ES2863926T3 - Ensayo de indolamina-2,3-dioxigenasa para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata - Google Patents

Ensayo de indolamina-2,3-dioxigenasa para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para - predecir el riesgo de un paciente de tener o desarrollar cáncer de próstata (PCa), - asignar a un paciente para una biopsia de próstata, - predecir el riesgo de un paciente de tener un PCa clínicamente relevante, - predecir el riesgo de un paciente de tener un PCa indolente, - distinguir entre cánceres indolentes y agresivos, - predecir el riesgo de un paciente de recidiva o recurrencia bioquímica de cáncer de próstata, y/o - predecir el riesgo de un paciente de progresión de un cáncer de próstata indolente a cáncer de próstata clínicamente relevante; en el que dicho procedimiento comprende detectar/ cuantificar el nivel de ARNm o proteína de indolamina-2,3- dioxigenasa (IDO) en una muestra de orina obtenida de dicho paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo de indolamina-2,3-dioxigenasa para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata
Antecedentes
El cáncer de próstata (PCa) es el cáncer más común en los hombres y una de las principales causas de mortalidad por cáncer en los hombres en los países desarrollados. La mayoría de los casos de cáncer de próstata terminal se originan a través de un proceso de progresión desde un tumor órgano-confinado de crecimiento lento hasta un cáncer de próstata resistente a la castración altamente invasivo (CRPC).
De acuerdo con un estudio grande (Schroder et al., (2009), New England J Med 360, 1320-8), la detección actual basada en el antígeno prostático específico (PSA) reduce la tasa de muerte por cáncer de próstata en 20 % pero se asocia con un alto riesgo de sobrediagnóstico, Rev Urol. 009; 11 (3): 127-133 doi: 10,3909/riu0474.
Actualmente, la biopsia de próstata es el procedimiento estándar de referencia para la detección del cáncer de próstata, a pesar de su asociación con posibles efectos secundarios dañinos para los pacientes, sus altos costos y una tasa definida de falsos positivos (11,5% según lo informado por Epstein et al, Utility of saturation biopsy to predict insignificant cancer at prostatectomía radical, volumen 66, Emisión 2 Agosto de 2005 Páginas 356-360) y negativo (23% según Rabbani et al., Incidence and clinical significance of false-negative sextant prostate biopsies, The Journal of Urology, Volumen 159, Emisión 472 Abril de 1998, Páginas 1247-1250).
El cáncer de próstata clínicamente localizado se trata típicamente mediante terapias bien establecidas como prostatectomía radical, braquiterapia y terapia de radiación haz externo. Si bien muchos pacientes se pueden curar con terapia local definitiva, algunos tendrán una recurrencia bioquímica (BR) de la enfermedad detectada por un PSA sérico en aumento después del tratamiento con prostatectomía radical.
La Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos (FDA) ha aprobado una prueba de cáncer de próstata basada en la detección del gen 3 del cáncer de próstata (PCA3) en la orina, pero se ha informado que su utilidad clínica es solo marginalmente mejor que la de la detección de PSA (Vlaeminck-Guillem et al., Urology.
2010;75(2):447); Roobol et al., Eur Urol. 2010;58(4):475). También el documento WO 2013/028788 desvela procedimientos para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata usando biomarcadores de orina.
Por tanto, la mejora de los procedimientos actuales para la detección de pacientes es de gran importancia.
Un cuerpo significativo de la bibliografía sugiere que la inflamación podría cumplir un papel importante en la aparición y progresión del PCa, aunque todavía no se ha establecido una correlación directa y causal entre la inflamación y el PCa. Una considerable evidencia epidemiológica indica que el PCa es más predominante en los grupos demográficos con un mayor grado de inflamación y que los pacientes afectados por la obesidad muestran un mayor riesgo de mortalidad específica por cáncer de próstata. Además, el análisis de los tejidos prostáticos ha revelado que, en la mayoría de los casos, los adenocarcinomas se encuentran adyacentes a la inflamación crónica.
Después de la transformación debido a la acumulación de varias mutaciones genéticas y alteraciones epigenéticas, las células tumorales se eliminan por completo o progresan a un cáncer manifiesto, de acuerdo con la aptitud inmunitaria. En particular, el escape inmunológico tumoral en el PCa se produce a través de la secreción de diferentes factores solubles derivados del tumor (TDSF) con propiedades inmunosupresoras, tal como la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), arginasa, óxido nítrico sintasa (NOS) y citocinas relevantes en la coordinación de la inmunoedición del cáncer y en la modulación de la red TDSF. Entre varios modificadores microambientales, nuestro interés se centró en aquellos que se han informado como posibles mediadores del inicio y la progresión del PCa (tal como IDO, IL-6 e IL-10). En la bibliografía se informan datos controvertidos sobre el papel del microambiente en el cáncer, donde la expresión de agentes promotores de tumores putativos solo a veces se correlaciona con la agresividad del cáncer y un resultado clínico deficiente. En efecto, los niveles altos de IDO se correlacionaron con un mal pronóstico clínico en carcinomas de ovario, endometrio y colon, melanoma maligno, cáncer de mama y pulmón, pero no en el carcinoma de células renales (RCC). En este último caso, los niveles elevados de ARNm de IDO en tumores primarios o metástasis se correlacionaron positivamente con una supervivencia global más prolongada. La expresión de IDO se detectó en células endoteliales de vasos recién formados dentro del área tumoral, no en células tumorales. Otros autores han confirmado estos datos y han planteado la hipótesis de que el IDO producido por las células endoteliales puede privar a las células de cáncer del aminoácido esencial triptofano y, por lo tanto, puede inhibir su crecimiento.
Descripción
La invención proporciona un procedimiento para
- asignar a un paciente para una biopsia de próstata,
- predecir el riesgo de un paciente de tener o desarrollar cáncer de próstata,
- predecir el riesgo de un paciente de tener cáncer de próstata clínicamente relevante,
- predecir el riesgo de un paciente de tener cáncer de próstata indolente,
- distinguir entre cánceres indolentes y agresivos,
- predecir el riesgo de un paciente de recidiva del cáncer de próstata,
- predecir el riesgo de un paciente de progresión de un cáncer de próstata indolente a cáncer de próstata sintomático.
En cualquier caso, el procedimiento comprende detectar/cuantificar el nivel de ARNm o proteína de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) en una muestra de orina obtenida del paciente.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para
- predecir el riesgo de un paciente de desarrollar cáncer de próstata,
- distinguir entre cánceres indolentes y agresivos entre los pacientes indicados para someterse a biopsia prostática,
- predecir la probabilidad de recurrencia bioquímica del cáncer de próstata en un paciente que se ha sometido al tratamiento del cáncer de próstata, y/o
- predecir el riesgo de progresión de dicho cáncer de próstata en un paciente que se ha sometido al tratamiento del cáncer de próstata, particularmente prostatectomía radical, braquiterapia y/o terapia de radiación de haz externo;
En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para
- predecir el riesgo de un paciente de tener cáncer de próstata,
- predecir el riesgo de un paciente de tener cáncer de próstata clínicamente relevante con una puntuación de Gleason > 7,
- predecir el riesgo de un paciente de tener cáncer de próstata y/o inflamación prostática multifocal crónica, - predecir el riesgo de un paciente de desarrollar cáncer de próstata,
- asignar a un paciente para una biopsia de próstata,
- distinguir entre cánceres indolentes y agresivos entre pacientes indicados para someter a biopsia prostática, - predecir el riesgo de un paciente de recurrencia bioquímica de cáncer de próstata, y/o
- predecir el riesgo de un paciente de la progresión de un cáncer de próstata indolente a cáncer de próstata sintomático.
Los inventores han cuantificado el nivel de ARNm y proteína de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) en muestras de orina y han determinado valores de corte relativos que predicen si el paciente se beneficiará de someterse a una biopsia de próstata y tiene un riesgo mayor que el promedio (ponderado respecto del grupo de pacientes relevante) de progresar a recurrencia bioquímica y/o enfermedad intratable.
Los pacientes pueden ser seleccionados por su médico como en riesgo de tener un tumor de próstata de acuerdo con las directrices internacionales (nomograma previo a la biopsia: raza, edad, antecedentes familiares, nivel de PSA> 4 ng/ml, resultado DRE, biopsias previas). Los pacientes que son seleccionados por su médico como en riesgo de tener un tumor de próstata están indicados para someterse a una biopsia de próstata. La prueba de acuerdo con la invención seleccionará cuáles de estos pacientes deben ser sometidos a biopsia y cuáles no.
La prueba de acuerdo con la invención se puede realizar repetidamente para controlar el desarrollo de PCa, en cualquier momento antes o después del tratamiento. Una vez que se detecta una biopsia positiva y se decide la aplicación de un tratamiento, el diagnóstico se basa en este resultado.
Si, después de la biopsia, el paciente es asignado a vigilancia activa, la prueba de IDO se puede usar para controlar los cambios en el desarrollo de la lesión. Si, después de la biopsia, se asigna al paciente a tratamiento, la prueba IDO se puede usar para controlar la presencia de tejido tumoral residual en la próstata.
En ciertas realizaciones, el riesgo del paciente de progresión de un cáncer de próstata indolente a un cáncer de próstata sintomático o clínicamente relevante se determina en un paciente seleccionado para realizar una biopsia de próstata.
En ciertas realizaciones, el riesgo del paciente de progresión de cáncer de próstata, en particular el riesgo de progresión de un cáncer de próstata indolente al cáncer de próstata sintomático o clínicamente relevante se determina en paciente que se ha sometido al tratamiento del cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones, se determina el riesgo del paciente de recurrencia bioquímica del cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones, el riesgo del paciente de recurrencia bioquímica del cáncer de próstata se determina en un paciente que se ha sometido al tratamiento del cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, el tratamiento del cáncer de próstata se selecciona de prostatectomía radical, braquiterapia, y/o terapia de radiación de haz externo. En ciertas realizaciones, se determina el riesgo del paciente de recidiva del cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones, no se realiza DRE antes de obtener la muestra de orina. El procedimiento de acuerdo con la invención produce resultados significativos sin la ejecución de un DRE. El abandono de un DRE aumenta el cumplimiento del paciente y hace que el procedimiento de acuerdo con la invención sea más rápido y más fácil.
En ciertas realizaciones, se realiza un DRE antes de obtener la muestra de orina. Esto puede ser beneficioso en los casos en que una primera prueba IDO de acuerdo con la invención dio resultados poco informativos, debido a problemas técnicos relacionados con el gen de control y diana.
En ciertas realizaciones, el ARNm de IDO se cuantifica en dicha muestra de orina.
En ciertas realizaciones, la cuantificación del ARNm de IDO se efectúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En ciertas realizaciones, la cuantificación del ARNm de IDO se realiza por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCRq).
En ciertas realizaciones, la cuantificación del ARNm de IDO se realiza por reacción en cadena de la polimerasa digital (PCRd). La PCR digital es un refinamiento biotecnológico de los procedimientos de PCR convencionales que se pueden usar para cuantificar directamente y amplificar clonalmente las cadenas de ácidos nucleicos. La PCR digital mejora las prácticas de PCR convencionales al dividir la reacción en múltiples reacciones más pequeñas. Se divide una muestra de modo que las moléculas de ácido nucleico individuales dentro de la muestra se localizan dentro de muchas regiones separadas. Se pueden usar placas de micropocillos, capilares, emulsión de aceite y matrices de cámaras miniaturizadas con superficies de unión de ácido nucleico para dividir las muestras.
Alternativamente, la cuantificación del ARNm de IDO se puede efectuar mediante otras técnicas conocidas por el experto en la técnica.
El experto en la materia conoce procedimientos y fórmulas adecuados para calcular la relación entre IDO y la expresión del gen de control. Un ejemplo del procedimiento se describe en "Materiales y procedimientos" a continuación.
En ciertas realizaciones, el gen de control es cualquier gen expresado por las células de la próstata a niveles más altos que el IDO. El experto en la materia sabe que la expresión del gen de control tiene que ser independiente de la presencia de cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, el gen de control es un gen constitutivo expresado por las células de la próstata a niveles más altos que IDO. En determinadas realizaciones, el gen de control es GAPDH.
En ciertas realizaciones, se excluye el riesgo de tener cáncer de próstata para el paciente si el nivel de ARNm de IDO está por debajo de un umbral predeterminado de ARNm 1. En otras palabras, se determina que el riesgo de un paciente de tener cáncer de próstata es (cerca de) 0 si el nivel de ARNm de IDO está por debajo del umbral predeterminado de ARNm 1.
En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 1 es un número absoluto de copias de moléculas de ARNm de IDO entre 0 y 100 copias dentro de la muestra. La muestra puede ser un volumen de orina sin procesar, en particular entre 0,1 ml y 5 ml, más particularmente entre 0,2 ml y 2 ml, más particularmente entre 0,25 y 1 ml, incluso más en particular aproximadamente 0,5 ml. La muestra puede ser un sedimento obtenido por centrifugación de orina, en particular por centrifugación de 2 ml a 100 ml de orina, más particularmente 5 ml a 75 ml de orina, más particularmente 15 ml a 50 ml de orina, incluso más en particular, aproximadamente 20 ml de orina.
En determinadas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 1 es una relación del número de copias de ARNm de IDO con respecto a la expresión de un gen de control.
Un paciente con niveles de ARNm de IDO por debajo de este umbral de ARNm 1 tiene 0% o una probabilidad insignificante de tener PCa (Figura 1A), por lo que no se recomienda una biopsia de próstata.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un riesgo de tener o desarrollar cáncer de próstata si el nivel de ARNm de IDO está elevado en comparación con los niveles de ARNm de IDO de una población de control de individuos que no sufren de cáncer de próstata. Esto se demuestra por los resultados de la biopsia de próstata o por los resultados de la prostatectomía (cuando estén disponibles).
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un riesgo significativo de tener cáncer de próstata si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 1.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un riesgo de tener cáncer de próstata (con una mayor probabilidad de tener un cáncer de próstata indolente que un cáncer clínicamente relevante) si el nivel de ARNm de IDO está por debajo de un umbral predeterminado de ARNm 2, pero por encima de un umbral predeterminado de ARNm 1.
En ciertas realizaciones, dicho umbral predeterminado de ARNm 2 está entre 1,5 y 6 veces el umbral predeterminado de ARNm 1.
Un paciente con niveles de ARNm de IDO por debajo de este umbral predeterminado de ARNm 2 pero por encima de un umbral predeterminado de ARNm 1 se asigna al grupo para el que se puede recomendar una biopsia (Figura 1A).
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un mayor riesgo de tener cáncer de próstata (con una mayor probabilidad de tener un cáncer clínicamente relevante que un cáncer de próstata indolente) si el nivel de ARNm de IDO está por encima de un umbral predeterminado de ARNm 3.
En ciertas realizaciones, dicho umbral predeterminado de ARNm 3 está entre 6 y 10 veces el umbral predeterminado de ARNm 4.
Un paciente con niveles de ARNm de IDO por encima de este umbral de ARNm 3 se asigna al grupo para el que siempre se recomienda una biopsia.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata clínicamente relevante si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 3. En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata caracterizado por una puntuación de Gleason > 7 si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 3. En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata que requiere tratamiento después de la biopsia de próstata si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 3. Para estos pacientes siempre se recomienda la biopsia de próstata.
En ciertas realizaciones, se asigna a un paciente un alto riesgo de recurrencia bioquímica del cáncer de próstata dentro de 5 años si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 3.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata clínicamente relevante si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 4. En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata caracterizado por una puntuación de Gleason > 7 si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 1. En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata que requiere tratamiento después de la biopsia de próstata si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 4. Para estos pacientes siempre se recomienda la biopsia de próstata.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de tener un cáncer de próstata con mayores posibilidades de progresión y metastatización si el nivel de ARNm de IDO está por encima de un umbral predeterminado de ARNm 4.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un riesgo de recidiva si el nivel de ARNm de IDO está por encima de un umbral predeterminado de ARNm 4.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un alto riesgo de recurrencia bioquímica del cáncer de próstata en 5 años si el nivel de ARNm de IDO está por encima del umbral predeterminado de ARNm 4.
En ciertas realizaciones, el cuarto umbral de ARNm predeterminado es más de 20 veces mayor que el umbral de ARNm 1. Un paciente con niveles de ARNm de IDO por encima de este umbral de ARNm 4 se asigna al grupo para el que siempre se recomienda una biopsia como opción de tratamiento urgente (Figura 1A).
Umbrales de expresión de ARNm de IDO con respecto a la expresión de GAPDH
En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 1 está entre 0,0001 y 0,004 veces de expresión con respecto a la expresión de GAPDH. En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 1 es 0,0015 veces de expresión de IDO con respecto a la expresión de GAPDH.
Los datos de los inventores demuestran que un paciente con niveles de ARNm de IDO por debajo de este umbral de ARNm 1 tiene 0% o una probabilidad insignificante de tener PCa (Figura 1A).
En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 2 está entre 0,004 y 0,0090 veces de expresión con respecto a GAPDH. En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 2 es 0,0075 veces de expresión de IDO con respecto a la expresión de GAPDH.
En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 3 está entre 0,0090 y 0,03 veces de expresión con respecto a GAPDH. En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 3 es 0,0096 veces de expresión de IDO con respecto a la expresión de GAPDH.
Los datos de los inventores demuestran que 87,5% de pacientes con PCa indolente (GS < 6 y BR y sin tratamiento después de la biopsia), 100% de pacientes sin PCa y 27% de pacientes con PCa clínicamente relevante (GS > 7, BR-, tratamiento después de la biopsia) expresaron IDO por debajo de 0,0096 (Figura 1A).
Los datos de los inventores demuestran que 72% de pacientes con PCa clínicamente relevante (GS > 7, tratamiento después de la biopsia) expresó IDO por encima de 0,0096 (Figura 1A). En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 4 está entre 0,03 y 0,05 veces de expresión con respecto a la expresión de GAPDH. En ciertas realizaciones, el umbral predeterminado de ARNm 4 es 0,0479 veces de expresión de IDO con respecto a la expresión de GAPDH.
Los datos de los inventores demuestran que 100% de pacientes con BR+ PCa (GS > 7, tratamiento después de la biopsia, BR dentro de 5 años) o que no responden a la radioterapia expresó IDO por encima de 0,0479 (Figura 1A).
En ciertas realizaciones, la proteína de IDO se cuantifica en dicha muestra de orina. En ciertas realizaciones, la cuantificación de la proteína de IDO se realiza por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).
Alternativamente, la cuantificación de la proteína de IDO se puede efectuar por otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, se excluye el riesgo de tener cáncer de próstata para el paciente si el nivel de proteína de IDO está por debajo de un umbral de proteína predeterminado 1. En ciertas realizaciones, se determina que el riesgo del paciente de tener cáncer de próstata es muy bajo si el nivel de proteína de IDO está por debajo del umbral de proteína predeterminado 1. En ciertas realizaciones, el umbral de proteína predeterminado 1 es una concentración absoluta de proteína de IDO, entre 0 y 100 pg/ml.
Un paciente con niveles de proteína IDO por debajo de este umbral de proteína 1 tiene baja probabilidad de tener PCa (Figura 1B), por lo que no se recomienda una biopsia de próstata.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un riesgo de tener o desarrollar cáncer de próstata si el nivel de proteína IDO es elevado en comparación con los niveles de proteína IDO de una población de control de individuos que no sufren de cáncer de próstata. Esto se demuestra por los resultados de la biopsia de próstata o por los resultados de la prostatectomía (cuando estén disponibles).
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un riesgo significativo de tener cáncer de próstata si el nivel de proteína de IDO está por encima de un umbral de proteína predeterminado 1.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un mayor riesgo de tener cáncer de próstata (con una mayor probabilidad de tener un cáncer de próstata indolente que de un cáncer clínicamente relevante) si el nivel de proteína de IDO está por encima de un umbral de proteína predeterminado 2. En ciertas realizaciones, dicho umbral de proteína predeterminado 2 está entre 1,5 y 6 veces el umbral de proteína predeterminado 1. En ciertas realizaciones, dicho umbral de proteína predeterminado 2 está entre 100 y 300 pg/ml. En ciertas realizaciones, dicho umbral de proteína predeterminado 2 es 200 pg/ml.
En ciertas realizaciones, un paciente con niveles de proteína de IDO por debajo del umbral de proteína 2 pero por encima del umbral de proteína 1 se asigna al grupo para el que se puede recomendar una biopsia.
En ciertas realizaciones, un paciente con niveles de proteína de IDO por encima de este umbral de proteína 2 se asigna al grupo para en que siempre se recomienda una biopsia.
En ciertas realizaciones, se asigna al paciente un mayor riesgo de tener cáncer de próstata (con una mayor probabilidad de tener un cáncer clínicamente relevante que de un cáncer de próstata indolente) si el nivel de proteína de IDO está por encima de un umbral de proteína predeterminado 3. En ciertas realizaciones, dicho umbral de proteína predeterminado 3 es más de 300 pg/ml o más del doble que el umbral de proteína predeterminado 1. Para estos pacientes siempre se recomienda la biopsia de próstata.
Los datos de los inventores demuestran que el 83% de los pacientes sin PCa tiene un nivel de proteína de IDO por debajo de 200 pg. Los datos de los inventores demuestran que el 87,5% de los pacientes con PCa clínicamente relevante (GS > 7, BR-, tratamiento después de la biopsia) tienen un nivel de proteína de IDO por encima de 200 pg. Los datos de los inventores demuestran que 100% de los pacientes con PCa indolente o sin PCa tienen un nivel de proteína de IDO por debajo del umbral de proteína 3 (Figura 1B). En ciertas realizaciones, la muestra de orina no se procesa y permite el análisis del ARN o proteína.
En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un volumen de orina con la adición de un reactivo para preservar el ARN.
En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un sedimento obtenido mediante la centrifugación de la orina. En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un sedimento obtenido mediante la centrifugación de la orina por encima de 300 g durante > 5 min. En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un sedimento obtenido mediante la centrifugación de la orina entre 200 y 2000 G durante > 5 min. En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un sedimento obtenido mediante la centrifugación de la orina a 300 g durante > 5 min. En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un sedimento obtenido mediante la centrifugación de la orina a > 700 g durante 10 min o más.
En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende las siguientes etapas:
a. la muestra de orina se centrifuga inmediatamente después de la recolección durante al menos 5 min, particularmente entre 5 y 30 minutos, más particularmente entre 8 y 15 min por debajo de 10 °C, particularmente entre 10 °C y 4 °C;
b. opcionalmente, se añaden uno o más compuestos inhibidores de la ARNasa a la muestra en el momento de la recolección o antes de la centrifugación.
En ciertas realizaciones, la muestra de orina es una muestra de ARN libre de células. Esta expresión se refiere a una preparación de ARN obtenida de una muestra de orina que no ha sido procesada (por ejemplo, por centrifugación) antes del aislamiento de ARN. No hay diferencias entre el sedimento y el ARN libre de células en términos de expresión génica de IDO (Fig. 2).
Las orinas se deben procesar inmediatamente después de la recolección, ya sea por centrifugación a 3 °C - 25 °C, en particular a 4 °C (para recolectar el sedimento) o por alicuotado (para análisis de ARN libre de células o proteínas). También es posible la adición de una solución para preservar el ARN de la degradación. También es posible mantener las muestras a 4 °C después de la recolección y realizar la centrifugación después de varias 20 horas (por ejemplo, 1­ 24 horas). Para analizar el ARN libre de células, se extrae ARN de 0,5 ml de orina sin centrifugación. Opcionalmente, se añaden uno o más compuestos inhibidores de ARNasa o estabilizadores de ARN a la muestra en el momento de la recolección. El ADNc de IDO generado por ARNm de retrotranscripción en consecuencia se cuantifica por PCR en tiempo real usando un conjunto de cebadores y sonda (el ensayo TaqMan mostrado en los ejemplos es un ejemplo del mismo) dirigido al gen IDO. Un ejemplo de una región de IDO adecuada es la región catalítica. El ensayo TaqMan que se muestra en los ejemplos se dirige a la región catalítica de IDO. La retrotranscripción se puede realizar con cebadores específicos de la diana o con cebadores mixtos. La retrotranscripción puede ser una reacción separada o se puede realizar en la misma reacción usada para la cuantificación de la secuencia diana. La cuantificación se puede realizar en tiempo real por u otros procedimientos cuantitativos, tales como la PCR digital o ARN-seq. Se usa un gen de control para calcular la expresión génica relativa de IDO con el fin de que la prueba sea independiente de las mediciones de PSA.
En determinadas realizaciones, el gen de control es GAPDH. En ciertas realizaciones, el ARN ribosómico 18s (ARNr) se usa como control interno (control técnico) para determinar la cantidad de material genético para la amplificación. Para 18s> 7 Ct (ciclo umbral en PCR en tiempo real), la prueba puede no ser informativa y, por lo tanto, se debe recolectar una nueva muestra de orina para poder repetir la prueba. En ciertas realizaciones, se podría prever el DRE para mejorar el rendimiento del gen de control técnico.
En ciertas realizaciones, el procedimiento emplea al menos uno, y particularmente todos los siguientes cebadores y sondas:
Cebador F 5'-GAAGACCCAAAGGAGTTTGC-3' (SEC ID NO 01)
Cebador R 5'-TGGAGGAACTGAGCAGCAT-3' (SEC ID NO 02)
Sonda: 5'-TGGGCATCCAGCAGACT-3' (SEC ID NO 03).
En ciertas realizaciones, la sonda se modifica con un fluoróforo en el extremo 5 'o 3' y un inactivador de fluoróforo en el otro extremo. El inactivador de fluoróforo es capaz de inactivar la fluorescencia emitida por el fluoróforo después de la excitación. Para la secuencia de sonda específica de SEC ID NO 03, MGB es un inactivador de fluoróforos particularmente útil que se puede usar en combinación con diferentes fluoróforos. Los ejemplos no limitantes son FAM/MGB, VIC/MGB, TWT/MGB, Yakima Yellow/MGB, HEX/MGB y Cy5/MGB. Otros pares útiles de fluoróforo e inactivador de fluoróforo son carboxifluoresceína (FAM)/(agente de unión al surco menor (MGB), FAM/inactivador Black Hole 1 (BHQ1), YYE/BHQ1, ROX/BHQ2, Cy5/BHQ2.
En ciertas realizaciones, la sonda se modifica con FAM (6-carboxi fluoresceína) en el extremo 5' y MGB en el extremo 3'.
En ciertas realizaciones, la proteína de IDO se cuantifica por ELISA. En ciertas realizaciones, la cuantificación se realiza mediante el uso del kit IDK® IDO ELISA por Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Alemania.
En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un volumen de orina sin procesar. En la presente memoria descriptiva, dicha muestra también se designa como muestra de ARN "libre de células". "No procesada" se refiere al hecho de que la muestra no ha sido centrifugada antes del aislamiento del ARN, por lo tanto, comprende orina "total", no una fracción separada de la muestra primaria (en otras palabras: la muestra como se obtiene del paciente) por centrifugación. La muestra de ARN no procesada puede comprender una solución que se ha añadido para evitar la degradación del ARN.
En ciertas realizaciones, la muestra de orina es un sedimento obtenido mediante la centrifugación de un volumen de orina.
El ARNm de IDO se expresa a niveles elevados en el tejido de PCa. Se ha informado que la proteína IDO está presente en los tejidos de PCa mediante tinción, pero nunca se ha cuantificado de manera absoluta. La observación de que el ARNm y la proteína de IDO se pueden detectar en niveles elevados en la orina de pacientes con sospecha de cáncer de próstata, y su nivel se puede usar como biomarcador para discriminar a los pacientes portadores de tumores o pacientes que necesitan una determinación adicional de su estado por biopsia, es sorprendente:
La detección de ARNm y proteínas de un tejido afectado por una enfermedad u otro daño en los fluidos corporales (tal como sangre, orina y saliva) difiere según el tipo de daño sufrido por el tejido durante el desarrollo de la enfermedad.
Un caso concreto que puede servir de referencia es la detección de PSA. El PSA es una molécula prostática altamente específica, cuyos niveles elevados en la circulación periférica son un indicador de daño prostático debido a la presencia de tumores, enfermedades benignas o inflamación (es decir, prostatitis) o sobreproducción debido a la edad o las relaciones sexuales. En particular, el PSA no es específico de un tumor. Actualmente, el PSA es el biomarcador más usado para el diagnóstico de PCa. La proteína PSA es secretada por las células prostáticas hacia el lumen de las glándulas prostáticas y llevada al conducto prostático. De ese modo, puede llegar y ser detectada en la orina. El PSA también ingresa fisiológicamente al torrente sanguíneo en su forma inactiva (PSA libre) a niveles no significativos (4 ng/ml), aunque esta última cantidad aumenta con la edad. Durante el desarrollo del tumor, más significativamente en estadio y grado superiores, debido a los daños a la estructura de la glándula prostática, los niveles de proteína PSA aumentan significativamente en el suero de los pacientes y hasta ahora, solo en esta muestra tiene poder predictivo para el cáncer de próstata. Esta proteína secretada se puede detectar en la orina, pero sus niveles en la orina solos no son predictivos (Bolduc et al. (2007), Can. Urol. Assoc. J. 1, 377-81).
En homología, el hecho de que el IDO sea detectable en tejido de cáncer de próstata a niveles más altos que en otras afecciones del órgano no predice que sea detectable en orina, mucho menos que, en este espécimen, se pueda detectar a niveles más elevados en muestras de pacientes que tienen tumores de PCa, en comparación con pacientes que tienen otras afecciones. Se han detectado altos niveles de IDO en muestras de tumores de próstata recolectadas después de la prostatectomía, su presencia en la próstata en etapas más tempranas (por ejemplo en biopsias de próstata) nunca se ha informado, por lo tanto, la capacidad de detectar IDO en la orina de pacientes con riesgo de albergar cáncer de próstata (como lo indica la prueba de PSA) pero cuyo diagnóstico aún no se ha evaluado (antes de la biopsia de próstata), es inesperado. Además, el IDO no es una proteína específica de la próstata ya que otras células dentro de la próstata pueden liberarla en áreas específicas donde ocurre la inmunomodulación. Por lo tanto, otras fuentes de IDO en la próstata, tales como células endoteliales, macrófagos, etc., contribuyen a los niveles de umbral detectables en un paciente. Es relevante para que un marcador no específico de tumor sea una herramienta válida de diagnóstico/pronóstico su sobreexpresión significativa respecto de un valor basal fisiológico en pacientes portadores de tumores. A pesar de su nivel umbral, la IDO no se secreta fisiológicamente de manera abundante en la orina y no aumenta significativamente después del masaje prostático, como lo hace el PSA (Figura 3). Por tanto, no es de esperar su detección en este fluido corporal a niveles elevados, como ocurre con el PSA. Sobre la base de estos datos preliminares, los inventores observaron que la detección de IDO (ARNm y proteína) en la orina de pacientes con riesgo de PCa tiene poder diagnóstico (Figura 1).
La orina, debido a su función fisiológica, es una muestra caracterizada por la presencia de células exfoliadas, restos celulares y material de desecho, y es rica en ARNasas, ADNasas y otras enzimas degradantes. Por lo tanto, se consideran un material difícil para el análisis de los ARN (considerados inestables y degradados fácil y rápidamente en tales condiciones), en comparación con la sangre, donde las células pueden sobrevivir durante períodos más largos. Además, se espera que la presencia de material de desecho aumente los niveles umbrales de moléculas no expresadas exclusivamente por un tipo de células, tal como IDO (la proteína está presente en varios tipos de células de la próstata). Por tanto, la detección de ARN y proteínas de IDO en tal muestra es inesperada. Aún más sorprendente es la posibilidad de usarlo como marcador cuantitativo con poder predictivo (Figura 1).
Términos y definiciones
En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión "ARNm" incluye cualquier especie de ARN que se puede usar para la cuantificación de la expresión de un gen determinado, que incluye el transcripto primario (también denominado pre-ARNm) y cualquier constructo intermedio formado durante el procesamiento de pre-ARNm a ARNm.
"PCa" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "cáncer de próstata".
"PSA" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere "antígeno específico de próstata".
“RP" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "prostatectomía radical".
"RTx" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "terapia de radiación".
"AS" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "vigilancia activa", una forma de controlar la evolución de una afección médica mediante pruebas regulares, en lugar de un tratamiento inmediato, tal como cirugía o quimioterapia.
"DRE" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "examen rectal digital".
"BR" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "recurrencia bioquímica" y especifica un aumento en los niveles detectables de un marcador de cáncer bioquímico, en particular un aumento en el nivel sanguíneo de PSA. La BR puede ocurrir en pacientes con cáncer de próstata en los que se ha tratado el cáncer de próstata, por ejemplo, mediante cirugía o terapia de radiación. Los pacientes afectados pueden no presentar síntomas. "BR-" significa que no hay recurrencia bioquímica del cáncer de próstata en un período de 5 años, "BR+" significa recurrencia bioquímica del cáncer de próstata dentro de los 5 años.
"Recidiva de PCa" en el contexto de la presente memoria descriptiva se considera que incluye la recurrencia en PCa, en particular recurrencia bioquímica, no respuesta/refractariedad a la terapia.
"GS" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "puntuación de Gleason". Una puntuación de Gleason es un sistema de clasificación del tejido del PCa sobre la base de su aspecto microscópico, evaluado por un patólogo. La GS varía de 2 a 10. Cuanto mayor es la GS, más agresivo y con peor pronóstico es el PCa.
"PPV" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a un "valor predictivo positivo".
"NPV" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a un " valor predictivo negativo".
"GAPDH" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a "Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa". GAPDH se expresa de forma constitutiva en la mayoría de las células y se puede usar para la normalización de los niveles de expresión génica.
“Cáncer de próstata indolente" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a un cáncer de próstata con una GS < 6.
"Cáncer de próstata clínicamente relevante" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a un cáncer de próstata que puede ser clasificado por el médico responsable como tal. El diagnóstico de un PCa clínicamente relevante genera una recomendación de tratamiento, generalmente por un procedimiento seleccionado de cirugía, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal y/o terapia de radiación. En la mayoría de los casos, un PCa clínicamente relevante se caracterizará por una GS > 7.
Los términos "cáncer de próstata sintomático" y "cáncer de próstata agresivo" en el contexto de la presente memoria descriptiva se usan como sinónimos de "cáncer de próstata clínicamente relevante".
En el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a un cáncer de próstata con una GS > 7.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión "riesgo (de tener cáncer de próstata)" es sinónimo de "probabilidad (de tener cáncer de próstata)".
En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión "umbral" es sinónimo de "corte”. En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión "umbral 1" es sinónimo de "primer umbral".
Siempre que se establezcan en esta presente memoria alternativas para características individuales separables como "realizaciones", se debe entender que tales alternativas se pueden combinar libremente para formar realizaciones discretas de la invención descrita en esta presente memoria. Por tanto, cualquiera de las realizaciones alternativas para un marcador detectable puede combinarse con cualquiera de las realizaciones alternativas de secuencia y estas combinaciones se pueden combinar con cualquier indicación médica o procedimiento de diagnóstico mencionado en la presente memoria.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, a partir de los cuales se pueden extraer otras realizaciones y ventajas. Se consideran que estos ejemplos ilustran la invención pero no limitan su alcance.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A muestra la definición de los umbrales para el ARNm de IDO y la viabilidad de la prueba sin realizar el DRE (masaje de próstata). Los pacientes con GS > 7 y GS < 6 tienen PCa y la GS se evaluó a partir de la biopsia o después de la prostatectomía, cuando estuvo disponible. GS > 7 significa PCa clínicamente relevante y GS < 6 significa PCa indolente. Valor de corte 1 (a < 0,0015, asignación a biopsia o riesgo de tener un PCa clínicamente relevante: NPV 100%, PPV 47%; riesgo de tener PCa: NPV = 100%, PPV = 82%), valor de corte 2 (b < 0,0075, asignación a biopsia o riesgo de tener PCa clínicamente relevante: NPV 81%, PPV 72%; riesgo de tener PCa: NPV = 47%, PPV = 100%), valor de corte 3 (c > 0,0096, asignación a biopsia o riesgo de tener PCa clínicamente relevante: NPV 83%, PPV 88%) y valor de corte 4 (d > 0,0479, riesgo de tener BR dentro de los 5 años desde el tratamiento o PCa resistente al tratamiento: NPV 100%, PPV 40%). La expresión génica relativa de IDO se analizó en la orina de pacientes recolectados sin la ejecución de un DRE. La prueba IDO reduce el número de biopsias innecesarias en: 14,8% con valor de corte 1, 51,8% con valor de corte 2 o 66,6% con valor de corte 3.
La Figura 1B muestra los umbrales para la proteína de IDO y la viabilidad de la prueba sin realizar el DRE (masaje de próstata). El valor de corte de proteína 1 (a < 42 pg/ml, asignación a biopsia o riesgo de tener un PCa clínicamente relevante: PPV 83%, NPV 63%, riesgo de tener PCa: PPV 90%, NPV 83%,), valor de corte de proteína 2 (b < 200 pg/ml, asignación a biopsia o riesgo de tener PCa clínicamente relevante: PPV 69%, NPV 100%; riesgo de tener PCa PPV 100%, NPV 85%) y la viabilidad de la prueba sin realizar el DRE (masaje de próstata). La expresión del gen relativo de IDO se analizó en la orina de pacientes recolectada sin la ejecución de un DRE. GS > 7, GS < 6 y sin PCa son los resultados de la biopsia o prostatectomía. La prueba de IDO reduce el número de biopsias innecesarias en 29,4% con valor de corte de proteína 2.
La Figura 2 muestra la viabilidad de la prueba en orina sin centrifugación (ARN libre frente a sedimento). Figura 3: El masaje prostético aumenta la cantidad de PSA de ARNm en la orina en un factor de 50; (prueba realizada en cinco pacientes que compara la expresión génica antes y después del DRE). Normalmente, el DRE aumenta la proteína de PSA en un factor de 3 en suero. A diferencia del PSA, el masaje prostético aumentó ligeramente la cantidad de IDO de 2 a 3 veces.
Materiales y procedimientos
Recolección de las orinas
El paciente se debe abstener de cualquier actividad sexual en las 24 horas antes de la recolección. Las primeras orinas de la mañana se recolectan en un recipiente estéril.
Sedimento: se centrifugan 20 ml a 2000 rpm durante 10 minutos, se desecha el sobrenadante y se usa el sedimento para la extracción de ARN.
ARN sin células y proteína: se usan 500 ul de orina para la extracción de ARN.
Extracción de ARN
La extracción de ARN se realiza de acuerdo con el protocolo del kit de ARN acuoso (Ambion). Se añaden 700 ul de solución de lisis al sedimento o a 500 ul de orina. La etapa de elución se realiza dos veces en el mismo tubo con un volumen de 50 ul cada vez (el volumen final es 100 ul). Las muestras se almacenan a -80 °C.
Retrotranscripción
Se añaden 30 ul de ARN a 30 ul de mezcla preparada con los kits de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems).
10 |jl de mezcla contienen 2,0 ml de tampón RT 10x, 0,8 j l de dNTP, 2,0 j l de cebadores aleatorios, 1,0 j l de enzima de transcripción inversa multiscribe y 4,2 j l de agua. La reacción se realiza en un termociclador en 4 etapas: 10 minutos a 25 °C, 120 minutos a 37 °C, 5 minutos a 85 °C 10 y 5 minutos a 4 °C. Las muestras se almacenan a -80 °C. PCR de tiempo real
Se diseña un ensayo IDO1 que cubre la unión exón-exón entre el exón 9 y 10. Los cebadores estén diseñados para tener una temperatura de fusión entre 58 °C y 61 °C, con una longitud óptima de 20 pb y un contenido de CG entre 30% y 80%. La sonda esté diseñada para tener una temperatura de fusión 10 °C més alta que la de los cebadores y no comienza con G. Los cebadores y la sonda se usan a una concentración final de 400 nM y 200 nM, respectivamente. Un ejemplo de ensayo de TaqMan esté representado por las secuencias:
Cebador F 5'-GAAGACCCAAAGGAGTTTGC-3' (SEC ID NO 01)
Cebador R 5-TGGAGGAACTGAGCAGCAT-3' (SEC ID NO 02)
Sonda: 5'-TGGGCATCCAGCAGACT-3' (SEC ID NO 03)
La sonda se modifica con FAM (6-carboxifluoresceína) en el extremo 5 prima y un MGB (agente de unión de surco menor, inactivador no fluorescente que se ajusta a las cualidades espectrales fA m , adquirido de Applied Biosystems)

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para
- predecir el riesgo de un paciente de tener o desarrollar cáncer de próstata (PCa),
- asignar a un paciente para una biopsia de próstata,
- predecir el riesgo de un paciente de tener un PCa clínicamente relevante,
- predecir el riesgo de un paciente de tener un PCa indolente,
- distinguir entre cánceres indolentes y agresivos,
- predecir el riesgo de un paciente de recidiva o recurrencia bioquímica de cáncer de próstata, y/o
- predecir el riesgo de un paciente de progresión de un cáncer de próstata indolente a cáncer de próstata clínicamente relevante;
en el que dicho procedimiento comprende detectar/ cuantificar el nivel de ARNm o proteína de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) en una muestra de orina obtenida de dicho paciente.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que no se realiza examen rectal digital (DRE) antes de obtener dicha muestra de orina.
3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se excluye el riesgo de tener cáncer de próstata para dicho paciente si dicho nivel de ARNm de IDO está por debajo de un umbral predeterminado 1 de ARNm.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que se asigna un riesgo de tener cáncer de próstata a dicho paciente si dicho nivel de ARNm de IDO está por debajo de umbral predeterminado 2 de ARNm, pero por encima de dicho umbral predeterminado 1 de ARNm.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho paciente se asigna para biopsia de próstata si dicho nivel de ARNm de IDO está por encima de un umbral predeterminado 3 de ARNm.
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se asigna un alto riesgo de tener un cáncer de próstata con una puntuación de Gleason > 7 a dicho paciente si dicho nivel de ARNm de IDO está por encima de un umbral predeterminado 3.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se asigna un alto riesgo de recurrencia bioquímica del cáncer de próstata dentro de 5 años a un paciente que se ha sometido al tratamiento del cáncer de próstata si dicho nivel de ARNm de IDO está por encima de dicho umbral predeterminado 3.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se asigna un riesgo de recidiva a dicho paciente si dicho nivel de ARNm de IDO está por encima de un umbral predeterminado 4 de ARNm.
9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cuantificación de ARNm de IDO se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en particular PCR de tiempo real cuantitativa (PCRq).
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que se asigna un bajo riesgo de tener un cáncer de próstata a dicho paciente si el nivel de la proteína de IDO está por debajo de un umbral de proteína predeterminado 1.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que se asigna un riesgo definido de cáncer de próstata clínicamente relevante a un paciente si el nivel de proteína de IDO está por encima de un umbral de proteína predeterminado 2.
12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o 10 a 11, en el que la cuantificación de la proteína de IDO se efectúa mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).
13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de orina es un volumen de orina sin procesar.
14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de orina es un sedimento obtenido por la centrifugación de un volumen de orina.
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