KR20010041591A - 효소원 핵산 검출 방법, 및 관련 분자 및 키트 - Google Patents

효소원 핵산 검출 방법, 및 관련 분자 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플을 프라이머, 및 촉매 핵산 서열을 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원과 접촉시킴을 포함하여, 표적이 존재하는 경우에 표적 및 촉매 분자의 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 하여, 샘플중 표적 핵산 서열을 검출하고 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열이 존재하는지를 동시에 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 최종적으로, 본 발명은 본 발명의 검출방법을 실시할 수 있는 분자 및 키트를 제공한다.

Description

효소원 핵산 검출 방법, 및 관련 분자 및 키트{Zymogenic nucleic acid detection methods, and related molecules and kits}
본 출원에서는, 다양한 간행물을 참고한다. 이들 간행물의 내용은 본 발명에 포함된 기술을 보다 상세하게 설명하기 위해 본 특허원에 참조문헌으로 혼입된다.
유전학, 질환 진단 및 법의학 분야에서는 시험관내 핵산 증폭 방법이 광범위하게 적용되고 있다. 지난 10년 동안, 공지된 핵산 서열("표적")을 증폭시키는 여러가지 기술이 제시된 바 있다. 여기에는 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; "PCR")(1 내지 7, 41), 쇄 치환 증폭 검정(strand displacement amplification assay; "SDA")(8), 전사-매개된 증폭(transcription-mediated amplification; "TMA")(9 및 10)[이는 또한 자체-지속 서열 복제(self-sustained sequence replication; "SSR")로도 공지됨]이 포함된다. PCR 및 SDA에 의해 생성된 증폭 산물("앰플리콘")은 DNA인 반면, TMA에 의해서는 RNA 앰플리콘이 생성된다. 이런 방법에 의해 생성된 DNA 또는 RNA 앰플리콘은 특정 질환과 관련된 핵산 서열의 마커로 사용할 수 있다.
몇 가지 방법으로 밀폐 시스템, 즉 단일 균질 반응 시스템에서 핵산을 증폭시키고 동시에 검출할 수 있다. 이런 방법에는 선라이즈(SunriseTM) 프라이머(11), 모르큘라 비콘스(Molecular Beacons)(12) 및 택맨(TaqmanTM) 시스템(13)이 포함된다. 밀봉된 균질한 튜브형을 이용하는 것이 증폭 반응 후 앰플리콘을 별도로 분석하는 것보다 몇 가지 점에서 유리하다. 밀폐 시스템 방법은 훨씬 적은 조작 과정으로 인하여 보다 신속하고 간단하다. 다른 반응으로부터의 앰플리콘에 의한 오염과 관련된 위양성(false positive) 잠재성을 배제할 수 있다. 균질 반응은 실시간으로 모니터할 수 있는데, 0시간때 시그널은 상기 시스템에서 기본 시그널 측정치이다. 따라서, 기본 시그널을 측정하기 위한 다른 대조 반응이 필요하지 않다. 시그널 강도의 변화는 샘플에 특정 핵산 서열의 증폭이 존재함을 암시한다.
표적 핵산 서열을 증폭시키는 대신에, 대안으로 리포터 시그널(reporter signal)을 증폭시키는 것이 포함된다. 측쇄화 DNA 검정(14)에서는 2차 리포터 분자(예: 알칼라인 포스파타제)를 이용하여 시그널을 증폭시키지만, 형광 상관 분광분석법(fluorescent correlation spectroscopy; FCS)에서는 시그널의 전기적 증폭을 이용한다(15).
다른 증폭 기술에서처럼, 최근 촉매 핵산이 집중 연구되고 있다. 치료제로서 촉매 핵산을 이용하여 유전자 기능을 억제시키는 잠재성은 문헌(16 내지 22)에서 광범위하게 논의되고 있다. 촉매 RNA 분자("리보자임")는 포스포디에스테르 결합 형성 및 절단을 촉매하는 것으로 밝혀졌다(16 및 23). 시험관내 발생 기술을 이용하여, 핵산의 절단(21, 22 및 24)과 연결(25), 포르피린 금속화(26), 및 탄소-탄소 결합의 형성(27), 에스테르 결합의 형성(28) 및 아미드 결합의 형성(29)을 포함하는 보다 광범위한 반응을 촉매할 수 있는 또 다른 핵산이 발견되었다.
리보자임은 RNA(16) 및 DNA(21) 분자 모두를 절단할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 촉매 DNA 분자("DNAzyme") 또한 RNA(17 및 24) 및 DNA(22 및 30) 분자를 절단할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 촉매 핵산은 표적 핵산 기질을 절단할 수 있는데, 단 상기 기질은 엄격한 서열 요건을 충족시켜야 한다. 표적 기질은 촉매 핵산의 하이브리드화 영역과 상보적이어야 하고, 절단 위치상에 특이적인 서열을 포함해야 한다. 절단 위치에서의 서열 요건의 예로는, DNAzymes("10-23 모델" 또는 "10-23 DNAzyme")(24) 부류의 경우에 퓨린:피리미딘 서열에 대한 요건과 해머헤드(hammerhead) 리보자임(16)의 경우에 서열 U:X에 대한 요건을 들 수 있는데, 이때 X는 A, C 또는 U일 수 있지만 G는 아니다.
치료적 잠재성 이외에, 촉매 핵산 분자는 유전자 진단 검정에서 분자 도구로 사용할 수 있다. 예를 들면, 리보자임을 사용하여, 2단계 방법으로 시그널을 증폭시킬 수 있다(31 내지 33). 제1 단계에서, 시험 샘플은 불활성 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨다. 이러한 접촉은 샘플에 표적 서열이 있는 경우, "유인" RNA 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 제2 단계에서, 유인 RNA 올리고뉴클레오티드는 증폭 캐스케이드(cascade)를 유도한다. 이러한 캐스케이드는, 검출되는 경우에 시험 샘플에 표적 서열이 존재한다는 것을 암시하는 다량의 촉매 활성 리포터 리보자임을 생성한다. 표적 서열 자체는 이 과정 동안에 증폭되지 않는다. 오히려, 리포터 시그널만 증폭된다.
요약하면, 표적 핵산 증폭과 이를 가능하게 하는 반응 조건은 공지되어 있다. 촉매 핵산 분자 및 이의 활성을 가능하게 하는 반응 조건 또한 공지되어 있다.
하지만, 단일 반응 환경에서, 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성의 동시 과정을 가능하게 하는 방법은 아직 없다. 게다가, 증폭 산물이 표적 및 촉매 핵산 분자에 대한 서열을 포함한 단일 핵산 분자인 경우, 표적 증폭 방법을 실시한 예는 없었다. 최종적으로, 표적 서열의 존재하에서만 이의 "센스" 촉매형으로 증폭되는 촉매 핵산 분자의 안티-센스 효소원 서열을 이용한 표적 증폭 방법은 지금까지는 없었다.
발명의 요약
본 발명은
(a) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성이 가능한 조건하에 샘플을,
(i) 표적 증폭을 개시하는데 적합한 DNA 프라이머 및
(ii) 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 DNA 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 표적이 존재하는 경우 표적과 촉매 핵산 분자의 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다)과 접촉시키고;
(b) 촉매 핵산 활성의 존재를 결정하고, 이로써 상기 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 결정함을 포함하여, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(a) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성이 가능한 조건하에 샘플을,
(i) 검출될 각 표적에 대해 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머가 하나 이상 존재하는 다수의 프라이머 및
(ii) 검출될 각 표적에 대해, 명백하게 측정가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원이 하나 이상 존재하는 다수의 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 상응하는 표적이 존재하는 경우 표적과 상응하는 촉매 핵산 분자 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다)과 접촉시키고;
(b) 각 촉매 핵산 활성의 존재를 동시에 결정하고, 이로써 상기 샘플에서 상응하는 표적 핵산 서열 각각의 존재를 결정함을 포함하여, 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열의 존재를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 프라이머가 효소원의 3'에 위치한, 프라이머 및 효소원을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머;
(b) 촉매 핵산 서열을 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 표적이 존재하는 경우 표적 및 촉매 핵산 분자 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다); 및
(c) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성을 가능하게 하는 시약을 포함하는, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
최종적으로, 본 발명은
(a) 검출될 각 표적에 대해 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머가 하나 이상 존재하는 다수의 프라이머;
(b) 검출될 각 표적에 대해, 명백하게 측정가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원이 하나 이상 존재하는 다수의 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 상응하는 표적이 존재하는 경우 표적 및 상응하는 촉매 핵산 분자 서열 둘다를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다); 및
(c) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성을 가능하게 하는 시약을 포함하는, 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 핵산 증폭을 통하여 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출하고 정량하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법으로, 촉매 핵산과 표적 서열 모두를 포함하는 단일 앰플리콘(amplicon)을 생성한다. 촉매 핵산은 표적이 존재하는 경우에만 이의 안티-센스 효소원 전구체로부터 합성된다.
도 1은 본 방법의 개략도를 나타낸 것이다. 여기서, 프라이머 및 효소원을 포함하는 핵산 분자는 표적 서열을 포함하는 게놈 DNA의 단편과 접촉시킨다. 이로써, 촉매 핵산 및 표적을 포함하는 제2 핵산 분자가 생성된다. 이 촉매 핵산 분자는 또한 검출가능한 기질을 절단한다.
정의
본 발명에서, 특정 용어는 다음과 같이 의미를 갖는 것으로 빈번히 사용된다. "촉매 핵산 분자", "촉매 핵산" 및 "촉매 핵산 서열"은 동의어이고, 각각은 별개의 기질을 특이적으로 인식하고 이 기질의 화학적 변형을 촉매하는 DNA 분자 또는 DNA-함유 분자(당해 분야에서는 "DNAzyme"으로 공지됨), 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자(당해 분야에서 "리보자임"으로 공지됨)를 의미한다. DNAzyme 및 리보자임상의 핵산 염기는 염기 A, C, G, T 및 U와 이들의 유도체일 수 있다. 이들 염기의 유도체는 당해 분야에 공지된 것으로, 참고문헌 40에 예시되어 있다.
표적 핵산 서열의 "증폭"은 (선형 증폭에 비하여) 이의 기하급수적 증폭을 의미하는데, 여기서 각 증폭 사이클은 바로 직전의 사이클에서 존재하는 표적 앰플리콘 수를 2배로 증가시킨다. 기하급수적 증폭 방법에는 PCR, SDA 및 TMA가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 기하급수적 증폭은 선형 증폭과는 상이한데, 선형 증폭에서 각 증폭 사이클은 바로 직전 사이클에서 존재하는 표적 앰플리콘의 수를 일정 수만큼 증가시킨다.
"리포터 기질", "화학적 기질" 및 "기질"은 동의어로, 각각은 촉매 핵산 분자에 의해 특이적으로 인식되고 변형되는 임의의 분자를 의미한다. "표적" 및 "표적 핵산 서열"은 동의어로, 각각은 본 방법에서 프라이머와 접촉하는 경우, 하이브리드화하고 완전한 분자 또는 이의 일부일 수 있는 서열을 포함하는, 본 발명에 의해 검출되고 측정되는 관심있는 핵산 서열을 의미한다. "프라이머"는 DNA 또는 DNA-함유 핵산 분자의 짧은 단편을 의미하는데, 이는 증폭 조건하에서, (i) 증폭될 DNA 또는 RNA 서열의 적합한 부분에 어닐링되고, (ii) 개시되어 폴리머라제 매개된 합성을 통해 그 자체가 물리적으로 확장된다. 최종적으로, "효소원"은 검출가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자의 안티-센스(즉, 상보적) 서열을 포함하는 핵산 서열을 의미하는데, 이의 전사 산물이 촉매 핵산 분자이다.
발명의 양태
본 발명은 샘플에서 관심있는 표적 핵산 서열을 검출하고 정량적으로 측정하는, 신속하고 유연성있는 방법을 제공한다. 이 방법은 단일 반응 용기에서, 촉매 핵산 활성을 통해 표적 증폭 및 검출을 동시에 실시할 수 있다는 점에서 독특하다. 또한, 증폭 산물이 표적 및 촉매 핵산 분자에 대한 서열을 포함하는 단일 핵산 분자라는 점에서 독특하다. 최종적으로, 본 방법은 최초로 표적 서열의 존재하에서만 이의 "센스" 촉매 형태로 증폭되는 촉매 핵산 분자의 안티-센스 효소원 서열을 사용한다.
보다 구체적으로, 본 발명은
(a) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성이 가능한 조건하에 샘플을,
(i) 표적 증폭을 개시하는데 적합한 DNA 프라이머 및
(ii) 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 DNA 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 표적이 존재하는 경우 표적과 촉매 핵산 분자의 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다)과 접촉시키고,
(b) 촉매 핵산 활성의 존재를 결정하고, 이로써 상기 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 결정함을 포함하여, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 단계(a)에서 수득한 샘플에서 촉매 핵산 활성의 양을 정량적으로 측정하는 단계 및 활성의 양을 공지된 표준과 비교 결정하여, 이로써 표적 핵산 서열의 양을 정량적으로 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 공지된 표준은 정량적인 측정에 사용되는 임의의 표준 또는 대조일 수 있다. 이들 표준의 예로는 (i) 공지된 반응 동역학 정보, (ii) 촉매 활성이 없거나 미리 측정된 촉매 활성 양을 포함한 샘플을 이용하여 수득한 시그널 수치가 포함된다.
한가지 양태에서, 프라이머 및 효소원은 개별 DNA 분자상에 존재하고, 프라이머 개시된 핵산 증폭은 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; 공지된 증폭 방법)이다. 다른 양태에서, 2개 이상의 DNA 분자는 프라이머 및 효소원을 모두 포함한다.
다른 양태에서, 샘플을 2개의 DNA 분자와 접촉시키는데, 각 분자는 프라이머를 포함하고, 적어도 한 분자는 프라이머가 효소원의 3'에 위치한 효소원을 포함한다.
상기 양태의 한가지 형태에서, 효소원에 의해 암호화되는 DNAzyme은 증폭된 동일 핵산 분자상에 실제적으로 잔류하는 서열을 인식하여 절단한다(즉, DNAzyme가 다른 분자상에 존재하는 기질을 절단하는 트랜스(trans) 절단과는 반대되는 시스(cis) 절단임). 보다 구체적으로, 증폭된 단일 핵산 분자는 증폭된 분자상에 함께 잔류하는 효소원-암호화된 촉매 핵산 DNAzyme에 의해 인식되어 시스 절단되는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
시스 DNAzyme-촉매된 절단을 이용한 본 발명의 바람직한 양태에서, 효소원-암호화된 DNAzyme은 10-23 DNAzyme이고, 본 방법의 단계(a)(i)에서 사용된 DNA 프라이머(즉, "키메라" 프라이머)는 10-23 DNAzyme에 의해 인식되고 시스 절단되는 부위의 5' 측면으로 작용하는 하나 이상의 퓨린 리보뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 키메라 프라이머상의 상기 퓨린 리보뉴클레오티드 잔기는 10-23 DNAzyme에 의한 절단에 필요하다. 따라서, 이런 키메라 프라이머를 사용하면, PCR 반응으로 10-23 DNAzyme 절단 위치를 생성할 수 있다. 키메라 프라이머는, 예를 들어 10-23 DNAzyme에 의해 인식되고 시스 절단되는 부위의 3' 측면으로 작용하는 리보뉴클레오티드 잔기를 또한 포함할 수 있다.
본 발명에서, 프라이머 및/또는 효소원을 포함하는 핵산 분자는, 예를 들면, 표적과 상보적인 서열과 같은 추가 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명에서 검출되거나 정량화되는 표적 서열은 임의의 핵산 서열일 수 있다. 한가지 양태에서, 표적 핵산 서열은 DNA 분자이다. 다른 양태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 분자이고, 단계(a)는 샘플을 프라이머 및 효소원과 접촉시키기 전에, 먼저 RNA 서열을 DNA로 역전사시키는 단계를 추가로 포함할 수 있따.
효소원에 의해 암호화되는 촉매 핵산 분자는 리보자임 또는 DNAzyme일 수 있다. 한가지 양태에서, 촉매 핵산 분자는 리보자임이다. 다른 양태에서, 촉매 핵산 분자는 DNAzyme이다.
본 방법에서 측정된 촉매 핵산 활성은 핵산 증폭 반응과 동일한 환경에서 동시에 발생할 수 있는(그리고, 임의로 측정될 수 있는) 임의의 활성이다. 촉매 핵산 활성은, 예를 들어 검출가능한 화학적 기질의 변형을 포함할 수 있는데, 여기서 변형은 포스포디에스테르 결합 형성 및 절단, 핵산 연결 및 절단, 포르피린 금속화, 및 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 및 아미드 결합의 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한가지 양태에서, 검출가능한 화학적 기질 변형은 형광 표지된 핵산 분자, 바람직하게는 DNA/RNA 키메라의 절단이다.
바람직한 양태에서, 리포터 기질은 절단되고, 이런 절단을 측정하는 것은 촉매 활성을 측정하는 한가지 방법이다. 예를 들어, 절단된 기질의 존재는 리포터 기질이 방사능 표지된 경우에만 겔 전기영동후의 포스포르이미징(phosphorimaging)으로 모니터할 수 있다. 절단된 기질의 존재는 기질내에서 절단 부위의 반대면에 혼입되어 있는 플루오로/퀀처(quencher) 분자의 분리에 의해 생성되는 형광 변화로 모니터할 수 있다. 이런 시스템은 실시간으로 모니터할 수 있는 균질 분석 기회를 제공한다. 형광 변화를 모니터하기 위한 방법은 당분야에 공지된 것이다. 예를 들면, 이런 방법에는 나안으로 관찰하거나 분광광도계를 이용한 모니터링이 포함된다.
표적 핵산 서열은 임의의 유기체로부터 수득할 수 있고, 샘플은 핵산 분자를 포함하거나 또는 이를 포함하는 것으로 추정되는 임의의 조성물일 수 있다. 한가지 양태에서, 표적은 식물 또는 동물(예: 마우스, 랫트, 기니피그, 흰족제비, 토끼 및 영장류)에서 수득한 것이다. 또 다른 양태에서, 표적은 물 또는 토양과 같은 공급원으로부터 수득한 샘플내 존재한다. 또 다른 양태에서, 박테리아, 바이러스 또는 미코플라스마(Mycoplasma)를 포함한 샘플로부터 표적을 수득한다.
적절한 양태에서, 사람으로부터 표적을 수득한다. 본 방법은, 예를 들면 공공 보건 및 법의학을 포함한 다양한 목적에 사용할 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명은 진단 목적으로 사용한다. 특히, 본 발명은, 질환이 없는 경우 존재하지 않는 하나 이상의 표적 핵산 서열이 존재하는 것이 특징인 질환을 개체에서 진단하는데 사용할 수 있다. 이런 질환은 당해 분야에 익히 공지된 것으로, 예로는, 암, 낭포성 섬유증 및 각종 이상 헤모글로불린증을 들 수 있다. 본 발명은 감염성 물질의 존재와 관련된 질환을 진단하는데 또한 사용할 수 있다. 이런 질환에는, 예를 들어 AIDS, C형 간염 및 결핵이 포함된다. 적절한 양태에서, 진단되는 개체는 사람이고, 질환은 암이다.
다른 양태에서, 표적 핵산 분자의 존재 또는 양을 검사할 샘플은 공공보건 목적으로 수집한 샘플이다. 이런 샘플의 예로는 유해한 병원균, 예를 들면, 박테리아, 바이러스 및 미코플라스마를 포함한 물, 음식 및 토양을 들 수 있다.
또 다른 양태에서, 표적 핵산 분자의 존재 또는 양을 검사할 샘플은 법의학 샘플이다. 이런 샘플의 예로는 범죄 현장과 같은 임의의 공급원으로부터 수득할 수 있는 체액, 조직 및 세포가 포함된다.
본 발명은 또한,
(a) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성이 가능한 조건하에 샘플을,
(i) 검출될 각 표적에 대해 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머가 하나 이상 존재하는 다수의 프라이머 및
(ii) 검출될 각 표적에 대해, 명백하게 측정가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원이 하나 이상 존재하는 다수의 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 상응하는 표적이 존재하는 경우 표적과 상응하는 촉매 핵산 분자 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다)과 접촉시키고;
(b) 각 촉매 핵산 활성의 존재를 동시에 결정하고, 이로써 상기 샘플에서 상응하는 표적 핵산 서열 각각의 존재를 결정함을 포함하여, 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열의 존재를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
한가지 양태에서, 다수의 표적의 존재를 동시에 검출하는 방법은 단계(a)에서 생성된 샘플에서 각 촉매 핵산 활성의 양을 정량적으로 측정하는 단계 및 각 활성의 양을 공지된 표준과 비교 결정하여, 이로써 표적 핵산 서열의 양을 정량적으로 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명에 의해 동시 검출할 수 있는 다수의 표적의 예는 참고문헌 39에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 프라이머가 효소원의 3'에 위치한, 프라이머 및 효소원을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 상기 분자는 본 방법에 따라 사용할 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머;
(b) 촉매 핵산 서열을 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 표적이 존재하는 경우 표적 및 촉매 핵산 분자 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다); 및
(c) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성을 가능하게 하는 시약을 포함하는, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
최종적으로, 본 발명은
(a) 검출될 각 표적에 대해 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머가 하나 이상 존재하는 다수의 프라이머;
(b) 검출될 각 표적에 대해, 명백하게 측정가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원이 하나 이상 존재하는 다수의 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 상응하는 표적이 존재하는 경우 표적 및 상응하는 촉매 핵산 분자 서열 둘다를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다); 및
(c) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성을 가능하게 하는 시약을 포함하는, 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
한가지 양태에서, 본 키트는 핵산 분자의 샘플을 개체 또는 샘플로부터 분리하는데 유용한 시약을 추가로 포함한다. 본 키트에서 구성성분은 구입하거나 하기의 실험 부분에서 예시한 바와 같이 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 본 키트의 구성성분은 용액중에 존재하거나 적절하게 동결건조될 수 있다. 한가지 양태에서, 구성성분은 동일 구획에 존재하고, 다른 구체예에서, 구성성분은 다른 구획에 존재한다. 적절한 구체예에서, 키트는 사용 안내서를 추가로 포함한다.
본 발명 및 키트에서, 핵산 증폭은 당해 분야에 공지된 적당한 방법에 따라 실시할 수 있는데, 바람직하게는 PCR, SDA 및 TMA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한가지를 따른다.
본 발명에 관련된 다수의 방법은 당해 분야의 통상의 숙련가에게 공지된 것이다. 여기에는 페놀 클로로포름 추출, 신속한 세포용해(lysis), 칼럼 포획을 포함하여 핵산 분자를 분리하는 방법(34 내지 38); 핵산 분자를 검출하고 정량하는 방법; 촉매 핵산 활성을 검출하고 정량하는 방법; PCR, SDA 및 TMA(SSR)를 포함한 핵산 서열을 증폭시키는 방법(1 내지 10 및 41); 특정 표적 서열을 증폭시키기 위한 프라이머 고안 및 제조방법; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 형광 공명 에너지 전달(fluorescent resonance energy transfer; FRET)(25 및 31)을 포함하여, 촉매 핵산 분자가 증폭된 핵산 단편을 절단하는지를 확인하는 방법이 포함된다.
본 발명의 실험적인 실시예를 참고로 하면 보다 효율적으로 이해될 수 있을 것이지만, 당해 분야의 숙련가라면 특정 실험은 단지 설명만을 위한 것임을 용이하게 인지할 것이다.
실시예 1
종양 세포 DNA에서 K-ras의 검출
A. PCR 프라이머
3개의 PCR 프라이머(5KID, 3K2Dz3, 3K2)는 올리고스 엑트 인코포레이티드(Oligos Etc., Inc.; Wilsonville, OR, USA)에서 합성하였다. 5' PCR 프라이머(5KID)는 사람 K-ras 유전자와 상보적이다. 3'프라이머 3K2Dz3은 효소원 PCR 프라이머로, (a) 활성 DNAzyme과 상보적인 촉매 불활성 안티센스 서열을 포함한 5' 영역 및 (b) 사람 K-ras 유전자와 상보적인 3' 영역을 포함한다. 5KID와 3K2Dz3을 이용한 PCR 증폭 동안에, 5KID의 확장에 의해 생성된 앰플리콘은 K-ras 서열과 이의 3' 영역에 혼입된 DNAzyme의 촉매 활성 센스 복제본을 모두 포함한다. 활성 DNAzyme은 RNA/DNA 리포터 기질(Sub 1)을 절단하도록 고안한다. 프라이머 3K2는 대조 프라이머로, 3K2Dz3에 혼입된 것과 동일한 K-ras-특이적 서열을 포함한다. 하지만, 이 프라이머는 효소원 서열을 포함하지는 않는다. PCR 프라이머의 서열은 아래에 제시한다. 밑줄친 서열은 사람 K-ras 유전자와 상보적이고, 굵은 글씨체의 서열은 활성 DNAzyme와 상보적인 불활성 (안티센스) 서열이다.
5KID (5' K-ras 프라이머)
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATA
3K2Dz3 (3' K-ras 효소원 프라이머)
GAGAACTGCAATTCGTTGTAGCTAGCCTTTCAGGACCCACGTCCACAAAATGATTCTGA
3K2 (대조 반응용 3' K-ras 프라이머)
CGTCCACAAAATGATTCTGA
B. 리포터 기질
리포터 기질(Sub 1)은 올리고스 엑트 인코포레이티드(Oligos Etc., Inc. ; Wilsonville, OR, USA)에서 합성하였다. Sub 1은 RNA(굵은 글씨, 밑줄) 및 DNA 염기를 모두 포함한 키메라 분자다. 이는, PCR 동안에 DNA 폴리머라제에 의한 이의 확장을 방지하는 3' 인산 그룹을 포함한다. Sub 1은 표준 기술(34)에 의해32P로 5' 말단 표지시킨다. Sub 1 서열은 아래에 나타내었다.
Sub 1
GAGAACTGCAAUGUUTCAGGACCCA
C. 대조 절단 반응을 위한 DNAzyme
DNAzyme Dz3a는 올리고스 엑트 인코포레이티드(Oligos Etc., Inc.; Wilsonville, OR, USA)에서 합성하였다. 이 DNAzyme는 효소원 프라이머 3K2Dz3을 이용한 PCR 증폭 동안에 생성된 활성 DNAzyme에 의해 절단되는 동일 서열에서 Sub 1을 절단하도록 고안한다. Dz3a의 서열은 아래에 나타내었다.
Dz3a
TCCTGAAAGGCTAGCTACAACGAATTGCAGT
D. 종양 세포주로부터 게놈 DNA의 제조
사람 세포주 K562는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; Rockville, MD)에서 수득하였다. K562는 야생형 K-ras 서열을 포함하는 백혈병 세포주이다. 게놈 DNA는 양이온성 중합체 추출(38)로 제조한다.
E. K-ras 유전자의 PCR 증폭
K562로부터 분리한 게놈 DNA는 PCR을 이용하여 증폭시킨다. 반응물(A1 및 A2)은 100mM NaCl, 50mM Tris(pH 8.3, 25℃) 및 8mM MgCl2중에서, 게놈 DNA(500 ng), 50 pmole 5KID, 1 pmole 3K2Dz3, 50 fmole32P-표지된 Sub 1 및 각각 100uM의 dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP)을 포함한다. 택(Taq) DNA 폴리머라제(5유니트/㎕; AmpliTaq, Perkin Elmer) 6유니트는 항체 희석 완충액(Clontech) 1.8㎕중에서 택스타트(TaqStartTM) 항체(1.1㎎/㎖, Clontech) 2㎕와 혼합한다. 택(Taq) DNA 폴리머라제:택스타트(TaqStartTM) 항체 혼합물은 PCR 혼합물에 첨가하기 전에, 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 전체 반응 용적은 50㎕이다. 제1 음성 대조 반응물(B)은 게놈 DNA를 제외한 모든 반응 성분을 포함한다. 제2 음성 대조 반응물(C)은 3K2Dz3이 1 pmole 3K2로 대체된 것을 제외하고는 모든 반응 성분을 포함한다. 양성 대조 절단 반응물(D)은 30 pmole Dz3a + 대조 반응물(C)에 존재하는 모든 반응 성분을 포함한다. 반응물은 젠엠프 PCR 시스템 9600(GeneAmp PCR system 9600; Perkin Elmer)에 두고, 94℃에서 2분 동안 변성시킨 다음, 92℃에서 20초 동안 및 58℃에서 30초 동안 사이클을 20회 반복하고, 이후 92℃에서 20초 동안, 74℃에서 1초 동안 및 40℃에서 20초 동안 사이클을 20회 반복한다.
F. 절단된 리포터 기질 Sub 1의 검출
각 반응물의 3㎕ 분취량은, 16% 변성된 폴리아크릴아미드 겔상에서의 전기영동에 의한 후속적인 조작없이 분석한다. 겔은 포스포르이미저:445 S1(Molecular Dynamics)상에서 포스포르이미지화시켜 가시화한다. 방사능 표지된 25-염기 Sub 1 리포터 기질은 절단되어 양성 대조 절단 반응물 D중에서 13개 염기의 방사능 표지된 단편을 생성한다. 동일한 13개 염기 단편은 게놈 DNA 및 효소원 프라이머 3K2Dz3을 포함한 PCR 산물 A1 및 A2에 존재하는데, 이는 PCR에 의한 K-ras 유전자 증폭이 성공적임을 나타낸다. 음성 대조 반응물 B(게놈 DNA 포함하지 않음)에서, 단지 25개 염기 단편만이 확실한데, 이는 표적 DNA의 증폭이 없으면 기질의 절단이 일어나지 않음을 나타낸다. 최종적으로, 음성 대조 반응물 C에서, 효소원 프라이머가 K-ras 서열만을 포함한 프라이머로 대체되는 경우, 활성 DNAzyme가 이 반응에서 생성되지 않기 때문에 기질이 절단되지 않는다.
실시예 2
형광성 리포터 기질의 절단
A. 리포터 기질
리포터 기질, SubCz2는 올리고스 엑트 인코포레이티드(Oligos Etc., Inc.; Wilsonville, OR, USA)에서 합성하였다. SubCz2의 서열은 아래에 나타내었다. SubCz2는 RNA(아래쪽) 및 DNA 뉴클레오티드를 모두 포함한 키메라 분자다. 이는, PCR 동안에 DNA 폴리머라제에 의해 확장되는 것을 방지하는 3' 인산 그룹을 포함한다. SubCz2는 5' 뉴클레오티드(굵은 글씨, 밑줄)에 부착된 6-카복시플루오레신("6-FAM") 잔기와 제1 "T" 디옥시리보뉴클레오티드(굵은 글씨, 밑줄) 3'에 부착된 N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민("TAMRA") 잔기를 사용하여 RNA 염기에 대해 합성한다. 리포터 기질의 절단은 485nm(FAM 여기 파장)에서 여기시키면서 530nm(FAM 방출 파장)에서 모니터할 수 있다.
SubCz2
5' CCACTCguATTAGCTGTATCGTCAAGCCACTC 3'
B. PCR 프라이머
2개의 PCR 프라이머는 브레사텍 피티와이 리미티드(Bresatec Pty. Ltd.; Adelaide, SA, Australia) 또는 퍼시픽 올리고스 피티와이 리미티드(Pacific Oligos Pty. Ltd.; Lismore, NSW, Australia)에서 합성하였다. 5' PCR 프라이머(5K49)는 사람 K-ras 유전자와 상보적이다. 3' 프라이머(3K45Zc2)는 효소원 PCR 프라이머로, (a) 활성 DNAzyme의 촉매 불활성 안티센스 서열을 포함한 5' 영역 및 (b) 사람 K-ras 유전자에 상보적인 3'영역을 포함한다. 5K49 및 3K45Zc2를 이용한 PCR 증폭 동안에 5K49 확장에 의해 생성된 앰플리콘은 K-ras 서열과 이들의 3' 영역에 혼입된 DNAzyme의 촉매 활성 센스 복제본을 모두 포함한다. 활성 DNAzyme은 RNA/DNA 리포터 기질 SubCz2를 절단하도록 고안한다. PCR 프라이머 서열은 아래에 나타내었다. 서열의 밑줄친 부분은 사람 K-ras 유전자와 상보적이고, 굵은 글씨로 나타낸 서열은 활성 DNAzyme와 상보적인 불활성(안티센스) 서열이다.
5K49 (5' K-ras 프라이머)
5' CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAA 3'
3K45Zc2 (3' K-ras 효소원 프라이머)
5' CCACTCTCGTTGTAGCTAGCCT
ATTAGCTGTATCGTCAAGCCACTCTTGC 3'
C. 종양 세포주로부터 게놈 DNA의 제조
사람 세포주 K562는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; Rockville, MD)에서 입수하였다. K562는 야생형 K-ras 서열을 포함한 백혈병 세포주이다. 게놈 DNA는 양이온성 중합체 추출(38)로 제조한다.
D. K-ras 유전자의 PCR 증폭
K562로부터 분리한 게놈 DNA는 PCR로 증폭시킨다. 반응물은 20 pmole 5K49, 3 pmole 3K45Zc2, 10 pmol SubCz2, 8mM MgCl2, 100uM의 각 dATP, dCTP, dTTP, dGTP 및 1 x 완충액(75mM KCl, 10mM Tris pH 8.3, 25℃)를 함유한다. PCR에 사용된 모든 용액은 DEPC 처리한 물로 제조한다. 택(Taq) DNA 폴리머라제(5유니트/㎕ AmpliTaq, Perkin-Elmer) 3유니트는 택스타트(TaqStartTM) 항체(Clontech)와 혼합하여 택(Taq) DNA 폴리머라제:택스타트(TaqStartTM) 항체의 최종 몰비가 1:10이 되게 한다. 택(Taq) DNA 폴리머라제:택스타트(TaqStartTM) 항체 혼합물은 PCR 혼합물에 첨가하기 전에, 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 전체 반응 용적은 50㎕로 제조한다. K562 게놈 DNA 500ng을 함유한 복제 반응물을 준비한다. 대조 반응물은 게놈 DNA를 제외한 모든 반응 성분을 포함한다. 반응물은 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템(ABI Prism 7700 Sequence Detection System)에 두고, 40℃에서 1분 동안 항온처리하고(기저선 표시), 94℃에서 3분 동안 변성시키고 70℃에서 1분 동안 사이클을 20회 반복한 다음, 94℃에서 5초 동안 항온처리한다. 추가로, 40℃에서 1분 동안 사이클을 50회 반복한 다음, 94℃에서 5초 동안 항온처리한다.
형광은 PCR의 어닐링/확장 단계 동안에 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템(ABI Prism 7700 Sequence Detection System)에서 측정한다. 게놈 DNA와의 반응은, 대조 반응에서 관찰된 형광보다 530nm에서 FAM 형광이 증가됨을 나타낸다. 이런 형광 증가를 이용하여, PCR 동안의 K-ras 앰플리콘의 증폭을 모니터한다. 이들 결과로, 균질 증폭 및 간단한 형광 형태로 실시간 검출을 용이하게하는데 효소원 PCR을 이용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3
변이 대립유전자를 구별하기 위한 효소원의 용도: K-ras 코돈 12에서의 돌연변이의 검출
A. 전략
효소원 프라이머를 이용한 PCR을 점 돌연변이 분석에 이용할 수 있다. 본 실시예에서, 효소원 프라이머는 PCR 동안에 활성 DNAzyme의 합성을 용이하게한다. 이들 DNAzyme은 이의 하이브리드화 암(hybridizing arm)이 K-ras내 코돈 12의 1번 위치와 완전하게 상보적인 경우에만, PCR 앰플리콘을 시스 절단하도록 고안하였다. 왈더 등(Walder et al.,41)은 택(Taq) DNA 폴리머라제가 하나 또는 두개의 3' 말단 리보스 잔기를 포함한 DNA/RNA 키메라 프라이머를 확장할 수 있음을 이미 보고한 바 있다. 이들 키메라 프라이머를 여기에 사용하여, 10-23 DNAzyme에 대한 기질로서 작용하는 PCR 앰플리콘을 생성한다.
5' DNA/RNA 키메라 프라이머(5K42r) 및 3'효소원 프라이머(3K42Dz2)를 이용한 PCR로 K-ras 영역을 증폭시킨다. 5K42r은 코돈 12에 인접한 K-ras 서열과 하이브리드화하고, 잠재적 DNAzyme 절단 부위를 형성하는 퓨린:피리미딘 잔기를 포함한다. 효소원 프라이머 3K42Dz2는 K-ras와 상보적인 3' 영역 및 DNAzyme의 안티센스를 포함한 5' 영역을 포함한다. 효소원 프라이머 자체는 고유의 촉매 활성이 없지만, 5K42r과 접합하여 사용하는 경우, (a) 이들의 5' 말단 근처의 DNAzyme 절단 부위 및 3' 말단에 활성(센스) DNAzyme를 갖는 앰플리콘을 쉽게 만들 수 있다. 이런 DNAzyme은 앰플리콘의 5'말단을 시스 절단하도록 고안한다. DNAzyme의 5' 암은 코돈 12에서의 야생형 서열과 완전하게 상보적이다. K-ras 코돈 12에 돌연변이가 일어나면 5' DNAzyme 부분과 미스매치가 발생하는데, 이로써 DNAzyme 절단의 효율이 상당히 감소될 것으로 예상된다.
B. 프라이머 서열
5' 키메라 프라이머 5K42r
(상위-데옥시리보뉴클레오티드 잔기; 하위-리보뉴클레오티드 잔기)
5' TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcT 3'
3' 효소원 프라이머 3K42Dz2
(진한 부분은 10:23 촉매 코어의 상보체)
5' ACTTGTGGTAGTTGGATCGTTGTAGCTAGCCCTGGTGGCAGCTGTATCGTCAAGGCACTC 3'
프라이머는 퍼시픽 올리고스 피티와이 리미티드(Pacific Oligos Pty. Ltd.; Lismore, NSW, Australia) 또는 올리고스 엑트 인코포레이티드(Oligos Etc., Inc.; Wilsonville, OR, USA)에서 합성하였다. 5' 프라이머 5K42r은 20uM 프라이머 25㎕ 를 폴리뉴클레오티드 키나아제(10 x 103U/㎖, 3'-포스파타제 비함유; Boehringer Mannheim) 2.5㎕, rRNasin(40U/㎕ 재조합 rRNasinR, 리보뉴클레아제 억제제; Progema) 2.5㎕, 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액(Boehringer Mannheim) 5㎕, g-32P 아데노신 5' 트리포스페이트(2.5uM, Stable Label GolaTM; Bresatec) 10㎕ 및 DEPC 물 5㎕로 37℃에서 30분 동안 항온처리하여 g-32P로 5' 말단을 표지한다.
C. K-ras DNA주형
야생형(GGT) 또는 코돈 12에서 돌연변이된(CGT 또는 AGT) K-ras 엑손 1 서열을 포함한 pUC 18 플라스미드 벡터를 PCR용 DNA 주형으로 사용한다.
D. 효소원 PCR에 의한 증폭 및 반응 동안에 합성된 DNAzyme에 의한 절단
PCR 혼합물은 0.2pg/㎕ K-ras 플라스미드 DNA, 10 pmole g-32P-표지된 5K42r, 2 pmole 3K42Dz2, 1mM DTT, 8mM MgCl2, 각각 100uM의 dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0.4U/㎕ rRNasinR및 1 x 완충액 (100mM NaCl, 50 mM Tris pH 8.3, 25℃)를 포함한다. 각 DNA 주형에 대한 복제 반응물을 준비한다. 택(Taq) DNA 폴리머라제(5유니트/㎕ AmpliTaq, Perkin-Elmer) 6유니트는 택스타스(TaqStartTM) 항체(Clontech)와 혼합하여, 택(Taq) DNA 폴리머라제:택스타트(TaqStartTM) 항체의 최종 몰비가 1:5가 되게한다. 택(Taq) DNA 폴리머라제:택스타트(TaqStartTM) 항체 혼합물은 PCR 혼합물에 첨가하기 전, 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 최종 반응 용적은 50㎕이다. 반응물은 젠앰프 PCR 9600(GeneAmp PCR 9600; Perkin-Elmer)에 두고, 94℃에서 2분 동안 변성시키고 60℃에서 1분 동안 사이클을 30회 반복한 다음, 94℃에서 20초 동안 처리한다. 반응물은 추가로, 50℃에서 1분 동안 사이클을 10회 반복한 다음, 94℃에서 20초 동안 처리한다.
각 반응물의 2.5㎕ 분취량을 적하된 염료(97.5% 포름아미드, 0.1% 크실렌 시아놀, 0.1% 브로모페놀 블루 및 0.01M EDTA) 2.5㎕와 혼합하고, 75℃에서 2분 동안 항온처리한 다음, 미리가온한 16% 변성(요소)아크릴아미드 겔에 바로 적하한다. 겔을 대략 1시간 동안 전기영동하고, PCR 산물 및 절단 단편은 모르큘라 다이나믹 포스포르이미저 445 S1(Molecular Dynamic Phosphorimager 445 S1)을 이용하여 겔을 스캔함으로써 가시화한다.
몇 개의 밴드가 겔상에서 보인다(데이터는 나타내지 않음). 가장 느린 것으로부터 가장 빠른 단편(처음부터 겔의 바닥까지)의 이동 순서는 (a) PCR 앰플리콘(이중으로 이동), (b) 혼입되지 않은 프라이머 및 (c) 절단된 PCR 앰플리콘이다. 5' 프라이머내 리보뉴클레오티드 잔기에서 기본 가수분해에 의해 생성된 2개의 소량 단편은 프라이머와 절단된 앰플리콘 사이에서 움직이고, 절단된 앰플리콘과 평행하게 움직이는 것으로 관찰되었다. 모든 반응물에서, PCR 산물 및 혼입되지 않은 프라이머가 가시화된다. 코돈 12에서 야생형인 주형 DNA(즉, DNAzyme와 완전 상보적인 것들)를 포함한 반응물은 절단된 앰플리콘을 포함한다. 코돈 12에서 돌연변이된 주형 DNA(즉, DNAzyme와 미스매치된 것들)를 포함한 반응물은 절단된 앰플리콘을 포함하지 않는다. 이들 반응물에서는, 겔상의 상기 위치에서 극히 낮은 수준의 기본 가수분해 산물만이 가시화된다.
아래의 서열은 코돈 12의 1번 위치(밑줄)에서 야생형인 앰플리콘으로, 여기서 DNAzyme(굵은 글씨)는 시스로 하이브리드화된다.
본 발명을 기본으로 하고 통상의 프라이머 고안 방법을 이용하여, 돌연변이 K-ras 서열을 특이적으로 절단하는 DNAzyme을 생성할 수 있는 효소원 프라이머를 용이하게 고안할 수 있다.
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Claims (25)

  1. (a) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성이 가능한 조건하에 샘플을,
    (i) 표적 증폭을 개시하는데 적합한 DNA 프라이머 및
    (ii) 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 DNA 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 표적이 존재하는 경우 표적과 촉매 핵산 분자의 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다)과 접촉시키고,
    (b) 촉매 핵산 활성의 존재를 결정하고, 이로써 상기 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 결정함을 포함하여, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계(a)에서 생성된 샘플에서 촉매 핵산 활성의 양을 정량적으로 측정하는 단계, 측정된 활성의 양을 공지된 표준과 비교하는 단계 및 이로써 표적 핵산 서열의 양을 정량적으로 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 프라이머 및 효소원이 별개의 DNA 분자상에 위치하고, 프라이머 개시된 핵산 증폭이 롤링 서클 증폭인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 샘플을 2개의 DNA 분자와 접촉시키며, 이때 각각의 분자는 프라이머를 포함하고, 하나 이상의 분자가 효소원의 3'에 프라이머가 위치하는 효소원을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계(a)(ii)에서 생성된 증폭된 단일 핵산 분자가, 증폭된 분자상에 공존하는 효소원-암호화된 촉매 핵산에 의해 인식되고 시스 절단되는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 효소원-암호화된 촉매 핵산이 10-23 DNAzyme이고 단계(a)(i)의 DNA 프라이머가, 10-23 DNAzyme에 의해 인식되고 시스 절단되는 위치의 5' 측면으로서 작용하는 퓨린 리보뉴클레오티드 잔기를 하나 이상 포함하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 2개 이상의 DNA 분자가 프라이머 및 효소원을 모두 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열이 DNA 분자인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열이 RNA 분자이고, 단계(a)가 프라이머 및 효소원을 샘플과 접촉시키기 전에, 표적 핵산 서열이 존재하는 경우, 이를 DNA로 역전사시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 촉매 핵산 분자가 리보자임인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 촉매 핵산 분자가 DNAzyme인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 촉매 핵산 활성이, 포스포디에스테르 결합 형성 및 절단, 핵산 연결 및 절단, 포르피린 금속화, 및 탄소-탄소 결합 형성, 에스테르 결합 형성 및 아미드 결합 형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 검출가능한 화학적 기질의 변형을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 검출가능한 화학적 기질의 변형이 형광 표지된 핵산 분자의 절단인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 형광 표지된 핵산 분자가 DNA/RNA 키메라인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열이 사람, 박테리아, 미코플라즈마 및 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유기체의 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 표적 핵산 서열이 사람의 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 샘플내 표적 핵산 서열의 존재가 유전자 질환의 지표가 되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 샘플이 법의학적 샘플인 방법.
  19. (a) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성이 가능한 조건하에 샘플을,
    (i) 검출될 각 표적에 대해 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머가 하나 이상 존재하는 다수의 프라이머 및
    (ii) 검출될 각 표적에 대해, 명백하게 측정가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원이 하나 이상 존재하는 다수의 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 상응하는 표적이 존재하는 경우 표적과 상응하는 촉매 핵산 분자 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다)과 접촉시키고;
    (b) 각 촉매 핵산 활성의 존재를 동시에 결정하고, 이로써 상기 샘플에서 상응하는 표적 핵산 서열 각각의 존재를 결정함을 포함하여, 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열의 존재를 동시에 검출하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계(a)에서 생성된 샘플에서 각각의 촉매 핵산 활성의 양을 정량적으로 측정하는 단계, 측정된 각각의 활성 양을 공지된 표준과 비교하는 단계 및 이로써 각각의 표적 핵산 서열의 양을 정량적으로 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 프라이머가 효소원의 3'에 위치한, 프라이머 및 효소원을 포함하는 DNA 분자.
  22. 제1항 또는 제19항에 있어서, 핵산 증폭이 PCR, SDA 및 TMA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법에 따라 수행되는 방법.
  23. (a) 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머;
    (b) 촉매 핵산 서열을 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 표적이 존재하는 경우 표적 및 촉매 핵산 분자 서열 모두를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다); 및
    (c) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성을 가능하게 하는 시약을 포함하는, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트.
  24. (a) 검출될 각 표적에 대해 표적의 증폭을 개시하는데 적합한 프라이머가 하나 이상 존재하는 다수의 프라이머;
    (b) 검출될 각 표적에 대해, 명백하게 측정가능한 활성을 포함하는 촉매 핵산 분자를 암호화하지만 자체가 이의 안티-센스 서열인 효소원이 하나 이상 존재하는 다수의 효소원(이때, 프라이머 및 효소원은, 상응하는 표적이 존재하는 경우 표적 및 상응하는 촉매 핵산 분자 서열 둘다를 포함하는 증폭된 단일 핵산 분자를 생성하도록 서로에 대해 위치한다); 및
    (c) 프라이머 개시되는 핵산 증폭 및 촉매 핵산 활성을 가능하게 하는 시약을 포함하는, 샘플에서 다수의 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 키트.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 핵산 증폭이 PCR, SDA 및 TMA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법에 따라 수행되는 키트.
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