KR100238835B1 - 클라미디아 트라코마티스 검출용 조성물 및 검출 방법 - Google Patents

클라미디아 트라코마티스 검출용 조성물 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 증폭 및 특이적 검출용 올리고뉴클레오티드 및 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 클라미디아 트라코마티스 뉴클레오티드 서열을 증폭시킬 수 있는 증폭 올리고뉴클레오티드 및 클라미디아 트라코마티스 핵산의 특이적 검출용 프로브 및 헬퍼 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 클라미디아 트라코마티스 검출용 특이적 배합물 및 장치의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
클리미디아 트라코마티스 검출용 조성물 및 검출 방법
[기술분야]
본 명세서에서 상세히 설명되고 청구된 발명은 예를 들어, 인후용 약솜, 조직 시료, 체액, 및 배양액으로부터의 시료 중에서 세균 중 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)로부터의 핵산을 증폭시키고 검출하기 위한 핵산 프로브, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 증폭 올리고뉴클레오티드의 구성 및 용도에 관한 것이다.
[배경기술]
클리미디아는 세계에서 가장 흔한 동물 병원균이다. 이 그람 음성 세포는 세포내 편성 유기체 (세포내 기생) 세균에서는 흔하지 않다. 이들은 감염된 숙주 세포 내에서 복제되고, 이들 스스로 대사 반응에 의한 에너지 생성 효소의 결핍으로 이들의 필요에 따라 숙주에서 생성된 ATP를 사용함으로써 이들의 숙조로부터 에너지를 빼앗는다.
클라미디아 트라코마티스는 클라미디아 속에서 3종으로 분류된 것 중 하나이고, 사람 병원균이다. 문헌[American Society for Microbiology, Manual of Clinical Microbiology (5th ed. 1991)]를 참조한다. 클라미디아 트라코마티스 균주는 트라코마 원인성 작용제, 포입체성 결막염 및 생식계 질병을 포함한다. 후자의 정황에서 클라미디아 트라코마티스는 남성에서 요도염 및 여성에서 자궁경관염을 일으키는 성적으로 전반되는 질병의 주 요인이다. 감염된 여성은 출산 과정 중 그녀의 아이에게 감염을 전반시킬 수 있고, 다른 상황에서는 폐렴 또는 안구 질병을 초래할 수 있다. 감염된 개인에서 클라미디아 트라코마티스 감염의 조기 검진은 필요한 치료를 증진시키고, 작용제의 연속 전반을 방지할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 시험 시료, 특히 사람 임상 시료에서 클라미디아 트라코마티스의 신속하고 특이적인 검출을 위한 핵산 혼성화 프로브를 제공하는 것이다.
여기서 사용된 용어 “시험 시료”는 목적하는 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 임의의 시료를 의미하고, 생물학적 시료, 체액 또는 배출물, 예를 들어, 요소, 혈액, 우유, 뇌척수액, 가래, 타액, 대변, 폐 아스피레이트(aspirate), 인후 또는 생식기용 약솜, 상기한 것 중 하나 이상을 함유하는 임상적 시료, 환경 시료, 식품 시료 및 실험 시료를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
핵산 혼성화는 완전 또는 부분 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 두 개의 핵산 가닥이 예비 결정된 반응 조건 하에서 함께 특이적 수소 결합으로 안정한 이중 가닥 하이브리드를 형성하는 과정이다. 핵산 가닥은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있고, 따라서, 혼성화는 RNA:RNA 하이브리드, DNA:DNA 하이브리드 또는 RNA:DNA 하이브리드를 형성할 수 있다.
따라서, 본 출원서에서 사용된 용어 “혼성화”는 완전 또는 부분적 상보성 단일 핵산 가닥 두 개가 함께 상반 평행(antiparallel) 방향으로 결합하여 이중 가닥의 안정한 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 이 이중가닥 구조의 두 개의 구성 가닥(때때로 하이브리드라 불림)은 수소 결합으로 함께 유지된다. 비록 이 수소 결합은 염기 아데닌과 티민 또는 우라실(A와 T 또는 U), 또는 시토신과 구아닌(C와 G)를 함유하는 뉴클레오티드 간에 통상적으로 형성되나, 염기쌍은 이“정규적”쌍의 구성원이 아닌 염기 간에도 형성될 수 있다. 비정규적 염기쌍은 당업계에 공지되어 있다. 문헌[The Biochemistry of the Nucleic Acids, (Adams 등, eds., 1992)]를 참조한다.
핵산 혼성화는 특이적 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산을 검출하고 정량화하는 통상의 방법이다. 이러한 방법은 유기체의 확인 및 분류, 감염 질병 및 유전적 비정상의 진단, 음식 및 약제의 시험, 및 수많은 다른 것들 중에서 가장 의심되는 것을 밝혀내는데 유용하다. 통상적으로, 핵산 혼성화 분석법은 표적 서열에 대해 상보성 핵산 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용한다. 이러한 표지는 당업계에 공지되어 있고, 방사능 동위원소, 효소 또는 형광기, 발광기 또는 화학발광기를 포함할 수 있고, 본 출원인들은 화학발광 아크리디늄 에스테르를 표지로 사용하는 것을 선호한다. 본 출원과 공동 소유권을 갖고 본 출원서에 참고문헌으로 기재된 아놀드(Arnold) 등의 문헌[미국 특허 제5185439호]를 참조한다. 상보성 영역에서 수소 결합에 의한 두 가닥의 어닐닝에 적절한 혼성화 조건 하에서 프로브와 표적 서열을 갖는 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료를 혼합한다. 이어서, 프로브를 시료에 존재하는 표적 핵산과 혼성화한다. 생성된 하이브리드 이중가닥을 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 히드록시아파타이트 흡착으로 검출할 수 있다. 또한, 이러한 기술들 중에 포함된 것으로 본 출원서와 공동 소유권을 갖고 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 미국 특허 제5,283,174호에 개시된 바와 같이, 비혼성화된 프로브 상에 존재하는 표지는 선택적으로 분해시킨 후, 잔류 혼성화된 프로브와 결합된 표지양을 측정한다. 이 후자의 기술은 혼성화 보호 분석법(Hybridization Protection Assay, HPA)로 불리우며, 현재 출원인에 의해 선호되는 방법이다.
종종 시험 시료는 사용된 특정 표지의 감수성 한계로 인해, 핵산 혼성화에 의한 검출 또는 정량화를 가능하게하는 충분히 많은 핵산 분자를 함유하지 못할 것이다. 이러한 경우에, 핵산 혼성화가 사용되어 시험 시료 중 그의 존재 또는 함량을 밝히기 전에, 검출가능한 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 증가시킨다. 이 과정은 핵산 증폭을 의미하고, 표적 핵산의 양적 증가는 표적 핵산 또는 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 것을 말한다.
증폭 방법은 표적 뉴클레오티드 서열을 주형으로 함유하는 하나 이상의 핵산 가닥을 핵산 중합 반응에서 사용하여 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 상보성 제2가닥을 생산하는 것이다. 이 방법을 반복하여, 후속 반복 과정에서 생산물 핵산을 주형으로 사용하여, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 많은 핵산 분자를 신속히 증가시킨다.
많은 증폭 방법이 기재되어 있고, 그 중 중합 연쇄 반응(PCR)의 다양한 실시 태양[물리스(Mullis) ed, 미국 특허 제4683195호 참조] 및 하나 이상의 단계로 시험관내 전사(RNA 합성)을 이용하는 방법[무가까와(Murakawa) 등, DNA 7:287-295; 버그(Burg) 등, PCT 출원 제WO89/1050호; 진저라스(Gingeras) 등, PCT 출원 제WO88/10315호; 카시안 앤드 풀츠(Kacian ＆ Fultz), 유럽 특허 제89313154호; 맥도너프(McDonough) 등, PCT 공개 제WO94/03472호; 카시안 등, PCT 공개 제WO93/22461호; 다타굽타(Dattagupta) 등, 1994년 3월 16일에 출원된 미국 출원 제08/215081호 참조]이 있다. 이 개시 문헌들은 본 출원서에 참고 문헌으로 기재되어 있고, 이들 중 후자 2개는 본 출원서와 공동 소유권을 갖는다.
대부분의 핵산 증폭 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머 및(또는) 프로모터-프라이머를 사용한다. 이 프라이머 또는 프로모터-프라이머는 상대적으로 짧고(바람직하게는 10 내지 100 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 12 내지 50 뉴클레오티드 길이임), 목적하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖도록 사람을 통해 화학적, 생물학적 또는 효소적으로 합성되고, 구성되고(되거나) 선택되는 단일 가닥 핵산 분자이다. 두 개의 핵산 가닥이 혼성화되는 조건 하에서 프라이머 또는 프로모터-프라이머가 표적 핵산과 함께 존재할 때, 프라이머 또는 프로모터-프라이머의 최소 부분이 표적 핵산과 이중 가닥을 형성한다. 그러나, 종종 일정하지 않게, 이러한 하이브리드의 특징은 프라이머 또는 프로모터-프라이머가 핵산 폴리머라제 매개된 프라이머 연장 반응에서 활성화 되면서 뉴클레오티드와 반응할 수 있는 유리 3′ 히드록실기를 갖는 것이다. 그러나, 유리 3′ 히드록실기는 프로모터-프라이머가 프로모터로 작용하는데 필요하지 않을 수 있다.
프라이머 연장 반응은 이중 가닥 프라이머:표적 핵산 하이브리드가 핵산 폴리머라제 및 필요한 뉴클레오티드 트리포스페이트와 접촉하는 경우에 일어난다. 프라이머의 반응성 3′ 히드록실기는 핵산 폴리머라제가 프라이머의 3′ 말단에 뉴클레오티드 잔기 첨가를 특이적으로 시작할 수 있게 하여, 초기(nascent) 핵산 가닥이 프라이머의 극성에 대해 5′에서 3′ 방향으로 증식한다. 증식 프라이머 연장 생성물의 서열은 표적 핵산 주형의 뉴클레오티드 서열에 의해 지배된다. 따라서, 프라이머는 초기 어닐링 또는 혼성화 영역에서 상보성 핵산 가닥의 합성을 개시한다.
“프로모터-프라이머”는 유리 3′ 히드록실기를 갖는 경우, 목적하는 핵산 표적물에 대해 상보성 3′ 영역을 갖는다는 점에서 프라이머로 작용할 수 있다. 또한, 프로모터-프라이머는 그의 5′ 말단에 표적 핵산에 대해 상보성이 아닌 뉴클레오티드 서열 영역을 갖는다. 이 영역이 핵산 폴리머라제의 작용으로 이중 가닥으로 되는 경우 (주형 핵산의 3′ 말단의 연장), 이중 가닥의 비상보성 영역은 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소를 사용하여 RNA 합성 개시 부위로 작용할 수 있다.
표적 뉴클레오티드 서열의 유일성 및 혼성화 분석에서 목적하는 선택도에 의존하기 때문에, 프라이머 또는 프로모터-프라이머 역시, 또한 별법으로 혼성화 분석 프로브로 작용할 수 있다. 별법으로 혼성화 분석 프로브 또는 증폭 올리고뉴클레오티드가 그의 일차 기능을 위해 구성되고 단독으로 사용될 수 있다.
혼성화 분석 프로브는 목적하는 표적 핵산의 존재 검출 및(또는) 정량화하는 데 사용되고, 이러한 프로브는 통상적으로 방사능 또는 발광 원자, 또는 화학발광기와 같은 검출가능한 화학적 기로 표지된다. 출원인은 아크리디늄 에스테르 유도체를 표지 시약으로 사용하는 것을 선호한다. 가끔 목적하는 표적 핵산은 통상적으로 생물학적 공급원으로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 갖는 상이한 핵산 분자들의 임의의 집단을 포함할 것이다. 제한하려는 것이 아니라 단지 예시적으로, 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 속(genus)의 핵산들에 의해 공유될 수 있고 (속 외의 유기체에 의해서는 아님), 이들 중에서의 임의의 검출이 바람직하다. 별법으로, 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 종(species) 또는 그 종의 스트레인에는 유일할 수 있다.
모든 프로브가 반드시 표지되는 것은 아니다. “헬퍼 올리고뉴클레오티드” 또는 ”헬퍼 프로브”라 불리우는 일부 혼성화 프로브는 분리된 표지된 프로브가 그의 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 쉽게 결합할 수 있도록 구성된다. 비록 이론적으로 한정되는 것을 바라지 않더라도, 헬퍼 프로브는 표적 핵산 중 분자내 수소 결합의 양을 국소적으로 감소시킴으로써 표지도니 프로브의 결합을 용이하게 하는 것으로 생각되고, 따라서 표적 뉴클레오티드 서열이 표지된 프로브와 특이적으로 혼성화되는 것을 더욱 유용하게 한다. 표지된 프로브의 결합 부위의 위치 및 표적 핵산의 2차 구조에 의존하기 때문에, 헬퍼 프로브는 표지된 프로브의 결합 부위에 근접한 뉴클레오티드 서열 영역의 지배를 받거나, 또는 결합 부위로부터 멀리 떨어져서도 프로브 결합에 영향을 미치는 영역의 지배를 받을 수 있다. 헬퍼 프로브는, 본 출원과 공동의 소유권을 갖으며 참고 문헌으로 인용된, 호간(Hogan) 등의 미국 특허 제5030557호에 기재되어 있다.
특정 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 핵산 혼성화의 용도의 기재는 코네(Kohne)의 미국 특허 제4851330호 및 호간 등의 국제 특허 출원 제PCT/US87/03009호에 기재되어 있고, 이 문헌들은 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌으로 인용된다. 호간은 핵산 혼성화 방법에 사용되는 시료(예를 들어, 가래, 요소, 혈액 및 조직 영역, 음식, 토양 및 수분) 중 비바이러스성 유기체 또는 비바이러스성 유기체 군의 존재를 측정하기 위한 방법을 기재하였다.
또한, 호간의 상기 문헌은 특이적 유기체 또는 유기체군에 속하는 표적화된 리보좀 RNA(rRNA) 뉴클레오티드 서열만을 특이적으로 검출하는 수 많은 혼성 프로브도 기재하였다.
클라미디아 트라코마티스의 검출용 DNA 혼성화 분석 프로브가 기재되어 있다. 히피아(Hyppia) 등의 문헌[J. Gen. Microbiol. 130:3159-64(1984)]에서는 클라미디아 트라코마티스로부터 6.7kb 플라스미드의 단리 및 혼성화 프로브로서의 용도가 기재되어 있다. 그리패이스(Griffais) 등의 문헌[Res. Microbiol. 140:139-141(1989)], 오스테르가드(Ostergaard) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 28:1254-1260(1990)], 맥가리티(McGarity) 등의 문헌[Gut 32:1011-1015(1991)], 클라스(Class) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 29:42-45(1991)], 롱기아루(Longiaru) 등의 문헌[유럽 특허 제420260호, 출원 번호 제90118620.5호], 롱기아루 등의 문헌[미국 특허 제5,232,829호]에서는 클라미디아 트라코마티스 플라스미드 뉴클레오티드 서열을 중합 연쇄 반응법(PCR)을 사용하여 증폭 올리고뉴클레오티드와 결합시켜 증폭시켰다. 클라미디아 트라코마티스의 주요 외막 단백질(MOMP)를 코딩하는 서열의 증폭은 듀틸(Dutilh) 등의 문헌[Res. Microbiol. 140:7-16(1989)], 홀랜드(Holland) 등의 문헌[J. Infec. Dis. 162:984-987(1990)], 보보(Bobo) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 28:1968-197(1990)], 홀랜드 등의 문헌[Infec. Immun. 60:2040-2047(1992)] 및 팔머(Palmer) 등의 문헌[J. Clin. Pathol. 44:321-325(1991)]에 기재되어 있다. 오세왈드(Ossewaarde) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 30:2122-2128(1992))] 및 루젠달(Roosendaal) 등의 문헌[J. Med. Microbiol. 38:426-433(1993))]에서는 플라스미드 및 MOMP 서열의 증폭에 대해 기재되어 있다.
호간 등의 문헌[PCT 출원 번호 제PCT/US87/03009호](본 출원과 공동 소유권을 가짐) 및 샤흐(Shah) 등의 문헌[PCT 공개 번호 제WO90/15159호]에서는 클라미디아 트라코마티스 16S 및 23S rRNA 서열의 검출용 프로브가 기재되어 있다. 나헤르(Naher) 등의 문헌[Genitourin. Med. 65:319-322(1991)], 클루이트만(Kluytmans) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 29:2685-2689(1991)], 사이육스(Scieux) 등의 문헌[Res. Microbiol. 143:755-765(1992)] 및 홀랜드 등의 문헌(Infect. Immun. 상기 문헌]에서는 클라미디아 트라코마티스 rRNA에 관한 프로브의 용도가 기재되어 있다. 침마(Cheema) 등의 문헌[Amer. J. Med. Sci. 302:261-268(1991)]에는 클라미디아 트라코마티스 리보좀 DNA에 관한 프로브가 기재되어 있다. 폴라르드(Pollard) 등의 문헌[Mol. Cell. Probes 3:383-389(1989)], 루젠달의 상기 문헌 및 클라스 등의 문헌[Eur. J. Clin. Microbiol, Infec. Dis. 9:864-868(1990)]에서는 클라미디아 트라코마티스 종의 16S 리보좀 서브유닛에서 유도된 뉴클레오티드 서열의 증폭이 기재되어 있다.
[발명의 요약]
본 발명의 특징은 클라미디아 트라코마티스의 코딩 rRNA 또는 DNA의 특이적 영역, 또는 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA 뉴클레오티드 서열을 반드시 함유하거나 또는 함유하는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에 대해 상보성이게 구성된 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 개시 및 청구한다.
본 발명의 혼성화 프로브는 표적 핵산의 선택적 검출이 가능한 조건 하에서 특이적 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자의 영역에서 표적 핵산에 혼성화되도록 구성된다.
본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 뉴클레오티드 서열(표적 핵산에 관함)의 3′ 측면에 놓인 표적 핵산의 영역과 혼성화되도록 구성 및(또는) 선택된다. 따라서, 혼성화된 증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 하나 이상의 영역에 대해 상보성 핵산 가닥의 합성을 가능하게 한다. 초기 가닥도 표적 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 개시된 혼성화 분석 프로브와 같이, 표적 핵산에 대한 특이성 정도가 높거나 또는 높지 않을 수 있다. 예를 들어, 증폭 올리고뉴클레오티드는 종(species) 특이적이지 않고, 속(genus) 또는 계(gamily) 특이적일 수 있다. 그러나, 증폭 산물(앰플리콘)이 종 특이적 혼성화 분석 프로브로 검출되는 한, 절대 특이성의 결핍이 클라미디아 트라코마티스의 검출에서 증폭 올리고뉴클레오티드의 유용성을 무효화하지는 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 프로브의 기본적이고 신규한 특징은 적절한 혼성화 반응 조건 하에서 비표적 핵산 또는 핵산 영역에 대해 표적 클라미디아 트라코마티스 핵산의 예비결정된 영역과 혼성화될 수 있다. 이 특이성은 표적 핵산과 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 수소 결합된 혼성화 복합체에 관여하는 혼성화 프로브의 뉴클레오티드 서열 간의 상보성 정도, 및 혼성화 반응 조건의 함수이다. 또한, 본 발명은 혼성화 프로브 또는 증폭 올리고뉴클레오티드와 그들의 특이적 표적 핵산 간에 형성된 이중 가닥 핵산 하이브리드 분자를 개시하고 청구한다. 표지된 프로브와 표적 핵산 분자 간에 형성된 하이브리드는 클라미디아 트라코마티스의 검출 및(또는) 정량화에 유용한데, 그 이유는 혼성화 반응 후, 이 구조가 비혼성화 표지된 프로브와 물리적 또는 화학적으로 구별되고, 따라서 표지가 원래 시료 중 표적 핵산의 존재에 대한 유일한 징후이기 때문이다.
유사하게도, 증폭 올리고뉴클레오티드와 그들의 표적 핵산 서열 영역간에 형성된 본 발명의 하이브리드는 DNA 합성, RNA 전사, 또는 둘다의 1단계 이상에 대한 개시 부위를 제공한다. 이어서, 생성된 증폭 핵산 서열 영역을, 하기에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 혼성화 분석 프로브를 사용하여 검출가능한 하이브리드 분자의 형성을 검출한다. 따라서, 하이브리드 분자의 두가지 형태는 본 발명의 목적을 얻는데 유용하다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 클라미디아 트라코마티스 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시킬 수 있는 증폭 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 클라미디아 트라코마티스 표적 뉴클레오티드 서열은 클라미디아 트라코마티스, 바람직하게는 클라미디아 트라코마티스 핵산 내에 함유된 DNA 또는 RNA에 존재하는 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열은 완벽하게 상보성이다. 바람직하게는, 증폭 올리고뉴클레오티드가 결합되는 핵산 서열 영역은 밀접하게 연관된 세균 종들에는 존재하지 않는다. 그러나, 증폭 올리고뉴클레오티드 및 헬퍼 올리고뉴클레오티드 모두는 종 특이적이로 클라미디아 트라코마티스 핵산의 증폭만을 가능하게 하거나, 또는 클라미디아 트라코마티스의 검출을 위해 그 자체가 특이적인 혼성화 분석 프로브의 결합을 도울 필요는 없다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 시험 시료 중 클라미디아 트라코마티스와 다른 미생물을 구별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 개시하는 것이다. 이 프로브들은 클라미디아 트라코마티스 핵산에 대해 높은 특이성을 가지며, 동일 프로브가 밀접하게 관련된 유기체, 예를 들어, 클라미디아 뉴모니에(Chlamydia pneumoniae) 또는 클라미디아 프시타치(Clamydia psittaci)로부터의 핵산에 대한 혼성화를 선호하지 않는 혼성화 조건 하에서 혼성화될 것이다. 따라서, 표지된 프로브의 용도는 이 유기체를 함유하는 시험 시료 중에서 클라미디아 트라코마티스의 특이적 검출 또는 정량화를 가능하게 한다. 이 프로브들은 혼성화 분석법에 단독으로 사용되거나, 또는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 결합되어 사용될 것이다. 혼성화 분석 프로브는 비증폭된 표적 핵산을 직접 검출하거나, 또는 핵산 증폭을 통해 획득된 클라미디아 트라코마티스 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 자궁 경관용 또는 요도용 약솜, 또는 다른 시료로부터 유도된 시험 시료 중에서 클라미디아 트라코마티스 핵산과 관련된 혼성화 분석 프로브 및 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하여 신속하고, 특이적이고, 재현가능한 클라미디아 트라코마티스의 확인을 가능하게 하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 시험 시료 중 클라미디아 트라코마티스 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자수를 증가시킴으로써 핵산 혼성화 분석법의 감수성을 증가시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 클라미디아 트라코마티스 특이적 혼성화 분석 프로브 대 그의 표적 핵산의 혼성화 비율을 증가시키고, 클라미디아 트라코마티스 핵산과 혼성화될 수 있는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용함으로서 형성되는 하이브리드의 안정성을 증가시키는 조성물을 제공하여, 표지된 프로브의 그의 표적에 대한 결합을 용이하게하는 것이다.
[바람직한 실시 태양 및 최적 방식 정의의 설명]
하기 용어는 다르게 표현되지 않는한, 명세서에서 지정된 의미를 갖는다.
“표적 핵산”은 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 또는 이중 가닥 핵산을 의미한다.
“올리고뉴클레오티드”는 길이가 2 뉴클레오티드를 초과하는, 바람직하게는 10 내지 100 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 12 내지 50 뉴클레오티드인 단일 가닥 뉴클레오티드 폴리머를 의미한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 또는 다른 희소하거나 또는 비천연적 결합으로 연결될 수 있다. 더우기, 올리고뉴클레오티드는 비통상적인 뉴클레오티드 또는 비뉴클레오티드 잔기를 가질 수 있다. 여기서 정의된 올리고뉴클레오티드는 핵산, 바람직하게는 DNA이나, RNA일 수 있거나, 또는 공유 결합된 리보- 및 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 가질 수 있다. 정의된 서열의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드는 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예륵 들어, 화학적 또는 생화학적 합성, 및 세균 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 재조합 핵산 분자로부터의 시험관 내 또는 생체 내 발현에 의해 생산될 수 있다. 이 개시에 의해 의도된 바대로, 올리고뉴클레오티드는 크로모좀 DNA 또는 그의 생체 내 전사 생산물로 구성되지 않는다.
“표적 핵산 서열”, “표적 뉴클레오티드 서열” 또는 “표적 서열”은 단일 가닥 표적 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 특이적이고 바람직한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열을 의미하고, 데옥시보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열은 완벽하게 상보성이다.
“대체적으로 유사한” 뉴클레오티드 서열은 특정 핵산 서열과 비교하여, 동일하거나, 또는 20% 이하의 미스매치(mismatch), 결실 및(또는) 부가(RNA 또는 DNA 등가 뉴클레오티드는 제외)를 갖는 뉴클레오티드 서열이다. 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 대해 상보성인 8 이하의 뉴클레오티드를 부가적으로 지닐 것이고, 대조 뉴클레오티드 서열보다 4 이하의 뉴클레오티드만큼 적게 지닐 것이다. 또한, 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 엄격한(stringent) 혼성화 조건 하에서 특정 핵산 서열에 대해 완벽하게 상보성 뉴클레오티드 서열의 핵산을 지닌 안정한 하이브리드를 형성할 수 있다.
“엄격한” 혼성화 분석 조건은 특이적 혼성화 분석 프로브가 표적 핵산(바람직하게는 클라미디아 트라코마티스의 rRNA 또는 rDNA)와 혼성화될 수 있고, 다른 미생물(예를 들어, 클라미디아 뉴모니에 및 클라미디아 프시타치)로부터 유도되거나 또는 사람으로부터 유도된 시험 시료 중 존재하는 다른 핵산과는 잘 혼성화되지 않는 조건을 의미한다. 이 조건들은 프로브의 GC 함량 및 길이, 혼성화 온도, 혼성화 시약 또는 용액의 조성, 및 추구되는 혼성화 특이성 정도를 포함하는 인자에 의존하여 변화할 수 있다. 특이적이고 엄격한 혼성화 조건의 예는 하기에서 제공된다.
“프로브”는 엄격한 혼성화 조건 하에서 안정하게 혼성화되기 위한, 검출될 핵산 서열에 대해 부분적 또는 완전한 상보성 서열을 지닌 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 군 또는 종 특이적 프로브의 경우에, 프로브는 엄격한 혼성화 조건 하에서 안정하게 표적 핵산과 혼성화되고, 다른 계통발생적 군 또는 종의 유기체로 부터의 것과 같은 비표적 핵산과 같은 혼성화되지 않는 능력을 지닌다. 그러나, 엄격한 혼성화 조건 하에서 이러한 서열이 프로브의 목적하는 특이성을 거의 변화시키지 않는 한, 프로브는 표적 서열에 대해 상보성이 아닌 영역을(그럴 필요는 없지만) 가질 수 있다. 이러한 비상보성 영역이 존재하는 경우, 이들은 5′프로머터 서열 및(또는) RNA 전사에 대한 결합 부위, 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 함유할 수 있거나, 또는 프로브, 표적 핵산 또는 양쪽 모두에 존재하는 촉매적 활성 부위 또는 헤어핀 구조와 같은 목적하는 2차 또는 3차 구조를 부여할 수 있는 서열을 함유할 수 있다. 프로브는 방사능 동위원소, 형광성 또는 화학발광성 잔기와 같은 레포터군의 잔기, 표적 서열로 혼성화를 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있는 효소 또는 다른 리간로 표지될 수 있다. 프로브의 하나의 용도는 혼성화 분석 프로브이고, 프로브는 생체내 또는 시험관 내에서 질병이 있는, 감염된, 또는 병원성 세포 내에서의 유전자 전사, mRNA 스프라이싱, 또는 번역을 봉쇄 또는 억제시키는 치료적 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 작용제로 사용될 수 있다.
이 출원서에서 사용된 문구, 특이적 서열의 군으로부터 “선택된 서열을 필수적으로 함유하는 핵산 서열을 갖는 프로브(또는 올리고뉴클레오티드)”란 기본적이고 신규한 특성으로서, 프로브가 엄격한 혼성화 조건 하에서 군의 핵산 서열 중 하나에 대해 정확히 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 영역에서 핵산과 안정한 하이브리드를 형성하는 것을 의미한다. 이 정의 하에서 정확한 상보성은 상응하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
“핵산 하이브리드” 또는 “하이브리드”는 이중 가닥, 수소 결합 영역, 바람직하게는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 12 내지 50 뉴클레오티드이고, 여기서 각 가닥은 다른 가닥에 대해 상보성이고, 영역은 화학발광 또는 형광 검출, 오토라디오그라피, 또는 겔 전기영동을 포함하나 이에 안정되지 않는 수단에 의해 검출될 수 있는 엄격한 혼성화 조건 하에서 충분히 안정적인 핵산 구조를 의미한다. 이러한 하이브리드는 RNA:RNA, RNA:DNA 또는 DNA:DNA 이중가닥 분자를 포함할 수 있다.
“상보성”이란 두 개의 단일 가닥 핵산의 유사 영역의 뉴클레오티드 서열, 또는 동일한 단일 가닥 핵산의 상이한 영역의 뉴클레오티드 서열을 엄격한 혼성화 조건하에서 단일 가닥이 안정한 이중 가닥 수소 결합된 영역에서 함께 혼성화되는 것을 가능하게하는 뉴클레오티드 염기 조성을 갖는 것을 의미한다. 하나의 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드의 인접 서열이 다른 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드의 동족 서열과 일련의 “규범적인” 수소 결합 염기쌍을 형성할 수 있고, 예를 들어, A는 U 또는 T와 쌍을 이루고, C는 G와 쌍을 이루어, 뉴클레오티드 서열은 “완벽하게” 상보적이다.
“보존적으로 개질된 변형체”란 제1핵산의 제1뉴클레오티드 서열에 대해 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 의미하고, 여기서 제1뉴클레오티드 서열 영역은 완벽하게 제2 “대조”핵산에 함유된 제2뉴클레오티드 서열 영역에 대해 상보성이다. 보존적으로 개질된 변형체는 4 이하의 뉴클레오티드를 더 함유하고, 대조 핵산보다는 4 이하의 뉴클레오티드를 덜 함유한다. 이러한 보존적으로 개질된 변형체는 대조 뉴클레오티드 서열보다 4 이하의 뉴클레오티드를 더 함유하는 5′ 비상보성 뉴클레오티드를 지닐 수 있는 것으로 이해된다. 보존적으로 개질된 변형체는 엄격한 혼성화 조건 하에서 클라미디아 트라코마티스 뉴클레오티드 서열을 지닌 표적 핵산과 안정한 하이브리드를 형성할 것이다.
“증폭 올리고뉴클레오티드”는 표적 뉴클레오티드 서열 영역과 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 핵산 합성 또는 프로모터 주형(예를 들어, 상보성 가닥의 합성용으로 기능적 프로모터 서열을 형성), RNA 합성의 개시, 또는 모두를 위한 프라이머로 작용한다. 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 합성을 개시하도록 구성되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 비상보성이나 RNA 폴리머라제(예를 들어, T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제)에 의해 인지되는 뉴클레오티드 서열 영역을 가질 수 있다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 프라이머 양 확장을 방지 또는 완화하기 위해 봉쇄된 3′말단을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있다. 여기서 정의된 증폭 올리고뉴클레오티드의 길이는 바람직하게는 12 내지 100 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오티드이다.
“핵산 증폭” 또는 “표적 증폭”은 하나 이상의 표적 핵산 서열을 갖는 핵산 분자의 수를 증가시키는 것을 의미한다.
“안티센스” 또는 “음성 센스”는 대조 핵산 서열의 것에 대해 상보성 또는 대체적으로 상보성 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다.
“센스”, “동일 센스” 도는 “양성 센스”는 대조 핵산 서열과 동일하거나 대체적으로 동일한 핵산 서열을 의미한다.
“헬퍼 올리고뉴클레오티드”는 통상적으로 표지된 혼성화 분석 프로브의 것과 다른 좌위(locus)에서 표적 핵산과 혼성화되도록 구성된 통상적으로 비표지도니 핵산 프로브를 의미하고, 표지된 프로브의 혼성화 속도, 또는 표적:표지된 프로브 하이브리드의 융해 온도(Tm)를 증가시키거나, 또는 모두를 증가시킨다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 핵산의 특이적 검출에 사용될 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 분석 프로브에 관한 것이다. 여기서 개시되고 청구된 모든 올리고뉴클레오티드는 이들이 클라미디아 트라코마티스 핵산의 것에 대해 상보성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 영역을 함유한다는 공통 사실을 공유한다.
[혼성화 조건 및 프로브/프라이머의 구성]
혼성화 반응 조건, 가장 중요하게는 혼성화 온도 및 혼성화 용액 중 염 농도는 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 혼성화 프로브가 바람직하게는 시료중 존재하는 것으로 추정되는 다른 비표적 핵산에 비해 표적 클라미디아 트라코마티스 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산과 혼성화되도록 선택될 수 있다. 감소된 염농도 및(또는) 증가된 온도(증가된 엄격함이라 불림)에서, 핵산 혼성화 정도는 이중 가닥 하이브리드 분자 중 뉴클레오티드 염기쌍 간의 수소 결합이 감소됨에 따라 붕괴되고, 이 과정은 “융해(melting)”라 불리운다.
일반적으로, 가장 안전한 하이브리는 가장 많은 수의 인접한 완벽하게 매치된 (즉, 수소결합된) 뉴클레오티드 염기쌍을 갖는 것이다. 따라서, 이러한 하이브리드는 통상저으로 혼성화 조건의 엄격성이 증가됨에 따라 융해되지 않을 것으로 기대된다. 그러나, 하나 이상의 미스매치, “비규범적” 또는 불완전한 염기쌍(핵산의 뉴클레오티드 서열 중 그 위치에서 약하거나 또는 존재하지 않는 염기쌍을 초래)를 함유하는 이중 가닥 핵산 영역은 시료 중에 존재하는 다른 비표적화된 핵산과 교차 반응하지 않고 핵산 하이브리드가 혼성화 분석에서 검출되는 상대적으로 매우 엄격한 조건 하에서는 여전히 충분히 안정할 것이다.
따라서, 표적 유기체의 핵산과 비표면적체이나 한편으로는 밀접하게 연관된 유기체의 핵산 간의 서열 변화 정도, 및 특정 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 혼성화 프로브의 뉴클레오티드 서열과 다른 표적 핵산의 것 간의 상보성 정도에 의존하기 때문에, 프로브와 표적 간의 하나 이상의 미스매치는 올리고뉴클레오티드의 비표적 핵산에 대한 표적체와의 혼성화 능력을 반드시 파괴시키지는 않을 것이다.
본 발명의 혼성화 분석 프로브들은 프로브:표적 하이브리드의 융해 온도(Tm, 단일 가닥이고 변성된 상태인 반응 혼합물 중 잠재적 이중 가닥 분자의 반에서의 온도로 정의됨)와 시험 시료 중 존재하는 것으로 기대되나, 검출되지 않기를 바라는 계통발생적으로 가장 밀접하게 연과된 유기체의 프로브 및 rRNA 또는 rDNA 간에 형성된 미스매치 하이브리드의 Tm 간의 상이성을 최소화하도록 선정되고, 선택되고(되거나) 구성되어 결정된다. 비표지된 증폭 올리고뉴클레오티드 및 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 유용한 표지된 혼성화 분석 프로브로서 특이성 정도가 매우 높을 필요는 없으나, 일반적으로 바람직하게는 다른 핵산에 비해 하나 이상의 유기체의 표적 핵산과 혼성화되는 유사한 방법으로 구성된다.
클라미디아 트라코마티스, 및 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에와 같은 밀접하게 관련된 유기체의 rRNA의 뉴클레오티드 서열을 공개된 공급원으로부터 얻거나, 독립적으로 당업계에 공지된 핵산 서열화 방법을 사용하여 본 출원인에 의해 결정하였다. 레인(Lane) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6955(1985)]을 참조한다.
이 다양한 유기체의 rRNA 서열을 정렬시킴으로써, 본 출원인은 상대적 이종 변화성의 특이적 분리 영역을 발견하였다. 표적 유기체, 클라미디아 트라코마티스와 “비표적” 유기체, 예를 들어, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에간의 뉴클레오티드 서열 변화성을 가장 크게 보인 이 영역을 종 특이적 혼성화 분석 프로브의 구성을 위한 표적 영역으로 선택하였다.
단순히, 추정되는 독특한 잠재적 표적 뉴클레오티드 서열의 확인은 기능적으로 종 특이적 혼성화 분석 프로브가 이 서열을 함유하는 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA와 혼성화될 수 있다는 것을 보증하지는 않는다. 다양한 다른 인자는 종 특이적 프로브에 대한 표적 부위로서 핵산 좌위의 적합성을 결정할 것이다. 예를 들어, 잠재적 표적 뉴클레오티드 서열의 GC 함량의 증가(따라서, 이중 가닥 프로브:표적 하이브리드의 것도 증가)는 일반적으로 안정성을 증가시켜서 하이브리드 Tm을 증가시킨다. 하나 이상의 “비표적” 유기체와 동일한 이 서열 영역 내의 인접 뉴클레오티드의 수도 안정성에 영향을 미쳐, 클라미디아 트라코마티스 rRNA에 대해 완벽히 상보성 프로브와 비표적 유기체 또는 유기체의 rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 간의 부분적으로 미스매치된 하이브리드의 Tm′을 증가시킨다. 따라서, 두 하이브리드의 융해 온도의 차이가 충분히 크지 않은 경우, 통상적으로 2-5℃ 이상에서, 프로브는 독특한 영역에 표적화됨에도 불구하고 종 특이적일 수 없다.
혼성화의 바람직한 온도 및 혼성화 용액 조성물(예를 들어, 염 농도)는 이중 가닥 하이브리드의 안정성에 대한 중요 영향력을 갖는 두가지 조건이다. 이 조건들은 군 또는 종 특이적 프로브를 제작하는데 있어서 고려되어야만 한다. 하이브리드 핵산의 열 안정성은 반응 혼합물의 이온 강도와 함께 증가된다. 다른 한편으로는, 수소 결합을 파괴하는 화학 시약, 예를 들어, 포름아미드, 우레아, 디메틸술폭시드 및 알코올은 하이브리드의 열 안정성을 크게 감소시킬 수 있다.
표적에 대한 프로브의 특이성을 최대화하기 위하여, 본 발명의 대상 프로브는 매우 엄격한 조건 하에서 그의 표적물과 혼성화되도록 구성하였다. 이러한 조건하에서 높은 상보성을 갖는 단일 핵산 가닥만이 서로 혼성화되고, 이러한 높은 상보성이 없는 단일 핵산 가닥은 하이브리드를 형성하지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격성(즉, 온도 및 이온 강도)는 하이브리드를 형성하기 위한 두 핵산간에 존재해야하는 상보성의 양을 결정할 수 있다. 본 발명과 함께, 엄격성은 프로브와 표적 핵산간에 형성된 하이브리드 및 프로브와 임의의 존재하는 단일 가닥 비표적 핵산 간에 형성된 잠재적 하이브리드 간의 안정성의 차이를 최소화하기 위하여 선택된다.
적절한 프로브 특이성은 비표적 유기체의 서열에 대해 완벽하게 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브의 길이를 최소화하고, 비표적 서열에 대한 G 및 C 리치(rich) 영역의 유사성을 피하고, 비표적 서열에 대해 가능한 많은 불안정화 미스매치를 함유하는 프로브를 제작함으로써 구성될 수 있다.
표적 핵산 서열의 길이, 즉 프로브 서열의 총 길이도 특이성에 중요할 수 있다. 어떤 경우에는 종 특이적 프로브 표적으로 사용될 수 있는 좌위 및 길이가 상이한 특정 “변화” 영역 중 여러 뉴클레오티드 서열이 존재할 수 있다. 어떤 경우에는 서열 영역이 프로브에 접근할 수 없거나, 또는 다른 이유로 인해, 종 특이적 프로브는 특정 rRNA 변화 영역으로 구성될 수 없다. 완전히 상보성이 아닌 핵산들이 혼성화될 가능성이 있는 반면, 가장 긴 완벽한 상동 염기 서열은 일반적으로 하이브리드 안정성을 결정할 것이다. 상이한 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 염기조성물이 사용될 수 있다.
혼성화를 억제하는 강력한 분자내 구조를 형성하는 표적 영역은 바람직하지 못한 표적 영역이다. 이와 같이, 강력한 자기 상보성을 초래하는 프로브 구성은 삼가야 한다. 상기한 바와 같이, 혼성화는 수소 결합된 이중 가닥 하이브리드를 형성하기 위한 상보성 핵산의 두 개의 단일 가닥의 결합이다. 따라서, 두 개의 가닥 중 하나 또는 둘의 전부 또는 일부가 분자내 또는 분자간 결합에 관여하는 경우, 신규 분자간 프로브:표적 하이브리드의 형성에 덜 관여하게 될 것이다. 예를 들어, 리보좀 RNA 분자는 수소 결합에 의해 매우 안정한 분자내 나선 구조(helices) 및 2차 구조를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 프로브와 혼성화될 때까지 표적 서열의 상당 부분이 단일 가닥 상태로 남아있도록 혼성화 분석법을 구성함으로써, 프로브와 표적물 간의 혼성화 속도 및 정도는 크게 증가할 것이다. 하나의 방법으로 이는 표적 뉴클레오티드 서열로 상대적으로 분자내 수소 결합에 관여하지 않는 서열을 선택함으로써 수행될 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 혼성화 분석 프로브는 표적 부위를 혼성화 분석 프로브와 혼성화되기 쉽게할 수 있는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 프로브와 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 헬퍼 프로브는 일반적으로 기재되어 있다.
표적 핵산에 대해 완벽하게 매치된 올리고뉴클레오티드에 대한 융해 온도의 추정을 제공하는 많은 식이 있다. 이러한 식 중 하나로, Tm = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(분획 G+C)-(600/N)(여기서, N=뉴클레오티드수 중 올리고뉴클레오티드 길이)는 길이가 약 14 내지 70 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드의 Tm에 대해 양호한 추정을 제공한다. 이러한 계산으로부터, 후속되는 Tm의 실험적 입증 또는 “미세 조정”을 스크리닝 방법을 사용하여 할 수 있다(혼성화 및 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 추가의 정보를 위해 본 출원서에 참고 문헌으로 인용된(11장) 문헌[삼브룩크(Sambrook) 등, Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)]을 참조). 이 참고 문헌도 하이브리드의 Tm상의 미스매치의 효과에 대한 추정을 제공한다.
[핵산 증폭]
바람직하게는, 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시뉴클레오티드이고, 핵산 폴리머라제에 의한 특이적 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 주형으로 사용되기에 충분히 길다. 프로브의 구성에서와 같이, 최적 프라이머 길이는 여러 인자, 즉 반응 온도, 프라이머의 구조 및 염기 조성, 및 프라이머의 사용 방법 등을 고려해야 한다. 예를 들어, 최적 특이성을 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산 서열의 복합성에 의존하며, 일반적으로 약 12개 이상의 뉴클레오티드를 함유해야 한다. 이러한 특이성이 필수적이지 않은 경우, 좀 더 짧은 프라이머를 사용할 수 있고, 이러한 경우에는 주형 핵산과의 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 좀 더 낮은 온도에서 반응을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드와 함께 사용된 핵산 폴리머라제는 리보 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 모두를 주형 의존적 방법으로 공유 결합된 핵산폴리머 또는 가닥에 혼입시키는 화학적, 물리적 또는 생물학적 작용제를 의미한다. 핵산 폴리머라제의 예로는 DNA 지배적 DNA 폴리머라제, RNA 지배적 DNA 폴리머라제 및(또는) RNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소이다. DNA 폴리머라제는, 주형 의존적 방법으로 5′에서 3′방향으로 핵산 합성을 일으킨다. 이중 가닥 핵산 중 두가닥이 상반 평행 방향이기 때문에, 이 방향은 주형의 3′영역에서 주형의 5′영역으로 향한다. DNA 지배적 DNA 폴리머라제는, 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I, 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus auaticus(Taq))로부터의 열 안정성 DNA 폴리머라제 및 바실러스 스테로써모필러스(Bacillus Stearothermophilus (Bst))로부터이 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. RNA 지배적 DNA 폴리머라제의 예로는 다양한 레트로바이러스 역전사 효소, 예를 들어, MMLV 역전사효소 또는 AMV 역 전사효소를 포함한다.
대부분의 핵산 증폭 반응 동안, 핵산 폴리머라제는 뉴클레오티드 잔기를 표적 핵산을 주형으로 사용하여 프라이머의 3′ 말단에 첨가하여서, 표적 핵산 영역에 부분적 또는 완전 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2핵산 가닥을 합성한다. 많은 핵산 증폭 반응에서, 생성된 이중가닥 구조를 갖는 두가닥은 증폭 반응을 진행하기 위하여 화학적 또는 물리적 수단에 의해 분리될 수 있다. 별법으로, 새로이 합성된 주형 가닥은 새로이 합성된 가닥을 소화시키지 않고 본래의 표적 가닥의 부분 또는 전부를 소화시키는 핵산 분해 효소를 사용하여, 제2프라이머 또는 프로모터-프라이머와 혼성화될 수 있다. 이러한 방법으로, 과정을 수회 반복하여, 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 수를 증가시킬 수 있다.
제1또는 제2증폭 올리고뉴클레오티드, 또는 모두가 프로모터-프라이머일 수 있다. 이러한 프로모터-프라이머는 통상적으로 표적 핵산 분자, 또는 프라이머 연장 상물의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보성이 아닌 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이 비상보성 서열은 증폭 올리고뉴클레오티드 상의 상보성 서열의 5′에 위치할 수 있고, 핵산 폴리머라제의 작용에 의해 이중가닥으로 만들어 질 때, RNA 합성의 개시 좌위를 제공할 수 있다. 따라서, 제공된 프로모터는 표적 핵산 서열의 다중 RNA 카피(copy)의 시험관 내 전사를 가능하게 할 수 있다. 본 출원서에서 대조구가 프라이머로 만들어질 때, 이러한 대조구는, 대조구의 정황이 명확하게 다른 것을 의미하지 않는 한, 프로모터-프라이머의 프라이머 측면을 포함하는 것으로 이해된다.
특정 증폭 시스템, 예를 들어, 다타굽타 등의 상기 문헌의 증폭 방법에서는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 가닥 치환을 지원하는 5′비상보성 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 더우기, 5′ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제와 함께 사용되는 경우, 증폭 올리고뉴클레오티드는 그의 5′ 말단에서 변형되어 효소 소화를 방지할 수 있다. 별법으로, 핵산 폴리머라제는, 예를 들어 5′ 뉴클레아제 도메인 없이 활성 폴리머라제 단편을 방출하는 프로테아제로 처리하여, 5′ 엑소뉴클레아제 활성이 제거되도록 변형될 수 있다. 이러한 경우에, 올리고뉴클레오티드는 그의 5′ 말단에서 변형될 필요가 없다
[올리고뉴클레오티드의 제조]
올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서브 유닛들이 함께 공유 결합되어 만들어진다. 뉴클레오티드 서브유닛들의 당(糖)기들은 리보스, 데옥시리보스 또는 그의 개질된 유도체, 예를 들어 O-메틸 리보스일 수 있다. 뉴클레오티드 서브유닛들은 포스포디에스테르 결합, 개질된 결합과 같은 결합, 또는 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 방해하지 않는 비뉴클레오티드 잔기에 의해 결합될 수 있다. 비개질된 결합은 표준 포스포디에스테르 결합이 상이한 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합, 또는 메틸포스포네이트 결합으로 치환되는 것을 포함한다. 상기한 바와 같이, 혼성화 분석 프로브로 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 아크리디늄 에스테르 또는 방사능 동위원소와 같은 레포터기를 함유하여 그의 표적 서열에 대한 프로브의 혼성화의 확인을 돕는다.
본 발명의 모든 증폭 올리고뉴클레오티드는 당 업계에 공지된 방법으로 쉽게 제조될 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 고상 방법을 사용하여 합성된다. 예를 들어, 카루테르스(Carruthers) 등의 문헌[Methods in Enzymology, Volume 143, 287(1987)]에서는 표준 포스포라미디트 고상 화학법을 사용하여 포스포디에스테르 결합에 의한 뉴클레오티드의 결합을 기재하고 있다. 이와 같이, 브하트(Bhatt) 등의 문헌[미국 특허 제5,252,723호](본 발명과 공동 소유권을 가짐)에서는 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 기재하고 잇다. 또한 클렘(Klem) 등의 문헌[PCT 출원 제WO92/07864호]에서는 메틸포스포네이트 결합을 함유하는 상이한 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드 합성에 대해 기재하고 있다. 후자의 세가지 문헌은 본 출원서에 참고 문헌으로 인용되고 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 유기 합성 방법은 당 업계의 기술자에게 공지되어 있고, 본 출원서에 참고문헌으로 인용된 삼부르크 등의 상기 문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 모든 올리고뉴클레오티드에서, 혼성화 분석 프로브, 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 화학적 기로 개질되어 그들의 수행능을 증진시키거나, 또는 증폭산물의 특성화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리머라제의 핵산 분해 활성에 내성인 올리고뉴클레오티드를 가능하게하는 골격 개질된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트기를 갖는 것은 증폭 반응 또는 다른 반응에서 이러한 효소의 사용을 가능하게 한다. 변형의 다른 예로는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 말단 간에 혼입되는 비뉴클레오티드 링커)예를 들어, 아놀드 등, 유럽 특허 출원 제88308766-0호로 본 출원서에 참고 문헌으로 인용됨)를 사용하여프라이머의 혼성화 또는 일롱게이션을 막지 않는 것이다. 증폭 올리고뉴클레오티드도 바람직하게 개질된 천연 뉴클레오티드의 혼합물을 함유할 수 있고, 리보- 및 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명과 공동 소유권을 가지며 본 출원서에 참고문헌으로 인용된 맥도너프(McDonugh)등의 미국 특허 출원 제07/925405에서 기재된 방법과 같이, 증폭 올리고뉴클레오티드의 3′ 말단을 봉쇄하여 DNA 합성 개시를 감소시키거나 예방할 수 있다. 상이하게 3′ 봉쇄된 프로모터-프라이머의 혼합물, 또는 3′ 봉쇄되고 비봉쇄된 프로모터-프라이머의 혼합물은,상기 문헌에 기재된 바와 같이, 핵산 증폭 효율을 증가시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 5′ 말단은 개질되어 특정 핵산 폴리머라제 중 존재하는 5′-엑소뉴클레아제 활성에 대해 내성을 가질 수 있다. 이러한 변형물은, 본 출원서에 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 상기 문헌[“뉴클레오티드 프로브에 대한 비뉴클레오티드 결합 시약”]에 기재된 기술을 사용하여, 비뉴클레오티드기를 프라이머의 5′ 말단 뉴클레오티드에 가하여 수행할 수 있다.
[클라미디아 트라코마티스 rRNA 및 rDNA의 증폭]
본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 특히 클라미디아 트라코마티스 23S 또는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열 또는 그의 rDNA 반대 부분에 의해 조절되어, 하나 이상의 클라미디아 트라코마티스 특이적 표적 뉴클레오티드 서열 영역의 증폭을 유발한다. 여기서, 증폭 올리고뉴클레오티드는 두 세트의 증폭 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 증폭 올리고뉴클레오티드의 제1세트의 구성원들은 하기 뉴클레오티드 서열(또는 티민 대신 우라실이 치환된 이 서열의 RNA 버전)중 하나를 갖는 rRNA 또는 rDNA 영역과 혼성화될 것이다.
[23S rRNA 특이적]
Figure kpo00001
[16S rRNA 특이적]
Figure kpo00002
이 증폭 올리고뉴클레오티드의 바람직한 실시 태양은 하기 서열 또는 티민 대신 우라실로 치환된 이 서열의 RNA 버전을 갖거나, 또는 필수적으로 함유한다. 또한, 이 올리고뉴클레오티드도 RNA 폴리머라제에 결합하고, 주형으로 표적 핵산을 사용하여 RNA 전사를 조절할 수 있는 프로모터 서열을 함유하는 부가적, 비상보성 염기를 그의 5′ 말단에 지닐 수 있다.
[23S rRNA 특이적]
Figure kpo00003
[16S rRNA 특이적]
Figure kpo00004
바람직하게는 서열 번호 12의 핵산 영역에 표적화된 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 13 및(또는) 14의 영역에 표적화된 것과 혼합하여 사용되고, 서열 번호 15의 핵산 영역에 표적화된 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 16의 핵산 영역에 표적화된 것과 혼합하여 사용되고, 서열 번호 45의 핵산 서열에 표적화된 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 51의 핵산 영역에 표적화된 것과 혼합하여 사용된다. 따라서, 바람직한 실시 태양에서, 서열 번호 4의 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 5 및(또는) 6의 것과 함께 사용되고, 서열 번호 7의 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 8의 것과 함께 사용되고, 서열 번호 44의 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 50의 것과 함께 사용된다.
제2세트를 함유하는 증폭 올리고뉴클레오티드는 특히 클라미디아 트라코마티스 23S rRNA 뉴클레오티드 서열, 또는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열 영역에 인접한 그의 rDNA 반대 부분에 의해 조절을 받는다. 이 증폭 올리고뉴클레오티드는 제1세트의 증폭 올리고뉴클레오티드에서와 동일한 방법, 예를 들어, 프라이머쌍의 구성원, 프라이머쌍의 군의 구성원, 또는 RNA 폴리머라제 개시 부위로서 사용할 수 있다. 그러나, 이들은 하기에 상세히 기재된 바 대로, 등온 가닥 핵산 증폭 시스템에서 이들의 바람직한 용도에 있어서, 제1세트의 구성원과 상이하다.
이 올리고뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드 서열, 또는 티민 대신 우라실이 치환된 이 서열의 RNA 버전 중 하나를 갖는 핵산과 혼성화될 것이다.
Figure kpo00005
증폭 올리고뉴클레오티드의 제2세트로 이루어진 올리고뉴클레오티드의 바람직한 실시태양은 하기 뉴클레오티드 서열 및 티민 대신 우라실이 치환된 이 서열의 RNA 버전을 갖는다. 가장 바람직한 실시 태양에서, 이 올리고뉴클레오티드는 그들의 5′-말단에 부가적 비상보성 뉴클레오티드를 지녀서 프라이머 연장 산물의 치환을 더욱 증진시킨다.
Figure kpo00006
본 발명의 모든 증폭 올리고뉴클레오티드는 상기 서열에 대해 변형, 결실, 또는 부가물을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 그러나, 증폭 올리고뉴클레오티드 역시, 또는 별법으로 봉쇄되고(되거나) 변형된 3′ 및(또는) 5′말단 또는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사의 개시 또는 일롱게이션을 유발 또는 증진시키는 서열 영역의 부가, 또는 분자내 염기쌍을 제공하고 2차 또는 3차 핵산 구조의 형태를 증진시킬 수 있는 서열 영역의 부가와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 특이적 뉴클레오티드 서열의 부가(예를 들어, T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 부가로 변형될 수 있다.
증폭 올리고뉴클레오티드는, 모두 본 출원서의 참고 문헌으로 인용되고 앞에 둘은 본 발명과 공동 소유권을 갖는, 카시안 및 풀츠의 상기 문헌, 다타굽타 등의 상기 문헌, 및 스닌스키 등의 미국 특허 제5079351호에서 기재된 방법과 같이, 핵산 증폭 방법, 예를 들어, RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 및 RNAse H 활성을 사용하는 중합 연쇄 반응 또는 증폭 반응에 사용된다.
증폭된 표적 서열을 검출하는데 유용한 광범위하고 다양한 방법이 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 기질 또는 프라이머는 새로이 합성된 DNA로 혼입되는 검출가능한 표지를 함유할 수 있다. 이어서, 생성된 표지된 증폭 산물은 사용되지 않는 표지된 뉴클레오티드 또는 프라이머로부터 분리될 수 있고, 표지는 분리된 산물 분획물에서 검출된다.
유용한 검출가능한 표지로 작용할 수 있는 물질은 당업계에 공지되어 있고, 방사능 동위원소, 형광물질, 화학발광 물질, 색소체, 및 직접 검출할 수는 없지만 그들의 표지된 형태의 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 아비딘 및 항체와 각각 반응하여 쉽게 검출할 수 있는 비오틴 및 햅텐과 같은 리간드를 포함한다.
다른 접근 방법은 검출가능한 핵산 프로브와 혼성화시키고, 생성된 표지된 하이브리드를 통상의 방법으로 측정하여 증폭 산물을 검출한다. 바람직한 용도에 있어서, 산물은 화학발광 아크리디늄 에스테르 표지된 핵산 프로브를 표적 서열에 혼성화시키고, 비혼성화된 프로브 상에 존재하는 아크리디늄 에스테르를 선택적으로 가수분해시키고, 발광측정기(luminometer) 중 잔류 아크리디늄 에스테르로부터 생성된 화학발광을 측정함으로써 분석할 수 있다. 아놀드 등의 상기 문헌 PCT 출원 제US88/02746호, 아놀드 및 넬슨(Nelson) 등의 미국 특허 제5283174호 및 넬슨 등의 “비동위원소 DNA 프로브 기술”(Academic Press, 샌 디에고 소재(KRICA, ed. 1992))을 참조하고, 이 문헌들은 본 출언서에 참고 문헌으로 인용되어 있고, 전자의 두 문헌은 본 발명과 공동 소유권을 갖는다.
[클라미디아 트라코마티스 rRNA 및 rDNA 에 대한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브]
본 출원서에 개시되고 청구된 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브는 계통발생적으로 밀접하게 연간된 세균 종, 바람직하게는 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 대해 바람직하게는 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA 뉴클레오티드 서열을 함유하는 표적 핵산과 혼성화될 수 있다. 이 혼성화 분석 프로브들은 클라미디아 트라코마티스와 상기 계통발생적으로 밀접하게 연관된 종의 리보좀 RNA의 상응하는 영역의 뉴클레오티드 서열의 비교를 기준으로 구성하고, 선택하고(하거나) 선정하였다.
본 발명의 혼성화 분석 프로브는 하기 표적 rDNA 뉴클레오티드 서열 또는 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전(뉴클레오티드 서열들은 완벽하게 상보성임)에 대해 상보적이다.
Figure kpo00007
이 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브의 바람직한 실시 태양은 하기 뉴클레오티드 서열 및 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전을 갖는다.
Figure kpo00008
본 발명의 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브는 바람직하게는 방사능 동위원소, 형광성 또는 화학발광성 잔기와 같은 검출가능한 표지, 프로브가 표적 서열과 혼성화되는 것을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있는 효소 또는 다른 리간드로 표지된다. 출원인은 화학발광성 아크리디늄 에스테르를 표지로 사용하는 것을 선호한다. 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 미국 특허 제5185439호를 참조한다. 분석 프로브는 상보성 영역에서 수소 결합에 의해 두 가닥의 어닐링을 가능하게 하는 적절한 혼성화 조건 하에서 표적 서열의 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 혼합한다. 프로브도 하나 이상의 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 결합하여 표적 클라미디아 트라코마티스 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 대한 결합을 용이하게 할 수 있다. 이어서, 프로브를 시료에 존재하는 표적 핵산에 혼성화시키고, 생성된 하이브리드 이중가닥을 당 업계에 공지된 다양한 기술, 예를 들어, 히드록시아파타이트 흡착 및 방사능 모니터링으로 분리 및 검출할 수 잇다. 또한, 이 기술 중에 속한 것으로 비표지된 프로브 상에 존재하는 표지를 선택적으로 분해시킨 후, 잔류 혼성화된 프로브와 결합된 표지량을 측정하는 방법이 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 미국 특허 제5283174호에 개시되어 있다. 이 후자의 기술은 현재 본 출원인에 의해 선호된다.
[클라미디아 트라코마티스의 검출용 헬퍼 올리고뉴클레오티드]
특이적 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하여 혼성화 분석 프로브와 표적 핵산의 혼성화를 용이하게 하였다. 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌을 인용된 호간 및 밀리만(Milliman)의 미국 특허 5030557호에 기재되어 있다. 클라미디아 트라코마티스의 특이적 검출을 용이하게 하기 이한 특이적 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 하기의 클라미디아 트라코마티스의 뉴클레오티드 서열 및 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전에 대해 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
Figure kpo00009
이 헬퍼 올리고뉴클레오티드의 바람직한 실시 태양은 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
Figure kpo00010
일반적으로 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 사용될 수 있으나, 그의 선택성에 있어서 반드시 종 특이성인 것은 아니다. 즉, 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 위한 표적 뉴클레오티드 서열은 클라미디아 트라코마티스 종에 반드시 유일한 것은 아니다.
바람직하게는 혼성화 분석 프로브는 증폭 올리고뉴클레오티드와 혼합하여 사용되고, 클라미디아 트라코마티스의 검출용 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 사용될 수 있다. 바람직한 배합물에서, 지정된 뉴클레오티드 서열을 갖는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 클라미디아 트라코마티스의 검출을 위한 하기 배합물로 사용된다.
Figure kpo00011
[클라미디아 트라코마티스의 증폭용 프라이머 정렬에 사용되는 증폭 올리고뉴클레오티드 바람직한 사용 방법]
본 발명의 모든 증폭 올리고뉴클레오티드가 클라미디아 트라코마티스 핵산의 증폭을 위한 많은 핵산 방법과 함께 사용될 수 있고, 예를 들어, 이러한 방법들은 상기 기재되어 있고, 하기 실시예에 개시되고, 바람직한 실시 태양에서, 본 출원과 공동 소유권을 가지며 본 출원서에 참고 문헌으로 인용된 다타굽타 등의 상기 문헌에 개시된 바와 같이, 핵산에 표적화된 이 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열번호 30 내지 42의 리보좀 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 상기 문헌에 개시된 증폭 방법에 따라, 프라이머 정렬을 사용하여 각 프라이머 연장 반응 후, 두 개의 가닥 중 하나를 열순환 또는 분해할 필요 없이 단일 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다.
바람직한 용도에서, 서열 번호 17 내지 29의 증폭 올리고뉴클레오티드는 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제와 함께 사용할 프라이머 정렬을 포함한다. 프라이머 정렬은 초기 표적 핵산(클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA)에 대해 상보성 뉴클레오티드 서열을 지닌 프라이머의 제1서브세트(서열 번호 17-23) 및 클라미디아 트라코마티스의 표적 rRNA 또는 rDNA 영역의 동일 센스의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머의 제2서브세트(서열번호 24-29)로 이루어진다. 프라이머의 이 두가지 서브세트는 각각 상보성 프라이머 및 센스 프라이머로 언급할 것이다. 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없으나, 정의된 증폭 조건 하에서 주형 가닥과 함께 안정한 하이브리드를 형성하는 것이 틀림없다. 각 신규 형성된 프라이머 연장 산물은, 일단 치환되면, 다른 핵산 합성용 주형으로 작용한다. 더우기, 증폭 반응은, 본 발명에 사용된 핵산 폴리머라제가 혼성화 온도 및 가닥 치환 온도에서 활성인 한, 일정한 온도 및 반응 조건 하에서 일어날 수 있다.
이 프라미어 정렬의 증폭 올리고뉴클레오티드는 다타굽타의 상기 문헌의 바람직한 방법으로 사용되어, 프라이머의 상보성 서브세트의 각 구성원은 혼성화된 상보성 프라미어간의 거리가 바람직하게는 1 내지 200 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 2 내지 10 뉴클레오티드인 표적 클라미디아 트라코마티스 핵산의 예비 결정된 좌우에 혼성화될 것이다. 적절한 반응 조건 하에서, 핵산 폴리머라제(바람직하게는 DNA 폴리머라제) 및 뉴클레오티드 트리포스페이트(바람직하게는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트)의 부가 시에, 프라이머 정렬을 포함하는 올리고뉴클레오티드 3′ 말단에 뉴클레오티드 부가를 시작할 수 있다.
이론적을 한정되는 것을 바라지 않으면서, 이 증폭 반응을 하기의 방법으로 진행시킨다. 초기 핵산 가닥은 원래 혼성화된 다른 프라이머에서의 위치로 연장될 때(제2초기 가닥이 연장되는 시점으로부터), 새로이 형성되는 가닥은 제2가닥의 5′ 말단에서 제2가닥을 종종 치환하여, 놓여있는 표적 핵산 가닥을 제1초기 가닥의 추가 연장을 위한 주형으로서 유용하게 한다. 그러는 동안, 제2초기 가닥이 연장되면서 제3초기 가닥을 치환할 것이고, 더 나아가 상보성 프라이머가 많은 초기 가닥으로 존재할 것이다. 이 모든 프라이머들은 증폭될 표적 뉴클레오티드 서열의 영역 중 3′쪽(표적 핵산에 비해) 상의 표적 핵산에 결합하도록 구성된다.
초기 가닥이 표적 뉴클레오티드 서열을 통하여 연장되고(되거나) 통과하여, 이들은 혼성화 기질을 프라이머 정렬의 “센스 프라이머” 서브세트를 위해 제공되는 뉴클레오티드 서열을 함유할 것이다. 이 프라이머들도 동일 극성의 프라이머가 1 내지 200 뉴클레오티드간에 떨어져있는 방법, 더욱 바람직하게는 프라이머가 1 내지 10 뉴클레오티드 간에 분리된 방법으로 구성된다. 이 프라미어들은, 상보성 프라이머와 같이, 동일 종류의 연장 및 표준 치환을 수행한다. 상보성 및 센스 프라이머 서브세트의 연장 및 표준 치환의 배합 효과는 반응 혼합물에서 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 수를 매우 신속하게 증가시킨다.
각 프라이머 세트의 구성원은 핵산 가닥의 주형 의존적 합성을 위한 개시점으로 사용되고, 동일 센스의 인접프라이머의 길이 연장에 기인한 합성된 가닥의 치환을 증진시키는 것으로 생각된다. 따라서, 가닥 치환 및 핵산 합성은 한 단계로 수행되는 것으로 생각된다. 이는 놀라운 발견이고, 출원인은 방법을 수행하는 정확한 메카니즘에 대해서는 잘 알지 못한다.
단일 센스의 두 개의 프라이머만이 핵산 합성 동안 가닥 치환을 일으키는데 필요한 것으로 믿어지고, 상보성 프라이머 및 센스 프라이머로 이루어진 프라이머 정렬은 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산의 지수적 증폭을 일으키기 위하여, 초기 핵산 주형 및 그의 상보물을 모두 증폭시키는데 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 이 방법에 사용된 핵산 폴리머라제는 5′ 엑소뉴클레아제 활성이 결여되고, 이 방법은 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 클렌노우(klenow) 단편이 작동하는 온도보다 높은 온도에서 수행한다. 반응은 37℃보다 43℃가 더 효율적이다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus strearothermophilus)로 부터의 Taq DNA 폴리머라제 및 DNA 폴리머라제). 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 이 효소의 클레노우 형 단백질 분해성 단편을 만들고 보고하였다. 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드와 함께 이 증폭 방법을 사용하여 최적 효율을 50 내지 70℃의 온도에서 얻었다.
예시된 모든 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 17 내지 29이고, 바람직한 방법을 사용하더라도, 표적 클라미디아 트라코마티스 핵산 증폭을 위한 프라미어 정렬과 함께 사용될 필요는 없다. 바람직하게는, 이 프라미어 정렬로부터 선택된 두 개 이상의 상보성 프라이머 및 두 개 이상의 센스 프라이머는 초기 주형 핵산 및 그의 상보물에 함유된 표적 서열을 증폭시키기 위하여 함께 사용된다. 그러나, 증폭 정도는 프라이머의 수를 증가시킴에 따라 증가되는 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 상보성 프라이머 세트 및 센스 프라이머 세트는 각각 두 개 이상의 프라이머를 함유한다. 가장 바람직한 실시 태양에서는, 4개 이상의 센스 프라이머 및 4개 이상의 상보성 프라이머가 사용되거나, 또는 7개 이상의 센스 프라이머 및 6개 이상의 상보성 프라이머가 사용된다.
본 발명의 다양한 실시 태양의 하기 실시예는 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 영역을 한정하려는 것은 아니다.
[실시예 1]
이 실험에서, 정재된 클라미디아 트라코마티스(ATCC 번호 VR-866) rRNA의 상이한 양을 클라미디아 트라코마티스 23S rRNA에 대해 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 음성 센스의 두 개의 올리고뉴클레오티드로 증폭시켰다. 표적 23S rRNA를 클라미디아 트라코마티스로부터 얻고(글리신(Glisin) 등, Biochemistry 13:2633(1974)), 완충액(50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 37.5mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM DTT)으로 희석하였다. 두 개의 프로모터-프라이머를 합성하였고, 각각은 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드의 5′ 말단에 공유 결합된 서열 번호 43의 뉴클레오티드 서열의 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유하였다.
프로모터-프라이머 중 하나를 유리 3′-말단 히드록실기를 사용하여, 반응물당 2pmol을 사용하였다. 제2프로모터-프라이머를 3′-말단에 공유결합되어 프라이머의 양적 연장을 봉쇄하거나 완화시키는 알칸 디올기를 사용하여 합성하고, 반응물당 13pmol을 사용하였다. 프라이머 및 다양한 양의 표적 핵산을 95℃에서 15분 동안 가열하였고, 42℃로 냉각하였고, 900 유닛의 몰로니 쥐 백혈 바이러스(MMLV) 역 전사효소 및 400 유닛의 T7 RNA 폴리머라제를 용액에 가하였다. 최종 증폭 혼합물은 50mM 트리스 HCl(pH 8.5), 35mM 염화칼륨, 4mM GTP, 4mM ATP, 4mM UTP, 4mM CTP, 1mM dATP, 1mM dTTP, 1mM dCTP, 1mM dGTP, 20mM MgCl2, 20mM N-아세틸-L-시스테인 및 5% 글리세롤을 함유하였다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 증폭을 서열 번호 2의 비표지된 헬퍼 프로브를 함유하는 프로브혼합물 중 100㎕의 증폭 반응 혼합물과 서열 번호 1의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브와 함께 혼성화하여 분석하였다. 혼성화를 0.05M 숙신산리튬염(pH 5), 0.6M LiCl, 1%(중량/부피) 리튬 라우릴 술페이트(LLS), 10mM에 틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 10mM 에틸렌글리콜 비스(베타-아미노에틸에테르) N,N,N′,N′ 테트라아세트산(EGTA)를 함유하는 용액에서 60℃에서 15분 동안 수행하였다. 0.15M 소듐 테트라보레이트(pH 8.5), 1% 트리톤(등록상표) X-100을 함유하는 300㎕ 용액을 각 튜브에 가하고,각 반응물을 60℃에서 5-7분 동안 배양하고, 실온으로 냉각하고, 젠-프로브 리더(LEADER) I 발광측정기(젠-프로브 인코포레이티드사, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 분석하였다. 발광측정기는 제1시약은 1mM 질산 및 0.1% 과산화수소수이고, 제2시약은 1N 수산화나트륨으로 이루어진 두 개의 시약을 자동적으로 주입하였다. 분석 결과는 상대 강도 유닛(PLU)로 발광측정기로 측정된 광자수의 측정치를 나타내었다. 각 반응을 세 번씩 수행하고, 그 결과를 하기하였다.
[표 1]
Figure kpo00012
이 자료는 0.025pg 이상의 클라미디아 트라코마티스 핵산의 증폭이 성공적이고, 백그라운드의 600배를 초과하는 신호 수준에서도 핵산 혼성화 분석이 검출될 수 있음을 나타낸다.
[실시예 2]
이 실험에서, 동일한 뉴클레오티드 서열의 두 개의 프로모터-프라이머를 다시 사용하였다. 증폭 및 혼성화 반응 조건은 하기의 차이점을 제외하고는 실시예 1과 동일하였다.
각 프로모터-프라이머를 5′ 말단에서 서열 번호 43의 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열 및 3′ 말단에서 서열 번호 7의 뉴클레오티드 서열의 표적 혼성화 영역으로 합성하였다. 하나의 프로모터-프라이머를 유리 3′-히드록실기를 반응물 당 2pmol을 사용하여 합성하였다. 다른 프로모터-프라이머를 3′-알칸 디올 개질기를 반응물 당 13pmol을 사용하여 합성하였다. 증폭 조건은 실시예 1에 기재한 바와 같다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브를 사용하여 분석하였다. 표적 핵산을 함유하는 반응을 세 번씩 수행하고, 음성 대조구를 두 번씩 수행하였다.
[표 2]
Figure kpo00013
[실시예 3]
이 실시예는 상반된 방향의 프라이머 및 프로모터-프라이머를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 rRNA의 증폭을 입증하였다. 증폭 및 혼성화 반응 조건은 하기 변형을 제외하고는 실시예에 기재된 것과 동일하였다. 하나의 프로모터-프라이머를 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열의 표적 결합 서열 영역의 5′ 말단에서 T7 프로모터 서열(서열 번호 43)을 합성하였다. 이 프로모터-프라이머를 서열 번호 5 또는 서열 번호 6을 갖는 프라이머 15pmol을 함유하는 반응물 당 15pmol을 사용하였다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 20㎕의 반응물을, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 서열 번호 1의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브 및 서열 번호 2의 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하여 혼성화에 의해 분석하였다. 표적을 함유하는 반응을 세 번씩 수행하고, 표적을 함유하지 않는 대조 반응은 두 번씩 수행하였고, 그 결과는 RLU로 하기하였다.
[표 3]
Figure kpo00014
[실시예 4]
상이한 양의 클라미디아 트라코마티스 rRNA를 5′ 말단에서 실시예 1의 T7 프로모터 서열을 갖는 서열번호 4 및 15pmol의 서열 번호 6의 프라이머의 서열 번호 4로 이루어진 15pmol의 프로모터-프라이머로 증폭시킴으로써 증폭 및 검출 시스템의 감수성을 측정하였다. 증폭 및 혼성화 반응은 실시예 1에 기재된 바와 동일하였다. 증폭 반응을 수행한 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 100㎕의 증폭 반응물을 서열 번호 1의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브 및 서열 번호 2의 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석하였다. 반응은 두 번 또는 세 번식 반복하고, 결과는 하기하였다. 결과는 실시예 5에서 논의하였다.
[표 4]
Figure kpo00015
[실시예 5]
증폭 및 혼성화 반응을 하기의 차이점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일하게 수행하였다. 클라미디아 트라코마티스 rRNA를 5′ 말단에서 실시예 1의 T7 프로모터 서열을 함유하는 서열 번호 7의 프로모터-프라이머 및 서열 번호 8의 프라이머로 증폭시켰다. 증폭된 핵산의 1㎕를 서열 번호 3의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브로 분석하였다.
[표 5]
Figure kpo00016
여기서 얻은 자료 및 상기 실험은 5′ 말단에 결합된 T7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 서열 번호 5 또는 서열 버호 6이 쌍을 이룬 서열 번호 4의 표적 결합 영역을 갖는 프로모터-프라이머로 증폭시킨 후, 서열 번호 1의 표지된 프로브 및 서열 번호 2의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 T7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 서열 번호 8과 쌍을 이루는 서열 번호 7의 프라이머를 사용하여 검출한 후, 서열 번호 3의 프로브를 사용하여 검출하는 것에 의하여 클라미디아 트라코마티스 rRNA를 검출하였다.
[실시예 6]
이 실시예는 증폭 및 검출 분석의 반응성 및 특이성을 나타내었다. 리보좀 RNA를 모든 공지된 상이한 클라미디아 트라코마티스 육종으로부터 단리 및 정제하였다. 세 개의 rRNA 종을 5′ 말단에 공유 결합된 실시예 1의 T7 프로모터 서열을 갖는 30pmol의 서열 번호 4의 프로모터-프라이머, 및 30pmol의 서열 번호 6의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 0.05pg의 rRNA을 함유하는 단일 반응물 및 0.005pg의 rRNA을 함유하는 이중 반응물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 증폭 혼합물을 사용하여 증폭시켰다. 시료를 95℃까지 5분 동안 가열하고, 42℃로 냉각하고, 900 유닛의 MMLV 역전사효소 및 400 유닛의 T7 RNA 폴리머라제를 각 반응물에 가하였다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 100㎕의 증폭된 핵산을 실시예 1에 기재된 혼성화 조건을 사용하여 서열 번호 1의 아크리디늄 에스테르 표지된 혼성화 분석 프로브 및 서열 번호 2의 비표지된 헬퍼 프로브를 사용하여 검출하였다. 결과는 RLU로 보고하였다.
[표 6]
Figure kpo00017
자료는 모든 육종의 클라미디아 트라코마티스를 증폭시키고, 증폭 올리고뉴클레오티드에 의해 검출하였다. 더우기, 세포 당 약 2,000 카피(copy)의 23S rRNA가 존재하는 것으로 생각되었고, 이는 세포 당 약 3×10-21몰의 23S rRNA에 해당한다. 이 실시예가 3×10-21몰의 rRNA가 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 검출할 수 있기 때문에, 이 증폭 올리고뉴클레오티드는 시료 당 하나의 클라미디아 트라코마티스 유기체의 rRNA 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시킬 수 있을 것으로 이해된다. 이는 엄격히(리보솜 보다) 게놈 핵산 서열에 속한 프라이머의 증폭 감수성보다 월등하였다.
[실시예 7]
이 실시예에서, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 뉴모니에 또는 클라미디아 프시타치로부터의 3×10-20몰의 정제된 RNA를 실시예 6의 증폭 올리고뉴클레오티드로 각각 증폭시킨 후, 상기 서열 번호 1의 프로브로 검출하였다. 자료는 클라미디아와 밀접하게 연관된 종으로부터의 RNA는 클라미디아 트라코마티스의 검출 조건 하에서는 검출되지 않음을 보였다. 또한, 결과는 예민한 감수성을 지닌 모든 공지된 클라미디아 트라코마티스 육종을 검출할 수 있는 동일 증폭 올리고뉴클레오티드는 클라미디아 트라코마티스의 핵산과 공지된 밀접한 계통발생 개체, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산 간의 구별할 수 있는 것으로 나타났다.
[표 7]
Figure kpo00018
[실시예 8]
이 실시예는 서열 번호 30-42의 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드의 하나의 특징적 실시 태양이다. 실시예는 본 발명의 다양한 실시 태양 및 올리고뉴클레오티드의 용도를 예시하려는 것이지, 이러한 실시예 또는 실시예들이 본 발명의 영역을 한정하려는 것은 아니다.
이 실시예는 리보좀 RNA(rRNA) 표적 핵산의 증폭은 먼저 DAN 주형을 생산한 후, 프라이머 정렬 및 5′-엑소뉴클레아제 결핍 DNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 주형을 증폭시키는 것을 예시하였다. rRNA로부터 DNA 주형의 생산 및 주형의 증폭은 DNA 주형 생산 및 증폭용 시약을 함유하는 동일 반응 용기에서 수행하였다.
이 실시예에서 사용된 프라이머 정렬은 13개의 프라이머로 구성된다. 프라이머는 상기한 표준 포스포라미디트 화학법으로 제조하였다. 프라이머 중 7개는 (rRNA 표적에 대해) 상보성 프라이머였다. 이 프라이머들은 하기 핵산 서열을 갖는다.
Figure kpo00019
프라이머 중 6개는 (rRNA 표적에 대해서) 센스 프라이머였다. 이 프라이머들은 하기 핵산 서열을 갖는다.
Figure kpo00020
표적 23S rRNA를 클라미디아 트라코마티스로부터 얻고(글리신 Biochemistry 13:2633(1974) 참조), 완충액(50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 37.5mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM DTT)로 희석하였다. 상이한 양의 rRNA 표적물을 완충액(7% DMSO, 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 2mM DTT) 20㎕ 중의 프라이머(각각 7피코몰)와 혼합하고, 60℃에서 30분 동안 배양하여 프라이머를 예비 혼성하하였다. 예비 혼성화된 프라이머를 0.2mM ATP, 0.2mM TTP, 0.2mM GTP, 0.2mM CTP, 몰로니 쥐 백혈 바이러스 역 전사효소(MMLV-RT), 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bst)의 큰 서브틸리신 단편으로 얻은 5′-엑소뉴클레아제 결핍 DNA 폴리머라제의 2 유닛에 노출시켰다. 증폭은 37℃에서 60분, 이어서 60℃에서 120분 동안 수행하였다.
증폭 산물은 95℃에서 5분 동안 배양하여 변성시킨 후, 넬슨 등의 상기 문헌에 따른 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브를 사용하여 분석하였다. 프로브를 아크리디늄 에스테르로 표지하는 것은 넬슨 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 클라미디아 트라코마티스 특이적 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브를 합성하여 서열 번호 44의 핵산 서열을 얻었다. 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브(2×10-11몰)을 60℃에서 15분 동안 100㎕의 혼성화 완충액(100mM 숙신산리튬염(pH 5.2), 8% 리튬도데실술페이트, 1.5mM EDTA 및 1.5mM EGTA)에서 증폭 산물과 배양하였다. 알칼리 용액(0.15M 소듐테트라보레이트, pH 7.6 및 5%(중량/부피) 트리톤(등록상표) X-100)을 가하여 비혼성화된 표지 상에 존재하는 아크리디늄 에스테르를 가수분해하고, 60℃에서 10분 동안 배양하였다. 잔사 화학발광을 발광측정기로 측정하였다. 표 8에 기재된 결과는 표적 핵산의 증폭을 입증하였다.
[표 8]
Figure kpo00021
이 자료들은 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프라이머 정렬 형식 중 서열 번호 30-42와 혼성화할 수 있는 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산의 증가를 초래하였다. 또한, 실시예는, 이 실험에서, 프라이머 정렬이 표적 RAN와 4×10-19몰 만큼 검출가능하게 증폭시킬 수 있음을 입증하였다.
[실시예 9]
이 실시예는 임상적 시료(사람 자궁경부용 약솜 시료)중 존재하는 클라미디아 트라코마티스 rRNA 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭을 예시하였다. 이 실시예에 사용된 올리고뉴클레오티드, 증폭 방법, 및 검출 방법은 실시예 8에 기재되어 있다. 이 실시예는 사용된 시료의 형태 및 시료 제조 방법에서 실시예 8과 상이하였다.
자궁 경부용 약솜 시료를 수거하여, 음이온 계면활성제(60mM 인산염 완충액(pH 6.8)), 6% 리튬도데실술페이트, 2mM EDTA 및 2mM EGTA)를 함유하는 완충액 용액에 현탁시켰다. 임상시료를 10-18몰의 23S 클라미디아 트라코마티스 rRNA로 제공하고, 시료를 프라이머 정렬로 이루어진 증폭 올리고뉴클레오티드와 혼성화시켰다. 표적 핵산을 실시예 8에 기재된 바와 같이 증폭시키고, 검출하였다. 임상 시료 중 표적 핵산의 성공적인 증폭을 획득하고, 증폭된 RNA 스파이크된 시료의 혼성화 분석에서 얻은 신호의 양은 임상 시료를 함유하나 클라미디아 트라코마티스 rRNA로 스파이크되지 않은 유사 혼합물에 관찰된 것의 50배를 초과하였다.
[실시예 10]
서열 번호 4 및 6 서열의 프라이머를 구성하여 바람직하게는 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에 23S rRNA에 비해 클라미디아 트라코마티스 23S rRNA와 혼성화되었다. 클라미디아 트라코마티스의 프라이머의 특이성을 상이한 증폭 형식으로 입증하기 위하여, 이들은 중합 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로 시험하였다. 각 클라미디아 rRNA(0.008×10-15몰)을 5mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM 트리스 HCl(pH 8.3), 1mM dTTP, 1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dCTP, 20U 알나신(RNasin), 50U의 MMLV 역 전사효소 및 서열 번호 4의 프라이머를 위한 결합 부위의 다운스트림과 42℃에서 15분, 이어서 95℃에서 10분, 최종적으로 80℃에서 3분 동안 혼성화되기 위해 구성된 서열 번호 103 GTCGCCTGGG CCATTTCTCT GCGGCCCCCC GGGG의 클라미디아 트라코마티스 rRNA에 대해 상보성인 100pmol의 프라이머를 함유하는 용액 20㎕에서 배양하였다. 이 용액에 25mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM 트리스 HCl(pH 8.3), 2.5 U Taq 폴리머라제, 5′ 말단에서 서열 번호 43의 T7 프로모터 서열을 갖고, 서열번호 4의 3′ 프라이머 서열을 갖는 50pmol의 프로모터-프라이머, 및 서열 번호 6의 50pmol의 프라이머를 함유하는 용액 80㎕를 가한다. 대조구로서, 클라미디아 뉴모니에 rRNA 서열 영역에 대해 상보성 표적 결합 영역을 갖는 프라이머 및 프로모터-프라이머쌍을 유사한 증폭 형식에 사용하였다. 즉, 프로모터-프라이머의 프로모터 영역은 5′ 말단에서 동일 T7 프로모터 서열을 지녔다. 선택된 핵산 증폭 형식이 PCR이기 때문에, 프로모터 서열은 증폭 반응에 필수적이지 않았다. 반응 혼합물을 55℃에서 0.5분 동안, 72℃에서 1분 동안, 및 95℃에서 1분 동안 열순환시킨 후, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 배양하고, 혼성화 또는 겔 분석하기 전에 4℃로 냉각하였다. 각 반응 혼합물 20㎕을 겔 전기영동법으로 트리스보레이트 EDTA 완충액을 사용한 후, 에티듐 브로마이드 염색하여 2% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 핵산을 자외선 하에서 가시화하였다. 결과는 하기에 요약하였다.
[표 9]
Figure kpo00022
이 결과는 선택적 혼성화 조건 하에서, 서열 번호 4 및 6의 클라미디아 트라코마티스 프라이머는 특이적으로 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키고, 클라미디아 뉴모니에 또는 클라미디아 프시타치 rRNA 서열은 증폭시키지 않는 것을 입증하였다.
[실시예 11]
클라미디아 트라코마티스 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 속하는 증폭 및 검출 시스템의 감수성은 상이한 양의 클라미디아 트라코마티스 rRNA를 30pmol의 3′ 영역으로 서열 번호 50의 뉴클레오티드 서열을 갖고 5′ 말단에서 서열번호 106의 T7 프로모터 서열, 및 서열 번호 44를 갖는 프로모터-프라이머, 및 프라이머 30pmol로 증폭시킴으로써 예시되었다. 증폭 및 혼성화 반응은 실시예 1에 기재된 것과는 달랐다. 증폭 반응을 수행한 후, 20㎕의 증폭 반응물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 서열 번호 46의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브 및 서열번호 48의 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드의 혼합물로 분석하였다. 반응을 세 번씩 수행하고, 결과는 하기하였다.
[표 10]
Figure kpo00023
결과는 클라미디아 트라코마티스 16S rRNA에 속한 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드의 하나의 클라미디아 트라코마티스 세포에 함유된 rRNA 수준에 근접하는 용액 중 클라미디아 트라코마티스 핵산의 존재를 증폭 및 검출할 수 있는 능력을 입증하였다.
[실시예 12]
클라미디아 트라코마티스 16S rRNA에 속한 증폭 및 검출 시스템의 특이성은 실시예 11에 기재된 증폭 올리고뉴클레오티드로 다양한 유기체로부터의 세포 용해물 또는 정제된 RNA를 증폭시킴으로써 입증되었다. 검출될 선택된 유기체를 계통발생적 교차영역에 나타나는 유기체와 함께 비뇨생식관으로부터 통상적으로 단리하였다. 각 시료는 250,000 이상의 세포의 세포 용해물 또는 2×10-15몰의 정제된 RNA를 함유하였다. 이를 실시예 11에 기재된 바와 같이 증폭 반응물에 가하였다. 전체 100㎕ 반응물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 서열 번호 46의 프로브 및 서열 번호 48의 비표지된 헬퍼 프로브를 사용하여 핵산 혼성화에 의해 분석하였다. 표 11 및 12에 기재된 결과는 세 번씩 반복한 것의 평균치이다.
[표 11]
Figure kpo00024
[표 12]
Figure kpo00025
[실시예 13]
서열 번호 44 및 50 서열의 프라이머를 MMLV 역 전사효소를 사용하여 중합 연쇄 반응(PCR) 형식 중에서 시험하였다. 클라미디아 rRNA(2×10-16몰)을 5mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM 트리스 HCl, pH 8.3, 1mM dTTP, 1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dCTP, 20U의 알나신(RNasin), 50U의 MMLV 역 전사효소 및 1mmol 무작위 뉴클레오티드 육배체(베링거 마나임에서 구입)를 함유하는 용액 20㎕에서 42℃에서 15분 동안, 이어서 95℃에서 10분 동안, 최종적으로 80℃에서 3분 동안 배양하였다. 이 용액에, 1.25mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM 트리스 HCl(pH 8.3), 2.5U Tqp 폴리머라제, 5′ 말단에서 서열번호 106의 T7 프로모터 서열 및 3′ 말단에서 서열번호 50의 표적 결합 영역을 갖는 50pmol의 프로모터-프라이머, 및 서열 번호 44의 50pmol의 프라이머를 함유라는 용액을 가하였다. PCR 형식에서, 프로모터 서열은 증폭에 요구되지 않는다. 반응 혼합물은 55℃에서 0.5분, 72℃에서 1분, 및 95℃에서 1분 동안 35번 순환시킨 후, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 배양하고, 혼성화 또는 겔 분석 전에 4℃로 냉각하였다. 20㎕의 각 반응 혼합물을 트리스보레이트 EDTA 완충액을 사용한 후, 에트리듐 브로마이드 염색을 사용하여 가시화하여 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 목적하는 크기의 앰플리콘 밴드를 클라미디아의 세가지 종, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 프시타치, 클라미디아 뉴모니에서 모두 관찰하였다.
이어서, 반응 혼합물을 서열 번호 46의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브 및 서열 번호 48의 헬퍼 프로브와 혼성화하여 분석하였다. 결과는 하기 표 13에 기재하였다.
[표 13]
Figure kpo00026
이 결과는 프로브/헬퍼 올리고뉴클레오티드의 배합물이 밀접하게 연관된 유기체의 다량의 RNA를 함유하는 시료 중에서도 클라미디아 트라코마티스를 특이적으로 검출할 수 있음을 입증하였다.
[실시예 14]
이 실시예는 단일 뉴클레오티드 서열의 프로모터-프라이머가 클라미디아 트라코마티스 16S rRNA 서열을 증폭시킬 수 있음을 입증하였다. 이 실험에서, 다양한 양의 정제된 클라미디아 트라코마티스(ATCC 번호 VR-886) rRNA를 클라미디아 트라코마티스 16S rRNA에 대해 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 음성 센스의 두가지 올리고뉴클레오티드로 증폭시켰다. 두가지 프로모터를 합성하였고, 이들은 각각 서열 번호 50의 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 5′말단에 공유결합된 서열 번호 106의 T7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 함유하였다.
프로모터 프라이머 중 하나를 유리 3′-말단 히드록실기를 반응물 당 2pmol 사용하여 합성하였다. 제2프로모터-프라이머를 3′ 말단에 공유결합되어 프라이머 연장양을 봉쇄 또는 완화시키는 알칸 디올기를 반응물 당 13pmol 사용하여 합성하였다. 증폭 반응 및 혼성화 분석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브는 서열 번호 46의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 서열 번호 48의 비표지된 헬퍼 프로브를 사용하였다. 결과는 각 조건에 대해 세 번씩 수행한 것의 평균치이다.
[표 14]
Figure kpo00027
상기의 다양한 실시예에서 보여진 실시태양은 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드가 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭 및(또는) 검출할 수 있고, 클라미디아 트라코마티스를 그의 공지된 계통발생적 연관체와 구별하기 위한 분석에 사용될 수 있음을 입증하였다. 본 발명의 실시예는 상기 실시태양에 의해 본 발명을 한정하려는 것이 아니고, 추가의 실시태양은 하기 청구항들 내에 존재한다.
＜서열표＞
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 : 젠-프로브 인코포레이티드
미국 92121 캘리포니아주 샌 디에고 캠퍼스 포인트 드라이브 9880
(ii) 발명의 명칭 : 클라미디아 트라코마티스의 검출용 조성물 및 검출 방법
(iii) 서열수 : 109
(v) 컴퓨터 판독형 :
(A) 매체 형태 : 3.5″ 디스켓 1.44 Mb 보관
(B) 컴퓨터 : IBM PC
(C) 운영 체계 : MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 워드 퍼펙트(버전 5.1)
(vi) 현 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(vii) 선행 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 : 08/323,257
(B) 출원일 : 1994. 10. 14
(viii) 변리사/대리인 정보 :
(A) 성명 : 헤버, 쉘돈 오.
(B) 등록 번호 : 38,179
(C) 참고/서류 번호 : 210/087-PCT
(ix) 전신 정보
(A) 전화 : (213) 489-1600
(B) 텔레팩스 : (213) 955-0440
(C) 텔렉스 : 67-3510
(2) 서열번호 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 1의 서열
Figure kpo00028
(2) 서열번호 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 2의 서열
Figure kpo00029
(2) 서열번호 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 3의 서열
Figure kpo00030
(2) 서열번호 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 4의 서열
Figure kpo00031
(2) 서열번호 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 5의 서열
Figure kpo00032
(2) 서열번호 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 6의 서열
Figure kpo00033
(2) 서열번호 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 7의 서열
Figure kpo00034
(2) 서열번호 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 8의 서열
Figure kpo00035
(2) 서열번호 9에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 9의 서열
Figure kpo00036
(2) 서열번호 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 10의 서열
Figure kpo00037
(2) 서열번호 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 11의 서열
Figure kpo00038
(2) 서열번호 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 12의 서열
Figure kpo00039
(2) 서열번호 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 13의 서열
Figure kpo00040
(2) 서열번호 14에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 14 서열
Figure kpo00041
(2) 서열번호 15에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 15의 서열
Figure kpo00042
(2) 서열번호 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 16의 서열
Figure kpo00043
(2) 서열번호 17에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 17의 서열
Figure kpo00044
(2) 서열번호 18에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 18의 서열
Figure kpo00045
(2) 서열번호 19에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 19의 서열
Figure kpo00046
(2) 서열번호 20에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 20의 서열
Figure kpo00047
(2) 서열번호 21에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 21의 서열
Figure kpo00048
(2) 서열번호 22에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 22의 서열
Figure kpo00049
(2) 서열번호 23에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 23의 서열
Figure kpo00050
(2) 서열번호 24에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 24의 서열
Figure kpo00051
(2) 서열번호 25에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 25의 서열
Figure kpo00052
(2) 서열번호 26에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 26의 서열
Figure kpo00053
(2) 서열번호 27에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 27의 서열
Figure kpo00054
(2) 서열번호 28에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 28의 서열
Figure kpo00055
(2) 서열번호 29에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 29의 서열
Figure kpo00056
(2) 서열번호 30에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 30의 서열
Figure kpo00057
(2) 서열번호 31에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 31의 서열
Figure kpo00058
(2) 서열번호 32에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 32의 서열
Figure kpo00059
(2) 서열번호 33에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 33의 서열
Figure kpo00060
(2) 서열번호 34에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 34의 서열
Figure kpo00061
(2) 서열번호 35에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 35의 서열
Figure kpo00062
(2) 서열번호 36에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 36의 서열
Figure kpo00063
(2) 서열번호 37에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 37의 서열
Figure kpo00064
(2) 서열번호 38에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 38의 서열
Figure kpo00065
(2) 서열번호 39에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 39의 서열
Figure kpo00066
(2) 서열번호 40에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 40의 서열
Figure kpo00067
(2) 서열번호 41에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 41의 서열
Figure kpo00068
(2) 서열번호 42에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 42의 서열
Figure kpo00069
(2) 서열번호 43에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 43의 서열
Figure kpo00070
(2) 서열번호 44에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 44의 서열
Figure kpo00071
(2) 서열번호 45에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 45의 서열
Figure kpo00072
(2) 서열번호 46에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 26염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 46의 서열
Figure kpo00073
(2) 서열번호 47에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 26염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 47의 서열
Figure kpo00074
(2) 서열번호 48에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 48의 서열
Figure kpo00075
(2) 서열번호 49에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 49의 서열
Figure kpo00076
(2) 서열번호 50에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 50의 서열
Figure kpo00077
(2) 서열번호 51에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 51의 서열
Figure kpo00078
(2) 서열번호 52에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 52의 서열
Figure kpo00079
(2) 서열번호 53에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 53의 서열
Figure kpo00080
(2) 서열번호 54에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 54의 서열
Figure kpo00081
(2) 서열번호 55에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 55의 서열
Figure kpo00082
(2) 서열번호 56에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 56의 서열
Figure kpo00083
(2) 서열번호 57에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 57의 서열
Figure kpo00084
(2) 서열번호 58에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 58의 서열
Figure kpo00085
(2) 서열번호 59에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 59의 서열
Figure kpo00086
(2) 서열번호 60에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 60의 서열
Figure kpo00087
(2) 서열번호 61에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 61의 서열
Figure kpo00088
(2) 서열번호 62에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 62의 서열
Figure kpo00089
(2) 서열번호 63에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 63의 서열
Figure kpo00090
(2) 서열번호 64에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 64의 서열
Figure kpo00091
(2) 서열번호 65에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 65의 서열
Figure kpo00092
(2) 서열번호 66에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 66의 서열
Figure kpo00093
(2) 서열번호 67에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 33염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 67의 서열
Figure kpo00094
(2) 서열번호 68에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 68의 서열
Figure kpo00095
(2) 서열번호 69에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 69의 서열
Figure kpo00096
(2) 서열번호 70에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 70의 서열
Figure kpo00097
(2) 서열번호 71에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 71의 서열
Figure kpo00098
(2) 서열번호 72에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 72의 서열
Figure kpo00099
(2) 서열번호 73에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 73의 서열
Figure kpo00100
(2) 서열번호 74에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 74의 서열
Figure kpo00101
(2) 서열번호 75에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 75의 서열
Figure kpo00102
(2) 서열번호 76에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 76의 서열
Figure kpo00103
(2) 서열번호 77에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 77의 서열
Figure kpo00104
(2) 서열번호 78에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 78의 서열
Figure kpo00105
(2) 서열번호 79에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 79의 서열
Figure kpo00106
(2) 서열번호 80에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 80의 서열
Figure kpo00107
(2) 서열번호 81에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 25염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 81의 서열
Figure kpo00108
(2) 서열번호 82에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 18염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 82의 서열
Figure kpo00109
(2) 서열번호 83에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 83의 서열
Figure kpo00110
(2) 서열번호 84에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 84의 서열
Figure kpo00111
(2) 서열번호 85에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 85의 서열
Figure kpo00112
(2) 서열번호 86에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 86의 서열
Figure kpo00113
(2) 서열번호 87에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 21염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 87의 서열
Figure kpo00114
(2) 서열번호 88에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 88의 서열
Figure kpo00115
(2) 서열번호 89에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 23염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 89의 서열
Figure kpo00116
(2) 서열번호 90에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 90의 서열
Figure kpo00117
(2) 서열번호 91에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 24염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 91의 서열
Figure kpo00118
(2) 서열번호 92에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 22염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 92의 서열
Figure kpo00119
(2) 서열번호 93에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 93의 서열
Figure kpo00120
(2) 서열번호 94에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 94의 서열
Figure kpo00121
(2) 서열번호 95에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 95의 서열
Figure kpo00122
(2) 서열번호 96에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 96의 서열
Figure kpo00123
(2) 서열번호 97에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 26염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 97의 서열
Figure kpo00124
(2) 서열번호 98에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 26염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 98의 서열
Figure kpo00125
(2) 서열번호 99에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 99의 서열
Figure kpo00126
(2) 서열번호 100에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 100의 서열
Figure kpo00127
(2) 서열번호 101에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 101의 서열
Figure kpo00128
(2) 서열번호 102에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 102의 서열
Figure kpo00129
(2) 서열번호 103에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 34염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 103의 서열
Figure kpo00130
(2) 서열번호 104에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 104의 서열
Figure kpo00131
(2) 서열번호 105에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 105의 서열
Figure kpo00132
(2) 서열번호 106에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 106의 서열
Figure kpo00133
(2) 서열번호 107에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 107의 서열
Figure kpo00134
(2) 서열번호 108에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 108의 서열
Figure kpo00135
(2) 서열번호 109에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열번호 109의 서열
Figure kpo00136

Claims (87)

  1. 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, a) 서열 번호 1, b) 서열 번호 9, c) 서열 번호 3, d) 서열 번호 10, e) 서열 번호 46, f) 서열 번호 47 및 g) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동물들로 이루어진 군으로부터 선택되고 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) rRNA, 또는 이 rRNA를 코딩하는 DNA로부터 유도된 제1뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 폴리머의 특정 영역과 검출 가능하게 안정한 하이브리드를 형성하고, 상기 혼성화 조건 하에서는 클라미디아 프시타치(Chlamydia psittaci) 또는 클라미디아 뉴모니에(Chlamydia pneumoniae)의 핵산과 검출가능하게 안정한 하이브리드를 형성하지 않는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 제1및 제2뉴클레오티드 서열은 a) DNA, b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택되는 전제 하에서, 상기 제1뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1인 경우, 상기 프로브가 서열 번호 9의 제2뉴클레오티드 서열을 갖고, 상기 제1뉴클레오티드 서열이 서열 번호 9인 경우, 상기 프로브가 서열 번호 1의 제2뉴클레오티드 서열을 갖고, 상기 제1뉴클레오티드 서열이 서열 번호 3인 경우, 상기 프로브가 서열 번호 10의 제2뉴클레오티드 서열을 갖고, 상기 제1뉴클레오티드 서열이 서열 번호 10인 경우, 상기 프로브가 서열 번호 3의 제2뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브.
  3. 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, a) 서열 번호 1, b) 서열 번호 9, c) 서열 번호 3, d) 서열 번호 10, e) 서열 번호 46, f) 서열 번호 47 및 보존적으로 개질된 그의 변형체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 클라미디아 프시타치 또는 클라미디아 뉴모니에로부터의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 핵산과 검출 가능하게 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브.
  4. a) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브, 및 b) 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 클라미디아 트라코마티스의 특이적 검출용 프로브 혼합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혼성화 분석 프로브의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1로 이루어진 프로브 혼합물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 헬퍼 프로브가 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, a) 서열 번호 11 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA등가물로 이루어진 군으로부터 선택되고 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 폴리머의 특이적 영역과 안정한 하이브리드를 형성하는 프로브 혼합물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 헬퍼 프로브가 a) 서열 번호 2 및 b) 보존적으로 개질된 그의 변형체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브 혼합물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 헬퍼 프로브의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 2로 이루어진 프로브 혼합물.
  9. a) 서열 번호 46의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브 및 b) 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드로 이루어진 클라미디아 트라코마티스의 특이적 검출용 프로브 혼합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혼성화 분석 프로브의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 46으로 이루어진 프로브 혼합물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 헬퍼 프로브가 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온의 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, a) 서열 번호 49 및 b)티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택되고 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 폴리머의 특이적 영역과 안정한 하이브리드를 형성하는 프로브 혼합물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 헬퍼 프로브가 a) 서열 번호 48 및 b) 보존적으로 개질된 그의 변형체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브 혼합물.
  13. 형성된 하이브리드의 검출은, 시료 중 존재하는 경우에, 클라미디아 프시타치 및(또는) 클라미디아 뉴모니에의 핵산의 존재가 아닌 클라미디아 트라코마티스 핵산의 존재를 특이적으로 의미하는 것인, 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브와, 시료 중 존재하는 a) 서열 번호 1, b) 서열 번호 9, c) 서열 번호 3, d) 서열 번호 10, e) 서열 번호 46, f) 서열 번호 47 및 g) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택되고 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 폴리머의 특이적 영역간에 형성된 검출가능하게 안정한 핵산 하이브리드.
  14. a) 60℃에서 15분 동안 0.8 M의 1가 양이온의 용액에 상응하는 혼성화 조건하에서, 상기 시료를 클라미디아 트라코마티스의 rRNA 또는 rDNA와는 혼성화되고, 비클라미디아성 세균의 rRNA 또는 rDNA와는 혼성화되지 않고, i) 서열 번호 1, ii) 서열 번호 9, iii) 서열 번호 3, iv) 서열 번호 10, v) 서열 번호 46, vi) 서열 번호 47 및 vii) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 이 rRNA를 코딩하는 DNA 영역에 대해 상보성인 제1올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, b) 상기 혼성화 조건을 상기 시료 및 올리고뉴클레오티드에 부과하여 올리고뉴클레오티드를, 존재한다면, 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA 서열을 코딩하는 핵산과 혼성화시켜서 안정한 하이브리드를 형성하는 단계, 및 c) 상기 시료 중 존재하는 상기 하이브리드를 시료 중 클라미디아 트라코마티스 핵산의 존재의 징후로서 검출하는 단계로 이루어진 시료 중 클라미디아 트라코마티스 핵산의 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 제1및 제2 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 올리고뉴클레오티드로 함께 이루어진, 상기 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA 서열을 코딩하는 핵산을 제 2 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제1올리고뉴클레오티드가 서열 번호 3 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 제1올리고뉴클레오티드가 서열 번호 10의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 제1올리고뉴클레오티드가 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 방법.
  19. 제14항에 있어서, 제1올리고뉴클레오티드가 서열 번호 46의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 방법.
  20. 제14항에 있어서, 제1 및 제2뉴클레오티드가 서열 번호 46 및 서열 번호 48의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 올리고뉴클레오티드로 함께 이루어진, 상기 클라미디아 트라코마티스 rRNA 또는 rDNA 서열을 코딩하는 핵산을 제2올리고뉴클레오티드와 혼성화시키는 방법.
  21. 제14항에 있어서, 제1올리고뉴클레오티드가 서열 번호 47의 뉴클레오티드 서열 또는 보존적으로 개질된 그의 변형체를 갖는 방법.
  22. a) i) 서열 번호 9, ii) 서열번호 12, iii) 서열 번호 5, iv) 서열 번호 6, v) 서열 번호 11 및 vi) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 영역을 통해 결합하거나 또는 중합을 유발하는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키는 단계, b) 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스 핵산과 특이적으로 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에 핵산의 혼성화를 증진시키지 않는 혼성화 조건 하에서, 증폭 올리고뉴클레오티드가 클라미디아 트라코마티스 핵산과 혼성화될 수 있는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 보존적으로 개질된 그의 변형체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 a) 서열 번호 43, b) 서열 번호 106, c) 서열 번호 104, d) 서열 번호 107 및 e) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 증폭 단계가 동일하거나 또는 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드의 집단을 사용하는 것으로 이루어지고, 이 증폭 올리고뉴클레오티드의 하부 집단은 그의 3′말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′말단이 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 증폭 단계가 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어지고, 이 중 하나 이상이 a) 서열 번호 4, b) 서열 번호 5, c) 서열 번호 6 및 d) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드는 대체적으로 동일 서열 번호와 유사하지 않다는 전제 하에서, 각각이 a) 서열 번호 4, b) 서열 번호 5, c) 서열 번호 6 및 d) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 두 개 이상의 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  30. 제22항에 있어서, 혼성화 분석 프로브가 a) 서열 번호 1 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  31. 제22항에 있어서, 상기 검출 단계가 서열 번호 2, 및 티민 대신 우라실치 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 사용하는 방법.
  32. a) i) 서열 번호 1, ii) 서열 번호 4, iii) 서열 번호 13, iv) 서열 번호 14 및 v) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 영역을 통해 결합하거나 또는 중합을 유발하는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드 사용하여 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키는 단계, b) 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스 핵산과 특이적으로 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에 핵산의 혼성화를 증진시키지 않는 혼성화 조건 하에서, 증폭 올리고뉴클레오티드가 클라미디아 트라코마티스 핵산과 혼성화될 수 있는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 보존적으로 개질된 그의 변형체로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 a) 서열 번호 43, b) 서열 번호 106, c) 서열 번호 104, d) 서열 번호 107 및 e) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 증폭 단계가 동일하거나 또는 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드의 집단을 사용하는 것으로 이루어지고, 이 증폭 올리고뉴클레오티드의 하부 집단은 그의 3′ 말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 방법.
  38. 제32항에 있어서, 상기 증폭 단계가 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어지고, 이 중 하나 이상이 a) 서열 번호 4, b) 서열 번호 5, c) 서열 번호 6 및 d) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  39. 제32항에 있어서, 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드는 대체적으로 동일 서열 번호와 유사하지 않다는 전제 하에서, 각각이 a) 서열 번호 4, b) 서열 번호 5, c) 서열 번호 6 및 d) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는, 두 개 이상의 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  40. 제32항에 있어서, 혼성화 분석 프로브가 a) 서열 번호 9 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  41. 제32항에 있어서, 상기 검출 단계가 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 사용하는 방법.
  42. a) i) 서열 번호 3, ii) 서열 번호 8, iii) 서열 번호 15 및 iv) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 영역을 통해 결합하거나 또는 중합을 유발하는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키는 단계, b) 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스 핵산과 특이적으로 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  43. 제42항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 a) 서열 번호 43, b) 서열 번호 106, c) 서열 번호 104, d) 서열 번호 107 및 e) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전을 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 증폭 단계가 동일하거나 또는 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드의 집단을 사용하는 것으로 이루어지고, 이 증폭 올리고뉴클레오티드의 하부 집단은 그의 3′ 말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 증폭 단계가 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어지고, 이 중 하나 이상이 a) 서열 번호 7, b) 서열 번호 8, 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드는 대체적으로 동일 서열 번호와 유사하지 않다는 전제 하에서, 각각이 a) 서열 번호 7, b) 서열 번호 8 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는, 두 개 이상의 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  48. 제42항에 있어서, 혼성하 분석 프로브가 a) 서열 번호 10 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  49. 제42항에 있어서, 상기 검출 단계가 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 사용하는 방법.
  50. a) i) 서열 번호 10, ii) 서열 번호 7, iii) 서열 번호 16 및 iv) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 영역을 통해 결합하거나 또는 중합을 유발하는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키는 단계, b) 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스 핵산과 특이적으로 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  51. 제50항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 a) 서열 번호 43, b) 서열 번호 106, c) 서열 번호 104, d) 서열 번호 107 및 e) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 5′비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 증폭 단계가 동일하거나 또는 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드의 집단을 사용하는 것으로 이루어지고, 이 증폭 올리고뉴클레오티드의 하부 집단은 그의 3′ 말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 방법.
  54. 제50항에 있어서, 상기 증폭 단계가 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어지고, 이 중 하나 이상이 a) 서열 번호 7, b) 서열 번호 8 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  55. 제50항에 있어서, 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드는 대체적으로 동일 서열 번호와 유사하지 않다는 전제 하에서, 각각이 a) 서열 번호 7, b) 서열 번호 8 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는, 두 개 이상의 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  56. 제50항에 있어서, 혼성화 분석 프로브가 a) 서열 번호 3 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  57. 제50항에 있어서, 상기 검출 단계가 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 사용하는 방법.
  58. a) i) 서열 번호 46, ii) 서열 번호 44, iii) 서열 번호 51 및 iv) 서열 번호 48 및 v) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 영역을 통해 결합하거나 또는 중합을 유발하는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키는 단계, b) 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스 핵산과 특이적으로 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  59. 제58항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 a) 서열 번호 43, b) 서열 번호 106, c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 증폭 단계가 동일하거나 또는 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드의 집단을 사용하는 것으로 이루어지고, 이 증폭 올리고뉴클레오티드의 하부 집단은 그의 3′ 말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 증폭 단계가 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어지고, 이중 하나 이상이 a) 서열 번호 44, b) 서열 번호 50 및, c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  63. 제58항에 있어서, 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드는 대체적으로 동일 서열 번호와 유사하지 않다는 전제 하에서, 각각이 a) 서열 번호 44, b) 서열 번호 50 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는, 두 개 이상의 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  64. 제58항에 있어서, 혼성화 분석 프로브가 a) 서열 번호 47 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  65. 제58항에 있어서, 상기 검출 단계가 a) 서열 번호 48 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 사용하는 방법.
  66. a) i) 서열 번호 47, ii) 서열 번호 45, iii) 서열 번호 50 및 iv) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 클라미디아 트라코마티스 핵산 영역을 통해 결합하거나 또는 중합을 유발하는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클라미디아 트라코마티스 핵산을 증폭시키는 단계, b) 60℃에서 15분 동안 0.8M의 1가 양이온 용액에 상응하는 혼성화 조건 하에서, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 비해 클라미디아 트라코마티스 핵산과 특이적으로 혼성화될 가능성이 큰 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  67. 제66항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 RNA 폴리머라제에 의해 RNA 합성을 개시할 수 있는 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 하나 이상의 상기 증폭 올리고뉴클레오티드가 a) 서열 번호 43, b) 서열 번호 106 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 5′ 비상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 증폭 단계가 동일하거나 또는 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드의 집단을 사용하는 것으로 이루어지고, 이 증폭 올리고뉴클레오티드의 하부 집단은 그의 3′ 말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 방법.
  70. 제66항에 있어서, 상기 증폭 단계가 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어지고, 이 중 하나 이상이 a) 서열 번호 44, b) 서열 번호 50 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  71. 제66항에 있어서, 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드는 대체적으로 동일 서열 번호와 유사하지 않다는 전제하에서, 각각이 a) 서열 번호 44, b) 서열 번호 50 및 c) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는, 두 개 이상의 상이한 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  72. 제66항에 있어서, 혼성화 분석 프로브가 a) 서열 번호 46 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 방법.
  73. 제66항에 있어서, 상기 검출 단계가 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 사용하는 방법.
  74. a) i) 서열 번호 7, ii) 서열 번호 8, iii) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드, b) i) 서열 번호 3, ii) 서열 번호 10 및 iii) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물, iv) 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 v) 하나 이상의 핵산 중합 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브로 이루어진 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산에 대한 클라미디아 트라코마티스 핵산의 특이적 검출 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드가 핵산 분자의 3′ 말단을 연장시키는 핵산 폴리머제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 핵산 분자의 하부 집단을 함유하는 조성물.
  76. a) i) 서열 번호 4, ii) 서열 번호 5, iii) 서열 번호 6 및 iv) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드, b) i) 서열 번호 1, ii) 서열 번호 9 및 iii) 티민 대신 우라실이 치환된 RNA 동등물, iv) 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 v) 하나 이상의 핵산 중합 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브로 이루어진, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산으로부터 클라미디아 트라코마티스 핵산의 특이적 검출 조성물.
  77. 제76항에 있어서, a) 서열 번호 2 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 함유하는 조성물.
  78. 제76항에 있어서, 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드가 핵산 분자의 3′말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 핵산 분자의 하부 집단을 함유하는 조성물.
  79. a) i) 서열 번호 44, ii) 서열 번호 50, iii) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드, b) i) 서열 번호 46, ii) 서열 번호 47 및 iii) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 동등물, iv) 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 v) 하나 이상의 핵산 중합 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브로 이루어진, 클라미디아 프시타치 및 클라미디아 뉴모니에의 핵산으로부터 클라미디아 트라코마티스 핵산의 특이적 검출 조성물.
  80. 제79항에 있어서, a) 서열 번호 48 및 b) 티민 대신 우라실이 치환된 그의 RNA 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 대체적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 추가로 함유하는 조성물.
  81. 제79항에 있어서, 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드가 핵산 분자의 3′말단을 연장시키는 핵산 폴리머라제의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 3′ 말단이 변형된 뉴클레오티드 서열과 대체적으로 유사한 핵산 분자의 하부 집단을 함유하는 조성물.
  82. a) 서열 번호 17, b) 서열 번호 18, c) 서열 번호 19, d) 서열 번호 20, e) 서열 번호 21, f) 서열 번호 22, g) 서열 번호 23, h) 서열 번호 24, i) 서열 번호 25, j) 서열 번호 26, k) 서열 번호 27, l) 서열 번호 28 및 m) 서열 번호 29으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는, 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 핵산 증폭용 증폭 올리고뉴클레오티드.
  83. 제82항의 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 44 및 서열 번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 혼성화 분석 프로브로 이루어진, 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 핵산의 증폭 및 특이적 검출용 조성물.
  84. 제1센스의 프라이머는 a) 서열 번호 17, b) 서열 번호 18, c) 서열 번호 19, d) 서열 번호 20, e) 서열 번호 21, f) 서열 번호 22, g) 서열 번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2센스의 증폭 올리고뉴클레오티드는 h) 서열 번호 24, i) 서열 번호 25, j) 서열 번호 26, k) 서열 번호 27, l) 서열 번호 28 및 m) 서열 번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동일 센스의 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 함유하는 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 핵산 증폭용 증폭용 프라이머 정렬.
  85. 제79항에 있어서, 상기 프라미어 정렬이 a) 서열 번호 17, b) 서열 번호 18, c) 서열 번호 19, d) 서열 번호 20, e) 서열 번호 21, f) 서열 번호 22, g) 서열 번호 23, h) 서열 번호 24, i) 서열 번호 25, j) 서열 번호 26, k) 서열 번호 27, l) 서열 번호 28 및 m) 서열 번호 29의 뉴클레오티드 서열의 증폭 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 정렬.
  86. 제85항의 프라이머 정렬, 및 서열 번호 44 및 서열 번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 혼성화 분석 프로브로 이루어진, 클라미디아 트라코마티스로부터 유도된 핵산의 증폭 및 특이적 검출용 조성물.
  87. a) 서열 번호 17, b) 서열 번호 18, c) 서열 번호 19, d) 서열 번호 20, e) 서열 번호 21, f) 서열 번호 22, g) 서열 번호 23, h) 서열 번호 24, i) 서열 번호 25, j) 서열 번호 26, k) 서열 번호 27, l) 서열 번호 28 및 m) 서열 번호 29로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 두 개 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 함유하는 클라미디아 트라코마티스 핵산 증폭용 장치.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69736667T2 (de) * 1996-07-16 2007-09-06 Gen-Probe Inc., San Diego Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm)
US7070925B1 (en) 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
JP2001505411A (ja) * 1996-09-05 2001-04-24 アメリカ合衆国 ３つのクラミジア種の検出および識別のための核酸アッセイ
ES2355739T3 (es) * 1997-04-03 2011-03-30 Life Technologies Corporation Composiciones y métodos para la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (rt-pcr).
FR2764293B1 (fr) * 1997-06-05 2001-09-14 Bio Merieux Fragment nucleotidique de l'arn 23s de bacteries du genre chlamydia, utilisations comme sonde, amorce, et dans un reactif et un procede de detection
US7569342B2 (en) * 1997-12-10 2009-08-04 Sierra Molecular Corp. Removal of molecular assay interferences
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
US6261769B1 (en) 1998-03-31 2001-07-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Intergenic spacer target sequence for detecting and distinguishing Chlamydial species or strains
US6821770B1 (en) * 1999-05-03 2004-11-23 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms
AU5267800A (en) * 1999-05-03 2000-11-17 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide probes for detection and quantitation of bacteria in the family enterobacteriaceae
US6376186B1 (en) * 1999-05-03 2002-04-23 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide probes for detection and quantitation of staphylococcus
DE19957827C2 (de) * 1999-11-25 2003-06-12 Epigenomics Ag Verwendung eines Oligomer-Arrays mit PNA- und/oder DNA-Oligomeren auf einer Oberfläche
US20030096315A1 (en) 2000-05-03 2003-05-22 Sanders Mitchell C. Device for detecting bacterial contamination and method of use
DE10021947A1 (de) * 2000-05-05 2001-11-08 Max Planck Gesellschaft Helferoligonukleotide für die in situ Hybridisierung
GB0016814D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (3)
US6682889B1 (en) 2000-11-08 2004-01-27 Becton, Dickinson And Company Amplification and detection of organisms of the Chlamydiaceae family
EP1251183A3 (en) * 2001-04-18 2003-12-10 Exiqon A/S Improved helper probes for detection of a target sequence by a capture oligonucleotide
US20030105320A1 (en) * 2001-08-31 2003-06-05 Becker Michael M. Affinity-shifted probes for quantifying analyte polynucleotides
WO2003063693A2 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Expressive Constructs, Inc. Method for detecting microorganisms
DE10237284A1 (de) * 2002-08-14 2004-03-04 Advalytix Ag Nukleinsäurenachweis
WO2004087942A2 (en) * 2003-01-31 2004-10-14 Ethicon, Inc. Method for detecting escherichia coli
CA2557612C (en) * 2003-11-03 2014-06-17 Ethicon, Inc. Methods, peptides and biosensors useful for detecting a broad spectrum of bacteria
CA2609206A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of chlamydophila pneumoniae in a test sample
AU2008224883A1 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Sierra Molecular Corporation Compositions, systems, and methods for preservation and/or stabilization of a cell and/or macromolecule
JP2012514461A (ja) * 2009-01-06 2012-06-28 ヨウ，キミン 標的核酸の交差プライミング増幅
US8628924B2 (en) 2009-07-21 2014-01-14 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative amplification and detection over a wide dynamic range
JP5838550B2 (ja) * 2010-12-22 2016-01-06 東ソー株式会社 クラミジア・トラコマチスｒｎａの検出方法及び検出試薬
WO2015023892A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hev nucleic acid
EP3438258B1 (en) * 2016-03-30 2021-09-22 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation Chlamydia trachomatis detecting primer set, chlamydia trachomatis detecting method using same, and reagent kit therefor
AU2017278065B2 (en) * 2016-06-10 2020-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Zika virus nucleic acid
US10450616B1 (en) 2018-05-09 2019-10-22 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis
US10954572B2 (en) 2019-07-25 2021-03-23 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae
CA3153514A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
US11891662B2 (en) 2019-12-02 2024-02-06 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin
CN114540525B (zh) * 2022-04-26 2022-08-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种检测或辅助检测鹦鹉热衣原体的引物组合物及其应用

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3486467T3 (de) * 1983-01-10 2004-10-14 Gen-Probe Inc., San Diego Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB2197363B (en) * 1986-11-14 1990-09-12 Univ Waterloo Packing seal for boreholes
AU616646B2 (en) * 1986-11-24 1991-11-07 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5079351A (en) * 1986-11-26 1992-01-07 Cetus Corporation Oligonucleotides and kits for detection of htlvi and htlvii viruses by hybridization
IL86724A (en) * 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340843C (en) * 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
SE459586B (sv) * 1987-09-14 1989-07-17 Mta Szegedi Biolog Koezponti Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning
PT88550A (pt) * 1987-09-21 1989-07-31 Ml Tecnology Ventures Lp Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas
US5283174A (en) * 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
CA1339872C (en) * 1987-09-21 1998-05-19 Lyle John Arnold Jr. Homogeneous protection assay
US5185439A (en) * 1987-10-05 1993-02-09 Gen-Probe Incorporated Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes
US5030557A (en) * 1987-11-24 1991-07-09 Ml Technology Venture Means and method for enhancing nucleic acid hybridization
US5449769A (en) * 1989-03-06 1995-09-12 Gen-Probe Incorporated Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds
DE69027910T2 (de) * 1989-05-31 1997-02-20 Amoco Corp Nukleinsäuresonden zum Nachweis von Chlamydia trachomatis und Chlamydia psittaci
EP0731175A3 (en) * 1989-07-11 2004-05-26 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for HIV nucleic acid
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
IE65771B1 (en) * 1990-01-25 1995-11-15 Zeneca Ltd Amplification of nucleotide sequences using vectorette units
WO1993004163A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 Massachusetts Institute Of Technology Strain of chlamydia
CA2135073C (en) * 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
WO1994003472A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification
US5374718A (en) * 1992-08-26 1994-12-20 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to chlamydia pneumoniae
EP0625213B1 (en) * 1992-10-09 1999-12-29 VYSIS, Inc. Assay methods
JPH07503859A (ja) * 1992-10-09 1995-04-27 ヴァイシス・インコーポレーテッド 挿入エレメントおよび増幅可能な核酸
WO1995024499A1 (en) * 1994-03-10 1995-09-14 Gen-Probe Incorporated Method for suppressing inhibition of enzyme-mediated reactions by ionic detergents
AU687535B2 (en) * 1994-03-16 1998-02-26 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification

Also Published As

Publication number Publication date
CA2200605A1 (en) 1996-04-25
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