CN101798595A

CN101798595A - 一种新的miRNA检测技术及其应用

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Publication number: CN101798595A
Application number: CN201010119369A
Authority: CN
Inventors: 江其生
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-08
Filing date: 2010-03-08
Publication date: 2010-08-11

Abstract

本发明涉及生物医学领域一种新的用于检测微小RNA(miRNA)所需试剂(盒)的制备、技术方法及其在临床医学、生物学和分子生物学等领域的应用。本发明是一种基于荧光定量PCR方法应用特别设计的引物和合成的MGB探针对成熟miRNAs进行检测、鉴定的实验试剂设计、制备与技术方法应用。与其它方法相比本发明所建立的技术方法具有高灵敏度、高特异性、可高通量检测以及耗时短、操作相对简单等特点。故本发明涉及到新的miRNA检测试剂或试剂盒的制备、技术方法的建立及其在基础研究以及临床医学中恶性肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等相关的预防、治疗与研究。

Description

一种新的miRNA检测技术及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域一种新的用于检测微小RNA(miRNA)所需试剂(盒)的制备、技术方法及其在临床医学、生物学和分子生物学等领域的应用。具体地说是一种基于荧光定量PCR技术应用MGB探针对成熟miRNAs进行高灵敏度、高特异性检测、鉴定的实验试剂设计、制备与技术方法应用。

背景技术

1 miRNA及其作用

小RNA是长度为19～28nt的RNA调控分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)和小干涉RNA(short-interfering RNA，siRNA)两类，miRNAs是继siRNAs之后新的研究热点之一，2002年和2003年被美国《科学》杂志评为年度十大科学成就[Couzin J.et al.Science，2002，298：2296-2297：Science，2003，302：2039-2045]。miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域(3-untranslated region，3UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制[Stark A，et al.Cell，2005，123(6)：1133]；miRNAs在表达上具组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调控分子，在基因的稳定和变异、疾病发生发展、细胞功能及信号转导等领域发挥重要作用[Akao Y，Biol PharmBull，2006，29：903-906]。截止到2009年9月，在miRNA公共数据库miRBase(htt-p://www.mirbase.org/)中已经有10883条来自不同物种的miRNA序列报道。

研究表明，miRNA与多种疾病的发生发展相关。如，miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用[Hammohd S M.CurrentOpinion in Genetics & Development，2006，16：1-6]，癌症的形成与miRNA对致癌和抑癌基因的调控有关；miRNA表达水平还与心肌肥厚、心律失常、血管内膜损伤和高血压[VanRooij E，et-al.Science，2007，316(5824)：575-579.]等心血管疾病有密切关联。

2 miRNA检测方法

miRNA表达水平的检测也是科学研究的热点。由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具进行检测，目前常用的检测方法有：

2.1 Northern blotting：Northern blotting是目前检测miRNA表达的常用手段，该法是用探针与纯化RNA进行杂交来检测固相支持物(膜)上的目标分子，这种技术较为复杂且费力、费时。

2.2 RT-PCR：RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平，但miRNA前体的表达水平并不一定和成熟miRNA的表达水平一致。因此，在RT-PCR的基础上，人们改进了一些技术，从而使得能够检测低表达量的miRNA，而检测对象由前体miRNA转为成熟miRNA。荧光实时定量PCR(real-time PCR)可以很精确的定量分析miRNA的表达，也可以用于验证预测的miRNA，且具有特异性强、敏感性高、操作相对简单、耗时短、可进行高通量检测等特点。

2.3芯片(microarrays)技术：2004年Liu等最先发表了关于微阵列能够获得高通量的结果。这些结果显示了组织特异性miRNA的表达标记，并通过Northern blot和real-time PCR进行了验证。芯片技术有着高通量和平行处理的特点，但其弱点就是信号的稳定性和可重复性较差，灵敏度较低、价格昂贵、难以普及且不能进行精确定量检测。

综上所述，不难看出，以Real-time PCR法检测成熟miRNAs是具有很多优势的检测技术。但目前该方法使用的多是以非特异性荧光标记染料Sybrgreen为主的实验方法，降低了实验的敏感性和特异性。近来发现高度特异的MGB探针可用于定量有活性的成熟miRNAs检测，且不受其前体干扰，还可在高度同源性的miRNAs之间进行区分，甚至可以鉴定只有一个碱基的序列差异。

本发明的目的是研制一种基于荧光定量PCR技术的以高度特异的MGB探针为荧光标记的用于miRNA检测鉴定的试剂(盒)设计、制备及检测技术。

本发明所设计、制备、引入的特异性引物和/或所使用的荧光探针和/或所建立的实验技术不同于目前已有的商品化的miRNA检测试剂盒。

发明内容

本发明的内容是利用RNA加尾和引物延伸法在miRNA用PolyA聚合酶处理后，用Oligod(T)/特异序列复合引物进行延伸得到反转录cDNA，然后用MGB探针法进行real-time PCR检测miRNA。

实验设计、方法与步骤如下：

1设计Oligod(T)/特异序列复合RT引物

miRNA经过PolyA聚合酶处理后，尾端会有多个AA碱基连接的尾巴。要想使Oligod(T)n/特异序列的复合RT引物与miRNA有效结合，在Oligod(T)n的3’端还要有1-2个碱基的锚定碱基与成熟miRNA序列匹配。

2合成MGB探针代替传统的Taqman探针

由于反转录得来的序列很短(大约70bp)，引物探针设计时就需要尽量短小，但特异性、灵敏度不能随之降低，因此，本发明以合成MGB探针代替传统的Taqman探针，这样探针的长度可以缩短到13-15bp，同时具有很高的灵敏度和好的特异性。

3设计上游及下游引物

根据miRNA序列信息设计特异上游引物(Forward Primer)，根据Oligod(T)/特异序列复合RT引物的序列信息设计通用下游引物(Reverse Primer)，Tm值尽量保证在60℃；根据miRNA序列信息设计特异MGB探针。

本发明在引物延伸法基础上设计采用了通用的Oligod(T)/特异序列复合RT引物和下游引物而减少了实验成本，并使本发明具有自主知识产权，在反转录中使用常规的反转录酶和方法而增加了试剂的可选择性。本发明技术与其它方法相比具有特异性强、敏感性高、成本低、操作相对简单等优点。

根据本发明，可将本发明所设计、制备和应用的试剂制备成miRNAs分析试剂盒用于体外检测、鉴定miRNAs和市场开发销售。

根据本发明，本发明设计的Oligod(T)/特异序列复合RT引物、合成的MGB探针代替传统的Taqman探针等可以单独试剂或组合试剂的形式应用及开发销售。

根据本发明，本发明的试剂设计制备方法、检测技术方法，特别是反转录与扩增条件可根据不同情况，包括miRNAs的种类、长度、GC含量、Tm值等的不同，适当优化反应条件。

根据本发明，本发明所制备的试剂和建立的技术方法可以用于人、动物、植物等相关的基础和应用研究工作。

根据本发明，本发明的实施对严重危害人类健康的恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等的发病机制研究和预防治疗具有重要的社会和经济效益。

具体实施方式

1 miRNA提取、纯化

用QAIGEN公司的miRNeasy Mini Kit(PN 217004)提取分离大Total RNA(＞200nt)和小RNA(＜200nt)，其操作方法参照该试剂盒说明进行。通过测定260nm OD值确定两种RNA浓度，用1％TAE琼脂糖凝胶电泳确认大RNA没有降解，以保证小RNA的质量；亦可以用3-4％TAE琼脂糖凝胶电泳确认小RNA。

2 miRNA加尾

取大约1-2μg的miRNA，用Poly(A)Tailing Kit(ABI，PN 1350M)进行尾端加A，试剂用量和操作方法按照该试剂盒说明进行。加尾后的小RNA进行反转录为cDNA。

3 miRNA反转录

用反转录酶SuperScript III(Invitrogen，PN18080085)，于50℃反应1小时进行反转录，反转录试剂配制和操作方法按照该产品说明书进行。

4 miRNA反转录产物进行real-time PCR检测

取反转录产物1.50μL进行real-time PCR检测。设计内参基因(5sRNA等)；用ABi公司的hsa-miR-16TaqMan

MicroRNA检测试剂(ABM 0000084365746)为阳性对照；以特定的miRNA标准品做标准曲线。

Real-time PCR反应混合液如下配制：

PCR Master Mix 试剂用量(④L) 商品编号

TOYOBO RT PCR Master MIX 5.00 TOYOBO，QPK-101

Forward primer，20μM 0.50

Universal primer，20μM 0.50

MGB probe，20μM 0.25

water 2.25

Total 8.5μL

RT-PCR Mix 试剂用量(④L)

反转录产物 1.50

PCR Master MIX 8.50

Total 10μL

振荡混匀，离心。在ABi 7900real-time PCR仪上运行如下程序：

PCR反应条件：(Real time PCR-ABi 7900)

95℃ 10min

95℃ 15sec

60℃ 60sec

5 Real-time PCR检测miRNA数据分析

利用ABi 7900 real-time PCR仪佩带的SDS 2.2-2.3分析软件进行扩增曲线以及样品CT值的分析。以CT值或者标准曲线计算出的copies数进行比较样本间特定miRNAs的表达水平。

Claims

1.设计Oligod(T)/特异序列复合RT引物，可与miRNA有效结合，在Oligod(T)n的3’端有1-2个碱基的锚定碱基与成熟miRNA序列匹配。

2.以合成的特异性MGB荧光探针代替传统的Taqman探针及非特异性荧光染料SYBRGREEN等，以缩小探针长度，同时具有高度的灵敏度和特异性，探针的特异序列根据miRNA的序列信息设计。

3.根据miRNA序列信息设计特异上游引物(Forward Primer)，根据Oligod(T)/特异序列复合RT引物的序列信息设计通用下游引物(Reverse Primer)，Tm值尽量保证在60℃。

4.技术方法主要内容包括利用RNA加尾和引物延伸法在miRNA用PolyA聚合酶处理后，用Oligod(T)/特异序列复合引物进行延伸得到反转录cDNA，然后用上、下游引物及MGB探针法进行real-time PCR扩增、检测miRNA。

5.含有权利要求1、2、3、4中的技术、方法所制备的单种或多种试剂及试剂组合物以及试剂盒，进行miRNA检测以用于基础研究和/或临床应用。