ES2891795T3

ES2891795T3 - Procedimiento y kit para el diagnóstico de cáncer colorrectal

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Publication number: ES2891795T3
Application number: ES16735685T
Authority: ES
Inventors: Rossella Solmi; Gabriella Mattei; Giampaolo Ugolini; Maria Teresa Rodia; Mattia Lauriola; Isacco Montroni
Original assignee: Universita di Bologna
Current assignee: Universita di Bologna
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2016-05-23
Publication date: 2022-01-31
Anticipated expiration: 2036-05-23
Also published as: WO2016185451A1; US20210214807A1; ITUB20150652A1; US20190024180A1; EP3298165A1; PT3298165T; EP3298165B1; US10900085B2

Abstract

Procedimiento para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre completa humana y/o de fracciones de sangre que comprenden ácidos nucleicos, que comprende las etapas de: a. extraer ARN total o ARNm a partir de dicha muestra b. llevar a cabo un análisis cuantitativo de los ARNm de los genes humanos TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2, en el que una sobreexpresión de TSPAN8 y COL1A2 y una subexpresión de LGALS4 y CEACAM6 con respecto a valores de referencia indican la presencia de cáncer colorrectal.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento y kit para el diagnóstico de cáncer colorrectal

La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre o de fracciones de sangre y a un kit para dicho diagnóstico.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El cáncer colorrectal (CRC, colorectal cáncer) es el tercer cáncer más habitual en todo el mundo, con casi 1,4 millones de casos nuevos diagnosticados en 2012. Se obtiene una tasa de supervivencia significativa si el tumor primario se detecta en un estadio temprano.

En la mayoría de los casos de CRC, se desarrolla un proceso de múltiples estadios, comenzando con adenomas precancerosos benignos que se convierten en carcinoma metastásico agresivo. Esto hace que el diagnóstico temprano sea fundamental con el fin de beneficiarse de las posibilidades de un desenlace positivo para pacientes con CRC.

Se han estudiado diversos modos de cribado no invasivos, que incluyen pruebas en deposiciones (heces) que detectan la presencia de hemoglobina o sangre en heces, y pruebas en deposiciones mejoradas que contemplan, además, la extracción de ADN integral. Muy recientemente, se ha propuesto un examen de ADN en heces de múltiples objetivos, Cologuard (Exact Sciences Corporation, Madison WI), aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, Food and Drug Administration); aun así, dada la alta tasa de falsos positivos en los ADN de deposiciones, son necesarios ajustes adicionales. Además, en 2010, el sistema CellSearchVR (Veridex, Johnson-Johnson, EE.UU.) para el recuento de células tumorales circulantes (CTC) en cáncer colorrectal metastásico (mCRC), basado en detección por inmunofluorescencia, ha recibido la aprobación de la FDA. Recientemente, se ha propuesto un panel combinatorio de siete biomarcadores de ARNm en sangre: anexina A3 (ANXA3), miembro D de la familia 4 de dominios de lectina de tipo C (CLEC4D), lamina B1 (LMNB1), Gla (ácido G-carboxiglutámico) rico en 4 rico en prolina (transmembrana) 4 (transmembrana) (PRRG4), proteína 6 inducida por factor de necrosis tumoral alfa (TNFAIP6), vanina 1 (VNN1) y receptor de interleucina 2 beta (IL2RB), por Marshall et al (Marshall KW, Mohr S, Khettabi FE, Nossova N, Chao S, Bao W, et al. A blood-based biomarker panel for stratifying current risk for colorectal cancer. International journal of cancer Journal international du cancer.

2010;126(5):1177-86) (ColonSentry®, Canadá -. Enzo Biochem EE.UU.). Recientemente, la prueba fue aprobada por el Departamento de Salud de Nueva York como una prueba para determinar el riesgo de una persona de padecer CRC. La investigación de marcadores como un instrumento de cribado en la sangre de un paciente representa un tema de investigación para el diagnóstico temprano de cáncer colorrectal. Numerosos informes incluyen la codificación de ARNm, microARN (miARN), proteínas, metabolitos, mutaciones de ADN y marcadores de metilación. Hasta la fecha, las principales tendencias de investigación sobre marcadores de ARNm candidatos, en general, implican diversos tipos de pruebas experimentales: células tumorales circulantes (CTC), células madre cancerosas (CSC) (17) y ARN libre circulante. La difusión metastásica se produce bastante pronto en el desarrollo tumoral; por tanto, una detección específica y sensible de CTC se ha vuelto crucial para el diagnóstico. Recientemente, se ha descrito la PCR cuantitativa (qPCR) como un buen procedimiento para la cuantificación de CTC.

Los ARNcf pueden ser excelentes biomarcadores tumorales de sangre, ya que pueden ser más informativos y exactos con respecto a biomarcadores de proteínas. Diversos grupos de investigación han estudiado la posible utilización de ARNm circulante como un marcador para el cáncer. La estrategia experimental general es emplear tecnología de micromatrices para analizar el perfil de expresión del ARNm, seguido de una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las muestras utilizadas son ARNm que se pueden extraer directamente a partir de la sangre, del suero/plasma o a partir de células sanguíneas aisladas.

En el estado de la técnica, se siente la necesidad de una prueba sencilla y fiable que se pueda llevar a cabo en sangre completa y que, por tanto, no requiera la manipulación de deposiciones (heces) o un procedimiento de extracción de CTC o CSC o fracciones de sangre. Entre otras cosas, una prueba fiable que se pueda llevar a cabo en sangre completa no conlleva el riesgo de perder, en las diversas etapas de manipulación, CTC y/o CSC, cuyo número es crítico para el éxito del ensayo.

El análisis de ARN se basa en el hecho de que las variaciones del fenotipo tumoral se asocian con cambios en los niveles de ARNm de genes que regulan o afectan a estos cambios. Esto condujo a la utilización de qRT-PCR.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer un procedimiento y un kit de diagnóstico para el diagnóstico temprano de cáncer colorrectal. Los autores de la presente invención han identificado y analizado ARN específicos que muestran las proporciones de expresión diferentes más altas entre muestras de sangre a partir de individuos sanos y a partir de individuos afectados por CRC, y han identificado algunos ARN candidatos. Entre estos, han identificado una peculiar combinación de ARN que permite obtener resultados con una sensibilidad >90 % y una especificidad >90 %, donde la sensibilidad de una prueba es proporcional a la capacidad de dicha prueba para identificar correctamente sujetos enfermos y la especificidad es la capacidad de dicha prueba para identificar correctamente individuos sanos. Como bien conoce un experto en la materia, los valores de sensibilidad y especificidad se obtienen a partir de un gráfico (curva ROC) que representa un área (AUC) cuyo mejor valor es 1 (el área de un cuadrado perfecto, coincidiendo las ordenadas y abscisas con el valor 100).

Subiendo a partir del área, y más precisamente a partir de la parte más alta, del punto que se proyecta hacia la izquierda (el área en cuestión está más o menos “escalonada” en el lado izquierdo del gráfico), se determinan el porcentaje de especificidad (en las abscisas) y el porcentaje de sensibilidad (en las ordenadas). Cuanto más tiende el área hacia un cuadrado con valor 1, más altos son los porcentajes de especificidad y sensibilidad. Los dos valores difícilmente van en la misma dirección, por ejemplo, valores altos de especificidad (capacidad para identificar correctamente sujetos sanos) a menudo están relacionados con valores bajos de sensibilidad (capacidad para identificar correctamente sujetos enfermos).

En el campo del diagnóstico de CRC, por ejemplo, la prueba de sangre oculta en heces (FOBT), aunque es altamente específica (de hecho, puede identificar incluso trazas muy pequeñas de sangre presentes en las heces), no es muy sensible, ya que no puede distinguir los casos en los que se produce hemorragia por motivos independientes de la presencia de un tumor, tanto que solo se descubre que un tercio de los casos positivos para FOBT están enfermos en una inspección por colonoscopia posterior.

En cambio, los autores de la presente invención dan a conocer un procedimiento y un kit de diagnóstico que tiene alta sensibilidad y alta especificidad.

Por tanto, los objetivos de la presente invención son: un procedimiento para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre completa humana y/o de fracciones de sangre que comprenden ácidos nucleicos, que comprende las etapas de

a. extraer ARN total o ARNm a partir de dicha muestra

b. llevar a cabo un análisis cuantitativo de los ARNm de los genes humanos TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2, en el que una sobreexpresión de TSPAN8 y COL1A2 y una subexpresión de LGALS4 y CEACAM6 con respecto a una muestra de control sano indican la presencia de cáncer colorrectal; y un kit que comprende una o varias alícuotas de reactivos adecuados para llevar a cabo el procedimiento indicado anteriormente. El procedimiento de la presente invención se puede utilizar, además, en asociación con un procedimiento terapéutico para monitorizar la progresión de la enfermedad y para cribados de control posteriores a un tratamiento terapéutico de cáncer colorrectal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS

Figura 1 (paneles a, b, c, d): curvas ROC de los marcadores individuales de la invención, TSPAN8, LGALS4, CEACAM6 y COL1A2.

Para evaluar la exactitud de diagnóstico en cuanto a especificidad y sensibilidad de los marcadores de la presente invención, se llevó a cabo un análisis de ROC. Los marcadores de la presente invención produjeron, como área bajo la curva (AUC), los siguientes valores: TSPAN8 (0,93), LGALS4 (0,827), CEACAM6 (0,806) y COL1A2 (0,748). Figura 2 (paneles a, b, c): curvas ROC para algunas combinaciones de los marcadores de la presente invención. La figura muestra cómo la combinación de los cuatro marcadores permite una especificidad y una selectividad de diagnóstico mayores que las combinaciones de algunos de los marcadores de la invención con ROC individuales muy altas.

Panel A. LGALS4+CEACAM6; Panel B. TSPAN8+COL1A2;

Panel C. TSPAN8+LGALS4+CEACAM6+COL1A2. Los datos completos se notifican en la tabla 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS SECUENCIAS SEQ ID N1 cebador de RT-PCR para TSPAN8

gctgcatgcttctgttgtttt

SEQ ID N2 cebador inverso de RT-PCR para TSPAN8

aacacaattatggcttcctg

SEQ ID N3 cebador de RT-PCR para COL1A2

gtggttactactggattgac

SEQ ID N4 cebador inverso de RT-PCR para COL1A2

ctgccagcattgatagtttc

SEQ ID N5 cebador de RT-PCR para LGALS4

ttaccctggtcccggacatt

SEQ ID N6 cebador inverso de RT-PCR para LGALS4

agcctcccgaaatatggcac

SEQ ID N7 cebador de RT-PCR para CEACAM6

cacagtctctggaagtgctcc

SEQ ID N8 cebador inverso de RT-PCR para CEACAM6

ggccagcactccaatcgt

SEQ ID N9 cebador de RT-PCR para B2M

tgcctgccgtgtgaaccatgt

SEQ ID N10 cebador inverso de RT-PCR para B2M

tgcggcatcttcaaacctccatga

SEQ ID N11 cebador de RT-PCR para EPCAM

gtatgagaaggctgagataaag

SEQ ID N12 cebador inverso de RT-PCR para EPCAM

cttcaaagatgtcttcgtcc

SEQ ID N13 cebador de RT-PCR para SPINK1

tgaaaatcggaaacgccagac

SEQ ID N14 cebador inverso de RT-PCR para SPINK1

gcggtgacctgatgggattt

SEQ ID N15 cebador de RT-PCR para CDH1

cagtacaacgacccaaccca

SEQ ID N15 cebador inverso de RT-PCR para CDH1

cacgctgacctctaaggtgg

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal como se comentó en la sección relacionada con el estado de la técnica anterior, el cáncer colorrectal es una enfermedad con una incidencia muy alta, para la que es necesario disponer de procedimientos de cribado diagnóstico que sean fiables y fáciles de llevar a cabo.

Para fines de diagnóstico, cuanto más altas sean la sensibilidad y la especificidad, más fiable es el diagnóstico.

Los valores de sensibilidad y especificidad se obtienen a partir de un gráfico (curva ROC) que representa un área (AUC) cuyo mejor valor es 1 (el área de un cuadrado perfecto, coincidiendo las ordenadas y abscisas con el valor 100).

Subiendo a partir del área, y más precisamente a partir de la parte más alta, del punto que se proyecta hacia la izquierda (el área en cuestión está más o menos “escalonada” en el lado izquierdo del gráfico), se determinan el porcentaje de especificidad (en las abscisas) y el porcentaje de sensibilidad (en las ordenadas). Cuanto más tiende el área hacia un cuadrado con valor 1, más altos son los porcentajes de especificidad y sensibilidad.

Sin embargo, tal como ya se comentó anteriormente, los valores de sensibilidad y especificidad difícilmente van en la misma dirección; a menudo, de hecho, valores altos de especificidad (capacidad para identificar correctamente sujetos sanos) están relacionados con valores bajos de sensibilidad (capacidad para identificar correctamente sujetos enfermos).

Por ejemplo, la prueba de sangre oculta en heces (FOBT) utilizada habitualmente para el diagnóstico de cáncer colorrectal, aunque es altamente específica (de hecho, puede identificar incluso trazas muy pequeñas de sangre presentes en las heces), no es muy sensible, ya que no puede distinguir los casos en los que se produce hemorragia por motivos independientes de la presencia de un tumor, tanto que, en una inspección por colonoscopia posterior, solo se descubre que un 1/3 de los casos positivos para FOBT están enfermos.

Evidentemente, por tanto, es necesaria una prueba con alta especificidad y alta sensibilidad en el presente estado de la técnica, puesto que una prueba que cumpla estos requisitos tiene un valor económico añadido (ya que permite proceder con una colonoscopia solo en individuos que tienen realmente una probabilidad muy alta de padecer un cáncer colorrectal), pero, sobre todo, un enorme valor psicológico, ya que permite descartar falsos positivos con una mayor exactitud, evitando las repercusiones psicológicas que conlleva en los propios individuos.

Los autores de la presente invención han identificado, en un amplio panel de supuestos marcadores, cuatro marcadores cuyo análisis combinado permite alcanzar valores de sensibilidad y especificidad de >90 % para cada parámetro.

En cuanto a los marcadores identificados por los inventores de la presente invención, con la excepción del marcador TSPAN8, estos marcadores muestran, como suele ser el caso, una correlación inversa entre los valores de sensibilidad y especificidad; por tanto, valores altos de sensibilidad se corresponden con valores bajos de especificidad, y viceversa, mientras que el análisis combinado de estos cuatro marcadores permite mejorar razonablemente los parámetros, tanto en cuanto a especificidad como a sensibilidad.

Tal como se demuestra por los datos resumidos en la tabla 1 y comentados a continuación, la asociación progresiva de 2, 3, hasta 4 marcadores, no permitió en absoluto prever que el conjunto de los 4 marcadores proporcionaría los valores de selectividad y especificidad obtenidos.

De hecho, los datos notificados en la tabla muestran cómo es completamente imposible prever el resultado, en cuanto a sensibilidad y especificidad del análisis combinado, analizando en paralelo las diversas combinaciones de los cuatro marcadores seleccionados por los inventores de la presente invención.

Por tanto, la presente invención da a conocer un procedimiento para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre completa humana o de fracciones de sangre que comprenden ácidos nucleicos, que comprende las etapas de

a. extraer ARN total o ARNm a partir de dicha muestra

b. llevar a cabo un análisis cuantitativo de los ARNm de los genes humanos TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2, en el que

una sobreexpresión de TSPAN8 y COL1A2 y una subexpresión de LGALS4 y CEACAM6 indican la presencia de cáncer colorrectal.

Según la presente invención, el gen humano TSPAN8 es el gen de tetraspanina 8, cuyo ARN tiene el número de registro de Genbank de ARN NM_004616.

Según la presente invención, el gen humano COL1A2 es el gen de colágeno, tipo I, alfa 2, cuyo ARN tiene el número de registro de Genbank de ARN NM_000089.

Según la presente invención, el gen humano LGALS4 es el gen 4 de lectina, de unión a galactósido, soluble cuyo ARN tiene el número de registro de Genbank de ARN NM_006149.

Según la presente invención, el gen humano CEACAM6 es el gen de la molécula de adhesión relacionada con el antígeno carcinoembrionario 6, cuyo ARN tiene el número de registro de Genbank de ARN NM_002483.

Según la presente invención, la muestra del procedimiento de la presente invención puede ser una muestra de sangre completa o de cualquier fracción de sangre que comprende ácidos nucleicos, como, por ejemplo, suero y/o plasma.

Para los fines de la presente invención, por sobreexpresión se entiende una expresión mayor que la fisiológica, que se puede evaluar comparando los valores de expresión para cada gen analizado con respecto a los presentes en individuos sanos de control o con respecto a un valor de corte preasignado (predeterminado).

Por subexpresión, para los fines de la presente invención, se entiende una expresión menor que la fisiológica, que se puede evaluar comparando los valores de expresión para cada gen analizado con respecto a los presentes en individuos sanos de control o con respecto a un valor de corte preasignado (predeterminado).

Por expresión fisiológica se entiende la detectada normalmente en individuos sanos.

Según una realización de la presente invención, por tanto, los valores de expresión para cada uno de los genes analizados se pueden obtener cuantificando el ARNm para cada gen en la muestra de interés y comparando dichos valores con respecto a los obtenidos en muestras sanas de control o con respecto a un valor de corte calculado de antemano para cada gen.

En el procedimiento, según la presente invención, por tanto, dichas sobreexpresión y subexpresión de dichos valores de referencia se pueden obtener a partir de una muestra de control recogida a partir de un individuo sano (o a partir de un conjunto de muestras de control recogidas a partir de individuos sanos) o con respecto a un valor de corte predeterminado para cada ARN de interés.

La muestra de control recogida a partir de un individuo sano puede ser una muestra de ARNm o ARN total, o incluso un conjunto de ARNm o ADNc que comprende, respectivamente, ARNm o ADNc de interés obtenidos a partir de individuos sanos. Alternativamente, cuando la expresión se cuantifica con respecto a un valor de corte predeterminado para cada ARN, este valor de corte será un valor de corte que se ha determinado de antemano, para cada uno de los ARN de interés, a partir de una muestra de sangre o de fracciones de sangre recogida a partir de individuos sanos.

Para los fines de la presente invención, el análisis cuantitativo de los ARNm se puede llevar a cabo utilizando cualquier procedimiento de análisis cuantitativo de ARNm conocido por un experto en la materia, como, por ejemplo, PCR cuantitativa en tiempo real, o PCR digital, o secuenciación ultraexhaustiva.

En una realización preferente, el análisis cuantitativo en b. se lleva a cabo mediante PCR en tiempo real, que es una técnica bien conocida por un experto en la materia.

La PCR en tiempo real, también denominada PCR cuantitativa o PCR cuantitativa en tiempo real (rtq-PCR), es un procedimiento de amplificación (reacción en cadena de la polimerasa, o PCR) y cuantificación simultáneas del ADN. Tal como conoce un experto en la materia, la extracción de ARN o ARNm permite crear ADNc mediante PCR con transcripción inversa, que se puede amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa de ADN y cuantificar después de cada ciclo de amplificación. Entre los procedimientos de cuantificación habituales se incluyen la utilización de colorantes fluorescentes que se intercalan con el ADN bicatenario (bc) y los oligonucleótidos de ADN modificado (denominados sondas) que fluorescen cuando se hibridan con un ADN. Por tanto, mediante PCR en tiempo real, es posible medir la expresión relativa de un gen en un momento específico, en una célula o en un tipo de tejido específico. La combinación de estas dos técnicas se suele denominar RT-PCR cuantitativa.

Tal como conoce un experto en la materia, mediante PCR en tiempo real, se puede llevar a cabo una cuantificación absoluta de la concentración de ARN específicos produciendo una curva de calibración estándar o, alternativamente, se puede llevar a cabo una cuantificación relativa comparando su cantidad con la de un gen de control.

La cuantificación absoluta puede utilizar muestras estándar (ADN plasmídico u otras formas de ADN) cuya concentración absoluta es conocida. Sin embargo, se debe asegurar de que la eficiencia de la PCR sea la misma para muestras conocidas y desconocidos. El procedimiento de cuantificación relativa es más sencillo, ya que requiere la cuantificación de genes humanos de control o de mantenimiento para normalizar la expresión del gen estudiado.

El experto en la materia puede diseñar fácilmente cebadores para PCR en tiempo real mediante programas adecuados disponibles públicamente, incluso en internet, puesto que las secuencias de los marcadores de la presente invención están disponibles en el Genbank de ARN y los números de registro para cada marcador se dan a conocer en la presente descripción.

A modo de un ejemplo simple, en modo alguno vinculante para la implementación de la presente invención, en el presente documento se dan a conocer pares de cebadores para PCR en tiempo real, adecuados para la implementación del procedimiento descrito en el presente documento.

Los pares de cebadores se pueden diseñar para su utilización en una única reacción, ya que funcionan en las mismas condiciones de PCR y no forman productos amplificados inespecíficos. Los pares de cebadores para PCR en tiempo real específicos para secuencias de interés están disponibles en el mercado (por ejemplo, Sigma Aldrich).

Según una realización a modo de ejemplo y no limitativa de la presente invención, la PCR en tiempo real se puede llevar a cabo utilizando los cebadores de SEQ ID 1 y 2 para TSPAN8; los cebadores de SEQ ID 3 y 4 para COL1A2, los cebadores de SEQ ID 5 y 6 para LGALS4 y los cebadores de SEQ ID 7 y 8 para CEACAM6.

Evidentemente, conociendo las secuencias de los ARNm que se van a cuantificar, el experto en la materia puede diseñar fácilmente otros pares de cebadores adecuados que se pueden utilizar en una única reacción de ^pC^ren tiempo real y que no producen productos amplificados inespecíficos.

Los pares de cebadores tendrán las modificaciones químicas utilizadas habitualmente para los cebadores de PCR en tiempo real.

En una realización preferente, el procedimiento de la presente invención da a conocer, además, la amplificación y la cuantificación, mediante la misma PCR en tiempo real, de uno o varios genes de mantenimiento de control humanos para la normalización de los valores obtenidos para los marcadores de interés.

Por ejemplo, como gen de control se puede utilizar el gen humano B2M, de microglobulina beta 2, cuyo número de registro de Genbank de ARN es NM_004048.

Un ejemplo no limitativo de cebador para la cuantificación de un gen de control se proporciona por los cebadores de SEQ ID 9 y 10, que permiten la cuantificación del gen B2M. Evidentemente, un experto en la materia puede diseñar fácilmente otros cebadores para la cuantificación de B2M, o de cualquier otro gen humano expresado de manera constitutiva que se vaya a utilizar como control.

Para los fines de la presente invención, el término cebador tiene el significado utilizado habitualmente en la bibliografía, por tanto, indica un oligonucleótido de una longitud que oscila normalmente entre 9 y 50 nucleótidos, normalmente entre 15 y 30 nucleótidos, con una secuencia que permite su hibridación de manera específica y eficiente con la secuencia de interés, ignorando las inespecíficas.

Evidentemente, en el procedimiento de la presente invención, se puede amplificar cualquier ARNm de un gen humano de mantenimiento que se vaya a utilizar como control para la normalización de los valores obtenidos para los ARNm de los genes TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2.

Tal como ya se mencionó, la normalización se puede llevar a cabo con respecto a uno o varios genes de control.

Por tanto, la normalización permitirá calcular un valor de Ct normalizado, indicado en la presente descripción como ACt, habiéndose calculado para cada muestra analizada el CT de cada marcador de interés (TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2), normalizándolo con respecto al CT de un gen expresado de manera constitutiva (de mantenimiento) con la siguiente operación:

ACt ^{marcador de Interés- CTmarcador de Interés —} CT ^{gen constitutivo}

por tanto, a modo de ejemplo,

En una realización de la presente invención, por tanto, el análisis cuantitativo del procedimiento comprende la evaluación del Ct para cada marcador y la evaluación del ACt normalizado con respecto a un gen expresado de manera constitutiva para cada marcador.

En esta realización, los individuos afectados por cáncer colorrectal tienen un ACt de <11,9±1,7 para TSPAN8; un ACt de <11,8±2,28 para COL1A2; un ACt de >11,42±2,42 para LGALS4 y un ACt de >10,9±1,79 para CEACAM6. Tal como se anticipó anteriormente, la presente invención da a conocer un procedimiento con valores de especificidad y selectividad mayores del 90 % para cada parámetro.

La tabla 1 notifica, a continuación, los valores observados para diversos marcadores y para todas las combinaciones de los 4 marcadores seleccionados en el presente documento.

Evidentemente, ninguna de las combinaciones sometidas a ensayo, con la excepción de la que comprende los 4 marcadores seleccionados, muestra que ambos parámetros, de selectividad y especificidad, sean mayores del 90 %.

Además, ninguno de los datos sobre las combinaciones de 2 o 3 marcadores podría haber permitido suponer el efecto observado con los 4.

Tabla 1

Tal como se puede observar en la tabla anterior, el único caso en el que tanto la sensibilidad como la especificidad superan inesperadamente valores del 90 % es cuando se analizan los 4 marcadores TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2.

La columna de AUC representa la exactitud de diagnóstico expresado en cuanto a “área bajo la curva” de las diversas combinaciones y de los marcadores individuales; evidentemente, solo la combinación de los 4 marcadores puede producir una exactitud de diagnóstico >0,95.

La presente invención, por tanto, da a conocer un procedimiento de diagnóstico, en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, con una especificidad >90 % y una sensibilidad >90 %; más concretamente, un procedimiento de diagnóstico con una sensibilidad de, aproximadamente, el 92,5 % y una especificidad de, aproximadamente, el 94 %, es decir, un procedimiento de diagnóstico con una sensibilidad mayor que la de la colonoscopia y de la prueba FOBT y una especificidad cercana a la de la colonoscopia y que, sin embargo, es mayor que la de la prueba FOBT.

En cuanto a la prueba de sangre oculta en heces (FOBT), en general, se considera que la sensibilidad de una única prueba FOBT oscila entre el 10 y el 40 %, y solo llevando a cabo 3 recogidas de muestra durante 3 días consecutivos, la sensibilidad podría llegar incluso hasta el 92 %, mientras que la especificidad es, en cualquier caso, del 90 %. Posteriormente, los pacientes positivos para FOBT se someten a un examen más minucioso, que es la colonoscopia, con una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 100 %. Solo un tercio de los pacientes positivos para FOBT resultan estar enfermos con carcinoma colorrectal, y el diagnóstico se realiza mediante colonoscopia. El procedimiento de la presente invención da a conocer la posibilidad de llevar a cabo una prueba que solo requiere una recogida y que muestra una sensibilidad del 92,5 % y una especificidad del 94 %.

Esto significa que, debido a su alta fiabilidad, puede reemplazar a la prueba de heces actual, pero también, y sobre todo, a la colonoscopia, que es una prueba invasiva y especialmente costosa.

El procedimiento dado a conocer en el presente documento se puede utilizar como un procedimiento sencillo de diagnóstico o cribado para poblaciones de pacientes, pero también se puede utilizar para monitorizar el progreso de una terapia contra el cáncer colorrectal, o para la monitorización posterapéutica de individuos que se han sometido a terapia sistémica y/o quirúrgica contra dicho cáncer.

Evidentemente, de hecho, puesto que el procedimiento de la presente invención permite un diagnóstico de alta especificidad y de alta selectividad del cáncer colorrectal, y puesto que dicho análisis no contempla intervenciones invasivas, el procedimiento se puede utilizar en paralelo a una terapia contra el cáncer colorrectal, para evaluar la expresión de los marcadores con respecto a niveles normales, o posteriormente a una terapia, para evaluar, también en este caso, la expresión de los marcadores con respecto a niveles normales y monitorizar cualquier cambio en la expresión de estos marcadores que pueda indicar la recidiva de la enfermedad.

La presente invención da a conocer, además, la utilización de un kit para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre completa humana o de fracciones de sangre que comprende ácidos nucleicos, que comprende una o varias alícuotas de reactivos para el análisis cuantitativo de la expresión de los genes humanos TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2 y, opcionalmente, para un gen humano expresado de manera constitutiva de control, en el que dichos reactivos comprenden los cebadores de SEQ ID 1 y 2 para TSPAN8; los cebadores de SEQ ID 3 y 4 para COL1A2, los cebadores de SEQ ID 5 y 6 para LGALS4 y los cebadores de SEQ ID 7 y 8 para CEACAM6.

Tal como se mencionó anteriormente, el análisis cuantitativo de la expresión génica se basa en la cuantificación del ARNm de los genes de interés.

Según la presente invención, la muestra para el kit de la presente invención puede ser una muestra de sangre completa o de cualquier fracción de sangre que comprende ácidos nucleicos, como, por ejemplo, suero y/o plasma. Los reactivos para el análisis cuantitativo para los fines de la presente invención son los utilizados habitualmente por el experto en la materia para procedimientos de análisis cuantitativo de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, sin limitar la invención a los mismos, PCR cuantitativa en tiempo real, o PCR digital, o secuenciación ultraexhaustiva. Los reactivos específicos para el análisis de cada ARNm de interés se pueden proporcionar en una o varias alícuotas distintas para cada ARNm de interés o se pueden proporcionar en una o varias alícuotas que contienen reactivos para la cuantificación de uno o varios ARNm de interés.

Según una realización de la invención, los reactivos para el análisis cuantitativo de la expresión de los genes mencionados anteriormente son cebadores de PCR en tiempo real específicos selectivamente para cada uno de dichos genes.

Conociendo la secuencia de los ARNm de los genes de interés, el experto en la materia puede diseñar con extrema facilidad cebadores de PCR en tiempo real que permiten una cuantificación selectiva de los ARNm de interés. Tales cebadores se pueden obtener, además, a partir de fuentes comerciales especializadas en la preparación de reactivos para PCR en tiempo real.

Según la presente invención, dichos cebadores son los cebadores de SEQ ID 1 y 2 para TSPAN8; los cebadores de SEQ ID 3 y 4 para COL1A2, los cebadores de SEQ ID 5 y 6 para LGALS4 y los cebadores de SEQ ID 7 y 8 para CEACAM6.

Además, el kit, según cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, puede contener reactivos para cuantificar la expresión de uno o varios ARNm de genes humanos expresados de manera constitutiva (de mantenimiento), los valores de expresión obtenidos se pueden utilizar para normalizar los valores de expresión registrados para los ARNm de interés descritos anteriormente, es decir, los ARNm de los genes humanos TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2.

Tales reactivos se pueden utilizar para cuantificar, tal como ya se describió anteriormente en conexión con el procedimiento, uno o varios ARNm de genes constitutivos, lo que permite la normalización de los valores medidos para los ARNm de los genes de interés, según la ecuación descrita anteriormente:

A modo de ejemplo, en modo alguno se debe interpretar como limitativo de la presente invención, tales reactivos pueden ser cebadores de PCR en tiempo real para uno o varios genes humanos constitutivos, tales como, por ejemplo, el gen B2M para el que se pueden utilizar, por ejemplo, los cebadores de SEQ ID 9 y 10.

Además, el kit, según cualquier realización de la presente invención, puede comprender, además, uno o varios reactivos para la extracción de ARN total o ARNm y/o, además, reactivos para la transcripción inversa de ARN total. Además, el kit, según cualquier realización de la presente invención, puede comprender, además, una o varias alícuotas de ARN total o ARNm o ADNc de individuos sanos como controles negativos y/o de individuos afectados por cáncer colorrectal como controles positivos.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos tienen el objetivo de ilustrar la presente invención sin limitarla en absoluto.

Los estudios que condujeron a la presente invención fueron aprobados por el Comité Ético de1Hospital^ “Sant’Orsola-Malpighi” de Bolonia, Italia, y cumplen los requisitos de la Declaración de Helsinki de Principios Éticos para la investigación médica que involucra individuos humanos.

Todos los individuos involucrados firmaron un formulario de consentimiento informado antes del inicio de los estudios.

Se obtuvieron muestras de sangre periférica a partir de 67 donantes sanos y 56 pacientes no correlacionados con análisis histológico que confirma CRC en cualquier estadio, previo a la terapia quirúrgica y sin la adición de tratamientos químicos o radiológicos a la terapia quirúrgica.

Para reducir el riesgo de contaminación de la muestra por las células epiteliales que porta la aguja, se descartó el primer ml de sangre.

Extracción de ARN

Se trató sangre completa, colocada en un tubo que contenía EDTA, para la lisis en el plazo de una hora desde la recogida, mediante la adición del reactivo TRIzol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), y se extrajo ARN total, según el protocolo del proveedor. El ARN total extraído a partir de 1 ml de sangre se sometió a precipitación con etanol estándar, y se disolvió el sedimento en 15 p.l de agua libre de ARNasa a una concentración final de hasta 0,5 pg/pl y se almacenó a -20 °C.

La concentración de todas las muestras de ARN total se cuantificó con un espectrofotómetro Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

qRT-PCR

Se sometieron 300 ng de ARN a transcripción inversa con el kit de síntesis de ADNc de la primera hebra RevertAid (Carlo Erba Reagents, Milán, Italia) y se amplificó utilizando el sistema EvaGreen (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), según la instrucción del proveedor. La lista de los cebadores utilizados para los marcadores candidatos y los genes de referencia se notifica en la tabla 2, a continuación (SIGMA ALDRICH, Milán, Italia).

Tabla 2. Los marcadores preferentes se seleccionaron de un total de 38.104 locus.

Cebador directo arriba, cebador inverso abajo.

Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo con el instrumento CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA), por duplicado, a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y a 60 °C durante 1 minuto, con análisis de la curva de fusión. Cada ejecución de qPCR incluyó, siempre, un control negativo sin ADNc y un control positivo de ADNc derivado de la línea celular HT-29, en la que se sabe que están presentes los genes de interés. La eficiencia de reacción (E) se calculó a partir de la pendiente de la curva estándar generada con diluciones en serie de 10 veces del ADNc de calibración, según la fórmula:

E = [10 (-1 /pendiente)-1 ] x 100.

Análisis estadístico

Se adoptó la prueba de Student para comparar los niveles de expresión analizados entre los casos con CRC y los controles. Se utilizó el análisis de la curva ROC (característica operativa del receptor) para evaluar la exactitud con la que los parámetros diagnosticaron el CRC, con el fin de distinguir entre pacientes con CRC y controles. Los cálculos tanto del área por encima de la curva como de los intervalos correspondientes a una confianza del 95 % se evaluaron utilizando Medcalc, versión 14, para análisis estadísticos. Con el fin de determinar el valor de corte de los marcadores que permite la mejor distinción entre los dos grupos, el análisis de distinción se llevó a cabo utilizando el programa estadístico SPSS, versión 22, tal como se describe en Wang H, Zhang X, Wang L, Zheng G, Du L, Yang Y, et al Investigation of cell free BIRC5 mRNA as a serum diagnostic and prognostic biomarker for colorectal cancer. Journal of surgical oncology. 2014;109(6):574-9. Los conjuntos de individuos sanos y de pacientes con CRC se consideraron como una variable de agrupación, y los cuatro marcadores independientes se agruparon juntos como variable prevista.

Meta-análisis del conjunto de datos mediante TRAM

Se llevó a cabo un meta-análisis sistemático que incluye la expresión génica diferencial en CRC y sangre normal con el fin de identificar los ARNm con la proporción de expresión más alta entre CRC y sangre con el fin de seleccionar los mejores candidatos como biomarcadores. Mediante Transcriptome Mapper, TRAM, fue posible manejar las plataformas experimentales con diferentes números de genes con el fin de maximizar la información que se podría extraer a partir del conjunto de datos. Se seleccionaron 37 series de GEO entre CRC, con 23 series adicionales para sangre. Las series seleccionadas incluyeron, respectivamente, un total de 2532 y 958 muestras. Para cada serie, se llevó a cabo un muestreo aleatorio que incluyó más de 10 muestras, por tanto, reduciendo el número de muestras analizadas a 349 para CRC y 200 para sangre (14 % y 21 % del total, respectivamente). El análisis del conjunto de datos finales integrado y normalizado permitió identificar genes, entre un total de 38.104 locus expresados, con un valor de expresión disponible tanto en el grupo ‘A’ (CRC) como en el grupo ‘B’ (sangre), con las proporciones absolutas ‘A’/ ’B’ más altas entre el valor de expresión en el tejido de CRC con respecto a células sanguíneas.

Selección de marcadores de CRC

Se llevó a cabo un cribado adicional de los resultados de la base de datos de TRAM con el fin de identificar los locus posiblemente mejores, que se resumen en la tabla 3, a continuación.

Tabla 3. Marcadores candidatos seleccionados, representados por los primeros 15 locus con la mejor proporción ‘A’/ ’B’, que tienen más del 50 % de datos de muestras para cada uno de los dos conjuntos.

Tabla 3.

Con el fin de seleccionar los mejores transcritos, considerando que el valor de expresión se expresa como porcentaje del valor promedio en el perfil de expresión integrado (es decir, 1.000=diez veces el promedio), se excluyeron, además, los últimos locus de la lista, desde SLC26A3 hasta KRT20, excepto CEACAM6, que tiene un valor de expresión absoluta alto. Posteriormente, se excluyeron el locus CEACAM5, el locus COL3A1 y el locus KRT18 debido a la presencia de seudogenes que no permiten diseñar cebadores de PCR específicos para su ARNm ni distinguir entre ARNm y contaminación por ADN. A continuación, se identificaron 7 posibles candidatos, que son los notificados en la tabla 2 (con la excepción del gen constitutivo B2M).

Análisis cuantitativo de marcadores de ARNm en sangre

Cada muestra de ARN (pacientes o sujetos sanos) se sometió a ensayo para determinar la calidad y para determinar la expresión de los marcadores candidatos enumerados en la tabla 2 mediante PCR cuantitativa, y se normalizaron los valores con el gen de mantenimiento B2M. Los genes sometidos a ensayo mostraron un único pico en el análisis de la curva de fusión, y todos los controles negativos produjeron valores de amplificación no detectables, lo que corrobora la especificidad de la amplificación.

Se calcularon los niveles de expresión de ARNm normalizados indicados como Delta CT (ciclo de corte), que fueron, respectivamente, 8,3±1,92 para TSPAN8; 11,23±1,36 para EPCAM; 11,88±2,87 para SPINK1; 9,59±2,37 para COL1A3; 9,9±0,9 para CDH1; 13,77±0,83 para LGALS4 y 12,8±1,08 para CEACAM6 en sujetos sanos, y 11,8±1,7 para TSPAN8; 11,83±1,23 para EPCAM; 11,88±2,87 para SPINK1; 11,85±2,59 para COL1A3; 11,9±1,08 para CDH1; 11,42±2,42 para LGALS4 y 10,9±1,79 para CEACAM6 en pacientes afectados por CRC.

Valor de diagnóstico de marcadores de ARNm en sangre para CRC

Con el fin de evaluar la exactitud de diagnóstico en cuanto a especificidad y sensibilidad de los marcadores candidatos, se llevó a cabo el análisis de la curva ROC. La mayor exactitud de diagnóstico (expresada en cuanto a AUC, o área bajo la curva) fue para los marcadores TSPAN8 (0,93), LGALS4 (0,827), CEACAM6 (0,806) y COL1A2 (0,748). El procesamiento gráfico para estos cuatro marcadores se notifica en la figura 1.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre completa humana y/o de fracciones de sangre que comprenden ácidos nucleicos, que comprende las etapas de:

a. extraer ARN total o ARNm a partir de dicha muestra

una sobreexpresión de TSPAN8 y COL1A2 y una subexpresión de LGALS4 y CEACAM6 con respecto a valores de referencia indican la presencia de cáncer colorrectal.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichas sobreexpresión y subexpresión se evalúan con respecto a valores de referencia a partir de una muestra de control de uno o varios individuos sanos o con respecto a valores de corte predeterminados para cada uno de dichos ARNm.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho análisis cuantitativo en la etapa b. se lleva a cabo mediante PCR en tiempo real.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que dicha PCR en tiempo real se lleva a cabo utilizando los cebadores de SEQ ID 1 y 2 para TSPAN8; los cebadores de SEQ ID 3 y 4 para COL1A2, los cebadores de SEQ ID 5 y 6 para LGALS4 y los cebadores de SeQ ID 7 y 8 para CEACAM6.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que dicha PCR en tiempo real comprende, además, la cuantificación de ARNm de uno o varios genes constitutivos (de mantenimiento) humanos para la normalización de los resultados obtenidos.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que dicho análisis cuantitativo comprende la evaluación del ACt normalizado con respecto a un gen humano expresado de manera constitutiva para cada marcador y en el que los individuos afectados por cáncer colorrectal tienen un ACt de <11,9±1,7 para TSPAN8; un ACt de <11,8±2,28 para COL1A2; un ACt de >11,42±2,42 para LGALS4 y un ACt >10,9±1,79 para CEACAM6.

7. Utilización de un kit que comprende una o varias alícuotas de reactivos para el análisis cuantitativo de la expresión de los genes humanos TSPAN8, LGALS4, CEACAM6, COL1A2 y, opcionalmente, para un gen humano expresado de manera constitutiva de control, en la que dichos reactivos comprenden los cebadores de SEQ ID 1 y 2 para TSPAN8; los cebadores de SEQ ID 3 y 4 para COL1A2, los cebadores de SEQ ID 5 y 6 para LGALS4 y los cebadores de SEQ ID 7 y 8 para CEACAM6, para el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una muestra de sangre completa humana y/o de fracciones de sangre que comprenden ácidos nucleicos.

8. Utilización de un kit, según la reivindicación 7, en la que dichos reactivos son reactivos de PCR en tiempo real que son específicos selectivamente para cada uno de dichos genes.

9. Utilización de un kit, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, comprendiendo dicho kit, además, cebadores de PCR en tiempo real para un ARNm de uno o varios genes constitutivos (de mantenimiento) humanos.

10. Utilización de un kit, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, comprendiendo dicho kit, además, reactivos para la extracción de ARN total o ARNm.

11. Utilización de un kit, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, comprendiendo dicho kit, además, una o varias alícuotas de ARN total o ARNm o ADNc a partir de individuos sanos como controles negativos y/o a partir de individuos afectados por cáncer colorrectal como controles positivos.