CN104531856A - 胃癌进展及预后相关分子标志物miR-1258 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胃癌根治术后预后诊断领域，具体来说涉及一种胃癌疾病进展分子标志物miR-1258，其可应用于在胃癌术后早期进行预后评估。MiR-1258在胃癌组织中明显低表达并与胃癌侵袭深度及淋巴管癌栓显著相关，尤为重要的是miR-1258表达量低的患者预后较差。本发明还提供了一种诊断胃癌进展及预后的试剂盒。使用本发明的胃癌进展与预后相关分子标志物miR-1258诊断胃癌患者术后进展及评估其生存，可给患者及时有效地随访、治疗等干预措施，以延长生存时间，提高生存质量。该发明的试剂盒具有操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。

Description

胃癌进展及预后相关分子标志物miR-1258

技术领域

本发明涉及胃癌根治术后预后诊断领域，具体来说涉及一种胃癌疾病进展分子标志物miR-1258，其可应用于在胃癌术后早期进行预后评估。

背景技术

胃癌是我国发病率和死亡率均居前列的恶性肿瘤。近年来，随着多学科综合治疗的推广，胃癌治疗水平有所提高。然而，进展期胃癌根治术后5年生存率长期徘徊在30%-50%，转移扩散是其预后不良的首要原因。因此，深入探索胃癌发生及转移机制，寻找转移高危个体预测和早期诊断的分子标志，确立新的治疗靶点对提高胃癌疗效具有特殊的重要意义。

MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为22核苷酸的非编码单链小分子RNA，转录和加工成熟后，可与靶基因mRNA的3’端非翻译区互补结合，降解mRNA或抑制其翻译。MiRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性，目前已被证实其在个体发育、细胞分化、增殖、凋亡等生理活动中以及在肿瘤发生、发展等病理过程中起重要调控作用。

近年来的研究表明，胃癌预后与miRNA密切相关，miRNA可以通过作用于靶基因从而影响胃癌进展，因此miRNA对胃癌预后评估也可能有相应的作用。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种新的与胃癌疾病进展相关的miRNA，可应用于在胃癌术后早期进行预后评估，以给患者及时有效地随访、治疗等干预措施，延长生存时间。

技术方案：该miRNA为miR-1258，其序列：5’-AGUUAGGAUUAGGUCGUGGAA -3’(MIMAT0005909) (SEQ ID NO:1)。

发明人发现，与癌旁非癌组织相比较，miR-1258在105对胃癌组织中明显低表达并与胃癌侵袭深度及淋巴管癌栓显著相关，尤为重要的是miR-1258表达量低的患者预后较差。由此可见，miR-1258的异常低表达与胃癌进展及预后密切相关。

在上述发现的基础上，本发明提供了miR-1258在制备评估胃癌进展及预后的诊断试剂中的用途。

具体地，所述诊断试剂通过检测胃癌患者手术标本癌组织及癌旁非癌组织中miR-1258的表达量，并与临床病理因素、预后进行分析，发现miR-1258在105对胃癌组织中明显低表达并与胃癌侵袭深度及淋巴管癌栓显著相关，尤为重要的是miR-1258表达量低的患者预后较差。在一个特定的实施方案中，使用定量PCR的方法检测胃癌患者术后标本癌组织及癌旁非癌组织中miR-1258的表达量。

本发明还提供了一种诊断胃癌进展及预后的诊断试剂盒，其包括：

（1）组织中总RNA提取试剂，

（2）RNA加polyA尾试剂，

（3）纯化RNA试剂，

（4）反转录试剂，

（5）定量PCR试剂，

其中，反转录试剂中包含RT-Primer

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA-3’(SEQ ID NO:2);

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC-3’(SEQ ID NO:3);

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG-3’(SEQ ID NO:4)。

定量PCR试剂包含胃癌进展与预后相关分子标志物miR-1258的特异性引物

miR-1258:5’-AGTTAGGATTAGGTCGTGGAAAA-3’(SEQ ID NO:5);

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3’(SEQ ID NO:6); U6:5’-Cgcttcggcagcacatatac-3’(SEQ ID NO:7);

5’-ttcacgaatttgcgtgtcat-3’(SEQ ID NO:8)。

使用本发明的胃癌进展与预后相关分子标志物miR-1258诊断胃癌患者术后进展及评估其生存，可给患者及时有效地随访、治疗等干预措施，以延长生存时间，提高生存质量。该发明的试剂盒具有操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。

具体实施方式

  1. 胃癌组织及癌旁非癌组织中mRNA提取

（1）收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2007-2009年间胃癌根治术后标本，胃癌组织及癌旁非癌组织105对，分别置于1.5ml 的RNase/DNase-free 离心管中，经液氮桶转移至-80℃深低温冰箱保存。

（2）使用mRNA提取试剂盒（美国Ambion公司的mirVana miRNA Isolation Kit）,从-80℃冰箱中迅速取出样本，切取适量的小块（50mg），立即投入置于冰上的裂解液中。使用电动匀浆器以3500转/分钟的转速对组织进行快速匀浆，时间为20-30秒。再经有机抽提，Glass-fiber洗脱，得到总RNA。

（3）提取的总RNA浓度测定及质量鉴定：取3μl RNA，使用Implen NanoPhotometer? P-Class测定浓度。取2μl RNA，在1%的agarose gel 中快速电泳，通过紫外凝胶成像仪拍照检测其完整性。

四步法定量检测胃癌组织及癌旁非癌组织中的miRNA

（1）加polyA 尾

应用加polyA 尾试剂盒（美国Ambion公司）在无RNA 酶的PCR管（Axygen 公司，200μl）中配制加polyA 尾的反应液，RNA模板5μg，体系为20μl。37℃水浴放置30分钟后置于冰上。

5μg总RNA加polyA尾反应体系

组分	加入量（μl）
		E-PAP (2 units/μL)	1
5X E-PAP Buffer	4
		ATP Solution(10 mM)	2
25 mM MnCl2	2
		RNase Inhibitor	1
RNA(5μg)	x
		Nuclease-free Water	10-x
总体积	20

 (注：加入的RNA体积由RNA的浓度确定，x=5μg/RNA浓度)

（2）加polyA 尾后的RNA抽提纯化

向以上反应液中加入20μl的酚/氯仿/异戊醇（10μl/9.6μl/0.4μl）,充分混匀。4℃，12000rpm离心10分钟，取上层水相转移至新无RNA 酶的PCR 管（Axygen 公司，200μl）。再经酚/氯仿萃取，3M醋酸钠及冰乙醇洗涤，用Nuclease-free Water 10μl将RNA重新溶解。取3μl RNA，使用Implen NanoPhotometer? P-Class测定浓度。

（3）反转录合成cDNA第一链：

使用美国Invitrogen公司的SuperScript First-Stand Synthesis System试剂盒。RNA模板4μg,体系为20μl。

ⅰ. 在无RNA 酶的PCR 管（Axygen 公司，200μl）中配制如下反应液（冰上操作），65℃孵育5分钟，立即放到冰上冰浴至少1分钟。

组分	加入量（μl）
		dNTP mix(10 mM)	1
RT primer	1
		RNA(4μg)	x
Nuclease-free Water	8-x
		总体积	10

 (注：RT primer为RT—primer1、RT—primer2、RT—primer3的混合物，加入的RNA体积由抽提后的RNA浓度确定，x=4μg/RNA浓度)

 (注：上海生工生物技术有限公司合成)

ⅱ. 配置反转录反应液

组分	加入量（μl）
		SuperScriptTMⅢ RT	1
10X RT Buffer	2
		25 mM MnCl2	4
0.1 M DTT	2
		RNase OUTTM	1
总体积	20

ⅲ. 将ⅰ与ⅱ得到的溶液混合，50℃孵育50分钟后85℃保温5分钟。立即放到冰上，待离心后加入1μl RNase H，37℃孵育20分钟，置冰上冷却，得到cDNA。-20℃保存待用。

（4）qPCR 定量检测

使用美国Invitrogen公司的EXPRESS SYBR? GreenER? qPCR Supermix Universal,体系为25μl。在无RNA 酶的PCR 管（Axygen 公司，200μl）中配制如下反应液（冰上操作）

  (注：以U6 RNA为内参，以上引物均由上海生工生物技术有限公司合成)

使用LightCycler 480 II系统（瑞士Roche公司）进行检测，程序设定如下：

温度	时间	循环数
			95℃	30s	1
95℃	5s	45
			56℃	30s	45

  (注：退火温度55-58℃，56℃最佳)

绘制溶解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃ 5s，60℃ 1min。

采用LightCycler 480 software release 1.5.1.62进行数据分析。

统计分析miR-1258与胃癌临床病理因素及预后的相关性

使用spss 16.0软件进行统计学分析。进行三次以上独立试验，所得数据使用平均数±标准差表示。使用t检验比较均值。对于miR-1258表达与临床病理因素相关性的研究，如病理因素是二分类变量，采用Mann-Whitney U检验，如为多分类变量，使用Kruskall-Wallis检验。单因素生存分析使用Log-rank检验，并绘制KM生存曲线，多因素生存分析采用Cox风险比例模型。所有统计结果均以P＜0.05认为存在显著差异。

用上述方法可测得胃癌组织及癌旁非癌组织中的miR-1258的平均Ct值分别为14.18 ± 3.35 和11.51 ± 2.88，与非癌组织相比较，miR-1258在105对胃癌组织中明显低表达（P＜0.001），并与胃癌侵袭深度(P = 0.023)及淋巴管癌栓(P = 0.017)显著相关。多因素生存分析结果显示，miR-1258表达量低的患者预后较差（P＜0.001）。

<110> 王振宁

<120> 胃癌进展及预后相关分子标志物miR-1258

<160> 序列个数

<170> PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 1

AGUUAGGAUUAGGUCGUGGAA

 

<210>2

<211>61

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 2

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA

 

<210>3

<211>61

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 3

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC

 

<210>4

<211>61

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 4

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG

 

<210>5

<211>23

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 5

AGTTAGGATTAGGTCGTGGAAAA

 

<210>6

<211>21

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 6

GCTGTCAACGATACGCTACGT

 

<210>7

<211>20

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 7

Cgcttcggcagcacatatac

 

<210>8

<211>20

<212> RNA

<213>人工序列

 

<400> 8

ttcacgaatttgcgtgtcat。

 

Claims (2)

1.一种胃癌进展及预后相关分子标志物miR-1258，其序列为5’-AGUUAGGAUUAGGUCGUGGAA -3’(SEQ ID NO:1)，其在制备评估胃癌进展及预后的诊断试剂中的应用。

2.一种如权利要求1所述的胃癌进展及预后相关分子标志物miR-1258的诊断试剂盒，其特征在于：其包括：

（1）组织中总RNA提取试剂，

（2）RNA加polyA尾试剂，

（3）纯化RNA试剂，

（4）反转录试剂，

（5）定量PCR试剂，

其中，反转录试剂中包含RT-Primer

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA-3’(SEQ ID NO:2);

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC-3’(SEQ ID NO:3);

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG-3’(SEQ ID NO:4)；

定量PCR试剂包含胃癌进展与预后相关分子标志物miR-1258的特异性引物

miR-1258: 5’-AGTTAGGATTAGGTCGTGGAAAA-3’(SEQ ID NO:5);

5’-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3’(SEQ ID NO:6);

U6: 5’-Cgcttcggcagcacatatac-3’(SEQ ID NO:7);

5’-ttcacgaatttgcgtgtcat-3’(SEQ ID NO:8)。