CN111621573A

CN111621573A - 一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物及其芯片和应用

Info

Publication number: CN111621573A
Application number: CN202010729704.8A
Authority: CN
Inventors: 任传利; 陈慧; 韩崇旭; 王倩倩; 梁成通; 李贵玲; 刘雨; 钱曼宁
Original assignee: Northern Jiangsu Peoples Hospital
Current assignee: Northern Jiangsu Peoples Hospital; Subei Peoples Hospital of Jiangsu Province
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2020-09-04

Abstract

本发明提供了胃癌分化相关标志物miRNA组合及其芯片和应用，属于生物医学技术领域。胃癌分化相关标志物miRNA组合物，包括miR‑138‑1、miR‑23B、miR‑24‑1、miR‑27B、miR‑503、miR‑614、miR‑30A和miR‑3189。所述miRNA组合物在制备检测胃癌分化的产品中的应用。经一系列试验验证，本发明提供的miRNA组合物作为miRNA诊断标志物，能够准确共预测胃癌分化程度，辅助临床诊断，为不同时期的胃癌患者制定不同的干预措施提供依据，改善预后。

Description

一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物及其芯片和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及胃癌分化相关标志物miRNA组合及其芯片和应用。

背景技术

胃癌是全球第五大最常见的恶性肿瘤[1]，占全球癌症相关死亡的8.8％[2]。我国是胃癌高发国家，胃癌负担十分严重[3]。目前临床工作中，胃癌诊断最可靠的手段仍是胃镜检查，其属于侵入性的检查，操作复杂，患者痛苦率高，不适宜作为常规筛查项目，而胃癌传统血清学肿瘤标志物，灵敏度和特异性均较低，并且对一些分化程度较差的肿瘤病理分型无法进行准确的判断，往往错过最佳诊疗时间[4]。尽管目前胃癌治疗手段如：外科手术、放疗、化疗、综合治疗取得了重大进展，但患者术后5年生存率依旧不容乐观仅为20％[5]。胃癌的预后与肿瘤细胞的分化程度相关。不同分化程度的胃癌细胞，其生长速度、转移侵袭能力具有显著的差别，可随着肿瘤的进展发生相应的改变，影响疾病的预后。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类长度为20～22个核苷酸的短链非编码RNA，通过与靶标基因互补结合，诱导mRNA降解亦或抑制蛋白质的翻译[6]。miRNA参与调节机体多种病理生理过程(细胞增殖，分化及侵袭等)，其异常表达与肿瘤发生发展有关，可辅助判断肿瘤组织来源、分化分期、治疗预后等[7,8]。胃癌细胞的增殖、侵袭转移以及凋亡等生物学特性的改变与miRNA的失调相关。

miRNA是医学领域的研究热点，其异常表达与肿瘤组织来源、分化分期、化疗耐药及预后密切相关。运用微阵列筛选疾病相关miRNA表达谱具有高效便捷的优势，可一性次检测不同样本中多个相关miRNA的表达。在Tetsuya Ueda等人[9]研究中，通过对所选取的上百个胃癌组织与正常组织进行差异表达miRNA表达谱的筛选，发现35个上调或下调的miRNA，不仅可用于鉴别胃癌组织与正常组织，还可鉴定肿瘤组织起源及肿瘤分型。此外，在肿瘤相关miRNA芯片研究中发现，一些miRNA会诱导“肿瘤干细胞”的产生，对于判断肿瘤起源具有重要的诊断价值，更令人眼前一亮的是，Lu等人研究中仅仅基于对200个miRNA的分析就可以对肿瘤进行精准分类，且可提供有用信息辅助判断某些分化差、无法确定组织来源的肿瘤[10]。肿瘤细胞分化程度，可以通过尽早判断分化程度及病理分型，有望逆转肿瘤进展，改善患者预后。因此针对胃癌等肿瘤分化标志物的鉴别，可以尽早对肿瘤病理类型进行判断，进行干预措施，具有一定的临床意义。

而现有技术中报道了很多关于胃癌相关miRNA数据，但是没有明确的关于胃癌分化相关miRNA的报道。

参考文献

[1]Cavatorta O,Scida S,Miraglia C,et al.Epidemiology of gastriccancer and risk factors[J].ActaBiomed,2018,89(8-S):82-87.

[2]Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in185countries[J].CA Cancer J Clin,2018,68(6):394-424.

[3]Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115-132.

[4]Kinoshita T,Kaito A.Current status and future perspectives oflaparoscopic radical surgery for advanced gastric cancer[J].TranslGastroenterol Hepatol,2017,2:43.

[5]Chen J G,Chen H Z,Zhu J,et al.Cancer survival in patients from ahospital-based cancer registry,China[J].J Cancer,2018,9(5):851-860.

[6]Fabian M R,Sonenberg N,Filipowicz W.Regulation of mRNA translationand stability by microRNAs[J].Annu Rev Biochem,2010,79:351-379.

[7]He L,Hannon G J.MicroRNAs:small RNAs with a big role in generegulation[J].Nat Rev Genet,2004,5(7):522-531.

[8]Shin V Y,Chu K M.MiRNA as potential biomarkers and therapeutictargets for gastric cancer[J].World J Gastroenterol,2014,20(30):10432-10439.

[9]Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al.Relation between microRNAexpression and progression and prognosis ofgastric cancer:a microRNAexpression analysis[J].Lancet Oncol,2010,11(2):136-146.

[10]Lu J,Getz G,Miska E A,et al.MicroRNA expression profilesclassifyhuman cancers[J].Nature,2005,435(7043):834-838.

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物及其芯片和应用，用于胃癌分化程度的预测。

本发明提供了一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物，包括miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189。

本发明提供了所述miRNA组合物在制备检测胃癌分化的产品中的应用。

优选的，所述产品通过检测样品中miRNA组合物的各miRNA的表达水平以检测样品的胃癌分化情况。

优选的，所述检测方法包括qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序。

优选的，所述产品包括基因芯片或试剂盒。

本发明提供了一种检测胃癌分化相关标志物的试剂在制备预测胃癌分化程度的试剂或试剂盒中的应用，所述胃癌分化相关标志物为所述miRNA组合物。

本发明提供了一种预测胃癌分化情况的miRNA芯片，包括与所述miRNA组合物互补配对的DNA片段。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术预测胃癌分化情况的试剂盒，包括检测miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189的引物对。

优选的，还包括荧光定量PCR检测用试剂。

本发明提供的胃癌分化相关标志物miRNA组合物，包括miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189。本发明初步确定8个miRNA用于预测胃癌分化情况：miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503在胃癌组织中表达较正常组织显著上调，可能作为致癌因子，其中miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B高表达与胃癌不良分化有关；miR-503与胃癌较高分化程度有关；miR-614、miR-30A、miR-3189在胃癌组织中表达显著下调，可能作为抑制因子，与较高分化程度胃癌相关。经一系列试验验证，本发明提供的一组miRNA诊断标志物，能够准确共预测胃癌分化程度，辅助临床诊断，为不同时期的胃癌患者制定不同的干预措施提供依据，改善预后。

具体实施方式

本发明提供了一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物，包括miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189。这8种miRNA在不同胃癌发展时期差异表达，用于共预测胃癌分化情况，miRNA组合物的名称及序列信息见表1。

表1 miRNA组合物的名称及序列信息

名称	编号	序列
			hsa-miR-138-1-3p	MIMAT0004607	GCUACUUCACAACACCAGGGCC(SEQ ID NO.1)
hsa-miR-23b(-3p)	MIMAT0000418	AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC(SEQ ID NO.2)
			hsa-miR-24-1(-5p)	MIMAT0000079	UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU(SEQ ID NO.3)
hsa-miR-27b(-3p)	MIMAT0000419	UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC(SEQ ID NO.4)
			hsa-miR-503(-5p)	MIMAT0002874	UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG(SEQ ID NO.5)
hsa-miR-30a(-5p)	MIMAT0000087	UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG(SEQ ID NO.6)
			hsa-miR-3189-3p	MIMAT0015071	CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG(SEQ ID NO.7)
hsa-miR-614	MIMAT0003282	GAACGCCUGUUCUUGCCAGGUGG(SEQ ID NO.8)

本发明提供了所述miRNA组合物在制备检测胃癌分化的产品中的应用。所述产品优选通过检测样品中miRNA组合物的各miRNA的表达水平以检测样品的胃癌分化情况。具体判断结果的方法优选如下：miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503在胃癌组织中表达较正常组织显著上调，可能作为致癌因子，其中miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B高表达与胃癌不良分化有关；miR-503与胃癌较高分化程度有关；miR-614、miR-30A、miR-3189在胃癌组织中表达显著下调，可能作为抑制因子，与较高分化程度胃癌相关。所述检测方法优选包括qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序。本发明对上述检测方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的检测方法即可。所述产品优选包括基因芯片或试剂盒。

本发明对所述检测胃癌分化相关标志物的试剂不做具体限定，按照本领域所熟知的检测miRNA的试剂即可，例如，引物对、探针、互补序列片段等。本发明对所述预测胃癌分化程度的试剂或试剂盒的制备方法不做具体限定，采用本领域所熟知的制备方法即可。

本发明提供了一种预测胃癌分化情况的miRNA芯片，包括与所述miRNA组合物碱基互补配对的DNA片段。本发明对所述基因芯片的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的芯片的制备方法即可，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5′端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，得到miRNA芯片。本发明对所述芯片的检测方法不做具体限定，采用本领域所熟知的芯片的检测方法即可。本发明对所述芯片的检测结果的判断方法同上述产品的判断方法，在此不做赘述。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术预测胃癌分化情况的试剂盒，包括检测miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189的引物对，依次为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32。本发明对所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。所述试剂盒优选还包括荧光定量PCR检测用试剂，例如荧光定量PCR反应预混液。本发明对所述试剂盒的检测结果的判断方法同上述产品的判断方法，在此不做赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物及其芯片和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

共预测胃癌分化相关miRNA的筛选

1.miRNA测序

人未分化胃癌细胞株HGC-27及中分化胃癌细胞株SGC-7901中差异表达miRNA通过广州市锐博生物科技公司进行转录组测序，结果如下表1所示：筛选出28个胃癌细胞分化相关miRNA，且具有统计学意义(p＜0.05)，其中19个miRNA在分化较差胃癌细胞株中相对高表达，9个miRNA在分化较好胃癌细胞株中相对高表达。

表1胃癌细胞HGC-27和SGC-7901的miRNA表达情况

注：log2(fold change)≥1表示miRNA在HGC-27中的表达量至少为SGC-7901的二倍，log2(fold change)≤-1表示miRNA在SGC-7901中的表达量至少为HGC-27的两倍。

2筛选胃癌分化相关miRNA

2.1 GEO数据库提取胃癌相关miRNA数据，对近10年芯片数据进行筛选，结果显示与获得胃癌分化相关miRNA有交集的芯片分别为：GSE23739、GSE99417。见表2。

表2 GEO数据库胃癌相关miRNA芯片

2.2筛选所得胃癌分化相关miRNA与GEO数据库提取胃癌发生相关miRNA数据进行取交集，获得8个miRNA用于共预测胃癌分化情况，分别为：miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A、miR-3189。见表3。

表3共预测胃癌分化相关miRNA

初步确定8个miRNA用于预测胃癌分化情况。miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503在胃癌组织中表达较正常组织显著上调，可能作为致癌因子，其中miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B高表达与胃癌不良分化有关；miR-503与胃癌较高分化程度有关；miR-614、miR-30A、miR-3189在胃癌组织中表达显著下调，可能作为抑制因子，与较高分化程度胃癌相关。

实施例2

(1)胃癌分化相关miRNA测序

a、miRNA测序样本

将人源胃癌细胞株HGC-27，SGC-7901置于液氮中保存备用。

b、细胞培养

HGC-27、SGC-7901均在PRMI-1640培养基中培养(内含10％FBS+1％青链霉素混合液)，视细胞状态及生长周期，2d～3d传代一次。

c、细胞样本处理

1)贴壁细胞置显微镜下观察，选取细胞生长至25cm²细胞培养瓶的90％左右(细胞数≥5×10⁶)，且细胞状态良好，弃去培养基，加入预冷的PBC漂洗一次；

2)按每10cm²细胞加入1ml Trizol的比例加入Trizol试剂；

3)反复吹打细胞，直至未见成团细胞块，使之充分溶解于Trizol中形成清亮不粘稠液体；

4)将上述处理的细胞样本全部转移至细胞冻存管中；

5)置于-80℃冰箱保存，待检。

d、样品送检及检测

将上述处理样本送至广州市锐博生物科技有限公司进行质量鉴定及miRNA芯片分析，按相关实验流程进行测序。

(2)GEO数据库提取胃癌发生相关miRNA

于GEO数据库提取近十年来所公开与胃癌发生相关miRNA芯片数据，对结果进行筛选，满足：a、芯片类型：表达谱芯片数据；b、主题词为stomach neoplasms OR gastriccancer；c、物种：Homo sapiens；d、样本类型：tissue orplasm。

(3)共预测胃癌分化相关miRNA

将(2)中筛选合格的miRNA芯片与(1)中具有统计学意义的测序结果取交集，获得目标miRNA组合，进一步进行验证，具体验证内容如下：

A.通过荧光定量PCR验证8种miRNA在GES-1，HGC-27和SGC-7901中的含量，验证测序芯片结果与GEO数据库提取数据结果。

B.构建miRNAmimic转染至胃癌细胞株HGC-27观察胃癌细胞增殖、侵袭能力的变化。

(4)miRNA诊断效能

a、实验组：收集在我院手术治疗，经手术病理切片证实为胃癌患者的术前血清样本及相关指标；

b、对照组：同期一定数量健康体检者血清标本及对应指标；

c、病历整理及随访记录实验组肿瘤分化程度，健康对照组与实验组传统肿瘤标CA199，CA724和CEA的检测结果；所有患者在术后均进行随访，随访终点事件为患者死亡或随访时间长达60个月；

d、血清样本miRNA的提取、浓度纯度检测及PCR扩增，依据检测结果划分高、中、低分化组和健康组；

e、通过ROC曲线比较miRNA与传统肿瘤标志物CA199，CA724和CEA在诊断胃癌敏感性及特异性的差别；

f、统计学分析

使用SPSS 20软件进行统计学分析。miRNA的相对表达量等计量数据以xˉ±s表示，采用t检验比较两组间差异。采用卡方检验比较miRNA高表达及低表达在各分化程度中的占比。采用Logistic分析miRNA与肿瘤分化程度的关系。采用Log Rank检验分析其生存率差异。以P＜0.05具有统计学差异。

2、预期结果

a、筛选所得miRNA在胃癌诊断中的灵敏性、特异性较传统肿瘤标志理想；

b、miRNA与胃癌分化程度相关，可有效区分胃癌分化程度，此外可能还与患者生存期相关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省苏北人民医院

<120> 一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物及其芯片和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcuacuucac aacaccaggg cc 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aucacauugc cagggauuac cac 23

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ugccuacuga gcugauauca gu 22

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uucacagugg cuaaguucug c 21

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uagcagcggg aacaguucug cag 23

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uguaaacauc cucgacugga ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccuuggguc ugauggggua g 21

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaacgccugu ucuugccagg ugg 23

Claims

1.一种胃癌分化相关标志物miRNA组合物，其特征在于，包括miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189。

2.权利要求1所述miRNA组合物在制备检测胃癌分化的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述产品通过检测样品中miRNA组合物的各miRNA的表达水平以检测样品的胃癌分化情况。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述检测方法包括qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序。

5.根据权利要求2～4任意一项所述应用，其特征在于，所述产品包括基因芯片或试剂盒。

6.一种检测胃癌分化相关标志物的试剂在制备预测胃癌分化程度的试剂或试剂盒中的应用，所述胃癌分化相关标志物为权利要求1所述miRNA组合物。

7.一种预测胃癌分化情况的miRNA芯片，其特征在于，包括与权利要求1所述miRNA组合物互补配对的DNA片段。

8.一种基于荧光定量PCR技术预测胃癌分化情况的试剂盒，其特征在于，包括检测miR-138-1、miR-23B、miR-24-1、miR-27B、miR-503、miR-614、miR-30A和miR-3189的引物对。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR检测用试剂。