JP2000300261A - ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用試薬 - Google Patents
ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用試薬Info
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- JP2000300261A JP2000300261A JP11106867A JP10686799A JP2000300261A JP 2000300261 A JP2000300261 A JP 2000300261A JP 11106867 A JP11106867 A JP 11106867A JP 10686799 A JP10686799 A JP 10686799A JP 2000300261 A JP2000300261 A JP 2000300261A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来のｔ（１５；１７）転座の臨床検査方法の
問題点を解決し、ＮＡＳＢＡにより、簡便、迅速、特異
的且つ高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出
を可能とする。 【解決手段】配列表・配列番号１〜４のいずれかに記載
の配列のうち少なくとも連続した１５塩基からなる核酸
配列を含むことを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍ
ＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド及びこれらを用いたＰ
ＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出方法。
問題点を解決し、ＮＡＳＢＡにより、簡便、迅速、特異
的且つ高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出
を可能とする。 【解決手段】配列表・配列番号１〜４のいずれかに記載
の配列のうち少なくとも連続した１５塩基からなる核酸
配列を含むことを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍ
ＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド及びこれらを用いたＰ
ＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ
キメラｍＲＮＡを簡便かつ迅速に検出するＰＭＬ−ＲＡ
ＲＡキメラｍＲＮＡ検出用のプライマーと検出／捕捉用
プローブ及びその利用法に関する。
キメラｍＲＮＡを簡便かつ迅速に検出するＰＭＬ−ＲＡ
ＲＡキメラｍＲＮＡ検出用のプライマーと検出／捕捉用
プローブ及びその利用法に関する。
【０００２】
【従来の技術】急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）は、急
性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）の一亜腫で、ＦＡＢ分類上
Ｍ３に属し、細胞形態的に多数の粗大顆粒と異形成の強
い核を有する前骨髄球が増加する。骨髄系細胞分化にお
いて、前骨髄球レベルで分化の停止した腫瘍と考えるこ
とが出来る。この、ＡＰＬ患者の約７０〜８０％におい
て、ｔ（１５；１７）転座が見出されており、ＡＰＬ以
外の白血病では認められないため、ｔ（１５；１７）転
座の有無を確認することはＡＰＬの診断を確定する上で
極めて重要である。
性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）の一亜腫で、ＦＡＢ分類上
Ｍ３に属し、細胞形態的に多数の粗大顆粒と異形成の強
い核を有する前骨髄球が増加する。骨髄系細胞分化にお
いて、前骨髄球レベルで分化の停止した腫瘍と考えるこ
とが出来る。この、ＡＰＬ患者の約７０〜８０％におい
て、ｔ（１５；１７）転座が見出されており、ＡＰＬ以
外の白血病では認められないため、ｔ（１５；１７）転
座の有無を確認することはＡＰＬの診断を確定する上で
極めて重要である。
【０００３】ｔ（１５；１７）転座は、第１５染色体長
腕（１５ｑ２２）に座位する転写制御因子であるＰＭＬ
遺伝子と、第１７染色体長腕（１７ｑ１１）に座位する
レチノイン酸レセプターα（ＲＡＲＡ）遺伝子の相互転
座によりＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを生成する。
この転座の１７番染色体上の切断点はＲＡＲα遺伝子の
イントロン２に集中している。また、１５番染色体上の
ＰＭＬ遺伝子では、ｂｃｒ１、ｂｃｒ２、ｂｃｒ３の３
つの部位に集中している。また、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメ
ラｍＲＮＡには、ＰＭＬ遺伝子内の切断の多様性とスプ
ライシングの多様性のために症例ごとに、また、同一症
例でも様々のアイソフォームが存在している（EMBO Jou
rnal 第１１巻、第４号、第１３９７〜１４０７頁,１
９９２年）。
腕（１５ｑ２２）に座位する転写制御因子であるＰＭＬ
遺伝子と、第１７染色体長腕（１７ｑ１１）に座位する
レチノイン酸レセプターα（ＲＡＲＡ）遺伝子の相互転
座によりＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを生成する。
この転座の１７番染色体上の切断点はＲＡＲα遺伝子の
イントロン２に集中している。また、１５番染色体上の
ＰＭＬ遺伝子では、ｂｃｒ１、ｂｃｒ２、ｂｃｒ３の３
つの部位に集中している。また、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメ
ラｍＲＮＡには、ＰＭＬ遺伝子内の切断の多様性とスプ
ライシングの多様性のために症例ごとに、また、同一症
例でも様々のアイソフォームが存在している（EMBO Jou
rnal 第１１巻、第４号、第１３９７〜１４０７頁,１
９９２年）。
【０００４】該ｔ（１５；１７）転座は、サザン法で転
座に伴う遺伝子の再構成が証明できる。高島ら（日本臨
床 第５０巻、第６号、第１３６３頁、１９９２年）は
３種のＤＮＡプローブを用いサザン法を実施し、１６例
のＡＰＬ患者のうち１５例でＲＡＲＡの再構成を認めて
いる。
座に伴う遺伝子の再構成が証明できる。高島ら（日本臨
床 第５０巻、第６号、第１３６３頁、１９９２年）は
３種のＤＮＡプローブを用いサザン法を実施し、１６例
のＡＰＬ患者のうち１５例でＲＡＲＡの再構成を認めて
いる。
【０００５】また、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ
−ＰＣＲ）を用いた検出方法も知られている（Cancer.
Genet.Cytogenet 第８４巻、第９１〜９４頁、１９８
４年）。ＲＴ−ＰＣＲ法では、切断点を挟んで、ＲＡＲ
α遺伝子側にリバースプライマー、ＰＭＬ遺伝子側にフ
ォワードプライマーを設定し、逆転写反応後ＰＣＲを実
施する。増幅産物をアガロースゲル中で確認することに
より、ｔ（１５；１７）転座の有無が判別できる。
−ＰＣＲ）を用いた検出方法も知られている（Cancer.
Genet.Cytogenet 第８４巻、第９１〜９４頁、１９８
４年）。ＲＴ−ＰＣＲ法では、切断点を挟んで、ＲＡＲ
α遺伝子側にリバースプライマー、ＰＭＬ遺伝子側にフ
ォワードプライマーを設定し、逆転写反応後ＰＣＲを実
施する。増幅産物をアガロースゲル中で確認することに
より、ｔ（１５；１７）転座の有無が判別できる。
【０００６】さらに近年、蛍光in situハイブリダイゼ
ーション法（ＦＩＳＨ法）による検出方法も開発されて
いる（臨床病理 第４４巻、第８号、第７３６頁、１９
９６年）。転座切断領域を挟んで、ＲＡＲα遺伝子側に
赤色ないし緑色の蛍光標識したプローブ、ＰＭＬ遺伝子
側に前者と異なる標識がされた蛍光標識されたプローブ
を設定し、ハイブリダイゼーションを行う。赤色と緑色
の蛍光が重なり黄色を呈した場合、転座であると認知で
きる。
ーション法（ＦＩＳＨ法）による検出方法も開発されて
いる（臨床病理 第４４巻、第８号、第７３６頁、１９
９６年）。転座切断領域を挟んで、ＲＡＲα遺伝子側に
赤色ないし緑色の蛍光標識したプローブ、ＰＭＬ遺伝子
側に前者と異なる標識がされた蛍光標識されたプローブ
を設定し、ハイブリダイゼーションを行う。赤色と緑色
の蛍光が重なり黄色を呈した場合、転座であると認知で
きる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来のｔ（１５；１
７）転座の検出法としては、上述したように、サザン
法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法などが挙げられる。し
かしながら、サザン法では感度不足が懸念され、ＲＴ−
ＰＣＲ法ではＰＣＲを実施知る前に逆転写反応を行わね
ばならず作業が繁雑となる。ＦＩＳＨ法では、シグナル
が偶然重なった場合、偽陽性と判定される問題点がある
とともに、作業に熟練を要するという技術的に問題点も
ある。
７）転座の検出法としては、上述したように、サザン
法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法などが挙げられる。し
かしながら、サザン法では感度不足が懸念され、ＲＴ−
ＰＣＲ法ではＰＣＲを実施知る前に逆転写反応を行わね
ばならず作業が繁雑となる。ＦＩＳＨ法では、シグナル
が偶然重なった場合、偽陽性と判定される問題点がある
とともに、作業に熟練を要するという技術的に問題点も
ある。
【０００８】近年、ＲＮＡを特異的に増幅するＲＮＡポ
リメラーゼを用いる増幅法として、ＮＡＳＢＡ(Nucleic
Acid Sequence Based Amplification)が注目されてき
た。ＮＡＳＢＡは基本的にＲＮＡのみから一定温度で簡
便に増幅出来る。また、ｔ（１５；１７）転座により生
じるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラ遺伝子から転写されるＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡは、ＤＮＡに比較し大量に
存在するので、高感度に検出可能である。従って、ｔ
（１５；１７）転座を簡便に区別出来るＮＡＳＢＡに対
応できるプライマーの構築は重要である。
リメラーゼを用いる増幅法として、ＮＡＳＢＡ(Nucleic
Acid Sequence Based Amplification)が注目されてき
た。ＮＡＳＢＡは基本的にＲＮＡのみから一定温度で簡
便に増幅出来る。また、ｔ（１５；１７）転座により生
じるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラ遺伝子から転写されるＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡは、ＤＮＡに比較し大量に
存在するので、高感度に検出可能である。従って、ｔ
（１５；１７）転座を簡便に区別出来るＮＡＳＢＡに対
応できるプライマーの構築は重要である。
【０００９】本発明の目的は、ＮＡＳＢＡで簡便、迅
速、特異的且つ高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮ
Ａを検出可能なオリゴヌクレオチドを提供することにあ
る。詳細には、従来のｔ（１５；１７）転座の臨床検査
方法の問題点を解決すべく、ＮＡＳＢＡに適したプライ
マーと、該プライマーにより得られる増幅産物の判定を
行うためのプローブを提供することにある。
速、特異的且つ高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮ
Ａを検出可能なオリゴヌクレオチドを提供することにあ
る。詳細には、従来のｔ（１５；１７）転座の臨床検査
方法の問題点を解決すべく、ＮＡＳＢＡに適したプライ
マーと、該プライマーにより得られる増幅産物の判定を
行うためのプローブを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＰＭＬ−Ｒ
ＡＲＡキメラｍＲＮＡの遺伝子に関する種々の検討を重
ねた結果、ＮＡＳＢＡを用いて、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメ
ラｍＲＮＡから簡便、迅速、特異的かつ高感度に増幅で
きる配列を有するプライマーと検出／捕捉プローブを用
いた検出方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
ＡＲＡキメラｍＲＮＡの遺伝子に関する種々の検討を重
ねた結果、ＮＡＳＢＡを用いて、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメ
ラｍＲＮＡから簡便、迅速、特異的かつ高感度に増幅で
きる配列を有するプライマーと検出／捕捉プローブを用
いた検出方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる （１）配列表・配列番号１記載の配列のうち少なくとも
連続した１５塩基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （２）配列表・配列番号２記載の配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （３）配列表・配列番号３記載の配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （４）配列表・配列番号４記載の配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （５）（１），（２），（３）及び（４）に記載のＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド
からなるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用プライ
マー群であって、かつ該プライマー群を構成するオリゴ
ヌクレオチドのうちの少なくとも１つがその５’末端に
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が結
合していることを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍ
ＲＮＡ検出用プライマー群。 （６）５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列が結合している（１）記載のＰＭＬ−ＲＡ
ＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド含む
（５）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用プ
ライマー群。 （７）下記(a)〜(h)の成分を含むことを特徴とするＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための試薬キッ
ト。 (a)５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列が結合している（１）記載のＰＭＬ−ＲＡＲ
ＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドからなる第
１プライマー、(b) （２）、（３）及び（４）記載のＰ
ＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチ
ドからなる第２プライマー群、(c)リボヌクレアーゼＨ
活性を有する物質、(d)ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質、(e)ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質、(f)ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質、(g)リボヌクレオシドトリフォスフ
ェート、及び(h)デオキシリボヌクレオシドトリフォス
フェート （８）第２プライマー群を構成するＰＭＬ−ＲＡＲＡキ
メラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドのうちの少なく
とも一つが５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列が結合している（７）記載のＰＭＬ−
ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための試薬キット。 （９）下記工程〜を含むことを特徴とするＰＭＬ−
ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ
（−）を大量に得る方法。 ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを鋳型として、
（７）記載の第１プライマーをハイブリダイズさせ、Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の作用に
より伸長させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物を得、 ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡのみ
を特異的に分解するリボヌクレアーゼＨ活性を有する物
質の作用により、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物からＲＮＡを分解して、一本鎖ＤＮＡを得、 該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、（７）記載の第２プラ
イマー群のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
をハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質の作用によりＤＮＡ伸長反応を行っ
て、５‘末端に上流に機能可能なプロモーター配列を有
する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ、 該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配列を
認識できるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
物質の作用により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡと
相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ（−）のコピー数を
増加させ、 上記工程で得られた一本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型とし
て、請求項７記載の第２プライマー群のうちの少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の作用に
よりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ッド伸長生成物を得、 ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡのみ
を特異的に分解するリボヌクレアーゼＨ活性を有する物
質の作用により、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物からＲＮＡを分解して一本鎖ＤＮＡを得、 該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、（７）記載の第１プラ
イマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有する物質の作用により伸長させて、５
‘末端に上流に機能可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ、 該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配列を
認識できるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
物質の作用により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡと
相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ（−）のコピー数を
増加させる （１０）得られた一本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型として、前
記〜を複数回繰り返す（９）記載のＰＭＬ−ＲＡＲ
ＡキメラｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）
を大量に得る方法。 （１１）配列表・配列番号５及び／又は６記載の塩基配
列または相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した
１５残基からなる塩基配列もしくは該塩基配列が修飾さ
れたオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用及び／又は捕捉用プ
ローブ。 （１２）（１１）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮ
Ａ検出用及び／又は捕捉用プローブを含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための
試薬キット。 （１３）（１２）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮ
Ａ検出用及び／又は捕捉用プローブを含む（７）又は
（８）に記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出
するための試薬キット。 （１４）（９）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
に相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）を大量に得る方法
により取得したアンチセンスＲＮＡ（−）のコピーを、
（１１）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用
及び／又は捕捉用プローブを用いて検出することを特徴
とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出方法。 （１５）（９）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
に相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）を大量に得る方法
により取得したアンチセンスＲＮＡ（−）のコピーを、
固相担体に吸着または結合した配列表・配列番号５及び
／又は６記載の塩基配列のうち少なくとも連続した１５
残基からなる捕捉プローブ、及び配列表・配列番号５及
び／又は６記載の塩基配列のうち少なくとも連続した１
５残基からなる塩基配列が標識で修飾された検出用プロ
ーブをハイブリダイズさせ、未反応の検出用プローブを
分離し、捕捉用プローブ、アンチセンスＲＮＡ（−）の
コピー及び検出用プローブの複合体の標識を測定する
（１４）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出
方法。
なる （１）配列表・配列番号１記載の配列のうち少なくとも
連続した１５塩基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （２）配列表・配列番号２記載の配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （３）配列表・配列番号３記載の配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （４）配列表・配列番号４記載の配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌク
レオチド。 （５）（１），（２），（３）及び（４）に記載のＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド
からなるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用プライ
マー群であって、かつ該プライマー群を構成するオリゴ
ヌクレオチドのうちの少なくとも１つがその５’末端に
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が結
合していることを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍ
ＲＮＡ検出用プライマー群。 （６）５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列が結合している（１）記載のＰＭＬ−ＲＡ
ＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド含む
（５）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用プ
ライマー群。 （７）下記(a)〜(h)の成分を含むことを特徴とするＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための試薬キッ
ト。 (a)５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列が結合している（１）記載のＰＭＬ−ＲＡＲ
ＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドからなる第
１プライマー、(b) （２）、（３）及び（４）記載のＰ
ＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチ
ドからなる第２プライマー群、(c)リボヌクレアーゼＨ
活性を有する物質、(d)ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質、(e)ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質、(f)ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質、(g)リボヌクレオシドトリフォスフ
ェート、及び(h)デオキシリボヌクレオシドトリフォス
フェート （８）第２プライマー群を構成するＰＭＬ−ＲＡＲＡキ
メラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドのうちの少なく
とも一つが５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列が結合している（７）記載のＰＭＬ−
ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための試薬キット。 （９）下記工程〜を含むことを特徴とするＰＭＬ−
ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ
（−）を大量に得る方法。 ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを鋳型として、
（７）記載の第１プライマーをハイブリダイズさせ、Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の作用に
より伸長させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物を得、 ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡのみ
を特異的に分解するリボヌクレアーゼＨ活性を有する物
質の作用により、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物からＲＮＡを分解して、一本鎖ＤＮＡを得、 該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、（７）記載の第２プラ
イマー群のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
をハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する物質の作用によりＤＮＡ伸長反応を行っ
て、５‘末端に上流に機能可能なプロモーター配列を有
する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ、 該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配列を
認識できるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
物質の作用により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡと
相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ（−）のコピー数を
増加させ、 上記工程で得られた一本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型とし
て、請求項７記載の第２プライマー群のうちの少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の作用に
よりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ッド伸長生成物を得、 ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡのみ
を特異的に分解するリボヌクレアーゼＨ活性を有する物
質の作用により、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物からＲＮＡを分解して一本鎖ＤＮＡを得、 該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、（７）記載の第１プラ
イマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有する物質の作用により伸長させて、５
‘末端に上流に機能可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ、 該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配列を
認識できるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する
物質の作用により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡと
相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ（−）のコピー数を
増加させる （１０）得られた一本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型として、前
記〜を複数回繰り返す（９）記載のＰＭＬ−ＲＡＲ
ＡキメラｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）
を大量に得る方法。 （１１）配列表・配列番号５及び／又は６記載の塩基配
列または相補的な塩基配列のうち、少なくとも連続した
１５残基からなる塩基配列もしくは該塩基配列が修飾さ
れたオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用及び／又は捕捉用プ
ローブ。 （１２）（１１）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮ
Ａ検出用及び／又は捕捉用プローブを含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための
試薬キット。 （１３）（１２）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮ
Ａ検出用及び／又は捕捉用プローブを含む（７）又は
（８）に記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出
するための試薬キット。 （１４）（９）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
に相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）を大量に得る方法
により取得したアンチセンスＲＮＡ（−）のコピーを、
（１１）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用
及び／又は捕捉用プローブを用いて検出することを特徴
とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出方法。 （１５）（９）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
に相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）を大量に得る方法
により取得したアンチセンスＲＮＡ（−）のコピーを、
固相担体に吸着または結合した配列表・配列番号５及び
／又は６記載の塩基配列のうち少なくとも連続した１５
残基からなる捕捉プローブ、及び配列表・配列番号５及
び／又は６記載の塩基配列のうち少なくとも連続した１
５残基からなる塩基配列が標識で修飾された検出用プロ
ーブをハイブリダイズさせ、未反応の検出用プローブを
分離し、捕捉用プローブ、アンチセンスＲＮＡ（−）の
コピー及び検出用プローブの複合体の標識を測定する
（１４）記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの検出
方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下に本発明において使用される
用語について説明する。「プロモーター」とは、ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合する配列であ
る。ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはこのプロモーター
配列に特異的に結合し、プロモーター配列よりも下流の
ＤＮＡ配列と相同なＲＮＡを合成する。
用語について説明する。「プロモーター」とは、ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合する配列であ
る。ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはこのプロモーター
配列に特異的に結合し、プロモーター配列よりも下流の
ＤＮＡ配列と相同なＲＮＡを合成する。
【００１３】「ＮＡＳＢＡ」は、標的ＲＮＡと相補的な
配列を有しかつＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを
５’末端に付加した第１プライマーと、標的ＲＮＡと同
じ配列を有する第２プライマーとを組合せて使用し、逆
転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲ
ＮＡポリメラーゼを作用させて、第１プライマーと第２
プライマー（群）の間の核酸配列を有するＲＮＡを増幅
する技術である。該方法で増幅される核酸は、標的ＲＮ
Ａと相補的な配列を有するＲＮＡである。一段階の酵素
反応でＲＮＡを増幅することが可能なＮＡＳＢＡ法の導
入により、核酸増幅工程は操作上、極めて簡素化され
る。この方法によれば、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ
により、一分子の二本鎖核酸から数十から数千分子のＲ
ＮＡを転写でき、ＰＣＲ法に比べ１サイクルあたりの増
幅効率が高い。また、ＰＣＲ法の際には必要であった温
度サイクルが不要であり、より簡便に増幅が可能であ
る。
配列を有しかつＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを
５’末端に付加した第１プライマーと、標的ＲＮＡと同
じ配列を有する第２プライマーとを組合せて使用し、逆
転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲ
ＮＡポリメラーゼを作用させて、第１プライマーと第２
プライマー（群）の間の核酸配列を有するＲＮＡを増幅
する技術である。該方法で増幅される核酸は、標的ＲＮ
Ａと相補的な配列を有するＲＮＡである。一段階の酵素
反応でＲＮＡを増幅することが可能なＮＡＳＢＡ法の導
入により、核酸増幅工程は操作上、極めて簡素化され
る。この方法によれば、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ
により、一分子の二本鎖核酸から数十から数千分子のＲ
ＮＡを転写でき、ＰＣＲ法に比べ１サイクルあたりの増
幅効率が高い。また、ＰＣＲ法の際には必要であった温
度サイクルが不要であり、より簡便に増幅が可能であ
る。
【００１４】「修飾」とは、オリゴヌクレオチドの配列
部分に他のヌクレオチドを付加または置換することを意
味する。付加とはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質
等を有するヌクレオチド、オリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡ
ＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等をオリゴヌク
レオチド配列の５’末端または３’末端に結合すること
である。置換とはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質
等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中の
ヌクレオチドの替わりに導入することである。また、合
成後に放射性物質や酵素、蛍光物質など公知のオリゴヌ
クレオチドの標識物を導入することも含まれる。
部分に他のヌクレオチドを付加または置換することを意
味する。付加とはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質
等を有するヌクレオチド、オリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡ
ＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等をオリゴヌク
レオチド配列の５’末端または３’末端に結合すること
である。置換とはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質
等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中の
ヌクレオチドの替わりに導入することである。また、合
成後に放射性物質や酵素、蛍光物質など公知のオリゴヌ
クレオチドの標識物を導入することも含まれる。
【００１５】「標識する」とは、放射性物質、酵素また
は蛍光物質など、検出可能な物質を結合することをい
う。
は蛍光物質など、検出可能な物質を結合することをい
う。
【００１６】以下、本発明の詳細を説明する。本発明の
標的核酸が高次構造を有しているような場合は、予め加
熱、酸、アルカリ等の変性処理により一本鎖として増幅
反応に供するのが好ましい。標的核酸がタンパク質、脂
質や糖質等の混合物中または生体試料中に存在する場
合、常法に従い標的核酸を抽出後、本発明に供すること
ができる。具体的な抽出方法としては、プロテイナーゼ
や界面活性剤等を含む溶液を加え約３０分間のインキュ
ベート後、得られる溶液をフェノールやクロロホルム等
で抽出しエタノール沈殿して核酸を得ればよい。また別
の方法として、Ｂｏｏｍらの方法（J. Clin. Microbio
l. 第２８巻、第４９５〜５０３頁）を用いても良い。
標的核酸が高次構造を有しているような場合は、予め加
熱、酸、アルカリ等の変性処理により一本鎖として増幅
反応に供するのが好ましい。標的核酸がタンパク質、脂
質や糖質等の混合物中または生体試料中に存在する場
合、常法に従い標的核酸を抽出後、本発明に供すること
ができる。具体的な抽出方法としては、プロテイナーゼ
や界面活性剤等を含む溶液を加え約３０分間のインキュ
ベート後、得られる溶液をフェノールやクロロホルム等
で抽出しエタノール沈殿して核酸を得ればよい。また別
の方法として、Ｂｏｏｍらの方法（J. Clin. Microbio
l. 第２８巻、第４９５〜５０３頁）を用いても良い。
【００１７】本発明のプライマーとプローブは配列表・
配列番号１〜６の核酸配列で示されている。使用する第
１プライマーは標的核酸配列に対して十分に相補的な核
酸配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有す
る。第２プライマーの３’末端は相補的鎖上の第１プラ
イマーの３’末端に向けられている。プローブは第一プ
ライマーと第二プライマーのいかなる組合せにおける増
幅産物ともハイブリダイゼーション出来るように設定さ
れている。
配列番号１〜６の核酸配列で示されている。使用する第
１プライマーは標的核酸配列に対して十分に相補的な核
酸配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有す
る。第２プライマーの３’末端は相補的鎖上の第１プラ
イマーの３’末端に向けられている。プローブは第一プ
ライマーと第二プライマーのいかなる組合せにおける増
幅産物ともハイブリダイゼーション出来るように設定さ
れている。
【００１８】本発明のプライマーはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でよく、化学合成により調製できる。例え
ば、パーキン・エルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９
１型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。各
種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で実施す
る。精製はＦＰＬＣで逆相カラムにて実施しても良い。
他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホ
ネート法、チオホスファイト法等がある。また、標的核
酸配列に変異がある場合や他の増幅領域や他の近縁ウイ
ルスとの共通増幅を目的とする場合、プライマー中に欠
失、挿入あるいは置換といった点突然変異があってもよ
い。本発明のプライマーは合成物であるから、容易、大
量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ること
が可能である。
（ＤＮＡ）でよく、化学合成により調製できる。例え
ば、パーキン・エルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９
１型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。各
種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で実施す
る。精製はＦＰＬＣで逆相カラムにて実施しても良い。
他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホ
ネート法、チオホスファイト法等がある。また、標的核
酸配列に変異がある場合や他の増幅領域や他の近縁ウイ
ルスとの共通増幅を目的とする場合、プライマー中に欠
失、挿入あるいは置換といった点突然変異があってもよ
い。本発明のプライマーは合成物であるから、容易、大
量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ること
が可能である。
【００１９】本発明において使用する第１プライマー
は、標的核酸配列に対して十分に相補的な塩基配列およ
びその５’末端側にプロモーター配列を有することが好
ましい。プロモーター配列は特に制限はされないが、Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作用するように機能する
必要がある。このようなプロモーター配列として、例え
ば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼならば5'-AATTCTAATACGACT
CACTATAGGG-3'が知られている。
は、標的核酸配列に対して十分に相補的な塩基配列およ
びその５’末端側にプロモーター配列を有することが好
ましい。プロモーター配列は特に制限はされないが、Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作用するように機能する
必要がある。このようなプロモーター配列として、例え
ば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼならば5'-AATTCTAATACGACT
CACTATAGGG-3'が知られている。
【００２０】一般的にプロモーター配列にはその後に続
く複製開始点までのスペーサーを含んでいても良い。例
えば、5'-AGGAGAG-3'が知られており、必要によりその
一部分をプロモーター配列の３’末端に結合しても良
い。増幅領域によっては、スペーサー配列を挿入するこ
とで増幅効率の向上が可能である。その他のプロモータ
ー配列として以下のものがある。Ｔ３ＲＮＡポリメラー
ゼならば5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼならば5'-ATTTAGGTGACACTATA-3' が挙げられ
る。
く複製開始点までのスペーサーを含んでいても良い。例
えば、5'-AGGAGAG-3'が知られており、必要によりその
一部分をプロモーター配列の３’末端に結合しても良
い。増幅領域によっては、スペーサー配列を挿入するこ
とで増幅効率の向上が可能である。その他のプロモータ
ー配列として以下のものがある。Ｔ３ＲＮＡポリメラー
ゼならば5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼならば5'-ATTTAGGTGACACTATA-3' が挙げられ
る。
【００２１】本発明に用いるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼと付随するプロモーター配列は上記の３種が好まし
いが限定はされない。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとそのプ
ロモーター配列を使用するのが特に好ましい。
ーゼと付随するプロモーター配列は上記の３種が好まし
いが限定はされない。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとそのプ
ロモーター配列を使用するのが特に好ましい。
【００２２】また本発明における第２プライマーは、第
１プライマー伸長物の核酸配列に対して相補的な核酸配
列を有し、標的核酸配列に対して十分に相同である。第
２プライマーは第１プライマー伸長物の核酸配列に対し
て相補的な核酸配列に加えて、必要によりその５’末端
側にプロモーター配列を有していても良い。第２プライ
マーがプロモーター配列を有している場合、第１プライ
マーのプロモーター配列と異なっていても同一であって
も良い。異なる場合には、それぞれのプロモーターに作
用するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要により複
数用いる。例えば、第２プライマーのプロモーター配列
にＴ７プロモーターを用いる場合にはＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼを、Ｔ３プロモーターを用いる場合にはＴ３ＲＮ
Ａポリメラーゼを、ＳＰ６プロモーターを用いる場合に
はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いる。
１プライマー伸長物の核酸配列に対して相補的な核酸配
列を有し、標的核酸配列に対して十分に相同である。第
２プライマーは第１プライマー伸長物の核酸配列に対し
て相補的な核酸配列に加えて、必要によりその５’末端
側にプロモーター配列を有していても良い。第２プライ
マーがプロモーター配列を有している場合、第１プライ
マーのプロモーター配列と異なっていても同一であって
も良い。異なる場合には、それぞれのプロモーターに作
用するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要により複
数用いる。例えば、第２プライマーのプロモーター配列
にＴ７プロモーターを用いる場合にはＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼを、Ｔ３プロモーターを用いる場合にはＴ３ＲＮ
Ａポリメラーゼを、ＳＰ６プロモーターを用いる場合に
はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いる。
【００２３】用いるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼと付
随するプロモーター配列は上記の３種が好ましいが、特
に限定はされない。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとそのプロ
モーター配列を使用するのが特に好ましい。さらに好ま
しくは、第２プライマーがプロモーター配列を有してい
る場合、第１プライマーも第２プライマーもＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列を結合せしめ、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼを用いてコピー数を増加させるのがよ
い。第１プライマーと第２プライマーの標的核酸配列、
相補配列又はそれぞれのプライマーの伸長物とハイブリ
ダイズする領域は、配列表に示す配列の連続した少なく
とも１５塩基からなる塩基配列が必要である。
随するプロモーター配列は上記の３種が好ましいが、特
に限定はされない。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとそのプロ
モーター配列を使用するのが特に好ましい。さらに好ま
しくは、第２プライマーがプロモーター配列を有してい
る場合、第１プライマーも第２プライマーもＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列を結合せしめ、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼを用いてコピー数を増加させるのがよ
い。第１プライマーと第２プライマーの標的核酸配列、
相補配列又はそれぞれのプライマーの伸長物とハイブリ
ダイズする領域は、配列表に示す配列の連続した少なく
とも１５塩基からなる塩基配列が必要である。
【００２４】Fahyらの報告によれば（PCR methods and
Applications 第１巻、第２５〜３３頁、１９９１
年）、ＮＡＳＢＡ法と同等の技術である３ＳＲ法では１
５塩基から３０塩基が好ましいとの報告がある。従っ
て、本発明においても標的核酸配列の調製法やＲＮＡポ
リメラーゼを用いる増幅法の実施条件により、最適配列
及び最適配列長が異なるため各条件に適した配列や配列
長を選択する必要がある。好ましくは３’末端側の配列
が配列表に示す配列の連続した少なくとも１５塩基から
なる塩基配列であることが望ましい。ハイブリダイズす
る領域の理想的な長さは１５塩基から配列表に示した全
配列長が好ましく、さらに好ましくは全配列長である。
Applications 第１巻、第２５〜３３頁、１９９１
年）、ＮＡＳＢＡ法と同等の技術である３ＳＲ法では１
５塩基から３０塩基が好ましいとの報告がある。従っ
て、本発明においても標的核酸配列の調製法やＲＮＡポ
リメラーゼを用いる増幅法の実施条件により、最適配列
及び最適配列長が異なるため各条件に適した配列や配列
長を選択する必要がある。好ましくは３’末端側の配列
が配列表に示す配列の連続した少なくとも１５塩基から
なる塩基配列であることが望ましい。ハイブリダイズす
る領域の理想的な長さは１５塩基から配列表に示した全
配列長が好ましく、さらに好ましくは全配列長である。
【００２５】またＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡに
は、ＰＭＬ遺伝子内の切断の多様性とスプライシングの
多様性のために、症例ごとにあるいは同一症例でも様々
のアイソフォームが存在している。そのため複数の第２
プライマー（本発明においては「第２プライマー群」と
いう）が必要となる。また本発明において、第１プライ
マー及び第２プライマー群からなる組合せを「プライマ
ー群」という。本発明において、鋭意検討の結果、配列
表・配列番号２記載の配列のうち少なくとも連続した１
５残基からなる塩基配列を含むことを特徴とするＰＭＬ
−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド
（第２プライマー(1)）と、配列表・配列番号３記載の
配列のうち少なくとも連続した１５残基からなる塩基配
列を含むことを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲ
ＮＡ検出用オリゴヌクレオチド（第２プライマー(2)）
と、配列表・配列番号４記載の配列のうち少なくとも連
続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴とす
るＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレ
オチド（第２プライマー(3)）を混合し、第２プライマ
ー群として用るのが特に好ましいことが見出された。
は、ＰＭＬ遺伝子内の切断の多様性とスプライシングの
多様性のために、症例ごとにあるいは同一症例でも様々
のアイソフォームが存在している。そのため複数の第２
プライマー（本発明においては「第２プライマー群」と
いう）が必要となる。また本発明において、第１プライ
マー及び第２プライマー群からなる組合せを「プライマ
ー群」という。本発明において、鋭意検討の結果、配列
表・配列番号２記載の配列のうち少なくとも連続した１
５残基からなる塩基配列を含むことを特徴とするＰＭＬ
−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド
（第２プライマー(1)）と、配列表・配列番号３記載の
配列のうち少なくとも連続した１５残基からなる塩基配
列を含むことを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲ
ＮＡ検出用オリゴヌクレオチド（第２プライマー(2)）
と、配列表・配列番号４記載の配列のうち少なくとも連
続した１５残基からなる塩基配列を含むことを特徴とす
るＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレ
オチド（第２プライマー(3)）を混合し、第２プライマ
ー群として用るのが特に好ましいことが見出された。
【００２６】その混合比率は、所望する条件に合わせ
０．０１μＭ〜１μＭ程度の範囲内で検討し、最適な条
件を見出せばよい。プライマーが少なすぎると増幅能が
低下するが、プライマー量が多すぎても非特異的反応が
進行するため増幅能が低下を招く。好ましくは、第２プ
ライマー(1)：第２プライマー(2)：第２プライマー(3)
＝０．８μＭ：０．０６７μＭ：０．４μＭである。
０．０１μＭ〜１μＭ程度の範囲内で検討し、最適な条
件を見出せばよい。プライマーが少なすぎると増幅能が
低下するが、プライマー量が多すぎても非特異的反応が
進行するため増幅能が低下を招く。好ましくは、第２プ
ライマー(1)：第２プライマー(2)：第２プライマー(3)
＝０．８μＭ：０．０６７μＭ：０．４μＭである。
【００２７】本発明を用いてＮＡＳＢＡ法を行う場合
は、公知文献（例えば、J. Virol. Methods 第３５巻、
第２７３〜２８６頁）を参考に実施すればよい。すなわ
ち、２５μlの反応系において酵素添加後の最終濃度が
４０ｍＭ Tris(ｐＨ８．５);２０ｍＭＭｇＣｌ2; ４０
ｍＭＫＣｌ;５ｍＭＤＴＴ; １５％ＤＭＳＯ;１ｍＭｄＮ
ＴＰ;４．１ｍＭｒＮＴＰ;０．２μＭ第１プライマー;
０．８μＭ第２プライマー(1)；０．０６７μＭ第２プ
ライマー(2)；０．４μＭ第２プライマー(3)になるよう
設定し、抽出ＲＮＡと混ぜて６５℃で５分間加熱する。
続いて、２．５μｇＢＳＡ、１２ＵＲＮＡ Guard、２０
ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、４ＵＡＭＶ逆転写酵素、
０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを添加して２５μlと
し、３時間インキュベートすればよい。この増幅条件に
おいて、標的核酸配列の抽出方法や抽出時の条件等によ
り、プライマーの配列を変更する必要が生じる場合があ
る。その場合には、上記条件中のＤＭＳＯ濃度やｒＮＴ
Ｐ濃度等を最適化すればよい。
は、公知文献（例えば、J. Virol. Methods 第３５巻、
第２７３〜２８６頁）を参考に実施すればよい。すなわ
ち、２５μlの反応系において酵素添加後の最終濃度が
４０ｍＭ Tris(ｐＨ８．５);２０ｍＭＭｇＣｌ2; ４０
ｍＭＫＣｌ;５ｍＭＤＴＴ; １５％ＤＭＳＯ;１ｍＭｄＮ
ＴＰ;４．１ｍＭｒＮＴＰ;０．２μＭ第１プライマー;
０．８μＭ第２プライマー(1)；０．０６７μＭ第２プ
ライマー(2)；０．４μＭ第２プライマー(3)になるよう
設定し、抽出ＲＮＡと混ぜて６５℃で５分間加熱する。
続いて、２．５μｇＢＳＡ、１２ＵＲＮＡ Guard、２０
ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、４ＵＡＭＶ逆転写酵素、
０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを添加して２５μlと
し、３時間インキュベートすればよい。この増幅条件に
おいて、標的核酸配列の抽出方法や抽出時の条件等によ
り、プライマーの配列を変更する必要が生じる場合があ
る。その場合には、上記条件中のＤＭＳＯ濃度やｒＮＴ
Ｐ濃度等を最適化すればよい。
【００２８】本発明で使用される検出用及び／又は捕捉
用プローブは配列表・配列番号５及び／又は６に示す配
列の連続した少なくとも１５塩基、好ましくは少なくと
も１８塩基からなる塩基配列が必要がある。検出用及び
／又は捕捉用プローブはプライマーと同じくＤＮＡでよ
く、化学合成により調製できる。例えば、パーキン・エ
ルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホス
ホアミダイト法により合成できる。脱保護はアンモニア
水で実施する。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや
逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリ
ン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスフ
ァイト法等がある。
用プローブは配列表・配列番号５及び／又は６に示す配
列の連続した少なくとも１５塩基、好ましくは少なくと
も１８塩基からなる塩基配列が必要がある。検出用及び
／又は捕捉用プローブはプライマーと同じくＤＮＡでよ
く、化学合成により調製できる。例えば、パーキン・エ
ルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホス
ホアミダイト法により合成できる。脱保護はアンモニア
水で実施する。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや
逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリ
ン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスフ
ァイト法等がある。
【００２９】また、合成時にビオチン、リンカーアー
ム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧ
ＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴ
Ｐ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入し
ても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物
質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中
のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入
しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から放
射性物質や酵素、蛍光物質など公知のオリゴヌクレオチ
ドの標識物を導入しても良い。
ム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧ
ＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴ
Ｐ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入し
ても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物
質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中
のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入
しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から放
射性物質や酵素、蛍光物質など公知のオリゴヌクレオチ
ドの標識物を導入しても良い。
【００３０】例を挙げると、オリゴヌクレオチドを酵素
標識する場合、特表昭６０−５００７１７号公報に開示
された合成法によりリンカーアームを有するヌクレオチ
ドをデオキシウリジンから化学合成し、オリゴヌクレオ
チド配列の一員として置換または付加し、Nucleic Acid
s Research 第１４巻、第６１１５頁（１９８６年）に
記載される方法に従って、アルカリホスファターゼやパ
ーオキシダーゼを結合させればよい。また標的核酸配列
や増幅産物に変異がある場合、プローブ中に欠失、挿入
あるいは置換といった点突然変異があってもよい。
標識する場合、特表昭６０−５００７１７号公報に開示
された合成法によりリンカーアームを有するヌクレオチ
ドをデオキシウリジンから化学合成し、オリゴヌクレオ
チド配列の一員として置換または付加し、Nucleic Acid
s Research 第１４巻、第６１１５頁（１９８６年）に
記載される方法に従って、アルカリホスファターゼやパ
ーオキシダーゼを結合させればよい。また標的核酸配列
や増幅産物に変異がある場合、プローブ中に欠失、挿入
あるいは置換といった点突然変異があってもよい。
【００３１】本発明の検出用プローブは、前記の方法で
酵素、ビオチン、蛍光物質、放射性物質等により修飾を
受けている必要がある。そして、それぞれの修飾物の特
性を利用して検出操作を実施すればよい。詳細には、増
幅産物をアガロースゲル電気泳動後、サザンブロット法
により核酸を膜に固定し、検出用プローブとハイブリダ
イゼーションを行い修飾物の性質に応じた既知の検出操
作を行えば良い。また、増幅産物を膜上にそのまま固定
し、アルカリ変性後、上記の方法で検出操作を行っても
良い。
酵素、ビオチン、蛍光物質、放射性物質等により修飾を
受けている必要がある。そして、それぞれの修飾物の特
性を利用して検出操作を実施すればよい。詳細には、増
幅産物をアガロースゲル電気泳動後、サザンブロット法
により核酸を膜に固定し、検出用プローブとハイブリダ
イゼーションを行い修飾物の性質に応じた既知の検出操
作を行えば良い。また、増幅産物を膜上にそのまま固定
し、アルカリ変性後、上記の方法で検出操作を行っても
良い。
【００３２】また、別の検出法として、検出用プローブ
と捕捉用プローブを使用したサンドイッチ検出法があ
る。検出用プローブは前述のように酵素、ビオチン、蛍
光物質、放射性物質等により修飾を受けている必要があ
る。そして、捕捉用プローブは、担体に吸着されれば未
修飾のままでも構わないが、担体の性質に合わせてビオ
チン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチ
ドを付加・置換またはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴ
Ｐ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等を付加すればよ
い。
と捕捉用プローブを使用したサンドイッチ検出法があ
る。検出用プローブは前述のように酵素、ビオチン、蛍
光物質、放射性物質等により修飾を受けている必要があ
る。そして、捕捉用プローブは、担体に吸着されれば未
修飾のままでも構わないが、担体の性質に合わせてビオ
チン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチ
ドを付加・置換またはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴ
Ｐ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等を付加すればよ
い。
【００３３】実際の方法としては、液相で検出用プロー
ブと捕捉可能な修飾を施した捕捉用プローブを反応させ
た後、担体に結合した捕捉剤で当該捕捉用修飾オリゴヌ
クレオチドを捕捉する液相サンドイッチ法（特開昭６１
−１９５６９９号公報、特開昭６１−２７４６９９号公
報、特開昭６２−２２９０６８号公報、特開平１−１０
４２００号公報、特表平１−５０１３９９号公報等）；
担体に直接結合した捕捉用オリゴヌクレオチドと検出用
修飾オリゴヌクレオチドを用いる固相サンドイッチ法
（特開昭６０−１８８１００号公報、特開昭６０−１８
８３９７号公報、特開昭６１−２６４２４０号公報、特
開昭６２−８１５６４号公報等）等を用いてもよい。特
に好ましくは、特開平６−３２９６９４号公報記載のポ
リヌクレオチド固定化法を用いて、リンカーアームを含
有した捕捉プローブを固相に固定化し、増幅産物と検出
用プローブをハイブリダイゼーションさせることで検出
を行えばよい。
ブと捕捉可能な修飾を施した捕捉用プローブを反応させ
た後、担体に結合した捕捉剤で当該捕捉用修飾オリゴヌ
クレオチドを捕捉する液相サンドイッチ法（特開昭６１
−１９５６９９号公報、特開昭６１−２７４６９９号公
報、特開昭６２−２２９０６８号公報、特開平１−１０
４２００号公報、特表平１−５０１３９９号公報等）；
担体に直接結合した捕捉用オリゴヌクレオチドと検出用
修飾オリゴヌクレオチドを用いる固相サンドイッチ法
（特開昭６０−１８８１００号公報、特開昭６０−１８
８３９７号公報、特開昭６１−２６４２４０号公報、特
開昭６２−８１５６４号公報等）等を用いてもよい。特
に好ましくは、特開平６−３２９６９４号公報記載のポ
リヌクレオチド固定化法を用いて、リンカーアームを含
有した捕捉プローブを固相に固定化し、増幅産物と検出
用プローブをハイブリダイゼーションさせることで検出
を行えばよい。
【００３４】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるも
のではない。
明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるも
のではない。
【００３５】（検体からＲＮＡの調製）Ｂｏｏｍらの手
法（J. Clin. Microbiol. 第２８巻、第４９５〜５０３
頁）に基づき、ＡＰＬ患者より採取した全血からＲＮＡ
を調製した。なお本培養細胞は、ＰＭＬ遺伝子のエクソ
ン３の下流にＲＡＲα遺伝子のエクソン３遺伝子が結合
したＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを発現している培
養細胞と、ＰＭＬ遺伝子のエクソン４の下流にＲＡＲα
遺伝子のエクソン３遺伝子が結合したＰＭＬ−ＲＡＲＡ
キメラｍＲＮＡを発現している培養細胞を用いた。培養
細胞液を、TritonX-100とグアニジウムチオシアネート
（ＧｕＳＣＮ）を含む溶解用緩衝液中で処理後、シリカ
を添加しｍＲＮＡを吸着させた。ｍＲＮＡ吸着シリカを
ＧｕＳＣＮを含む洗浄用緩衝液で２〜３回洗浄後、アセ
トンでＧｎＳＣＮを除去し乾燥させた。溶出はＲＮａｓ
ｅやＤＮａｓｅを含まない蒸留水で行った。溶出液は、
同蒸留水で段階希釈した。
法（J. Clin. Microbiol. 第２８巻、第４９５〜５０３
頁）に基づき、ＡＰＬ患者より採取した全血からＲＮＡ
を調製した。なお本培養細胞は、ＰＭＬ遺伝子のエクソ
ン３の下流にＲＡＲα遺伝子のエクソン３遺伝子が結合
したＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを発現している培
養細胞と、ＰＭＬ遺伝子のエクソン４の下流にＲＡＲα
遺伝子のエクソン３遺伝子が結合したＰＭＬ−ＲＡＲＡ
キメラｍＲＮＡを発現している培養細胞を用いた。培養
細胞液を、TritonX-100とグアニジウムチオシアネート
（ＧｕＳＣＮ）を含む溶解用緩衝液中で処理後、シリカ
を添加しｍＲＮＡを吸着させた。ｍＲＮＡ吸着シリカを
ＧｕＳＣＮを含む洗浄用緩衝液で２〜３回洗浄後、アセ
トンでＧｎＳＣＮを除去し乾燥させた。溶出はＲＮａｓ
ｅやＤＮａｓｅを含まない蒸留水で行った。溶出液は、
同蒸留水で段階希釈した。
【００３６】（in vitroＲＮＡの調製）ＰＭＬ遺伝子の
エクソン６の下流にＲＡＲα遺伝子のエクソン３遺伝子
が結合したＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラin vitroＲＮＡ得る
ために、fusion ＰＣＲを実施した。
エクソン６の下流にＲＡＲα遺伝子のエクソン３遺伝子
が結合したＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラin vitroＲＮＡ得る
ために、fusion ＰＣＲを実施した。
【００３７】ＰＭＬ遺伝子のエクソン６の３’末端側に
リバースプライマー、また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列を有するフォワードプライマーをリバ
ースプライマーの位置より上流に設定しＰＣＲを実施し
た。別途、ＲＡＲα遺伝子のエクソン３遺伝子の５’末
端側にフォワードプライマー、また、リバースプライマ
ーをフォワードプライマーの位置より下流に設定しＰＣ
Ｒを実施した。なお、ＰＭＬ遺伝子のエクソン６の３’
末端側にリバースプライマーと、ＲＡＲα遺伝子のエク
ソン３遺伝子の５’末端側にフォワードプライマーの、
それぞれ５’末端にfusionＰＣＲ出来るような配列を付
与しておいた。
リバースプライマー、また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列を有するフォワードプライマーをリバ
ースプライマーの位置より上流に設定しＰＣＲを実施し
た。別途、ＲＡＲα遺伝子のエクソン３遺伝子の５’末
端側にフォワードプライマー、また、リバースプライマ
ーをフォワードプライマーの位置より下流に設定しＰＣ
Ｒを実施した。なお、ＰＭＬ遺伝子のエクソン６の３’
末端側にリバースプライマーと、ＲＡＲα遺伝子のエク
ソン３遺伝子の５’末端側にフォワードプライマーの、
それぞれ５’末端にfusionＰＣＲ出来るような配列を付
与しておいた。
【００３８】続いて、両者のＰＣＲ産物を用いてfusion
ＰＣＲを行い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有するＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を鋳型
に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitro ＲＮＡ
を合成し、精製を行った。その吸光度と分子量からコピ
ー数を算出し、検討用のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラin vit
roＲＮＡとした。
ＰＣＲを行い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有するＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を鋳型
に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitro ＲＮＡ
を合成し、精製を行った。その吸光度と分子量からコピ
ー数を算出し、検討用のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラin vit
roＲＮＡとした。
【００３９】（プライマーの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシン
セサイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて
配列表に示される配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列（AAT TCTAATACGACTCACTATAGGG
AGGAGA）を５’末端に結合したＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラ
ｍＲＮＡに相補的な配列を有する第１プライマー（配列
番号１：AATTCT AATACGACTCACTATAGGGAGGAGAGGCGGAAGAA
GCCCTTGCAGCCCTCACA）と、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲ
ＮＡに相同な配列を有する第２プライマー(1)（配列番
号２：GGACCTCAGCTCTTGCATCA）、第２プライマー(2)
（配列番号３：CCTATT GACGTTGACCTGCCA）、第２プライ
マー(3)（配列番号４：AGGAGCCCCGTCATAGGA）を合成し
た。具体的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２
Ｍスケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保
護はアンモニア水で５５℃で一夜実施した。精製はファ
ルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
セサイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて
配列表に示される配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列（AAT TCTAATACGACTCACTATAGGG
AGGAGA）を５’末端に結合したＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラ
ｍＲＮＡに相補的な配列を有する第１プライマー（配列
番号１：AATTCT AATACGACTCACTATAGGGAGGAGAGGCGGAAGAA
GCCCTTGCAGCCCTCACA）と、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲ
ＮＡに相同な配列を有する第２プライマー(1)（配列番
号２：GGACCTCAGCTCTTGCATCA）、第２プライマー(2)
（配列番号３：CCTATT GACGTTGACCTGCCA）、第２プライ
マー(3)（配列番号４：AGGAGCCCCGTCATAGGA）を合成し
た。具体的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２
Ｍスケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保
護はアンモニア水で５５℃で一夜実施した。精製はファ
ルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００４０】（検出用プローブの調製） （１）リンカーアームを有するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラ
ｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表に示される配列、すなわち、
検出用プローブ（配列番号５: TTGAGACCCAGAGCA GCAGTT
C）を合成した。この際、特表昭６０−５００７１７号
公報に掲載された合成法によりデオキシウリジンから化
学合成した、５位にリンカーアームを有するウリジンを
上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウリジンはオ
リゴヌクレオチド内に任意のＴと置換しうるが、本実施
例においては５'末端に結合した。合成されたリンカー
オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で
一夜実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相
カラムにて実施した。
ｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表に示される配列、すなわち、
検出用プローブ（配列番号５: TTGAGACCCAGAGCA GCAGTT
C）を合成した。この際、特表昭６０−５００７１７号
公報に掲載された合成法によりデオキシウリジンから化
学合成した、５位にリンカーアームを有するウリジンを
上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウリジンはオ
リゴヌクレオチド内に任意のＴと置換しうるが、本実施
例においては５'末端に結合した。合成されたリンカー
オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で
一夜実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相
カラムにて実施した。
【００４１】（２）リンカーオリゴヌクレオチドのアル
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドのアルカリホスファタ
ーゼを介して、アルカリホスファターゼをNucleic Acid
s Research 第１４巻、第６１１４頁（１９８６）に記
載の方法に従って結合した。リンカーオリゴヌクレオチ
ド1.5 A260を０．２ＭＮａＨＣＯ3１２．５μlに溶解
し、ここへ１０ｍｇスベリン酸スクシニミジル（ＤＳ
Ｓ）２５μlを加えて、室温で２分間反応させた。反応
液を１ｍＭＣＨ3ＣＯＯＮａ(ｐＨ５．０)で平衡化したS
ephadex G-25カラムでゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去
した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌ
クレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリホスフ
ァターゼ(１００ｍＭＮａＨＣＯ3,３ＭＨＣｌに溶解し
たもの）と室温で１６時間反応させることによりアルカ
リホスファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プ
ローブはファルマシア製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラム
を用いて精製した標識プローブを含む画分を集め、セン
トリコン３０Ｋ（アミコン社製）を用いて限外濾過法に
より濃縮した。
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドのアルカリホスファタ
ーゼを介して、アルカリホスファターゼをNucleic Acid
s Research 第１４巻、第６１１４頁（１９８６）に記
載の方法に従って結合した。リンカーオリゴヌクレオチ
ド1.5 A260を０．２ＭＮａＨＣＯ3１２．５μlに溶解
し、ここへ１０ｍｇスベリン酸スクシニミジル（ＤＳ
Ｓ）２５μlを加えて、室温で２分間反応させた。反応
液を１ｍＭＣＨ3ＣＯＯＮａ(ｐＨ５．０)で平衡化したS
ephadex G-25カラムでゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去
した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌ
クレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリホスフ
ァターゼ(１００ｍＭＮａＨＣＯ3,３ＭＨＣｌに溶解し
たもの）と室温で１６時間反応させることによりアルカ
リホスファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プ
ローブはファルマシア製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラム
を用いて精製した標識プローブを含む画分を集め、セン
トリコン３０Ｋ（アミコン社製）を用いて限外濾過法に
より濃縮した。
【００４２】（捕捉用プローブの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡ
シンセサイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法
にて配列表に示される配列、すなわち捕捉用プローブ
（配列番号６;GAAGAGATAGTGCCC AGCCCTC）を合成した。
この際、特表昭６０−５００７１７号公報に掲載された
合成法により、デオキシウリジンから化学合成した５位
にリンカーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレ
オチドに導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド
内に任意のＴと置換しうるが、この実施例においては
５'末端に結合した。合成されたリンカーオリゴヌクレ
オチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実施し
た。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて
実施した。
シンセサイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法
にて配列表に示される配列、すなわち捕捉用プローブ
（配列番号６;GAAGAGATAGTGCCC AGCCCTC）を合成した。
この際、特表昭６０−５００７１７号公報に掲載された
合成法により、デオキシウリジンから化学合成した５位
にリンカーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレ
オチドに導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド
内に任意のＴと置換しうるが、この実施例においては
５'末端に結合した。合成されたリンカーオリゴヌクレ
オチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実施し
た。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて
実施した。
【００４３】（捕捉プローブの固相担体への結合）固相
担体として、ポリスチレン性のマイクロタイタープレー
ト（マイクロライト２、ダイナテック社）を用いた。捕
捉用プローブを５０ｍＭホウ酸緩衝液で１０pmole／ml
に希釈した。その溶液をマイクロタイタープレートのウ
ェルの１００μlずつ分注し室温で一夜インキュベート
した。得られたプレートから捕捉プローブ溶液をアスピ
レーターで除き、ブロッキングバッファーを各ウエルに
１５０μlずつ分注し、室温で２時間放置しブロックし
た。
担体として、ポリスチレン性のマイクロタイタープレー
ト（マイクロライト２、ダイナテック社）を用いた。捕
捉用プローブを５０ｍＭホウ酸緩衝液で１０pmole／ml
に希釈した。その溶液をマイクロタイタープレートのウ
ェルの１００μlずつ分注し室温で一夜インキュベート
した。得られたプレートから捕捉プローブ溶液をアスピ
レーターで除き、ブロッキングバッファーを各ウエルに
１５０μlずつ分注し、室温で２時間放置しブロックし
た。
【００４４】（増幅反応）増幅反応はJ. Virol. Method
s 第３５巻、第２７３〜２８６頁に基づき実施した。２
５μlの反応系において酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ
Tris(ｐＨ８．５);２０ｍＭ ＭｇＣｌ2; ４０ｍＭＫＣ
ｌ; ５ｍＭＤＴＴ; １５％ＤＭＳＯ; １ｍＭｄＮＴＰ;
４．１ｍＭｒＮＴＰ; ０．２μＭ第１プライマー; ０．
８μＭ第２プライマー(1)；０．０６７μＭ第２プライ
マー(2)；０．４μＭ第２プライマー(3)になるよう設定
し抽出ＲＮＡと混ぜて６５℃で５分間加熱した。２．５
μｇＢＳＡ、１２ＵＲＮＡ Guard、２０ＵＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼ、４ＵＡＭＶ逆転写酵素、０．２ＵＲＮａｓ
ｅＨを添加して２５μlとし、３時間インキュベートし
た。
s 第３５巻、第２７３〜２８６頁に基づき実施した。２
５μlの反応系において酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ
Tris(ｐＨ８．５);２０ｍＭ ＭｇＣｌ2; ４０ｍＭＫＣ
ｌ; ５ｍＭＤＴＴ; １５％ＤＭＳＯ; １ｍＭｄＮＴＰ;
４．１ｍＭｒＮＴＰ; ０．２μＭ第１プライマー; ０．
８μＭ第２プライマー(1)；０．０６７μＭ第２プライ
マー(2)；０．４μＭ第２プライマー(3)になるよう設定
し抽出ＲＮＡと混ぜて６５℃で５分間加熱した。２．５
μｇＢＳＡ、１２ＵＲＮＡ Guard、２０ＵＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼ、４ＵＡＭＶ逆転写酵素、０．２ＵＲＮａｓ
ｅＨを添加して２５μlとし、３時間インキュベートし
た。
【００４５】（サンドイッチハイブリダイゼーション法
による検出）得られた増幅産物を等量の０．６ＮＮａＯ
Ｈを加え室温で１分変性させた。捕捉プローブ結合プレ
ートよりブロックバッファーを除き、変性させた試料１
０μlを添加した。次にハイブリダイゼーション緩衝液
を１００μl加え、５０℃で６０分間ハイブリダイゼー
ションを行った。液をウェルからから除き、洗浄液１
（２ｘＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム）を２００
μｌ加えて、５０℃で５分間洗浄した。続いて洗浄液１
を除き、２００μlの１ｘＳＳＣでウェル内をすすぎ、
アルカリ性ホスファターゼ標識プローブ溶液１００μl
を加え、５０℃で６０分間ハイブリダイゼーションを行
った。
による検出）得られた増幅産物を等量の０．６ＮＮａＯ
Ｈを加え室温で１分変性させた。捕捉プローブ結合プレ
ートよりブロックバッファーを除き、変性させた試料１
０μlを添加した。次にハイブリダイゼーション緩衝液
を１００μl加え、５０℃で６０分間ハイブリダイゼー
ションを行った。液をウェルからから除き、洗浄液１
（２ｘＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム）を２００
μｌ加えて、５０℃で５分間洗浄した。続いて洗浄液１
を除き、２００μlの１ｘＳＳＣでウェル内をすすぎ、
アルカリ性ホスファターゼ標識プローブ溶液１００μl
を加え、５０℃で６０分間ハイブリダイゼーションを行
った。
【００４６】プローブ溶液をウェルから除き、洗浄液１
を２００μl加えて、５０℃で１０分間洗浄し、次に洗
浄液２（１ｘＳＳＣ，０．５％Triton X-100）を２００
μl加え室温で１０分間洗浄した。最後に１ｘＳＳＣを
２００μl加えてウェル内をすすいだ後、アルカリ性フ
ォスファターゼの基質である化学発光物質、Lumiphos48
0（和光純薬工業）を１００μl加え、３７℃、暗所で１
５分間発光反応を行った。発光量はマイクロライト１０
００（ダイナテック社）で測定した。
を２００μl加えて、５０℃で１０分間洗浄し、次に洗
浄液２（１ｘＳＳＣ，０．５％Triton X-100）を２００
μl加え室温で１０分間洗浄した。最後に１ｘＳＳＣを
２００μl加えてウェル内をすすいだ後、アルカリ性フ
ォスファターゼの基質である化学発光物質、Lumiphos48
0（和光純薬工業）を１００μl加え、３７℃、暗所で１
５分間発光反応を行った。発光量はマイクロライト１０
００（ダイナテック社）で測定した。
【００４７】
【表１】
【００４８】（結果）ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
は、ＰＭＬ遺伝子内の切断の多様性とスプライシングの
多様性のために様々なアイソフォームが存在している。
本発明により、表１に示されるように、ＮＡＳＢＡを用
いて様々なアイソフォームが一度に検出出来るようにな
った。ＮＡＳＢＡを用いているのでＲＴ−ＰＣＲのよう
に逆転写反応を必要とせず、また数値として検出できる
ためＦＩＳＨ法等で問題となるような誤認が生じない。
本発明により、簡便、迅速、特異的且つ高感度にＰＭＬ
−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出可能となった。
は、ＰＭＬ遺伝子内の切断の多様性とスプライシングの
多様性のために様々なアイソフォームが存在している。
本発明により、表１に示されるように、ＮＡＳＢＡを用
いて様々なアイソフォームが一度に検出出来るようにな
った。ＮＡＳＢＡを用いているのでＲＴ−ＰＣＲのよう
に逆転写反応を必要とせず、また数値として検出できる
ためＦＩＳＨ法等で問題となるような誤認が生じない。
本発明により、簡便、迅速、特異的且つ高感度にＰＭＬ
−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出可能となった。
【００４９】
【発明の効果】上述したように、本発明のＮＡＳＢＡに
適したプライマーと、該プライマーにより得られる増幅
産物の判定を行うためのプローブを用いれば、従来のｔ
（１５；１７）転座の臨床検査方法の問題点を解決出
来、簡便、迅速、特異的且つ高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡ
キメラｍＲＮＡを検出可能となる。
適したプライマーと、該プライマーにより得られる増幅
産物の判定を行うためのプローブを用いれば、従来のｔ
（１５；１７）転座の臨床検査方法の問題点を解決出
来、簡便、迅速、特異的且つ高感度にＰＭＬ−ＲＡＲＡ
キメラｍＲＮＡを検出可能となる。
【００５０】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GGCGGAAGAA GCCCTTGCAG CCCTCACA 28
【００５１】 配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GGACCTCAGC TCTTGCATCA 20
【００５２】 配列番号：３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： CCTATTGACG TTGACCTGCC A 21
【００５３】 配列番号：４ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： AGGAGCCCCG TCATAGGA 18
【００５４】 配列番号：５ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列：22 TTGAGACCCA GAGCAGCAGT TC 22
【００５５】 配列番号：６ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列： GAAGAGATAG TGCCCAGCCC TC 22
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA12 CA09 CA10 HA13 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ53 QR08 QR13 QR32 QR56 QR62 QR63 QR82 QS03 QS25 QS34 QS35
Claims (15)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１記載の配列のうち少
なくとも連続した１５塩基からなる塩基配列を含むこと
を特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列表・配列番号２記載の配列のうち少
なくとも連続した１５残基からなる塩基配列を含むこと
を特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 配列表・配列番号３記載の配列のうち少
なくとも連続した１５残基からなる塩基配列を含むこと
を特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列表・配列番号４記載の配列のうち少
なくとも連続した１５残基からなる塩基配列を含むこと
を特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 請求項１，２，３及び４に記載のＰＭＬ
−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドか
らなるＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用プライマ
ー群であって、かつ該プライマー群を構成するオリゴヌ
クレオチドのうちの少なくとも１つがその５’末端にＤ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が結合
していることを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲ
ＮＡ検出用プライマー群。 - 【請求項６】 ５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列が結合している請求項１記載のＰ
ＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチ
ド含む請求項５記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
検出用プライマー群。 - 【請求項７】 下記(a)〜(h)の成分を含むことを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための
試薬キット。(a)５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列が結合している請求項１記載の
ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオ
チドからなる第１プライマー、(b) 請求項２、３及び４
記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌ
クレオチドからなる第２プライマー群、(c)リボヌクレ
アーゼＨ活性を有する物質、(d)ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼ活性を有する物質、(e)ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を有する物質、(f)ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を有する物質、(g)リボヌクレオシドトリ
フォスフェート、及び(h)デオキシリボヌクレオシドト
リフォスフェート - 【請求項８】 第２プライマー群を構成するＰＭＬ−Ｒ
ＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドのうち
の少なくとも一つが５’末端にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列が結合している請求項７記載
のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出するための試
薬キット。 - 【請求項９】 下記工程（１）〜（８）を含むことを特
徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡに相補的なア
ンチセンスＲＮＡ（−）を大量に得る方法。（１）ＰＭ
Ｌ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを鋳型として、請求項７記
載の第１プライマーをハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の作用により伸長
させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得、
（２）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解するリボヌクレアーゼＨ活性を有す
る物質の作用により、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長
生成物からＲＮＡを分解して、一本鎖ＤＮＡを得、
（３）該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、請求項７記載の第
２プライマー群のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレ
オチドをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有する物質の作用によりＤＮＡ伸長反応を
行って、５‘末端に上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ、（４）該２本
鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配列を認識でき
るＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の作
用により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡと相補的な
配列を有する一本鎖ＲＮＡ（−）のコピー数を増加さ
せ、（５）上記工程で得られた一本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、請求項７記載の第２プライマー群のうちの少
なくとも１つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさ
せ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の
作用によりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハ
イブリッド伸長生成物を得、（６）ＲＮＡ／ＤＮＡハイ
ブリッド伸長生成物のＲＮＡのみを特異的に分解するリ
ボヌクレアーゼＨ活性を有する物質の作用により、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡを分解し
て一本鎖ＤＮＡを得、（７）該一本鎖ＤＮＡを鋳型とし
て、請求項７記載の第１プライマーをハイブリダイズさ
せ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する物質の
作用により伸長させて、５‘末端に上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成さ
せ、（８）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモータ
ー配列を認識できるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性
を有する物質の作用により、ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍ
ＲＮＡと相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ（−）のコ
ピー数を増加させる - 【請求項１０】 得られた一本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、前記（５）〜（８）を複数回繰り返す請求項９記
載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡに相補的なアンチ
センスＲＮＡ（−）を大量に得る方法。 - 【請求項１１】 配列表・配列番号５及び／又は６記載
の塩基配列または相補的な塩基配列のうち、少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列もしくは該塩基配列
が修飾されたオリゴヌクレオチドからなることを特徴と
するＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用及び／又は
捕捉用プローブ。 - 【請求項１２】 請求項１１記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキ
メラｍＲＮＡ検出用及び／又は捕捉用プローブを含むこ
とを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡを検出
するための試薬キット。 - 【請求項１３】 請求項１２記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキ
メラｍＲＮＡ検出用及び／又は捕捉用プローブを含む請
求項７又は８に記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ
を検出するための試薬キット。 - 【請求項１４】 請求項９記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメ
ラｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）を大量
に得る方法により取得したアンチセンスＲＮＡ（−）の
コピーを、請求項１１記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍ
ＲＮＡ検出用及び／又は捕捉用プローブを用いて検出す
ることを特徴とするＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの
検出方法。 - 【請求項１５】 請求項９記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメ
ラｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ（−）を大量
に得る方法により取得したアンチセンスＲＮＡ（−）の
コピーを、固相担体に吸着または結合した配列表・配列
番号５及び／又は６記載の塩基配列のうち少なくとも連
続した１５残基からなる捕捉プローブ、及び配列表・配
列番号５及び／又は６記載の塩基配列のうち少なくとも
連続した１５残基からなる塩基配列が標識で修飾された
検出用プローブをハイブリダイズさせ、未反応の検出用
プローブを分離し、捕捉用プローブ、アンチセンスＲＮ
Ａ（−）のコピー及び検出用プローブの複合体の標識を
測定する請求項１４記載のＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲ
ＮＡの検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11106867A JP2000300261A (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11106867A JP2000300261A (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300261A true JP2000300261A (ja) | 2000-10-31 |
Family
ID=14444506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11106867A Pending JP2000300261A (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ検出用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000300261A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102925558A (zh) * | 2012-09-29 | 2013-02-13 | 童永清 | 一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒 |
-
1999
- 1999-04-14 JP JP11106867A patent/JP2000300261A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102925558A (zh) * | 2012-09-29 | 2013-02-13 | 童永清 | 一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒 |
| CN102925558B (zh) * | 2012-09-29 | 2014-09-17 | 童永清 | 一种检测PML-RARa融合基因mRNA表达量的试剂盒 |
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