DE3751567T2

DE3751567T2 - Rns-ribozym restriktionsendoribonukleasen und verfahren.

Info

Publication number: DE3751567T2
Application number: DE3751567T
Authority: DE
Inventors: Michael Been; Thomas Cech; Arthur Zaug
Original assignee: University Patents Inc
Current assignee: University Patents Inc
Priority date: 1986-12-03
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2007-12-03
Also published as: WO1988004300A1; JP2530906B2; US4987071A; HK188395A; EP0291533B1; ATE129251T1; US6025167A; US5591610A; DE3751567D1; EP0291533A1; EP0291533A4; US5354855A; US6180399B1; US5093246A; JPH01501445A

Description

Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen von RNA (RNS), die als ein RNA-Enzym funktionieren, d.h. ein Ribozym mit sequenzspezifischen Endoribonucleaseaktivitäten.
Die Tetrahymena-rRNA-Intervenierende-Sequenz (IVS) ist ein katalytisches RNA-Molekül oder Ribozym. Es vermittelt das RNA-Selbst-Spleißen, indem es sein eigenes Ausschneiden aus dem großen ribosomalen RNA-Vorläufer durchführt und sich anschließend selbst in eine zirkuläre Form umwandelt (Kruger, K., et al.,(1982) Cell 31: 147-157; Zaug, A. J., et al., (1983) Nature 301: 578-583). In diesen Reaktionen können die Spleiß-Stellen und Zirkularisierungs-Stellen als intramolekulare Substrate für eine Aktivität, die sich innerhalb der IVS- RNA befindet, betrachtet werden (Zaug, A.J., et al., (1984) Science 224: 574-578). Dies ist jedoch keine echte enzymatische Reaktion, da die RNA am Ende der Selbst-Spleiß-Reaktion nicht in ihrer ursprünglichen Form regeneriert wird. Die IVS-RNA wird, falls in ihrer linearen Form, als L-IVS-RNA bezeichnet.
Diese Ansicht wurde durch Studien der L-19-IVS-RNA, einer linearen Form der IVS, der die ersten 19 Nucleotide fehlen, bestätigt. Da ihr die Zirkularisierungs-Stellen fehlen, wird die L- 19-IVS-RNA daran gehindert, intramolekulare Reaktionen zu vollziehen (Zaug, A.J., et al., (1984) Science 224: 574-578). Sie behält jedoch immer noch Aktivität zurück und kann Spaltungs-Ligations-Reaktionen an anderen RNA-Molekülen katalysieren (Zaug, A.J. und Cech, T.R. (1986) Science 231: 470-475). Wenn mit Oligo(cytidylsäure) als Substrat ausgestattet, wirkt die L-19-IVS-RNA als ein Enzym mit Nucleotidyltransferase- [Poly(C)- Polymerase-] und Phosphodiesterase- (Ribonuclease-) Aktivitaten (Zaug, A.J. und Cech, T.R. (1986) Science 231: 470-475). Mit 3'-phosphorylieftem Oligo(C)-Substraten wirkt dasselbe Ribozym als eine Phosphotransferase und eine saure Phosphatase (Zaug, A.J. und Cech, T.R. (1986) Biochemistry 25: 4 478-4 482). Eine mechanistische Schlüsseleigenschaft von allen vier dieser Reaktionen ist die Bildung eines kovalenten Enzym Substrat Intermediates, in welchem ein Nucleotid oder Phosphat uber das 3'-O von G414, dem 3'-terminalen Guanosin der IVS- RNA, verestert wird. Dieses kovalente Intermediat wird durch einen nucleophilen Angriff durch die 3'-Hydroxylgruppe von G414 gebildet. Der Mechanismus des Selbst-Spleißens wird weiter im Uberblick von Cech (1986) Scientific American 225 (5): 64 75 dargestellt.
Szostak (1986) Nature 322: 83-86 offenbart, daß 5'- und 3'-Deletionen der Tetrahymena-IVS in der Lage sind, auf Substratmolekülen, die den 5'-Anteil der Tetrahymena-IVS umfassen, zu wirken.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 vergleicht das RNA-Selbst-Spleißen (A) mit der RNA-Endoribonucleaseaktivität (B).
Figur 2 zeigt Produkte der Spaltung einer Vielzahl von RNA-Substraten durch die RNA- Endoribonuclease.
Figur 3 vergleicht die unterschiedliche Substrataktivität von drei verschiedenen Formen des L- 19-IVS-Ribozyms in 2,5 M Harnstoff.
Figur 4 zeigt den Zeitverlauf der Oligonucleotid-Spaltung.
Figur 5 zeigt die Konstruktion des Plasmids, welches die L-21-IVS-RNA herstellt.

Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

Legende der Figuren

Fig. 1 Ein Modell für die L-19-IVS-RNA, die mittels eines Mechanismus, der eine intermolekulare Version des ersten Schritts des Selbst-Spleißens der Prä-rRNA ist, wie eine RNA- Restriktionsendonuclease wirkt. Dünne Buchstaben und Linien stehen für IVS-Sequenzen, fette Buchstaben und dicke Linien stehen für Exon-Sequenzen (oben) oder Substrat-RNA- Sequenzen (unten) und das kursive G ist ein freies Guanosinnucleotid oder -nucleosid.
Fig. 2 Die L-19-IVS-beta-RNA spaltet große RNA-Substrate bei einem Transfer von Guanosin. a: Einheitlich markierte 0,6 uM pAK105-RNA (508 nt), eine Stunde lang unter den unten beschriebenen Bedingungen inkubiert mit 0,2 uM L-19-IVS-beta-RNA und 0, 0,1 oder 0,5 mM GTP (unmarkiert). (M): Mischung von vier Substrat-RNAs als Marker für das Molekulargewicht. b: Verschiedene tritiierte RNA-Substrate (jeweils I ug), inkubiert mit 0,2 uM L-19-IVS-beta-RNA und 120 uM [alpha-³²P]-GTP 1 Stunde lang unter denselben Reaktionsbedingungen wie a. Ein Autoradiogramm zeigt nur [³²p]-GTP-markierte Produkte. Die L-19-IVS-beta-RNA wird also während der Inkubation ebenfalls GTP-markiert. c: Nucleotidsequenz des Spaltungsproduktes pAK105 (1), bestimmt durch die enzymatische Methode (Donis-Keller, H., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 3 133-3 142). Einige Nucleotide konnten nicht bestimmt werden aufgrund des Vorhandenseins einer Bande in der unbehandelten (Kontroll-) RNA-Probe. G*: markiertes, mit der RNA während der Reaktion verknüpftes GTP.

Methoden:

L-19-IVS-RNA wurde mittels Methoden, die den zuvor beschriebenen ähnlich sind, synthetisiert (Zaug, A.J. und Cech, T.R., (1986) Science 231: 470-475), außer daß ein anderes RNA-Polymerase-Matrizen-System verwendet wurde. Das Plasmid pT7-TT1A3 (welches einen T7-RNA-Polymerase-Promoter, ein 42 bp großes 5'-Exon, die gesamte 413 bp IVS und ein 82 bp großes 3'-Exon enthält) wurde mit Eco RI geschnitten und mit der RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 transkribiert (Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81; 2 035-2 039). Die Transkripte wurden weiter unter Selbst-Spleiß-, Zirkularisierungs- und Bedingungen der stellenspezifischen Hydrolyse inkubiert, um L-19-IVS-RNA herzustellen (Zaug, A. J., et al., (1984) Science 224: 574-578; Zaug, A. J. und Cech, T. R., (1986) Science 231: 470-475). Das 3'-terminale Guanosin wurde dann durch Periodatoxidation und beta- Eliminierung entfernt (Winter, G. et al., (1978) Nucleic Acids Res. 5 : 3 129-3 139), um L19- IVS-beta-RNA zu erhalten. Substrat-RNAs wurden durch eine T7-RNA-Polymerase- Transkription von BamHI-geschnittenem pAK105 (Mount, S.M., et al., (1983) Cell 33 : 509- 518) XmnI- oder ScaI-geschnittenem pT7-1 (vertrieben von U.S. Biochemical Corp.) und SnaBI- geschnittenem pDW27, welcher für M1-RNA kodiert (erhalten von D. Wahl und N. Pace), hergestellt. Die Substrat-RNAs wurden mit L-19-IVS-beta-RNA in 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, bei 50ºC inkubiert; zusätzlich war GTP in der angegebenen Konzentration vorhanden. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mM gestoppt. Die Produkte wurden durch Elektrophorese in 4%igen Polyacrylamid-, 8 M Harnstoff-Gelen analysiert und einer Fluorographie (a) oder Autoradiographie (b) unterzogen.
Fig. 3 Drei unterschiedliche Ribozyme können zwischen Sequenzen unterscheiden, die nur durch den Austausch einer einzelnen Base innerhalb des Erkennungselementes voneinander abweichen. a: Synthese definierter Oligoribonucleotid-Substrate durch die Methode von Lowary et al., (Lowary, P. et al., NATO ASI Series A, Band 110, 69-76, 1986). DNA wurde mit T7- RNA-Polymerase in Gegenwart von [alpha ³²P] ATP transkribiert, um mit ³²P in den angezeigten Positionen (*) markierte Oligonbonucleotide herzustellen. b. Vorgeschlagene Wechselwirkungen zwischen den drei Oligoribonucleotid-Substraten (obere Strange, fette Buchstaben) und den aktiven Stellen der passenden Ribozyme (untere Strange). Pfeile zeigen Spaltstellen und Stellen der Guanosinaddition. c: Spaltung von drei Oligoribonucleotid-Substraten durch Wildtyp- und abweichende L-19-IVS-RNAs, die mittels 20%iger Polyacrylamid-, 7 M Harnstoff-Gelelektrophorese geassayt wurde. (-): Unbehandeltes Substrat. In anderen Paaren von Spuren wurde 1,0 uM ³²p-markiertes Substrat mit 0,125 M Ribozym 15 min lang (linke Spur) oder 60 min lang (rechte Spur) bei 50ºC in 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pli 7,5, 0,5 mM GTP (unmarkiert), 2,5 M Harnstoff inkubiert. Weil das ³²P auf die Nucleotide, die stromabwärts von der Spaltstelle liegen, begrenzt ist, ist nur das kleinere der Produkte sichtbar. Die Identität des GA&sub5;-Produktes wurde durch die Behandlung des Substrats und der Reaktionsmischungen mit RNase T&sub2; und das Kontrollieren des Transfers von ³²P auf Gp bestätigt. Die Bande, die oberhalb von GA&sub5; in den Spuren 2 und 3 wandert, wurde nicht konsistenter Weise erzeugt und wurde nicht identifiziert.

Methoden:

Substrate wurden durch die Transkription von auf einem DNA-Synthesegerät von Applied- Biosystems synthetisierten Desoxyoligonucleotiden hergestellt. Derselbe obere Promotorstrang wurde in jeder Transkription verwendet. Der untere Strang, welcher Promotor- und Matrizensequenzen enthält, wurde verändert, um die unterschiedlichen RNA-Substrate zu erhalten. Die DNA wurde mit gereinigter Phage-T7-RNA-Polymerase transkribiert (Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 2 035- 2 039) wie beschrieben (Lowary, P., et al., NATO ASI Series, Band 110, wie oben). Abweichende Ribozyme werden von Been und Cech beschrieben (Been, M.D., et al., (1986) Cell 47: 207- 216). Das 24C-Ribozym wurde auf ähnliche Weise aus Transkripten von pBG/-3G:24C hergestellt. Die abweichenden Ribozyme wurden einer beta-Eliminierung, um ihr 3'-terminales G zu entfernen, nicht unterzogen.
Fig. 4 Kinetische Analyse der RNA-Endoribonuclease-Reaktion. a: das Oligoribonucleotid- Substrat (2,5 uM) wurde mit Wildtyp-L-19-IVS-beta-RNA (0,2 uM) wie in Fig 3 inkubiert; außer daß Harnstoff weggelassen wurde. b: Kinetik des Spaltens von GGCCCUCUA&sub5; als eine Funktion der GTP-Konzentration. Die RNA-Substratkonzentration wurde konstant bei 2,5 uM gehalten. c. Kinetik des Spaltens als eine Funktion der RNA Konzentration, wobei die GTP Konzentration konstant bei 0,5 mM gehalten wurde.

Methoden:

Die Produkte wurden mittels einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Mit dem Autoradiogramm als Anleitung wurde ein jedes Gel in Streifen geschnitten und die Radioaktivität in dein Substrat, das nicht reagiert hatte, und dem GA&sub5;-Produkt wurde durch eine Flüssig-Szintillationszählung bestimmt. Die Anfangsspaltgeschwindigkeit (Vo) wurde aus einem halblogarithmischen Diagramm der Fraktion der Reaktion als einer Funktion der Zeit bestimmt. 1/Vo wurde dann als eine Funktion des Kehrwerts der Substratkonzentration aufgetragen; die Graphen sind lineare Anpassungen der kleinsten Quadrate zu den Datenpunkten.
Fig 5. Das Plasmid pBGST7 enthält ein Fragment, wobei die IVS in eine Vielfachklonierungsstelle eines kleinen pUC 18-Derivates eingefügt ist, welches seinerseits einen Phage-T7- Promotor enthält. Die doppelte Linie steht für die Plasmid-DNA mit der IVS. Die relativen Positionen der Promotoren sind angezeigt. Die Positionen der EcoRI- und Hind III-Stelle sind durch die Pfeilspitzen kenntlich gemacht. Die obere Linie steht für das In-Vitro-Transkript, das von der gereinigten Plasmid-DNA mit der Phage-T7-RNA-Polymerase hergestellt wurde. Die Zahlen über ihm beziehen sich auf die Länge, in Nucleotiden, des Exons und der IVS. Die untere Linie steht für das In-Vivo-Transkript des 5'-Endes von lacZ'. Die IVS (dicke Linie) enthält in allen drei Leserahmen Stop-Codons, so kann ein fünktionelles alpha-Fragment nur hergestellt werden, falls die IVS ausgeschnitten ist und die Exons durch Spleißen in E. coli verknüpft werden.
Wir beschreiben hier eine fünfte enzymatische Aktivität des Tetrahymena-Ribozyms. Es spaltet andere RNA-Moleküle an Sequenzen, die der 5'-Spleiß-Stelle des rRNA-Vorläufers ähneln. Das Spalten erfolgt gleichzeitig mit dem Zufügen eines freien Guanosin-Nucleotids an das 5'-Ende des stomabwärts gelegenen RNA-Fragments; daher kann ein Produkt leicht während der Reaktion endmarkiert werden. Die Reaktion ist dem ersten Schritt des Prä-rRNA-Selbst- Spleißens analog (Fig. 1). Ein Spalten erfordert nicht das Nucleotid G&sup4;¹&sup4; des Ribozyms; daher schließt es, anders als die ersten vier Aktivitäten, nicht die Bildung eines kovalenten Enzym- Substrat-Intermediates ein. Daher existieren als ein Ergebnis der Arbeit der Erfindung sequenzspezifische Endoribonucleasen proteinfrei, d.h. fähig in der Abwesenheit von einem Protein zu wirken, und zusarmengesetzt aus RNA, welche enzymatisch aktiv gegenüber anderen RNA- Molekülen sind. Diese RNA-Ribozyme wirken auf exogene RNA. Daher ist das Enzym oder Ribozym aus RNA zusammengesetzt und das Substrat ist RNA (oder gemischte RNA-DNA- Polymere).
Das Ribozym hat eine hohe Spezifität für das Spalten nach der Nucleotidsequenz CUCU; unter stringenten Bedingungen kann es Stellen, die eine Übereinstimmung von 3 aus 4 mit dieser Erkennungssequenz haben, benachteiligen. Zum Beispiel spaltet das Ribozym in einer Lösung mit 2,5 M Harnstoff nach CUCU, während es die verwandten Sequenzen CUGU und CGCU ignoriert (Fig. 3c). Die Sequenzspezifität nähert sich der von den DNA-Restriktionsendonucleasen an (Nathans, D. und Smith, H.O. (1975) Annu. Rev. Biochem. 44: 273-293). Wir zeigen weiter, daß stellenspezifische Mutationen in der aktiven Stelle der IVS-RNA, der sogenannten internen Leitsequenz (Davies, R.W., et al., (1982) Nature 300: 719-724; Waring, R.B., et al., (1986) Nature 321: 133-139) oder der 5'-Exon-Bindestelle (Inoue, T., et al., (1985) Cell 43: 431-437; Garriga, G., et al., (1986) Nature 322:86-89; Been, M.D. und Cech, TR., (1986) Cell 47 : 207-216), die Sequenzspezifität des Ribozyms in einer vorhersagbaren Weise ändern. In ihrer Wirkungsweise als Endoribonuclease erkennt die L-19-IVS-RNA vier oder mehr Nucleotide bei der Auswahl einer Reaktionsstelle. Protein-Ribonucleasen, die auf einzelsträngige RNA-Substrate wirken, haben nur auf dem Niveau des Mononucleotids eine Spezifität (zum Beispiel spaltet Ribonuclease T&sub1; nach Guanosin). Daher hat die L-19 mehr Basensequenzspezifität für einzelsträngige RNA als eine jegliche bekannte Protein- Ribonuclease und kann der Spezifität von einigen der DNA-Restriktionsendonucleasen nahekommen. Eine attraktive Eigenschaft dieser neuen RNA-Endoribonuclease ist, daß ihre Substratspezifität vollständig und vorhersagbar durch das Verändern der Sequenz der internen Bindestelle geändert werden kann.
Die Endoribonuclease-Reaktion ist dem ersten Schritt des Prä-rRNA-Selbst-Spleißens analog (Fig. 1). Sowohl die enzymatische als auch die Selbst-Spleiß-Reaktionen verwenden die selben zwei Bindestellen, eine Oligopyrimidin-Bindestelle und eine Guanosin-Bindestelle, um Spezifität zu erreichen und zu der Katalyse beizutragen. Die Oligopyrimidin-Bindestelle ist ebenfalls als die 5'-Leitsequenz (Waring, R.B., et al., (1986) Nature 321:133-139) oder die 5'-Exon- Bindestelle (Inoue, T., et al., (1985) Cell 43: 431; Garriga, G., et al., (1986) Nature 322: 86- 89; Been, M.D. und Cech, T.R., Cell (1986) 47: 207-216) bekannt. Ihre Rolle beim Selbst- Spleißen wurde überzeugend durch die Analyse von Einzelbasen-Mutationen und Zweit- Stellen-Suppressor-Mutationen gezeigt (Waring, R.B., et al., (1986) siehe oben; Been, M.D. und Cech, T.R., (1986) siehe oben; Perea, J. und Jacq, C., (1985) EMBO, J., 4: 3 281). Die Rolle dieser selben Nucleotide bei der Endoribonuclease Reaktion wird durch die Veranderung der Substratspezifitat der mutanten Enzyme (Fig. 3) gezeigt, wobei die veranderte Spezifität nach den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung vorhersagbar ist. Die am Selbst-Spleißen beteiligte Guanosin-Bindestelle wurde auf keinem besonderen Satz von Nucleotiden lokalisiert, aber ihre allgemeinen Eigenschaften wurden beschrieben (Bass, B.L. und Cech, T.R., (1984) Nature 308: 820, (1986) Biochemistry 25: 4 473). Die Endonbonuclease-Aktivitat scheint nach den folgenden Kriterien dieselbe Guanosin Bindestelle zu verwenden. in beiden Fallen ist Guanosin so aktiv wie GTP, wohingegen UTP, CTP, ATP und dGTP eine geringe, falls uberhaupt irgendeine, Aktivitat haben. Zusatzlich ist der Kam von 44 uM, für GTP gezeigt, in vernunftiger Ubereinstimmung mit dem Wert von 32 ± 8 uM, bestimmt für Selbst Spleißen unter etwas anderen Reaktionsbedingungen (Bass, B.L. und Cech, T.R., Biochemistry (1986) siehe oben).
Die Endoribonuclease-Aktivität der L-19-IVS-RNA erfordert nicht ihr 3'-terminales Guanosin (G&sup4;¹&sup4;). Diesbezüglich weicht es von den Nucleotidyltransfer-, Phosphotransfer- und den hydrolytischen Aktivitäten desselben Enzyms ab. In diesen Reaktionen nimmt G&sup4;¹&sup4; an einem kovalenten Enzym-Substrat-Komplex teil, der ein obligatorisches Reaktionsintermediat zu sein scheint (Zaug, A.J. und Cech, T.R. (1986) Science 231: 470-475; Zaug, A.J. und Cech, T.R., (1986) Biochemistry 25: 4 478). Daher ist die L-19-IVS-RNA nicht auf Reaktionsmechanismen beschränkt, die die Bildung eines kovalenten Enzym-Substrat-Intermediats mit einschließen. Sie kann ebenfalls Bisubstrat-Reaktionen durch einen Einzelumlagerungsmechanismus bzw. Einzelverdrängungsmechanismus katalysieren. Ribonuclease P, ein RNA- Enzym, das das Spalten durch Hydrolyse statt durch Umesterung katalysiert, scheint ebenfalls ohne die Bildung eines kovalenten Intermediates zu wirken (Marsh, T.L., et al., (1985) Science 229: 79-81; Guerrier-Takeda, C., et al., (1986) Biochemistry 25: 1 509).
Die hier berichtete Endoribonuclease-Aktivität von der L-19-IVS-RNA scheint einzelsträngige RNA-Substrate zu erfordern. Auf der kürzlich von Szostak ((1986) Nature 322: 83-86) berichteten Arbeit beruhend, scheint es möglich, daß eine kleinere Version der Tetrahymena- IVS-RNA, der ihre 5'-Exon-Bindestelle fehlt, eine Endoribonuclease-Aktivität haben könnte, die ein basengepaartes Substrat erfordert. Das von Szostak ((1986) Nature, siehe oben) getestete Substrat war ein RNA-Fragment, das das Ende des 5'-Exons, gepaart mit der 5'-Exon- Bindestelle, enthielt. Dieses RNA-"Substrat" schloß jedoch ebenfalls einen wesentlichen Anteil der IVS-RNA ein, so bleibt es nachzuweisen, ob das Ribozym eine Endoribonuclease-Aktivität bei doppelsträngigen RNA-Substraten im allgemeinen hat.
Die vorliegende Erfindung stellt ein enzymatisches Ribonucleinsäuremolekül bereit, welches in der Lage ist, durch Umesterung ein separates RNA-Molekül an einer vorbestimmten Phosphatesterbindung in einer einzelsträngigen Ziel-Nucleotidsequenz innerhalb des separaten RNA-Moleküls zu spalten, wobei das enzymatische Molekül umfaßt:
(i) einen Substratbindungsteil, der zur Bindung mit der Ziel-Nucleotidsequenz in der Lage ist; und
(ii) einen enzymatischen Teil mit Endonucleaseaktivität, unabhängig von irgendeinem Protein in vitro, wobei das enzymatische Molekül nur die einzelsträngige Zielsequenz spalten kann, ohne Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem enzymatischen Molekül und irgendeinem Teil des separaten RNA-Moleküls.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfähren zur spezifischen Spaltung eines separaten RNA- Moleküls an einer einzelsträngige RNA beinhaltenden Ziel-Nucleotidsequenz bereit, umfassend das Kontaktieren eines enzymatischen Ribonucleinsäuremoleküls, wie oben definiert, mit einem separaten RNA-Molekül, welches eine einzelsträgige Ziel-Nucleotidsequenz enthält, unter Bedingungen, die zu einer spezifischen Spaltung der Zielsequenz durch Endonucleaseaktivität des enzymatischen Moleküls führen.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines enzymatischen Ribonucleinsäuremoleküls mit einer von irgendeinem Protein unabhängigen Endonucleaseaktivität bereit, wobei die Aktivität für eine Nucleotidsequenz spezifisch ist, die eine Spaltstelle definiert welche eine einzelsträngige RNA-Zielstelle in einem separaten ersten RNA-Molekül beinhaltet, umfassend die Schritte:
(i) Nachweisen eines zweiten RNA-Moleküls, das zur intramolekülaren Spaltung durch Umesterung, die sich aus einem nucleophilen Angriff an einer Phosphoresterbindung ergibt, in der Lage ist,
(ii) Bestimmen der Spaltstelle und der nucleophilen Angriffsgruppe des zweiten RNA-Moleküls, wobei jene Stelle mindestens vier Basen beinhaltet, und
(iii) Synthetisieren eines enzymatischen Ribonukleinsäuremoleküls, das dem zweiten RNA- Molekül entspricht, jedoch nicht die Spaltstelle und die nucleophile Angriffsgruppe besitzt, so daß das enzymatische Molekül nur durch Umesterung eine einzeisträngige Zielsequenz spalten kann, ohne Bildung einer kovalenten Bindung zwischen sich und irgendeinem Teil der Zielsequenz, wobei das Synthetisieren gegebenenfalls das Abändern eines oder mehrerer Reste des zweiten RNA-Moleküls einschließt so daß die Zielspezifität des enzymatischen Moleküls verändert ist.
Sequenzspezifische Endoribonucleasen könnten viele der gleichen Anwendungen für die Untersuchung von RNA besitzen, die DNA-Restriktionsendonucleasen für die Untersuchung von DNA bzw. DNS haben (Nathans, D. und Smith, H.O., (1975) Ann. Rev. Biochem. 44: 273). Zum Beispiel könnte das Muster von Restriktionsfragmenten verwendet werden, um Sequenzverwandtschaften zwischen zwei verwandten RNAs nachzuweisen und große RNAs konnten in spezifischer Weise in Fragmente von einer zur Untersuchung nutzlicheren Große gespalten werden. Die Spezifitat des Ribozyms für 4 Nucleotide ist ideal zur Spaltung von RNAs einer unbekannten Sequenz, eine RNA einer zufaliigen Sequenz wurde durchschnittlich alle 256 Basen eine Spaltstelle aufweisen. Darüber hinaus ist die automatische Endmarkierung eines Fragmentes während der Ribozymspaltung ein praktischer Vorteil.
Die Entwicklung der Ribozyme als nützliche Instrumente für die Molekularbiologie hat begonnen. Die Spaltungseffizienz großer RNA-Substrate muß erhöht werden, so daß vollständige Verdaue statt teilweiser Verdaue erhalten werden können. Die Wirkungen denaturierender Mittel wie Harnstoff und Formamid muß weiter untersucht werden; sie scheinen die Sequenzspezifität der Spaltung zu erhöhen und zur selben Zeit sollten sie die Struktur in dem Substrat aufschinelzen, um die Verfügbarkeit von Zielsequenzen zu maximieren. Schließlich kann die Mutagenese der aktiven Stelle des Ribozyms durch Fachleute durchgeführt werden, um alle möglichen Permutationen der 256 möglichen Tetranucleotid-Spaltungsenzyme sicherzustellen.

RNA-Sequenzerkennung

Protein-Ribonucleasen können RNA-Substrate mit hoher Spezifität spalten, indem sie eine Kombination der RNA-Struktur und -Sequenz erkennen, wobei die Betonung auf der Struktur liegt (z.B. RNase III (Robertson, H.D. (1982) Cell 30: 669) und RNase M5 (Stalil, D. A., et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5 644). Bekannte Proteine, die einzelsträngige RNA-Substrate spalten, haben andererseits eine Spezifität nur auf der Ebene des Mononucleotids oder des Dinucleotids (z.B. schneidet RNase T&sub1; nach Guanosinen [Egami, F., et al., (1980) Molec. Biol. Biochem. Biophys. 32: 250-277]). Daher hat die L-19-IVS-RNA beträchtlich mehr Basensequenzspezifität für die Spaltung einzelsträngiger RNA als irgendeine bekannte Protein-Ribonuclease.

Abweichende Ribozyme (oder andere Versionen des Ribozyms, die Aktivität beibehalten)

Frühere Arbeit an den Sequenz-Erfordernissen für das Selbst-Spleißen (Price, J.V. et al., (1985) Nucleic. Acid. Res. 13: 1 871) zeigen, daß die Sequenz-Erfordernisse untersucht werden können, wie darin durch Insertionen und Deletionen gezeigt, um andere selbstspleißende IVS-RNAs zu erhalten. In ähnlicher Weise konnten wir die L-19-IVS-RNA verändern, um eine Reihe von RNA-sequenzspezifischen Endoribonuclease-Molekülen zu erhalten. Derart wurden drei Bereiche von Price et al. gefünden, die für das Selbst-Spleißen der IVS nötig sind. Ähnliche Experimente würden die nötigen Anteile der L-19-IVS-RNA für die Endoribonuclease-Aktivität enthüllen, Burke, J.M., et al., (1986) Cell 45: 167-176, zeigt die Rolle konservierter Elemente für die IVS-Selbst-Spleiß-Sequenz; diese Arbeit zeigt eine weitere Verwendung von Mutageneseexperimenten, um die hochkonservierten Sequenzen zu verandern, um ihre Aktivität zu ändern. Ebenso kann in ähnlicher Weise die Aktivitat der L-19- IVS-RNA mit begleitender Veränderung der Aktivität verändert werden, um eine Reihe von Endoribonucleasen zu verwirklichen.
Cech, T.R., et al. haben kürzlich ein noch kleineres Stück der L-19-IVS-RNA gefünden, welches eine vollständige enzymatische Aktivität enthält und die Nucleotide 19-331 der RNA umfaßt. Man hat ebenfalls gefünden, daß das Stück von 21-331 vollständig aktiv ist. Plasmide wurden konstruiert, um die L-19- und L-21-IVS-RNA-Stränge in direkter Weise herzustellen. Hier ist der Promotor auf die Position 19 oder die Position 21 verlagert und die DNA, die für die Restriktionsstelle kodiert, ist an der Position 331 statt an der Stelle 414.
Been, M.D. und Cech, T.R. ((1986) Cell 47: 207) zeigen unter Verwendung stellenspezifischer Mutagenese, däß Veränderungen in der Spezifität der Polymeraseaktivität eine Polymeraseaktivität bezüglich Oligo-U zur Folge haben. Daher können Fachleute leicht das Obenstehende verwenden, um andere aktive L-19-IVS-RNA-Enzyme zu erhalten.
Waring, R.B. und Davies, (1984) Gene 28: 277, zeigen eine Klasse von IVS-RNA-Molekülen mit ähnlicher Struktur. Diese Arbeit ist ähnlich zu der von Cech, T.R. et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3 903, die eine Klasse von Pilzmitochondrien-RNA-IVS-Molekülen zeigt. Es wurde gefünden, daß einige dieser anderen IVS-Moleküle selbst-spleißend sind; (Cech, T.R., et al., (1981) Cell 27 487 Kruger, K., et al., (1982) ebenda 31: 147; Garriga, G., et al., (1984) ebenda 39. 631 Van der Horst, G., et al., (1985) ebenda 40: 759; Chu, F.K., et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 10 680; Peebles, C.L., et al., Cell im Druck, Van der Veen, R., et al., ebenda im Druck). Daher kann eine Serie oder viele Serien oder eine Klasse oder Familie von Endoribonucleasen aus derselben oder aus anderen natürlichen Quellen auf der Arbeit der Erfindung begründet werden. Fachleute werden in der Lage sein, andere RNA-Enzyme aus unterschiedlichen natürlichen Quellen ausfindig zu machen.
Man kann die folgenden RNA-Sequenzelemente so betrachten, daß sie die minimale aktive Stelle für die Ribozymaktivität bereitstellen, basierend auf Cech, et al., PNAS (1983) und Waring & Davies, siehe oben. Die Elemente A und B wechselwirken miteinander, wie dies 9L und 2 tun. An vielen Positionen der Sequenz ist mehr als 1 Base zulässig; die beobachteten Substitutionen werden gezeigt, indem ein Buchstabe direkt unterhalb der Base für die er substituieren kann, gedruckt ist. Zum Beispiel werden an Position 1 in Sequenzelement A die Nucleotide A und U beobachtet, wobei A häufiger ist. ebenfalls genannt N= beliebige Base
wobei diese, nämlich GACUA links und UAGUC rechts, wie unterstrichen paaren;
kompensatorische Basenaustausche sind gestattet.- Siehe Burke, et al., (1986) siehe oben
Die lineare Sequenz der Nicht-Matrizen-DNA, die für L-IVS-RNA kodiert, ist nachfolgend gezeigt. Das kodierende Bereich für das L-19-WS-RNA-"Ribozym" beginnt an der durch den Pfeil angezeigten Stelle und erstreckt sich bis zum Ende (G&sup4;¹&sup4;). Natürlich sind in der RNA die Ts Us.
Bei der Diskussion der L-19-IVS-RNA ist der Bereich der Sequenz für die aktive Stelle, der in Bezug auf die Aktivität und Varianten diskutiert wird:
Das erste Ribonucleotid für die L-19-IVS-RNA an dem 5'-OH-Ende ist das Äquivalent des Nucleotids 20 der intakten L-IVS-RNA. Was die Positionen 23, 24, 25 etc. betrifft, so sind dies die Positionen 23, 24, 25 der L-IVS-RNA (als ob die ersten 19 Positionen vorhanden wären).
Da dC&sub5; an die L-19-IVS-RNA bindet (siehe oben), ist es währscheinlich, daß die Endoribonucleasen auf gemischte Polymere von DNA und RNA einwirken werden. Zum Beispiel wird die L-19-IVS-RNA den DNA-Anteil binden, während das RNA-Enzym auf den RNA-Teil des gemischten Polymers einwirkt. Veränderungen der Bindestelle, um die anderen Nucleotide zu binden, werden zu einer Reihe von gemischter Polymer-Aktivität in einer Serie solcher Endoribonucleasen führen.

Abkürzungen:

IVS: intervenierende Sequenz; L-19-IVS-RNA (lies "L minus 19"): eine lineare RNA von 395 Nucleotiden, der die ersten 19 Nucleotide der IVS fehlen; CHES: 2-(Cyclohexylamin)ethansulfonsäure; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure; MES: 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure; Tris: Tris(Hydroxymethyl)aminomethan; p*: ³²P innerhalb eines Oligonucleotids (zum Beispiel: C5p* ist CpCpCpCpC[³²P]-pCp).

Enzymherstellung:

Die L-19-IVS-RNA kann synthetisiert und gereinigt werden, wie von Zaug und Cech (1986) Science (Wash., D.C.) 231: 470-475 beschrieben (siehe die Fig. 5 für eine detaillerte Beschreibung). Kurz gesagt, wurde RNA von pSPTT1A3 mit Bakteriophage-SP6-RNA-Polymerase in vitro transkribiert. (Alternativerweise kann RNA von pT7-TT1A3 oder von einem beliebigen der Plasmide aus der pBG-Serie mit Bakteriophage-T7-RNA-Polymerase in vitro transkribiert werden). Die Transkripte wurden weiter inkubiert, um das Selbst-Spleißen und die Zirkularisierung der IVS-RNA zu fördern. Die RNA wurde anschließend in MgCl&sub2; bei pH 9,0 inkubiert (Bedingungen der stellenspezifischen Hydrolyse), um die zirkuläre IVS-RNA in L- 19-IVS-RNA umzuwandeln. Die L-19-IVS-RNA wurde durch Polyacrylarnidgelelektrophorese und Sephadex-G-50-Chromatographie gereinigt. Die Enzymkonzentration wurde durch Spektrophotometrie unter der Voraussetzung eines molaren Extinktionskoeffizienten bei 260 nm von 3,26 x 10&sup6; M&supmin;¹ cm&supmin;¹ bestimmt.

Gebräuchliche wirksame Plasmide sind wie folgt:

pSPTT1A3, pT7-TT1A3, pBGST7, pBG/-2G:23C, pBG/23C, pBG/-3G:24C, pBG/24C, pBG/-4G:25C, pBG/25C und pBG/23A&sub4; und pT7L-21. Die PBG-Plasmidserie wird in Been, M. und Cech, T.R. (1986) Cell 407: 207 beschrieben. Zum Beispiel stellen die Plasmide pBG/3G:24C und pBG/24C die L-19-IVS-RNA-24C-Variante her, welche RNA nach der 4- Basensequenz CGCU schneidet. Diese Plasmide sind hinterlegt und verfügbar im "Department of Chemistry und Biochemistry, University of Colorado", Boulder, Colorado 80 309-0215. Beispiele von diesen, einschließlich von pBGST7 (ATCC 40 288), pT7-TT1A3 (ATCC 40 290) und pBG/-3G:24C (ATCC 40 289), wurden bei der "American Type Culture Collection" (ATCC) 12 301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20 301, am 25. November 1986 hinterlegt. Das Plasmid pT7L-2 1 stellt die L-21-IVS-RNA her, worin die ersten 21 Basen deletiert sind. Dieses Plasmid (ATCC 40 291) wurde ebenfalls bei der ATCC am 2. Dezember 1986 hinterlegt.

Herstellung der Substrate

C5p*Cp und A6p*Cp wurden aus C&sub5;-OH bzw. A&sub6;-OH mit T&sub4;-RNA-Ligase (New England Nuclear), p*Cp und ATP hergestellt. Die Produkte wurden durch 20%-Polyacrylamid-7M- Harnstoff-Gelelektrophorese und Sephadex-G-25-Chromatographie gereinigt. C5p* wurde aus C5p*Cp durch eine Behandlung mit Kälberdarmphosphatase und eine beta-Eliminierung hergestellt (Winter & Brownlee, (1978) Nucleic Acid. Res. 5: 3 129). Unmarkiertes C5p wurde in einer ähnlichen Weise mit unmarkiertem pCp als Donor in der Ligase-Reaktion hergestellt. Die Konzentration wurde durch Spektrophotometrie unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten bei 270 nm von 30 x 10³ M&supmin;¹ cm&supmin;¹ bestimmt.

Herstellung von E-p*

Unmarklerte L-19-IVS-RNA (16 pMol) wurde mit 5,2 pMol C5p* in 50 mM NaOAc, pH 5,0, und 20 mM MgCl&sub2; bei 42ºC 10 min. lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von EDTA bis zu 40 mM gestoppt. Das E-p* wurde von nicht-reagiertem C5p* durch Säulenchromatographie auf Sephadex G-100-120 gereinigt welche in 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,25 M NaCl und 0 001 M EDTA aquilibriert worden war. Die Fraktionen, die den E-p*- Komplex enthielten, wurden vereinigt und mit 3 Volumen Ethanol präzipitiert. Das getrocknete Präzipitat wurden dann in H&sub2;O gelöst.

Endoribonuclease-Standardreaktionen

Die Substrat-RNA wird gemäß des Verfährens von Carmichael und Mcmaster (1980) Meth. in Enzymol. 65: 380-391 mit Glyoxal vorbehandelt und dann mit Ethanol präzipitiert, und das Präzipitat wird durch Zentrifugation in einer Eppendorff-Zentrifuge pelletiert. Das Pellet wird getrocknet und die RNA in Wasser resuspendiert. Die glyoxylierte Substrat-RNA (0,2 uM) wird mit Ribozym (zum Beispiel L-19-IVS-beta-RNA, 0,2 uM) bei 50ºC in 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM GTP, 2,5 M Harnstoff eine Stunde lang inkubiert

Stoppen der Reaktion und Analyse der Produkte

In allen Fällen werden die Reaktionen durch die Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mM gestoppt. Die Produkte können durch Elektrophorese in einem 20%-Polyacrylamid-7,0M-Harnstoff-Gel (Standardsequenzierungsgel) analysiert werden. Falls ³²P-markierte RNA-Substrate verwendet werden, können die Produkte durch Autoradiographie lokalisiert werden.
Die folgenden Beispiele und die obenstehenden Standardbedingungen dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, sie nicht aber zu beschränken.

Beispiel I

Sequenzspezifisches Spalten bzw. Schneiden großer RNAs:

Das L-19-IVS-RNA-Enzym wurde hergestellt durch das Inkubieren von Prä-rRNA unter Bedingungen, die das Selbst-Spleißen, die Zirkularisierung und die stellenspezifische Hydrolyse begünstigen (Zaug, A.J., et al., (1984) Science 224: 574; Zaug, A.J., et al., (1986) Science 231: 470). Das 3'-terminale Guanosin (G&sup4;¹&sup4;) wurde dann von der L-19-IVS-RNA durch eine Periodatoxidation, gefolgt von einer beta-Eliminierung, entfernt (Winter, G., et al., (1978) Nudeic Acids Res. 5: 3 129-3 139). Wie erwartet hat das sich ergebende Ribozym (L-19-IVS- beta) eine stark reduzierte Aktivität als Nucleotidyltransferase, was unter Verwendung von [³²P]-p(C)&sub5; als Substrat geassayt wurde. Wenn GTP zugegeben wurde, war das Ribozym jedoch fähig, p(C)&sub5; ebenso zu schneiden, wie große RNA-Moleküle. Zum Beispiel wurde das 504 nt große pAK105-Transkript (Mount, S.M., et al., (1983) Cell 33: 509-518), ein Fragment der Mäuse-beta-Globin-Prä-mRNA, welches das erste Intron enthält, gespalten, um größere Fragmente von 148, 360 und 464 nt sowie einige kleinere Fragmente zu ergeben (Fig. 2a). Wie nachfolgend gezeigt, können die 360- und 148-nt-Fragmente als die 5'- und 3'-Produkte der Spaltung an Position 360 erklärt werden. Das 464-nt-Fragment ist das 3'-Produkt der Spaltung an Position 44, wobei das 5'-44-nt-Fragment zu klein ist, um beobachtet zu werden. Die Abwesenheit einer größeren Menge einer 316-nt-RNA, dem erwarteten Produkt der Spaltung sowohl an der Position 44 als auch der Position 360, zeigt einen Partialverdau mit wenigen Molekülen, die mehr als einmal gespalten wurden, an.
Das Spalten erforderte Magnesiumionen (Optimum bei 10-20 mM MgCl&sub2;) und war im wesentlichen unabhängig von monovalentem Kation in dem Bereich von 0-200 mM NaCl. Das pH-Optimum lag in dem Bereich von 7,5 bis 8,0, und das Temperaturoptimum betrug etwa 50ºC Obwohl die beta-eliminierte L-19-IVS-RNA in der Lage war, die Spaltungsreaktion zu katalysieren, war die Entfernung von G&sup4;¹&sup4; vom Ribozym für die Spaltungsaktivität nicht erforderlich. Das Enzym arbeitete mit derselben Geschwindigkeit, ob das G&sup4;¹&sup4; entfernt worden war oder nicht. Wir erklären die Aktivität der intakten L-19-IVS-RNA durch das Postulat, daß bei Sättigungskonzentrationen von GTP der Angriff von GTP auf das Substrat sehr effektiv mit dem Angriff durch G&sup4;¹&sup4; kompetitiert.
Wir vermerken, daß die IVS-RNA und die L-19-IVS-RNA proteinfrei sind. Die L-19-IVS- RNA ist daher ein proteinfreies RNA-Enzym (oder Ribozym). Die L-19-IVS-RNA und dergleichen fünktionieren also als Enzyme in der Abwesenheit von Proteinen. Dies gilt sowohl für exogenes als auch für endogenes Protein. Dies wird bewiesen durch das Beibehalten von Aktivität, wenn sie einer Protease-Aktivität, Kochen oder Natriumdodecylsulfat unterzogen wird. Jegliches RNA-Polymerase-Protein aus dem Transkriptionssystem, das verwendet wurde, um die IVS-RNA herzustellen, wird durch Phenolextraktion entfernt. Die Möglichkeit, die IVS-RNA in einem zur Gänze definierten System in vitro herzustellen, und die RNA-Polymerase durch eine Phenolextraktion zu entfernen, ist ein weiterer Beweis für die proteinfreie Natur der Reaktion.

Beispiel II

Markierte Spaltungsprodukte:

Wenn [alpha-³²P]-GTP in der Reaktion von pAK105-RNA wie in obenstehendem Beispiel I eingeschlossen wurde, waren die 148- und 464-nt-Spaltungsprodukte markiert (Fig. 2b). Ein direktes Sequenzieren dieser markierten RNA-Fragmente (z.B. Fig. 2c) zeigte, daß die Spaltung und die GTP-Addition an den Nucleotiden 44 und 360 in der Sequenz auftreten, so daß die stromabwärts liegenden Spaltungsprodukte 5'-GTP-markiert sind. Die durch die GTP- Addition gebildeten Bindungen sind gegenüber RNase T&sub1; empfindlich, was bestätigt, daß das GTP durch sein 3'-O mittels einer normalen 3'-5'-Phosphodiesterbindung kovalent angefügt war. Die Reaktion der 841 nt großen pT7-1-(Xmn 1)-RNA (im wesentlichen pBR322- Sequenzen) stellte 4 markierte Hauptfragmente her. Diese wurden auf dieselbe Weise sequenziert. pT7-1-RNA mit zusätzlichen 122 nt an ihrem 3'-Ende, hergestellt durch die Transskription von pT7-1-DNA, die an der ScaI-Stelle geschnitten worden war, zeigte die erwartete Vergrößerung des Molekulargewichtes der markierten Produkte. In all diesen Reaktionen, einschließlich derer, in welchen Substrat-RNA weggelassen worden war, wurde die L-19-IVS- RNA markiert, möglicherweise durch die Guanosin-Austauschreaktion, die anderswo vorgeschlagen worden ist (Zaug, A.J., et al., (1985) Science 229: 1 060-1 064; Price, J.V., et al., (1987) J. Mol. Biol. im Druck). Die Stellen der Selbstmarkierung waren heterogen.

Beispiel III

Bewertung der Spezifität:

Die Sequenz nahe des 5'-Endes eines jeden endmarkierten Produktes (siehe Beispiel II oben) wurde mit der bekannten Sequenz der RNA verglichen, um die der Spaltstelle vorausgehenden Nucleotide zu identifizieren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Sowohl den Haupt- als auch den Nebenspaltstellen gehen vier Pyrimidine voraus, wobei die Konsensus- Sequenz CUCU ist. Dies ist exakt die Tetranucleotidsequenz, von der erwartet wird, daß sie ein optimales Ziel für das Ribozym darstellt. Die Wichtigkeit der Nucleotide an den Positionen -5 und -6, bezogen auf die Spaltstelle, ist noch nicht klar, obwohl die Abwesenheit von G- Resten signifikant sein kann. Es gibt keine offensichtliche Sequenzbevorzugung stromabwärts von der Spaltstelle, wobei alle vier Nucleotide an Position +1 vertreten sind.
Bei der Bewertung der Spezifität ist es ebenfalls nötig, zu betrachten, welche möglichen Stellen in der RNA nicht durch das Ribozym gespalten wurden. Was die pAK105-RNA betrifft, gab es nur eine CUCU-Stelle, an der eine Spaltung nicht beobachtet wurde. (Eine Spaltung an dieser Stelle würde eine markierte 378 nt große RNA hergestellt haben.) Andererseits wurden ziemlich viele Stellen, die CUCU in 3 von 4 Positionen entsprechen, nicht gespalten. Diese schließen 17 CUMU-Sequenzen (wobei M ≠ C) und 7 CNCU-Sequenzen (wobei N ≠ U) ein. In pT7-1-RNA wurde eine Spaltung an den beiden CUCU-Sequenzen in der RNA beobachtet, jedoch nur bei einer der 15 vorhandenen UUUU-Sequenzen. Somit hat das Ribozym eine starke Präferenz für die Spaltung nach dem Tetranucleotid CUCU.

Beispiel IV

Spaltung innerhalb von Bereichen basengepaarter RNA-Sekundärstruktur:

M1-RNA, die RNA-Untereinheit der RNase P von E.coli (Reed, R.E., et al., (1982) Cell 30: 627-636) wurde nicht durch die L-19-IVS-RNA-beta unter Standardreaktionsbedingungen gespalten (Fig. 2b). M1-RNA enthält die Sequenz UCCUCU, welche eine ausgezeichnete Ziel- Stelle sein sollte. Diese Sequenz ist jedoch an einem stabilen Haarnadelstamm beteiligt (Guerrier-Takada, C., et al., (1984) Biochemistry 23: 6 327-6 334; Pace, N.R., et al., (1985) Orig. of Life 16: 97- 116), was sie vermutlich als ein Substrat nicht verfügbar macht. Wir haben gefünden, daß die Denaturierung der M1-RNA mit Glyoxal das effiziente Spalten dieser Stelle durch die L-19-IVS-RNA gestattete, in Unterstützung der Interpretation, daß die RNA- Sekundärstruktur die Spaltung inhibieren kann. Das für die Denaturierung verwendete Glyoxal-Verfähren entspricht Carmichael, G.G., et al., (1980) Meth. in Enzymol. 65: 380-391.

Beispiel V

Mutationen der aktiven Stelle ändern die Substratspezifität:

Die Substratspezifität wurde als nächstes in einem definierten System untersucht, wo wir sicher sein konnten, daß eine Sekundärstruktur in der Substrat-RNA sich nicht auf die Spalt-Reaktion auswirkte. Oligoribonucleotid-Substrate wurden durch das Verfähren der Phage-T7-Polymerase-Transkription, entwickelt von Uhlenbeck und Mitarbeitern (Lowary, P., et al., (1986) NATO ASI Series, Band 110: 69-76) synthetisiert (Fig. 3a). Ein Substrat enthielt eine perfekte Ubereinstimmung mit der Tetranucleotid-Konsensus-Sequenz. Die anderen Substrate wiesen Einzelbasen-Austausche auf, die eine Übereinstimmung von 3 aus 4 mit dem Konsensus ergaben.
Diese Substrate wurden mit der Wildtyp-L-19-IVS-RNA und mit zwei veränderten Ribozymen getestet (Been, M.D. und Cech, T.R. (1986) Cell 47: 207-216). Die zwei Abweichungen haben Einzelbasen-Austausche in den 5'-Exon-Bindestellen, die die Sequenzspezifität des ersten Schritts beim Selbst-Spleißen der Prä-rRNA ändern (Been, M.D., et al. siehe oben). Von der Variante 23C (G an Position 23 der L-19-IVS-RNA umgewandelt zu C) wird erwartet, daß sie CUGU-Substrate erkennt, und die Variante 24C (A an Position 24 umgewandelt zu C) sollte CGCU erkennen (Fig. 3b). Im Verlauf dieser Studien fanden wir, daß der Einschluß von 2,5 M Harnstoff oder 15% Formarnid in die Reaktionen in starker Weise die Spezifität erhöht, was jedem Ribozym erlaubte, Substrate mit einem Einzelbasen-Austausch in der Erkennungssequenz zu unterscheiden. Unser Arbeitsmodell ist, daß diese denaturierenden Mittel die Basenpaarung zwischen dem Substrat und den Nucleotiden der aktiven Stelle des Ribozyms destabiiisieren, wodurch fehlgepaarte Komplexe benachteiligt werden. Die Ergebnisse der Behandlung der 3 Substrate mit einem jeden der 3 Ribozyme in der Gegenwart von 2,5 M Harnstoff sind in Fig. 3c gezeigt. Ein jedes Substrat wird ausschließlich durch das Ribozym gespalten, das in der Lage ist, einen in perfekter Weise basengepaarten Enzym-Substrat- Komplex herzustellen (Fig. 3b). Daher wird in Betracht gezogen, daß die aktive Stelle manipuliert werden kann, um eine beliebige Basensequenz zu erkennen, insoweit sie XYZU ist, worin X, Y und Z eine beliebige der vier Basen A, U, C, G sein können und die Nucleotide in der Sequenz von vier Basen dieselben oder verschiedene sein können.
Wenn abweichende Ribozyme mit der 504 nt großen pAK105-RNA inkubiert wurden, ergab jedes Ribozym ein anderes Muster von Spaltungsprodukten. Eine hauptsächliche Spaltstelle wurde für drei abweichende Ribozyme kartiert, wobei eine 25C-Variante (G an Position 25 umgewandelt zu C) eingeschlossen ist. Den durch die 23C-, 24C- und 25C-Ribozyme gespaltenen Stellen geht jeweils CCCUGU UCUGCU bzw. CUGUCU voraus; die Unterstreichung zeigt die Base an, die ein G C-Basenpaar mit dem mutierten Nucleotid in dem abweichenden Ribozym bilden würde. Eine jede von diesen Sequenzen kann 6 zusammenhängende Basen- Paare mit den Nucleotiden der aktiven Stelle des abweichenden Ribozyms bilden. Während mehr Spaltstellen sequenziert werden müssen, bevor eine Spezifität in geeigneter Weise beurteilt werden kann, sind diese anfänglichen Ergebnisse vielversprechend.

Beispiel VI

Die Spaltung ist katalytisch:

Der Zeitverlauf der Spaltung des Oligonucleotid-Substrates GGCCCUCU*AAAAA (worin der Stern die Spaltstelle bezeichnet) durch das Wildtyp-Ribozym ist in der Figur 4a gezeigt. Die Reaktion von 2,5 uM Substrat mit 0,2 uM Ribozym ist in 90 min zu 66% vollständig. Daher ist es leicht ersichtlich, daß das Ribozym katalytisch wirkt.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Serie von Substratkonzentrationen bestimmt. Die Kinetik wird in angemessener Weise durch das Michaelis-Menten-Geschwindigkeitsgesetz beschrieben. Die Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der GTP-Konzentration ist in Form eines Lineweaver-Burk-Diagramms in Fig. 4k gezeigt. Die Km für GTP beträgt 44 uM. Die Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der RNA-Substanz-Konzentration bei der Sättigungskonzentration von GTP ist in Fig. 4C gezeigt. Die Km für dieses Oligoribonucleotid-Substrat ist 0,8 uM, und kkat ist 0,13 min&supmin;¹. Unter Vmax-Bedingungen setzt das Enzym daher etwa 8mal pro Stunde um.

Plasmidkonstruktion

Been, Michael, D. und Cech, Thomas, R. (1986) Cell 47: 207-216 berichten über die Konstruktion der pBG-Plasmidserie. Im allgemeinen war das für diese Untersuchungen verwendete Plasmid (pBGST7) von dem Klonierungsvektor pUC18 abgeleitet. Die Methodik für die folgenden Manipulationen ist in Maniatis, T., et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor) beschrieben. pUC18 wurde mit HaeII teilweise verdaut und lineare Moleküle von Einheitslänge wurden mittels Agarosegelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Die gewonnene DNA wurde mit T4- DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu machen und dann mit Kälberdarmphosphatase dephosphoryliert. pT7-2 (U.S. Biochemical Corp.) wurde mit PvuII und HindIII geschnitten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, und das den Phage-T7-Promotor enthaltende Fragment wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Das den Promotor enthaltende Fragment wurde in den linearisierten pUC 18 ligiert und das Plasmid in den E. coli-Stamm JM83 transformiert. Einzelne Kolonien wurden abgenommen bzw. gepickt, und Minipräp-DNA wurde mittels eines Restriktionsendonuclease-Verdaus gescreent, um das Promotor-Fragment der richtigen HaeII-Stelle zuzuordnen (Position 680 auf der Karte in dem Katalog von New England Biolabs). Die Orientierung des T7-Promotors wurde bestimmt, indem EcoRI-geschnittene Minipräp-DNA mit T7-RNA-Polymerase transkribiert und die Größe des Produktes bestimmt wurde. Dieses Plasmid (pUT718) wurde dann in der Vielfachklonierungsstelle mit KpnI und SpM geschnitten und mit T4-DNA- Polymerase behandelt, gefolgt von Kälberdarmphosphatase. Ein die IVS enthaltendes BamHI- DNA-Fragment wurde aus pJE457 isoliert (Price, J.V. und Cech, T.R. (1985) Science 228: 719-722) und mit S1-Nuclease behandelt, Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das S1-behandelte Fragment, das kurze Deletionen an beiden Enden enthielt, wurde in das KpnI/SphI-geschnittene pUT718 ligiert. Der E. coli-Stamm JM83 wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert und auf LB-Agar mit Ampicillin und X- gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactosid) ausplattiert. Aus blauen Kolonien isolierte DNA wurde mittels einer Agarosegelelektrophorese auf Insertionen der Größe der IVS getestet. Die Exon-Sequenzen wurden durch die Didesoxysequenzierung der Minipräp-DNA bestimmt. Idealerweise sollten nur Plasmide, die die IVS und Exons, die den Leseralimen des lacZ-Genfragmentes bewahren, blaue Kolonien ergeben, und dies wird abhängen von dem Spleißen der Botschaft in E. coli (Waring, R.B., et al., (1985) Cell 40: 371-380; Price, J.V. und Cech, T.R. (1985) Science 228: 719 722). Tatsachlich hatten einige Plasmide, die den Kolonien eine hellblaue Farbe verliehen, Exons, für welche ein korrektes Spleißen der IVS nicht den geeigneten Leserahmen erzeugen sollte, diese wurden nicht weiter untersucht. Eines, das eine dunkelblaue Kolonie herstellte, pBGST7 (Figur 5) hatte ebenfalls den erwarteten Leserahmen und wurde für diese Untersuchungen verwendet.

Mutagenese

Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese an Plasmid-DNA wurde im wesentlichen durchgeführt, wie von Inouye, S. und Inouye, M. (1986) in "DNA and RNA Synthesis", S. Narang, Hrsg. (New York: Academic Press), im Druck, beschrieben. Die pBGST7-DNA wurde in dem für die Ampicillinresistenz kodierenden Gen mit XmnI geschnitten. In einer separaten Reaktion wurde die pBGST7-DNA mit EcoRI und Hind III, Stellen, die die IVS und die Exonsequenzen flankieren, geschnitten. Der Vektor-Anteil des Plasmids wurde von dem die IVS enthaltenden Fragment durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt und durch Elektroelution gewonnen. Die XmnI-geschnittene DNA wurde mit dem Vektorfragment in der Gegenwart des die fehl gepaarte Base enthaltenden Oligonucleotids gemischt, 5 min lang auf 95ºC erwärmt, 30 min lang bei 37ºC belassen, dann 30 min lang auf 4ºC und dann auf Eis gestellt. Die Produkte wurden bei Raumtemperatur mit dNTPS und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I 2 Stunden lang behandelt. Der E. coli-Stamm JM83 wurde mit der DNA transformiert und ampicillinresistente Kolonien wurden aufgrund der Farbe abgenommen (wobei Weiß oder Hellblau den Verlust der Spleiß-Aktivität anzeigen) und die Minipräp-DNA wurde sequenziert.
Die Doppelmutanten wurden unter der Verwendung der Plasmid-DNA von Einzelmutanten und dem Screenen nach wiederhergestellter beta-Galaktosidase-Aktivität hergestellt. pBG/- 2G:23C wurde aus pBG/-2G und einem zweiten auf Position 23 gerichteten Oligonucleotid hergestellt. pBG/-3G:24C wurde beginnend mit pBG/24C und unter der Verwendung von dem dem auf die Position -3 gerichteten Oiigonucleotid erzeugt. pBG/-4G:25C wurde durch das Erzeugen einer zirkulären Heteroduplex aus pBG/-4G:25C, die an unterschiedlichen Positionen linearisiert worden war, hergestellt. Die Transformation dieser Heteroduplizes erzeugte blaue und hellblaue Kolonien, beide in einer geringen Häufigkeit. Die blauen Kolonien waren von der Wildtypsequenz, die hellblauen Doppelmutanten.

pSPTT1A3:

Das ThaI-Fragment des Gens der ribosomalen RNA von Tetrahymena entält die IVS und kleine Anteile der flankierenden Exons. Hind-III-Linker wurden an die Enden des ThaI- Fragmentes ligiert und es wurde in die Hind-III-Stelle des Polylinkers von pSP62 (New England Nuclear) eingefügt, welcher den SP6-Promotor enthält. Das rekombinante Plasmid wurdemittels Standardverfahren in E. coli kloniert.

pT7TT1A3:

Die Konstruktion von pT7TT1A3 war identisch zu pSPTT1A3, außer daß das ThaI-Fragment in die Hind-III-Stelle von pT7-2 kloniert wurde (U.S. Biochemical Corp.), welches den T7- Promotor enthält.

Plasmid pT7 L-21:

pBGST7 (beschrieben in Been & Cech, (1986) Cell 47: 207) wurde mit den Restriktionsendonucleasen SphI und Hind III geschnitten und das die IVS minus ihrer ersten 44 Nucleotide enthaltende kleine Fragment wurde gereinigt. pUC18 wurde mit Sph I und Hind III geschnitten, mit dem Sph-Hind-III-Fragment von pBGST7 gemischt und mit DNA-Ligase behandelt. E. coli-Zellen wurden transformiert, Kolonien wurden abgenommen, Plasmid-DNA wurde aus einzelnen Kolonien isoliert und sequenziert. Ein Plasmid, das das SPM-Hind-III-Fragment der IVS richtig in pUC 18 eingefügt enthielt, wurde für den nächsten Schritt ausgewählt. Dieses Plasmid wurde mit den Restriktionsendonucleasen SphI und EcoRI geschnitten und ein synthetisches Oligonucleotid wurde in das Plasmid unter Verwendung von DNA-Ligase eingefügt. Das synthetische Oligonucleotid enthielt eine Hälfte der EcoRI-Restriktionsstelle, den T7-Promotor und die Nucleotide 22-44 der Tetrahymena-IVS, die an der SphI-Stelle endeten. E. coli-Zellen wurden transformiert, Kolonien wurden abgenommen, Plasmid-DNA wurde aus einzelnen Kolonien isoliert und sequenziert.
Man fand durch eine Sequenzanalyse, daß das endgültige Plasmid pT7L-21 den T7-Promotor richtig neben das Nucleotid 22 der IVS angeordnet enthielt. (Siehe Figur 5).
Daher kann das Verfahren verwendet weden, um definierte Stücke von RNA zu schaffen. Zum Beispiel können diese definierten Stücke 5'-OH- oder 3'-OH-Endstücke sein oder Zentralstücke, die die aktive Stelle für Untersuchungen und die Herstellung abweichender RNA- Formen enthalten. Tabelle 1: Stellen der Spaltung großer RNA-Substrate durch die Wildtyp-L-19-IVSβ-RNA Substrat Stelle Größe (nt)* Sequenz&spplus; pAK-105 (β-Globin-prä-mRNA) Konsensus beobachtet erwartet&spplus;&spplus;
* Größe des GTP-markierten Fragments.
&spplus; Die Sequenzen sind in 5'-3'-Richtung aufgelistet. Pfeile zeigen Stellen der Spaltung und Guanosinaddition an.
&spplus;&spplus;Die erwartete Konsensus-Sequenz beruht auf der bekannten Sequenz am Ende des 5'-Exons (CUCUCU), modifiziert durch die Möglichkeit, daß entweder ein C oder ein U an der Position -5 in der Lage sein könnten, mit dem G in der aktiven Stelle zu paaren. Es gibt einigen Grund zu denken, daß an der Position -1 ein C nicht so gut sein könnte wie ein U (Davies, R.W., et al., (1982) Nature 300: 710-724; Michel, F. et al., (1983) EMBO J. 2: 33-38; Inoue, T. et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 143-165).

Claims

1. Enzymatisches Ribonucleinsäuremolekül, welches in der Lage ist, durch Umesterung ein separates RNA-Molekül an einer vorbestimmten Phosphatesterbindung in einer einzelsträngigen Ziel-Nücleotidsequenz innerhalb des separaten RNA-Moleküls zu spalten, wobei das enzymatische Molekül folgendes umfaßt:

(i) einen Substratbindungsteil, der zur Bindung mit der Ziel-Nucleotidsequenz in der Lage ist; und

(ii) einen enzymatischen Teil mit Endonudeaseaktivität, unabhängig Voll irgendeinem Protein in vitro, wobei das enzymatische Molekül nur die einzeisträngige Zielsequenz spalten kann, ohne Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem enzymatischen Molekül und irgendeinem Teil des separaten RNA-Moleküls.

2. Enzymatisches Molekül nach Anspruch 1 in gereinigter Form.

3. Enzymatisches Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Substratbindungsteil vier oder mehr Basen beinhaltet.

4. Enzymatisches Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, welches ein pH- Optimum bezüglich der Endonucleaseaktivität zwischen 7,5 und 8,0 besitzt.

5. Enzymatisches Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das enzymatische Nucleinsäuremolekül ferner eine zweite von irgendeinem Protein unabhängige Endonucleaseaktivität für Desoxynucleotide beinhaftende Nucleinsäure besitzt.

6. Enzymatisches Molekül nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, weiches chemisch synthetisiert worden ist.

7. Verfahren zur spezifischen Spaltung eines separaten RNA-Moieküls an einer einzelsträngige RNA beinhaltenden Ziel-Nucleotidsequenz, umfassend das Kontaktieren eines enzymatischen Ribonucleinsäuremoleküls, wie es nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert ist, mit einem separaten RNA-Molekül, welches eine einzeisträngige Ziel-Nucleotidsequenz enthält unter Bedingungen, die zu einer spezifischen Spaltung der Zielsequenz durch Endonucleaseaktmtät des enzymatischen Moleküls führen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Spaltung in Gegenwart von Guanosin oder eines Phosphatesters davon durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Spaltung in Gegenwart eines zweiwertigen Kations durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zweiwertige Kation Mg²&spplus; ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines enzymatischen Ribonucleinsäuremoleküls mit einer von irgendeinem Protein unabhängigen Endonucleaseaktivität, wobei die Aktivität für eine Nucleotidsequenz spezifisch ist, die eine Spaltstelle definiert, welche eine einzelsträngige RNA-Zielstelle in einem separaten ersten RNA-Molekül beinhaltet, umfässend die Schritte:

(I) Nachweisen eines zweiten RNA-Moleküls, das zur intramolekularen Spaltung durch Umesterung, die sich aus einem nucleophilen Angriff an einer Phosphoresterbindung ergibt, in der Lage ist,

(II) Bestimmen der Spaltstelle und der nucleophilen Angriffsgruppe des zweiten RNA- Moleküls, wobei jene Stelle mindestens vier Basen beinhaltet, und

(III) Synthetisieren eines enzymatischen Ribonucleinsäuremoleküls, das dem zweiten RNA- Molekül entspricht, jedoch nicht die Spaltstelle und die nucleophile Angriffsgruppe besitzt, so daß das enyymatische Molekül nur durch Umesterung eine einzelsträngige Zielsequenz spalten kann ohne Bildung einer kovalenten Bindung zwischen sich und irgendeinem Teil der Zielsequenz, wobei das Synthetisieren gegebenenfalls das Abändern eines oder mehrerer Reste des zweiten RNA-Moleküls einschließt so daß die Zielspezifität des enzymatischen Moleküls verändert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Bestimmungsschritt das Bestimmen des Nucleotids in direkter Nachbarschaft in der 3'- oder 5'-Richtung der Spaltstelle des zweiten RNA-Moleküls umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, ferner umfassend das Bestimmen der Sequenz in dem zweiten RNA-Molekül, die mit der die Spakstelle beinhaltenden Nucleotidsequenz eine Basenpaarung eingeht, und Behalten der Sequenz in dem zweiten RNA-Molekül, während die Sequenz, die damit Basenpaarung eingeht, entfernt wird.