DE19811618C1 - Ribozym codierende DNA und ein Oligonucleotidsubstrat enthaltende Zusammensetzung und Verfahren zur Messung von Transkriptionsraten - Google Patents

Ribozym codierende DNA und ein Oligonucleotidsubstrat enthaltende Zusammensetzung und Verfahren zur Messung von Transkriptionsraten

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Abstract

Beschrieben werden Zusammensetzungen (Reportersysteme), die eine ein Ribozym codierende DNA-Sequenz enthalten und ein Oligonucleotidsubstrat, das von dem von der DNA-Sequenz transkribierten Ribozym gespalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonucleotidsubstrat mit einer fluorophoren Gruppe (Reportergruppe) und einer fluoreszenz-löschenden Gruppe (Quenchergruppe) markiert, wobei nach Spaltung mit dem Ribozym die Löschung der Fluoreszenz des Fluorophors durch die Fluoreszenz-löschende Gruppe unterbunden ist, also ein Fluoreszenzsignal erzeugt wird. Ferner werden Verfahren zur Messung von Transkriptionsraten beschrieben, beispielsweise zur Bestimmung von Hemmstoffen der Transkription oder Transkriptionsaktivatoren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen (Repor­ tersysteme), die eine ein Ribozym, bevorzugt ein Hammer­ headribozym, codierende DNA-Sequenz enthalten und ein Oligo­ nucleotidsubstrat, das von dem von der DNA-Sequenz transkri­ bierten Ribozym gespalten wird. In einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform ist das Oligonucleotidsubstrat mit einer fluoro­ phoren Gruppe (Reportergruppe) und einer fluoreszenzlöschen­ den Gruppe (Quenchergruppe) markiert, wobei nach Spaltung mit dem Ribozym die Löschung der Fluoreszenz des Fluorophors durch die fluoreszenzlöschende Gruppe unterbunden ist, also ein Fluoreszenzsignal erzeugt wird. Ferner betrifft die vor­ liegende Erfindung Verfahren zur Messung von Transkriptions­ raten, beispielsweise zur Bestimmung von Hemmstoffen der Transkription oder Transkriptionsaktivatoren, unter Verwen­ dung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Die Mechanismen eukaryontischer und prokaryontischer Trans­ kription werden in der Regel mit Verfahren untersucht, bei denen die mRNA zellfrei, d. h. unter Verwendung entsprechend aufbereiteter Zellextrakte, in vitro synthetisiert wird ("In vitro-Transkription"). Für die Herstellung von Transkripten werden dabei speziell entwickelte Transkriptionsvektoren eingesetzt, die zusätzlich zum Reportergen auch den Promotor für eine entsprechende RNA-Polymerase tragen. Soll bei­ spielsweise der Einfluß bestimmter Transkriptionsaktivatoren auf die Transkription untersucht werden, so muß die mRNA des codierenden Reportergens mit geeigneten Methoden nachweisbar und quantifizierbar sein. Im allgemeinen werden dem Zellex­ trakt dazu radioaktiv markierte Nucleosidtriphosphate beige­ fügt, welche in die entstehende mRNA eingebaut werden. Die radioaktiv markierte mRNA wird dann aus dem Zellextrakt iso­ liert, auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufge­ trennt und durch Autoradiographie visualisiert und quantifi­ ziert (T. Maniatis, E. Fritsch, J. Sambrook, Molecular cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982), 6.45). Ein alternatives Verfahren, die sog. "Dot-Hybridisations-Technik", nutzt radioaktiv mar­ kierte RNA-Sonden zum Nachweis der in vitro transkribierten mRNAs (J. Flores et. al., Lancet 1 (1983), 555-558). Prinzi­ piell besteht auch die Möglichkeit, die Transkription indi­ rekt über die Aktivität des Luciferase-Enzyms zu detektie­ ren, indem die Transkription des Luciferase-Reporter-Gens an ein in vitro Translationssystem gekoppelt ist.
Die WO 97/26333 beschreibt synthetische und humanisierte Gene des grünfluoreszierenden Proteins (GFP), die so verändert sind, daß sie zu hohen Expressionsraten in menschlichen Zellen führen. Weiterhin ist auch ein Verfahren zum Nachweis eines Stoffes beschrieben, der die Transkription des Gens mit einem ausgewählten Promotor in einer Säugerzelle stimuliert, wobei ein Expressionsvektor mit dem Gen unter der Kontrolle des Promotors in eine Säugerzelle eingebracht wird und die Zelle einer den Stoff enthaltenden Zusammensetzung ausgesetzt wird, wobei der Nachweis GFP-fluoreszierender Zellen das Vorhandensein des nachzuweisenden Stoffes anzeigt.
Die Nachteile der vorstehend beschriebenen und teils routinemäßig verwen­ deten Nachweismethoden sind insbesondere der Einsatz von größeren Mengen radioaktiv markierter Nucleosidtriphosphate und/oder der hohe methodische und zeitliche Aufwand, der mit der Quantifizierung der RNA-Transkripte verbunden ist. Bes­ sere Methoden zur direkten, schnellen und sensitiven Messung von Transkriptionraten sind jedoch nicht nur für wissen­ schaftliche Fragestellungen von Interesse, sondern auch für die biotechnologisch arbeitende Industrie. So werden bei­ spielsweise beim sog. "High throughput screening" kombinato­ rische Substanzbibliotheken auf potentielle Leitstrukturen durchsucht, welche die Transkription bestimmter therapeu­ tisch relevanter Zielgene beeinflussen. Auch für solche und ähnliche Anwendungen würde ein technisch einfaches, sensiti­ ves Nachweis-System einen großen Fortschritt bedeuten, da hier bislang keine befriedigenden Lösungen existieren.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verfahren und für diese Verfahren geeignete Systeme bereit­ zustellen, die eine einfache und empfindliche Messung von Transkriptionsraten erlauben.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß mit der erfindungs­ gemäßen Zusammensetzung (Reportersystem), die genannten Pro­ bleme umgangen werden können. Dieses System weist unter an­ derem die folgenden Vorteile auf:
  • - Direkter Nachweis der mRNA im Zellextrakt.
  • - Schnelle, reproduzierbare und technisch einfache Quanti­ fizierung von Transkriptionsraten, beispielsweise über automatisierte Fluoreszenz-Messung.
  • - Hochsensitiver und hochspezifischer Nachweis auch klein­ ster Mengen an RNA-Transkripten (katalytisches Prinzip zur Signalverstärkung).
  • - Einfache Verlaufskontrolle der Transkription, beispiels­ weise durch zeitabhängige Fluoreszenzmessung (Echtzeit- Analytik).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine Zusammenset­ zung, enthaltend
  • a) eine ein Ribozym codierende DNA-Sequenz, die mit einem Promotor und/oder regulatorischen Elementen funktionell verknüpft ist; und
  • b) ein Oligonucleotidsubstrat, das von dem von der DNA aus (a) transkribierten Ribozym gespalten wird,
wobei nach Spaltung ein unmittelbar meßbares Signal erzeugt wird, da das gespaltene Oligonucleotidsubstrat von dem unge­ spaltenen Oligonucleotidsubstrat unterscheidbar ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Ribozyme" betrifft katalyti­ sche RNA-Moleküle mit der Fähigkeit, andere RNA-Moleküle an Phosphodiester-Bindungen sequenzspezifisch zu spalten. Die Hydrolyse der zu spaltenden Zielsequenz wird dabei stets eingeleitet durch Ausbildung eines katalytisch aktiven Kom­ plexes, bestehend aus Ribozym und Substrat-RNA. Nach erfolg­ ter Spaltung dissoziiert das hydrolysierte Substrat-Oligo­ nucleotid vom Ribozym ab; letzteres ist dann für weitere Um­ setzungen verfügbar.
Für die erfindungsgemäßen Zwecke eignen sich prinzipiell alle Ribozyme, die Phosphodiester-Bindungen in trans, d. h. intermolekular spalten können. Abgesehen von Ribonuclease P (C. Guerrier-Takada et. al., Cell 44 (1983) 849-857) sind die bekannten natürlicherweise vorkommenden Ribozyme (Hammer­ head-Ribozym, Hairpin-Ribozym, Hepatitis Delta Virus Ribo­ zym, Neurospora mitochondriales VS Ribozym, Gruppe I und Gruppe II Introns) allerdings sich selbst spaltende bzw. selbst spleißende Katalysatoren, die in cis (intramolekular) wirken (Übersichtsartikel in P. Turner (Hrg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 1-9). Durch Separieren der katalytischen Einheit von der die Spaltstelle enthaltenden Sequenz, gelang es in allen Fällen, in trans spaltende Ribo­ zym-Varianten herzustellen: Hammerhead-Ribozym (J. Haselhoff und W. Gerlach. Nature 334 (1988), 585-591); Hairpin-Ribozym (A. Hampel und R. Tritz, Biochemistry 28 (1989), 4929-4933); Hepatitis Delta Ribozym (M. Been, Trends Biochem. Sci. 19 (1994) 251-256); Neurospora mitochondriales VS Ribozym (H. Guo et. al., J. Mol. Biol. 232 (1993) 351-361); Gruppe I Intron aus Tetrahymena (Zaug et. al., Nature 324 (1986), 429- 433); Gruppe II Intron (S. Augustin et. al., Nature 343 (1990) 383-386).
Der hier verwendete Ausdruck "Promotor" betrifft jede DNA- Sequenz, die die Transkription der damit funktionell ver­ knüpften DNA-Sequenz durch die entsprechende RNA-Polymerase in vivo (oder in vitro) in prokaryontischen oder eukaryonti­ schen Systemen steuert. Solche Promotoren sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise PolII-Promotoren, SP6-, T3- und T7-Promotoren. Die endogene Ribozym-Expression in eukaryontischen Zellen bzw. Zellextrakten kann beispiels­ weise durchgeführt werden, indem die Ribozym codierende DNA- Sequenz in die untranslatierte Region von Genen insertiert wird, die von der RNA-Polymerase II transkribiert werden und unter der Kontrolle von stark transkribierenden Promotoren stehen. Beispiele sind virale Promotoren, wie der SV40 frühe Promotor (F. Cameron und P. Jennings, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 9139-9143), der Promotor des Actin-Gens (N. Sarver et. al. Science 247 (1990) 1222-1225) oder ein retro­ viraler "long terminal repeat", wie der HIV-LTA (Koizumi et. al., Gene 117 (1992), 179-184).
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform han­ delt es sich bei dem Ribozym um ein Hammerhead-Ribozym. Das Hammerhead-Ribozym ist mit nur etwa 30 Nucleotiden Länge ei­ nes der kleinsten bekannten Ribozyme, das die ortsspezifi­ sche Hydrolyse von Phosphodiester-Bindungen katalysiert (Übersichtsartikel: K. Birikh et. al., Eur. J. Biochem. 245 (1997) 1-16). Die Ribozym-Struktur umfaßt drei doppelsträn­ gige Bereiche (Helices I, II und III), welche die spaltbare Phosphodiester-Bindung flankieren, sowie zwei hochkonser­ vierte einzelsträngige Sequenzen (O. Uhlenbeck, Nature 328 (1987), 596-600). Durch Separieren der katalytischen Core- Sequenz von einer die Spaltstelle enthaltenden Substrat-Se­ quenz gelang es, Ribozym-Varianten herzustellen, die in der Lage sind, unter physiologischen Bedingungen nahezu jede Ziel-RNA in trans zu spalten (J. Haselhoff und W. Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591).
Im Zusammenhang mit den vielversprechenden therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten von Hammerhead-Ribozymen gelang es in jüngster Zeit, Hammerhead-Ribozyme hinsichtlich der kine­ tischen Eigenschaften (hohe Umsatzraten), der Sequenzlänge (Minimalmotive) sowie Substrat-Spezifitäten zu optimieren. Übersichtsartikel zu diesem Thema sind z. B.. Birikh, Eur. J. Biochem. 245 (1997), 1-16; Burke, Nature Biotech. 15 (1997), 414-415 und Eckstein, Lilley (Hrsg.), Nucleic Acids and Molecular Biology 10, Springer Verlag (1996), 173-329.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorstehenden Promotoren regulierbar, d. h. sie können, beispielsweise durch Transkriptionsaktivatoren, aktiviert werden oder durch bestimmte Verbindungen gehemmt werden. Gene von Eukaryonten und Prokaryonten unterscheiden sich hinsichtlich der Organi­ sation der Transkriptionseinheit beträchtlich voneinander (H. Ibelgaufts, Gentechnologie von A bis Z, VCH Verlag Wein­ heim (1990), 219-223). Der 5'-flankierende Bereich eines eukaryontischen Gens wird häufig als Promotorregion bezeich­ net, da er eine Reihe von distinkten DNA-Sequenzelementen enthält, die an der Kontrolle der Genexpression beteiligt sind. Hierzu zählen u. a. die TATA-Box und die Initiatorse­ quenz, die zusammen den Core-Promotor bilden. Die basale Transkription wird im wesentlichen durch die grundsätzlichen Transkriptionsaktivatoren der Klasse II reguliert (TF II A, B, D, E, F, H und Pol II). Analog zur basalen Transkription spricht man von einer aktivierten Transkription, wenn zu­ sätzliche regulatoriche Elemente die Transkription beein­ flußen. Eine Aktivierung erfolgt vornehmlich durch Bindung von Transkriptionsaktivatoren an sog. "Upstream activating sequences" (UAS). Beispiele für eine aktivierte Transkrip­ tion sind: SP1 bindet an die SP1-Bindestelle, CREB bindet an das CRE-Element.
Durch Auswahl geeigneter Promotoren können, wie nachstehend noch näher beschrieben, in einem geeigneten Testsystem, Ver­ bindungen, die die Transkription aktivieren oder hemmen, identifiziert werden. Die Wahl des Promotors hängt von der Art des in vitro-Transkriptions-System (z. B. Hefe-, HeLa- oder Pilz-Zellextrakte) und der verwendeten RNA-Polymerase ab. Mit dem hier beschriebenem Verfahren kann gemessen wer­ den, ob die Transkription generell inhibiert oder aktiviert wird, bzw. unbeeinflußt bleibt. Der Mechanismus oder das Prinzip der Beeinflussung durch eine bestimmte Substanz einer Verbindungsbibliothek ist Gegenstand nachfolgender Untersuchungen.
Vorzugsweise ist die das Ribozym codierende DNA-Sequenz ein linearisierter Vektor, in dem die Termination der Transkrip­ tion durch Spaltung der Matrizen-DNA stromabwärts der das Ribozym codierenden DNA mit einem geeigneten Restriktions­ enzym erfolgen kann. Alternativ ist die das Ribozym codie­ rende DNA-Sequenz mit einem Terminationssignal für die Transkription bei in vivo-Anwendungen funktionell verknüpft. Solche Terminationssignale sind dem Fachmann bekannt. Ein allgemeines prokaryontisches Stop-Signal der Transkription ist ein GC-reicher Bereich bestimmter Symmetrie, auf den eine AT-reiche Sequenz folgt (A. Wu und T. Platt, Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1978), 5442-5446). Auch für die euka­ ryontische Pol II gibt es Stop-Signale, die die Termination der Transkription an einer definierten Stelle erlauben.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die das Ribozym codierende DNA, gegebenenfalls mit den weiteren, vorstehend diskutierten Sequenzen in einen Vektor inser­ tiert, der die Vermehrung der insertierten DNA in einem ge­ eigneten Wirt erlaubt. Geeignete Vektoren für die Vermehrung in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen sind dabei z. B. pBR322, pNEB193, pUC18, pUC19 (Biolabs, USA.) (J. Sampson und O. Uhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 1033-1037).
Die vorstehend beschriebenen Ribozyme (bevorzugt Hammerhead- Ribozyme oder Hammerhead-Ribozym-Varianten), können als di­ rekte Reporter zur Quantifizierung von Transkriptionsraten in in vitro-Transkriptions-Systemen eingesetzt werden. Die Reporter-RNA wird dabei endogen erzeugt, d. h. durch Ab­ schrift des codierenden Gens, beispielsweise von einem ge­ eigneten Transkriptionsvektor.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stabilisierte Ribozyme, was eine längere Lebensdauer des Ri­ bozyms, z. B. in in vitro-Transkriptionssystemen gewährlei­ stet. Dabei wird das Ribozym zusammen mit stabilisierenden Sequenzen transkribiert, die sogenannte "Capping-Strukturen" imitieren und dadurch die Stabilität der RNA gegenüber Exo­ nuclease-Degradation erhöhen (Gene Therapy 4 (1996), 45-54; M. Sioud et. al., J. Mol. Biol. 223 (1992), 831-835).
Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotidsubstrat" be­ trifft jedes Oligonucleotid, vorzugsweise RNA, das von dem Ribozym gespalten werden kann, wobei das gespaltene Oli­ gonucleotidsubstrat von dem ungespaltenen Oligonucleotidsub­ strat unterscheidbar ist und ein unmittelbar meßbares Signal erzeugt wird.
Beispielsweise trägt das Substrat an einem Ende eine Anker­ gruppe, die seine Immobilisierung an eine geeignete Matrix erlaubt und an seinem anderen Ende eine Reportergruppe, die zum Nachweis des immobilisierten (ungespaltenen) Substrates dient. Bei Abwesenheit des Ribozyms bleibt das Substrat in­ takt und kann nach seiner Immobilisierung auf der Matrix einfach nachgewiesen werden, da die Ankergruppe mit der Re­ portergruppe nach wie vor verbunden ist. Bei Anwesenheit des Ribozyms hingegen ist das Reporter-spezifische Signal nicht nachweisbar, da die Reportergruppe von der Ankergruppe in­ folge der Spaltung des Substrates getrennt wurde. Alternativ zur Ankergruppe (z. B. Biotin) kann die Immobilisierung des Substrats auch über komplementäre Sequenzhybridisierung er­ folgen, sofern Spaltstelle und Reportergruppe jenseits der Hybridisierungsstelle liegen. Einfach nachweisbare Reporter­ gruppen, die leicht an Nucleinsäure-Enden zu koppeln sind, sind beispielsweise 32P, Farbstoff-Moleküle und Moleküle, die mit markierten Antikörpern nachweisbar sind.
Das erfindungsgemäße Oligonucleotidsubstrat ist zu der(n) Sequenz(en) des Ribozyms, die für die Substratbindung ver­ antwortlich ist (sind), im wesentlichen komplementär, d. h. es weist eine Komplementarität auf, die eine Anlagerung an das Ribozym auf eine Art und Weise erlaubt, daß eine wirk­ same und spezifische Spaltung des Oligonucleotidsubstrats gewährleistet ist. Vorzugsweise ist das Oligonucleotidsub­ strat zu den für die Substratbindung verantwortlichen Se­ quenzen des Ribozyms vollständig komplementär. Die Länge des sich an das Ribozym anlagernden Bereichs des Oligonucleotid­ substrats beträgt vorzugsweise 5 bis 8 Nucleotide (P. Turner Hrsg., Ribozyme protocols, Humana press (1997), 151-159, 253-264). Das Oligonucleotidsubstrat kann an seinem 5'- und/oder 3'-Ende zusätzliche Sequenzen enthalten, die nicht an der Anlagerung an das Ribozym beteiligt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das vorstehende Oligonucleotidsubstrat doppelt markiert, wobei das gespal­ tene Substrat leicht vom intakten Substrat unterscheidbar ist.
Zum Beispiel enthält der in vitro-Transkriptionsansatz neben der Ribozym codierenden DNA ein endständig biotinyliertes Substrat-Oligonucleotid, das an seinem anderen Ende mit Fluorescein markiert ist. Nach der minimalen Inkubations­ zeit, die bei ungehinderter Transkription zur Spaltung des Substrates ausreicht, wird die Transkription gestoppt. Der Transkriptionsansatz wird anschließend mit einer Streptavi­ din-beschichteten Festphase (z. B. mit einer kommerziell er­ hältlichen Mikrotiterplatte) inkubiert, um die Kopplung des biotinylierten Substrat-Endes an die Streptavidin-Matrix zu ermöglichen. Nach Entfernung des Transkriptionsansatzes und Waschen der Matrix wird diese vermessen. Bei ungestörter (d. h. nicht-inhibierter) Transkription ist keine Fluores­ cein-spezifische Fluoreszenz bzw. nur eine schwache unspezi­ fische Hintergrund-Fluoreszenz meßbar, da das Fluorescein­ markierte Spaltstück nicht immobilisiert werden konnte. Erfolgte dagegen keine oder nur verminderte Transkription des Ribozyms, beispielsweise infolge von Inhibition durch einen Transkriptionsinhibitor, kann der Anteil an unge­ spaltenem, immobilisierten Substrat durch Messung der Fluo­ rescein-spezifischen Fluoreszenz quantifiziert werden.
Besonders bevorzugt sind RNA-Oligonucleotide oder DNA-RNA- Hybride in denen eine fluorophore Gruppe (z. B. FAM = 6- Carboxy-Fluorescein, TET = Tetrachloro-6-Carboxy-Fluorescein oder HEX = Hexachloro-6-Carboxy-Fluorescein) und eine ent­ sprechende fluoreszenzlöschende Gruppe, ein sog. "Quencher" (z. B. Sulforhodamin 101 oder TAMRA = 6-Carboxy-Tetramethyl- Rhodamin), in räumlicher Nähe so angebracht sind, daß es zur effektiven Löschung der Fluoreszenz des Fluorophors kommt (Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York (1983), 303-339; V. Förster, Annals of Physics (Leipzig) 2 (1948), 55-75). Nach Spaltung des Substrates durch Ribozym-katalysierte Hydrolyse einer be­ stimmten Phosphodiester-Bindung können sich die Spaltstücke in Lösung voneinander entfernen: Die Fluoreszenz des Fluoro­ phors wird nun nicht mehr intramolekular gelöscht. Erfolgt also die Transkription des Reporter-Ribozyms in Gegenwart solcher doppelt markierten Substrate, so kann die Transkrip­ tionsrate über die Menge an Ribozym (= mRNA des Reporter­ gens) quantifiziert werden, da mit Spaltung des Substrates ein messbares Fluoreszenz-Signal erzeugt wird. Unter ge­ eigneten Bedingungen (z. B. Substratüberschuß) ist die unge­ löschte Fluoreszenz der Menge an transkribiertem Reporter- Ribozym sowie der Inkubationszeit proportional und kann über geeignete automatisierte "Read-Out"-Geräte quantifiziert werden.
Den oben beschriebenen RNA-Oligonucleotidsubstraten analoge DNA-Oligonucleotide sind kommerziell erhältlich (z. B. von PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) oder durch einfa­ che Synthese zugänglich (Livak et. al., PCR Methods Appl. 4 (1995) 1-6 und Rudert et. al., BioTechniques 22 (1997) 1140- 1145). Beispielsweise werden die doppelt markierten DNA-Oli­ gonucleotide zur semiquantitativen Analyse von PCR-amplifi­ zierter DNA eingesetzt (Taqman®, PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA; siehe auch z. B. Lang et. al., J. Immun. Methods 203 (1997), 181-192). Die Taqman®-PCR-Technik nutzt dabei die intrinsische 5' → 3' Nuclease-Aktivität des Taq- Polymerase-Enzyms: Während der Amplifikation wird das 5'- und 3'- doppelt markierte DNA-Oligonucleotid vom Enzym hy­ drolysiert. Nach Spaltung der DNA-Sonde diffundieren Fluoro­ phor und Quencher auseinander, was die Aufhebung der Fluo­ reszenz-Löschung zur Folge hat. Die Fluoreszenz des Fluoro­ phors wird anschließend gemessen und dient als Maß für die erzielte Amplifikation (Livak et. al., Research News (1995), PA Applied Biosysthems, Foster City, CA).
Ähnlich der vorstehend beschriebenen Anwendung für doppelt markierte DNA-Oligonucleotide ist auch die Verwendung von entsprechenden RNA-basierenden Substraten problemlos reali­ sierbar. Methoden zur Markierung von Ribonucleinsäuren mit fluorophoren bzw. fluoreszenzlöschenden Gruppen sowie Tech­ niken zur Messung des Energietransfers (Quenching) wurden bereits detailliert beschrieben (Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 241-251). Die synthetische und enzymatische Herstellung von Ribozymen sowie die Her­ stellung linearisierter Transkriptionsvektoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997) 51-111). 5'-Fluorophor- und 3'-Quencher-markierte RNA-Oligonucleotide sind ebenso wie die analogen DNA-Oligonucleotide kommerziell erhältlich (z. B. 5'-FAM- und 3'-TAMRA-markierte RNA bei Eurogentec, Bel­ gien). Die Markierung erfolgt günstigerweise an den RNA- Enden, um die Hybridisierung des Ribozyms nicht zu beein­ flussen.
Um die mit unerwünschter Spaltung (z. B. durch Nucleasen im Transkriptionssystem) einhergehende Fluoreszenz-Emission zu vermeiden, ist insbesondere der Einsatz Nuclease-resistenter Oligonucleotid-Substrate von Vorteil (Eaton und Pieken, Annu. Rev. Biochem. 64 (1995), 837-863 und Shimayama et. al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2605-2611). Dies ist vor allem in Hinblick auf in vivo-Anwendungen von Vorteil, bei denen das doppelt markierte Substrat durch geeignete Techniken (z. B. Mikroinjektion, Liposomentransport, etc.) exogen in Zellen eingeschleust wird (P. Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 417-451). Somit handelt es sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform bei den doppelt markierten Substraten um modifizierte RNA-Oligo­ nucleotide. Solange die Spaltstelle im Substrat NUH ↓, (nach IUB Code.: N = jede Base, H = A, U oder C) lautet, kann das Substrat Desoxyribonucleotide oder/und modifizierte Basen oder/und 2'-modifizierte Riboseeinheiten enthalten. Dadurch wird die Stabilität des Substrates im Zellextrakt erhöht (N. Taylor et. al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 4559-4565). Auch kann die Verwendung von intern-markierten, statt end­ markierten Oligonucleotid-Substraten zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis beitragen, da die Fluoreszenz­ löschung u. a. mit kürzeren Abständen zwischen den beiden Gruppen (Fluorophor und Quencher) verstärkt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Transkriptionsraten, die fol­ genden Schritte umfassend:
  • a) Inkontaktbringen der vorstehend beschriebenen Zusammen­ setzung mit einem in vitro-Transkriptionssystem unter Bedingungen, bei denen die Transkription der das Ribozym codierenden DNA-Sequenz erfolgt und bei denen das Ribo­ zym katalytisch aktiv ist; und
  • b) Messung der Menge an gespaltenem Oligonucleotidsubstrat nach einem und/oder über einen geeigneten Zeitraum.
Nachfolgend ist die prinzipielle Vorgehensweise erläutert, um die Erfindung als einfache Screening-Methode zur Identi­ fizierung von Transkriptionsinhibitoren aus kombinatorischen Substanzbibliotheken zu nutzen.
(a) Auswahl und Herstellung der Ribozym codierenden DNA und des doppelt markierten Oligonucleotid-Substrates
Ribozym codierende DNA-Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. Entsprechend dem gewünschten Ribozymtyp und der passenden Oligonucleotidsubstrat-Sequenz kann die das erfindungsgemäße Ribozym codierende DNA-Sequenz gemäß dem Fachmann bekannten Techniken hergestellt werden.
Dabei dient als Matrize für die in vitro-Transkription des Ribozyms entweder doppelsträngige PCR-DNA oder ein lineari­ sierter Vektor. Methoden zur Herstellung entsprechender Ma­ trizen sind dem Fachmann bekannt (Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997), 69-78 und 121-139).
Besonders bevorzugt sind Hammerhead-Ribozyme. Da pH-Wert, Temperatur, Mg2+-Konzentration sowie Art und Länge der Sub­ strat-bindenden Sequenzen die Ribozym-Aktivität stark beein­ flussen, gilt es, diejenige Kombination von Ribozym und Sub­ strat auszuwählen, die zu optimierten Umsatzraten unter den physiologischen Bedingungen des jeweiligen Test-Systems führt. Geeignete Vorgehensweisen sind dem Fachmann bekannt. Ein Hammerhead-Ribozym mit guten intermolekularen Spaltungs­ eigenschaften bezüglich der komplexierten Substrat-RNA (kcat/Km = 0,032 nM-1 min-1 bei pH 7,5, 10 mM MgCl2, 25°C) ist beschrieben in Fedor und O. Uhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1668-1672: 5'-GGG UCC UCU GAU GAG GGC CGU UAG GCC GAA ACU CC-3' (Ribozym) und 5'-GGG AGU CAG GAU- 3' (Substrat). Auf Grundlage dieser Sequenzen können bei­ spielsweise günstige Hammerhead-Ribozym-Varianten und ent­ sprechende Substrate entworfen werden (siehe Beispiel 1). Neben den kinetischen Parametern ist beim Design des Ribo­ zyms vor allem darauf zu achten, daß abgesehen von der Pro­ motorsequenz selbst der direkt auf den Promotor folgende transkribierte Bereich (von bis zu 10 Nucleotiden) oft einen entscheidenden Einfluß auf die Transkriptionsraten hat. Da die 5'-transkribierte Sequenz in der Regel identisch ist mit einem Teil des Substrat-Hybridisierungsbereiches, ist im be­ sonderen Maße beim Entwurf der Ribozym- und Substrat-Sequen­ zen zu beachten, daß sowohl eine optimale Transkription als auch die Ribozym-Substrat-Hybridisierung möglich ist. Bei der Auswahl der doppelt markierten Substrat-Sequenz ist des weiteren insbesondere auf folgende Punkte zu achten:
  • - Die NUH-Schnittstelle lautet günstigerweise GUC oder AUC.
  • - Das Emissionsspektrum des Fluorophors überlappt mit dem Absorptionsspektrum des Quencher-Farbstoffes.
  • - Das Substrat bildet möglichst keine intramolekularen Se­ kundärstrukturen.
  • - Die 5'-terminale Base sollte nicht Guanosin sein.
  • - Das Substrat sollte günstigerweise symmetrisch über 12 bis höchstens 16 Nucleotide an das Ribozym hybridisie­ ren.
(b) Herstellung des in vitro-Transkriptions-Systems
Die Herstellung von Zellextrakten, die als in vitro-Trans­ kriptionssysteme genutzt werden, ist dem Fachmann bekannt. Die Durchführung von in vitro-Transkriptionen in diesen Zellextrakten ist dem Fachmann ebenfalls bekannt. Ein Bei­ spiel für ein geeignetes in vitro-Transkriptionssystem ist das Klasse II System aus menschlichen Zellkernextrakten (Matsui et. al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 11992-11996; und Roeder, Trends Biochem. Sci. 21 (1996), 327-335). Die Akti­ vität von Hammerhead-Ribozymen ist in der Regel unter phy­ siologischen Bedingungen ausreichend hoch, kann aber bei­ spielsweise durch Erhöhung der Mg2+-Konzentration auf 5 bis 10 mM gesteigert werden. In der Regel bleibt dadurch die Transkription unbeeinflußt.
(c) Durchführung der Reaktion
Dem Zellextrakt wird eine geeignete DNA-Matrize zugesetzt, die die Transkription des gewünschten Ribozyms ermöglicht. Das Oligonucleotid-Substrat wird dem Ansatz günstigerweise im Überschuß zugesetzt, um im Meßzeitraum lineare, reprodu­ zierbare Abhängigkeiten zwischen dem akkumulierten Reporter- Ribozym und dem gemessenen Signal (vorzugsweise einem Fluo­ reszenz-Signal) zu gewährleisten. Eine parallele Messung verschiedener Transkriptionsansätze kann beispielsweise in kommerziell erhältlichen "96-Well"-Mikrotiterplatten erfol­ gen. Nachdem die zu testenden, potentiellen Inhibitoren oder Aktivatoren zugesetzt wurden, wird die in vitro-Trans­ kription dann, beispielsweise durch Zugabe der entsprechen­ den RNA-Polymerase, gestartet. Geeignete Reaktionszeiten liegen im Bereich von etwa 1 min bis etwa 60 min.
Die Messung der Transkriptionsrate erfolgt durch die Bestim­ mung der Fluoreszenz, die mit der Menge an gespaltenem Oli­ gonucleotidsubstrat gekoppelt ist. In entsprechend geeichten Systemen kann die tatsächliche Menge an transkribierter RNA bestimmt werden. Die Eichung kann beispielsweise wie folgt vorgenommen werden. Bekannte Mengen an Ribozym-codierender DNA werden mit bekannten Mengen an doppelt markiertem Sub­ strat inkubiert. Die Transkription erfolgt dabei in Gegen­ wart von 32P-α-UTP, welches in die entstehende Ribozym-RNA eingebaut wird. In indentischen Ansätzen mißt man dann zeit­ abhängig den Anstieg der Fluoreszenz, wobei die einzelnen Ansätze zu unterschiedlichen Zeiten gestoppt werden. Zur Quantifizierung der entstandenen Mengen an Ribozym werden die Ansätze auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel auf­ getrennt und mit Hilfe eines Phosphor-Imagers ausgewertet. Über die Einbaurate des Radionucleotids kann dann die Menge an Ribozym für jeden Meßpunkt bestimmt werden. Durch Auftrag der gemessenen relativen Fluoreszenz gegen die ermittelte Ribozymkonzentration erhält man schließlich die Eichkurve für nachfolgende Messungen.
(d) Messung der Transkriptionsraten und Auswertung
Bei der Verwendung von Oligonucleotidsubstraten, die mit einer fluorophoren Gruppe und einer fluororeszenzlöschenden Gruppe markiert sind, erfolgt die Messung der emittierten Fluoreszenz günstigerweise automatisiert mit Hilfe eines ge­ eigneten "Read-Out"-Gerätes (z. B. ABI Prism 770 Sequence Detection System, Perkin Elmer). Methoden zur Eichung und der Fluoreszenz-Messung selbst sowie Programme zur Computer­ unterstützten Datenverarbeitung sind detailliert beschrieben (Handbuch zu ABI Prism 770 Sequence Detection System, Perkin Elmer; Rudert et al., BioTechniques 22 (1997) 1140-1145). Im Prinzip wird die Fluoreszenz des Fluorophors über Hinter­ grund (ΔRn-Wert) für jeden Transkriptionsansatz zeitabhängig aufgezeichnet. Die Auswertung kann anschließend am ABI Prism 7700-Gerät selbst erfolgen, indem die Spektren der verschie­ denen Ansätze bei unterschiedlichen Zeitpunkten mit dem Spektrum der nicht-inhibierten Referenz verglichen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Hemmstoffen der Transkription oder Transkriptionsaktivatoren, die folgenden Schritte umfassend:
  • a) Inkontaktbringen der vorstehend beschriebenen Zusammen­ setzung mit einem ersten in vitro-Transkriptionssystem und einem zweiten Transkriptionssystem, das die zu untersuchende Verbindung enthält, unter Bedingungen, bei denen die Transkription der das Ribozym codierenden DNA- Sequenz erfolgt und bei denen das Ribozym katalytisch aktiv ist;
  • b) Messung der Menge an gespaltenem Oligonucleotidsubstrat nach einem und/oder über einen geeigneten Zeitraum in beiden Transkriptionssystemen, wobei eine höhere Trans­ kriptionsrate im zweiten Transkriptionssystem auf die Gegenwart eines Transkriptionsaktivators hindeutet und eine erniedrigte Transkriptionsrate auf die Gegenwart eines Hemmstoffs der Transkription.
Die prinzipielle Vorgehensweise ist mit der vorstehend be­ schriebenen identisch, außer daß nicht nur ein Testsystem verwendet wird, sondern zwei Systeme, die sich nur in einem Punkt unterscheiden, nämlich dadurch, daß das zweite Test­ system die zu untersuchende Verbindung enthält.
Nach Auswertung der Daten kann die Auswirkung der zugesetz­ ten Substanz auf die Transkriptionsrate relativ zur Referenz (= nicht-inhibierte Transkription) bestimmt werden: Ein ge­ ringeres Fluoreszenzsignal deutet auf Inhibition hin, ein höheres Signal auf die Gegenwart eines Transkriptionsaktiva­ tors.
Um die Nützlichkeit der vorstehend beschriebenen Ribozyme und die Sensitivität des beschriebenen Verfahrens weiter zu erhöhen, können Techniken der "in vitro-Selektion" (Pan, Curr. Op. Chem. Biol. 1 (1997), 17-25; Breaker, Chem Rev. 97 (1997), 371-390) und des "Ribozym-Engineering" (Turner (Hrsg.), Ribozyme protocols, Humana press (1997) 11-15, 141- 159, 253-273) angewandt werden. Damit können besonders ef­ fektive de novo-Ribozyme bzw. Varianten natürlicher Ribozyme hergestellt werden, um optimale Umsatzraten mit dem nicht- natürlichen Oligonucleotid-Substrat unter den jeweiligen Be­ dingungen des in vitro-Transkriptions-Systems zu erzielen (S. Santoro and G. Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 4262-4266).
Diese in vitro-Selektion wurde in jüngster Zeit erfolgreich angewandt, um Ribozyme mit veränderten Substrat-Spezifitäten und Aktivitäten zu erzeugen (Vaish, Biochemistry 36 (1997), 6495-6501, und Berzal-Herranz et. al., Gene Dev. 6 (1992), 129-134). Ein besonders günstiges Verfahren stellt in diesem Zusammenhang die "in trans-Selektion" von Ribozymen dar, bei der direkt auf Spaltung des doppelt markierten Oligonucleo­ tid-Substrates selektiert wird (Ishizaka, Biochem. Biophys. Research Com. 214 (1995), 403-409). Aus den durch dieses Verfahren erhältlichen Ribozymsequenzen können unmittelbar diejenigen Ribozyme isoliert werden, die im automatisierten Fluoreszenz-Screening der Zellextrakte die gewünschte Eigen­ schaft zeigen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die vorstehend beschriebene Zusammensetzung, die eine DNA-Sequenz enthält, die ein in vitro-selektiertes Ribozym codiert.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung zur absoluten oder vergleichenden Messung von Transkriptionsraten, vorzugsweise mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich die vorste­ hend beschriebenen Zusammensetzungen enthaltende Kits, vor­ zugsweise zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Erfindungsgemäß bevorzugt werden Kits, die ferner ein in vitro-Transkriptionssystem, beispielsweise eines der vorste­ hend beschriebenen Systeme enthalten.
Legende zur Fig. 1
Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Zusammenset­ zung (in vitro Reporter-System). (1) Erzeugung des Ribozyms durch in vitro-Transkription im Zellextrakt. Als Matrize dient eine entsprechende DNA-Sequenz, beispielsweise vekto­ riellen Ursprungs. (2) Die Bindung des doppelt markierten Substrates (z. B. 5'-FAM- und 3'-TAMRA-markierte RNA) an das Ribozym führt zur Ausbildung des katalytisch aktiven Komple­ xes. Die Fluoreszenz ist im Substrat intramolekular ge­ löscht. (3) Spaltung des doppelt markierten Substrates. (4) Dissoziation der Reaktionsprodukte vom Ribozym. Durch Aufhe­ bung des Quench-Effektes wird ein Fluoreszenz-Signal hν ge­ messen.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel 1 Messung des Einflußes von Inhibitoren auf die in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase 1. Herstellung der Ribozym-codierenden Matrizen-DNA und der 5'-FAM- und 3'-TAMRA-markierten Substrat-RNA
Die in diesem Beispiel beschriebene Ribozym codierende DNA- Sequenz HHR1-DNA sowie das RNA-Substrat SL1 sind abgeleitet von einem bekannten Hammerheadribozym-Substrat-Komplex (M. Fedor und O. Uhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1668-1672). Die Matrize für die in vitro-Transkrip­ tion des Ribozyms HHR1, die Ribozym codierende doppelsträn­ gige HHR1-DNA, wurde durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) erzeugt. Zu diesem Zweck wurde der Sense-Strang des Ribo­ zyms, inklusive 5'-terminaler T7-Promotor-Sequenz, an einem "Expedite Oligonucleotide Synthesizer" (Millipore, USA) syn­ thetisiert: 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT A GGG TCC TCT GAT GAG GCC GTT AGG CCG AAA CTC GT-3' (HHR1-DNA; die Primerbin­ destellen sind kursiv geschrieben). Die Synthese des Anti­ sense-Stranges sowie die Amplifikation der doppelsträngigen Matrize erfolgte unter Verwendung folgender Primer: 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT A-3'. (5'-Primer) und 3'-GG CAA TCC GGC TTT GAG CA-5' (3'-Primer). Ein typischer 100 µl-Reaktionsan­ satz enthielt: 10 mM Tris-HCl, pH 8,9, 100 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,05% Tween 20 (v/v), 200 mM dA/dC/dG/dTTP, 2 µM 5'- und 3'-Primer, ca. 200 nM einzelsträngige DNA-Matrize und 2,5 Einheiten Tth-DNA-Poly­ merase. Die Amplifikation erfolgte nach Herstellerprotokoll (Boehringer Mannheim, Tth-DNA-Polymerase Kit) in vier bis fünf PCR-Zyklen à 95°C, 55 Sec.; 55°C, 1 Min.; 72°C, 1 Minu­ te. Die amplifizierte DNA wurde anschließend nach Standard­ methoden isoliert und über ein Agarosegel von überschüssigen Primern gereinigt (T. Maniatis, E. Fritsch, J. Sambrook, Molecular cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982), 14.2-14.35). In analoger Weise wurde eine doppelsträngige DNA-Matrize, codierend für eine inaktive Ribozym-Variante HHR1mut, ausgehend von fol­ gender einzelsträngiger DNA hergestellt: 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT A GGG TCC TCT TAG GAG GCC GTT AGG CCA GAA CTC GT-3' (HHR1mut; Primer-Bindestellen sind kursiv geschrieben, Mu­ tationen hervorgehoben). Die folgenden Primer 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT A-3' (5'-Primer) und 3'-GG CAA TCC GGT CTT GAG CA-5' (3'-Primer) wurden verwendet.
Die 5'-FAM- und 3'-TAMRA-markierte Substrat-RNA SL1 mit der Sequenz 5'-FAM-ACG AGU CAG GAU U-TAMRA-3' wurde bei Eurogentec (Belgien) bezogen und über ein 20%iges denaturie­ rendes Polyacrylamidgel aufgereinigt (P. Turner (Hrsg.), Ri­ bozyme protocols, Humana press (1997) 79-81).
2. In vitro-Transkription
Ein typischer 50 µl Reaktionsansatz enthielt: 40 mM Tris- HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM Spermidin, 5 mM Dithiothrei­ tol, 5-25 mM MgCl2, ca. 500 nM SL1, 0.2-2 µM HHR1-DNA bzw. HHR1mut-DNA, 4 mM A/C/G/UTP und 50 Einheiten T7-RNA-Po­ lymerase. Es ist wichtig darauf zu achten, daß in die Transkription ausschließlich doppelsträngige DNA eingesetzt wird, da sowohl einzelsträngige Sense-Strang-DNA, als auch 3'-Primer-DNA die Spaltungs-Reaktion inhibieren könnten. Die in vitro-Transkription wurde durch Zugabe der Polymerase ge­ startet und es wurde bei 37°C für die Dauer der Messung in­ kubiert.
3. Echt-Zeit-Messung der Fluoreszenz bei Spaltung von SL1 durch HHR1
Die Fluoreszenzmessung der Transkriptionsansätze erfolgte automatisiert in einem temperierbaren "ABI Prism 770"-Spek­ trometer (Applied Biosystems, USA). In Abständen von 7 Sekunden. wurden Spektren im Emissions-Wellenlängenbereich der beiden Farbstoffe (FAM, λmax = 518 nm und TAMRA, λmax = 582 nm) aufgezeichnet (Anregungsenergie = 488 nm). Nach einer Inkubationszeit von drei Stunden wurden die gesammel­ ten Daten mit Hilfe der Geräte-eigenen Software ausgewertet. Zur Echt-Zeit-Verlaufskontrolle der einzelnen Transkrip­ tionen wurden die Fluoreszenzspektren (Bereich von 500 nm bis 660 nm) zeitabhängig über das Spektrum der Referenz- Transkription (mit nicht-funktionaler HHR1mut-DNA) proji­ ziert. Bei optimalen Transkriptionsbedingungen konnte dabei ein deutlicher Anstieg der FAM-spezifischen Fluoreszenz in Ansätzen mit HHR1-DNA relativ zur konstanten Fluoreszenz der Referenz-Transkription mit HHR1mut-DNA beobachtet werden. Durch Auftrag der relativen Fluoreszenz des Fluorophors (ΔRn-Wert) bei 535 nm gegen die Zeit wurde anschließend der Anteil an gespaltener Substrat-RNA relativ zur Negativkon­ trolle (identischer Ansatz mit inaktiver HHR1mut-DNA anstatt HHR1-DNA) bestimmt. Methoden zur Eichung des Geräts sowie Programme zur Computerunterstützten Datenverarbeitung sind detailliert beschrieben (Handbuch zu ABI Prism 770 Sequence Detection System, Perkin Elmer; W. Rudert et. al., BioTechniques 22 (1997) 1140-1145). Die Auswertung der Meß­ daten für eine Substratkonzentration von 900 nM SL1 ergab erwartungsgemäß, daß die relative Fluoreszenz ΔRn des Fluo­ rophors bei konstanter Konzentration an HHR1-DNA mit den Inkubationszeiten anstieg. Das inaktivierte Ribozym HHR1mut hatte keinen Einlfuß auf das gemessene Fleoreszenzsignal.
4. Echt-Zeit-Messung der T7-Transkriptionsraten in Gegen­ wart von Inhibitoren der T7-RNA-Polymerase
Die Messungen wurden wie unter 3. in analoger Weise durchge­ führt, diesmal mit T7-Lysozym, einem Inhibitor der T7-RNA- Polymerase (R. Ikeda, P Bailey, J. Biol. Chem. 267 (1992), 20153-20159). Erwartungsgemäß nahm an relativ zur nicht-in­ hibierten Transkription mit steigender Inhibitor-Konzentra­ tion ab.

Claims (13)

1. Zusammensetzung, enthaltend
  • a) eine ein Ribozym codierende DNA-Sequenz, die mit einem Promotor und/oder regulatorischen Elementen funktionell verknüpft ist; und
  • b) ein Oligonucleotidsubstrat, das von dem von der DNA aus (a) transkribierten Ribozym gespalten wird,
wobei das gespaltene Oligonucleotidsubstrat von dem un­ gespaltenen Oligonucleotidsubstrat unterscheidbar ist und ein unmittelbar meßbares Signal erzeugt wird.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein Hammerhead-Ribozym codiert.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA- Sequenz (a) in einen Vektor insertiert ist.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA-Sequenz (a) und/oder das Oligonucleotidsubstrat (b) Nuclease-resistent sind.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Oligonucleotidsubstrat ein doppelt markiertes Oligo­ nucleotidsubstrat ist.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das doppelt mar­ kierte Oligonucleotidsubstrat eine fluorophore Gruppe und eine fluoreszenzlöschende Gruppe enthält und wobei nach Spaltung mit dem Ribozym die Löschung der Fluores­ zenz des Fluorophors durch die fluoreszenzlöschende Gruppe unterbunden ist.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die fluorophore Gruppe 6-Carboxy-Fluorescein (FAM) und die fluoreszenz­ löschende Gruppe 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin (TAMRA) ist.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die DNA-Sequenz von (a) ein in vitro-selektiertes oder nicht-natürliches Ribozym codiert.
9. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Transkrip­ tionsraten, die folgenden Schritte umfassend:
  • a) Inkontaktbringen der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem in vitro-Transkriptions­ system unter Bedingungen, bei denen die Transkrip­ tion der das Ribozym codierenden DNA-Sequenz erfolgt und bei denen das Ribozym katalytisch aktiv ist; und
  • b) Messung der Menge an gespaltenem Oligonucleotidsub­ strat nach einem und/oder über einen geeigneten Zeitraum.
10. Verfahren zur Identifizierung von Hemmstoffen der Trans­ kription oder Transkriptionsaktivatoren, die folgenden Schritte umfassend:
  • a) Inkontaktbringen der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem ersten in vitro-Trans­ kriptionssystem und einem zweiten Transkriptions­ system, das die zu untersuchende Verbindung enthält, unter Bedingungen, bei denen die Transkription der das Ribozym codierenden DNA-Sequenz erfolgt und bei denen das Ribozym katalytisch aktiv ist; und
  • b) Messung der Menge an gespaltenem Oligonucleotidsub­ strat nach einem und/oder über einen geeigneten Zeitraum in beiden Transkriptionssystemen, wobei eine höhere Transkriptionsrate im zweiten Transkrip­ tionssystem im Vergleich zum ersten Transkriptions­ system auf die Gegenwart eines Transkriptionsaktiva­ tors hindeutet und eine erniedrigte Transkriptions­ rate auf die Gegenwart eines Hemmstoffs der Trans­ kription.
11. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur absoluten oder vergleichenden Messung von Transkriptionsraten.
12. Kit, die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend.
13. Kit nach Anspruch 12, außerdem ein in vitro-Transkrip­ tionssystem enthaltend.
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