脏、卵巢等中均未见PCA3表达，来源于乳腺、十二指肠、睾丸、卵巢的肿瘤组织中也未见PCA3基因表达。分析前列腺癌的八种细胞系，分别是ALVA-31、DU-145、JCA-1、LNCaP、PC-3、PPC-1和TSU-prl，发现PCA3基因仅在LNCaP细胞系中表达，LNCaP细胞为雄激素依赖细胞系，PC-3、DU-145等为雄激素非依赖细胞系，PCA3基因在PC-3、DU-145中表达缺失可能提示PCA3基因前列腺癌细胞在由激素依赖向非依赖的转变过程中起着一定作用，研究PCA3基因的功能可能会给前列腺癌由激素依赖向非依赖转变的机制提供新的思路。PCA3基因多表达于前列腺癌上皮细胞，而不是基质细胞，通过RISH(RNA原位杂交)法可以证实。

同样，de Kok等研究发现PCA3是诊断前列腺癌的特异性、高灵敏性的工具。运用实时定量的RT-PCR技术，能准确量化地检测PCA3。它具有诊断前列腺癌和判断其预后的价值。de Kok等运用实时定量RT-PCR技术，绝对定量正常前列腺、前列腺增生组织、前列腺癌组织中PCA3拷贝数，同时定量各样本中rRNA拷贝数，取其比值来减少样本间差异。为了比较PCA3作为诊断前列腺癌工具的有效性，有学者把PCA3在上述组织中的表达与其它敏感的前列腺癌瘤标比较，如人端粒末端转移酶反转录酶基因(hTERTgene)，hTERT是通过端粒末端转移酶的活性来表达的，端粒末端转移酶活性被认为是一个有前景的前列腺癌相关肿瘤标记物，在90%以上的前列腺癌中发现高表达，在正常和良性前列腺增生组织中表达很低或不表达。de Kok等通过分析11例正常前列腺、5例BHP和31例前列腺腺癌样本发现，PCA3和hTERT在前两种标本中含量都很少，PCA3(均值为1.7，范围0～5.2)和hTERT(均值为174，范围0～593)，两者之间没有明显的差别。但在前列腺腺癌中，PCA3(334～39465、均值为5849,p＜0.0001)和hTERT(0.7～76.1、均值为10.1,P＜0.0001)均有显著的统计学意义。与良性组织相比，前列腺腺癌细胞中PCA3的含量增加了34倍，而hTERT仅为6倍。即使组织中前列腺癌细胞的含量少(≤10%)，PCA3的表达量也明显高于正常或者增生的前列腺组织。在白细胞中无PCA3表达，但是能检测到hTERT mRNA，表明如果通过血液、尿液、前列腺按摩液或者精液，hTERT mRNA可能导致假阳性，而PCA3mRNA却能检测出进入这些体液的少量癌细胞。没有发现PCA3的表达与前列腺癌的临床分期及病理分级有相关性。通过接收机运行曲线(Receiver operating curve ROC)分析，曲线下面积(Area under the curve AUC)代表其诊断效率。PCA3的AUC-ROC为0.98(95%可信区间0.96～1.00)，而hTERT的AUC-ROC为0.88(95%可信区间0.78～0.97)，表明PCA3诊断前列腺癌的特异性和敏感性要好于hTERT。

PCA3基因是一种非编码基因，在检测方面，无法使用以蛋白或抗体为基础的检测方法。RISH法、RT-PCR技术可在前列腺组织穿刺细胞学活检和体液(如血液、精液、尿液和前列腺按摩液)检测中应用。

ACPP mRNA在前列腺中的高表达，是一个前列腺特异基因，是前列腺癌RT-PCR检测中理想的内参.与PSA mRNA内参的相比，以他们有相似的前列腺的应用，在前列腺中的表达比其他组织高1000倍以上，而ACPP在人群中表达的个体差异不明显。

但是，与正常前列腺组织相比，PSA在前列腺癌中的表达升高两倍（p，0.01）；而ACPP的表达没有变化。

前列腺癌(PCa)为老年性疾病，具有病因复杂、发病部位隐蔽、潜伏期长且病理表现多样等特点，是欧美国家男性泌尿生殖道最常见的恶性肿瘤之一，发病率在美国男性肿瘤中占第二位，约占男性肿瘤的17%，死亡率占第二位。2003年美国新发现前列腺癌患者220900人，死亡28900人。迄今为止，我国前列腺癌发病率虽远低于欧美发达国家，但其增长较为迅速。由于我国人口老龄化、饮食结构的改变以及诊断技术的不断提高，前列腺癌的发病率在不断上升。顾方六等以北京大学泌尿外科研究所建所前后50年间泌尿外科共收治住院病人为研究对象，发现80年代后前列腺癌在泌尿系肿瘤中所占比例呈直线上升趋势，由3.3%上升至13.4%。全国的发病率已由50年代的0.2/10万升至90年代的1.2-3.4/10万，依据2012年中国肿瘤登记年报显示，前列腺癌为中国男性癌症发病率的第6位，中国逻辑性癌症死亡率的第9位，虽然与欧美国家的102/10万相比要低得多，但也有逐年增高的趋势。因此前列腺癌的早期诊断有重要的临床意义。

早期前列腺癌可以通过前列腺癌根治手术或者放疗获得治愈，如果肿瘤发生了远处转移或者局部临近器官的侵犯，临床治疗效果较差。我国前列腺癌患者在确诊时往往处于进展期，抗雄性激素治疗虽然在一定范围内可以抑制肿瘤进展，但终究不能根治，该类前列腺癌患者预后往往较差。目前的临床检查方法也不能判断前列腺癌患者的病情是将保持稳定还是将进展为威胁患者生命的侵袭性前列腺癌。目前临床上把PSA(前列腺特异抗原)作为筛选前列腺癌的首选标记物，PSA具有前列腺组织特异性，无前列腺癌特异性，前列腺增生、前列腺炎、急性尿储留、前列腺的各种手术操作和有关前列腺的各种检查(如DRE)，即使仅有很轻微的损伤，均可引起血清PSA水平的升高，导致诊断的特异性降低，临床使用其筛选前列腺癌时常常导致不必要的前列腺穿刺。因此，寻找早期发现前列腺癌的肿瘤标记物成为降低前列腺癌死亡率的关键。目前在前列腺癌肿瘤标志物的研究方面已经取得了很大的进展，发现了一些前列腺癌特异的基因或者抗原，PSMA已被广泛地运用于前列腺癌的临床诊断和治疗中。近年来发现的人血管舒缓素激肤释放酶2(human kallikrein-2)和前列腺干细胞抗原(PSCA)也被证实为前列腺癌特异性基因，但它们并不能提高前列腺癌的早期诊断率。基因DD3mRNA（即为PCA3mRNA）高度表达于前列腺癌细胞中(＞95%)，对于前列腺癌诊断的敏感性和特异性大于90%，作为早期诊断、判断预后的肿瘤标志物，显示出良好的应用前景。

从国内外研究成果来看，PCA3mRNA对前列腺癌的诊断灵敏度与特异性均好PSA，将替代PSA检测成为前列腺癌一线诊断试剂，其主要用途有：

1）临床前列腺癌的早期筛查与诊断；

2）前列腺疾病人群的前列腺癌的排除诊断；

3）前列腺癌病人预后诊断与疗效评价；

4）男性人群的健康体检筛查。

发明内容

本发明提出一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒，解决了现有技术中对前列腺癌的诊断灵敏度与特异性差的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物，包括如下序列：

ACPPmRNA基因的引物设计与合成：参照Genebank提供的ACPPmRNA基因序列，应用Genamic expression软件设计5’端及3’端引物：

上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’

下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’。

一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，包括：

ACPPmRNA基因的引物设计与合成：

上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’

下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’；以及

PCA3mRNA基因的引物设计与合成：参照Genebank提供的PCA3mRNA序列，应用Genamic expression软件设计5’端及3’端引物；共设计2对引物；

第1对引物设计如下：

上游引物：5’-TGGGAAGGACCTGATGATACA-3'；

下游引物：5’-CCCAGGGATCTCTGTGCTT-3'，扩增产物为220bp；

第2对引物设计如下：

上游引物：5'-TGGCAGGGGTGAGAAATAAG-3'；

下游引物：5'-TGCTTCCTTTTGTGCTTCCT-3'，扩增产物为186bp。

作为优选的技术方案，所述检测试剂盒包括RT-PCR反应液、MMLV RT/Hot start Taq Mix、阳性对照以及阴性对照。

作为优选的技术方案，所述试剂盒中各组分的量为RT-PCR反应液：200ul；MMLV RT/Hot start Taq Mix：20ul；阳性对照（cDNA)：20ul；阴性对照（cDNA)：20ul。

作为优选的技术方案，所述RT-PCR反应液的组成如下，10×RT-PCR Buffer：20.0ul；25mM MgCl₂：16.0ul；10mM dNTP：4.0ul；ACPPmRNA5’端引物：2.0ul；ACPPmRNA3’端引物：2.0ul；PCA3mRNA5’端引物：2.0ul；PCA3mRNA3’端引物：2.0ul；ddH₂O：152ul。

有益效果

（1）本发明提供了一种前列腺特异基因ACPP mRNA定量检测新方法，该方法可以检测前列腺组织、前列腺按摩液、精液、血液、尿液（或尿液沉渣）等样本中的ACPP mRNA表达量。由于前列腺组织细胞与前列腺癌细胞均有ACPPmRNA的高表达，所以对ACPP mRNA的检测，可以确定样本中是否含有列腺组织细胞与前列腺癌细胞和他们的含量。而基因DD3mRNA（即为PCA3mRNA）高度表达于前列腺癌细胞中(＞95%)，可作为前列腺癌早期诊断、判断预后的肿瘤标志物。PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒是以ACPP mRNA为内参的分子诊断试剂，极大地提高了前列腺癌检测的灵敏度与特异性，诊断准确率更高。

（2）ACPP mRNA在前列腺中有很高的表达，并能够容易且可靠地检测出来；ACPP mRNA仅在前列腺上皮细胞中表达，特异性强；在正常前列腺上皮细胞与前列腺肿瘤细胞中ACPP mRNA表达水平基本一致。

利用ACPP mRNA作为前列腺癌PCA3mRNA RT-PCR检测内参十分理想，一方面可以计算PCA3mRNA/ACPP mRNA比值，确认检测结果，判定前列腺癌；另一方面由于ACPP mNRA仅在前列腺上皮细胞（或前列腺癌细胞）中表达，ACPPmRNA的检测结果可以判定组织细胞样本取样是否成功，进而判定实验是否成功。增加检测结果的可信度。

（3）利用本发明制备的PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，是一项创新的组合，优于PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR组合检测试剂盒，其检测灵敏度提高至90%以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1：ACPPmRNA RT-PCR检测灵敏度实验结果电泳图；

图2为本发明实施例2：PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测灵敏度实验结果电泳图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

ACPPmRNA RT-PCR检测

1.ACPPmRNA基因引物设计与合成：参照Genebank提供的ACPPmRNA基因序列，应用Genamic expression软件设计5’端及3’端引物：

上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’

下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’

经过生物信息学分析、BLAST检索，以上引物均有高度特异性100%，未发现有同源序列，是非常好的引物.

2.LNCaP细胞培养与应用：LNCaP细胞为人前列腺癌细胞，可以高表达 ACPPmRNA，可以利用该细胞研究RT-PCR反应条件与进行相关实验。

LNCaP细胞的复苏：水浴箱先升温至37℃，取出冻存管置入水浴(37℃)中摇动至融化，至悬液状。75%酒精消毒冻存管口，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上的培养液，混合后离心1000gX5min，去上清。用培养液适当稀释后，接种培养瓶，置于37℃5%CO2孵箱中静置培养。LNCaP细胞贴壁需24-36h，第3天更换培养液一次，期间勿频繁拿放观察，以免影响细胞贴壁。

更换培养液步骤:用吸管吸出旧培养液或倒出，后用Hanks液(pH7.0-7.2)洗1-2遍，再加入数毫升新培养液(pH7.0-7.2)置CO₂孵箱培养。

传代步骤:经过1周左右换液，培养瓶中LNCaP细胞生长状态良好，已覆盖80%瓶底，细胞形态呈单层、多角形且彼此粘连时可传代。

(1)吸取或倒掉瓶内旧培养液；

(2)加入1ml左右(150ml培养瓶)0.25%胰蛋白酶，轻摇培养瓶，使消化液浸润所有细胞表面；

(3)消化液最好在370C(胰酶作用最适温度)，放入CO2孵箱，消化2-5min后把培养瓶置于显微镜下观察，见细胞回缩、细胞间隙增大时，立即终止消化；

(4)可使用含10%血清培养液或血清终止消化，轻拍瓶底，镜下可见大量细胞在悬液中，少量贴壁，可用弯头吸管，吸取培养液，反复按顺序轻柔吹打瓶底细胞；

(5)细胞计数或直接将细胞悬液等分两瓶，并再加入少许新培养液，置CO2孵箱中。

LNCaP细胞的收集：对大多数细胞株来说，一个直径90mm培养皿中，培养细胞的总RNA回收率100-200ug(mRNA约为1-2ug)。

(1)取生长旺盛(对数生长期细胞)占瓶底90%以上，去旧培养液加入胰酶消化(同前)；(2)细胞悬液(计数5X10⁶)离心后去上清；

(3)加入数毫升0.9%生理盐水重悬细胞，移入Eppendorf管中，离心后去上清(消除胰酶对实验的影响)。Eppendorf管封管后置液氮瓶中保存备用。

3.mRNA的高效提取

经典的总RNA提取方法，适用于组织样本（前列腺组织）、前列按摩液、精液及细胞培养物等样本。

(1)样品裂解:LNCaP细胞培养瓶(细胞数约5X10⁶)加TRIzol800ul，立即混匀，抽打裂解酶5-10次，室温5min静置。

(2)加入200ul氯仿，用力颠倒混匀10S，室温静置5min。

(3)高速离心10000g X15min,4℃。

(4)移上层水相到1.5ml管内，加入500ul异丙醇振荡混匀。室温静置10min，4℃离心10000g X10min

(5)去上清，用75%乙醇1ml,4℃离心7500gX5min。

(6)晾干乙醇，室温倒置5-15min，使RNA沉淀，恰好干燥。

(7)溶解RNA，加入0.1%DEPC水50ul。

(8)2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

4.逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：

(1)逆转录反应：在PCR反应管中加入下列成分(按10ul反应体积计算)

10×RT Buffer	1.0ul
		25mM MgCl₂	2.0ul
10mM dNTP	1.0ul
		RNase inhibitor(40u/ul)	0.25ul
AMV Reverse Transcriptase	0.5ul

Random9mers	0.5ul
		Positive control RNA样品	1.0ul
RNase Free ddH₂O	3.75ul

反应液混匀后离心，30℃10min，42℃30min,99℃5min,5℃5min。

(2)PCR扩增反应：在PCR反应管中加入下列成分(按50ul体积计算)

5×PCR Buffer	10.0ul
		25mM MgCl₂	4.0ul
10mM dNTP	1.0ul
		TaKaRa Ex Taq^TM HS(5u/ul)	0.25ul
5’端引物	0.5ul
		3’端引物	0.5ul
逆转录产物	2.0ul
		ddH₂O	31.75ul

开始循环：94℃2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s重复35个循环。末次循环后再延伸5min。反应结束后，短暂离心，吸取5ul电泳分析，余置-20℃冰箱。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认反应产物，见图1。

经电泳分析，LNCaP细胞表达ACPmRNA基因。该方案具有良好的检测性能。

ACPPmRNA在前列腺中的高表达，是一个前列腺特异基因，是前列腺癌RT-PCR检测中理想的内参，是PSAmRNA内参的良好替代物，以ACPPmRNA作为RT-PCR检测内参具有以下的优点：

在前列腺中ACPPmRNA高表达，是任何其他组织的1000倍以上，所以样本中ACPPmRNA拷贝数高，很容易通过RT-PCR检测到，即易检测，有较好的检测敏感性；

通过ACPP抗体进行IHC染色显示，在前列腺组织中细胞内和细胞间均出现明显的免疫组化染色反应，证明ACPP是一种前列腺特异基因，即具有前列腺组织特异性。

ACPP是一种前列腺特异基因，所以具有前列腺组织的广谱性，由于只在前列腺组织表达，无论是前列腺增生、前列腺炎、前列腺癌等前列腺疾病均可检测到。避免了漏检的发生。在前列腺病变中，ACPP的表达量保持稳定，是少有的特异的内参。与之相比较，PSA基因表达水平在一些前列腺癌中显著升高。

由于样本（静脉血，精液或尿液）中前列腺组织细胞量往往极微量，需要对样本取样的有效性进行监测，才能保证检测结果的可靠性。所以ACPPmRNA不仅是定量检测的内参指标，同时也是样本有效性的监测指标。

实施例2

PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒的制作

试剂组成：

制作步骤如下：

1）制备阳性对照：

LNCaP细胞培养与应用：LNCaP细胞为人前列腺癌细胞，可以高表达ACPPmRNA，同时高表达PCA3mRNA，可以利用该细胞研究RT-PCR反应条件与进行相关实验。

更换培养液步骤:用吸管吸出旧培养液或倒出，后用Hanks液(pH7.0-7.2)洗1-2遍，再加入数毫升新培养液(pH7.0-7.2)置CO2孵箱培养。

(1)吸取或倒掉瓶内旧培养液；

(1)取生长旺盛(对数生长期细胞)占瓶底90%以上，去旧培养液加入胰酶消化(同前)；(2)细胞悬液(计数5X106)离心后去上清；

收集LNCaP细胞，依据RNA提取试剂盒操作说明书，提取LNCaP的总RNA。

(1)样品裂解:LNCaP细胞培养瓶(细胞数约5X106)加TRIzol800ul，立即混匀，抽打裂解酶5-10次，室温5min静置。

(2)加入200ul氯仿，用力颠倒混匀10S，室温静置5min。

(3)高速离心10000g X15min,4℃。

(5)去上清，用75%乙醇1ml,4℃离心7500gX5min。

(6)晾干乙醇，室温倒置5-15min，使RNA沉淀，恰好干燥。

(7)溶解RNA，加入0.1%DEPC水50ul。

(8)2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

提取LNCaP的总RNA，通过逆转录反应，制作cDNA，逆转录反应体系如下：

10×RT Buffer	1.0ul
		25mM MgCl2	2.0ul
10mM dNTP	1.0ul
		RNase inhibitor(40u/ul)	0.25ul
AMV Reverse Transcriptase	0.5ul
		Random9mers	0.5ul
Positive control RNA样品	1.0ul
		RNase Free ddH2O	3.75ul

反应液混匀后离心，30℃10min，42℃30min,99℃5min,5℃5min。

反应结束时，进行热灭活，使AMV Reverse Transcriptase失去活性，反应液用1×RT Buffer进行稀释，即为阳性对照，阳性对照中含有PCA3mRNA与ACPPmRNA的转录产物。

每管分装20ul，于-20～-80℃中保存备用。

2）制备阴性对照：

收集RWPE-1细胞，依据RNA提取试剂盒操作说明书，提取LNCaP的总RNA，通过逆转录反应，制作cDNA，逆转录反应体系如下：

10×RT Buffer	1.0ul
		25mM MgCl2	2.0ul
10mM dNTP	1.0ul

RNase inhibitor(40u/ul)	0.25ul
		AMV Reverse Transcriptase	0.5ul
Random9mers	0.5ul
		Positive control RNA样品	1.0ul
RNase Free ddH2O	3.75ul

反应结束时，进行热灭活，使AMV Reverse Transcriptase失去活性，反应液用1×RT Buffer进行稀释，即为阳性对照，阴性对照中只有ACPPmRNA的转录产物，没有PCAmRNA的转录产物。

每管分装20ul，于-20～-80℃中保存备用。

3）配制RT-PCR反应液：

RT-PCR反应液配方如下

10×RT-PCR Buffer	20.0ul
		25mM MgCl2	16.0ul
10mM dNTP	4.0ul
		ACPPmRNA5’端引物	2.0ul
ACPPmRNA3’端引物	2.0ul
		PCA3mRNA5’端引物	2.0ul
PCA3mRNA3’端引物	2.0ul
		ddH2O	152ul
总体积	200ul

依据以上配方，可以一性次配制50ml，然后分装成200ul/管。-20℃冻存备用。

开始循环：94℃2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s重复35个循环。末次循环后再延伸5min。反应结束后，短暂离心，吸取5ul电泳分析，余置-20℃冰箱。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认反应产物，见图2。

经电泳分析：前列腺正常细胞与前列腺癌细胞均高表达ACPPmRNA，而前列腺癌细胞株中LNCaP、LNCaP clone FGC、前列腺癌患者1,2,3、22RV1等6个样本中检测到PCA3mRNA的表达；而正常前列腺细胞RWPE-1与正常人精液中没有到PCA3mRNA的表达。

4）酶混合的配制：

MMLV RT逆转录酶与Hot start Taq热启动Taq酶，依据1∶1配制，混匀后分装成20ul/管，以1ul/次的标准使用。

应用本发明技术制备的PCA3mRNA/ACPPmRNA RT-PCR检测试剂盒的质量标准

1）准确性：取10份阴性质控品（正常前列腺细胞株或前列腺按摩液等）进行检测时，检测结果无假阳性出现，全部为阴性，只有ACPPmRNA RT-PCR产物的电泳条带，不出现PCA3mRNA RT-PCR产物的电泳条带；

取10份阳性质控品（如：LNCaP细胞株、Du145细胞株、PC-3系列细胞株、PANC-1细胞株等）进行检测时，检测结果无假阴性，全部为阳性。

2)临床标本的初步评估是

A.PCA3mRNA/ACPPmRNA比值的临界值设定为：1.23×10-3；

B.检测敏感性为：90%以上；敏感性=真阳性/(真阳性+假阴性)

C.检测特异性为：90%以上；特异性=真阴性/(真阴性+假阳性)

D.阳性预测值为：90%以上；阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)

E.阴性预测值为：90%以上；阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)

PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒对前列腺癌患者的检测

为了判断“PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒”的临床应用性能，特进行小范围的临床样本的检测验证。收集的临床样本有：前列腺癌50例（血液30例、尿液15例、前列腺按摩液5例等）、前列腺增生20例（血液10、尿液10例等）、前列腺炎25例（血液10例、尿液15例）、健康人50例（尿液40例、5例精液、血液5例等）。

检测结果见下表：

本实验结果表明：PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒对于前列腺癌的检出符合率为94%，阴性样本没有检测阳性，即不出现假阳性。

PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒与PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR检测试剂盒检测结果比较：

为了评价利用本发明的制备的PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒检测效果优于PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR检测试剂盒检测的检测效果，特此进行了平行实验，观察前列腺癌检出符合率。收集的临床样本有：前列腺癌50例（血液30例、尿液15例、前列腺按摩液5例等）、前列腺增生20例（血液10、尿液10例等）、前列腺炎25例（血液10例、尿液15例）、健康人50例（尿液40例、5例精液、血液5例等）。

本实验结果表明：利用本发明制备的PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒对前列腺癌检测的检出符合率是94%，而PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR检测试剂盒对前列腺癌检测的检出率为76%。所以利用本发明制备的检测试剂盒明显优于PCA3mRNA/PSA mRNA RT-PCR检测试剂盒,是对前列腺癌分子诊断试剂的提升。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物，包括如下序列：

ACPPmRNA基因的引物设计与合成：

上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’

下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’。

2.一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，包括：

ACPPmRNA基因的引物设计与合成：

上游引物：5’-CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3’

下游引物：5’-TATATACTCTCCAAGTTCATA-3’；以及

PCA3mRNA基因的引物设计与合成：共设计2对引物；

第1对引物设计如下：

上游引物：5’-TGGGAAGGACCTGATGATACA-3'；

下游引物：5’-CCCAGGGATCTCTGTGCTT-3'，扩增产物为220bp；

第2对引物设计如下：

上游引物：5'-TGGCAGGGGTGAGAAATAAG-3'；

下游引物：5'-TGCTTCCTTTTGTGCTTCCT-3'，扩增产物为186bp。

3.根据权利要求2所述的一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括RT-PCR反应液、MMLV RT/Hot start TaqMix、阳性对照以及阴性对照。

4.根据权利要求3所述的一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分的量为RT-PCR反应液：200ul；MMLVRT/Hot start Taq Mix：20ul；阳性对照（cDNA)：20ul；阴性对照（cDNA)：20ul。

5.根据权利要求3所述的一种PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液的组成如下，10×RT-PCR Buffer：20.0ul；25mM MgCl₂：16.0ul；10mM dNTP：4.0ul；ACPPmRNA5’端引物：2.0ul；ACPPmRNA3’端引物：2.0ul；PCA3mRNA5’端引物：2.0ul；PCA3mRNA3’端引物：2.0ul；ddH₂O：152ul。