ES2964893T3 - Procedimientos de tratamiento de carcinomas uroteliales - Google Patents

Procedimientos de tratamiento de carcinomas uroteliales Download PDF

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Abstract

Se describen métodos y composiciones para tratar un carcinoma urotelial y/o micropapilar, tal como un carcinoma urotelial micropapilar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de tratamiento de carcinomas uroteliales
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los EE. UU. No. 61/847.532, depositada el 17 de julio de 2013.
Antecedentes
El cáncer de vejiga urinaria sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo (Kaufman DS, y col. Lancet. (2009) 18374:239-49; Noon AP, y col. Nat Rev Urol. (2013) 10:67-8; Ploeg M, y col. World J Urol (2009) 27:289-93). A pesar del éxito significativo de la terapia anticancerígena dirigida en otros tumores sólidos comunes, como el cáncer de mama y de pulmón, los pacientes con carcinoma urotelial (CU) metastásico y locorregionalmente avanzado tienen opciones de terapia limitadas, especialmente cuando se desarrolla quimiorresistencia a las terapias anticancerígenas estándar. Gorin MA, y col. Postgrad. Med. (2012) 124:28-36; Calabró F, y col. Eur Urol. (2009) 55(2):348-358).
La variante micropapilar del CU (CUMP) se describió por primera vez en 1994 (Amin MB, y col. Am J Surg Pathol. (1994) 18:1224-32). El CUMP, que abarca aproximadamente el 5 % de todos los cánceres de vejiga, es una lesión clínicamente importante caracterizada por una histología distintiva que presenta pequeñas micropapilas creadas por grupos de 4 a 5 células de ancho, núcleos situados periféricamente y vacuolas citoplasmáticas con una fuerte tendencia a desarrollar permeación intralinfática o simular la afectación linfovascular debido a la producción de artefactos de retracción del estroma peritumoral (Amin MB, y col. (1994) supra); Sangoi AR, y col. Am J Surg Pathol. (2010) 34:1367-76; Kamat AM, y col. Cáncer (2007) 110:62-7; López JI, y col. Histopathology (1999) 34:561-2).
El diagnóstico del CUMP conlleva un pronóstico adverso. La supervivencia a cinco años después del diagnóstico de carcinoma urotelial metastásico es pequeña, lo que indica la necesidad de mejorar el tratamiento farmacológico de la enfermedad. El régimen citotóxico estándar del CUMP es metotrexato, vinblastina, doxorrubicina y cisplatino (MVAC), y justifica una mejora. Está bien aceptado que el diagnóstico de CUMP conlleva un pronóstico adverso y los patólogos han recomendado encarecidamente que, incluso si una minoría de CU de vejiga urinaria presenta un patrón de CUMP, se recomienda que el diagnóstico de CUMP se haga directamente o el tumor se debe clasificar como CU con características de CUMP (Amin MB, y col. (1994), supra; Sangoi AR, y col. (2010), supra; Kamat AM, y col. (2007), supra; López JI, y col. (1999), supra). Entre las características clínico-patológicas notables del CUMP se encuentra la asociación de enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico de un tumor sin invasión o con invasión limitada de la pared de la vejiga. Este hallazgo es similar al observado en otros carcinomas micropapilares que ocurren en otros sitios como el endometrio, la mama y el pulmón (del Carmen MG, y col. Gynecol Oncol. (2012) 127:651-61; Chen L, y col., Int J Surg Pathol. (2008) 16:155-63; Kamiya K, y col. Mod Pathol. (2008) 21:992-1001).
Dada la naturaleza altamente agresiva del CUMP, existe la necesidad de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de carcinomas micropapilares, como CUMP.
Resumen
La invención es tal como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento, incluida la administración a un paciente en un procedimiento de tratamiento, debe interpretarse como referencia a los agentes de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia, o para su uso en la administración a un paciente en un procedimiento de tratamiento. Cualquier divulgación aquí o realización de la divulgación aquí no está cubierta por las reivindicaciones en la medida en que la divulgación o realización de la divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento per se o un producto per se, ya que no se reivindica ni un procedimiento de tratamiento per se ni un producto per se. Cualquier parte de la descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención, pero sirve para la comprensión de la invención reivindicada.
La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de alteraciones en el dominio extracelular de una proteína HER2 en un carcinoma urotelial (CU) y/o un carcinoma micropapilar, p.ej., carcinoma urotelial micropapilar (CUMP). Por ejemplo, los solicitantes han identificado una prevalencia de aproximadamente de más del 40 % de mutaciones del dominio extracelular de HER2 en CUMP. En realizaciones, la frecuencia de mutación de ERBB2 fue significativamente mayor en muestras de CU que tenían una histología de CUMP confirmada (aproximadamente el 40 % de 15 muestras analizadas), en comparación con una frecuencia más baja en las muestras que no eran de CUMP (p.ej., alrededor del 9 % de 64 muestras que presentaban una histología de CU tradicional). En otras realizaciones de 64 casos de CU analizados, 3/64 tenían una mutación de S310F y 1/64 tenían una fusión de ERBB2-GRB7. En determinadas realizaciones, la alteración incluye una sustitución de un residuo de serina en la posición 310 (S310) en HER2 por un residuo de fenilalanina o tirosina; o una sustitución de arginina en la posición 157 por triptófano. Por lo tanto, la divulgación proporciona, al menos en parte, procedimientos para tratar un carcinoma urotelial y/o micropapilar, incluidos los del tracto urinario, vejiga urinaria, células uroteliales, así como procedimientos y reactivos para identificar, evaluar o detectar una alteración como descrito aquí, p.ej., una mutación de HER2, en un carcinoma urotelial y/o urotelial micropapilar.
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer urotelial y/o cáncer que comprende una histología de micropapilas, p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., un carcinoma urotelial micropapilar). El procedimiento incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente (p.ej., un agente terapéutico) que se dirige y/o inhibe HER2, p.ej., un producto del gen HER2 (p.ej., una proteína H<e>R2), tratando así al sujeto.
En una realización, el procedimiento incluye además adquirir conocimiento de uno o ambos de:
(i) la presencia (o ausencia) de una alteración en HER2; o
(ii) la presencia (o ausencia) de una histología micropapilar
en el sujeto, o una muestra de cáncer o tumor del sujeto.
En otra realización, el procedimiento incluye además identificar al sujeto, o una muestra de cáncer o tumor del sujeto, como si tuviera uno o ambos de:
(i) la presencia (o ausencia) de una alteración en HER2; o
(ii) la presencia (o ausencia) de una histología micropapilar.
En determinadas realizaciones, la presencia de la alteración de HER2, la histología micropapilar, o ambas, en el sujeto es indicativa de que es probable que el sujeto responda al agente.
Aún en otras realizaciones, el agente se administra en respuesta a una determinación de la presencia de la alteración de HER2, la histología micropapilar, o ambas, en el sujeto, o la muestra de cáncer o tumor del sujeto.
En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además adquirir conocimiento de que el carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., un carcinoma urotelial micropapilar) no tiene una amplificación genética y/o sobreexpresión de HER2 o un producto del gen HER2.
Cánceres
En ciertas realizaciones, el cáncer o carcinoma, p.ej., el carcinoma micropapilar, se elige entre un cáncer o carcinoma del sistema urinario (p.ej., riñón, vejiga, uréter, uretra y uraco), células uroteliales, mama, pulmón, endometrio, vía biliar o tiroides. En una realización, el carcinoma es un carcinoma urotelial (CU), p.ej., un CU metastásico. Aún en otra realización, el carcinoma tiene una histología micropapilar y se elige entre un cáncer del tracto urinario, vejiga, células uroteliales o conducto biliar. Aún en otras realizaciones, el carcinoma es un carcinoma de células transicionales (CCT) o un carcinoma de células uroteliales. En una realización, el carcinoma (p.ej., el carcinoma micropapilar) es un carcinoma urotelial micropapilar (CUMP). Cabe señalar que el término "carcinoma urotelial micropapilar" y su abreviatura, "CUMP" se utilizan indistintamente en el presente documento.
En determinada realización, el cáncer tiene, o se identifica o se determina que tiene, una histología de micropapilas. En determinadas realizaciones, la histología micropapilar o histología de micropapilas comprende pequeñas micropapilas creadas por grupos de dos o más células (típicamente de 4 a 5 células) a través de núcleos situados periféricamente y vacuolas citoplasmáticas.
En otras realizaciones, el cáncer o carcinoma, p.ej., el cáncer o carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., el carcinoma urotelial micropapilar), comprende, o se identifica o se determina que tiene, una alteración en<h>ER2, p.ej., una alteración en HER2 como se describe en el presente documento. En una realización, el carcinoma micropapilar no tiene una amplificación genética o sobreexpresión de HER2 o un producto del gen HER2. Por ejemplo, el cáncer no es un cáncer o carcinoma amplificado por ERBB2 (p.ej., un carcinoma urotelial amplificado por ERBB2). En determinadas realizaciones, el cáncer no tiene, o se identifica que no tiene, un nivel elevado de un producto del gen HER2. En otras realizaciones, el cáncer es, o se identifica como negativo, para un producto del gen HER2 sobreexpresado (p.ej., el cáncer es negativo para la amplificación o sobreexpresión de HER2 mediante procedimientos de detección de ácidos nucleicos o proteínas, p.ej., PCR o inmunohistoquímica).
En otras realizaciones, el cáncer, p.ej., el carcinoma micropapilar, comprende, o se identifica o se determina que tiene, una alteración en uno o más de: AKT1, AKT2, CCND1, EGf R, PIK3CA, PIK3R1 o RAF1. En una realización, el cáncer tiene un HER2 de tipo salvaje y comprende una alteración en uno o más de: AKT1, AKT2, CCND1, EGFR, PIK3CA, PIK3R1 o RAF1. Estos cánceres pueden tratarse con moduladores, p.ej., inhibidores, de uno o más de: AKT1, AKT2, CCND1, EGFR, PIK3CA, PIK3R1 o RAF1.
En determinadas realizaciones, la alteración en HER2 da como resultado una mayor actividad de un producto del gen HER2 (p.ej., una proteína HER2), en comparación con una actividad de tipo salvaje de HER2. Por ejemplo, la alteración puede resultar en una alteración (p . e j un aumento) en uno o más de: actividad de quinasa y/o dimerización de una proteína HER2. En una realización, la alteración de HER2 es, o comprende, una mutación (p.ej., una mutación somática), p.ej., una sustitución (p.ej., una sustitución de base), una deleción o una inserción. En una realización, la alteración ocurre en el dominio extracelular de HER2, p.ej., la alteración se encuentra en el dominio II de HER2 (p.ej., HER2 humano). En una realización, la alteración es una mutación sin sentido. En una realización, la alteración es una sustitución en el residuo 310 de HER2. En una realización, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo S310 por fenilanina (p.ej., S310F) o tirosina (p.ej., S310Y) de HER2. En una realización, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo S310 por fenilanina de HER2. En otra realización, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo S310 por tirosina de HER2. En otra realización más, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 157, p.ej., una sustitución de arginina en la posición 157 por triptófano (p.ej., R157W). Aún en otras realizaciones, la alteración es un evento de amplificación del gen HER2. En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una alteración en el dominio quinasa de HER2. En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 719, p.ej., una sustitución de glicina en la posición 719 por serina (p.ej., G719S). En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 689, p.ej., una sustitución de valina en la posición 689 por metionina (p.ej., V689M). En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 700, p.ej., una sustitución de metionina en la posición 700 por ácido aspártico (p.ej., M700D). En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 826, p.ej., una sustitución de asparagina en la posición 826 por serina (p.ej., N826S). En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 839, p.ej., una sustitución de alanina en la posición 839 por treonina (p.ej. A839T). En otras realizaciones, la alteración es, o comprende, una sustitución del residuo 861, p.ej., una sustitución de leucina en la posición 861 por glutamina (p.ej., L861Q).
Sujetos
En determinadas realizaciones, el sujeto tiene una alteración en HER2, p.ej., el sujeto tiene un carcinoma urotelial y/o micropapilar que comprende una alteración de HER2 descrita en el presente documento. En otras realizaciones, se identifica, o se ha identificado previamente, que el sujeto tiene un carcinoma (p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar) que comprende una alteración de HER2. En una realización, el sujeto no tiene una amplificación genética o sobreexpresión de HER2 o un producto del gen HER2. Por ejemplo, el sujeto no tiene un cáncer o carcinoma amplificado por ERBB2 (p.ej., un carcinoma urotelial amplificado por ERBB2). En determinadas realizaciones, el sujeto no muestra un nivel elevado o es negativo para un producto del gen HER2 (p.ej., el cáncer es negativo para la expresión de HER2 mediante procedimientos de detección de ácidos nucleicos o proteínas, p.ej., PCR o inmunohistoquímica).
En otras realizaciones, se identifica, o se ha identificado previamente, que el sujeto tiene un carcinoma con una histología micropapilar, p.ej., una histología micropapilar como se describe en el presente documento. En otras realizaciones más, se identifica, o se ha identificado previamente, que el sujeto tiene un carcinoma con una alteración en HER2 (p.ej., una alternancia de HER2 como se describe en el presente documento, tal como una sustitución en el residuo 310 o el residuo 157), y que tiene un carcinoma con una histología micropapilar. Por ejemplo, se identifica, o se ha identificado previamente, que el sujeto tiene un carcinoma micropapilar elegido del tracto urinario, vejiga, células uroteliales o conducto biliar. En una realización, el sujeto está identificado, o ha sido previamente identificado, por tener un CUMP.
En una realización, el sujeto es un ser humano. En una realización, el sujeto tiene o está en riesgo de tener un cáncer (p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP) como se describe en este documento) en cualquier etapa de la enfermedad, p.ej., un cáncer metastásico. En otras realizaciones, el sujeto es un paciente con cáncer, p.ej., un paciente que tiene un carcinoma urotelial y/o micropapilar como se describe en el presente documento.
En una realización, el sujeto está recibiendo o ha recibido tratamiento con un diferente (p.ej., no-HER2) agente terapéutico o modalidad terapéutica. En una realización, el agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2 es una quimioterapia, inmunoterapia o un procedimiento quirúrgico. En una realización, el agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2 comprende uno o más (o todos) de: metotrexato, vinblastina, doxorrubicina y/o cisplatino (MVAC).
En una realización, en respuesta a la determinación de la presencia de la alteración de HER2 y/o histología micropapilar descrita en el presente documento, se suspende el agente terapéutico o modalidad terapéutica diferente. En otras realizaciones más, se ha identificado que el sujeto tiene probabilidad o improbabilidad de responder al agente terapéutico o modalidad terapéutica diferente.
En determinadas realizaciones, el sujeto ha participado previamente en un ensayo clínico, p.ej., un ensayo clínico para un diferente (p.ej., no-HER2) agente terapéutico o modalidad terapéutica. En otras realizaciones, el sujeto es un paciente con cáncer que ha participado en un ensayo clínico, p.ej., un ensayo clínico para un diferente (p.ej., no-HER2) agente terapéutico o modalidad terapéutica.
Agentes
En ciertas realizaciones, el agente (p.ej., el agente terapéutico) utilizado en los procedimientos apunta y/o inhibe HER2 (p.ej., un gen HER2 o un producto génico como se describe en el presente documento). En una realización, el agente se une e inhibe HER2. En una realización, el agente es un inhibidor de HER2 reversible o irreversible. En determinadas realizaciones, el agente es un inhibidor pan-ERBB, o un inhibidor dual o específico de HER2. En una realización, el agente es un inhibidor dual de EGFR/ERBB2, p.ej., un inhibidor dual de EGFR/ERBB2 reversible o irreversible.
En una realización, el agente es una molécula de anticuerpo, p.ej., una molécula de anticuerpo anti-HER2 (p.ej., un anticuerpo monoclonal o biespecífico), o un conjugado de los mismos (p.ej., un anticuerpo contra HER2 conjugado con un agente citotóxico (p.ej., mertansina DM1)). En una realización, el agente es un inhibidor de quinasa. En una realización, el inhibidor de quinasa se elige entre: un inhibidor de quinasa multiespecífico, un inhibidor de HER2/ERBB2, un inhibidor de EGFR (p.ej., un inhibidor pan ERBB), un inhibidor de HER3 y/o un inhibidor de molécula pequeña que es selectivo para HER2.
En una realización, el agente se elige entre: un inhibidor de quinasa, un inhibidor de quinasa multiespecífico; un inhibidor de HER2; un inhibidor de EGFR (p.ej., un inhibidor pan ERBB); un inhibidor de molécula pequeña que es selectivo para HER2; una molécula de anticuerpo (p.ej., un anticuerpo monoclonal o biespecífico) contra HER2; un anticuerpo contra HER2 conjugado con un agente citotóxico (p.ej., mertansina DM1) y/o una inmunoterapia celular HER2.
En una realización, el agente se elige entre: AV-203, AMG 888, U3-1287, APC8024, DN24-02, Neuvenge, Lapuleucel-T, MM-111, MM-121, SAR256212, MM-141, LJM716, REGN1400, MEHD7945A, RG7597, RG7116, Trastuzumab, trastuzumab emtansina (T-DM1), pertuzumab, afatinib, TAK-285, Neratinib, Dacomitinib, BMS-690514, BMS-599626,<Pelitinib, CP-724714, Lapatinib,>T<a>K-165,<ARRY-380 y/o AZD8931. En una realización, el agente es un inhibidor>irreversible de la tirosina quinasa HER2/EGFR, p.ej., Neratinib.
En otras realizaciones, el agente se elige entre una molécula de ácido nucleico (p.ej., una molécula antisentido, una ribozima, un ARN bicatenario o una molécula de triple hélice) que se hibrida y/o inhibe un ácido nucleico de HER2, p.ej., un ácido nucleico de HER2 que codifica la alteración, o una región reguladora de la transcripción que bloquea o reduce la expresión del ARNm de la alteración.
Composiciones, p.ej., composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más de los agentes, p.ej., los agentes terapéuticos descritos en el presente documento, para su uso, p.ej., en el tratamiento de un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP) como se describe en el presente documento también se divulgan.
Además, los kits que comprenden los agentes, p.ej., los agentes terapéuticos (y composiciones de estos), con instrucciones de uso en el tratamiento de un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP) y/o determinar la presencia de una alteración y/o una histología descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación presenta un kit que comprende uno o más reactivos de detección (p.ej., sondas, cebadores, anticuerpos), capaces, p.ej., de detección específica de un ácido nucleico o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento.
La divulgación también proporciona procedimientos para: identificar, evaluar o detectar una alteración descrita en el presente documento, p.ej., una mutación HER2, en un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP). Se incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden las alteraciones, construcciones de ácido nucleico, células huésped que contienen las moléculas de ácido nucleico; polipéptidos purificados que comprenden la alteración descrita en el presente documento y agentes de unión; reactivos de detección (p.ej., sondas, cebadores, anticuerpos, kits, capaces, p.ej., de detección específica de un ácido nucleico o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento); ensayos de detección para identificar moléculas que interactúan, p.ej., inhibir las alteraciones, p.ej., nuevos inhibidores de quinasa o aglutinantes de HER2. En una realización, la detección de la alteración comprende secuenciar, p.ej., secuenciación de ácidos nucleicos o secuenciación de aminoácidos.
Alternativamente, o en combinación con los procedimientos descritos en el presente documento, la divulgación presenta un procedimiento para determinar la presencia de una alteración y/o histología micropapilar descrita en el presente documento en un cáncer, p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., carcinoma urotelial micropapilar (CUMP)). El procedimiento incluye: adquirir conocimientos (p.ej., adquiriendo conocimiento directamente) que la alteración aquí descrita está presente en un sujeto, p.ej., una muestra (p.ej., una muestra de cáncer o tumor) del sujeto. En una realización, la etapa de adquisición comprende una determinación de la presencia de la alteración en una molécula de ácido nucleico del sujeto, p.ej., realizando una etapa de secuenciación. En otras realizaciones, la etapa de adquisición comprende una determinación de la presencia de un polipéptido o una proteína que comprende la alteración descrita en el presente documento en la muestra del sujeto. Alternativamente o en combinación, el procedimiento incluye además determinar la histología de la muestra, p.ej., determinando si la muestra presenta histología micropapilar.
Aspectos o realizaciones adicionales de la divulgación incluyen uno o más de lo siguiente.
En una realización, el sujeto, o la muestra, comprende una o más células o tejido de un carcinoma urotelial y/o micropapilar elegido del tracto urinario, vejiga, células uroteliales o conducto biliar. En una realización, el sujeto o muestra comprende una o más células o tejido de un carcinoma urotelial urotelial o micropapilar.
En una realización, el procedimiento comprende además administrar un agente, p.ej, un agente terapéutico que se dirige y/o inhibe HER2, p.ej., un agente como se describe en el presente documento, al sujeto que responde a la determinación de la presencia de la alteración y/o la histología micropapilar en la muestra del sujeto.
En una realización, la mutación se detecta en una molécula de ácido nucleico o un polipéptido. El procedimiento incluye detectar si una molécula o polipéptido de ácido nucleico mutado está presente en una célula (p.ej., una célula circulante), un tejido (p.ej., un tumor), o una muestra, p.ej., una muestra de tumor, de un sujeto. En una realización, la muestra es una muestra de ácido nucleico. En una realización, la muestra de ácido nucleico comprende ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, p.ej., ARNm. En otras realizaciones, la muestra es una muestra de proteína.
En realizaciones, el procedimiento incluye además determinar la histología del tejido o la muestra, p.ej., determinando si la muestra presenta histología micropapilar. En una realización, la muestra está, o ha sido clasificada como que tiene una histología micropapilar.
En una realización, la muestra o tejido se clasifica, o se ha clasificado, como no maligno o maligno utilizando otras técnicas de diagnóstico. p.ej., inmunohistoquímica. Por ejemplo, la muestra o el tejido no muestra un nivel elevado o es negativo para un producto del gen HER2 (p.ej., el cáncer es negativo para la expresión de HER2 mediante procedimientos de detección de ácidos nucleicos o proteínas, p.ej., PCR o inmunohistoquímica).
En una realización, la muestra se adquiere de un sujeto (p.ej., un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un cáncer, p.ej., un paciente), o alternativamente, el procedimiento incluye además adquirir una muestra del sujeto. La muestra se puede elegir entre uno o más de: tejido, p.ej., tejido canceroso (p.ej., una biopsia de tejido), sangre total, suero, plasma, raspado bucal, esputo, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, células tumorales circulantes, ácidos nucleicos circulantes o médula ósea. En determinadas realizaciones, la muestra es un tejido (p.ej., una biopsia de tumor), una célula tumoral circulante o un ácido nucleico.
En realizaciones, el tumor proviene de un cáncer descrito en el presente documento, p.ej., se elige entre un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., un CUMP.
En una realización, el sujeto tiene riesgo de tener, o tiene, un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., un CUMP.
En otras realizaciones, la mutación se detecta en una molécula de ácido nucleico mediante un procedimiento elegido entre uno o más de: ensayo de hibridación de ácido nucleico, ensayos basados en amplificación (p.ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), ensayo PCR-RFLP, PCR en tiempo real, secuenciación, análisis de detección, SSP, HPLC o genotipado por espectrometría de masas.
En una realización, el procedimiento incluye: poner en contacto una muestra de ácido nucleico, p.ej., una muestra de ADN genómico (p.ej., una muestra cromosómica o una muestra fraccionada, enriquecida o pretratada de otro modo) o un producto genético (ARNm, ADNc), obtenido del sujeto, con un fragmento de ácido nucleico (p.ej., una sonda o cebador como se describe en el presente documento (p.ej., una sonda o cebador específico de exón) en condiciones adecuadas para la hibridación y determinar la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico mutada. El procedimiento puede incluir, opcionalmente, enriquecer una muestra para el gen o producto génico.
Alternativamente, o en combinación con los procedimientos descritos en el presente documento, la divulgación presenta un procedimiento para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico mutada. El procedimiento incluye: adquirir una secuencia para una posición en una molécula de ácido nucleico, p.ej., secuenciando al menos un nucleótido de la molécula de ácido nucleico (p.ej., secuenciar al menos un nucleótido en la molécula de ácido nucleico que comprende la mutación), determinando de este modo que la mutación está presente en la molécula de ácido nucleico. Opcionalmente, la secuencia adquirida se compara con una secuencia de referencia o una secuencia de referencia de tipo salvaje. En una realización, la molécula de ácido nucleico es de una célula (p.ej., una célula circulante), un tejido (p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., un CUMP), o cualquier muestra de un sujeto (p.ej., muestra de sangre o plasma). En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico de una muestra de tumor (p.ej., una muestra de tumor o cáncer). En una realización, la secuencia se determina mediante un procedimiento de secuenciación de próxima generación. El procedimiento puede incluir además adquirir, p.ej., adquirir directa o indirectamente, una muestra, p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., un CUMP.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para analizar un tumor o una célula tumoral circulante. El procedimiento incluye adquirir una muestra de ácido nucleico del tumor o de la célula circulante; y secuenciación, p.ej., mediante un procedimiento de secuenciación de próxima generación, una molécula de ácido nucleico, p.ej., una molécula de ácido nucleico que incluye una alteración como se describe en el presente documento.
Aún en otra realización, se detecta un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento. El procedimiento incluye: poner en contacto una muestra de proteína con un reactivo que se une específicamente a un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento; y detectar la formación de un complejo del polipéptido y el reactivo. En una realización, el reactivo está marcado con un grupo detectable para facilitar la detección del reactivo unido y no unido. En una realización, el reactivo es una molécula de anticuerpo, p.ej., se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo y un fragmento de anticuerpo.
En otra realización más, el nivel (p.ej., nivel de expresión) o actividad del polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento. Por ejemplo, el nivel (p.ej., nivel de expresión) o actividad del polipéptido (p.ej., ARNm o polipéptido) se detecta y (opcionalmente) se compara con un valor predeterminado, p.ej., un valor de referencia (p.ej., una muestra de control).
En otra realización más, la alteración se detecta antes, durante o después de iniciar un tratamiento en un sujeto que tiene una alteración descrita en el presente documento.
En una realización, la alteración se detecta en el momento del diagnóstico de un cáncer. En otra realización, la alteración se detecta en un intervalo predeterminado, p.ej., un primer momento y al menos en un momento posterior.
En ciertas realizaciones, en respuesta a una determinación de la presencia de la alteración, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluye además uno o más de:
(1) estratificar una población de pacientes (p.ej., asignando un sujeto, p.ej., un paciente, a un grupo o clase);
(2) identificar o seleccionar al sujeto como probable o improbable que responda a un tratamiento, p.ej., un tratamiento con inhibidor de HER2 como se describe en el presente documento;
(3) seleccionar una opción de tratamiento, p.ej., administrar o no administrar un agente terapéutico preseleccionado, p.ej., un inhibidor de HER2 como se describe en el presente documento; o
(4) pronosticar el curso temporal de la enfermedad en el sujeto (p.ej., evaluando la probabilidad de aumento o disminución de la supervivencia del paciente).
En determinadas realizaciones, en respuesta a la determinación de la presencia de una mutación, el sujeto se clasifica como candidato para recibir tratamiento con una terapia divulgada en el presente documento. En una realización, en respuesta a la determinación de la presencia de una mutación, el sujeto, p.ej., un paciente, puede además ser asignado a una clase particular si se identifica una mutación en una muestra del paciente. Por ejemplo, un paciente identificado con una mutación puede clasificarse como candidato para recibir tratamiento con una terapia descrita en el presente documento. En una realización, el sujeto, p.ej., un paciente, se asigna a una segunda clase si la mutación no está presente. Por ejemplo, se puede determinar que un paciente que tiene un tumor que no contiene una mutación no es candidato para recibir una terapia descrita en el presente documento.
En otra realización, en respuesta a la determinación de la presencia de la alteración, se identifica que el sujeto tiene probabilidades de responder a un tratamiento que comprende una terapia descrita en el presente documento.
En otra realización más, en respuesta a la determinación de la presencia de la alteración, el procedimiento incluye administrar un agente, p.ej., un agente terapéutico como se describe en el presente documento, p.ej., un inhibidor de HER2, al sujeto.
Método de evaluación de un tumor o un sujeto
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para evaluar un sujeto (p.ej., un paciente), p.ej., por riesgo de tener o desarrollar un cáncer, p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., CUMP. El procedimiento incluye: adquirir información o conocimiento de la presencia de una mutación como se describe en el presente documento en un sujeto (p.ej., adquirir información del genotipo del sujeto que identifica una mutación presente en el sujeto); adquirir una secuencia para una molécula de ácido nucleico identificada en el presente documento (p.ej., una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de mutación); o detectar la presencia de un ácido nucleico o polipéptido en el sujeto), donde la presencia de la mutación se correlaciona positivamente con un mayor riesgo de padecer o tener un cáncer asociado con dicha mutación.
El procedimiento puede incluir además adquirir, p.ej., directa o indirectamente, una muestra de un paciente y evaluar la muestra para detectar la presencia de una alteración y/o una histología micropapilar como se describe en el presente documento.
El procedimiento puede incluir además las etapas de identificar (p.ej., evaluar, diagnosticar, cribar y/o seleccionar) el sujeto como correlacionado positivamente con un mayor riesgo de, o que tenga, un cáncer asociado con la alteración.
En otra realización, un sujeto identificado por tener la alteración y/o histología micropapilar se identifica o selecciona como probable o improbable que responda a un tratamiento, p.ej., una terapia descrita en el presente documento. El procedimiento puede incluir además tratar al sujeto con una terapia descrita en el presente documento.
En un aspecto relacionado, se proporciona un procedimiento para evaluar un paciente o una población de pacientes. El procedimiento incluye: identificar, seleccionar u obtener información o conocimiento de que el paciente o la población de pacientes ha participado en un ensayo clínico; adquirir información o conocimiento de la presencia de una alteración (p.ej., una alteración como se describe en este documento) en el paciente o población de pacientes (p.ej., adquiriendo información del genotipo del sujeto que identifica una alteración presente en el sujeto); adquirir una secuencia para una molécula de ácido nucleico identificada en el presente documento (p.ej., una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de alteración); o detectar la presencia de un ácido nucleico o polipéptido mutado en el sujeto), donde la presencia de la alteración, sola o en combinación con una histología micropapilar, identifica al paciente o población de pacientes como susceptibles de responder a un agente como se describe en el presente documento (p.ej., un inhibidor de HER2).
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además tratar al sujeto con un agente como se describe en el presente documento (p.ej., un inhibidor de HER2).
Informes
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir proporcionar un informe, ya sea en formato electrónico, web o en papel, al paciente o a otra persona o entidad, p.ej., un cuidador, p.ej., un medico, p.ej., un oncólogo, un hospital, una clínica, un tercero pagador, una compañía de seguros u oficina gubernamental. El informe puede incluir resultados del procedimiento, p.ej., la identificación de valores de nucleótidos, la indicación de presencia o ausencia de una alteración y/o histología micropapilar como se describe en el presente documento, o secuencia de tipo salvaje. En una realización, se genera un informe, tal como en papel o en formato electrónico, que identifica la presencia o ausencia de una alteración descrita en el presente documento, y opcionalmente incluye un identificador para el paciente del cual se obtuvo la secuencia.
El informe también puede incluir información sobre el papel de una mutación como se describe en este documento, o una secuencia de tipo salvaje, en la enfermedad. Dicha información puede incluir información sobre pronóstico, resistencia u opciones terapéuticas potenciales o sugeridas. p.ej., un agente como se describe en el presente documento (p.ej., un inhibidor de HER2). El informe puede incluir información sobre la probable eficacia de una opción terapéutica, la aceptabilidad de una opción terapéutica o la conveniencia de aplicar la opción terapéutica a un paciente. p.ej., un paciente que tiene una secuencia, alteración o mutación identificada en la prueba y, en realizaciones, identificada en el informe. Por ejemplo, el informe puede incluir información o una recomendación sobre la administración de un medicamento, p.ej., la administración a una dosis preseleccionada o en un régimen de tratamiento preseleccionado, p.ej., en combinación con otros medicamentos, al paciente. En una realización, no todas las mutaciones identificadas en el procedimiento se identifican en el informe. Por ejemplo, el informe puede limitarse a mutaciones en genes que tengan un nivel preseleccionado de correlación con la aparición, el pronóstico, el estadio o la susceptibilidad del cáncer al tratamiento. p.ej., con una opción terapéutica preseleccionada. El informe se puede entregar, p.ej., a una entidad descrita en este documento, dentro de los 7, 14 o 21 días posteriores a la recepción de la muestra por parte de la entidad que practica el procedimiento.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para generar un informe, p.ej., un informe personalizado del tratamiento del cáncer, mediante la obtención de una muestra, p.ej., una muestra de tumor, de un sujeto, detectando una mutación como se describe en el presente documento en la muestra, y seleccionando un tratamiento basándose en la mutación identificada. En una realización, se genera un informe que anota el tratamiento seleccionado, o que enumera, p.ej., en orden de preferencia, dos o más opciones de tratamiento según la mutación identificada. En otra realización, el sujeto, p.ej., a un paciente se le administra además el procedimiento de tratamiento seleccionado.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o prueba de la invención se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados.
En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, los procedimientos y el ejemplo son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los detalles de una o más realizaciones presentadas en la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas presentados en la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1 muestra un gráfico en mosaico de alteraciones genómicas en 15 casos de carcinoma urotelial micropapilar.
FIGs. 2A-2D representa una tabla que resume las características clínicas y las alteraciones genómicas identificadas en 15 casos de CUMP. Los datos para cada caso están abarcados en las FIGs. 2A-2D. Para cada caso de estudio, las características clínicas de: género (femenino (F) o masculino (M), edad en el momento en que se obtuvo la muestra, muestra secuenciada, tipo de tumor, grado del tumor, profundidad de cobertura del estadio del tumor, alteraciones genómicas, alteraciones procesables, y las alteraciones genómicas en AKT1, AKT2 y ARIDIA se resumen para cada caso de estudio en la FIG. 2A. Para cada caso de estudio, las alteraciones genómicas en AURKA, BAP1, CCND1, CCND3, CCNE1, EGFR, EPHA3, ERBB2, FBXW, HRAS e IDHA se resumen en la FIG. 2B. Para cada caso de estudio, las alteraciones genómicas en IRS2, JAK2, KRAS, MCL1, MDM2, MLL2, MSH2, MYCL1, NF2, PTCH1, PIK3CA y PIK3R1 se resumen en la FIG. 2C. Para cada caso de estudio, las alteraciones genómicas en PTEN, RAF1 y RB1 se resumen en la FIG. 2D.
Por ejemplo, para el Caso de Estudio 1, las características clínicas de: sexo (F), edad en el momento en que se obtuvieron las muestras (71), tipo de tumor secuenciado de la muestra (metástasis) (CUMP), grado del tumor (HG), estadio del tumor ( IV), profundidad de cobertura (1525), alteraciones genómicas (3), alteraciones procesables (2) y las alteraciones genómicas en AKT1 (ninguna), AKT2 (ninguna) y ARIDIA (ninguna) se resumen para cada caso de estudio en la FIG. 2A. Para cada caso de estudio, las alteraciones genómicas en AURKA (ninguna), BAP1 (ninguna), CCND1 (ninguna), CCND3 (ninguna), CCNE1 (ninguna), EGFR (ninguna), EPHA3 (ninguna), ERBB2<(S310F), FBXW (G423V), h>R<a>S<(ninguna) e IDHA (ninguna) se resumen en la FIG. 2B. Para cada caso de estudio,>las alteraciones genómicas en IRS2 (ninguna), JAK2 (ninguna), KRAS (ninguna), MCL1 (ninguna), MDM2 (ninguna), MLL2 (ninguna), MSH2 (ninguna), MYCL1 (ninguna), NF2 (ninguno), PTCH1 (ninguna), PIK3CA (ninguna) y PIK3R1 (ninguna) se resumen en la FIG. 2C. Para cada caso de estudio, las alteraciones genómicas en PTEN (ninguna), RAF1 (ninguna) y RB1 (ninguna) se resumen en la FIG. 2D.
FIG. 3 representa la incidencia relativa de mutaciones de erbb2 en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga urinaria (todos los carcinomas uroteliales) en la base de datos cósmica y carcinoma urotelial micropapilar en el estudio actual.
FIGs. 4A-4Z representan una tabla que resume las alteraciones genómicas en 64 casos de carcinoma urotelial no micropapilar de vejiga en recaída/metastásico. Los datos de cada caso se engloban en dos cifras consecutivas. Por ejemplo, los datos para los casos N1-N4 están abarcados en las FIGs. 4A-4B; los datos que describen la histología, el tipo de muestra, las variantes cortas conocidas y las probables variantes cortas para los casos N1-N4 se incluyen en la FIG. 4A; y los datos que describen CNA conocidos, reordenamientos conocidos y reordenamientos probables para los casos N1-N4 están abarcados en la FIG. 4B. Por ejemplo, para el caso de estudio N1, los datos que describen la histología (no CUMP), el tipo de muestra (TURBT), las variantes cortas conocidas (FGFR1_c.422C>G_p.T141R(0.52,660)) y las variantes cortas probables (MLL2: N M_003482: c.15597_15612delGGCAGTGGCACTATGA_p. H5200fs*38(0.29,664) , TP53:NM_000546:c.559+1C>A_p.splice(0.41,530)) está abarcado en la FIG. 4A; y los datos que describen CNA conocidos (CCND1_amplificación (9, exones 5 de 5), CDKN2A_loss (0, exones 5 de 5), CDKN2B_loss (0, exones 5 de 5), ERBB2_amplification (20, exones 27 de 27), FGF19_amplification (9 , exones 3 de 3), amplificación_FGF3(9,exones 3 de 3), amplificación_FGF4(9,exones 3 de 3), amplificación_RAF1(16,exones 16 de 16)), reordenamientos conocidos (ninguno) y reordenamientos probables (ninguno) está abarcado en la FIG.
4B.
FIG. 5 muestra la histología y la lista de alteraciones genómicas en 6 casos de carcinoma urotelial micropapilar con mutaciones en el gen ERBB2.
FIG. 6 representa un gráfico en mosaico de alteraciones genómicas en casos de carcinoma urotelial micropapilar.
Descripción detallada
En el presente documento se describe la identificación de una mutación en una serina en la posición 310 a fenilalanina (S310F) en el dominio extracelular de HER2 en un ser humano con carcinoma urotelial (CU). Además, en el presente documento se describe un análisis genómico de una serie de pacientes con carcinoma urotelial micropapilar (CUMP) y carcinomas de vejiga urotelial no micropapilares (no CUMP) para caracterizar el panorama genómico de CUMP. En una serie retrospectiva de CUMP, los solicitantes han identificado una prevalencia de aproximadamente más del 40 % de mutaciones del dominio extracelular de HER2. En realizaciones, la frecuencia de mutación de ERBB2 fue significativamente mayor en muestras de CU que tenían una histología CUMP confirmada (aproximadamente el 40 % de 15 muestras analizadas), en comparación con una frecuencia más baja en las muestras que no eran CUMP (p.ej.,<alrededor del 9 % de 64 muestras que presentaban una histología de>C<u tradicional). En particular, la serina en la>posición 310 está mutada a fenilalanina (S310F) o tirosina (S310Y), y también se observan otras mutaciones<funcionales de HER2. ERBB2 S310F es una mutación activadora de h>ER2,<que es sensible a inhibidores duales>irreversibles de Egfr/Erbb2. Las mutaciones de ERBB2 no se han informado previamente en el carcinoma urotelial (COSMIC, PubMed, agosto de 2012), pero pueden sugerir sensibilidad a las terapias farmacológicas dirigidas a Her2. Estos resultados sugieren además una correlación significativa del genotipo con el fenotipo histológico y el comportamiento biológico en una neoplasia genitourinaria agresiva, un paradigma bien delineado de la mutación HER2 como una alteración genómica impulsora oncogénica.
Por consiguiente, en el presente documento se describen procedimientos para tratar un carcinoma urotelial y/o micropapilar, incluidos los del tracto urinario, vejiga, células uroteliales, tales como carcinoma urotelial micropapilar, usando un agente (p . e j un agente terapéutico) que se dirige y/o inhibe HER2 (p . e j un producto del gen HER2, p.ej., una proteína HER2), así como procedimientos y reactivos para identificar, evaluar y/o detectar una alteración como se describe en el presente documento, p.ej., una mutación HER2, en un carcinoma micropapilar (p.ej., carcinoma urotelial micropapilar).
La morfología o histología micropapilar ocurre en neoplasias que surgen en diferentes sistemas de órganos y muestra un comportamiento biológico agresivo independientemente de su sitio de origen. Los carcinomas con esta morfología incluyen aquellos que afectan a órganos y tejidos, como el tracto urinario, la vejiga, las células uroteliales, la vía biliar, la tiroides, el endometrio, la mama y el pulmón. Se puede llevar a cabo una evaluación de una morfología o histología micropapilar usando procedimientos conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en De Oliveira, R. y col. (2009) American Journal of Clinical Pathology, 131, 694-700 (para adenocarcinoma de pulmón); y Singh K. y col. Diagnostic Pathology 2011, 6:13 (para el endometrio)).
El carcinoma urotelial micropapilar de la vejiga urinaria es una forma rara, pero muy agresiva, de cáncer de vejiga asociada con metástasis a distancia y una supervivencia más corta del paciente. La morfología o histología micropapilar en el contexto del CUMP se puede caracterizar por una histología distintiva que presenta pequeñas micropapilas creadas por grupos de 4 a 5 células de ancho, núcleos situados periféricamente y vacuolas citoplasmáticas con una fuerte tendencia a desarrollar permeación intralinfática o simular afectación linfovascular debido a la producción de artefactos de retracción del estroma peritumoral (descritos, por ejemplo, (Amin MB, y col. (1994) Am J Surg Pathol. 18:1224-32); Sangoi AR, y col. (2010) Am J Surg Pathol. 34:1367-76; Kamat AM, y col. (2007) Cáncer 110:62-7; López JI, y col. (1999) Histopathology 34:561-2).
"Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano" o "HER2" (también conocido como Neu, ErbB-2, CD340 (grupo de diferenciación 340) o p185) se refiere a una molécula de HER2 (p.ej., un ácido nucleico o una proteína). La proteína HER2 se refiere a una proteína, típicamente HER2 humana, que está codificada por el gen ERBB2. HER2 es miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR/ErbB). La familia ERBB de receptores tirosina quinasas contiene cuatro miembros conocidos: receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ERBB1, HER1); ERRB2 (HER2), ERBB3 (HER3) y ERBB4 (HER4). La proteína HER2 tiene aproximadamente 1255 aminoácidos de longitud. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de HER2 son conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Coussens L. y col. (1985) Science 230 (4730): 1132-9, y se reproducen a continuación).
Se ha demostrado que la amplificación o sobreexpresión de la ERBB2 se ha demostrado que el gen desempeña un papel importante en la patogénesis y progresión de ciertos tipos agresivos de cáncer de mama. En los últimos años, ha evolucionado hasta convertirse en un importante biomarcador y objetivo de terapia para la enfermedad. Se ha demostrado que mutaciones somáticas adicionales de HER2 activan mutaciones que probablemente logren la tumorigénesis (ver por ejemplo, Bosé y col. Cancer Disc. 3(2):224-37). Mutaciones somáticas ejemplares que activan la señalización del ERBB2 se puede dividir en al menos tres tipos de pequeñas inserciones y mutaciones sin sentido en el dominio quinasa; mutaciones sin sentido en el dominio extracelular; y grandes eliminaciones del dominio extracelular que producen la forma truncada de ERBB2 (p95HER2) (Herter-Sprie GS, y col. (2013) Front. Oncol. 3:86). La mutación S310 se considera una mutación activadora, sensible a inhibidores duales irreversibles de EGFR/ERBB2 (Lee JC, y col. (2006) PLoS Med. 3:e485; Greulich H. y col. (2010) Genes Cancer. 1: 1200-10; Greulich H, y col. (2012) Proc Natl Acad Sci USA. 109:14476-81).
Ciertos términos se definen a continuación y a lo largo de la especificación.
Tal como se utilizan en el presente documento, los artículos "un" y "una" se refieren a uno o más de uno (p.ej., a al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
El término "o" se usa en el presente documento para significar y se usa indistintamente con el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
"Aproximadamente" y "aproximadamente" significarán generalmente un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados de error ejemplares están dentro del 20 por ciento ( %), típicamente, dentro del 10 % y, más típicamente, dentro del 5 % de un valor o rango de valores dado.
"Adquirir" o "adquisición", tal como se utilizan los términos en este documento, se refiere a la obtención de posesión de una entidad física o un valor, p.ej., un valor numérico, "adquiriendo directamente" o "adquiriendo indirectamente" la entidad física o el valor. "Adquirir directamente" significa realizar un proceso (p.ej., realizando un procedimiento sintético o analítico) para obtener la entidad física o el valor. "Adquirir indirectamente" se refiere a recibir la entidad física o el valor de otra parte o fuente (p.ej., un laboratorio externo que adquirió directamente la entidad física o el valor). Adquirir directamente una entidad física incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física, p.ej., un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen crear una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, separar o purificar una sustancia, combinar dos o más entidades separadas en una mezcla, realizar una reacción química que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente un valor incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una muestra u otra sustancia, p.ej., realizar un proceso analítico que incluye un cambio físico en una sustancia, p.ej., una muestra, analito o reactivo (a veces denominado en este documento "análisis físico"), realizando un procedimiento analítico, p.ej., un procedimiento que incluye uno o más de los siguientes: separar o purificar una sustancia, p.ej., un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, p.ej., un tampón, disolvente o reactivo; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, p.ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del analito; o cambiando la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, p.ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del reactivo.
"Adquirir una secuencia", como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a obtener la posesión de una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos, "adquiriendo directamente" o "adquiriendo indirectamente" la secuencia. "Adquirir directamente una secuencia" significa realizar un proceso (p.ej., realizar un procedimiento sintético o analítico) para obtener la secuencia, como realizar un procedimiento de secuenciación (p.ej., un procedimiento de secuenciación de próxima generación (NGS). "Adquirir indirectamente una secuencia" se refiere a recibir información o conocimiento de, o recibir, la secuencia de otra parte o fuente (p.ej., un laboratorio externo que adquirió directamente la secuencia). La secuencia adquirida no necesita ser una secuencia completa, p.ej., secuenciar al menos un nucleótido u obtener información o conocimiento que identifique una mutación divulgada en el presente documento como presente en un sujeto constituye la adquisición de una secuencia.
Adquirir directamente una secuencia incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física, p.ej., un material de partida, como una muestra de tejido, p.ej., una biopsia o una muestra de ácido nucleico aislado (p.ej., ADN o ARN). Los cambios ejemplares incluyen crear una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, tal como un fragmento de ADN genómico; separar o purificar una sustancia (p.ej., aislar una muestra de ácido nucleico de un tejido); combinar dos o más entidades separadas en una mezcla, realizar una reacción química que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente un valor incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una muestra u otra sustancia como se describe anteriormente.
"Adquirir una muestra", tal como se utiliza el término en este documento, se refiere a obtener la posesión de una muestra, p.ej., una muestra de tejido o muestra de ácido nucleico, "adquiriendo directamente" o "adquiriendo indirectamente" la muestra. "Adquirir directamente una muestra" significa realizar un proceso (p.ej., realizando un procedimiento físico como una cirugía o extracción) para obtener la muestra. "Adquirir una muestra indirectamente" se refiere a recibir la muestra de otra parte o fuente (p.ej., un laboratorio externo que adquirió directamente la muestra). La adquisición directa de una muestra incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física, p.ej., un material de partida, tal como un tejido, p.ej., un tejido en un paciente humano o un tejido que ha sido previamente aislado de un paciente. Los cambios ejemplares incluyen crear una entidad física a partir de un material de partida, diseccionar o raspar un tejido; separar o purificar una sustancia (p.ej., una muestra de tejido o una muestra de ácido nucleico); combinar dos o más entidades separadas en una mezcla; realizar una reacción química que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente una muestra incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una muestra u otra sustancia, p.ej., como se describió anteriormente.
Una "alteración", tal como se utiliza en el presente documento, de un gen o producto génico (p.ej., un gen HER2 o un producto genético) se refiere a la presencia de una mutación o mutaciones dentro del gen o producto genético, p.ej., una mutación que afecta la cantidad o actividad del gen o producto genético, en comparación con el gen normal o de tipo salvaje. La alteración puede ser en cantidad, estructura y/o actividad en un tejido o célula cancerosa, en comparación con su cantidad, estructura y/o actividad, en un tejido o célula normal o sano (p.ej., un control), y se asocia con una enfermedad, como el cáncer. Por ejemplo, un gen o producto génico que está asociado con el cáncer, o que predice la capacidad de respuesta a terapias contra el cáncer, puede tener una secuencia de nucleótidos alterada (p.ej., una mutación), secuencia de aminoácidos, translocación cromosómica, inversión intracromosómica, número de copias, nivel de expresión, nivel de proteína, actividad de proteína o estado de metilación, en un tejido canceroso o una célula cancerosa, en comparación con un tejido normal y sano o célula. Las mutaciones ejemplares incluyen, entre otras, mutaciones puntuales (p.ej., silenciosa, con cambio de sentido o sin sentido), deleciones, inserciones, inversiones, mutaciones de enlace, duplicaciones, translocaciones, reordenamientos inter e intracromosómicos. Las mutaciones pueden estar presentes en la región codificante o no codificante del gen. En ciertas realizaciones, las alteraciones están asociadas (o no asociadas) con un fenotipo, p.ej., un fenotipo canceroso (p.ej., uno o más de riesgo de cáncer, progresión del cáncer, tratamiento del cáncer o resistencia al tratamiento del cáncer).
"Entidad de unión" significa cualquier molécula a la que se pueden unir etiquetas moleculares directa o indirectamente y que es capaz de unirse específicamente a un analito. La entidad de unión puede ser una etiqueta de afinidad en una secuencia de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, la entidad de unión permite la separación del ácido nucleico de una mezcla, tal como una molécula de avidina, o un anticuerpo que se une al hapteno o un fragmento de unión a antígeno de este. Las entidades de unión ejemplares incluyen, entre otras, una molécula de biotina, un hapteno, un anticuerpo, un fragmento de unión de anticuerpo, un péptido y una proteína.
"Complementario" se refiere a complementariedad de secuencia entre regiones de dos cadenas de ácido nucleico o entre dos regiones de la misma cadena de ácido nucleico. Se sabe que un residuo de adenina de una primera región de ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un residuo de una segunda región de ácido nucleico que es antiparalelo a la primera región si el residuo es timina o uracilo. De manera similar, se sabe que un residuo de citosina de una primera cadena de ácido nucleico es capaz de emparejarse con un residuo de una segunda cadena de ácido nucleico que es antiparalelo a la primera cadena si el residuo es guanina. Una primera región de un ácido nucleico es complementaria a una segunda región del mismo ácido nucleico o de uno diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas de forma antiparalela, al menos un residuo de nucleótido de la primera región es capaz de aparearse con una base. residuo de la segunda región. En ciertas realizaciones, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, por lo que, cuando las porciones primera y segunda están dispuestas de manera antiparalela, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de los residuos de nucleótidos de la primera porción son capaces de aparearse a bases con residuos de nucleótidos de la segunda porción. En otras realizaciones, todos los residuos de nucleótidos de la primera porción son capaces de aparearse a bases con residuos de nucleótidos en la segunda porción.
El término "cáncer" o "tumor" se usa indistintamente en el presente documento. Estos términos se refieren a la presencia de células que poseen características típicas de las células que causan cáncer, tales como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, rápido crecimiento y tasa de proliferación, y ciertos rasgos morfológicos característicos.
El término "neoplasia" o célula "neoplásica" se refiere a una etapa proliferativa anormal, p.ej., una etapa hiperproliferativa, en una célula o tejido que puede incluir una etapa benigna, premaligna, maligna (cáncer) o metastásica.
El cáncer se "inhibe" si se alivia, elimina, retarda o previene al menos un síntoma del cáncer. Como se usa en el presente documento, el cáncer también se "inhibe" si la recurrencia o metástasis del cáncer se reduce, retarda, retrasa o previene.
"Agente quimioterapéutico" significa una sustancia química, tal como un agente citotóxico o citostático que se usa para tratar una afección, particularmente el cáncer.
Tal como se utilizan en el presente documento, "terapia contra el cáncer" y "tratamiento del cáncer" son términos sinónimos.
Tal como se utilizan en el presente documento, "quimioterapia" y "quimioterapéutico" y "agente quimioterapéutico" son términos sinónimos.
Los términos "homología" o "identidad", como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos, siendo la identidad una comparación más estricta. Las frases "porcentaje de identidad u homología" y "% de identidad u homología" se refieren al porcentaje de similitud de secuencia encontrada en una comparación de dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. "Similitud de secuencia" se refiere al porcentaje de similitud en la secuencia de pares de bases (según se determina mediante cualquier procedimiento adecuado) entre dos o más secuencias de polinucleótidos. Dos o más secuencias pueden tener una similitud entre 0 y 100 %, o cualquier valor entero intermedio. La identidad o similitud se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base de nucleótidos o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de polinucleótidos es función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de polinucleótidos. El grado de identidad de las secuencias polipeptídicas es función del número de aminoácidos idénticos en posiciones compartidas por las secuencias polipeptídicas. Un grado de homología o similitud de secuencias polipeptídicas es función del número de aminoácidos en posiciones compartidas por las secuencias polipeptídicas. El término "sustancialmente idéntico", como se usa en el presente documento, se refiere a una identidad u homología de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %. 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más.
"Es probable" o "mayor probabilidad", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una mayor probabilidad de que ocurra un artículo, objeto, cosa o persona. Así, en un ejemplo, un sujeto que probablemente responda al tratamiento con un inhibidor de quinasa, solo o en combinación, tiene una mayor probabilidad de responder al tratamiento con el inhibidor solo o en combinación, en relación con un sujeto o grupo de sujetos de referencia. .
"Es poco probable" se refiere a una menor probabilidad de que un evento, elemento, objeto, cosa o persona ocurra con respecto a una referencia. Por tanto, un sujeto que es poco probable que responda al tratamiento con un inhibidor de quinasa, solo o en combinación, tiene una probabilidad reducida de responder al tratamiento con un inhibidor de quinasa, solo o en combinación, en relación con un sujeto o grupo de sujetos de referencia.
"Secuenciar" una molécula de ácido nucleico requiere determinar la identidad de al menos 1 nucleótido en la molécula. En realizaciones, se determina la identidad de menos de todos los nucleótidos en una molécula. En otras realizaciones, se determina la identidad de la mayoría o de todos los nucleótidos de la molécula.
"Secuenciación de próxima generación o secuenciación NGS o NG", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier procedimiento de secuenciación que determina la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico individuales (p.ej., en secuenciación de una sola molécula) o proxies clonalmente expandidos para moléculas de ácido nucleico individuales de una manera altamente paralela (p.ej., más de 105 moléculas se secuencian simultáneamente). En una realización, la abundancia relativa de las especies de ácidos nucleicos en la biblioteca se puede estimar contando el número relativo de apariciones de sus secuencias afines en los datos generados por el experimento de secuenciación. Los procedimientos de secuenciación de próxima generación se conocen en la técnica y se describen, p.ej., en Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46. La secuenciación de próxima generación puede detectar una variante presente en menos del 5 % de los ácidos nucleicos de una muestra.
"Muestra", "muestra de tejido", "muestra de paciente", "muestra de tejido o célula de paciente" o "espécimen" se refieren cada uno a una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido procedente de un órgano, muestra de tejido, biopsia o aspirado fresco, congelado y/o conservado; sangre o cualquier componente sanguíneo; fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; o células de cualquier momento de la gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se mezclan naturalmente con el tejido, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares. En una realización, la muestra se conserva como una muestra congelada o como una preparación de tejido fijado con formaldehído o paraformaldehído e incluido en parafina (FFPE). Por ejemplo, la muestra se puede incrustar en una matriz, p.ej., un bloque de FFPE o una muestra congelada.
Una "muestra de ácido nucleico tumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de ácido nucleico de una muestra de tumor o cáncer. Normalmente, es ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc derivado de ARN, de una muestra de tumor o cáncer. En determinadas realizaciones, la muestra de ácido nucleico tumoral se purifica o aísla (p.ej., se retira de su estado natural).
Una "muestra de ácido nucleico" de "control" o "referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de ácido nucleico de una muestra de control o de referencia. Normalmente, es ADN, p.ej., ADN genómico, o ADNc derivado de ARN, que no contenga la alteración o variación en el gen o producto génico, p.ej., que no contiene una mutación. En determinadas realizaciones, la muestra de ácido nucleico de referencia o de control es una secuencia de tipo salvaje o no mutada. En determinadas realizaciones, la muestra de ácido nucleico de referencia se purifica o aísla (p.ej., se retira de su estado natural). En otras realizaciones, la muestra de ácido nucleico de referencia es de una muestra no tumoral, p.ej., un control sanguíneo, un tumor adyacente normal (NAT) o cualquier otra muestra no cancerosa del mismo sujeto o de uno diferente.
"Adyacente a la posición de interrogación", como se usa en el presente documento, significa un sitio lo suficientemente cerca como para que se pueda usar un reactivo de detección complementario con el sitio para distinguir entre una mutación, p.ej., una alteración descrita en el presente documento y una secuencia de referencia, p.ej., una secuencia no mutante o de tipo salvaje, en un ácido nucleico diana. Directamente adyacente, como se usa en el presente documento, es donde 2 nucleótidos no tienen nucleótidos intermedios entre ellos.
"Mutación asociada", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mutación dentro de una distancia preseleccionada, en términos de secuencia de nucleótidos o aminoácidos primarios, de una mutación definitoria. p.ej., un mutante como se describe en el presente documento. En realizaciones, la mutación asociada está dentro de n, donde n es 2, 5, 10, 20, 30, 50, 100 o 200 nucleótidos de la mutación definitoria (n no incluye los nucleótidos que definen las mutaciones asociadas y definitorias). En realizaciones, la mutación asociada es una mutación por translocación.
"Posición de interrogación", como se usa en el presente documento, comprende al menos un nucleótido (o, en el caso de polipéptidos, un residuo de aminoácido) que corresponde a un nucleótido (o residuo de aminoácido) que está mutado en una mutación de interés. p.ej., en una mutación identificada o en un ácido nucleico (o proteína) analizado, p.ej., secuenciado o recuperado.
Una "secuencia de referencia", tal como se utiliza en el presente documento, p.ej., como comparador para una secuencia mutante, es una secuencia que tiene un nucleótido o aminoácido diferente en una posición de interrogación que el mutante que se está analizando. En una realización, la secuencia de referencia es de tipo salvaje para al menos la posición de interrogación.
Encabezados, p.ej., (a), (b), (i), etc., se presentan simplemente para facilitar la lectura de la especificación y las reivindicaciones. El uso de encabezados en la especificación o reivindicaciones no requiere que las etapas o elementos se realicen en orden alfabético o numérico ni en el orden en que se presentan.
Varios aspectos presentados en la invención se describen con más detalle a continuación. A lo largo de la especificación se establecen definiciones adicionales.
Procedimientos y agentes terapéuticos.
La invención describe, al menos en parte, procedimientos para tratar un cáncer, p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP) en un sujeto. En ciertas realizaciones, los procedimientos incluyen el tratamiento de un carcinoma urotelial y/o micropapilar que alberga una alteración descrita en el presente documento (p.ej., una alteración de HER2 descrita en el presente documento). Los procedimientos incluyen administrar al sujeto un agente terapéutico, p.ej., un agente que antagoniza la función de HER2.
En ciertas realizaciones, el cáncer, p.ej., el carcinoma urotelial y/o micropapilar, se elige entre un cáncer del sistema urinario (p.ej., riñón, vejiga, uréter, uretra y uraco), células uroteliales, mama, pulmón, endometrio, vía biliar o tiroides. En una realización, el carcinoma micropapilar se elige entre un cáncer del tracto urinario, vejiga, células uroteliales o conducto biliar. En una realización, el carcinoma micropapilar es un carcinoma urotelial micropapilar (CUMP). En una realización, el carcinoma urotelial es metastásico.
En determinada realización, el cáncer tiene, o se identifica o se determina que tiene, una histología de micropapilas. En determinadas realizaciones, la histología micropapilar o histología de micropapilas comprende pequeñas micropapilas creadas por grupos de dos o más células (típicamente de 4 a 5 células) a través de núcleos situados periféricamente y vacuolas citoplasmáticas.
En otra realización, el cáncer, p.ej., el carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP), comprende, o se identifica o determina que tiene, una alteración en HER2, p.ej., una alteración en HER2 como se describe en el presente documento. En una realización, el carcinoma urotelial y/o micropapilar (p.ej., CUMP) no tiene una amplificación genética ni una sobreexpresión de HER2 o un producto del gen HER2. Por ejemplo, el cáncer no es un cáncer o carcinoma amplificado por ERBB2 (p.ej., un carcinoma urotelial amplificado por ERBB2). En determinadas realizaciones, el cáncer no tiene un nivel elevado o es negativo para un producto del gen HER2 (p.ej., el cáncer es negativo para la expresión de HER2 mediante procedimientos de detección de ácidos nucleicos o proteínas, p.ej., PCR o inmunohistoquímica).
"Tratar", "tratamiento" y otras formas de esta palabra se refieren a la administración de un agente, p.ej., un agente terapéutico, solo o en combinación con un segundo agente en una cantidad eficaz para impedir el crecimiento de un cáncer, para hacer que un cáncer se reduzca en peso o volumen, para extender el tiempo de supervivencia esperado del sujeto y/o el tiempo hasta la progresión del tumor o similares. En esos sujetos, el tratamiento puede incluir, entre otros, inhibir el crecimiento tumoral, reducir la masa tumoral, reducir el tamaño o el número de lesiones metastásicas, inhibir el desarrollo de nuevas lesiones metastásicas, supervivencia prolongada, supervivencia libre de progresión prolongada, tiempo prolongado para progresión y/o mejora de la calidad de vida. Un cáncer se "trata" si al menos un síntoma del cáncer se alivia, se elimina, se retarda o se previene. Un cáncer también se "trata" si la recurrencia o metástasis del cáncer se reduce, retarda, retrasa o previene.
Como se usa en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" contemplan una acción que ocurre antes de que un sujeto comience a sufrir el nuevo crecimiento del cáncer y/o que inhibe o reduce la gravedad del cáncer.
Como se usa en el presente documento, y a menos que se especifique lo contrario, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo del cáncer, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con el cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo del cáncer. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" puede abarcar una cantidad que mejora la terapia general, reduce o evita los síntomas o causas del cáncer, o mejora la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.
Como se usa en el presente documento, y a menos que se especifique lo contrario, una "cantidad profilácticamente eficaz" de un agente es una cantidad suficiente para prevenir el nuevo crecimiento del cáncer, o uno o más síntomas asociados con el cáncer, o prevenir su recurrencia. Una cantidad profilácticamente eficaz de un agente significa una cantidad del agente, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención del cáncer. La expresión "cantidad profilácticamente eficaz" puede abarcar una cantidad que mejora la profilaxis general o potencia la eficacia profiláctica de otro agente profiláctico.
El término "paciente" o "sujeto" incluye a un ser humano (p.ej., un hombre o una mujer de cualquier grupo de edad, p.ej., un paciente pediátrico (p.ej., bebé, niño, adolescente) o paciente adulto (p.ej., adulto joven, adulto de mediana edad o adulto mayor). Cuando el término se usa junto con la administración de un compuesto o fármaco, entonces el paciente ha sido objeto de tratamiento, observación y/o administración del compuesto o fármaco.
Estos tratamientos se pueden proporcionar a un paciente que haya tenido una respuesta insatisfactoria a un tratamiento diferente (p.ej., no-HER2) agente terapéutico o modalidad terapéutica. En una realización, el sujeto está recibiendo o ha recibido tratamiento con un diferente (p.ej., no-HER2) agente terapéutico o modalidad terapéutica. En una realización, el agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2 es una quimioterapia o un procedimiento quirúrgico. En una realización, el agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2 comprende uno o más de: metotrexato, vinblastina, doxorrubicina y/o cisplatino (MVAC).
Un agente, p.ej., el agente terapéutico descrito en el presente documento se puede administrar, solo o en combinación, p.ej., en combinación con otros agentes o procedimientos quimioterapéuticos, en una cantidad suficiente para reducir o inhibir el crecimiento de células tumorales y/o tratar o prevenir el cáncer en el sujeto.
El agente, p.ej., agente terapéutico, puede ser una molécula pequeña, una proteína, un polipéptido, un péptido, una molécula de anticuerpo, un ácido nucleico (p.ej., un ARNip, un antisentido o un microARN), una molécula pequeña o una terapia de células inmunitarias. En el presente documento se describen agentes ejemplares y clases de agentes.
En una realización, el agente, p.ej., agente terapéutico, se une a e inhibe HER2. En una realización, el agente es una molécula de anticuerpo. Los términos "anticuerpo" y "molécula de anticuerpo", tal como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno, como un polipéptido presentado en la divulgación. Una molécula que se une específicamente a un polipéptido dado presentado en la divulgación es una molécula que se une al polipéptido, pero no se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. p.ej., una muestra biológica que contiene naturalmente el polipéptido. Ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')<2>que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima como la pepsina. La divulgación proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular. Se conocen en la técnica anticuerpos contra HER2, así como técnicas para generar anticuerpos contra un polipéptido diana. p.ej., HER2 (ver, p.ej., WO 2012/092426, titulado "Optimization of Multigene Analysis of Tumor Samples ".
En otra realización, el agente se selecciona de una molécula antisentido, unas ribozimas, una molécula de ARN bicatenario, una molécula de triple hélice, que se hibridan con un ácido nucleico que codifica la mutación, o una región reguladora de la transcripción que bloquea o reduce la expresión de ARNm de la mutación. En una realización, el agente es un inhibidor de quinasa. En una realización, el inhibidor de quinasa se elige entre: un inhibidor de quinasa multiespecífico, un inhibidor de HER2, un inhibidor de ERBB2, un inhibidor de EGFR (p.ej., un inhibidor pan ERBB), una molécula de anticuerpo, (p.ej., un anticuerpo monoclonal) contra HER2 y/o un inhibidor de molécula pequeña que es selectivo para HER2.
Como se usa en el presente documento, un "inhibidor pan ERBB" es un inhibidor que no es específico para un miembro de la familia ERBB pero que puede inhibir a todos los miembros de la familia ERBB. p.ej., HERI, HER2, HER3 y HER4.
En una realización, el agente se elige entre: AV-203, AMG 888, U3-1287, APC8024, DN24-02, Neuvenge, Lapuleucel-T, MM-111, MM-121, SAR256212, MM-141, LJM716, REGN1400, MEHD7945A, RG7597, RG7116, Trastuzumab, trastuzumab emtansina (T-DM1), pertuzumab, afatinib, TAK-285, Neratinib, Dacomitinib, BMS-690514, BMS-599626, Pelitinib, CP-724714, Lapatinib, TAK-165, ARRY-380 o AZD8931. En una realización, el agente es Neratinib. Cada uno de estos inhibidores se describe con más detalle a continuación.
AV-203 es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra ErbB-3; y se describe en Cancer Research: 15 de abril de 2012; Volumen 72, Número 8, Suplemento.AM2012-2509.
AMG-888 (U3-1287) es un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3); y se describe en J Clin Oncol 29: 2011 (suplemento; resumen 3026).
APC 8024 (Lapuleucel-T, Neuvenge, DN24-02) es una inmunoterapia celular activa autóloga en investigación diseñada para estimular una respuesta inmune contra las células tumorales que expresan el antígeno canceroso HER-2/neu; y se describe en Clin Cancer Res 15 de septiembre de 2009 15; 5937.
MM-111 es una proteína de fusión de anticuerpos biespecíficos que se dirige específicamente al heterodímero ErbB2/ErbB3 y anula la unión del ligando; y se describe en Cancer Res 15 de diciembre de 2010; 70(24 Suplemento): P6-15-15.
MM-121 (sar256212) es un anticuerpo monoclonal completamente humanizado dirigido contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3); y se describe en Res. Cancer. 15 de marzo de 2010; 70 (6): 2485-94.
El anticuerpo monoclonal MM-141 que actúa como inhibidor tetravalente de PI3K/AKT/mTOR MM-141 está diseñado para interferir con esta vía bloqueando la señalización inducida por ligando a través de los receptores IGF-1R y ErbB3; y se describe en Oncotarget agosto de 2012; 3(8): 744-758.
LJM716 es un anticuerpo totalmente humano basado en HuCAL dirigido contra HER3; y se describe en Cancer Research: 15 de abril de 2012; Volumen 72, Número 8, Suplemento 1. AM2012-2733.
REGN1400 es un anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido contra ERBB3; y se describe en Cancer Research: 15 de abril de 2012; Volumen 72, Número 8, Suplemento 1.
MEHD7945A (RG7597) es un anticuerpo monoclonal que se dirige dualmente a EGFR y HER3; y se describe en Cáncer Res l5 de enero de 2013 73; 824.
RG7116 es un anticuerpo monoclonal humanizado diseñado con glicoingeniería dirigido contra HER3. RG7116 es un anticuerpo terapéutico que se une al receptor HER3 inactivo y está optimizado para la activación del efector inmunológico; y se describe en Mirschberger C y col. Cancer Res. 18 de junio de 2013 [Epub antes de la impresión]. Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2; y se describe en British Journal of Cancer (2012) 106, 6-13.
Trastuzumab emtansina (T-DM1) es un anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2 conjugado con una fracción citotóxica; y se describe en British Journal of Cancer (2012) 106, 6-13.
Pertuzumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2; y se describe en British Journal of Cancer (2012) 106, 6-13.
Afatinib es un inhibidor irreversible de molécula pequeña derivado de anilino-quinazolina de la familia ErbB (EGFR/HER1, HER2 y HER4); y se describe en British Journal of Cancer (2012) 106, 6-13.
TAK-285 es un compuesto de bajo peso molecular que inhibe las actividades de la quinasa HER2 y EGFR; y se describe en Br J. Cancer. 14 de febrero de 2012; 106(4).
Neratinib es un inhibidor irreversible de molécula pequeña de EGFR/HER1, HER2 y HER4; y se describe en British Journal of Cancer (2012) 106, 6-13.
Dacomitinib es un inhibidor irreversible de molécula pequeña de la familia pan-EGFR de tirosina quinasas (familia ErbB), que incluye ErbB-1, ErbB-2 y ErbB-3; y se describe en PLoS One. 2013; 8(2): e56112.
BMS-690514 es un inhibidor de panHER/VEGFR/EGFR de molécula pequeña; y se describe en Cancer Res.. 1 de julio de 2007; 67 (13): 6253-62.
BMS-599626 es un inhibidor de panHER/EGFR de molécula pequeña a base de pirrolotriazina; y se describe en Clin Cancer Res. 15 de octubre de 2006; 12 (20 parte 1): 6186-93.
Pelitinib es un inhibidor de la tirosina quinasa pan-ErbB de 3-cianoquinolina, que se une de forma covalente de forma irreversible a los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ErbB-1, -2 y -4; y se describe en Nature Reviews Cancer 10, 760-774 (noviembre de 2010)).
CP-724714 es una molécula pequeña inhibidora del receptor erbB2; y se describe en Cancer Res. 15 de octubre de 2007; 67 (20): 9887-93.
Lapatinib es una molécula pequeña, reversible, inhibidora dual de EGFR/HER1 y HER2; y se describe en British Journal of Cancer (2012) 106, 6-13.
TAK-165 (mubritinib) es una molécula pequeña inhibidora de HER2; y se describe en Int J Urol. Mayo de 2006; 13(5): 587-92.
ARRY-380 es un inhibidor de HER2 reversible de molécula pequeña; y se describe en Cancer Research: 15 de diciembre de 2009; Volumen 69, Número 24, Suplemento 3.<s>A<b>C<s>-09-5104.
AZD8931 es un inhibidor equipotente reversible de la señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico, ERBB2 (HER2) y ERBB3; y se describe en Clin Cancer Res. 15 de febrero de 2010;16(4):1159-69.CCR-09-2353. Los agentes, p.ej., los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se pueden administrar en combinación con un segundo agente terapéutico o una modalidad terapéutica diferente, p.ej., agentes anticancerígenos y/o en combinación con procedimientos quirúrgicos y/o de radiación.
Por "en combinación con" no se pretende implicar que la terapia o los agentes terapéuticos deban administrarse al mismo tiempo y/o formularse para su administración juntos, aunque estos procedimientos de administración están dentro dy colcance de la divulgación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de una o más terapias o agentes terapéuticos adicionales. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un horario determinado para ese agente. Se apreciará además que el agente terapéutico adicional utilizado en esta combinación puede administrarse juntos en una única composición o administrarse por separado en diferentes composiciones. La combinación particular a emplear en un régimen tendrá en cuenta la compatibilidad de la composición farmacéutica inventiva con el agente terapéuticamente activo adicional y/o el efecto terapéutico deseado que se desea lograr.
En ciertas realizaciones, el cáncer, p.ej., el carcinoma micropapilar, comprende, o se identifica o se determina que tiene, una alteración en uno o más de: AKT1, AKT2, CCND1, EGFR, PIK3CA, PIK3R1 o RAF1. En una realización, el cáncer tiene un HER2 de tipo salvaje y comprende una alteración en uno o más de: AKT1, AKT2, CCND1, EGFR, PIK3CA, PIK3R1 o RAF1. Estos cánceres pueden tratarse con moduladores, p.ej., inhibidores, de uno o más de: AKT1, AKT2, CCND1, EGFR, PIK3CA, PIK3R1 o RAF1.
Inhibidores de ácidos nucleicos
En otra realización más, el agente, p.ej., el agente terapéutico, inhibe la expresión de un ácido nucleico que codifica una alteración descrita en el presente documento. Ejemplos de tales agentes incluyen moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas antisentido, ribozimas, ARNip, moléculas de triple hélice que se hibridan con un ácido nucleico que codifica una mutación o una región reguladora de la transcripción, y bloquea o reduce la expresión del ARNm de la mutación.
En una realización, el antagonista de ácido nucleico es un ARNip que se dirige al ARNm que codifica una mutación. También se pueden utilizar otros tipos de ácidos nucleicos antagonistas, p.ej., un ARNds, una ribozima, un formador de triple hélice o un ácido nucleico antisentido. En consecuencia, las moléculas de ácido nucleico aisladas que son inhibidores de ácido nucleico, p.ej., antisentido, ARNi, para una molécula de ácido nucleico que codifica una mutación.
Un ácido nucleico "antisentido" puede incluir una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, p.ej., complementario a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario de una cadena codificante de mutación completa, o sólo de una parte de esta. En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica la mutación (p.ej., las regiones no traducidas 5' y 3'). Los agentes antisentido pueden incluir, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases (es decir., de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleótidos), p.ej., aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleobases, o aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS) (oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que se hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión. Los compuestos antisentido pueden incluir una serie de al menos ocho nucleobases consecutivas que son complementarias a una secuencia en el gen diana. No es necesario que un oligonucleótido sea 100 % complementario de su secuencia de ácido nucleico diana para que sea específicamente hibridable. Un oligonucleótido es específicamente hibridable cuando la unión del oligonucleótido a la diana interfiere con la función normal de la molécula diana causando una pérdida de utilidad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido a una molécula no diana. secuencias en condiciones donde se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamientos terapéuticos o, en el caso de ensayos in vitro, en las condiciones donde se realizan los ensayos.
La hibridación de oligonucleótidos antisentido con ARNm puede interferir con una o más de las funciones normales del ARNm. Las funciones del ARNm con las que se va a interferir incluyen todas las funciones clave tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de traducción de proteínas, la traducción de proteínas del ARN, el corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm y la función catalítica. actividad que puede realizar el ARN. La unión de proteínas específicas al ARN también puede verse interferida por la hibridación de oligonucleótidos antisentido con el ARN.
Compuestos antisentido ejemplares incluyen secuencias de ADN o ARN que se hibridan específicamente con el ácido nucleico diana, p.ej., el ARNm que codifica una mutación descrita en el presente documento. La región complementaria puede extenderse por entre aproximadamente 8 y aproximadamente 80 nucleobases. Los compuestos pueden incluir una o más nucleobases modificadas. Las nucleobases modificadas son conocidas en la técnica. También están disponibles descripciones de agentes de ácidos nucleicos modificados. Ver, por ejemplo, Patente EE. UU. Nos.
4.987.071; 5.116.742; y 5.093.246; Woolf y col. (1992) Proc Natl Acad Sci USA; Antisense RNAand DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988); 89:7305-9; Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) Bioassays 14:807-15.
Las moléculas de ácido nucleico antisentido normalmente se administran a un sujeto (p.ej., por inyección directa en un sitio de tejido), o generado in situ de modo que se hibridan con o se unen al ARNm celular y/o al ADN genómico que codifica una mutación para inhibir de este modo la expresión de la proteína, p.ej., inhibiendo la transcripción y/o traducción. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para dirigirse a células seleccionadas y luego administrarse sistémicamente. Para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar de manera que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada. p.ej., uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden administrarse a las células utilizando los vectores descritos en el presente documento. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores donde la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III.
En otra realización más, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico a-anomérico. Una molécula de ácido nucleico anomérico a forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario donde, a diferencia de las unidades p habituales, las cadenas discurren paralelas entre sí (Gaultier y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue y col. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
Los ARNip son pequeños ARN bicatenarios (ARNds) que opcionalmente incluyen salientes. Por ejemplo, la región dúplex de un ARNip tiene aproximadamente de 18 a 25 nucleótidos de longitud, p.ej., aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos de longitud. Normalmente, las secuencias de ARNip son exactamente complementarias al ARNm diana. Los ARNds y ARNsi en particular pueden usarse para silenciar la expresión génica en células de mamíferos (p.ej., células humanas). Los ARNip también incluyen ARN de horquilla corta (ARNsh) con tallos de 29 pares de bases y salientes 3' de 2 nucleótidos. Ver, p.ej., Clemens y col. (2000) Proc. Natl. Sci.<u>S<a>97:6499-6503; Billy y col. (2001) Proc. Natl. Sci. USA 98:14428-14433; Elbashir y col. (2001) Nature. 411:494-8; Yang y col. (2002) Proc. Natl. Sci. USA 99:9942-9947; Siolas y col. (2005), Nat. Biotechnol. 23(2):227-31; 20040086884; U.S.
20030166282; 20030143204; 20040038278; y 20030224432.
En otra realización más, un ácido nucleico antisentido presentado en la divulgación es una ribozima. Una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica una mutación puede incluir una o más secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de un ADNc de mutación divulgado en el presente documento (es decir., SEQ ID NO:6), y una secuencia que tiene una secuencia catalítica conocida responsable de la escisión del ARNm (ver U.S. Pat. No. 5,093,246 o Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591). Por ejemplo, una derivada de un tetrahimena. Se puede construir ARN de L-19 IVS donde la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se va a escindir en un ARNm que codifica una mutación. Ver, p.ej., Cech y col. Patente EE. UU. No. 4.987.071; y Cech y col. Patente EE. UU. No. 5.116.742. Alternativamente, se puede usar ARNm de mutación para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad ribonucleasa específica a partir de un conjunto de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
La inhibición de un gen mutado se puede lograr dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de la mutación para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen mutado en las células diana. Ver en general, Helene, C. (1991) Anticarcer Drug Des. 6:569-84; Helene, C. i (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, LJ (1992) Bioassays 14:807-15. Las secuencias potenciales que pueden ser dianas para la formación de triple hélice se pueden aumentar mediante la creación de una molécula de ácido nucleico llamada "retroceso". Las moléculas de retroceso se sintetizan de manera alterna 5'-3', 3'-5', de modo que sus bases se aparean primero con una cadena de un dúplex y luego con la otra, eliminando la necesidad de un tramo considerable de purinas o pirimidinas para estar presente en una cadena de un dúplex.
La divulgación también proporciona moléculas cebadoras y sonda oligonucleotídicas marcadas de forma detectable. Normalmente, dichos marcadores son quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivos o colorimétricos.
Una molécula de ácido nucleico mutada se puede modificar en la fracción base, la fracción azúcar o la cadena principal de fosfato para mejorar, p.ej., la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Para ejemplos no limitantes de oligonucleótidos sintéticos con modificaciones ver Toulm6 (2001) Nature Biotech. 19:17 y Faria y col. (2001) Nature Biotech. 19:40-44. Tales oligonucleótidos de fosforamidita pueden ser agentes antisentido eficaces.
Por ejemplo, la cadena principal de fosfato de desoxirribosa de las moléculas de ácido nucleico se puede modificar para generar ácidos nucleicos peptídicos (ver Hyrup B. y col. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5-23). Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico peptídico" o "PNA" se refieren a un imitador de ácido nucleico, p.ej., un imitador de ADN, donde la columna vertebral de fosfato de desoxirribosa se reemplaza por una columna vertebral pseudopeptídica y solo se conservan las cuatro nucleobases naturales. La columna vertebral neutra de un PNA puede permitir una hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar usando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en Hyrup B. y col. (1996) supra y Perry-O'Keefe y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675.
Los PNA de moléculas de ácido nucleico mutadas se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, los PNA se pueden usar como agentes antisentido o antigénicos para la modulación específica de secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la detención de la transcripción o traducción o inhibiendo la replicación. Los PNA de moléculas de ácido nucleico mutadas también se pueden utilizar en el análisis de mutaciones de un solo par de bases en un gen (p.ej., mediante sujeción por PCR dirigida por PNA); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, (p.ej., nucleasas S1 (Hyrup B. y col. (1996) supra)); o como sondas o cebadores para secuenciación o hibridación de ADN (Hyrup B. y col. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra).
En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (p.ej., para apuntar a los receptores de la célula huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver, p.ej., Letsinger y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.<u>S<a>86:6553-6556; Lemaitre y col. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:648-652; WO88/09810) o la barrera hematoencefálica (ver, p.ej., WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de escisión desencadenados por hibridación (ver, p.ej., Krol y col. (1988) BioTechniques 6:958-976) o agentes intercalantes (Ver, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para ello, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula (p.ej., un péptido, un agente de entrecruzamiento desencadenado por hibridación, un agente de transporte o un agente de escisión desencadenado por hibridación).
En algunas realizaciones, se proporciona un inhibidor de ácido nucleico descrito en el presente documento para la inhibición de la expresión de un ácido nucleico que comprende la alteración in vitro.
Evaluación de Sujetos
Sujetos, p.ej., pacientes, pueden ser evaluados para detectar la presencia de una alteración, p.ej., una alteración como se describe en este documento. Un paciente puede evaluarse, por ejemplo, determinando la secuencia genómica del paciente, p.ej., por un procedimiento NGS. Alternativamente, o además, la evaluación de un paciente puede incluir analizar directamente la presencia de una mutación en el paciente, tal como mediante un ensayo para detectar un ácido nucleico mutado (p.ej., ADN o ARN), tal como mediante transferencia Southern, transferencia Northern o RT-PCR, p.ej., qRT-PCR. Alternativamente, o además, se puede evaluar la presencia de una mutación proteica en un paciente, tal como mediante inmunohistoquímica, transferencia Western, inmunoprecipitación o ensayo de perlas inmunomagnéticas.
En un aspecto, los resultados de un ensayo clínico, p.ej., un ensayo clínico exitoso o no exitoso, puede reutilizarse para identificar agentes que se dirijan a una alteración descrita en este documento, p.ej., una mutación HER2. Mediante un procedimiento ejemplar, un agente candidato usado en un ensayo clínico puede reevaluarse para determinar si el agente en el ensayo se dirige a una mutación o es eficaz para tratar un tumor que contiene una mutación particular. Por ejemplo, se pueden identificar sujetos que participaron en un ensayo clínico de un agente, como un inhibidor de quinasa. Pacientes que experimentaron una mejoría en los síntomas, p.ej., cáncer (p.ej., un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., CUMP), como la disminución del tamaño del tumor o la disminución de la velocidad de crecimiento del tumor, se pueden evaluar para detectar la presencia de una mutación. Los pacientes que no experimentaron una mejoría en los síntomas del cáncer también pueden ser evaluados para detectar la presencia de una mutación. Cuando se descubre que los pacientes portadores de una mutación tenían más probabilidades de responder al agente de prueba que los pacientes que no portaban dicha mutación, entonces se determina que el agente es una opción de tratamiento adecuada para un paciente portador de la mutación.
La "reevaluación" de pacientes puede incluir, por ejemplo, determinar la secuencia genómica de los pacientes, o un subconjunto de los pacientes del ensayo clínico, p.ej., por un procedimiento NGS. Alternativamente, o además, la reevaluación de los pacientes puede incluir analizar directamente la presencia de una mutación en el paciente, como por ejemplo mediante un ensayo para detectar un ácido nucleico mutado (p.ej., ARN), como por RT-PCR, p.ej., qRT-PCR. Alternativamente, o además, se puede evaluar la presencia de una mutación proteica en un paciente, tal como mediante inmunohistoquímica, transferencia Western, inmunoprecipitación o ensayo de perlas inmunomagnéticas.
Procedimientos para la detección de ácidos nucleicos y polipéptidos.
Los expertos en la técnica conocen procedimientos para evaluar un gen mutado, mutaciones y/o productos génicos. En una realización, la mutación se detecta en una molécula de ácido nucleico mediante un procedimiento elegido entre uno o más de: ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, SSP, HPLC o genotipado por espectrometría de masas.
Los procedimientos ejemplares adicionales incluyen procedimientos tradicionales de "sonda directa" tales como transferencias Southern y procedimientos de "sonda comparativa" tales como hibridación genómica comparativa (CGH), p.ej., se puede utilizar CGH basada en ADNc o basada en oligonucleótidos. Los procedimientos se pueden utilizar en una amplia variedad de formatos que incluyen, entre otros, sustrato (p.ej., membrana o vidrio) procedimientos unidos o enfoques basados en matrices.
En ciertas realizaciones, los procedimientos de evaluación incluyen sondas/cebadores contra las alteraciones descritas en el presente documento.
En una realización, se pueden diseñar sondas/cebadores para detectar una mutación o una mutación recíproca de la misma. Estas sondas/cebadores son adecuados, p.ej., para amplificación por PCR. Se utilizan sondas que contienen segmentos de ADN que son esencialmente complementarios a secuencias de bases de ADN existentes en diferentes porciones de los cromosomas. Ejemplos de sondas útiles según la invención, y el marcaje e hibridación de sondas<con muestras se describen en dos patentes estadounidenses de Vysis, Inc. Patente>E<e>.<UU. Nos. 5.491.224 y>6.277.569 a Bittner, y col.
Las sondas cromosómicas suelen tener entre 50 y 105 nucleótidos de longitud. Las sondas más largas normalmente comprenden fragmentos más pequeños de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las sondas que se hibridan con ADN centromérico y ADN específico de locus están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Vysis, Inc. (Downers Grove, Illinois), Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oeg) o de Cytocell (Oxfordshire, Reino Unido). Alternativamente, se pueden fabricar sondas de forma no comercial a partir de ADN cromosómico o genómico mediante técnicas estándar. Por ejemplo, las fuentes de ADN que pueden usarse incluyen ADN genómico, secuencias de ADN clonadas, híbridos de células somáticas que contienen uno o parte de un cromosoma (p.ej., cromosoma humano) junto con el complemento cromosómico normal del huésped y cromosomas purificados mediante citometría de flujo o microdisección. La región de interés se puede aislar mediante clonación o mediante amplificación específica de sitio mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Nath y Johnson, Biotechnic Histochem., 1998, 73(1):6-22, Wheeless y col., Cytometry 1994, 17:319-326, y Patente e E. UU. No.
5.491.224.
Las sondas que se utilizarán se hibridan con una región específica de un cromosoma para determinar si hay una anomalía citogenética presente en esta región. Un tipo de anomalía citogenética es la deleción. Aunque las deleciones pueden ser de uno o más cromosomas completos, las deleciones normalmente implican la pérdida de parte de uno o más cromosomas. Si toda la región de un cromosoma contenida en una sonda se elimina de una célula, normalmente no se producirá la hibridación de esa sonda con el ADN de la célula y no habrá ninguna señal presente en ese cromosoma. Si la región de un cromosoma que está parcialmente contenida dentro de una sonda se elimina de una célula, aún puede ocurrir la hibridación de esa sonda con el ADN de la célula, pero puede haber menos señal presente. Por ejemplo, la pérdida de una señal se compara con la hibridación de una sonda con ADN de células de control que no contienen las anomalías genéticas que las sondas pretenden detectar. En algunas realizaciones, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más células se enumeran para determinar la presencia de la anomalía citogenética.
Las anomalías citogenéticas que se van a detectar pueden incluir, entre otras, translocaciones no recíprocas, translocaciones equilibradas, inversiones intracromosómicas, mutaciones puntuales, deleciones, cambios en el número de copias de genes, cambios en el nivel de expresión genética y mutaciones de la línea germinal. En particular, un tipo de anomalía citogenética es la duplicación. Las duplicaciones pueden ser de cromosomas completos o de regiones más pequeñas que un cromosoma completo. Si la región de un cromosoma contenida en una sonda se duplica en una célula, la hibridación de esa sonda con el ADN de la célula normalmente producirá al menos una señal adicional en comparación con la cantidad de señales presentes en las células de control sin anomalías de la región cromosómica contenida en la sonda.
Las sondas cromosómicas están marcadas para que pueda detectarse la región cromosómica con la que se hibridan. Las sondas normalmente están marcadas directamente con un fluoróforo, una molécula orgánica que emite fluorescencia después de absorber luz de menor longitud de onda/mayor energía. El fluoróforo permite visualizar la sonda sin una molécula de detección secundaria. Después de unir covalentemente un fluoróforo a un nucleótido, el nucleótido se puede incorporar directamente a la sonda con técnicas estándar como traducción de mella, cebado aleatorio y marcaje por PCR. Alternativamente, los nucleótidos de desoxicitidina dentro de la sonda pueden transaminarse con un conector. Luego, el fluoróforo se une covalentemente a los nucleótidos de desoxicitidina transaminados. Ver Patente EE. UU. No. 5.491.224.
Patente EE. UU. No. 5.491.224 describe el marcaje de sonda como varios residuos de citosina que tienen un marcador fluorescente unido covalentemente al mismo. El número de bases de citosina marcadas fluorescentemente es suficiente para generar una señal fluorescente detectable, mientras que los segmentos de ADN individuales así marcados conservan esencialmente sus propiedades de unión complementaria (hibridación) específicas con respecto al cromosoma o región cromosómica a detectar. Dichas sondas se fabrican tomando el segmento de sonda de ADN no marcado, transaminando con un grupo conector varios nucleótidos de desoxicitidina en el segmento, uniendo covalentemente un marcador fluorescente al menos una porción de las bases de desoxicitidina transaminadas.
Las sondas también se pueden marcar mediante traducción de mella, etiquetado con cebador aleatorio o etiquetado por PCR. El etiquetado se realiza utilizando nucleótidos marcados con fluorescencia (directa) o con hapteno (indirecta). Ejemplos representativos y no limitantes de etiquetas incluyen: AMCA-6-dUTP, CascadeBlue-4-dUTP, Fluoresceína-12-dUTP, Rodamina-6-dUTP, TexasRed-6-dUTP, Cy3-6-dUTP, Cy5-dUTP, Biotina(BIO)-11-dUTP, Digoxigenina(DIG)-11-dUTP o Dinitrofenilo (DNP)-11-dUTP.
Las sondas también pueden marcarse indirectamente con biotina o digoxigenina, o marcarse con isótopos radiactivos como 32P y 3H, aunque se requieren moléculas de detección secundaria o un procesamiento adicional para visualizar las sondas. Por ejemplo, una sonda marcada con biotina puede detectarse mediante avidina conjugada con un marcador detectable. Por ejemplo, la avidina se puede conjugar con un marcador enzimático como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante. Los marcadores enzimáticos se pueden detectar en reacciones colorimétricas estándar utilizando un sustrato y/o un catalizador para la enzima. Los catalizadores de la fosfatasa alcalina incluyen 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y nitroazul de tetrazolio. El diaminobenzoato se puede utilizar como catalizador de la peroxidasa de rábano picante.
También se pueden preparar sondas de manera que un marcador fluorescente u otro marcador no forme parte del ADN antes o durante la hibridación, y se agregue después de la hibridación para detectar la sonda hibridada con un cromosoma. Por ejemplo, se pueden utilizar sondas que tengan moléculas antigénicas incorporadas en el ADN. Después de la hibridación, estas moléculas antigénicas se detectan mediante anticuerpos específicos que reaccionan con las moléculas antigénicas. Dichos anticuerpos pueden incorporar ellos mismos un fluorocromo o pueden detectarse utilizando un segundo anticuerpo con un fluorocromo unido.
Independientemente de cómo se trate o modifique, el ADN de la sonda se purifica comúnmente para eliminar los productos residuales que no han reaccionado (p.ej., moléculas de fluorocromo no incorporadas al ADN) antes de su uso en la hibridación.
Antes de la hibridación, las sondas cromosómicas se desnaturalizan según procedimientos bien conocidos en la técnica. Las sondas pueden hibridarse o recocerse con el ADN cromosómico en condiciones de hibridación. Las "condiciones de hibridación" son condiciones que facilitan la hibridación entre una sonda y el ADN cromosómico diana. Dado que la hibridación de diferentes sondas variará dependiendo de la longitud de la sonda, la concentración de bases y similares, la hibridación se facilita variando la concentración de la sonda, la temperatura de hibridación, la concentración de sal y otros factores bien conocidos en la técnica.
Las condiciones de hibridación se facilitan variando las concentraciones, composiciones de bases, complejidades y longitudes de las sondas, así como concentraciones de sal, temperaturas y duración de la incubación. Por ejemplo, ¡n situ Las hibridaciones normalmente se realizan en un tampón de hibridación que contiene 1-2x SSC, 50-65 % de formamida y ADN bloqueador para suprimir la hibridación no específica. En general, las condiciones de hibridación, como se describe anteriormente, incluyen temperaturas de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 55 °C y duraciones de incubación de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 96 horas.
La unión no específica de sondas cromosómicas al ADN fuera de la región diana se puede eliminar mediante una serie de lavados. La temperatura y la concentración de sal en cada lavado se varían para controlar la rigurosidad de los lavados. Por ejemplo, para condiciones de alta rigurosidad, los lavados se pueden llevar a cabo entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 80 °C, usando de 0,2x a aproximadamente 2x SSC, y aproximadamente de 0,1 % a aproximadamente 1 % de un detergente no iónico tal como Nonidet P-40 (NP40). La rigurosidad se puede reducir disminuyendo la temperatura de los lavados o aumentando la concentración de sal en los lavados. En algunas aplicaciones es necesario bloquear la capacidad de hibridación de secuencias repetitivas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se usa ARNt, ADN genómico humano o ADN Cot-I para bloquear la hibridación no específica. Después del lavado, se deja escurrir el portaobjetos y se seca al aire, luego se aplica al portaobjetos medio de montaje, una contratinción como DAPI y un cubreobjetos. Los portaobjetos pueden verse inmediatamente o almacenarse a -20 °C antes del examen.
En los procedimientos CGH, una primera colección de ácidos nucleicos (p.ej., de una muestra, p.ej., un posible tumor) se marca con una primera etiqueta, mientras que una segunda colección de ácidos nucleicos (p.ej., un control, p.ej., de una célula/tejido sano) está etiquetado con una segunda etiqueta. La relación de hibridación de los ácidos nucleicos está determinada por la relación de los dos marcadores (primero y segundo) que se unen a cada fibra de la matriz. Cuando hay eliminaciones o multiplicaciones cromosómicas, se detectarán diferencias en la proporción de las señales de las dos etiquetas y la proporción proporcionará una medida del número de copias. La C<g>H basada en matrices también se puede realizar con etiquetado de un solo color (en lugar de etiquetar el control y la posible muestra de tumor con dos tintes diferentes y mezclarlos antes de la hibridación, lo que producirá una proporción debido a la hibridación competitiva de sondas en las matrices). En CGH de un solo color, el control se etiqueta y se hibrida con una matriz y se leen las señales absolutas, y la posible muestra de tumor se etiqueta y se hibrida con una segunda matriz (con contenido idéntico) y se leen las señales absolutas. La diferencia en el número de copias se calcula en función de las señales absolutas de las dos matrices. Se describen protocolos de hibridación adecuados para su uso con los procedimientos presentados en la invención. p.ej., en Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; EPO Pub. No. 430,402; Methods in Molecular Biology, vol. 33: In situ Hibridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994), etc. En una realización, se usa el protocolo de hibridación de Pinkel y col. (1998) Nature Genetics 20: 207-211, o de Kallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992)). CGH basado en matrices se describe en la Patente EE. UU. No. 6.455.258.
En otra realización más, se pueden usar ensayos basados en amplificación para medir la presencia/ausencia y el número de copias. En tales ensayos basados en amplificación, las secuencias de ácidos nucleicos actúan como plantilla en una reacción de amplificación (p.ej., Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En una amplificación cuantitativa, la cantidad de producto de amplificación será proporcional a la cantidad de plantilla en la muestra original. Comparación con controles apropiados, p.ej., tejido sano, proporciona una medida del número de copias.
Los procedimientos de amplificación "cuantitativa" son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la PCR cuantitativa implica coamplificar simultáneamente una cantidad conocida de una secuencia de control utilizando los mismos cebadores. Esto proporciona un estándar interno que se puede utilizar para calibrar la reacción de PCR. Los protocolos detallados para la PCR cuantitativa se proporcionan en Innis, y col. (1990) PCR Protocols, AQ Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.). La medición del número de copias de ADN en loci de microsatélites mediante análisis de PCR cuantitativo se describe en Ginzonger, y col. (2000) Cancer Research 60:5405-5409. La secuencia de ácido nucleico conocida para los genes es suficiente para permitir que un experto en la técnica seleccione de forma rutinaria cebadores para amplificar cualquier porción del gen. También se puede utilizar la PCR cuantitativa fluorogénica. En la PCR cuantitativa fluorogénica, la cuantificación se basa en la cantidad de señales de fluorescencia, p.ej., TaqMan y sybr verde.
Otros procedimientos de amplificación adecuados incluyen, entre otros, la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (ver Wu y Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren y col. (1988) Science 241:1077, y Barringer y col. (1990) Gene 89: 117), transcription amplification (Kwoh, y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), self-sustained sequence replication (Guatelli, y col. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), dot PCR y adaptador de enlazador PCR, etc.
Muestras de ácido nucleico
Una variedad de muestras de tejido pueden ser la fuente de las muestras de ácido nucleico utilizadas en los presentes procedimientos. Se pueden aislar fragmentos de ADN genómico o subgenómico de la muestra de un sujeto (p.ej., una muestra de tumor, un tejido adyacente normal (NAT), una muestra de sangre o cualquier control normal)). En determinadas realizaciones, la muestra de tejido se conserva como una muestra congelada o como una preparación de tejido fijado con formaldehído o paraformaldehído e incluido en parafina (FFPE). Por ejemplo, la muestra se puede incrustar en una matriz, p.ej., un bloque FFPE o una muestra congelada. El paso de aislamiento puede incluir clasificación por flujo de cromosomas individuales; y/o microdisección de la muestra de un sujeto (p.ej., una muestra de tumor, una NAT, una muestra de sangre).
Los protocolos para el aislamiento, la fragmentación y el procesamiento del ADN a partir de una muestra de tejido se conocen en la técnica como se describe, p.ej., en WO 2012/092426, titulado "Optimización del análisis multigénico de muestras de tumores". Procedimientos adicionales para aislar ácidos nucleicos (p.ej., ADN) de tejidos fijados con formaldehído o paraformaldehído e incluidos en parafina (FFPE), p.ej., en Cronin M. y col., (2004) Am J Pathol.
164(1 ):35-42; Masuda N. y col., (1999) Nucleic Acids Res. 27(22):4436-4443; Specht K. y col., (2001) Am J Pathol.
158(2):419-429, Ambion RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Protocol (Ambion, n.° de catálogo AM1975, septiembre de 2008) y QlAamp® DNA FFPE Tissue Handbook (Qiagen, Cat. No. 37625, octubre de 2007). RecoverAll™. El kit de aislamiento de ácido nucleico total utiliza xileno a temperaturas elevadas para solubilizar muestras incluidas en parafina y un filtro de fibra de vidrio para capturar ácidos nucleicos. El kit de tejido DNA FFPE QlAamp® utiliza Microtecnología de ADN QlAamp® para la purificación de ADN genómico y mitocondrial.
Diseño de cebos
Un cebo puede ser una molécula de ácido nucleico, p.ej., una molécula de ADN o ARN, que puede hibridarse con (p.ej., ser complementario de), y permitir así la captura de un ácido nucleico diana. En una realización, un cebo es una molécula de ARN. En otras realizaciones, un cebo incluye una entidad vinculante, p.ej., una etiqueta de afinidad, que permite la captura y separación, p.ej., mediante unión a una entidad de unión, de un híbrido formado por un cebo y un ácido nucleico hibridado con el cebo. En una realización, un cebo es adecuado para la hibridación en fase de solución.
Los cebos pueden producirse y usarse mediante procedimientos y condiciones de hibridación como se describe en US 2010/0029498 y Gnirke, A. y col. (2009) Nat Biotechnol. 27(2):182-189, y WO 2012/092426, titulado "Optimization of Multigene Analysis of Tumor Samples".
Secuenciación
La invención también incluye procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos. En una realización, se puede usar cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente al menos una parte de una mutación. En una realización, la secuencia mutada se compara con una secuencia de referencia (control) correspondiente.
En una realización, la secuencia de la molécula de ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento se determina mediante un procedimiento que incluye uno o más de: hibridar un oligonucleótido, p.ej., un oligonucleótido específico de alelo para una mutación descrita en el presente documento en dicho ácido nucleico; hibridar un cebador o un conjunto de cebadores (p.ej., un par de cebadores), que amplifica una región que comprende la mutación del alelo; amplificando, p.ej., amplificando específicamente, una región que comprende la mutación del alelo; unir un oligonucleótido adaptador a un extremo de un ácido nucleico que comprende la mutación del alelo; generando una óptica, p.ej., una señal colorimétrica, específica de la presencia de la mutación; hibridar un ácido nucleico que comprende la mutación con un segundo ácido nucleico, p.ej., un segundo ácido nucleico unido a un sustrato; generando una señal, p.ej., una señal eléctrica o fluorescente, específica de la presencia de la mutación; e incorporar un nucleótido en un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico que contiene la mutación.
En otra realización, la secuencia se determina mediante un procedimiento que comprende uno o más de: determinar la secuencia de nucleótidos a partir de una molécula de ácido nucleico individual, p.ej., donde una señal correspondiente a la secuencia se deriva de una sola molécula en lugar de, p.ej., a partir de una suma de señales de una pluralidad de moléculas expandidas clonalmente; determinar la secuencia de nucleótidos de proxies clonalmente expandidos para moléculas de ácido nucleico individuales; secuenciación masivamente paralela de lectura corta; secuenciación basada en plantillas; pirosecuenciación; secuenciación en tiempo real que comprende imágenes de la incorporación continua de nucleótidos marcadores de colorantes durante la síntesis de ADN; secuenciación de nanoporos; secuenciación por hibridación; secuenciación basada en matrices de nanotransistores; secuenciación de polonias; secuenciación basada en microscopía de efecto túnel (STM); o secuenciación basada en sensores de moléculas de nanocables.
Puede usarse cualquier procedimiento de secuenciación conocido en la técnica. Las reacciones de secuenciación ejemplares incluyen aquellas basadas en técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert (Proc. Natl Acad Sci USA (1977) 74:560) o Sanger (Sanger y col. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci 74:5463). Se puede utilizar cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciación automatizados al realizar los ensayos (Biotechniques (1995) 19:448), incluida la secuenciación por espectrometría de masas (ver, por ejemplo, Patente EE. UU. Número 5.547.835 y solicitud internacional de patente Número de publicación WO 94/16101, titulada DNA Sequencing by Mass Spectrometry by H.<Koster; Patente>E<e>.<UU. Número 5.547.835 y solicitud internacional de patente Número de publicación WO 94/21822>titulada DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via Exonuclease Degradation by H. Koster), y Patente EE. UU. Número 5.605.798 y Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US96/03651 titulada DNA Diagnostics Based on Mass Spectrometry by H. Koster; Cohen y col. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; y Griffin y col. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159).
La secuenciación de moléculas de ácido nucleico también se puede realizar mediante secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de próxima generación incluye cualquier procedimiento de secuenciación que determine la secuencia de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico individuales o proxies expandidos clonalmente para moléculas de ácido nucleico individuales de una manera altamente paralela (p.ej., mayor que 105 las moléculas se secuencian simultáneamente). En una realización, la abundancia relativa de las especies de ácidos nucleicos en la biblioteca se puede estimar contando el número relativo de apariciones de sus secuencias afines en los datos generados por el experimento de secuenciación. Los procedimientos de secuenciación de próxima generación se conocen en la técnica y se describen, p.ej., en Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46.
En una realización, la secuenciación de próxima generación permite la determinación de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico individual (p.ej., el sistema de secuenciación de genes HeliScope de Helicos BioSciences y el sistema PacBio RS de Pacific Biosciences). En otras realizaciones, el procedimiento de secuenciación determina la secuencia de nucleótidos de proxies expandidos clonalmente para moléculas de ácido nucleico individuales (p.ej., el secuenciador Solexa, Illumina Inc., San Diego, California; 454 Life Sciences (Branford, Connecticut) e Ion Torrent). p.ej., secuenciación masivamente paralela de lectura corta (p.ej., el secuenciador Solexa, Illumina Inc., San Diego, California), que genera más bases de secuencia por unidad de secuenciación que otros procedimientos de secuenciación que generan menos lecturas pero más largas. Otros procedimientos o máquinas para la secuenciación de próxima generación incluyen, entre otros, los secuenciadores proporcionados por 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), Applied Biosystems (Foster City, California; secuenciador SOLiD) y Helicos BioSciences Corporation (Cambridge), Mass.).
Las plataformas para la secuenciación de próxima generación incluyen, entre otras, el sistema FLX del secuenciador de genoma (GS) de Roche/454, el analizador de genoma (GA) de Illumina/Solexa, el sistema de detección de ligadura de oligonucleótidos (SOLiD) de soporte de Life/APG y sistema G.007 de Polonator, el sistema de secuenciación de genes HeliScope de Helicos BioSciences y el sistema PacBio RS de Pacific Biosciences.
Las tecnologías NGS pueden incluir una o más etapas, p.ej., preparación de plantillas, secuenciación e imágenes, y análisis de datos como se describe en WO 2012/092426, titulado "Optimization of Multigene Analysis of Tumor Samples".
Análisis de los datos
Una vez generadas las lecturas de NGS, se pueden alinear con una secuencia de referencia conocida o ensamblar de novo.
Por ejemplo, identificar variaciones genéticas como el polimorfismo de un solo nucleótido y variantes estructurales en una muestra (p.ej., una muestra de tumor) se puede lograr alineando las lecturas de NGS con una secuencia de referencia (p.ej., una secuencia de tipo salvaje). Se describen procedimientos de alineación de secuencias para NGS. p.ej., en Trapnell C. y Salzberg S.L. Nature Biotech., 2009, 27:455-457.
Ejemplos de ensamblajes de novo se describen, p.ej., en Warren R. y col., Bioinformatics, 2007, 23:500-501; Butler J. y col., Genome Res., 2008, 18:810-820; y Zerbino D.R. y Birney E., Genome Res., 2008, 18:821-829.
La alineación o el ensamblaje de la secuencia se puede realizar utilizando datos leídos de una o más plataformas NGS, p.ej., mezclando datos de lectura de Roche/454 e Illumina/Solexa.
Los algoritmos y procedimientos para el análisis de datos se describen en WO 2012/092426, titulada "Optimization of Multigene Analysis of Tumor Samples".
Detección de polipéptido mutado
La actividad o nivel de un polipéptido mutado (p.ej., una mutación HER2) también se puede detectar y/o cuantificar detectando o cuantificando el polipéptido expresado. El polipéptido mutado puede detectarse y cuantificarse mediante cualquiera de varios medios conocidos por los expertos en la técnica. Estos pueden incluir procedimientos bioquímicos analíticos tales como electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión y similares, o diversos procedimientos inmunológicos tales como reacciones de precipitina en fluido o gel, inmunodifusión (única o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo (RIA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, transferencia Western, inmunohistoquímica (IHC) y similares. Un experto en la materia puede adaptar procedimientos de detección de proteínas/anticuerpos conocidos.
Otro agente para detectar un polipéptido mutado es una molécula de anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido correspondiente a un polipéptido, p.ej., un anticuerpo con una etiqueta detectable. En el presente documento se describen técnicas para generar anticuerpos. El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo de la sonda o anticuerpo mediante acoplamiento (es decir., unir físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que esté directamente marcado. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcaje final de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia.
En otra realización, el anticuerpo está marcado, p.ej., un anticuerpo marcado radioactivamente, marcado con cromoforo, marcado con fluoróforo o marcado con enzima. En otra realización, un derivado de anticuerpo (p.ej., un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de un par proteína-ligando {p.ej., biotinaestreptavidina}), o un fragmento de anticuerpo (p.ej., un anticuerpo monocatenario, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado, etc.) que se une específicamente a una proteína mutada.
Los polipéptidos mutados de células se pueden aislar usando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica. Los procedimientos de aislamiento de proteínas empleados pueden ser, por ejemplo, los descritos en Harlow y Lane (Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Los medios para detectar proteínas usando técnicas electroforéticas son bien conocidos por los expertos en la técnica (ver en general, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
En otra realización, se utiliza análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de un polipéptido en la muestra.
En otra realización, el polipéptido se detecta usando un inmunoensayo. Como se usa en el presente documento, un inmunoensayo es un ensayo que utiliza un anticuerpo para unirse específicamente al analito. Por tanto, el inmunoensayo se caracteriza por la detección de la unión específica de un polipéptido a un antianticuerpo en contraposición al uso de otras propiedades físicas o químicas para aislar, seleccionar y cuantificar el analito.
El polipéptido mutado se detecta y/o cuantifica usando cualquiera de varios ensayos de unión inmunológica (ver, p.ej., Patente EE. UU. Nos. 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, ver también Asai (1993) Methods in Cell Biology Volumen 37: Anticuerpos en Cell Biology, Academic Press, Inc. Nueva York; Stites & Terr (1991) Basic and Clinical Immunology 7a edición.
Kits
En un aspecto, la divulgación presenta un kit, p.ej., que contiene un oligonucleótido que tiene una alteración descrita en el presente documento, p.ej., una mutación HER2. Opcionalmente, el kit también puede contener un oligonucleótido que sea la contraparte de tipo salvaje del oligonucleótido mutante.
Un kit puede incluir un transportador, p.ej., estando un medio compartimentado para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedores. En una realización, el recipiente contiene un oligonucleótido, p.ej., un cebador o sonda como se describe anteriormente. Los componentes del kit son útiles, por ejemplo, para diagnosticar o identificar una mutación en una muestra de tumor en un paciente. La sonda o cebador del kit se puede utilizar en cualquier ensayo de secuenciación o detección de nucleótidos conocido en la técnica. p.ej., un ensayo de secuenciación, p.ej., un procedimiento NGS, RT-PCR o hibridación in situ.
En algunas realizaciones, los componentes del kit son útiles, por ejemplo, para diagnosticar o identificar una mutación en una muestra de tumor en un paciente y, en consecuencia, identificar un agente terapéutico apropiado para tratar el cáncer.
Un kit presentado en la divulgación puede incluir, p.ej., ensayo de controles positivos y negativos, nucleótidos, enzimas (p.ej., ARN o ADN polimerasa o ligasa), disolventes o tampones, un estabilizador, un conservante, un anticuerpo secundario, p.ej., un anticuerpo anti-HRP (IgG) y un reactivo de detección.
Un oligonucleótido puede proporcionarse en cualquier forma, p.ej., líquido, seco, semiseco o liofilizado, o en forma para almacenamiento congelado.
Normalmente, un oligonucleótido y otros componentes de un kit se proporcionan en una forma estéril. Un oligonucleótido, p.ej., un oligonucleótido que contiene una mutación, descrita en el presente documento, o un oligonucleótido complementario a una alteración descrita en el presente documento, se proporciona en una solución líquida, la solución líquida generalmente es una solución acuosa, p.ej., una solución acuosa estéril. Cuando el oligonucleótido se proporciona en forma seca, la reconstitución generalmente se logra mediante la adición de un disolvente adecuado. El solvente, p.ej. opcionalmente, se puede incluir en el kit un tampón estéril.
El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene un oligonucleótido en una concentración adecuada para usar en el ensayo o con instrucciones para la dilución para usar en el ensayo. En algunas realizaciones, el kit contiene contenedores, divisores o compartimentos separados para el oligonucleótido y los componentes del ensayo, y el material informativo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden estar contenidos en una botella o vial, y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plástico. En otras realizaciones, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un único contenedor no dividido. Por ejemplo, una composición de oligonucleótidos está contenida en un frasco o vial al que se le ha adherido el material informativo en forma de etiqueta. En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad (p.ej., un paquete) de contenedores individuales, cada uno de los cuales contiene una o más formas unitarias (p.ej., para uso con un ensayo) de un oligonucleótido. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de ampollas, paquetes de aluminio o blísteres, cada uno de los cuales contiene una única unidad de oligonucleótido para su uso en la secuenciación o detección de una mutación en una muestra de tumor. Los contenedores de los kits pueden ser herméticos y/o impermeables. El contenedor puede etiquetarse para su uso.
Para los kits basados en anticuerpos, el kit puede incluir: (1) un primer anticuerpo (p.ej., unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido mutado; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido o al primer anticuerpo y se conjuga con un agente detectable.
En una realización, el kit puede incluir material informativo para realizar e interpretar la secuenciación o el diagnóstico. En otra realización, el kit puede proporcionar orientación sobre dónde informar los resultados del ensayo. p.ej., a un centro de tratamiento o proveedor de atención médica. El kit puede incluir formularios para informar los resultados de un ensayo de secuenciación o diagnóstico descrito en el presente documento, y dirección e información de contacto con respecto a dónde enviar dichos formularios u otra información relacionada; o una dirección URL (Localizador uniforme de recursos) para informar los resultados en una base de datos en línea o una aplicación en línea (p.ej., Una aplicación). En otra realización, el material informativo puede incluir orientación sobre si un paciente debe recibir tratamiento con un fármaco quimioterapéutico particular, dependiendo de los resultados del ensayo.
El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En muchos casos, el material informativo, p.ej., instrucciones, se proporciona en material impreso, p.ej., un texto impreso, dibujos y/o fotografías, p.ej., una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material informativo también se puede proporcionar en otros formatos, como material legible por computadora, grabación de video o grabación de audio. En otra realización, el material informativo del kit es información de contacto, p.ej., una dirección física, dirección de correo electrónico, sitio web o número de teléfono, donde un usuario del kit puede obtener información sustancial sobre la secuenciación o ensayo de diagnóstico y/o su uso en los procedimientos descritos en este documento. El material informativo también puede proporcionarse en cualquier combinación de formatos.
En algunas realizaciones, se proporciona una muestra biológica a un proveedor de análisis, p.ej., un proveedor de servicios (como un centro externo) o un proveedor de atención médica, que evalúa la muestra en un ensayo y proporciona una lectura. Por ejemplo, en una realización, un proveedor de análisis recibe una muestra biológica de un sujeto, tal como una muestra de sangre o tejido, p.ej., una muestra de biopsia, y evalúa la muestra usando un ensayo descrito en el presente documento, p.ej., un ensayo de secuenciación o ensayo de hibridación in situ y determina que la muestra contiene una mutación. El proveedor del ensayo, p.ej., un proveedor de servicios o un proveedor de atención médica, puede entonces concluir que el sujeto es, o no, un candidato para un medicamento en particular o un régimen de tratamiento del cáncer en particular.
Otras realizaciones de la divulgación incluyen las siguientes.
Moléculas de ácido nucleico, reactivos de detección y captura
La divulgación también presenta una molécula de ácido nucleico aislada, o una preparación aislada de moléculas de ácido nucleico, que incluye una alteración descrita en el presente documento. Dichas moléculas de ácido nucleico o preparaciones de estas pueden incluir una alteración descrita en el presente documento o pueden usarse para detectar, p.ej., secuencia, una alteración.
La divulgación también presenta una molécula de ácido nucleico, p.ej., fragmento de ácido nucleico, adecuado como sonda, cebador, cebo o miembro de biblioteca que incluye, flanquea, se hibrida con, que son útiles para identificar, o se basan de otro modo en, una alteración descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, la sonda, cebador o molécula cebo es un oligonucleótido que permite la captura, detección o aislamiento de una molécula de ácido nucleico que contiene una alteración descrita en el presente documento. p.ej., una alteración en ERBB2, p.ej. una mutación en HER2 en el residuo S310 donde el residuo S310 mutó a S310F o S310Y; o una mutación en el residuo 157 de HER2.
El oligonucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a moléculas de ácido nucleico o fragmentos de moléculas de ácido nucleico que comprenden una alteración descrita en el presente documento. La identidad de secuencia entre la molécula de ácido nucleico, p.ej., el oligonucleótido y la secuencia diana no necesitan ser exactos, siempre que las secuencias sean suficientemente complementarias para permitir la captura, detección o aislamiento de la secuencia diana. En una realización, el fragmento de ácido nucleico es una sonda o cebador que incluye un oligonucleótido entre aproximadamente 5 y 25, p.ej., entre 10 y 20, o 10 y 15 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, el fragmento de ácido nucleico es un cebo que incluye un oligonucleótido de entre aproximadamente 100 y 300 nucleótidos, 130 y 230 nucleótidos, o 150 y 200 nucleótidos, de longitud.
En una realización, el fragmento de ácido nucleico puede usarse para identificar o capturar, p.ej., mediante hibridación, una molécula de ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento, p.ej., una alteración en HER2, p.ej., una mutación en HER2 en el residuo S310 donde el residuo S310 mutó a S310F o S310Y; o una mutación en el residuo 157 de HER2. Por ejemplo, el fragmento de ácido nucleico puede ser una sonda, un cebador o un cebo, para usar en la identificación o captura, p.ej., por hibridación, una alteración descrita en el presente documento.
Las sondas o cebadores descritos en el presente documento se pueden usar, por ejemplo, amplificación por PCR. En una realización ejemplar donde la detección se basa en PCR, la amplificación de la mutación se puede realizar usando un cebador o un par de cebadores. p.ej., para amplificar una secuencia que flanquea una alteración descrita en el presente documento.
En otras realizaciones, el fragmento de ácido nucleico incluye un cebo que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento, y de ese modo permite la captura o aislamiento de dicha molécula de ácido nucleico. En una realización, un cebo es adecuado para la hibridación en fase de solución. En otras realizaciones, un cebo incluye una entidad vinculante, p.ej., una etiqueta de afinidad, que permite la captura y separación, p.ej., mediante unión a una entidad de unión, de un híbrido formado por un cebo y un ácido nucleico hibridado con el cebo.
En otras realizaciones, el fragmento de ácido nucleico incluye un miembro de la biblioteca que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, el miembro de la biblioteca incluye una mutación, p.ej., una sustitución de base, que da como resultado una alteración descrita en el presente documento.
El fragmento de ácido nucleico puede marcarse de forma detectable con, p.ej., un radiomarcador, un marcador fluorescente, un marcador bioluminiscente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador de par de unión o puede incluir un marcador de afinidad; una etiqueta o identificador (p.ej., un adaptador, código de barras u otro identificador de secuencia).
Polipéptidos
En otro aspecto, la divulgación presenta un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento (p.ej., un polipéptido purificado que comprende una alteración descrita en el presente documento), un fragmento biológicamente activo o antigénico del mismo, así como reactivos (p.ej., moléculas de anticuerpo que se unen a un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento), procedimientos para modular la actividad de un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento y detección de un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento.
En otra realización, el polipéptido o fragmento es un péptido, p.ej., un péptido o proteína inmunogénica que contiene una alteración descrita en el presente documento. Dichos péptidos o proteínas inmunogénicas se pueden usar para generar anticuerpos específicos del polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento. En otras realizaciones, dichos péptidos o proteínas inmunogénicas se pueden usar para la preparación de vacunas. La preparación de vacuna puede incluir otros componentes, p.ej., un adyuvante.
En otro aspecto, la divulgación presenta moléculas de anticuerpo que se unen a un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento o un fragmento descrito en el presente documento. En realizaciones, el anticuerpo puede distinguir el polipéptido de tipo salvaje del mutado, p.ej., comprendiendo el polipéptido una alteración descrita en el presente documento. Las técnicas para generar moléculas de anticuerpos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 2012/092426, titulado "Optimization of Multigene Analysis of Tumor Samples".
Reactivos de detección
En otro aspecto, la divulgación presenta un reactivo de detección, p.ej., una preparación purificada o aislada del mismo. Los reactivos de detección pueden distinguir un ácido nucleico o una secuencia de proteínas que tenga una alteración descrita en el presente documento. p.ej., de una molécula de ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento, p.ej., una alteración en ERBB2; una alteración en HER2, p.ej. una mutación en HER2 en el residuo S310 donde el residuo S310 está mutado a S310F o S310Y.
Reactivos de detección, p.ej., reactivos de detección basados en ácidos nucleicos, se pueden utilizar para identificar mutaciones en un ácido nucleico diana, p.ej., ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, p.ej., en una muestra, p.ej., una muestra de ácido nucleico derivada de un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., CUMP. reactivos de detección, p.ej., reactivos de detección basados en anticuerpos, se pueden utilizar para identificar mutaciones en una proteína diana, p.ej., en una muestra, p.ej., una muestra de proteína derivada o producida por una célula de carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., célula de CUMP.
Reactivos de detección a base de ácidos nucleicos
En una realización, el reactivo de detección comprende una molécula de ácido nucleico, p.ej., una molécula de ADN, ARN o molécula mixta de ADN/ARN, que comprende una secuencia que es complementaria con una secuencia de ácido nucleico en un ácido nucleico diana (la secuencia en el ácido nucleico diana que está unida por el reactivo de detección se denomina en el presente documento "detección sitio de unión del reactivo" y la porción del reactivo de detección que corresponde al sitio de unión del reactivo de detección se denomina "sitio de unión objetivo"). En una realización, el sitio de unión del reactivo de detección está dispuesto en relación con la posición de interrogación de manera que la unión (o en realizaciones, la falta de unión) del reactivo de detección al sitio de unión del reactivo de detección permite la diferenciación de secuencias mutantes y de referencia para un mutante descrito. en el presente documento (molécula de ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento, p.ej., una alteración en ERBB2; una alteración en HER2, p.ej. una mutación en HER2 en el residuo S310 donde el residuo S310 está mutado a S310F o S310Y, o una mutación en el residuo 157 de HER2, de una secuencia de referencia. El reactivo de detección se puede modificar, p.ej., con una etiqueta u otro resto, p.ej., una fracción que permite la captura.
En una realización, el reactivo de detección comprende una molécula de ácido nucleico, p.ej., una molécula de ADN, ARN o mezcla de ADN/ARN, que, p.ej., en su sitio de unión al objetivo, incluye la posición de interrogación y que puede distinguir (p.ej., por la afinidad de unión del reactivo de detección a un ácido nucleico diana o la capacidad de reacción, p.ej., una reacción de ligadura o extensión con el reactivo de detección) entre una mutación, p.ej., una translocación descrita en el presente documento y una secuencia de referencia. En realizaciones, la posición de interrogación puede corresponder a un terminal, p.ej., a un nucleótido terminal 3' o 5', un nucleótido inmediatamente adyacente a un nucleótido terminal 3' o 5', o a otro nucleótido interno, del reactivo de detección o sitio de unión diana.
En realizaciones, la diferencia en la afinidad del reactivo de detección por un ácido nucleico diana que comprende la alteración descrita en el presente documento y la de un ácido nucleico diana que comprende la secuencia de referencia permite la determinación de la presencia o ausencia de la secuencia de mutación (o referencia). Normalmente, dichos reactivos de detección, en condiciones de ensayo, exhibirán niveles sustancialmente más altos de unión sólo al mutante o sólo a la secuencia de referencia. p.ej., exhibirá niveles sustanciales de unión solo a la mutación o solo a la secuencia de referencia.
En realizaciones, la unión permite (o inhibe) una reacción posterior, p.ej., una reacción posterior que involucra el reactivo de detección o el ácido nucleico diana. P.ej., la unión puede permitir la ligación o la adición de uno o más nucleótidos a un ácido nucleico, p.ej., el reactivo de detección, p.ej., por la ADN polimerasa, que puede detectarse y usarse para distinguir el mutante de la referencia. En realizaciones, la posición de interrogación está ubicada en el extremo, o suficientemente cerca del extremo, del reactivo de detección o su sitio de unión objetivo, de modo que la hibridación, o una reacción química, p.ej., la adición de uno o más nucleótidos al reactivo de detección, p.ej., por la ADN polimerasa, solo ocurre, o ocurre a un ritmo sustancialmente mayor, cuando hay una coincidencia perfecta entre el reactivo de detección y el ácido nucleico objetivo en la posición de interrogación o en una posición de nucleótido dentro de 1, 2 o 3 nucleótidos de la posición de interrogación.
En una realización, el reactivo de detección comprende un ácido nucleico, p.ej., una molécula de ADN, ARN o mezcla de ADN/ARN donde la molécula, o su sitio de unión diana, está adyacente (o flanqueada), p.ej., directamente adyacente, a la posición de interrogación, y que puede distinguir entre una mutación descrita en el presente documento y una secuencia de referencia en un ácido nucleico diana.
En realizaciones, el sitio de unión del reactivo de detección es adyacente a la posición de interrogación, p.ej., el nucleótido terminal 5' o 3' del reactivo de detección, o su sitio de unión objetivo, es adyacente, p.ej., entre 0 (directamente adyacente) y 1.000, 500, 400, 200, 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos desde la posición de interrogación. En realizaciones, el resultado de una reacción variará con la identidad del nucleótido en la posición de interrogación, lo que permitirá distinguir entre secuencias mutantes y de referencia. P.ej., en presencia de un primer nucleótido en la posición de interrogación, se favorecerá una primera reacción sobre una segunda reacción. P.ej., en una reacción de ligación o extensión del cebador, el producto será diferente, p.ej., a cargo, secuencia, tamaño o susceptibilidad a una reacción adicional (p.ej., escisión por restricción) dependiendo de la identidad del nucleótido en la posición de interrogación. En realizaciones, el reactivo de detección comprende moléculas emparejadas (p.ej., cebadores directos e inversos), lo que permite la amplificación, p.ej., mediante amplificación por PCR, de un dúplex que contiene la posición de interrogación. En tales realizaciones, la presencia de la mutación puede determinarse mediante una diferencia en la propiedad del producto de amplificación. p.ej., tamaño, secuencia, carga o susceptibilidad a una reacción, resultante de una secuencia que comprende la posición de interrogación y una secuencia correspondiente que tiene un nucleótido de referencia en las posiciones de interrogación. En realizaciones, la presencia o ausencia de un producto de amplificación característico es indicativa de la identidad del nucleótido en el sitio de interrogación y, por lo tanto, permite la detección de la mutación.
En realizaciones, el reactivo de detección, o su sitio de unión objetivo, está directamente adyacente a la posición de interrogación, p.ej., el nucleótido terminal 5' o 3' del reactivo de detección está directamente adyacente a la posición de interrogación. En realizaciones, la identidad del nucleótido en la posición de interrogación determinará la naturaleza de una reacción. p.ej., una reacción que involucra el reactivo de detección, p.ej., la modificación de un extremo del reactivo de detección. P.ej., en presencia de un primer nucleótido en la posición de interrogación, se favorecerá una primera reacción sobre una segunda reacción. A modo de ejemplo, la presencia de un primer nucleótido en la posición de interrogación, p.ej., un nucleótido asociado a una mutación puede promover una primera reacción, p.ej., la adición de un nucleótido complementario al reactivo de detección. A modo de ejemplo, la presencia de una A en el puesto de interrogación provocará la incorporación de una T, teniendo, p.ej., una primera etiqueta colorimétrica, mientras que la presencia de una G y la posición de interrogación provocarán la incorporación de una C, teniendo, p.ej., una segunda etiqueta colorimétrica. En una realización, la presencia de un primer nucleótido en el nucleótido dará como resultado la ligación del reactivo de detección a un segundo ácido nucleico. P.ej., se puede hibridar un tercer ácido nucleico con el ácido nucleico diana lo suficientemente cerca del sitio de interrogación de modo que si el tercer ácido nucleico tiene una coincidencia exacta en el sitio de interrogación se ligará al reactivo de detección. La detección del producto de ligación, o su ausencia, es indicativa de la identidad del nucleótido en el sitio de interrogación y, por tanto, permite la detección de la mutación.
Se pueden emplear una variedad de lecturas. P.ej., la unión del reactivo de detección a la secuencia mutante o de referencia puede ir seguida de un resto, p.ej., una etiqueta, asociada con el reactivo de detección, p.ej., un marcador radiactivo o enzimático. En realizaciones, la etiqueta comprende un agente de extinción y un agente de señalización y la hibridación da como resultado la alteración de la distancia entre esos dos elementos. p.ej., aumentando la distancia y desactivando el agente de señalización. En realizaciones, el reactivo de detección puede incluir un resto que permite la separación de otros componentes de una mezcla de reacción. En realizaciones, la unión permite la escisión del reactivo de detección unido, p.ej., por una enzima, p.ej., por la actividad de nucleasa de la ADN polimerasa o por una enzima de restricción. La escisión puede detectarse mediante la aparición o desaparición de un ácido nucleico o mediante la separación de un agente de extinción y un agente de señalización asociado con el reactivo de detección. En realizaciones, la unión protege o hace que el objetivo sea susceptible a reacciones químicas adicionales. p.ej., etiquetado o degradación, p.ej., por enzimas de restricción. En realizaciones, la unión con el reactivo de detección permite la separación por captura o la manipulación física del ácido nucleico diana para permitir de ese modo la identificación. En realizaciones, la unión puede dar como resultado una localización detectable del reactivo o objetivo de detección, p.ej., la unión podría capturar el ácido nucleico objetivo o desplazar un tercer ácido nucleico. La unión puede permitir la extensión u otro cambio de tamaño en un componente, p.ej., el reactivo de detección, que permite distinguir entre secuencias mutantes y de referencia. La unión puede permitir la producción, p.ej., mediante PCR, de un amplicón que distingue la secuencia mutante de la de referencia.
En una realización, el reactivo de detección, o el sitio de unión diana, está entre 5 y 500, 5 y 300, 5 y 250, 5 y 200, 5 y 150, 5 y 100, 5 y 50, 5 y 25, 5 y 20. , 5 y 15, o 5 y 10 nucleótidos de longitud. En una realización, el reactivo de detección, o el sitio de unión objetivo, está entre 10 y 500, 10 y 300, 10 y 250, 10 y 200, 10 y 150, 10 y 100, 10 y 50, 10 y 25, 10 y 20. , o 10 y 15 nucleótidos de longitud. En una realización, el reactivo de detección, o el sitio de unión diana, tiene entre 20 y 500, 20 y 300, 20 y 250, 20 y 200, 20 y 150, 20 y 100, 20 y 50, o 20 y 25 nucleótidos de longitud. . En una realización, el reactivo de detección, o el sitio de unión diana, es suficientemente largo para distinguir entre secuencias mutantes y de referencia y tiene menos de 100, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos de longitud.
Preparaciones de ácidos nucleicos y usos de estos.
En otro aspecto, la divulgación presenta preparaciones purificadas o aisladas de un ácido nucleico de células neoplásicas o tumorales. p.ej., ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación descrita en el presente documento, útil para determinar si una mutación descrita en el presente documento está presente. El ácido nucleico incluye la posición de interrogación y, normalmente, una secuencia adicional en uno o ambos lados de la posición de interrogación. Además, el ácido nucleico puede contener secuencias heterólogas, p.ej., secuencias adaptadoras o cebadoras, normalmente unidas a uno o ambos extremos del ácido nucleico. El ácido nucleico también incluye un marcador u otro resto, p.ej., una fracción que permite la separación o localización.
En realizaciones, el ácido nucleico tiene entre 20 y 1000, 30 y 900, 40 y 800, 50 y 700, 60 y 600, 70 y 500, 80 y 400, 90 y 300, o 100 y 200 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas). En una realización, el ácido nucleico tiene entre 40 y 1.000, 50 y 900, 60 y 800, 70 y 700, 80 y 600, 90 y 500, 100 y 400, 110 y 300, o 120 y 200 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas). En otra realización, el ácido nucleico tiene entre 50 y 1.000, 50 y 900, 50 y 800, 50 y 700, 50 y 600, 50 y 500, 50 y 400, 50 y 300, o 50 y 200 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas). En realizaciones, el ácido nucleico tiene una longitud suficiente para permitir la secuenciación (p.ej., mediante secuenciación química o determinando una diferencia en Tm entre preparaciones mutantes y de referencia) pero tiene opcionalmente menos de 100, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas).
Tales preparaciones se pueden utilizar para secuenciar el ácido nucleico de una muestra, p.ej., una muestra neoplásica o tumoral. En una realización, la preparación purificada se proporciona mediante amplificación in situ de un ácido nucleico proporcionado sobre un sustrato. En realizaciones, la preparación purificada es espacialmente distinta de otros ácidos nucleicos, p.ej., otros ácidos nucleicos amplificados, sobre un sustrato.
En una realización, la preparación purificada o aislada de ácido nucleico se deriva de un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., CUMP.
Tales preparaciones se pueden usar para determinar si una muestra comprende una secuencia mutante, p.ej., una alteración descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para determinar la secuencia de una posición de interrogación para una alteración descrita en el presente documento, que comprende:
proporcionar preparaciones purificadas o aisladas de ácido nucleico, p.ej., ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación descrita en el presente documento,
secuenciación, mediante un procedimiento que rompe o forma un enlace químico, p.ej., un enlace químico covalente o no covalente, p.ej., en un reactivo de detección o una secuencia diana, el ácido nucleico para determinar la identidad del nucleótido en una posición de interrogación. El procedimiento permite determinar si está presente una alteración aquí descrita.
En una realización, la secuenciación comprende poner en contacto el ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento con un reactivo de detección descrito en el presente documento.
En una realización, la secuenciación comprende determinar una propiedad física, p.ej., estabilidad de una forma dúplex del ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento, p.ej., t<metro>, que puede distinguir la secuencia mutante de la de referencia.
En una realización, el ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento se deriva de un carcinoma urotelial y/o micropapilar. p.ej., CUMP.
Mezclas y dispositivos de reacción
En otro aspecto, la divulgación presenta preparaciones purificadas o aisladas de un ácido nucleico, p.ej., ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación descrita en el presente documento, útil para determinar si una mutación descrita en el presente documento está presente, dispuesta en un dispositivo de secuenciación o un soporte de muestra para usar en dicho dispositivo. En una realización, el ácido nucleico deriva de un carcinoma urotelial y/o micropapilar. p.ej., CUMP.
En otro aspecto, la divulgación presenta preparaciones purificadas o aisladas de un ácido nucleico, p.ej., ADN, p.ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación descrita en el presente documento, útil para determinar si una mutación divulgada en el presente documento está presente, dispuesta en un dispositivo para determinar una propiedad física o química, p.ej., estabilidad de un dúplex, p.ej., t<m>o un portamuestras para su uso en dicho dispositivo. En una realización, el dispositivo es un calorímetro. En una realización, el ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento se deriva de un carcinoma urotelial y/o micropapilar. p.ej., CUMP.
Los reactivos de detección descritos en el presente documento se pueden usar para determinar si una alteración descrita en el presente documento está presente en una muestra. En realizaciones, la muestra comprende un ácido nucleico que se deriva de un carcinoma micropapilar, p.ej., CUMP. La célula puede ser de una muestra neoplásica o tumoral, p.ej., una biopsia tomada de la neoplasia o del tumor; de células tumorales circulantes, p.ej., de sangre periférica; o de una muestra de sangre o plasma. En una realización, el ácido nucleico deriva de un carcinoma urotelial y/o micropapilar. p.ej., CUMP.
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para preparar una mezcla de reacción, que comprende:combinar un reactivo de detección, o una preparación purificada o aislada del mismo, descrito en el presente documento con un ácido nucleico diana derivado de un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., CUMP, que comprende una secuencia que tiene una posición de interrogación para una alteración descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación presenta una mezcla de reacción, que comprende:
un reactivo de detección, o una preparación purificada o aislada del mismo, descrito en el presente documento; y un ácido nucleico diana derivado de una célula de carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., una célula de CUMP, que comprende una secuencia que tiene una posición de interrogación para una alteración descrita en el presente documento.
En una realización de la mezcla de reacción, o el procedimiento para preparar la mezcla de reacción: el reactivo de detección comprende un ácido nucleico, p.ej., una molécula de ADN, ARN o ADN/ARN mixto que es complementaria con una secuencia de ácido nucleico en un ácido nucleico diana (el sitio de unión del reactivo de detección) donde el sitio de unión del reactivo de detección está dispuesto en relación con la posición de interrogación de manera que la unión de el reactivo de detección al sitio de unión del reactivo de detección permite la diferenciación de secuencias mutantes y de referencia para una secuencia de mutación o evento descrito en el presente documento.
En una realización de la mezcla de reacción, o del procedimiento para preparar la mezcla de reacción: la secuencia de ácido nucleico diana deriva de un carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., CUMP, como se describe en el presente documento. En una realización de la mezcla de reacción, o el procedimiento para preparar la mezcla de reacción: la mutación es una alteración descrita en el presente documento, que incluye: una sustitución, p.ej., una sustitución descrita en el presente documento.
Una alteración descrita en el presente documento se puede distinguir de una referencia, p.ej., una secuencia no mutante o de tipo salvaje, mediante reacción con una enzima que reacciona de manera diferencial con la mutación y la referencia. P.ej., se pueden distinguir mediante escisión con una enzima de restricción que tiene actividad diferente para las secuencias mutantes y de referencia. P.ej., la divulgación incluye un procedimiento para poner en contacto un ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento con dicha enzima y determinar si está presente un producto de esa escisión que puede distinguir la secuencia de referencia de la forma mutante.
En un aspecto, la divulgación proporciona una preparación purificada de un producto de escisión de enzima de restricción que puede distinguir entre secuencia mutante y de referencia, donde un extremo del producto de escisión está definido por una enzima que escinde diferencialmente entre secuencia mutante y de referencia. En una realización, el producto de escisión incluye la posición de interrogación.
Reactivos, procedimientos, mezclas de reacción y dispositivos de detección a base de proteínas
Una proteína mutante descrita en el presente documento se puede distinguir de una referencia, p.ej., una proteína no mutante o de tipo salvaje, por reacción con un reactivo, p.ej., un sustrato, p.ej, un sustrato para actividad catalítica o actividad funcional, o un anticuerpo, que reacciona diferencialmente con la proteína mutante y de referencia. En un aspecto, la divulgación incluye un procedimiento para poner en contacto una muestra que comprende una proteína mutante descrita en el presente documento con dicho reactivo y determinar si la proteína mutante está presente en la muestra.
En otra realización, la divulgación presenta un anticuerpo que puede distinguir una proteína mutante descrita en el presente documento, o un fragmento de esta, de una referencia. p.ej., una proteína no mutante o de tipo salvaje.
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para preparar una mezcla de reacción que comprende: combinar un reactivo de detección, o una preparación purificada o aislada del mismo, p.ej., un sustrato, p.ej., un sustrato para la fosforilación u otra actividad, o un anticuerpo, descrito en el presente documento con una proteína diana derivada de una célula de carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., célula de CUMP, que comprende una secuencia que tiene una posición de interrogación para una alteración descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación presenta una mezcla de reacción que comprende:
un reactivo de detección, o una preparación purificada o aislada del mismo, p.ej., un sustrato, p.ej., un sustrato para la fosforilación u otra actividad, o un anticuerpo, descrito en el presente documento; y
una proteína diana derivada de una célula de carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., célula de CUMP, que comprende una secuencia que tiene una posición de interrogación para una alteración descrita en el presente documento.
En una realización de la mezcla de reacción, o el procedimiento para preparar la mezcla de reacción: el reactivo de detección comprende un anticuerpo específico para una proteína mutante descrita en el presente documento.
En una realización de la mezcla de reacción, o el procedimiento para preparar la mezcla de reacción que incluye una célula de carcinoma urotelial y/o micropapilar, p.ej., célula de CUMP.
En una realización de la mezcla de reacción, o el procedimiento para preparar la mezcla de reacción: la mutación es una alteración descrita en el presente documento (p.ej., una mutación de HER2 descrita en este documento).
Procedimientos de detección
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento o ensayo para detectar agentes que modulan, p.ej., inhibir, la expresión o actividad de un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una mutación como se describe en el presente documento. El procedimiento incluye poner en contacto un ácido nucleico, polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento, o una célula que expresa un ácido nucleico, polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento, con un agente candidato; y detectar un cambio en un parámetro asociado con un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento, p.ej., un cambio en la expresión o una actividad del ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento. El procedimiento puede, opcionalmente, incluir comparar el parámetro tratado con un valor de referencia, p.ej., una muestra de control (p.ej., comparando un parámetro obtenido de una muestra con el agente candidato con un parámetro obtenido de una muestra sin el agente candidato). En una realización, si se detecta una disminución en la expresión o actividad del ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento, el agente candidato se identifica como un inhibidor. En otra realización, si se detecta un aumento en la expresión o actividad del ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento, el agente candidato se identifica como un activador.
En una realización, la etapa de contacto se realiza en un sistema sin células, p.ej., un lisado celular o en un sistema reconstituido. En otras realizaciones, la etapa de contacto se efectúa en una célula en cultivo, p.ej., una célula que expresa una alteración descrita en el presente documento (p.ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En otras realizaciones más, la etapa de contacto se efectúa en una célula in vivo (una célula que expresa presente en un sujeto, p.ej., un sujeto animal (p.ej., un modelo animal in vivo).
Los parámetros ejemplares evaluados incluyen uno o más de:
(i) un cambio en la actividad vinculante, p.ej., unión directa del agente candidato a un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento; una competición de unión entre un ligando conocido y el agente candidato a un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento;
(ii) un cambio en la actividad quinasa, p.ej., niveles de fosforilación de un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento (p.ej., una autofosforilación aumentada o disminuida); o un cambio en una diana de un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento. En determinadas realizaciones, un cambio en la actividad quinasa, p.ej., fosforilación, se detecta mediante cualquiera de las transferencias Western (p.ej., usando un anticuerpo que se une a un polipéptido que comprende una alteración descrita en el presente documento, espectrometría de masas, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, perlas inmunomagnéticas, entre otros;
(iii) un cambio en la actividad de una célula que contiene una célula tumoral o una célula recombinante, p.ej., un cambio en la proliferación, morfología o tumorigenicidad de la célula;
(iv) un cambio en el tumor presente en un sujeto animal, p.ej., tamaño, apariencia, proliferación del tumor; o
(v) un cambio en el nivel, p.ej., nivel de expresión, de un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento.
En una realización, se evalúa un cambio en un ensayo libre de células en presencia de un agente candidato. Por ejemplo, se puede detectar una actividad de un ácido nucleico, polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento, o la interacción de un ácido nucleico, polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento con un ligando aguas abajo. En una realización, el polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento se pone en contacto con un ligando, p.ej., en solución, y se monitorea la capacidad de un agente candidato para modular, p.ej., inhibir, una interacción, p.ej., unión, entre el ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento y el ligando.
En otras realizaciones, se detecta un cambio en la actividad de una célula en una célula en cultivo, p.ej., una célula que expresa una mutación (p.ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En una realización, la célula es una célula recombinante que está modificada para expresar un ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento. p.ej., es una célula recombinante transfectada con un ácido nucleico que comprende una alteración descrita en el presente documento. La célula transfectada puede mostrar un cambio en respuesta a la mutación expresada, p.ej., aumento de la proliferación, cambios en la morfología, aumento de la tumorigenicidad y/o adquisición de un fenotipo transformado. Un cambio en cualquiera de las actividades de la célula. p.ej., se puede detectar la célula recombinante, en presencia del agente candidato. Por ejemplo, una disminución en uno o más de: proliferación, tumorigenicidad, morfología transformada, en presencia del agente candidato puede ser indicativo de un inhibidor de un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento. En otras realizaciones, se detecta un cambio en la actividad de unión o fosforilación como se describe en el presente documento.
Aún en otra realización, un cambio en un tumor presente en un sujeto animal (p . e j un modelo animal in vivo). En una realización, el modelo animal es un animal que contiene un tumor o un xenoinjerto que comprende células que expresan un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento (p.ej., células tumorigénicas que expresan un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento). El agente candidato puede administrarse al sujeto animal y se detecta un cambio en el tumor. En una realización, el cambio en el tumor incluye uno o más de un crecimiento tumoral, se evalúa el tamaño del tumor, la carga tumoral y la supervivencia. Una disminución en uno o más del crecimiento tumoral, el tamaño del tumor, la carga tumoral o una mayor supervivencia es indicativo de que el agente candidato es un inhibidor.
En otras realizaciones, un cambio en la expresión de un ácido nucleico o polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento se puede controlar detectando los niveles de ácido nucleico o proteína. p.ej., utilizando los procedimientos descritos en este documento.
En determinadas realizaciones, los procedimientos de detección descritos en el presente documento se pueden repetir y/o combinar. En una realización, un agente candidato que se evalúa en un sujeto libre de células o basado en células descrito en el presente documento se puede probar adicionalmente en un sujeto animal.
En una realización, el agente candidato es un compuesto de molécula pequeña, p.ej., un inhibidor de la quinasa, un ácido nucleico (p.ej., antisentido, ARNip, aptámero, ribozimas, microARN), una molécula de anticuerpo (p.ej., un anticuerpo completo o un fragmento de unión a antígeno de este que se une a la mutación). El agente candidato se puede obtener de una biblioteca (p.ej., una biblioteca comercial de inhibidores de quinasas) o diseñados racionalmente.
En otras realizaciones, el procedimiento o ensayo incluye proporcionar una etapa basada en la generación de señales dependiente de la proximidad, p.ej., un ensayo de dos híbridos que incluye una proteína de primera mutación (p.ej., una proteína mutada), y una segunda proteína mutada (p.ej., un ligando), poner en contacto el ensayo de dos híbridos con un compuesto de prueba, en condiciones donde dicho ensayo de dos híbridos detecta un cambio en la formación y/o estabilidad del complejo, p.ej., la formación del complejo inicia la activación de la transcripción de un gen informador.
En un ejemplo no limitante, la estructura tridimensional del sitio activo de un polipéptido o proteína que comprende una alteración descrita en el presente documento se determina cristalizando el complejo formado por el polipéptido o proteína y un inhibidor conocido. Luego se utiliza el diseño racional de fármacos para identificar nuevos agentes de prueba realizando alteraciones en la estructura de un inhibidor conocido o diseñando compuestos de moléculas pequeñas que se unen al sitio activo del polipéptido o proteína.
Los agentes candidatos se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos enfoques en procedimientos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen funcionalidades de péptidos, pero con una nueva estructura no peptídica que son resistentes a la degradación enzimática pero que, sin embargo, siguen siendo bioactivas; ver, por ejemplo, Zuckermann, R.N. y col. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas de fase sólida o de fase de solución paralelas espacialmente direccionables; procedimientos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; el procedimiento de biblioteca 'una perla y un compuesto'; y procedimientos de biblioteca sintética que utilizan selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de biblioteca biológica y biblioteca de peptoides se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos peptídicos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Se pueden encontrar ejemplos de procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo en: DeWitt y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann y col. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho y col. (1993) Science 261:1303; Carrell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 33:2059; Carell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 33:2061; y Gallop y col. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (p.ej., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o<en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, Patente>E<e>. UU. No. 5,223,409), esporas (Ladner Patente EE. UU. No. 5,223,409), plásmidos (Cull y col. (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra.).
También se puede detectar la interacción entre dos moléculas, p.ej., utilizando transferencia de energía de fluorescencia (FET) (ver, por ejemplo, Lakowicz y col., Patente EE. UU. No. 5.631.169; Stavrianopoulos, y col., Patente EE. UU. No. 4.868.103). Un evento de unión de FET se puede medir convenientemente a través de medios de detección fluorométricos estándar conocidos en la técnica (p.ej., utilizando un fluorímetro).
En otra realización, la determinación de la capacidad de la proteína mutada para unirse a una molécula diana se puede lograr usando Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real (ver, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo y col. (1995) Curr. Opin. Structur. Biol. 5:699-705). La "resonancia de plasmón superficial" o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar ninguno de los interactuantes (p.ej., BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)), lo que resulta en una señal detectable que puede usarse como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
Ejemplos
Ejemplo 1. Una mutación de dominio extracelular activador ERBB2 (HER2) en el carcinoma urotelial (CU)
Este ejemplo describe los resultados de un estudio de 35 CU que incluyó un subconjunto de casos utilizados en el Ejemplo 2. Las condiciones experimentales son las descritas en el Ejemplo 2. Se describe una única mutación de ER<b>B2 en el caso CUMP perfilado.
En este estudio, en el CU de una paciente de 71 años con CU de alto grado en estadio IV, se identificó una mutación del dominio externo S310F en el gen ERBB2. Esta es la primera mutación reportada de ERBB2 en el CU. La histología se toma de la muestra de metástasis en los ganglios linfáticos utilizada para la evaluación NGS. Tenga en cuenta que este tumor tiene una arquitectura micropapilar. Este CU presenta la sustitución de la base S310F en el gen ERBB2 (HER2). Este tumor también presentaba mutaciones en los genes FBXW7 y TP53.
Datos in vitro recientes sugieren que ERBB2 S310F es una mutación activadora, que es sensible a inhibidores duales irreversibles de Egfr/Erbb2 (Greulich H (2010) Cáncer Res. 1:1200-1210). Las mutaciones de ERBB2 no se han informado previamente en el carcinoma urotelial (COSMIC, PubMed, agosto de 2012), pero sugieren sensibilidad a las terapias farmacológicas dirigidas a Her2.
Ejemplo 2. Una alta frecuencia de activación de mutación del dominio extracelular ERBB2 (HER2) en el carcinoma urotelial micropapilar.
En este ejemplo, se realizó un análisis genómico de una serie de pacientes con CUMP y una serie ampliada de pacientes sin CUMP para caracterizar el panorama genómico de CUMP e identificar opciones de tratamiento específicas para pacientes diagnosticados con esta enfermedad.
Procedimientos
La secuenciación de próxima generación (NGS) dirigida se realizó en bibliotecas basadas en ligadura de adaptador capturadas por hibridación utilizando ADN extraído de 4 secciones embebidas en parafina fijadas con formalina y cortadas a 10 micrones de 15 casos de CUMP y 64 casos de no CUMP en un sistema certificado por CLIA. laboratorio (Foundation Medicine). El diagnóstico patológico de cada caso se confirmó en portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina de rutina y todas las muestras enviadas para la extracción de ADN contenían un mínimo de 20 % de ADN derivado de células tumorales. Todas las CUMp fueron confirmadas histológicamente utilizando los criterios publicados (Sangoi AR, y col. (2010) Am J Surg Pathol. 34:1367-76) por 3 patólogos. Se realizó la secuenciación de ADN de 3230 exones de 182 genes relacionados con el cáncer y 37 intrones de 14 genes frecuentemente reordenados en el cáncer (1,14 millones de pb en total) en sistemas indexados, ligados con adaptador, capturados por hibridación (kit personalizado Agilent SureSelect) y se secuenció completamente utilizando 49 pb. lecturas emparejadas en Illumina HiSeq 2000. Los casos de CUMP se secuenciaron a una profundidad promedio de 978X. Los CU no MP se secuenciaron a una profundidad promedio de 969X. Todas las muestras se evaluaron para detectar alteraciones genómicas, incluidas sustituciones de bases, inserciones, eliminaciones, alteraciones del número de copias (amplificaciones y eliminaciones homocigotas) y fusiones/reordenamientos de genes seleccionados como se describió anteriormente (Lipson D, y col. (2012) Nat Med. 18:382-4).
Los procesos bioinformáticos utilizados en este estudio incluyeron algoritmos bayesianos para detectar sustituciones de bases, algoritmos de ensamblaje local para detectar inserciones y eliminaciones cortas, una comparación con muestras de control normales emparejadas por procesos para detectar alteraciones en el número de copias de genes y un análisis de pares de lectura quimérica para identificar genes. fusiones. Los AG procesables se definieron como aquellos vinculados a terapias dirigidas disponibles comercialmente en el mercado o a terapias dirigidas que se están probando en ensayos clínicos registrados. En los 10 casos de CUMP se analizó la sobreexpresión de la proteína HER2 (ERBB2) mediante inmunohistoquímica (IHC) utilizando el ensayo Dako Herceptest.
Resultados
Las 15 muestras de CUMP se obtuvieron de 10 pacientes masculinos (66 %) y 5 mujeres (33 %) con una edad media de 66 años (intervalo de 55 a 86 años). La secuenciación se realizó en el tumor primario en 11 (73 %) casos (6 muestras de TURBT y 5 cistectomías) y en lesiones metastásicas en 4 (27 %) de los casos. Todos los tumores eran de alto grado, 3 casos estaban en estadio I, 3 en estadio II, 2 en estadio III y 7 en estadio IV. Se identificaron un total de 67 alteraciones genómicas (GA) (promedio de 4,47 GA por tumor), incluidas alteraciones en TP53 (10 casos, 67 %), ERBB2 (6 casos, 40 %), MCL1 (5 casos, 33 %), RB1 (5 casos, 33 %), y ARID1A (4 casos, 27 %) (FIG. 1 y FIG. 2). el 6 ERBB2 Todas las mutaciones estaban ubicadas dentro del dominio extracelular de ERBB2 incluyendo S310F (4 casos), S310Y (1 caso) y R157W (1 caso) (FIG. 2; FIG. 5). No hay mutaciones en el ERBB2 Se observaron dominios de tirosina quinasa. Los 6 casos de CUMP con ERBB2 mutación fueron negativos para ERBB2 amplificación y en los 3 casos donde había tejido adicional disponible para la prueba, estos ERBB2 Las CUMP mutadas también fueron negativas para la sobreexpresión de HER2 mediante inmunohistoquímica (IHC) (FIG. 2; FIG. 5).
Por el contrario, sólo 6/64 (9,4 %) de los CU no MP albergaban ERBB2 alteraciones que incluyen mutaciones S310F (3 casos), amplificación (2 casos, 40 y 15 copias) y una ERBB2-GRB7 fusión (1 caso) (FIG. 4; FIG. 6). El ERBB2 La frecuencia de mutación observada tanto en las cohortes de CUMP como donde no pertenecen a CUMP es mayor que 2/159 (1,3 %) de cambios de proteínas. ERBB2 mutaciones reportadas en cáncer del tracto urinario en COSMIC (15). El enriquecimiento de alteraciones de ERBB2 en CUMP en comparación con el CU no MP son significativas entre esta serie (p < 0,0084) y para todos los tipos de cáncer del tracto urinario en COSMIC (p < 0,001). Los 9 casos de CUMP ERBB2 WT albergaban al menos una alteración procesable, incluidas alteraciones en AKT1, AKT2, CCND1, EGFR, PIK3CA, PIK3R1 y RAF1. Las alteraciones más frecuentes en el grupo sin CUMP implicaron mutaciones en TP53 (38 total; 58 % de los casos no CUMP) y CDKN2A/B (25 total; 39 % de los casos no CUMP). Alteraciones en los genes remodeladores de la cromatina, incluidas mutaciones truncadoras en KDM6A (17 total; 27 % de los casos no CUMP) y ARID1A (12 total; 19 % de los casos sin CUMP) fueron notables en el grupo sin CUMP (FIG. 4; FIG. 6).
Discusión
CUMP es un subtipo relativamente raro de CU que comprende aproximadamente de 3000 a 4000 nuevos casos diagnosticados cada año en los EE. UU., una incidencia justo por debajo de la de la enfermedad alcanzada exitosamente, la leucemia mielógena crónica (Amin MB, y col. (1994) Am J Surg Pathol.18:1224-32); Sangoi AR, y col. (2010) Am J Surg Pathol. 34:1367-76; Kamat AM, y col. (2007) Cáncer. 110:62-7; López JI, y col. (1999) Histopathology 34:561-2). Se considera ampliamente que CUMP tiene un pronóstico adverso que se refleja en la propensión a invadir espacios linfovasculares y diseminarse a sitios distantes en las primeras etapas del curso de la enfermedad (Amin MB, y col. (1994) supra); Sangoi AR, y col. (2010) supra; Kamat AM, y col. (2007); López JI, y col.<(1999) supra). Cualquier componente de CUMP en un>C<u de la vejiga se considera significativo y los estudios han>demostrado que, a medida que aumenta la proporción del componente de CUMP, el pronóstico empeora (Amín, MD. (2009) Modern Pathol. 22:T96-S118; Samaratunga H, y col. (2004) Histopathol.45: 55-64; Stewart SL, y col. (2004)MMWR Survey Summ. 53:1-108). Dado que se sabe que el CUMP produce metástasis incluso cuando no hay invasión local de la pared muscular de la vejiga, se ha recomendado la cirugía radical temprana para el CUMP en<comparación con el>C<u convencional sin MP (Kamat AM, y col. (2007) supra.>
En el presente ejemplo, se observó el enriquecimiento significativo de la frecuencia de mutación de ERBB2 en CUMP<(40 %) versus no c>U<m>P<(9,4 %) (p < 0,0084). En comparación con la base de datos COSMIC que contiene sólo 2 (1,4>%) mutaciones que alteran proteínas en ERBB2 en 158 carcinomas de vejiga urinaria (COSMIC v65Release". Catalogue O f Somatic Mutations In Cancer. Welcome Trust Sanger Institute. Consultado el 1 de julio de 2013 (http://www.sanger.ac.uk/cosmic)), el enriquecimiento en CUMP también es muy significativo (p < 0,0001).
Todas las mutaciones de 6ERBB2 identificadas en CUMP en este estudio se localizaron en el dominio extracelular, con cinco mutaciones en S310 y ninguna mutación dentro del dominio tirosina quinasa. Esto contrasta con otros tipos de tumores donde la mayoría de las mutaciones de ERBB2 se localizan dentro del dominio quinasa con una frecuencia en COSMIC del 78 % en todos los tejidos, del 97 % en adenocarcinoma de pulmón y del 81 % en cáncer de mama (FIG. 3). Los fundamentos biológicos de la ubicación del dominio extracelular de las mutaciones de ERBB2 en el CUMP no están claras y justifican una mayor investigación.
Por el contrario, en el cáncer de pulmón las alteraciones de ERBB2 son predominantemente mutaciones de inserción en la quinasa y solo una pequeña fracción de las alteraciones involucran el dominio extracelular. (COSMIC v65Release". Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Welcome Trust Sanger Institute. Consultado el 1 de julio de 2013 (http://www.sanger.ac.uk/cosmic). En el cáncer de mama, aunque similar al cáncer de pulmón en la localización de la gran mayoría de las alteraciones del dominio quinasa de ERBB2, las inserciones son relativamente poco comunes y prácticamente todas las mutaciones del dominio quinasa son sustituciones de bases (COSMIC v65Release". Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Welcome Trust Sanger Institute. Consultado el 1 de julio de 2013 (http://www.sanger.ac.uk/cosmic). Un enriquecimiento de una mutación de ERBB2 dentro de un subtipo de cáncer común también se ha descrito recientemente en una serie de carcinomas lobulillares invasivos mutados CDH1 de mama con una frecuencia del 23 % en comparación con una frecuencia del 2 % en todos los cánceres de mama (Ross JS, y col. (2013) Clin Cancer Res. 19:2668-76).
En el conjunto de datos TCGA sobre carcinoma urotelial de vejiga, aunque las mutaciones en ERBB2 no se describen, amplificación de ERBB2 apareció en el 6 % (9/150) de los casos (The cBio Cancer Genomic Portal, abril de 2013). Estudios separados han informado amplificación de ERBB2 basada predominantemente en el análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) en el 8-9 % de los carcinomas uroteliales primarios, y con mayor frecuencia en las metástasis en los ganglios linfáticos (Fleischmann A, y col. (2011) Euro Urol.60:350-7). Además, en un estudio sobre cánceres de vejiga no invasivos de los músculos, se ha observado amplificación de ERBB2 en carcinomas uroteliales de alto grado (HG-CU) con una incidencia similar del 9 %, pero no en ninguna de las neoplasias uroteliales papilares de bajo potencial maligno o carcinomas uroteliales de bajo grado (LG-CU) estudiados, y se ha observado asociado con la recurrencia y progresión en el CU de alto grado (Chen PC, (2013) y col. J Clin Pathol.66:113-9). La sobreexpresión de Her2 se ha identificado en el 19 % (22/116) de los cánceres de vejiga, con un enriquecimiento significativo en los tumores de grado III y con invasión muscular. Gardiner RA, y col. (1992) Urol Res.20:117-20). Sin embargo, los estudios han informado resultados inconsistentes con respecto al valor pronóstico de la expresión de HER2 detectada por IHC (Tsai YS, y col. (2012) Adv. Urol.:181964). En el estudio actual, 3 (100 %) de los CUMP con ERBB2 mutado fueron negativos para la expresión de HER2 mediante IHC.
Además de la amplificación de ERBB2, la activación de las mutaciones de ERBB2 también pueden predecir la sensibilidad a las terapias dirigidas contra HER2 (Herter-Sprie GS, y col. Front Oncol. 2013;3:86; Bosé, y col. (2013) Cancer Discover. 3(2):224-37; Maziéres J, y col. (2013) J Clin Oncol. 31:1997-2003; Ali SM, y col. (2013) J Clin Oncol.
27 de septiembre [Epub antes de imprimir). Los inhibidores irreversibles de HER2 (ERBB2) están surgiendo y parecen mostrar mayor potencia y durabilidad que los inhibidores reversibles disponibles en el mercado, tanto en entornos clínicos como preclínicos. Bosé, y col. (2013) Cancer Discover. 3(2):224-37; Maziéres J, y col. (2013) J Clin Oncol.
31:1997-2003). Las mutaciones del dominio extracelular S310F/Y ERBB2 observadas en 5 casos de<c>U<m>P y 3 casos de CU se consideran una mutación activadora y sensible a inhibidores duales irreversibles de Egfr/Erbb2 (Herter-Sprie GS, y col. (2013) Front Oncol. 3:86; Lee JC, y col. (2006) PLoS Med. 3:e485; Greulich H. y col. Genes Cancer.
2010;1:1200-10; Greulich H, y col. (2012) Proc Natl Acad Sci USA. 109:14476-81). Las alteraciones del dominio quinasa en ERBB2 se consideran homólogos a las encontrados en el gen EGFR (Greulich H. (2010) Genes Cancer 1:1200-10). Las mutaciones del dominio extracelular S310F/Y ERBB2 encontradas en los casos de CUMP no son tan comparables con las mutaciones del dominio extracelular de EGFR y, hasta la fecha, no están tan bien caracterizadas como las mutaciones de inserción y sustitución de bases descritas en los cánceres de pulmón y mama (COSMIC v65Release". Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Welcome Trust Sanger Institute. Consultado el 1 de julio de 2013 (http://www.sanger.ac.uk/cosmic). Aunque el mecanismo de activación del receptor aún no se ha caracterizado para estas mutaciones del dominio extracelular de EGFR, es tentador especular que el mecanismo tumorigénico subyacente es causado por una conformación menos ligada del dominio extracelular ya que la mayoría de las sustituciones de aminoácidos se localizan en las interfaces entre dominios. Lee JC, y col. (2006) PLoS Med 3:e485).
Aunque las terapias dirigidas anti-HER2 disponibles actualmente, como trastuzumab, lapatanib y otras, están actualmente bajo investigación para el tratamiento de los carcinomas uroteliales amplificados por ERBB2, los datos del ensayo de fase 3 aún no han surgido. Marín AP, y col. (2010) J Cancer Res Clin Oncol. 136:1915-20. Para cánceres de vejiga no amplificados como el CUMP con 6 ERBB2 mutado en el estudio actual, las pruebas estándar para el estado de amplificación/sobreexpresión de HER2 (ERBB2) (IHC y FISH) fueron uniformemente negativas y, por lo tanto, no se habría detectado que estos tumores agresivos estuvieran impulsados por activación de ERBB2. Dada la promesa de alcanzar tumores con ERBB2 mutado (HER2 IHC/FISH negativo), como los que se han iniciado recientemente en los ensayos clínicos para cánceres de mama y pulmón, el estudio actual sostiene que este enfoque debe extenderse al cáncer de vejiga urinaria, especialmente cuando el tumor presenta un patrón de CUMP. La arquitectura micropapilar y el curso clínico agresivo bien documentado atribuido al CUMP también se han relacionado con los carcinomas micropapilares de endometrio, mama y pulmón (del Carmen MG, y col. (2012) Gynecol Oncol.
127:651-61; Chen L, y col. (2008) Int J Surg Pathol.; 16:155-63; Kamiya K, y col. (2008) Mod Pathol. 21:992-1001). Sin embargo, hasta la fecha no se ha reportado ninguna asociación de mutaciones de ERBB2 en estos otros tipos agresivos de carcinomas micropapilares. Este estudio ilustra el impacto de la subtipificación histológica en el panorama genómico y el potencial resultante para dirigir terapias dirigidas.
En el presente documento se proporciona una secuencia de aminoácidos y nucleótidos ejemplar para HER2 humano como SEQ ID NO:1 y SEQ ID No :2, respectivamente. SEQ ID NO:1 corresponde a una isoforma de HER2 que contiene un péptido señal (aminoácidos 1-22). El residuo Ser310 está resaltado.
Secuencia de referencia NCBI: NP_004439.2
1 melaalcrwg lllallppga astqvctgtd mklrlpaspe thldmlrhly qgcqvvqgnl 61 eltylptnas lsflqdiqev qgyvliahnq vrqvplqrlr ivrgtqlfed nyalavldng 121 dplnnttpvt gaspgglrel qlrslteilk ggvliqmpq lcyqdtilwk difhknnqla 181 ltlidtnrsr achpcspmck gsrcwgesse dcqsltrtvc aggcarckgp lptdccheqc 241 aagctgpkhs dclaclhfnh sgicelhcpa lvtyntdtfe smpnpegryt fgascvtacp 301 ynylstdvgs ctlvcplhnq evtaedgtqr cekcskpcar vcyglgmehl revravtsan 361 iqefagckki fgslaflpes fdgdpasnta plqpeqlqvf etleeitgyl yisawpdslp 421 dlsvfqnlqv irgrilhnga ysltlqglgi swlglrslre lgsglalihh nthlcfvhtv 481 pwdqlfmph qallhtanrp edecvgegla chqlcarghc wgpgptqcvn csqflrgqec 541 veecrvlqgl preyvnarhc lpchpecqpq ngsvtcfgpe adqcvacahy kdppfcvarc 601 psgvkpdlsy mpiwkfpdee gacqpcpinc thscvdlddk gcpaeqrasp ltsiisavvg 661 illvvvlgvv fgilikrrqq kirkytmrrl lqetelvepl tpsgampnqa qmrilketel 721 rkvkvlgsga fgtvykgiwi pdgenvkipv aikvlrents pkankeilde ayvmagvgsp 781 yvsrllgicl tstvqlvtql mpygclldhv renrgrlgsq dllnwcmqia kgmsyledvr 841 lvhrdlaam vlvkspnhvk itdfglarll dideteyhad ggkvpikwma lesilrrrft 901 hqsdvwsygv tvwelmtfga kpydgipare ipdllekger lpqppictid vymimvkcwm 961 idsecrprfr elvsefsrma rdpqrfvviq nedlgpaspl dstfyrslle dddmgdlvda 1021 eeylvpqqgf fcpdpapgag gmvhhrhrss strsgggdlt lglepseeea prsplapseg 1081 agsdvfdgdl gmgaakglqs lpthdpsplq rysedptvpl psetdgyvap ltcspqpeyv 1141 nqpdvrpqpp spregplpaa rpagatlerp ktlspgkngv vkdvfafgga venpeyltpq 1201 ggaapqphpp pafspafdnl yywdqdpper gappstfkgt ptaenpeylg ldvpv (SEQID NO:!)
Secuencia de referencia NCBI: NM_004448.2
1 atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 61 gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 121 acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 181 gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 241 cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 301 attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 361 gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 421 cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 481 ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 541 ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 601 ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 661 gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 721 gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 781 agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 841 tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 901 tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 961 gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1021 gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1081 atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1141 tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1201 gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1261 gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1321 tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1381 ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1441 ccctgggacc ágetetttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1501 gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1561 tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1621 gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1681 ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1741 gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1801 cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1861 ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1921 ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 1981 attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag 2041 aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg 2101 acacctagcg gagegatgee caaccaggcg cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg 2161 aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag tctacaaggg catctggatc 2221 cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc 2281 cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca 2341 tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg tgcagctggt gacacagctt 2401 atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag 2461 gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg 2521 ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa 2581 attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg agacagagta ccatgcagat 2641 gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc 2701 caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc 2761 aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg 2821 ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg 2881 attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc 2941 agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg 3001 gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct 3061 gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg 3121 ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca 3181 ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg 3241 gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc 3301 ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg aggaccccac agtacccctg 3361 ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg 3421 aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc 3481 cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc aagactctct ccccagggaa gaatggggtc 3541 gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag 3601 ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc 3661 tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac ccagcacctt caaagggaca 3721 cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc cagtgtga
(SEQ ID NO:2)

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un agente que inhibe HER2 para su uso en un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un carcinoma micropapilar, donde el carcinoma comprende una alteración en HER2, donde la alteración es una sustitución en el residuo 310 de HER2 o una sustitución en el residuo 157 de HER2.
2. El agente para uso según la reivindicación 1, donde el carcinoma comprende una sustitución de una serina en el residuo 310 de HER2 por fenilalanina o tirosina.
3. El agente para uso según la reivindicación 1, donde el carcinoma comprende una sustitución de una arginina en el residuo 157 de HER2 por triptófano.
4. El agente para uso según la reivindicación 1, donde el carcinoma micropapilar es un carcinoma urotelial micropapilar (CUMP).
5. El agente para uso según la reivindicación 1, donde el carcinoma micropapilar se elige entre un cáncer del tracto urinario, de la vejiga o de las células uroteliales.
6. El agente para uso según la reivindicación 1, donde la presencia de la alteración en HER2 se determina mediante secuenciación.
7. El agente para uso según la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende además identificar al sujeto, o una muestra, por ejemplo, una muestra de cáncer o tumor del sujeto, que tiene la alteración y/o una histología micropapilar.
8. El agente para uso según la reivindicación 1, donde el agente se administra en respuesta a una determinación de la presencia de la alteración de HER2, la histología micropapilar, o ambas, en el sujeto, o la muestra, por ejemplo, la muestra de cáncer o tumor, del sujeto.
9. El agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la alteración se detecta en una molécula de ácido nucleico adquirida del sujeto, opcionalmente, donde dicha molécula de ácido nucleico está presente en una célula circulante, el carcinoma micropapilar o una muestra de sangre o plasma.
10. El agente para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se identifica o se ha identificado previamente que el sujeto tiene un CUMP.
11. El agente para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto está en tratamiento o se ha sometido a un tratamiento con un agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2, opcionalmente donde el agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2 comprende uno o más de: metotrexato, vinblastina, doxorrubicina o cisplatino.
12. El agente para uso según la reivindicación 11, donde, en respuesta a la determinación de la presencia de la alteración de HER2 y/o histología micropapilar, se suspende el agente terapéutico o la modalidad terapéutica no-HER2.
13. El agente para uso según la reivindicación 11 o 12, donde el agente se administra después de la interrupción del agente terapéutico o modalidad terapéutica no-HER2.
14. El agente para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agente inhibe un gen o producto génico de HER2.
15. El agente para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agente se elige entre: (i) uno o más de: un inhibidor de quinasa; un inhibidor de quinasa multiespecífico; un inhibidor de HER2; un inhibidor de EGFR; un inhibidor pan ERBB; un inhibidor de molécula pequeña que es selectivo para HER2; una molécula de anticuerpo; un anticuerpo monoclonal o biespecífico contra HER2; un anticuerpo contra HER2 conjugado con un agente citotóxico; o una inmunoterapia celular HER2;
(ii) un inhibidor de HER2 reversible o irreversible;
(iii) un inhibidor pan ERBB, un inhibidor dual o un inhibidor específico de HER2;
(iv) un inhibidor dual de EGFR/ERBB2 reversible o irreversible;
(v) una molécula de anticuerpo anti-HER2, o un conjugado de la misma;
(vi) un inhibidor de quinasa, opcionalmente donde el inhibidor de quinasa se elige entre uno o más de: un inhibidor de quinasa multiespecífico, un inhibidor de HER2/ERBB2, un inhibidor pan-ERBB, un inhibidor de HER3 o un inhibidor de molécula pequeña que es selectivo para HER2;
(vii) uno o más de: AV-203, AMG 888, U3-1287, APC8024, DN24-02, Neuvenge, Lapuleucel-T, MM-111, MM-121, SAR256212, MM-141, LJM716, REGN1400, MEHD7945A, RG7597, RG7116, Trastuzumab, trastuzumab emtansina (T-DM1), pertuzumab, afatinib, TAK-285, Neratinib, Dacomitinib, BMS-690514, BMS-599626, Pelitinib, CP-724714, Lapatinib, TAK-165, ARRY-380, AZD8931 o Neratinib; o
(viii) una molécula antisentido, una ribozima, un ARN bicatenario o una molécula de triple hélice, cada una de las cuales se hibrida y/o inhibe (a) un ácido nucleico de HER2, por ejemplo, un ácido nucleico de HER2 que codifica la alteración, o (b) una región reguladora de la transcripción y bloquea o reduce la expresión de ARNm de un ácido nucleico de HER2 que codifica la alteración.
16. Un procedimiento para determinar la presencia de una alteración de HER2 en un carcinoma micropapilar, que comprende determinar la presencia de una alteración de HER2 en una muestra del carcinoma micropapilar de un sujeto, donde la alteración de HER2 comprende una sustitución en el residuo 310 de HER2 o una sustitución en residuo 157 de HER2; y donde el procedimiento comprende además uno o más de:
(1) en respuesta a la determinación de la presencia de la alteración de HER2, el sujeto se clasifica como candidato para recibir tratamiento con un agente que inhibe HER2;
(2) en respuesta a la determinación de la presencia de la alteración de HER2, se identifica que el sujeto tiene probabilidades de responder a un tratamiento con un agente que inhibe HER2; o
(3) En respuesta a la determinación de que la muestra no contiene la alteración de HER2, se determina que el sujeto no es candidato para recibir un agente que inhiba HER2.
17. El procedimiento según la reivindicación 16, donde la alteración comprende una sustitución de una serina en el residuo 310 de HER2 por fenilalanina o tirosina.
18. El procedimiento según la reivindicación 16, donde la alteración comprende una sustitución de una arginina en el residuo 157 de HER2 por triptófano.
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