JP4990621B2 - Ｒｎａプロセシングタンパク質複合体及びその使用 - Google Patents

Ｒｎａプロセシングタンパク質複合体及びその使用 Download PDF

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Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2003年7月2日に出願された米国仮出願第60/484,615号に与えられた利益を主張するものであり、この出願の全内容が本明細書に参照によりそのまま全て組み入れられる。
【０００２】
1. 序
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつヒトタンパク質複合体を提供する。特に、この発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつヒトタンパク質複合体を提供する。この発明はまた、ヒトSen2のスプライス変異体、すなわちヒトSen2ΔEx8、及びヒトSen2ΔEx8を含むヒトタンパク質複合体を提供する。ヒトSen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。この発明はまた、プレ−リボソームRNA切断活性をもつヒトタンパク質複合体を提供する。この発明はまた、本明細書に記載の複合体又はその構成成分に免疫特異的に結合する抗体、並びに、そのような抗体を利用して疾患を診断、予防、治療、管理又は軽減する方法を提供する。この発明はまた、本明細書に記載の複合体を、とりわけスクリーニング、診断及び治療に使用する方法を提供する。この発明はさらに、上記の複合体を製造し精製する方法を提供する。この発明はさらに、本明細書に記載の複合体の構成成分の発現をモジュレートする化合物を同定する方法、本明細書に記載の複合体の形成又は明細書に記載の複合体の活性、並びに、上記方法にしたがって同定された化合物を使用して、増殖性疾患などの疾患又はその症状を予防、治療、管理又は軽減する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
2.1 tRNA作成
真核細胞内におけるtRNAの成熟及び維持には、５’末端及び３’末端のトリミング、特定の塩基の改変及び場合によってはイントロンの除去を含む幾つかのプロセシング事象が必要となる。プロセッシングにおけるこれらの様々なステップのための酵素は、酵母系、古細菌系、哺乳類系及び細菌系において特徴付けられてきた(Deutscher, M. P. tRNA Processing Nucleases, in tRNA: Structure, Biosynthesis and Function, D. Soll 及び U. RjaBhandary (eds.), American Society for Microbiology, Washington DC, (1995), pp. 51-65)。５’末端のトリミングにはRNアーゼPの活性が必要であり、３’末端のトリミングには様々なエンド-及びエクソ-ヌクレアーゼの機能が必要となる。改変は、tRNAと様々な改変酵素との相互作用を通じて生じる。大部分のtRNAには、多くの広範囲で種特異的な改変が含まれる(Bjork, G. Biosynthesis and Function of Modified Nucleosides, in tRNA : Structure, Biosynthesis and Function, D. Soll 及び U. RajBhandary (eds. ), American Society for Microbiology, Washington DC, (1995), pp. 165-205)。古細菌及び真核生物においては、tRNAのイソアクセプター群の幾つかは14ヌクレオチドから105ヌクレオチドにわたる大きさの介在配列を含む
(Trotta, C. R. 及び Abelson, J. N. tRNA Splicing: An RNA World Add-On or an Ancient Reaction? In RNA World II, Tom Cech, Ray Gestel及びJohn Atkins (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) 及び Abelson et al. , 1998, Journal of Biological Chemistry 273: 12685-12688)。イントロンの除去には、3つの酵素の活性が必要である。最初のステップにおいては、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが５’ 及び３’接合部位でtRNAを認識し、切断する。古細菌及び真核生物のtRNAエンドヌクレアーゼは進化的に保存された酵素であり、５’ 及び３’スプライス部位における切断を達成するために１つの類似した活性部位を含む。しかし、これらの酵素はtRNA基質を異なった方法で認識するように分岐してきた。古細菌の酵素は、バルジ-ヘリックス-バルジとして知られる保存されたイントロンの構造を認識する。この構造は、4ヌクレオチドのへリックスで隔てられた2つの3ヌクレオチドのバルジを含む。切断は、各バルジの内部で起こり、イントロンを放出する。真核生物のエンドヌクレアーゼは成熟ドメインから５’ 及び３’スプライス部位までの1セットの距離を測る、成熟ドメインに依存する方法でtRNA基質を認識する(Reyes et al., 1988, Cell 55: 719-730)。しかし最近、真核生物の酵素が各々のスプライス部位に１つのバルジを必要とし、この酵素は実際に、古細菌のエンドヌクレアーゼの機構と同一のイントロン依存型認識機構によってtRNAを認識する能力を保持しているということが実証された(Fruscoloni et al. , 2001, EMBO Rep 2:217-221)。tRNAの半分の分子は、切断されるとすぐに、特異なtRNAスプライシングリガーゼの作用で結合する(Trotta, C. R. 及び Abelson, J. N. tRNA Splicing: An RNA World Add-On or an Ancient Reaction? In RNA WorldII, Tom Cech, Ray Gestel及びJohn Atkins (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) 及び Abelson et al., 1998, Journal of Biological Chemistry 273:12685-12688)。酵母では、ライゲーション産物はスプライス部位にリン酸をもつtRNAである。tRNA２’- ホスホトランスフェラーゼがリン酸の除去を行い、成熟tRNA産物を生成する(Trotta, C. R. 及び Abelson, J. N. tRNA Splicing: An RNA World Add-On or an Ancient Reaction? In RNA WorldII, Tom Cech, Ray Gestel及びJohn Atkins (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) 及び Abelson et al., 1998, Journal of Biological Chemistry 273: 12685-12688)。
【０００４】
tRNAは、翻訳機構において重要な構成成分であり、様々な他のタンパク質に基づく構成成分（伸張因子、アミノ-アシルシンセターゼ等）と比較して非常に安定である。tRNA分子の半減期は非常に長い。さらに、rRNAやリボソームと同様に、tRNAは活発に成長している細胞の細胞質内に過剰に存在する(Ikemura, T. 及び Okeki, H. , 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 1087-1097)。こうして、tRNA分子の特異的ターゲティングは無制限な細胞増殖を選択的に阻害し、細胞の成長を抑制することができる。
【０００５】
2.2 プレ- mRNA切断
真核生物のmRNA前駆体（プレ-ｍRNA）が細胞質に輸送される前に幾つかのプロセシングステップが必要となる。プレ-ｍRNAプロセシングは５’末端のキャッピング、スプライシング、エンドヌクレアーゼ的切断及びポリアデニル化による新たな３’末端の生成を含む。プレ-ｍRNAの転写、キャッピング、スプライシング及び３’末端のプロセシングはin vivoにおける連成プロセスである(Barabino 及び Kelly, 1999, Cell, 99,9-11 ; Minvielle-Sebastia 及び Keller, 1999, Curr.Opin. Cell Biol., 11,352-357 ; Zhoa et al. , 1999, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63,405-445 ; Hirose 及び Manley, 2000, Genes Dev., 14,1415-1429; 及び Proudfoot, 2000, Trends Biochem. Sci., 25,290-293において概説)。
【０００６】
プレ-ｍRNAの３’末端は2段階の反応で生成する。まずプレ-ｍRNAがエンドヌクレアーゼ的に切断され、次に上流の切断断片がポリアデニル化し、下流の切断産物が続いて分解する。In vitroにおける哺乳類の３末端プロセシングの再構成には、6つのトランス作用因子、すなわちCPSF、CstF、CFIm、 CFIIm、PAP、PABP2が必要となる(Wahle 及び Ruegsegger, 1999, FEMS Micro Rev., 23,277-295 ; 及び Zhoa et al., 1999, Micoboil. Mol.Biol. Rev., 63,405-445において概説)。切断―ポリアデニル化特異性因子（CPSF）並びに切断刺激因子（CstF）は各々、切断部位の上流にあるヘキサヌクレオチドAAUAAA及び切断部位の下流にあるG/Uリッチな配列エレメントを各々認識する。さらに、切断複合体は切断因子Im（CFIm）及びIIm（CFIIm）並びにポリ(A)ポリメラーゼ（PAP）を含む。第一の段階の後、CstF、CFIm並びにCFIImは下流切断断片と共に放出される。CPSFは 依然として上流切断産物に結合したままであり、PAPをRNAに結合する。PAPは、プロセシング反応においてポリ(A)テールの付加に関与する酵素であり、反応にはCPSF及びポリ(A)結合タンパク質II（PABP2）もまた必要となる。
【０００７】
2.3 癌及び腫瘍性疾患
癌は米国において死因の第2位である。American Cancer Societyは、2001年には癌の新患が1300万人おり、癌が55万人の死亡原因となると予測した。1990年代には、全体的な割合が年1％ずつ減少してきた。癌を発症したことがあるアメリカ人は900万人生存している。NIHは癌の直接医療費を600億ドルと見積もっている。
【０００８】
現在、患者の腫瘍細胞を根絶するための癌治療には外科手術、化学療法及び/又は放射線療法が含まれる（例えば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein 及び Federman,eds., Chapter 12, Section IVを参照）。これらの全ての方法は、患者に著しい不利益をもたらす。例えば外科手術は、患者の健康状態に因っては禁忌となり、又は患者が受け入れられないということがあり得る。さらに、外科手術では腫瘍組織を完全には除去し得ない場合がある。放射線治療では、放射線を照射された腫瘍細胞が、正常組織と比べて放射線への高い感受性を示した場合にのみ効果があり、また放射線治療は頻繁に深刻な副作用を引き起こし得る(上記)。 化学療法に関して、腫瘍疾患の治療のため、様々な化学療法薬が入手可能である。しかし、様々な化学療法薬が入手可能であるにも関わらず、従来の化学療法には多くの欠点があった（例えば、Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer PatientManagement"in Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein 及び Federman, eds., ch. 12, sect. 10を参照）。ほぼ全ての化学療法薬が有毒であり、化学療法はひどい吐き気、骨髄抑制、免疫抑制等を含む、著しく、また多くの場合危険な副作用を引き起こし得る。さらに、多くの腫瘍細胞は、多剤耐性を通じて化学療法薬耐性となり又は化学療法薬耐性を発達させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本技術分野においては、新規な化合物及び組成物並びに、前述の副作用を減少させ、もしくは伴うことなく癌又は腫瘍疾患を治療するために役立つ方法に対する、重大な必要性がある。さらに癌治療には、特異性を高め、毒性を低下させた癌細胞特異的な治療法が必要である。
【００１０】
本明細書におけるいずれの参考文献の引用も、その先行技術としての利用可能性を認めたものであると解釈してはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
3. 発明の概要
本発明は、RNAのプロセシングに関わる複合体を提供する。特に、本発明はプレ-tRNAスプライシング、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性に関わるRNA-核酸分解活性をもつ複合体を提供する。さらに具体的には、本発明は、RNA核酸分解活性をもつ精製された複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iv)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を、2つ以上又は任意の組み合わせとして含む、上記複合体を提供する。
【００１２】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iv)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。他の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１３】
特定の実施形態においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20(配列番号2))、又は、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265，図20(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197, 図22(配列番号4))、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22(配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23 (配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23 (配列番号5)) 、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv) Sen54(受託番号XP_208944，図24 (配列番号8)) 、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24 (配列番号7)) 、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-ｍRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１４】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(v) ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１５】
特定の実施形態においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2))、又は、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265，図20(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 (配列番号4)) 、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3)) 、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23 (配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23 (配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) Sen54(受託番号XP_208944，図24 (配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(v) ヒトClp1(受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))、又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25(配列番号9))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１６】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(v) ヒトClp1(受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vi)、ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子(「CPSF」) 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vii)ヒト切断因子Im(「CFIm」)又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(viii) ヒト切断因子IIm (「CFIIm」)又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(ix)ヒト切断刺激因子(「CSF」) 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１７】
１つの実施形態においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20(配列番号2))、又は、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265，図20(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 (配列番号4))、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23 (、配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23 (配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトClp1(受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))、又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25 (配列番号9))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi)ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子(「CPSF」) 又は、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vii)ヒト切断因子Im(「CFIm」) 又は、ヒトCFIm をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(viii) ヒト切断因子IIm (「CFIIm」)、又は、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ix)ヒト切断刺激因子(「CSF」)、又は、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１８】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、 (iv)ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(v)ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vi)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(viii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の、さらに特定の実施形態においては、上記複合体はPAP（ポリ(A)ポリメラーゼ）及びSmタンパク質（核内低分子リボ核タンパク質）を含まない。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。この実施形態によれば、上記複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００１９】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトCPSF160、又は、ヒトCPSF160をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトCPSF30、又は、ヒトCPSF30をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトCstF64、又は、ヒトCstF64をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトシンプレキン、又は、ヒトシンプレキンをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトSen2、又は、ヒトSen2をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi)ヒトSen15、又は、ヒトSen15をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vii)ヒトSen34、又は、ヒトSen34をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(viii) ヒトSen54、又は、ヒトSen54をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。特定の、さらに特定の実施形態においては、上記複合体はPAP（ポリ(A)ポリメラーゼ）及びSmタンパク質（核内低分子リボ核タンパク質）を含まない。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。この実施形態によれば、上記複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００２０】
本発明は、ヒトSen2のスプライス変異体、すなわちヒトSen2ΔEx8を提供する。特に本発明は、ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体をコードする核酸配列、及びヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体をコードするアミノ酸配列を提供する。特定の実施形態においては、本発明はストリンジェントな条件下で、Sen2ΔEx8をコードする核酸配列の全長にわたってヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を提供する。好ましくは、このような核酸配列はSen2ΔEx8活性（例えばClp1及びSen54と複合体を形成する能力）を有するタンパク質をコードする。別の実施形態においては、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を提供する。ここで、上記タンパク質はSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2))とは異なり、好ましくは、このタンパク質はSen2ΔEx8活性を有する。別の実施形態においては、本発明は配列番号11の核酸配列を含む核酸配列を提供する。本発明はさらに、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列を含むベクター及びそのベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列を含む宿主細胞をさらに提供する。
【００２１】
本発明は、精製したタンパク質を提供する。ここで、上記タンパク質は、本質的に配列番号12のアミノ酸配列又は配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列からなる。本発明はさらに、ヒトSen2ΔEx8と免疫特異的に結合するが、Sen2とは結合しない抗体又はその断片を提供する。特に本発明は、Sen2タンパク質からエクソン8を除去することによって作出したSen2ΔEx8のユニーク領域と免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
【００２２】
本発明は、ヒトSen2ΔEx8を含む精製したタンパク質複合体を提供する。特に、本発明は、精製したタンパク質複合体であって、上記複合体がヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片及並びに、(i)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を1つ以上、又は任意の組合せとして含む、精製したタンパク質複合体を提供する。
【００２３】
上記Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解ヌクレオチド活性を有する。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8複合体はプレ- tRNA切断活性及び/又は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。本発明は、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体及び、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。本発明はまた、ヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iv)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、ヒトSen2ΔEx8複合体をも提供する。特定の実施形態においては、上記複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記複合体はtRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。特定の実施形態においては、上記複合体は３’末端mRNAプロセシング活性を有する。これらのヒトSen2ΔEx8複合体はtRNAを複数の部位で切断し、RNA構造のマッピング及び３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼプロセシングに役立つ。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度及び精度は、全長のSen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。
【００２４】
特定の実施形態においては、本発明は、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、その機能的に活性のある断片、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 (配列番号4))、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。別の実施形態においては、本発明は、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、その機能的に活性のある断片、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 ( (配列番号4))、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23(配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23 (配列番号5))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv) ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24 (配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24 (配列番号7))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。
【００２５】
特定の実施形態においては、本発明は(i) ヒトSen2ΔEx8、及び(ii) ヒトSen34を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は(i) ヒトSen2ΔEx8、(ii) ヒトSen15及び (iii) ヒトSen34を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は(i) ヒトSen2ΔEx8及び(ii) ヒトSen54を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。
【００２６】
これらの実施形態によれば、ヒトSen2ΔEx8複合体はRNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、ヒトSen2ΔEx8複合体はtRNAを複数の部位で切断する。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、RNA構造のマッピング及び３’エンドヌクレアーゼプロセシングに役立つ。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性が有する忠実度及び精度は、全長Sen2含有複合体が有するtRNA切断活性と比較して低下している。
【００２７】
特定の実施形態においては、本発明は精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、(i) ヒトSen2ΔEx8、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ii) ヒトSen34、又は、ヒトSen34をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、(i) ヒトSen2ΔEx8、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15、又は、ヒトSen15をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iii) ヒトSen34、又は、ヒトSen34をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、(i) ヒトSen2ΔEx8、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ii) ヒトSen54、又は、ヒトSen54をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。
【００２８】
本発明は、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(v)ヒトClp1(受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記複合体は、(i)ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片をさらに含んでもよい。本発明はまた、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(v)ヒトClp1(受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vi)ヒトCSPF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vii)ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(viii)ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(ix)ヒトCstF 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。
【００２９】
特定の実施形態においては、本発明は、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24 (配列番号7))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 (配列番号4) ))、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23 (配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23 (配列番号5))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(v) ヒトClp1 (受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25(配列番号9))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。
【００３０】
特定の実施形態においては、上記複合体は(i) ヒトCPSF160、又は、ヒトCPSF160をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトCPSF30、又は、ヒトCPSF30をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトCstF64、又は、ヒトCstF64をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv) ヒトシンプレキン、又は、ヒトシンプレキンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質をさらに含んでもよい。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24 (配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24 (配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 (配列番号4))又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23 (配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23 (配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトClp1 (受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25 (配列番号9))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi) ヒトCPSF、又は、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vii) ヒトCFIm、又は、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(viii) ヒトCFIIm、又は、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ix) ヒトCSF、又は、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。 本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iii)ヒトClp1(受託番号NP_006822，図25(配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含み、任意に(i)ヒトCPSF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iv)ヒトCstF 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を１つ以上又は任意の組合せとして含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態において、本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24 (配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iii)ヒトClp1 (受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))、又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25 (配列番号9))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記複合体は、(i) ヒトCPSF160、又は、ヒトCPSF160をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトCPSF30、又は、ヒトCPSF30をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトCstF64、又は、ヒトCstF64をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv) ヒトシンプレキン、又は、ヒトシンプレキンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質をさらに含んでもよい。別の実施形態においては、本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号1１)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24 (配列番号8))、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24 (配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトClp1 (受託番号NP_006822，図25 (配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25 (配列番号9))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトCPSF、又は、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトCFIm、又は、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi) ヒトCFIIm、又は、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(vii) ヒトCstF、又は、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。
【００３２】
本発明はまた、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体を提供する。特に、本発明は、(i)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(ii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体を提供する。さらに具体的には、本発明は、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22 (配列番号4))、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965，図22 (配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ii) ヒトSen34(受託番号NP_076980，図23(配列番号6))、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。このタンパク質複合体を異なったリボソームRNAの生合成に用いてもよい。例えば、28S、18S、5.5S及び5SリボソームRNAの生成は、このタンパク質複合体の調節によって変化し得る。
【００３３】
特定の実施形態においては、本発明の複合体の、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つのタンパク質成分が、例えば融合タンパク質として、互いに共有結合する。特定の他の実施形態においては、本発明の複合体は、互いに非共有結合した、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つのタンパク質成分を含む。さらに別の実施形態においては、本発明の複合体は、共有結合したタンパク質成分と非共有結合したタンパク質成分との1つの組合せとを含む。特定の他の実施形態においては、本発明の複合体のタンパク質成分は、異種アミノ酸配列、すなわち、上記タンパク質と異なるアミノ酸配列と融合する。さらに、本発明の複合体は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも2つの、機能的に活性な上記複合体のタンパク質成分の断片を含んでもよい。本発明の複合体は、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は少なくとも5つの、機能的に活性な上記複合体のタンパク質成分の断片を含んでもよい。本発明の複合体は、上記複合体のタンパク質成分の機能的に活性な誘導体を、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ又は少なくとも3つ、少なくとも4つ又は少なくとも5つ含んでもよい。1つの実施形態においては、このように機能的に活性な誘導体は融合タンパク質である。この実施形態によれば、このような融合タンパク質は、異種配列、すなわち、上記タンパク質成分のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３４】
本発明は、複合体を精製する方法を提供する。特に、本発明は、複合体を精製する方法であって、上記方法が、細胞から細胞抽出物又は核抽出物を調製する工程であって、ここで上記細胞は上記複合体のすべてのタンパク質成分を発現し、上記タンパク質成分の少なくとも1つがペプチドタグと融合されている工程、及び上記ペプチドタグによって上記複合体を精製する工程を含む、上記方法を提供する。
【００３５】
本発明は、本発明の複合体と免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載の免疫測定法において、上記複合体の個々のタンパク質成分のいずれかに対するよりも高い親和性で本発明の複合体に免疫特異的に結合する、抗体又はその断片を提供する。別の実施形態においては、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載の免疫測定法において、本発明の複合体に免疫特異的に結合するが、上記複合体の個々のタンパク質成分のいずれかに対しては結合しない抗体又はその断片を提供する。本発明はまた、複合体で被験者を免疫することを含む、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片の作製方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、下記の複合体のタンパク質成分の1つに免疫特異的に結合する抗体又はその断片であって、上記抗体又はその断片が、(i) ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii) ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii) ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv) ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(v) ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、の1つに免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。上記抗体又はその断片は未知のものであることが好ましい。本発明はまた、タンパク質成分で被験者を免疫することを含む、本発明の複合体のタンパク質成分の1つに免疫特異的に結合する抗体又はその断片の作製方法を提供する。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載の免疫測定法において、ヒトSen2に対する親和性よりも高い親和性でヒトSen2ΔEx8に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。別の実施形態においては、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載の免疫測定法において、ヒトSen2ΔEx8には免疫特異的に結合するが、ヒトSen2に対しては結合しない抗体又はその断片を提供する。
【００３８】
本発明は、1つ以上の下記の複合体のタンパク質成分の発現（RNAレベル及び/又タンパク質レベル）をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、(i) ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii) ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii) ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv) ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は(v) ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片の1つ以上の発現をモジュレートする化合物を同定する、上記方法を提供する。タンパク質の発現を測定する技法は当業者に周知であり、例えば、タンパク質発現レベルにおいては免疫測定法、RNA発現レベルにおいてはRT-PCR法又はノーザンブロット法を含む。
【００３９】
本発明は、複合体の形成をモジュレートする化合物を同定するスクリーニングアッセイを提供する。特に、本発明は、複合体の形成をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、細胞を化合物と接触させる工程であって、ここで、上記細胞は上記複合体のすべてのタンパク質成分を含む工程、及び上記細胞内で形成された複合体の量を測定する工程を含む、上記方法を提供する。上記方法は、上記細胞から複合体を単離することをさらに含んでもよい。複合体の量は、複合体の形成を測定するための当業者に周知ないずれかの方法によって、又は本明細書に記載のいずれかの方法（例えばFRETといった方法）によって測定し得る。特定の実施形態において、本発明は複合体の形成をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、上記複合体のすべてのタンパク質成分を含む細胞と化合物とを接触させる工程であって、ここで、上記細胞が、1つ、2つ、3つ、4つ又はそれ以上の複合体タンパク質成分を発現するように操作されている工程、及び上記細胞内で形成された複合体の量を測定する工程を含む、上記方法を提供する。この実施形態によれば、上記細胞はいずれかの非ヒト細胞又は上記複合体の1つ以上の成分を欠損したヒト細胞であってよい。
【００４０】
本発明は、複合体の形成をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、(a)タンパク質を含む複合体の形成に導く条件下、化合物の存在下で、複合体のタンパク質成分をインキュベートするステップ、及び(b)上記複合体の量を測定するステップであって、ここでステップ(b)において、上記化合物の不在下又は適当な対照（例えば、リン酸緩衝生理食塩水といった陰性対照）の存在下もしくは所定の参照範囲で測定される上記複合体の量の差は、上記化合物が上記複合体の形成をモジュレートすることを示す、上記ステップを含む、上記方法を提供する。複合体形成を測定する技法は、当技術分野において周知又は本明細書に記載されている。
【００４１】
本発明は、複合体のエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又はヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するための、細胞を使用したアッセイ及び無細胞アッセイを提供する。1つの実施形態においては、本発明は、複合体のエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、(a)化合物又は化合物のライブラリーのメンバーと、上記ヒト複合体のタンパク質成分及び上記複合体の基質を含む又はこれらを含むように操作された細胞とを接触させる工程、ならびに(b) 基質の減少又はエンドヌクレアーゼ反応の反応産物の増加のいずれかを測定することによってエンドヌクレアーゼ活性のレベルを検出する工程を含む、上記方法を提供する。別の実施形態においては、発明は、複合体のエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が(a)複合体を、エンドヌクレアーゼ基質及び化合物又は化合物のライブラリーのメンバーと共にインキュベートする工程、ならびに(b) 基質の減少又はエンドヌクレアーゼ反応の反応産物の増加のいずれかを測定することによってエンドヌクレアーゼ活性のレベルを検出する工程を含む、上記方法を提供する。
【００４２】
特定の実施形態においては、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、1つのtRNAイントロンを含むレポーター遺伝子の転写及び翻訳を行うことが可能な条件下（例えば、無細胞又は細胞を使用したアッセイ）で、化合物又は化合物ライブラリーのメンバーと、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及びレポーター遺伝子を含む核酸（例えば、RNA又はDNA）をもつ複合体とを接触させる工程、ならびに当該レポーター遺伝子の発現（すなわち、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性から生じたプロセシングされたレポーター遺伝子mRNAの産出、レポーター遺伝子のタンパク質産物及び/又はレポーター遺伝子産物の活性）を検出する工程を含む、上記方法を提供する。ここで、上記化合物の存在下における当該レポーター遺伝子の発現が、当該化合物の不在下又は適当な対照の存在下又は所定の参照範囲で当該レポーター遺伝子の発現と比較して変化すると、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される。レポーター遺伝子に基づいたアッセイにおける、あらかじめ決定した参照範囲、又は上記化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、陰性対照）の存在下における発現と比較したレポーター遺伝子の発現の減少は、特定の化合物が、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性（例えば、tRNAイントロンの認識又は切断）を低下させ又は阻害したことを示す。一方、レポーター遺伝子に基づいたアッセイにおける、あらかじめ決定した参照範囲、又は上記化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、陰性対照）の存在下における発現と比較したレポーター遺伝子の発現の増加は、特定の化合物がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を高めたことを示す。特定の実施形態において、TNT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systemsをその方法に従って使用する(Promega, Madison WI)。他の特定の実施形態においては、上記レポーター遺伝子の転写及び翻訳に必要とされる因子を提供するために細胞抽出物が用いられる。さらに別の特定の実施形態においては、化合物及び上記tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼを細胞に導入する（例えば、好ましくは異種プロモーターの調節下で、上記複合体のタンパク質成分をコードする核酸を用いて細胞を形質転換する）。本発明のこの実施形態によれば、複合体の組換タンパク質成分は、単独に又は融合複合体として、上記細胞中で発現し得る。好適な実施形態においては、ヒトタンパク質複合体は非ヒト細胞中に導入され、又は非ヒト細胞中で発現する。
【００４３】
本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、当該方法が（a）細胞中でtRNAイントロンを含むレポーター遺伝子を含む核酸を発現する工程、（b）当該細胞を化合物又は化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程、及び（c）当該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下における当該レポーター遺伝子の発現が、あらかじめ決定した参照範囲、又は上記化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、陰性対照）の存在下における当該レポーター遺伝子の発現と比較して変化すると、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法をさらに提供する。特に、対照と比較してレポーター遺伝子の発現が増加することは、当該化合物がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大させたことを示す。一方、対照と比較してレポーター遺伝子の発現が減少することは、上記化合物がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低下させたことを示す。
【００４４】
別の実施形態においては、本発明はヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、当該方法が、（a）化合物ライブラリーのメンバーと、tRNAイントロンを有するレポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞とを接触させる工程、及び（b）当該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下における当該レポーター遺伝子の発現が、あらかじめ決定した参照範囲、又は上記化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、陰性対照）の存在下における当該レポーター遺伝子の発現と比較して変化すると、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法をさらに提供する。特に、対照と比較してレポーター遺伝子の発現が増加することは、当該化合物がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大させたことを示す。一方、対照と比較してレポーター遺伝子の発現が減少することは、上記化合物がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低下させたことを示す。
【００４５】
別の実施形態においては、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ本発明の複合体と、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質及び化合物もしくは化合物ライブラリーのメンバーとを接触させる工程であって、ここで上記基質は５’末端が発蛍光団で標識され、３’末端が消光剤で標識される、又は５’末端が消光剤で標識され、３’末端が発蛍光団で標識される工程、ならびに蛍光の変化を測定することによってtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、上記化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の不存在下及び適当な対照の存在下におけるシグナルと比較して変化すると、tRNAスプライシング活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法を提供する。無細胞抽出液中のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは上記基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生じる。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害し又は低下させる化合物は、上記基質の切断を阻害し又は低下させ、これによって、陰性対照（例えばPBS）と比較した検出可能な蛍光シグナルの発生を阻害又は低下させる。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、上記基質の切断を高め、これによって陰性対照（例えばPBS）と比較した検出可能な蛍光シグナルの発生を増大させる。
【００４６】
別の実施形態においては、本発明はヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ本発明の複合体と、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質及び化合物もしくは化合物ライブラリーのメンバーとを接触させる工程であって、ここで当該基質は５’末端が蛍光供与体部分で標識され、３’末端が蛍光受容体部分で標識されている、又は上記基質の５’末端が蛍光受容体部分で標識され、３’末端が蛍光供与体部分で標識されている工程、ならびにtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、化合物の存在下において、蛍光供与体部分の波長での蛍光受容体部分の蛍光放射が、上記化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下、又はあらかじめ決定した参照範囲と比較して変化すると、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法を提供する。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは上記基質を切断し、その結果、蛍光供与体部分の波長での蛍光供与体部分及び蛍光受容体部分によって、蛍光放射を低下させる。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害又は低下させる化合物は、上記基質の切断を阻害し又は低下させ、これによって蛍光供与体部分の波長での蛍光受容体部分の蛍光放射を増大させる。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を高める化合物は、上記基質の切断を高めることによって、蛍光供与体部分の波長での蛍光受容体部分の蛍光放射を低減する。
【００４７】
別の実施形態においては、本発明はヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、化合物又は化合物のライブラリーのメンバーと、ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端切断レポーター遺伝子を含む核酸をもつ本発明の複合体とを接触させる工程であって、ここで、レポーター遺伝子の転写及び翻訳が行われ得る条件下（例えば、無細胞アッセイ又は細胞を使用したアッセイ）でレポーター遺伝子が切断部位の３’に位置している工程、並びに当該レポーター遺伝子の発現（すなわち、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性によってレポーター遺伝子の５’が切断されることから生じたプロセスmRNAの生成、レポーター遺伝子産物の量又はレポーター遺伝子産物の活性）を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下における当該レポーター遺伝子の発現が、当該化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下における当該レポーター遺伝子の発現、又はあらかじめ決定した参照範囲と比較して変化すると、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法を提供する。この実施形態によれば、上記レポーター遺伝子の発現に必要とされる全ての因子もまた提供される。特定の実施形態において、TNT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systemsを使用する(Promega, Madison WI)。他の特定の実施形態において、上記レポーター遺伝子の転写及び翻訳に必要な因子を提供するために、細胞抽出物を使用する。さらに他の特定の実施形態においては、上記複合体及び上記３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を細胞に導入する。特に、レポーター遺伝子に基づくアッセイにおいて、あらかじめ決定した参照範囲と比較した、又は上記化合物の不存在下もしくは適当な対照（例えば、陰性対照）の存在下における発現と比較してレポーター遺伝子の発現が増加すると、特定の化合物が３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性（例えば、基質の認識又は切断）を低下させ又は阻害していることを示す。一方、レポーター遺伝子に基づくアッセイにおいて、あらかじめ決定した参照範囲と比較した、又は上記化合物の不存在下もしくは適当な対照（例えば、陰性対照）の存在下の発現と比較したレポーター遺伝子の発現の減少は、特定の化合物が３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を増大させていることを示す。
【００４８】
別の実施形態において、本発明はヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害し又は低下させる化合物を同定する方法であって、上記方法が、ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ本発明の複合体と、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質及び化合物又は化合物ライブラリーのメンバーとを接触させる工程であって、ここで上記基質は５’末端が発蛍光団で標識され、３’末端が消光剤で標識される、又は上記基質の５’末端が消光剤で標識され、３’末端が発蛍光団で標識される工程、並びに３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、上記化合物の不存在下もしくは適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下又はあらかじめ決定した参照範囲と比較して、上記化合物の存在下で蛍光シグナルが変化すると、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法を提供する。ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害し又は低下させる化合物は、上記基質の切断を阻害し又は低下させ、これによって対照と比較して検出可能な蛍光シグナルの発生を低下させる。ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を高める化合物は、上記基質の切断も高め、これによって対照と比較して検出可能な蛍光シグナルの発生を増大させる。
【００４９】
別の実施形態においては、本発明はヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害し又は低下させる化合物を同定する方法であって、上記方法が、ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ本発明の複合体と、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質及び化合物又は化合物ライブラリーのメンバーとを接触させる工程であって、ここで当該基質は５’末端が蛍光供与体部分で標識され、３’末端が蛍光受容体部分で標識されている、又は上記基質の５’末端が蛍光受容体部分で標識され、３’末端が蛍光供与体部分で標識されている工程、並びに３’ mRNAエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、化合物の存在下における、蛍光供与体部分の波長での蛍光受容体部分の蛍光放射が、上記化合物の不在下もしくは適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下、又はあらかじめ決定した参照範囲と比較して変化すると、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される工程を含む、上記方法を提供する。ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害し又は低下させる化合物は、上記基質の切断を阻害し又は低下させ、これによって対照と比較して蛍光供与体部分の波長での蛍光受容体部分の蛍光放射を増大させる。ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を高める化合物は、上記基質の切断を高めることによって、蛍光供与体部分の波長での蛍光受容体部分の蛍光放射を低下させる。
【００５０】
特定の実施形態においては、３’末端プレ-mRNAプロセシングに対する化合物の作用、例えばGAPDH及びEFIAといった任意の発現遺伝子の改変を測定するため、RT-PCRを使用することができるが、5.2節に記載したような定量的RT-PCRアッセイに限定されるものではない。
【００５１】
本発明は、複合体のプレ- tRNA切断活性及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法をさらに提供する。化合物が複合体のプレ- tRNA切断活性及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする能力を測定するために、当業者に周知又は本明細書に記載の技法を使用してもよい。例えば、化合物が複合体のプレ- tRNA切断活性をモジュレートする能力は、化合物の存在下でtRNAからtRNA断片が生成されるレベルと、上記化合物の不在下又は適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下で同じtRNAからtRNA断片が生成されるレベルとを比較することによって測定することができる。ここで、上記レベルの変化は、上記化合物が複合体のプレ- tRNA切断活性をモジュレートしたことを示す。化合物が複合体のプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする能力は、例えば化合物の存在下で、プレ-リボソームRNAから特定のリボソームRNA（例えば、28S、18S、5.8S及び/又は5S）が生成されるレベルと、上記化合物の不在下又は適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下で同じプレ-リボソームRNAから上記リボソームRNAが生成されるレベルとを比較することによって測定することができる。ここで、上記レベルの変化は、上記化合物が複合体のプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートしたことを示す。ここで、上記レベルの変化は、上記化合物が複合体のプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートしたことを示す。特定の実施形態においては、複合体のプレ- tRNA切断活性及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法は、細胞を使用したアッセイである。他の実施形態においては、複合体のプレ- tRNA切断活性及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法は、無細胞アッセイである。
【００５２】
本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）をモジュレートする、本明細書に記載のアッセイで同定される化合物については、in vitroアッセイ（例えば、細胞を使用したアッセイもしくは無細胞アッセイ）及び/又は当業者に周知もしくは本明細書に記載のin vivoアッセイにおいて、本明細書に記載の疾患（例えば増殖性疾患もしくは異常なRNA核酸分解活性に特徴づけられ、関連し、もしくは起因する疾患）又は特定の疾患をもつ患者から取得した細胞に対する上記化合物の作用を試験してもよい。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を抑制し又は低下させる、本明細書に記載のアッセイで同定される化合物については、in vitroアッセイ（例えば、細胞を使用したアッセイもしくは無細胞アッセイ）及び/又は当業者に周知もしくは本明細書に記載のin vivoアッセイにおいて、高増殖細胞対正常細胞に対する上記化合物の増殖抑制効果を試験してもよい。別の実施形態においては、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を抑制し又は低下させる、本明細書に記載のアッセイで同定される化合物については、癌を目的とした動物モデルにおいて、癌又はその症状の予防、治療もしくは軽減についての上記化合物の効果を測定する試験を行ってもよい。さらに別の実施形態において、本発明の複合体のタンパク質成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を高める、本明細書に記載のアッセイで同定される化合物について、創傷治癒に対する効果を試験してもよい。
【００５４】
特定の実施形態においては、異なる細胞コンテクスト及び/又は異なる生理的条件下における本発明の複合体又は本発明の複合体の成分の機能の評価に、本明細書に記載のアッセイで同定される化合物を使用することができる。例えば、種々の病理組織から取得した細胞と本発明のアッセイで同定される化合物とを接触させて、このような細胞中における複合体の機能を試験することができる。
【００５５】
さらに他の実施形態においては、本発明のアッセイで同定される化合物を、細胞中における組換タンパク質の発現をモジュレートすることに使用することができる。例えば、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの機能を増大させる化合物は、細胞中における組換タンパク質の発現を高めるために使用することができる。
【００５６】
本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体の核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）をモジュレートする、本明細書に記載のアッセイで同定される化合物の構造は、当業者に周知又は本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。使用する方法は、一つには、スクリーニングするライブラリーの性質によって決まる。例えば、各々アドレスと識別子を有する、化合物のアッセイ又はマイクロアレイは、例えば陽性試料と上記の個々のアッセイに用いた原化合物リストとを相互参照することによって簡略化（deconvoluted）してよい。あるいは、ここで同定された化合物の上記構造を、質量分析法、核磁気共鳴（NMR）、円偏光二色性、X線結晶解析又は振動分光法を用いて決定してもよい。
【００５７】
本発明は、増殖性疾患又はその症状、又は増大するRNA核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ- リボソームRNA切断活性）に特徴づけられ、関連し、もしくは起因する疾患又はその症状を治療、管理又は軽減するために、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を抑制又は低減する上記化合物の使用を包含する。本発明はまた、低下したRNA核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ- リボソームRNA切断活性）に特徴づけられ、関連し、もしくは起因する疾患又はその症状を治療、管理又は軽減するために、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を刺激し又は高める上記化合物の使用をも包含する。本発明はまた、患者の創傷治癒を促進するために、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体の核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を刺激し又は高める上記化合物の使用をも包含する。
【００５８】
本発明は、1つの担体及び下記の1つ又は下記の2つ以上の組合せを含む組成物であって、上記組成物が、（i）本発明の複合体の成分、（ii）本発明の複合体、（iii）本発明の複合体の成分もしくは本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、（iv）本発明の複合体の成分の発現をモジュレートする化合物、（v）本発明の複合体の形成をモジュレートする化合物、（vi）本発明の複合体のエンドヌクレアーゼ活性（例えば、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性）をモジュレートする化合物、（vii）本発明の複合体のプレ- tRNA切断活性をモジュレートする化合物、及び/又は（viii）本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物を含む、上記組成物を提供する。上記組成物は、1つ以上の他の予防薬又は治療薬をさらに含んでもよい。好適な実施形態においては、上記組成物は医薬組成物である。この実施形態によれば、上記医薬組成物は、好ましくは滅菌され、及び目的とする投与又は使用の方法に適した形態になっている。本発明は、本明細書に記載の疾患又はその症状の予防、治療、管理又は軽減における上記組成物の使用を包含する。
【００５９】
本発明はまた、本発明の複合体もしくはその成分に免疫特異的に結合する抗体、又は本発明の複合体もしくはその成分に免疫特異的に結合する、本発明の方法によって同定された化合物を用いて、増殖性疾患又は異常なプレ-tRNAプロセシング及び/もしくは３’末端プレ-mRNAプロセシングに関連し、特徴付けられもしくは起因する疾患を検出し、診断し又は監視する方法を提供する。本発明はまた、このような疾患を有する又はこのような疾患を有することが疑われる被験者の細胞又は組織サンプルから精製した複合体のRNA核酸分解活性と、例えば正常な、非癌性の細胞又は組織サンプルから精製した複合体といった対照のRNA核酸分解活性とを当業者に周知又は本明細書に記載のアッセイを用いて比較することによって、増殖性疾患又は異常なプレ-tRNAプロセシング及び/もしくは３’末端プレ-mRNAプロセシングに関連し、特徴付けられもしくは起因する疾患を検出し、診断し又は監視する方法を提供する。本発明は、被験者（例えば、このような疾患を有する又はこのような疾患を有することが疑われる被験者）の細胞又は組織サンプルから精製した本発明の複合体の構造と、例えば正常な、非癌性の細胞又は組織サンプルから精製した本発明の複合体といった対照の構造とを当業者に周知なアッセイ（例えば、円偏光二色性及び核磁気共鳴）を用いて比較することによって、増殖性疾患又は異常なプレ-tRNAプロセシング及び/もしくは３’末端プレ-mRNAプロセシングに関連し、特徴付けられもしくは起因する疾患を検出し、診断し又は監視する方法をさらに提供する。
【００６０】
本発明はまた、、細胞中で本発明の複合体の少なくとも1つの成分を発現させることを含む、細胞中のタンパク質の発現を改変する方法を提供する。さらに特定の実施形態においては、本発明の複合体の全ての成分及び/又は融合複合体は、組換DNA技術を用いて細胞中で発現する。上記複合体の成分又は複合体を、誘発性で、構成的もしくは組織特異的なプロモーター、例えば、複合体の成分又は複合体の過剰発現を支持するプロモーターを用いて発現させることができる。特定の実施形態においては、上記複合体の成分又は融合複合体は、変異して、野生型の成分又は複合体と比べて活性が高く又は低くなる（例えば、各々、より高いもしくはより低い複合体形成活性、又は、各々、より高いもしくはより低いRNA核酸分解活性を有する）。
【００６１】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の複合体は未成熟ストップコドンを有するmRNA分子又はプレ-mRNA分子の切断に用いられる。特定の、さらに特定の実施形態においては、複合体は未成熟ストップコドン部位もしくはその近傍の部位におけるmRNA分子又はプレ-mRNA分子の切断に用いられる。理論に拘束されずに、本発明の複合体は未成熟ストップコドン部位もしくはその近傍の部位におけるmRNA分子又はプレ-mRNA分子を切断する。特定の実施形態においては、上記複合体は、未成熟ストップコドンの500、400、300、200、100又は50ヌクレオチド内でmRNA分子又はプレ-mRNA分子を切断する。特定の実施形態においては、上記複合体は、未成熟ストップコドンの1から50、1から100、1から250、1から500、10から50、10から100、25から100、50から100、50から250、50から500、100から500、又は250から500ヌクレオチド内でmRNA分子又はプレ-mRNA分子を切断する。
【００６２】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の複合体は、mRNA分子又はプレmRNA分子内の未成熟ストップコドンの同定に用いられる。特定の実施形態においては、上記複合体は、未成熟ストップコドンの500、400、300、200、100又は50ヌクレオチド内でmRNA分子又はプレ-mRNA分子を切断する。特定の実施形態においては、上記複合体は、未成熟ストップコドンの1から50、1から100、1から250、1から500、10から50、10から100、25から100、50から100、50から250、50から500、100から500、又は250から500ヌクレオチド内でmRNA分子又はプレ-mRNA分子を切断する。
【００６３】
未成熟ストップコドンを同定するためには、本発明の複合体による目的のmRNA又はプレ- mRNAの切断に導く条件下で、mRNA又はプレ- mRNAを本発明の複合体と共にインキュベートする。切断が起こった時点で、上記切断産物を分析し、切断部位の位置を決定する。切断部位の位置は、これに限定するものではないが、ノーザンブロット解析といった当業者に知られているいずれの方法によっても決定できる。
【００６４】
特定の実施形態においては、本発明の複合体を、本発明の複合体による未成熟ストップコドンの切断のモジュレーターを同定するために使用することができる。特定の実施形態においては、本発明の複合体による目的のmRNA又はプレ- mRNAの切断に導く条件下、化合物の存在下で、上記複合体を、mRNA又はプレ- mRNAと共にインキュベートする。ここで、上記mRNA又はプレ- mRNAは、未成熟ストップコドンを有することが知られている。上記化合物が、生成する切断産物の量を増加させた場合、上記化合物は、本発明の複合体の未成熟ストップコドン切断活性の活性化剤として同定される。上記化合物が生成する切断産物の量を減少させた場合、上記化合物は、複合体の未成熟ストップコドン切断活性の阻害剤として同定される。
【００６５】
複合体の安定性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記方法が、（a）化合物の存在下、上記複合体の維持に導く条件下で、複合体をインキュベートする工程、及び（b）上記複合体の量を測定する工程であって、ここで、上記化合物の不在下で測定される上記複合体の量と比較して、工程（b）で測定される上記複合体の量の差は、上記化合物が複合体の安定性をモジュレートすることを示す工程、を含む上記方法。
【００６６】
本発明は、癌の治療もしくは予防、又はその症状の軽減のための治療薬を同定する方法であって、当該方法が、化合物ライブラリーのメンバーを細胞と接触させる工程、細胞内で形成された本発明の複合体の量を測定する工程であって、ここで、化合物が、当該化合物の不在下での上記複合体の量と比較して上記複合体の量を減少させた場合、上記化合物を癌細胞又は腫瘍細胞と接触させて、当該癌細胞又は腫瘍細胞の増殖を検出すると、上記化合物が癌細胞又は腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害する場合に、化合物は抗増殖化合物として同定される工程を含む、上記方法を提供する。本発明はさらに、癌の治療もしくは予防、又はその症状の軽減のための治療薬を同定する方法であって、当該方法が、化合物ライブラリーのメンバーを本発明の複合体及びレポーター遺伝子を含む1つの核酸と接触させる工程であって、ここで、レポーター遺伝子はtRNAイントロンを含み、遺伝子発現に必要とされる全ての因子が存在する工程、並びに当該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物が、当該化合物の不在下での上記レポーター遺伝子の発現と比較して上記レポーター遺伝子の発現を減少させた場合、上記化合物を癌細胞又は腫瘍細胞と接触させて、当該癌細胞又は腫瘍細胞の増殖を検出すると、上記化合物が癌細胞又は腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害する場合に、上記化合物は抗増殖化合物として同定される工程を含む、上記方法を提供する。本発明はさらに、癌の治療もしくは予防、又はその症状の軽減のための治療薬を同定する方法であって、当該方法が、化合物ライブラリーのメンバーを本発明の複合体並びにレポーター遺伝子及び1つの３’末端プレ-mRNA切断部位を含む1つの核酸と接触させる工程であって、ここで、レポーター遺伝子は３’末端プレ-mRNA切断部位の３’に位置し、遺伝子発現に必要とされる全ての因子は存在している工程、並びに当該レポーター遺伝子を検出する工程であって、ここで、化合物が、当該化合物の不在下での上記レポーター遺伝子の発現と比較して上記レポーター遺伝子の発現を減少させた場合、上記化合物を癌細胞又は腫瘍細胞と接触させて、当該癌細胞又は腫瘍細胞の増殖を検出すると、上記化合物が癌細胞又は腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害する場合に、化合物は抗増殖化合物として同定される工程を含む、上記方法を提供する。上記方法は、癌の動物モデルにおいて当該化合物を試験する工程であって、ここで当該試験が当該化合物を当該動物モデルに投与する工程及び上記化合物が当該動物モデルにおいて増殖又は癌細胞の拡大の低減に有効であることを検証する工程を含む工程、をさらに含んでもよい。上記方法は、上記化合物の細胞毒性を測定する工程をさらに含んでもよい。上記方法は、上記化合物の細胞増殖抑制作用を測定する工程をさらに含んでもよい。
【００６７】
3.1 用語
本明細書において使用する、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（camelised）抗体、キメラ抗体、単一鎖 Fvs（scFv）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Fabフラグメント、F（ab）フラグメント、ジスルフィド結合Fvs（sdFv）、及び抗イディオタイプ（anti-Id）抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を指す。特に抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれの種類（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2）又はサブクラスにも入り得る。
【００６８】
本明細書において使用する、「化合物」という用語は、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）をモジュレートする能力が試験され、複合体のRNA-核酸分解活性をモジュレートしたことが同定されており、複合体の形成をモジュレートすることが同定され、又は複合体のタンパク質成分の発現をモジュレートすることが同定された、任意の医薬品又は複合体を指す。「化合物」という用語は、これに限定されるものではないが、小分子、抗体及びその断片、ならびに二本鎖核酸及び一本鎖核酸を含む。本発明の複合体のRNA-核酸分解活性は、とりわけ、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、３’末端プレ-mRNA切断エンドヌクレアーゼ、プレ-tRNA切断、又はリボソームRNA切断であり得る。
【００６９】
本明細書において使用する、タンパク質性物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び抗体）との関連における「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失及び/又は付加の導入によって変化した1つのアミノ酸配列を含むタンパク質性物質を指す。本明細書において使用する「誘導体」という用語はまた、例えば、任意の種類の分子を共有結合することによって改変された、タンパク質性物質を指す。例えば、限定する目的ではないが、抗体を、例えば、糖鎖付加、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合等によって改変してもよい。タンパク質性物質の誘導体は、限定されるものではないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下の代謝合成等を含む、当業者に知られている技法を用いた化学的改変によって作製してもよい。さらに、タンパク質性物質誘導体は、1つ以上の非古典型アミノ酸を含んでよい。タンパク質性物質誘導体は、例えばRNA核酸分解活性をもつ複合体への関与といった、派生元のタンパク質性物質と類似又は同一の機能を保持する。タンパク質性物質との関連における「誘導体」という用語はまた、第2のタンパク質性物質（例えば、上記誘導体の派生元のタンパク質性物質）と類似又は同一の機能を保持するタンパク質性物質をも指すが、必ずしも第2のタンパク質性物質と類似又は同一のアミノ酸配列を含み、又は第2のタンパク質性物質と類似又は同一の構造を保持するものではない。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質性物質は、下記の少なくとも1つを満たす第2のタンパク質性物質であって、（a）タンパク質性物質が、第2のタンパク質性物質のアミノ酸配列と、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも99％同一のアミノ酸配列を有すること、（b）タンパク質性物質が、ストリンジェントな条件下で、少なくとも5連続アミノ酸残基、少なくとも10連続アミノ酸残基、少なくとも15連続アミノ酸残基、少なくとも20連続アミノ酸残基、少なくとも25連続アミノ酸残基、少なくとも40連続アミノ酸残基、少なくとも50連続アミノ酸残基、少なくとも60連続アミノ酸残基、少なくとも70連続アミノ酸残基、少なくとも80連続アミノ酸残基、少なくとも90連続アミノ酸残基、少なくとも100連続アミノ酸残基、少なくとも125連続アミノ酸残基、又は少なくとも150連続アミノ酸残基の第2のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされること、ならびに（c）タンパク質性物質が、第2のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも99％同一のヌクレオチド配列によってコードされること、を満たす上記第2のタンパク質性物質を指す。第2のタンパク質性物質と類似の構造をもつタンパク質性物質は、第2のタンパク質性物質と類似の二次構造、三次構造、四次構造を有するタンパク質性物質を指す。タンパク質性物質の構造は、限定されるものではないが、ペプチドシークエンシング、X線結晶解析、核磁気共鳴、円偏光二色性、及び結晶学的電子顕微鏡法を含む当業者に知られている方法によって決定することができる。特定の実施形態において、誘導体は機能的に活性な誘導体である。
【００７０】
誘導体のアミノ酸配列と、その誘導体が派生したタンパク質性物質のアミノ酸配列との%同一性を決定するため、あるいは 誘導体をコードする核酸配列と、その誘導体が派生したタンパク質性物質をコードする核酸配列とを比較するために、最適な比較を行う目的で上記配列を整列させる（例えば、第2のアミノ酸配列又は核酸配列と最適に整列させるために第1のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入する）。次に、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列におけるある1つの位置が、第2のアミノ酸配列における対応する位置にあるものと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められていた場合、その位置にある分子は同一である。上記2つの配列間の%同一性は、上記配列が共有する同一位置の数を表す役割を果たす（すなわち、%同一性 = 同一の重複位置の数/総位置数×100%）。1つの実施形態においては、上記2つの配列は同じ長さである。2つの配列間の%同一性の決定はまた、数学アルゴリズムを用いて達成することもできる。好ましい、非限定的な、2つの配列の比較に利用された数学アルゴリズムの例は、Karlin 及び Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 2264-2268,のアルゴリズムであり、これはKarlin 及び Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5873-5877へと改変された。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403.のNBLAST 及び XBLAST プログラムに組み込まれている。 BLAST によるヌクレオチド検索は、NBLAST ヌクレオチドプログラムパラメーターセットで実施できる。例えば、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列は、スコア=100,ワード長=12 で取得する。BLAST によるタンパク質検索は、XBLAST プログラムパラメーターセットで実施できる。例えば、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列は、スコア=50, ワード長=3 で取得する。比較のためにギャップ入りアラインメントを取得する場合、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のとおりGapped BLASTを利用することができる。あるいは、分子間の距離関係を検知する反復検索を実施するためにPSI-BLASTを使用することができる(上記)。 BLAST、Gapped BLAST、及び PSI-Blastプログラムを利用する場合、各々のプログラムの初期パラメータ(例えば、XBLAST及びNBLASTの)を利用できる(例えば、NCBI ウェブサイトを参照)。配列比較に利用される数学アルゴリズムの別の、好ましい、非限定的な例は、Myers 及び Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG 配列アラインメントソフトウェアパッケージの部分であるALIGN プログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列比較のためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重みつき残基表、ギャップ長ペナルティー12及びギャップペナルティー4を使用することができる。
【００７１】
2つの配列間の%同一性は、ギャップを導入し、又はギャップを導入せずに、上記に記載した技法と類似の技法を用いて決定することができる。%同一性の計算の際には、通常、完全一致のみを計算する。
【００７２】
本明細書において使用する、「疾患」及び「疾病」という用語は、被験者の状態を指す（例えば、増殖性疾患又は異常なRNA核酸分解活性によって特徴付けられ、関連し又は起因する疾患）。
【００７３】
本明細書において使用する、増殖性疾患に関連した「有効量」という用語は、増殖性疾患もしくは1つ以上の増殖性疾患の症状の進行、重篤性及び/もしくは持続期間を低減又は軽減し、増殖性疾患もしくはその1つ以上の症状の発症、再発もしくは発病を予防し、増殖性疾患もしくはその1つ以上の症状の進展を予防し、又は別の治療薬の治療効果を強化もしくは向上させるために十分な治療薬（例えば、化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を抑制する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、又は本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片）の量を指す。異常なRNA核酸分解活性によって特徴づけられ、関連し又は起因する疾患に関連した「有効量」という用語は、異常なRNA核酸分解活性によって特徴づけられ、関連し又は起因する疾患又はその1つ以上の症状の進行、重篤性及び/又は持続期間を低減又は軽減し、異常なRNA核酸分解活性によって特徴づけられ、関連し又は起因する疾患又はその1つ以上の症状の発症、再発又は発病を予防し、異常なRNA核酸分解活性によって特徴づけられ、関連し又は起因する疾患又はその1つ以上の症状の進展を予防し、別の治療薬の治療効果を強化もしくは向上させるために十分な治療薬（例えば、化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を抑制する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、又は本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片）の量を指す。本明細書において使用する、創傷治癒に関連した「有効量」という用語は、創傷（例えば、負傷に起因する創傷）又はその1つ以上の症状の進行、重篤性及び/又は持続期間を低減もしくは軽減し、創傷、創傷に関連する病気もしくはその1つ以上の症状の発症、再発もしくは発病を予防し、創傷に関連する病気もしくはその1つ以上の症状の進展を予防し、又は別の治療薬の治療効果を強化もしくは向上させるために十分な治療薬（例えば、化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を抑制する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、又は本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片）の量を指す。
【００７４】
本明細書において使用する、「蛍光受容体部分」という用語は、蛍光供与体部分から与えられるエネルギーを吸収し、転移されたエネルギーを蛍光として再放射する蛍光化合物を指す。蛍光受容体部分の例としては、これに限定されるものではないが、クマリン及び関連する発蛍光団、キサンテン（例えば、フルオレセイン、ロードール（rhodol）、及びローダミン）、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラディアジンダセン（Difluoroboradiazindacenes）及びフタロシアニンが含まれる。
【００７５】
本明細書において使用する、「蛍光供与体部分」という用語は、エネルギーを吸収することができ、エネルギーを、別の蛍光化合物のような受容体に転移することができる蛍光化合物を指す。蛍光供与体部分の例としては、これに限定されるものではないが、クマリン及び関連する色素、キサンテン色素（例えば、フルオレセイン、ロードール（rhodol）、及びローダミン）、レゾルフィン、シアニン色素、バイメーン（bimanes）、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタルヒドラジド(例えば、ルミノール及びイソルミノール誘導体)、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノハイドロキノン、蛍光ユーロピウム、テルビウム複合体及び関連の化合物が含まれる。
【００７６】
本明細書において使用する、「発蛍光団」という用語は、蛍光を発する発色団を指す。
【００７７】
本明細書において使用する、「断片」という用語は、別のポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも5連続アミノ酸残基、少なくとも10連続アミノ酸残基、少なくとも15連続アミノ酸残基、少なくとも20連続アミノ酸残基、少なくとも25連続アミノ酸残基、少なくとも40連続アミノ酸残基、少なくとも50連続アミノ酸残基、少なくとも60連続アミノ酸残基、少なくとも70連続アミノ酸残基、少なくとも80連続アミノ酸残基、少なくとも90連続アミノ酸残基、少なくとも100連続アミノ酸残基、少なくとも125連続アミノ酸残基、少なくとも150連続アミノ酸残基、少なくとも175連続アミノ酸残基、少なくとも200連続アミノ酸残基、又は少なくとも250連続アミノ酸残基、のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。特定の実施形態においては、タンパク質又はポリペプチドの断片は、上記タンパク質又はポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持している。
【００７８】
本明細書において使用する、タンパク質性物質に関連した「機能的に活性な誘導体」という用語は、上記誘導体が派生したポリペプチド又はタンパク質の少なくとも1機能を保持する、タンパク質性物質の誘導体を指す。特定の実施形態においては、上記機能的に活性な誘導体は、上記誘導体が派生したタンパク質又はポリペプチドの少なくとも2つ、3つ、4つ又は5つの機能を保持する。特定の実施形態においては、上記機能的に活性な誘導体は、上記誘導体が派生したタンパク質の、特定の第3のタンパク質に結合する能力又はRNA核酸分解活性をもつ特定の複合体、例えば、本発明の複合体を形成する能力を保持する。別の特定の実施形態においては、上記機能的に活性な誘導体は、上記誘導体が派生したタンパク質のRNA核酸分解活性を保持する。
【００７９】
本明細書において使用する、「機能的に活性な断片」という用語は、上記第2の、異なったポリペプチド又はタンパク質の少なくとも1つの機能を保持するポリペプチド又はタンパク質の断片を指す。特定の実施形態においては、ポリペプチド又はタンパク質の断片は、上記タンパク質又はポリペプチドの少なくとも2つ、3つ、4つ又は5つの機能を保持する。特定の実施形態においては、上記機能的に活性な断片は、上記第2のタンパク質の、特定の第3のタンパク質に結合する能力又は特定の複合体を形成する能力を保持する。別の特定の実施形態においては、上記機能的に活性な断片は、上記第2のタンパク質の、RNA核酸分解活性を保持する。
【００８０】
本明細書において使用する、「融合複合体」という用語は、タンパク質複合体を意味し、ここで、上記複合体のタンパク質成分は、ペプチド結合又は他の共有結合によって互いに結合している。
【００８１】
本明細書において使用する、「融合タンパク質」という用語は、第1のタンパク質又はポリペプチド又はその機能的な断片、その類似体もしくは誘導体のアミノ酸配列、及び異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチド（すなわち、第1のタンパク質又はその断片、類似体もしくは誘導体とは異なる、第2のタンパク質又はポリペプチド又はその断片、類似体もしくは誘導体）のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。言い換えれば、融合タンパク質は第1のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列及び第1のタンパク質とは通常関連していない又は第1のタンパク質の一部となっていないアミノ酸配列を含む。
【００８２】
本明細書において使用する、「宿主細胞」という用語は、1つの核酸分子でトランスフェクトされる又は形質転換される特定の対象細胞及びこのような細胞の子孫細胞又は潜在的な子孫細胞を含む。このような細胞の子孫は、後代に起こり得る変異もしくは環境の影響、又は上記核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みに起因して、上記の核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一でなくてもよい。
【００８３】
本明細書において使用する、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、その条件下で、少なくとも30%（好ましくは、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%又は99.5%、）互いに同一である核酸配列が、通常互いにハイブリダイズしたままで残るようなハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を表す。このようなストリンジェントな条件は、当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6.に見られる。１つの、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件についての非限定的な例は、約45℃で6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中でハイブリダイゼーションし、続いて約68℃で、0.1XSSC、0.2% SDS 中で1回以上の洗浄を行うことである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件についての好適で、非限定的な例は、約45℃で6XSSC中でハイブリダイゼーションし、続いて50℃から65℃で、0.2 X SSC、0.1% SDS 中で1回以上の洗浄を行うことである（すなわち、50℃、55℃、60℃又は65℃で1回以上の洗浄を行う）。本発明の上記核酸は、このような条件の下では、A又はTヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列だけにハイブリダイズする核酸分子を含まないことが分かっている。特定の実施形態においては、高ストリンジェントな条件は、6X SSC、50 mMTris-HCl (pH=7.5)、1 mM EDTA、 0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA 及び100μg/ml の変性サケ精子DNAからなるバッファ中における65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2X SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll及び0. 01% BSAからなるバッファ中での37℃で45分間の洗浄、及び0.1X SSCからなるバッファ中での50℃で45分間の洗浄を含む。ストリンジェンシー条件を決定する模範的な方法は、4.3.1節を参照されたい。
【００８４】
本明細書において使用する、「免疫特異的に結合する」という用語及び類似する用語は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗原又は断片に特異的に結合し、他の抗原には特異的に結合しない（例えば、これに限定するものではないが、ELISA法といった標準免疫アッセイによって決定される）抗体又はその断片を指す。抗原に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は抗体は、例えば免疫アッセイ、BIAcore、又は当技術分野において知られている他のアッセイによって決定されるように、より低い親和性で他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に結合する。抗原に免疫特異的に結合する抗体又は断片は、関連する抗原と交差反応する。抗原と免疫特異的に結合する抗体又は断片は、他の抗原とは交差反応しないことが好ましい。
【００８５】
本明細書において使用する、「併用して」という用語は、1以上の治療薬（例えば、予防用/治療用製剤）の使用を指す。「併用して」という用語は、疾患をもつ被験者に治療薬（例えば、予防用/治療用製剤）を投与する順番を限定するものではない。疾患をもつ被験者に対して、第1の治療薬（例えば、本発明の方法によって同定される化合物といった予防用又は治療用製剤）を第2の治療薬（例えば、化学療法薬又はTNF-α拮抗薬といった予防用/治療用製剤）の投与に先立って（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前に）、同時に、又は投与後（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後に）投与することができる。
【００８６】
本明細書において使用する、「ライブラリー」という用語は、複数の化合物を指す。ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリー、例えば、コンビナトリアルケミストリー技法を用いた合成化合物のコレクション又は、各々固有の三次元空間を占める、低分子量（1000ダルトン以下）の固有の化学薬品のコレクションでよい。特定の実施形態においては、1つのライブラリーは少なくとも50 ; 100; 150; 200; 250; 500; 750; 1,000 ; 1,250 ; 1,500 ; 1,750 ; 2,000 ; 2,500 ; 5,000 ; 7,500 ; 10,000 ; 20,000 ; 30,000 ; 40,000 ; 又は少なくとも50,000の異なる化合物からなる。特定の実施形態においては、1つのライブラリーは多くとも50 ; 100; 150; 200; 250; 500; 750; 1,000 ; 1,250 ; 1,500 ; 1,750 ; 2,000 ; 2,500 ; 5,000 ; 7,500 ; 10,000 ; 20,000 ; 30,000 ; 40,000 ;又は多くとも50,000の異なる化合物からなる。特定の実施形態においては、1つのライブラリーは10 及び 100; 10 及び 150; 100 及び 200; 100 及び 250; 100 及び 500; 100 及び 750; 500 及び 1,000 ; 500 及び 1,250 ; 500 及び 1,500 ; 500 及び 1,750 ; 1,000 及び 2,000 ; 1,000 及び 2,500 ; 2,000 及び 5,000 ; 2,000 及び 7,500 ; 2,000 及び 10,000 ; 5,000 及び 20,000 ; 10,000 及び 30,000 ; 10,000 及び 40,000 ; 20,000 及び 50,000の間の異なる化合物からなる。
【００８７】
本明細書において使用する、「管理する」及び「管理」という用語は、被験者が治療（例えば、予防薬又は治療薬の投与）から得る薬効であって、上記疾患の治癒にはつながらないものを指す。特定の実施形態においては、被験者は疾病又は疾患を「管理」するために1つ以上の治療薬を投与され、それによって疾病又は疾患の進行又は悪化を予防する。
【００８８】
本明細書において使用する、「非応答性」及び「不応性」という用語は、疾患（例えば癌）に対する現在入手可能な治療薬（例えば、予防薬又は治療薬）であって、上記疾患又はそれに伴う1以上の症状から解放するには臨床的に不十分な治療薬で治療を受けている患者を表現する。通常、このような患者は重度の、常に活性化した疾病を患い、疾患に伴う症状を軽減する付加的な治療薬を必要とする。
【００８９】
本明細書において使用する、「ORF」という用語は、mRNAの読み取り枠、すなわち、mRNAがタンパク質に翻訳される領域を指す。
【００９０】
本明細書において使用する、「製薬上許容可能な塩（類）」という語句は、これに限定されるものではないが、本発明の方法を用いて同定した化合物中に存在する酸性基又は塩基性基の塩を含む。塩基性の性質をもつ化合物は、様々な無機酸及び有機酸と幅広い種類の塩を形成することができる。製薬上許容可能な、上記塩基性化合物の酸付加塩を調製するために用いることができる上記酸は、無毒の酸付加塩、すなわち、これに限定されるものではないが、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、過クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホナート、p-トルエンスルホナート、及びパモエート (すなわち、1,1'-メチレン-ビス- (2-ヒドロキシ-3-ナフト酸塩))の塩を含む、製薬上許容可能な陰イオンを含有する塩を形成する。アミノ部分を含む化合物は、上述の酸に加えて、様々なアミノ酸と製薬上許容可能な塩を形成し得る。酸性の性質をもつ化合物は、様々な製薬上許容可能な陽イオンと共に塩基性塩を形成することができる。これらの塩の例には、アルカリ金属又はアルカリ土類金属及び、特に、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム及び鉄の塩が含まれる。
【００９１】
本明細書において使用する、「予防する」及び「予防」という用語は、1つの治療薬の投与又は併用した治療薬の投与による、疾患又はその1つ以上の症状の、発症、再発又は発症の予防を指す。
【００９２】
本明細書において使用する、「あらかじめ決定した参照範囲」という用語は、個々のアッセイの、上記読み出しのための参照範囲を指す。特定の実施形態においては、上記用語は、特定の細胞による、又は特定の無細胞抽出液中における、レポーター遺伝子の発現及び/又は活性のための参照範囲を指す。各々の研究室は、個々のアッセイ、細胞種および無細胞抽出液のための独自の参照範囲を確立する。好適な実施形態においては、少なくとも1つの陽性対照及び少なくとも1つの陰性対照が、分析する個々のバッチの化合物に含まれる。
【００９３】
本明細書において使用する、「予防薬」という用語は、疾患の予防に用いることができる任意の医薬品を指す。特定の実施形態においては、「予防薬」という用語は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される化合物、本発明の複合体、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又は断片、Sen2ΔEx8タンパク質、Sen2ΔEx8をコードする核酸、Sen2ΔEx8に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分又は本発明の複合体の成分をコードする核酸もしくは本発明の複合体の成分の発現を予防又は低減する核酸（例えば、アンチセンス核酸又はRNAiを用いる）を指す。他の特定の実施形態においては、「予防薬」という用語は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイで同定される化合物、本発明の複合体、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又は断片、Sen2ΔEx8タンパク質、Sen2ΔEx8をコードする核酸、Sen2ΔEx8に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分、又は本発明の複合体の成分をコードする核酸もしくは本発明の複合体の成分の発現を予防又は低減する核酸（例えば、アンチセンス核酸又はRNAiを用いる）、以外の薬剤であって、疾患又はその1つ以上の症状の発症、発症及び/又は進行の予防又は阻害に有効であることが知られ、又は上記予防又は阻害に利用されていた、もしくは現在利用されている薬剤を指す。異常なRNA-核酸分解活性によって特徴付けられ、関連し又は起因する疾患に関連した「予防薬」は、異常なRNA-核酸分解活性によって特徴付けられ、関連し又は起因する疾患又はその1つ以上の症状の危険性を予防又は低減することができる量の化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を阻害する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、を指す。本明細書において使用する、創傷治癒に関連した「予防薬」という用語は、創傷、創傷に伴う症状、その1つ以上の症状の発症、再発もしくは発症を予防することができ、創傷に伴う症状もしくはその1つ以上の症状の進展を予防することができ、又は別の治療薬の治療効果を高めもしくは改善することができる化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を阻害する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、を指す。
【００９４】
本明細書において使用する「予防的に有効な量」という用語は、疾患又はその1つ以上の症状の発症、再発もしくは発症を予防するのに十分な治療薬（例えば、本発明の方法で同定された化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を阻害する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体又はその断片といった予防薬）の量を指す。
【００９５】
本明細書において使用する、例えば本明細書の方法によって同定した化合物といった、タンパク質性物質又は核酸以外の化合物に関連する「精製した」という用語は、化学的に合成した場合に実質的に化学的前駆体又は他の化学物質を含まない化合物を指す。特定の実施形態においては、上記化合物は60%、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%又は99%、他の、異なる化合物を含まない。好ましい実施形態においては、本明細書の方法によって同定される化合物は精製されている。
【００９６】
具体的には、タンパク質性物質（例えば、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ又はそのサブユニットといったペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）に関連する「精製した」という用語は、細胞物質又は派生元の細胞もしくは組織源から取得した夾雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学的に合成した場合に、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質性物質を指す。「細胞物質を実質的に含まない」という語は、タンパク質性物質を、それが精製され又はその中で組換的に生成された細胞の細胞成分から分離する、タンパク質性物質の調製を含む。従って、タンパク質性物質又は細胞物質を実質的に含まない物質には、約30%、20%、10%、又は5%以下（乾燥重量）の異種タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は抗体（「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を含有するタンパク質性物質の製剤が含まれる。タンパク質性物質を組換的に生成する場合、実質的に培地を含まないこともまた好ましい。すなわち、培地は上記タンパク質製剤の体積のうち、約20%、10%又は5%以下に相当する。上記タンパク質性物質を化学的合成によって生成する場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことが望ましい。すなわち、タンパク質性物質を、上記タンパク質性物質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離する。従って、このようなタンパク質性物質の製剤は、約30%、20%、10%、又は5%（乾燥重量）以下の、目的のタンパク質性物質以外の化学的前駆体又は化合物を含有する。好ましくは、本明細書で開示されるタンパク質性物質は精製されている。
【００９７】
本明細書において使用する、核酸分子に関連する「精製した」という用語は、核酸分子の自然源中に存在する他の核酸分子から分離した核酸分子を指す。さらに、cDNA分子といった「精製した」核酸分子は、組換技術を用いて作出する場合には他の細胞物質もしくは培地を実質的に含まず、化学的に合成する場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことが好ましい。特定の実施形態においては、核酸分子は精製されている。好適な実施形態においては、複合体のタンパク質成分をコードする核酸分子は精製されている。
【００９８】
本明細書において使用する、「消光剤」という用語は、蛍光部分の発光を低減することができる1分子又は化合物の1部を指す。このような低減は、光子が通常蛍光部分から放出された後の光の低減を含む。
【００９９】
本明細書において使用する、「RNA-核酸分解活性」という用語は、これに限定するものではないが、プレ- tRNAスプライシング活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及びプレ-リボソームRNA切断活性を指す。
【０１００】
本明細書において使用する、「小分子」及び類似する用語は、これに限定するものではないが、ペプチド、ペプチド模倣剤、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、分子量が約10,000g/モル以下の有機化合物又は無機化合物（すなわち、異種有機化合物及び有機金属化合物を含む）、分子量が約5,000 g/モル以下の有機化合物又は無機化合物、分子量が約1,000g/モル以下の有機化合物又は無機化合物、分子量が約500g/モル以下の有機化合物又は無機化合物、分子量が約100 g/モル以下の有機化合物又は無機化合物、ならびにこれらの化合物の、塩、エステル及び他の製薬上許容可能な形態を含む。これらの化合物の塩、エステル及び他の製薬上許容可能な形態もまた包含される。
【０１０１】
本明細書において使用する、同定した化合物に関連した「特異的に結合する」及び類似する用語は、本発明の複合体又は複合体のタンパク質成分又は複合体のタンパク質成分の断片には結合し、他の複合体、タンパク質又はポリペプチドには結合しない、もしくはより低い親和性で結合する、本発明によって同定される化合物を指す。上記結合親和性は、例えば免疫測定法、BIAcore、又は当技術分野において知られている他のアッセイで測定することができる。本発明の複合体又は複合体のタンパク質成分又は複合体のタンパク質成分の断片に特異的に結合する化合物は、関連するタンパク質又はポリペプチドと交差反応してよい。本発明の複合体又は複合体のタンパク質成分又は複合体のタンパク質成分の断片に特異的に結合する化合物は、関連するタンパク質又はポリペプチドとは交差反応しないことが好ましい。
【０１０２】
本明細書において使用する、「被験者」及び「患者」という用語は、本明細書中で同義的に用いられる。「被験者」という用語は、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、馬、猫、犬、ラット及びマウス）ならびに霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザルのような猿、及びヒト）、ならびにさらに好ましくはヒトを含む哺乳類を指す。1つの実施形態においては、上記被験者は、現行の、増殖性疾患の治療法に対しては不応性又は非応答性である。別の実施形態においては、被験者は家畜（例えば、馬、ウシ、ブタ等）、又はペット（例えば犬もしくは猫）である。好適な実施形態においては、被験者はヒトである。
【０１０３】
本明細書において使用する、「ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質」という語句は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼによって認識され、及び切断される任意のヌクレオチド配列を指す。例えば、バルジ-へリックス-バルジ構造又はtRNA前駆体の成熟ドメインを含むヌクレオチド配列は、本明細書に記載されたアッセイにおいて、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質として利用し得る。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが認識し切断するヌクレオチド配列は、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、55ヌクレオチド、60ヌクレオチド、65ヌクレオチド、75ヌクレオチド、100ヌクレオチド、125ヌクレオチド、150ヌクレオチド、あるいはそれ以上のヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載されたアッセイにおいて利用される、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの上記基質は、tRNAイントロンを含む。上記基質は、成熟ドメイン又はバルジ-へリックス-バルジ構造を含んでよい。好適な実施形態においては、上記基質は前駆体tRNAの成熟ドメインを含む。
【０１０４】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質は、当業者に周知な任意の方法によって生成し得る。例えば、上記基質は、ホスホアミダイト法又は他の液相もしくは固相法を用いて化学的に合成し得る。ホスホアミダイト法によるポリヌクレオチドの形成に用いる化学反応の詳細な説明は周知である。(例えば、Caruthers et al., U. S. Pat. Nos. 4,458, 066 及び4,415, 732; Caruthers etal., 1982, Genetic Engineering 4: 1-17; UsersManual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, 1990, pages 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237; Ojwang, et al., 1997, Biochemistry, 36: 6033-6045を参照)。合成後、当業者に知られている、標準的な技法を用いて上記基質を精製することができる(Hwang et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (23): 12997- 13002 及び引用されている参照文献を参照)。上記基質の長さ及び合成の方法によって、これらの精製技法は、これに限定するものではないが、逆相高性能液体クロマトグラフィー（「逆相HPLC」）、高速液体クロマトグラフィー（「FPLC」）及びゲル精製を含む。特定の実施形態においては、図1に示す基質を本明細書のアッセイに利用することができる。図1に示すハイブリダイズしたtRNA基質を生成するためには、加熱及び冷却によって、ハイブリダイズした基質の両鎖が別々に転写され、続いて上記二本の鎖がハイブリダイズするようにする。環状に順序を変えたtRNA基質を合成するために、上記RNAをイントロンの５’末端（図1C）からイントロンの３’末端へと転写する。
【０１０５】
本明細書において使用する、「ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質」という語句は、ヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼによって認識され、及び切断される任意のヌクレオチド配列を指す。例えば、上記切断部位の上流の配列AAUAAA及び下流のG/Uリッチ配列エレメントをもつヘキサヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を、本明細書に記載のアッセイにおいてヒト３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質として利用してもよい。３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼによって認識され、及び切断されるヌクレオチド配列は、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、55ヌクレオチド、60ヌクレオチド、65ヌクレオチド、75ヌクレオチド、100ヌクレオチド、125ヌクレオチド、150ヌクレオチド又はそれ以上を含む。特定の実施形態においては、本明細書に記載のアッセイにおいて使用する上記３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質は、切断部位及びポリアデニル化部位を含む。
【０１０６】
本明細書において使用する、「相乗的な」という用語は、本明細書に記載された方法の1つを用いて同定された化合物（例えば、本発明の複合体の活性をモジュレートする）、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、本発明の複合体の成分をコードする核酸、ならびに疾患もしくはその症状の予防、治療、管理もしくは軽減に使用されていた又は現在使用されている、上記治療薬の相加的作用よりもさらに有効な別の治療薬（例えば薬剤）の併用を指す。治療薬の併用による相乗効果（例えば、予防薬又は治療薬）によって、1つ以上の上記治療薬をより低い用量で使用し及び/又は疾患をもつ被験者に当該治療薬をより低頻度で投与することができる。治療薬（例えば、予防薬又は治療薬）をより少ない用量で使用し、及び/又は当該治療薬を低頻度で投与することができるため、疾患又はその症状の予防、治療、管理又は軽減において、当該治療薬の薬効を減じることなく上記医薬品の患者への投与に伴う毒性が低減する。さらに相乗効果によって、疾患又はその症状の予防、治療、管理又は軽減において治療薬（例えば薬剤）の薬効を向上させることができる。最終的には、治療薬（例えば、予防薬又は治療薬）の併用による相乗効果によって、いずれかの治療薬を単独で用いる際に伴う不都合なもしくは好ましくない副作用を回避又は低減し得る。
【０１０７】
本明細書において使用する、「治療薬」という用語は、疾患又はその症状の予防、治療、管理又は軽減に使用することができる任意の薬剤を指す。特定の実施形態においては、「治療薬」という用語は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、本発明の複合体の成分をコードする核酸、又はアンチセンスもしくはRNAi核酸を指す。他の実施形態においては、「治療薬」という用語は、疾患又はその1つ異常の症状の予防、治療、管理もしくは軽減に役立つことが知られており、又は予防、治療、管理もしくは軽減に使用されていたもしくは現在使用されている、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物、以外の薬剤を指す。
【０１０８】
本明細書において使用する、「治療上有効な量」という用語は、疾患の1つ以上の症状を軽減し、疾患の進展を予防し、上記疾患の退行を起こし、又は別の治療薬（例えば、治療薬）の治療効果を向上もしくは改良するのに十分な治療薬（例えば、治療薬）の量を指す。特定の実施形態においては、癌治療に関して、治療上有効な量は、癌細胞の増殖を阻害又は低減し、腫瘍細胞の広がり（転移）を阻害又は低減し、癌に伴う1つ以上の症状の発症、発症、もしくは進行を阻害もしくは低減し、又は腫瘍の大きさを縮小する、療法（例えば、治療薬）の量を指す。好ましくは、治療上有効な療法（例えば、治療薬）は、リン酸緩衝生理食塩水（「PBS」）といった対照と比較して癌細胞の増殖又は腫瘍の大きさを、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、 少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも100%低減する。異常なRNA-核酸分解活性に特徴づけられ、関連し、又は起因する疾患に関連した「治療上有効な量」は、異常なRNA-核酸分解活性に特徴づけられ、関連し、又は起因する疾患もしくはその1以上の症状の、進行、重篤性及び/又は持続時間を低減もしくは軽減し、異常なRNA-核酸分解活性に特徴づけられ、関連し、又は起因する疾患もしくはその1以上の症状の発症、再発もしくは発症を予防し、異常なRNA-核酸分解活性に特徴づけられ、関連し、又は起因する疾患もしくはその1以上の症状の進展を予防し、又は別の治療薬の治療効果を向上もしくは改良するのに十分な化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を阻害する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片の量を指す。本明細書において使用する、創傷治癒に関連した「治療上有効な量」という用語は、創傷（例えば、負傷に起因する創傷）もしくはそれに伴う1つ異常の症状の進行、重篤性及び/又は持続時間を低減もしくは軽減し、創傷、創傷に関連する症状、もしくはその1つ以上の症状の発症、再発もしくは発症を予防し、創傷もしくはその1つ以上の症状に関連した病気の進展を予防し、又は別の治療薬の治療効果を向上又は改良するのに十分な化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体の成分をコードする核酸、本発明の複合体の成分の発現を阻害する核酸、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片の量を指す。
【０１０９】
本明細書において使用する、「治療する」、「治療」という用語は、1以上の治療薬（例えば、本発明の方法によって同定する化合物、本発明の複合体、本発明の複合体の成分、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、本発明の複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、本発明の複合体の成分をコードする核酸、又はそれら及び別の治療薬との併用）の投与に起因する疾患もしくはその1以上の症状の進行、重篤性及び/又は持続時間の低減もしくは軽減を指す。特定の実施形態においては、これらの用語は、癌細胞の増殖の阻害もしくは低減、腫瘍細胞の広がり（転移）の阻害もしくは低減、癌に関連する1つ以上の症状の発症、発症もしくは進行の阻害もしくは低減、又は腫瘍の大きさの縮小を指す。
【０１１０】
本明細書において使用する、「tRNAイントロン」という用語は、ヒトtRNAエンドヌクレアーゼが認識及び切断する任意のヌクレオチド配列を指す。特に、「tRNAイントロン」という用語は、通常tRNA前駆体に見られるイントロンを指す。
【０１１１】
本明細書において使用する、「tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ」という用語は、前駆体tRNAに含まれるスプライス部位の認識及び前駆体tRNAに存在するイントロンの切断に関与する酵素を指す。古細菌のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは、古細菌の前駆体tRNA中のバルジ-へリックス-バルジモチーフを認識する。真核生物のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは、前駆体tRNAに含まれるスプライス部位を、成熟ドメインからスプライス部位までの距離を測定することによって認識する。真核生物のtRNAエンドヌクレアーゼはまた、前駆体tRNAに含まれるバルジ-へリックス-バルジモチーフを認識する能力を有する。酵母のtRNAエンドヌクレアーゼは、分子量54kDa（SEN54）、44kDa（SEN2）、34kDa（SEN34）及び15kDa（SEN15）を有するサブユニットを含むヘテロ四量体である。これらの因子のヒトホモログ及びそのGenBank受託番号は、表1に記載する。
【０１１２】
本明細書において使用する、「療法」という用語は、疾病又は疾患（例えば、増殖性疾患もしくは創傷治癒に伴う症状）又はその1つ以上の症状の予防、治療、管理又は軽減に使用することができる任意の方法、プロトコル及び/又は医薬品を指す。特定の実施形態においては、これらの用語は、医療関係者に知られている、疾病又は疾患（例えば、増殖性疾患又は創傷治癒に関連する症状）もしくはその1つ以上の症状の予防、治療、管理又は軽減に役立つ化学療法、放射線療法、外科処置、支持療法及び/又は他の治療を指す。
【０１１３】
略語
CPSF 切断-ポリアデニル化特異性因子
CFIm 切断因子Im
CFIIm 切断因子IIm
CstF又はCSTF 切断刺激因子
HTS ハイスループットスクリーニング
FP 蛍光分極
FRET 蛍光共鳴エネルギー移動
HPLC 高性能液体クロマトグラフィー
FPLC 高速液体クロマトグラフィー
FACS 蛍光活性化セルソーター
4. 発明の詳細な説明
本発明は、RNAのプロセシングに関与する複合体を提供する。特に、本発明は、プレ-tRNAスプライシング及び/又は３’末端プレ-mRNA切断に関与する、エンドヌクレアーゼ活性をもつ複合体を提供する。さらに具体的には、本発明は、RNA核酸分解活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、下記の（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片の、2つ以上又は任意の組合せを含む、上記複合体を提供する。
【０１１４】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、下記の（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１１５】
特定の実施形態においては、本発明の複合体は、（i）ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、をさらに含んでもよい。
【０１１６】
本発明はまた、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（v）ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体をも提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１１７】
特定の実施形態においては、本発明の複合体は、（i）ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、をさらに含んでもよい。
【０１１８】
本発明の複合体のタンパク質成分のアミノ酸配列及びこのようなタンパク質成分をコードする核酸配列についての受託番号は、下記の表1に示す。
【０１１９】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（v）ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vi）ヒトCPSF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vii）ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（viii）ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（ix）ヒトCstF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１２０】
特定の実施形態においては、本発明の複合体は、（i）ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、をさらに含んでもよい。
【０１２１】
本発明は、ヒトSen2のスプライス変異体、すなわちヒトSen2ΔEx8を提供する。特に、本発明はヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体、及びヒトSen2ΔEx8をコードするアミノ酸配列又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で、Sen2ΔEx8をコードする核酸配列の全長にわたってハイブリダイズする核酸配列を提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、上記タンパク質がSen2（受託番号:NP_079541，図20 (配列番号2)）とは異なる、タンパク質をコードする核酸配列を提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号11の核酸配列を含む核酸配列を提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列を含むベクター及び上記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸を含む宿主細胞をさらに提供する。
【０１２２】
本発明は、精製したタンパク質であって、上記タンパク質が、本質的に配列番号12のアミノ酸配列からなる、又は、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%もしくは少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列からなる、上記タンパク質を提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8には免疫特異的に結合するがSen2には結合しない、抗体又はその断片をさらに提供する。特に本発明では、Sen2タンパク質からエクソン8を欠失することによって作出したSen2ΔEx8特有の領域に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
【０１２３】
本発明はまた、ヒトSen2ΔEx8を含む精製したタンパク質複合体を提供する。上記Sen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、プレ-tRNA切断活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。本発明は、（i）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、及び（ii）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。本発明はまた、ヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、（ii）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記ヒトSen2ΔEx8複合体をも提供する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は３’末端mRNAプロセシング活性を有する。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。特定の実施形態において、上記複合体は、（i）ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片をさらに含んでもよい。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、tRNAを複数部位で切断し、RNA構造のマッピング及び３’末端エンドヌクレアーゼプロセシングに役立つ。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。
【０１２４】
本発明は、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、（ii）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（v）ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は３’末端mRNAプロセシング活性を有する。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。特定の実施形態において、上記複合体は、（i）ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片をさらに含んでもよい。本発明はまた、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、（ii）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（v）ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vi）ヒトCSPF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vii）ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（viii）ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（ix）ヒトCstF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記精製したヒトSen2ΔEx8複合体も提供する。本発明はまた、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、（ii）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含み、任意に（i）ヒトCPSF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトCstF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の、さらに特定の実施形態においては、上記複合体は、tRNA切断活性及び/又は３’末端プレ-mRNAプロセシング活性を有する。
【０１２５】
本発明はまた、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体をも提供する。特に、本発明は、（i）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（ii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体を提供する。このタンパク質複合体を、異なったリボソームRNAの生合成に使用してもよい。例えば、28S、18S、5.5S及び5SリボソームRNAの生成は、このタンパク質複合体を改変することによって変えることができる。
【０１２６】
本発明は、本発明の複合体を精製する方法を提供する。特に、本発明は、本発明の複合体を精製する方法であって、上記方法が、細胞抽出物又は細胞からの核抽出物を調製する工程、ただし、上記細胞が、上記複合体の全てのタンパク質成分を発現し、少なくとも1つのタンパク質成分がペプチドタグと融合している工程、及び上記ペプチドタグによって複合体を精製する工程を含む、上記複合体を精製する方法を提供する。
【０１２７】
本発明は、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。特定の実施形態において、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載の免疫アッセイにおいて、複合体に対しては、複合体の個々の成分に対するより高い親和性で免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。別の実施形態においては、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載の免疫アッセイにおいて、複合体には免疫特異的に結合するが、複合体の、個々の成分には結合しない、抗体又はその断片を提供する。本発明は、上記複合体で被験者に免疫性を与えることを含む、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を生成する方法も提供する。
【０１２８】
本発明はまた、下記の複合体の成分の1つに免疫特異的に結合する抗体又はその断片であって、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（v）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、の1つに免疫特異的に結合する抗体又はその断片も提供する。上記抗体又はその断片は、未知のものであることが好ましい。本発明はまた、上記複合体のタンパク質成分で被験者に免疫性を与えることを含む、複合体のタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を生成する方法も提供する。
【０１２９】
特定の実施形態においては、本発明は、当業者に周知又は本発明に記載の免疫アッセイにおいて、ヒトSen2ΔEx8に対してはヒトSen2よりも高い親和性で免疫特異的に結合する、抗体又はその断片を提供する。別の実施形態においては、本発明は、当業者に周知又は本発明に記載の免疫アッセイにおいて、ヒトSen2ΔEx8に対しては免疫特異的に結合するが、ヒトSen2に対しては結合しない、抗体又はその断片を提供する。
【０１３０】
本発明は、1つ以上の、下記の複合体の成分の発現（RNA及び/又はタンパク質レベルにおける）をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（v）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、の1つ以上の上記複合体のタンパク質成分の発現をモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。タンパク質の発現を測定する技法は、当業者に周知であり、例えば、タンパク質発現レベルにおいては免疫アッセイ、RNA発現レベルにおいてはRT-PCR又はノーザンブロット法が含まれる。
【０１３１】
本発明は、本発明の複合体の形成をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。特に、本発明は、本発明の複合体の形成を安定化又は促進する化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、本発明の複合体の解離を不安定化する又は促進する化合物を同定する方法をも提供する。このような方法は、細胞を用いて行うことも可能であるし、無細胞系で行うことも可能である。
【０１３２】
本発明はまた、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。特に、本発明は、当業者に周知又は本明細書に記載のアッセイを用いて、複合体のプレ-tRNAプロセシング活性及び/又は３’末端プレ-mRNAプロセシング活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供する。例えば、本発明の複合体のRNA核酸分解活性をモジュレートする化合物を同定するために、本発明の方法に従って、レポーター遺伝子に基づくアッセイであるFRETアッセイ及びFISHアッセイを用いてもよい。
【０１３３】
本発明は、本発明の複合体のプレ-tRNA切断活性及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法を、さらに提供する。本発明の複合体のプレ-tRNA切断活性及び/又はプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物の能力を測定するために、当業者に周知又は本明細書に記載の技法を用いてもよい。例えば、本発明の複合体のプレ-tRNA切断活性をモジュレートする化合物の能力は、化合物の存在下でtRNAから生成されるtRNAフラグメントのレベルと、上記化合物の不在下又は適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下で、同じtRNAから生成されるtRNAフラグメントのレベルとを比較することによって測定してもよく、ここで、上記レベルの変化は、上記化合物が、複合体のプレ-tRNA切断活性をモジュレートしたことを示す。化合物が、本発明の複合体の上記プレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする能力は、例えば、上記化合物の存在下で、プレ-リボソームRNAから生成される特定のリボソームRNA（例えば、28S、18S、5.8S及び/又は5S）のレベルと、上記化合物の不在下又は適当な対照（例えば、PBSといった陰性対照）の存在下で、同じプレ-リボソームRNAから生成される上記リボソームRNAレベルとを比較することによって測定してもよく、ここで、上記レベルの変化は、上記化合物が、複合体のプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートしたことを示す。
【０１３４】
本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体の、プレ-リボソームRNA切断活性）をモジュレートする、本明細書に記載のアッセイによって同定した化合物は、上記化合物の、本明細書に記載の疾患（例えば、増殖性疾患又は異常なRNA-核酸分解活性によって特徴付けられ、関連し又は起因する疾患）に対する、又は特定の疾患をもつ患者から取得した細胞に対する効果について、当業者に周知又は本明細書に記載の、in vitroアッセイ（例えば、細胞を使用したアッセイもしくは無細胞アッセイ）又はin vivoアッセイにおいて試験してもよい。
【０１３５】
特定の実施形態においては、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を抑制又は低減する、本明細書に記載のアッセイにおいて同定する化合物は、高増殖細胞対正常細胞に対する上記化合物の増殖抑制効果について、当業者に周知又は本明細書に記載の、in vitroアッセイ（例えば、細胞を使用したアッセイもしくは無細胞アッセイ）又はin vivoアッセイによって試験してもよい。別の実施形態において、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を抑制又は低減する、本明細書に記載のアッセイにおいて同定する化合物は、癌もしくはその症状の予防、治療又は軽減に対する上記化合物の有効性を測定するために、癌を目的とした動物モデルにおいて試験してもよい。さらに別の実施形態において、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を高める、本明細書に記載のアッセイにおいて同定する化合物は、その化合物の創傷治癒に対する効果について試験してもよい。
【０１３６】
本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）をモジュレートする、本明細書に記載のアッセイにおいて同定する化合物の構造は、当業者に周知又は本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。使用する方法は、一つには、スクリーニングするライブラリーの性質によって決まる。
【０１３７】
例えば、各々アドレスと識別子を有する化合物のアッセイ又はマイクロアレイは、例を挙げると陽性試料と上記の個々のアッセイに用いた原化合物リストとを相互参照することによって簡略化（deconvoluted）してよい。あるいは、ここで同定した上記構造を、質量分析法、核磁気共鳴、円偏光二色性、X線結晶解析又は振動分光法を用いて決定してもよい。
【０１３８】
本発明は、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を抑制又は低減する化合物であって、上記化合物が、増殖性疾患もしくはその症状、又は増大するRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）によって特徴付けられ、関連しもしくは起因する疾患もしくはその症状の予防、治療、管理もしくは軽減を目的として、本明細書に記載された方法に従って同定された、上記化合物の使用を包含する。本発明は、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を刺激し又は高める化合物であって、上記化合物が、減少するRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）によって特徴付けられ、関連しもしくは起因する疾患の予防、治療、管理又は軽減を目的として、本明細書に記載された方法に従って同定された、上記化合物の使用を包含する。本発明はまた、本発明の複合体の成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ- tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ- tRNA切断活性及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を刺激し又は高める化合物であって、上記化合物が、被験者の創傷治癒の増強を目的として、本明細書に記載された方法に従って同定された、上記化合物の使用も包含する。
【０１３９】
本発明は、担体及び下記の1つ又は下記の2つ以上の組合せを含む組成物であって、上記組成物が（i）本発明の複合体のタンパク質成分、（ii）本発明の複合体、（iii）本発明の複合体の成分もしくは本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片、（iv）本発明の複合体の成分の発現をモジュレートする化合物、（v）本発明の複合体の形成をモジュレートする化合物、（vi）本発明の複合体のエンドヌクレアーゼ活性（例えば、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性）をモジュレートする化合物、（vii）本発明の複合体のプレ- tRNA切断活性をモジュレートする化合物、及び/又は（viii）本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物を含む、上記組成物を提供する。上記組成物は、1つ以上の他の予防薬又は治療薬をさらに含んでもよい。好適な実施形態においては、上記組成物は医薬組成物である。この実施形態によれば、上記医薬組成物は、好ましくは滅菌され、及び目的とする投与又は使用の方法に適した形態になっている。本発明は、本明細書に記載の疾患又はその症状の予防、治療、管理又は軽減における上記組成物の使用を包含する。
【０１４０】
本発明はまた、本発明の複合体もしくはその成分に免疫特異的に結合する抗体、又は本発明の複合体もしくはその成分に特異的に結合する、本発明の方法によって同定された化合物を用いて、増殖性疾患又は異常なプレ-tRNAプロセシング及び/もしくは３’末端プレ-mRNAプロセシングに関連し、特徴付けられもしくは起因する疾患を検出し、診断し又は監視する方法をも提供する。本発明はまた、このような疾患を有する又はこのような疾患を有することが疑われる被験者の細胞又は組織サンプルから精製した複合体のRNA核酸分解活性と、例えば正常な、非癌性の細胞又は組織サンプルから精製した複合体といった対照のRNA核酸分解活性とを当業者に周知又は本明細書に記載のアッセイを用いて比較することによって、増殖性疾患又は異常なプレ-tRNAプロセシング及び/もしくは３’末端プレ-mRNAプロセシングに関連し、特徴付けられもしくは起因する疾患を検出し、診断し又は監視する方法をも提供する。本発明はさらに、被験者（例えば、このような疾患を有する又はこのような疾患を有することが疑われる被験者）の細胞又は組織サンプルから精製した本発明の複合体の構造と、例えば正常な、非癌性の細胞又は組織サンプルから精製した複合体といった対照の構造とを当業者に周知なアッセイ（例えば、円偏光二色性及び核磁気共鳴）を用いて比較することによって、増殖性疾患又は異常なプレ-tRNAプロセシング及び/もしくは３’末端プレ-mRNAプロセシングに関連し、特徴付けられもしくは起因する疾患を検出し、診断し又は監視する方法を提供する。
【０１４１】
4.1 Sen2ΔEx8
本発明は、Sen2ΔEx8又はSen2ΔEx8と呼ぶ、Sen2のスプライス変異体をコードする核酸を提供する。上記Sen2ΔEx8は、ヒトSen2のスプライス変異体であり、ヒトSen2のゲノムDNA配列においてエクソン8を欠損している。図2は、2つのヒトSen2サブユニット（例えば、Hs Sen2及びSen2ΔEx8）のアミノ酸配列及び酵母サブユニットSc Sen 2pのアミノ酸配列の整列を表す。この配列の整列から、YRGGYモチーフ、酵母の５’スプライス部位（Sc Sen 2p）の活性部位及び古細菌（示さず）のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに高度の類似点があることが明らかである。上記配列の整列に基づけば、ヒトSen2ΔEx8は、ヒトSen2エンドヌクレアーゼに見られる、推定膜貫通ドメインを欠損しており、このことがヒト細胞におけるヒトSen2ΔEx8の局在に影響を与えていると考えられる。
【０１４２】
本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体を提供する。特に本発明は、配列番号11のヌクレオチド配列と同一の連続ヌクレオチド配列を含む核酸配列を提供する。本発明はまた、配列番号11のヌクレオチド配列もしくはその相補的核酸と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.8%同一の核酸配列をも提供する。本発明は、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50もしくはそれ以上の、配列番号11もしくはその相補的核酸のヌクレオチドのヌクレオチド配列における連続ヌクレオチドを含み、ここで上記ヌクレオチド配列が、配列番号11もしくはその相補的核酸のヌクレオチド910からヌクレオチド960を含む、核酸配列を提供する。本発明はまた、高ストリンジェントな条件下で、配列番号11もしくはその相補的核酸のヌクレオチド配列に対して、配列番号1の核酸配列の全長にわたってハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む、核酸配列を提供する。
【０１４３】
本発明は、配列番号12のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする連続ヌクレオチド配列を含む核酸配列を提供する。本発明はまた、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.8%同一のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする連続ヌクレオチド配列を含む、核酸配列を提供する。本発明はまた、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、少なくとも20、もしくは少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55もしくはそれ以上の、配列番号12のアミノ酸配列における連続アミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで上記ポリペプチドが配列番号12の311から327残基を含む、核酸配列を提供する。本発明はまた、高ストリンジェントな条件下で、配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸配列の全長にわたってハイブリダイズする核酸配列を提供する。
【０１４４】
本発明は、これに限定するものではないが、配列番号11の核酸などの、Sen2ΔEx8をコードする核酸配列を含有する、もしくは含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、これに限定するものではないが、配列番号11の核酸などの、Sen2ΔEx8をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含むベクターを提供する。本発明はまた、これに限定するものではないが、配列番号11の核酸などの、Sen2ΔEx8をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含むベクターを含有する、もしくは含む宿主細胞も提供する。宿主細胞を、Sen2ΔEx8をコードする核酸配列又はその機能的に活性な断片もしくは誘導体でトランスフェクトするために、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿及びリポソーム法といった、当業者に周知の技法を使用してよい。ベクター、トランスフェクション法及び宿主細胞の説明については、例えば、後述する、4.5.4.1.4節及び4.5.4.1.5節を参照されたい。ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は誘導体を精製するために、ヒトSen2ΔEx8に免疫特異的な抗体又はその機能的に活性な断片又は誘導体を用いた免疫沈降法といった、当業者に周知の技法を用いてよい。ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は誘導体などのタンパク質性物質を精製する方法の説明については、後述の4.3節を参照されたい。
【０１４５】
本発明は、ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片、又は機能的に活性な誘導体のアミノ酸配列を提供する。特に、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列を含む精製したタンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.8%同一の、精製したタンパク質を提供する。本発明はまた、高ストリンジェントな条件下で、配列番号11のヌクレオチド配列にその全長にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、精製したタンパク質を提供する。本発明はまた、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55もしくはそれ以上の、配列番号12のアミノ酸配列の連続アミノ酸を含み、配列番号12の311残基から327残基を含有する、精製したポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.8%同一のポリペプチドをコードする連続ヌクレオチド配列を含む精製したタンパク質を提供する。
【０１４６】
本発明はまた、ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体及び異種アミノ酸配列（例えば、異なったアミノ酸配列；ヒトSen2ΔEx8のアミノ酸配列と結合した天然には見られないアミノ酸配列）を含む融合タンパク質を提供する。
【０１４７】
4.2 本発明の複合体
4.2.1 tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体
本発明は、tRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、
上記複合体が、2つ又はそれ以上の、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。
【０１４８】
特に、本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。1つの実施形態においては、本発明はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、（i）ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2)）、或いは、ヒトSen2をコードする核酸（受託番号NM_025265，図20 (配列番号1)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸（受託番号NM_052965, 図22(配列番号3)、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトSen34（受託番号NP_076980,図23（配列番号6））は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び（iv）ヒトSen54（受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸（受託番号XM_0208944, 図24(配列番号7）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、を含む、上記複合体を提供する。
【０１４９】
特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１５０】
本発明はまた、tRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（v）ヒトClp1又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。
【０１５１】
特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は３’末端mRNAプロセシング活性を有する。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。特定の実施形態においては、上記複合体は、（i）ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片をさらに含んでもよい。
【０１５２】
1つの実施形態においては、本発明はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2)）、或いは、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265，図20(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸（受託番号NM_052965, 図22(配列番号3)、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトSen34（受託番号NP_076980,図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iv）ヒトSen54（受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸（受託番号XM_0208944,図24(配列番号7）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び（v）ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸（受託番号NM_006831，図25(配列番号9)）、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は３’末端mRNAプロセシング活性を有する。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。特定の実施形態においては、上記複合体は（i）ヒトCPSF160或いは、ヒトCPSF160をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトCPSF30或いは、ヒトCPSF30をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトCstF64或いは、ヒトCstF64をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン或いは、ヒトシンプレキンをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、をさらに含んでもよい。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１５３】
本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ、精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（v）ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25（配列番号10)）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vi）ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子（「CPSF」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vii）ヒト切断因子Im（「CFIm」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（viii）ヒト切断因子IIm（「CFIIm」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（ix）ヒト切断刺激因子（「CSF」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１５４】
CPSF、CstF、CFIm及びCFIImは、複数のサブユニットからなる。種々のサブユニットの受託番号を、下記の表1に示す。CPSF、CstF、CFIm及びCFIImは、各々異なるセットのサブユニットを含むことができる。特定の実施形態においては、CPSFは160kDの因子1及び30kDの因子4を含む。さらに特定の実施形態においては、CPSFは、160kDの因子1、100kDの因子2、73kDの因子3及び30kDの因子4を含む。特定の実施形態においては、CstFは、50kDのサブユニット1、64kDのサブユニット2及び77kDのサブユニット3を含む。さらに特定の実施形態においては、CstFは、50kDのサブユニット1、64kDのサブユニット2、77kDのサブユニット3及びシンプレキンを含む。特定の実施形態においては、CFImは、68kDのサブユニット及び25kDのサブユニットを含む。さらに特定の実施形態においては、CFImは、68kDのサブユニット、25kDのサブユニット、59kDのサブユニット及び72kDのサブユニットを含む。特定の実施形態においては、CFIImはClp1を含む。さらに特定の実施形態においては、CFIImはClp1及びhpcf11を含む。別のさらに特定の実施形態においては、CFIImは、Clp1、CFIm 25kDサブユニット及びCFIm 68kDサブユニットを含む。さらに別の特定の実施形態においては、CFIImは、Clp1、CFIm 25kDサブユニット及びCFIm 68kDサブユニット及びhpcf11を含む。
【０１５５】
シンプレキンに関する詳細な情報は、University of Baselバイオセンターのケラー博士の研究室のホームページ、及びTakagaki,Y. and J. Manley, 2000, Molecular & Cellular Biol 20: 1515-1525において得ることができる。
【０１５６】
Wahle and Ruegsegger, 1999, FEMS Micro Rev., 23,277-295 及び Zhoa et al., 1999, Micoboil. Mol. Biol. Rev., 63, 405-445は、RNAプロセシングに関与する因子について記載し、両参考文献とも本明細書にそのまま全て組み入れられる。
【０１５７】
特定の実施形態においては、CPSF及びCstFの全てのサブユニットは、各々、本発明の複合体中に存在する。
【表１】
表1: GenBank 受託番号
Figure 0004990621
Figure 0004990621
【０１５８】
1つの実施形態においては、本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2)）、或いは、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265，図20(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))或いは、ヒトSen15をコードする核酸（受託番号NM_052965，図22 (配列番号3)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトSen34（受託番号NP_076980, 図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iv）ヒトSen54（受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸（受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（v）ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸（受託番号NM_006831, 図25（配列番号9))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（vi）ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子（「CPSF」）或いは、ヒトCPSF又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（vii）ヒト切断因子Im（「CFIm」）或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（viii）ヒト切断因子IIm（「CFIIm」）或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び（ix）ヒト切断刺激因子（「CSF」）或いは、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有してもよい。
【０１５９】
さらに特定の実施形態においては、本発明の複合体は精製されている。
【０１６０】
特定の実施形態においては、本発明は、本発明の複合体のヒトタンパク質の相同体又は類似体を含む複合体を提供する。本発明の複合体の成分の相同体又は類似体は、本発明の複合体のヒトタンパク質と、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一である。誘導体は、例えば、融合タンパク質、上記タンパク質の変異体、又は化学的部分が連結したタンパク質の形態、であり得る。本発明の複合体の成分の断片は、物理的に上記複合体に統合される上記タンパク質成分の能力を保持しているタンパク質成分の一部分である。
【０１６１】
特定の実施形態においては、本発明の複合体のタンパク質成分は、同じ種に由来する。さらに特定の実施形態においては、上記タンパク質成分は全てヒトに由来する。別の特定の実施形態においては、上記タンパク質成分は全て哺乳動物に由来する。
【０１６２】
特定の他の実施形態においては、複合体の上記タンパク質成分は、非ヒト種、例えば、これに限定するものではないが、ウシ、ブタ、馬、猫、犬、ラット、マウス、霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザルといった猿）に由来する。特定の実施形態においては、1つ又はそれ以上のタンパク質成分がヒトに由来し、他のタンパク質成分はヒト以外の哺乳動物に由来して、キメラ複合体を形成する。
【０１６３】
4.2.2 3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体
本発明は、以下の2つ以上を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する、精製されたタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen2又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片、(iii)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vi)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(viii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(ix)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(x)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(xi)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(xii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(xiii)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１６４】
特に、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen2又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトSen15又は機能的に活性名誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片、(iii)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vi)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vii)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(viii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(ix)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１６５】
一つの実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製された複合体を提供する：(i)ヒトSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2))、或いは、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265，図20(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3)、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen34（受託番号NP_076980,図23（配列番号6）、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)Sen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831, 図25 (配列番号9)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、RNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。他の実施形態において、複合体は、(i)ヒト切断−ポリアデニル化特異性因子（CPSF）、或いは、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒト切断因子Im(CFIm)、或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒト切断因子IIm(CFIIm)、或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(iv)ヒト切断刺激因子（CSF）、或いは、ヒトCSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、を更に含む。
【０１６６】
本発明は、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有し、ヒトSen2ΔEx8を含む、精製されたタンパク質複合体を提供する。本発明は、以下に挙げるうちの2つ以上を含む精製されたタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(v)Clp1又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。特に、本発明は、以下を含む、3’末端プレmRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；及び(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。本発明はまた、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有するヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼのプロセシングとRNA構造のマッピングに有用である。
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(ii)ヒトSen15（受託番号NP_443197, 図22 (配列番号4)）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。別の実施形態において、本発明は、以下を含む精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトSen34（受託番号NP_076980,図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv)Sen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。これらの実施形態に従って、ヒトSen2ΔEx8複合体は、tRNAを複数の部位で切断する。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、3’エンドヌクレアーゼのプロセシングとRNA構造のマッピングに有用である。
【０１６８】
本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はtRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。一定の実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１６９】
本発明はまた、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(v)Clp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vi)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vii)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(viii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(ix)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１７０】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)ヒトSen34（受託番号NP_076980, 図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822，図25(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25(配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい；(i)ヒトCPSF160、又はヒトCPSF160をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトCPSF30、又はヒトCPSF30をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトCstF64、又はヒトCstF64をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv)ヒトシンプレキン、又はヒトシンプレキンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【０１７１】
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen15(受託番号NP_443197， 図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)ヒトSen34（受託番号NP_076980, 図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831, 図25(配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(vi)ヒトCPSF（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(vii)ヒトCFIm（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(viii)ヒトCFIIm（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(ix)ヒトCstF（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によって
コードされるタンパク質。
【０１７２】
本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(iii)ヒトClp1（受託番号NP_006822, 図25(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、RNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。一定の実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、更に以下を含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１７３】
別の実施形態において、精製された複合体は、以下を更に含む：(i)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(iv)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１７４】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(iii)ヒトClp1（受託番号NP_006822，図25(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25(配列番号9)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【０１７５】
ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、RNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度及び精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又はCPSF160をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトCPSF30又はCPSF30をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトCstF64又はCstF64をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又はシンプレキンをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【０１７６】
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトClp1（受託番号NP_006822，図25(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831，図25(配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)ヒトCPSF、或いは、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(v)ヒトCFIm、或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(vi)ヒトCFIIm、或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(vii)ヒトCstF、或いは、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【０１７７】
CPSF、CstF、CFIm及びCFIImは、複数のサブユニットからなる。異なるサブユニットの受託番号は、セクション4.2.1の表１に示す。CPSF、CstF、CFIm及びCFIImは、それぞれ、サブユニットの異なるセットを含むことができる。特定の実施形態において、CPSFは160kDの因子1と30kDの因子4を含む。より具体的な実施形態において、CPSFは160kDの因子1、100kDの因子2、73kDの因子3及び30kDの因子4を含む。特定の実施形態において、CstFは50kDのサブユニット1、64kDのサブユニット2及び77kDのサブユニット3を含む。より具体的な実施形態において、CstFは50kDのサブユニット1、64kDのサブユニット2、77kDのサブユニット3及びシンプレキンを含む。特定の実施形態において、CFImは68kDのサブユニット及び25kDのサブユニットを含む。より具体的な実施形態において、CFImは68kDのサブユニット、25kDのサブユニット、59kDのサブユニット及び72kDのサブユニットを含む。特定の実施形態において、CFIImはClp1を含む。より具体的な実施形態において、CFIImはClp1とhPcfllを含む。別のより具体的な実施形態において、CFIImはClp1、CFImの25kDのサブユニット及びCFImの68kDのサブユニットを含む。更に別のより具体的な実施形態において、CFIImはClp1、CFImの25kDサブユニット及びCFImの68kDのサブユニット及びhpcf11を含む。
【０１７８】
シンプレキンの詳細な情報は、バーセル（Basel）大学のバイオセンター、Keller博士の研究室のホームページとTakagaki, Y. and J. Manley, 2000, Molecular ＆ Cellular Biol 20: 1515-1525から得られる。
【０１７９】
Wahle及びRuegsegger, 1999, FEMS Micro Rev., 23,277-295及びZhoaら, 1999, Micoboil. Mol. Biol. Rev., 63,405-445に、RNAプロセシングに関係する因子について記載されており、これらの文献は、本明細書にそのまま組み込まれる。
【０１８０】
ある実施形態において、CPSFとCstFのすべてのサブユニットは、それぞれ、本発明の複合体に存在する。
【０１８１】
ある実施形態において、本発明は、構成成分が、本発明のタンパク質複合体のヒト構成成分の相同体又は類似体である、複合体を提供する。本発明の複合体のヒト構成成分の相同体又は類似体は、本発明の複合体のヒト構成成分に対して、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも99.5%同一である。誘導体は、例えば、融合タンパク質、タンパク質の突然変異型、またはタンパク質と結合した化学的部分を持つタンパク質の形でありうる。本発明の複合体の構成成分の断片は、複合体に物理的に組み込まれるという構成成分の能力を保持する、タンパク質構成成分の一部である。
【０１８２】
ある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分は、同じ種に由来する。より具体的な実施形態において、タンパク質構成成分はすべてヒトに由来する。別の特定の実施形態において、タンパク質複合体はすべて哺乳動物に由来する。
【０１８３】
他のある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分は、ヒトではない種に由来し、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、霊長類（例えばチンパンジー、カニクイザルなどのサル）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、１つ以上の構成成分はヒトに由来し、その他の構成成分はヒト以外の哺乳動物に由来し、キメラ複合体を生じる。
【０１８４】
4.2.3 tRNA切断複合体
本発明は、プレ-tRNA切断活性を有するSen2ΔEx8複合体を提供する。本発明は、以下に挙げるうちの２つ以上を含む、プレ-tRNA切断活性を有する精製されたタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSenl5又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(v)Clp1又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【０１８５】
ある実施形態において、本発明は、以下に挙げるうちの２つ以上を含む複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen34（受託番号NP_076980, 図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(iv)ヒトSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944，図24(配列番号7))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【０１８６】
本発明は、以下を含む、プレ-tRNA切断活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；及び(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。本発明はまた、以下を含む、プレ-tRNA切断活性を有するヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、tRNAを複数の部位で切断し、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼのプロセシングとRNA構造のマッピングに有用である。
【０１８７】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、プレ-tRNA切断活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。別の実施形態において、本発明は、以下を含む、精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトSen34（受託番号NP_076980,図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv)Sen54(受託番号XP_208944， 図24(配列番号8))、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944， 図24(配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又はCPSF160をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトCPSF30又はCPSF30をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトCstF64又はCstF64をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又はシンプレキンをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。それらの実施形態に従って、ヒトSen2ΔEx8複合体は、tRNAを複数の部位で切断する。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、3’エンドヌクレアーゼのプロセシングとRNA構造のマッピングに有用である。
【０１８８】
ある実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質複合体のヒト構成成分の相同体又は類似体である複合体を提供する。本発明の複合体のヒト構成成分の相同体又は類似体は、本発明の複合体のヒト構成成分に対して、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一である。誘導体は、例えば、融合タンパク質、タンパク質突然変異型、又はタンパク質と結合した化学的部分を持つタンパク質の形でありうる。本発明の複合体の構成成分の断片は、複合体に物理的に組み込まれるという構成成分の能力を保持する、タンパク質構成成分の一部である。
【０１８９】
4.2.4 リボソームRNA切断複合体
また、本発明はプレ-リボソームRNA切断活性を有する複合体を提供する。特に、本発明は、以下を含む、プレ-リボソームRNA切断活性を有するタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片、及び(ii)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。このタンパク質複合体は、異なるリボソームRNAの生合成に使用することができる。このタンパク質複合体をモジュレートすることにより、例えば、28S、18S、5.5S及び5SリボソームRNAを生成できる。
【０１９０】
特に、本発明は、プレ-リボソームRNA切断活性を有する複合体を提供し、ここでこの複合体は、以下を含む：ヒトSen34（受託番号NP_076980, 図23（配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075，図23(配列番号5))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及びヒトSen15(受託番号NP_443197，図22(配列番号4))、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965, 図22(配列番号3))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【０１９１】
ある実施形態において、本発明は、その構成成分が本発明のタンパク質複合体のヒト構成成分の相同体又は類似体である複合体を提供する。本発明の複合体のヒト構成成分の相同体又は類似体は、本発明の複合体のヒト構成成分に対して、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一である。誘導体は、例えば、融合タンパク質、タンパク質の突然変異型、又はタンパク質に結合した化学的部分を持つタンパク質の形でありうる。本発明の複合体の成分の断片は、複合体に物理的に組み込まれるという構成成分の能力を保持する、タンパク質構成成分の一部である。
【０１９２】
ある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分は、同じ種に由来する。より具体的な実施形態において、タンパク質構成成分はすべてヒトに由来する。別の特定の実施形態において、タンパク質構成成分はすべて哺乳動物に由来する。
【０１９３】
他のある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分は、ヒトではない種に由来し、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、霊長類（例えばチンパンジー、カニクイザルなどのサル）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、１つ以上の構成成分は、ヒトに由来し、その他の構成成分はヒト以外の哺乳動物に由来し、キメラ複合体を生じさせる。
【０１９４】
4.3 本発明の複合体の産生と精製
本発明の複合体は、当業者に知られている方法により製造できる。ある実施形態において、細胞で複合体の構成成分を同時発現して、その後、その複合体を精製することにより、複合体を製造することができる。特定のより具体的な実施形態において、細胞は、組換えDNA技術により、複合体の少なくとも１つの構成成分を発現する。別の実施形態において、細胞は、複合体の構成成分を正常に発現する。特定の他の実施形態において、複合体の構成成分は別々に発現され、ここで、その構成成分は、組換えDNA技術を使って発現させることができ、又は少なくとも１つの構成成分を、構成成分を正常に発現する細胞から精製する。複合体の個々の構成成分を、本発明の複合体の構成成分が互いに結合するような条件下で、インビトロでインキュベーションし、本発明の複合体を産生する。
【０１９５】
１つ以上の構成成分を組換えDNA技術で発現する場合、組換えタンパク質を製造するのに当業者に知られている方法を使用できる。本発明のタンパク質複合体の構成成分タンパク質の核酸配列とアミノ酸配列は、本明細書で提供されており（表１及び配列番号11-12参照）、当該技術分野で知られている方法、例えば、各配列の3’と5’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを用いたPCR増幅、及び/又は各ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたcDNA又はゲノムライブラリーからのクローニングにより、構成成分タンパク質の核酸配列とアミノ酸配列を得ることができる。
【０１９６】
タンパク質構成成分は、タンパク質精製と組換えタンパク質発現に関する当該技術分野で周知の方法により、単独の形で又は複合体の形で得ることができる。１つ以上のタンパク質を組換え発現させるため、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含む核酸配列を、適切な発現ベクターの中に挿入することができ、ベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む。また、必要な転写と翻訳シグナルを、構成成分タンパク質遺伝子の天然のプロモーター、及び/又はフランキング領域から供給できる。
【０１９７】
様々な宿主-ベクター系を、タンパク質コード配列を発現するのに利用することができる。宿主-ベクター系として、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物の細胞系、ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、又はバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNAで形質転換された細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、その強度と特異性が異なる。利用する宿主-ベクター系に応じて、多くの適切な転写と翻訳要素のうちのどれか１つを使用することができる。
【０１９８】
好ましい実施形態において、本発明の複合体は、構成成分タンパク質の完全なコード配列を、同じ細胞で、同じプロモーター又は別個のプロモーターの制御下のどちらかで発現させることにより得られる。更にもう一つの実施形態において、構成成分タンパク質の誘導体、断片又は相同体を、組換えで発現させる。好ましくは、タンパク質の誘導体、断片又は相同体は、複合体の別の構成成分と複合体を形成する。特定の実施形態において、タンパク質の構成成分は、抗複合体抗体に結合する複合体を形成する。
【０１９９】
適切な転写/翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列から成るキメラ遺伝子を含む発現ベクターを作製するために、当該技術分野で可能な方法を、DNA断片をベクターに挿入するのに使用できる。その方法として、インビトロでの組換えDNA及び合成技術、並びにインビボでの組換え技術（遺伝的組換え）を挙げることができる。構成成分タンパク質又は誘導体、それらの断片若しくは相同体をコードする核酸配列の発現は、その遺伝子又はそれらの断片を組換えDNA分子で形質転換した宿主で発現させるため、第二の核酸配列により調節することができる。例えば、タンパク質の発現を、当該技術分野で公知のプロモーター/エンハンサーで制御することができる。特定の実施形態において、プロモーターは構成成分タンパク質の遺伝子本来のものではない。ある実施形態において、使用可能なプロモーターは構成的(constitutive)プロモーターである。ある実施形態において、使用可能なプロモーターは誘導型（inducible）プロモーターである。ある実施形態において、使用可能なプロモーターは組織特異的プロモーターである。使用可能なプロモーターとして、SV40初期プロモーター(Bernoist及びChambon, 1981, Nature 290: 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296: 39-42);β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクター(Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731)又はtacプロモーター(DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25; Gilbertら, 1980, Scientific American 242: 79-94);ノパリン合成酵素プロモーターを含む植物の発現ベクター(Herrar-Estrellaら, 1984, Nature 303: 209-213)又はカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Garderら, 1981, Nucleic Acids Res. 9: 2871)、及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら, 1984, Nature 310: 115-120); Gal4プロモーターなどの酵母及び他の真菌類から得られるプロモーター要素(Johnstonら, 1987, Microbiol. Rev. 51: 458-476)、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(Schiblerら, 1987, Annual Review Genetics 21: 237-257)、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター(Struhlら, 1995, Annual Review Genetics 29: 651-674-257; Guarente 1987, Annual Review Genetics 21: 425-452)、アルカリホスファターゼプロモーター(Struhlら, 1995, Annual Review Genetics 29: 651-674-257; Guarente 1987, Annual Review Genetics 21: 425-452)、及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている、以下の動物の転写制御領域:膵臓腺房細胞（pancreatic acinar cell）で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら, 1984, Cell 38: 639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald 1987, Hepatology 7: 425-515);膵臓β細胞で活性なインシュリン遺伝子制御領域(Hanahanら, 1985, Nature 315: 115-122)、リンパ球で活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら, 1984, Cell 38: 647-658; Adamsら, 1985, Nature 318 : 533-538 ; Alexanderら, 1987, Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444)、精巣、乳房、リンパ球及びマスト細胞で活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域(Lederら, 1986, Cell 45: 485-495)、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinckertら, 1987, Genes and Devel. 1: 268-276)、肝臓で活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235: 53-58)、肝臓で活性なα-1アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171)、骨髄細胞で活性なβグロブリン遺伝子制御領域(Mogramら, 1985, Nature 315: 338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46: 89-94)、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら, 1987, Cell 48 : 703-712)、骨格筋で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani 1985, Nature 314: 283-286)、及び視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら, 1986, Science 234: 1372-1378)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
特定の実施形態において、構成成分タンパク質又はその断片、誘導体若しくは相同体、１つ以上の複製開始点及び、任意に、１つ以上の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）をコードする核酸配列と結合できるプロモーターを含むベクターを使用する。この実施形態に従って、当業者に公知のプロモーターを使用できる。プロモーターとして、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター又は誘導型プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
別の特定の実施形態において、構成成分タンパク質のコード配列又はその一部を含む発現ベクターは、一緒に又は別々に、３つのpGEXベクター（グルタチオンS-トランスフェラーゼ発現ベクター、Smith 及びJohnson, 1988, Gene 7: 31-40）のうちの１つの複数のクローニング部位に遺伝子配列をサブクローニングすることにより作製される。タンパク質の構成成分とGSTが１つの融合タンパク質として発現されるよう、そのタンパク質の構成成分をコードするヌクレオチド配列が、GSTをコードするヌクレオチド配列と同じリーディングフレームに存在するように注意すべきである。
【０２０２】
目的の配列を含む発現ベクターは、３つの一般的な方法：(1)核酸ハイブリダイゼーション、(2)「マーカー」遺伝子機能の存在又は不存在、及び(3)挿入された配列の発現、により同定することができる。一番目の方法では、挿入された配列と相同な又は相補的な配列を含むプローブに核酸ハイブリダイゼーションすることにより、コード配列を検出することができる。二番目の方法では、ベクターに目的の配列を挿入することにより生じる特定の「マーカー」機能（例えば抗生物質に対する耐性、バキュロウイルスでの包埋体（occlusion body）の形成）が存在するかしないかに基づいて、組換えベクター/宿主系を同定し、選択することができる。例えば、構成成分タンパク質遺伝子又はその一部をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、コードされるタンパク質又はその一部を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在（例えばβ-ガラクトシダーゼ活性の失活）により同定されるであろう。三番目の方法では、組換えベクターにより発現された構成成分タンパク質をアッセイすることにより、組換え発現ベクターを同定することができる。このようなアッセイは、例えば、インビトロのアッセイ系で相互作用する種の物理的又は機能的特徴、例えばタンパク質を含む複合体の形成又は抗-複合体抗体との結合に基づくことができる。発現されたタンパク質構成成分に特異的に向けられている抗体を使って、発現した配列を検出してもよい。ある実施形態において、発現された配列は、タンパク質構成成分の融合タンパク質であり、ペプチドタグを含み、ここでペプチドタグはGFPタグのように、目で見ることができる。
【０２０３】
組換え構成成分タンパク質分子が同定されて、複合体又は個々のタンパク質が精製されると、これらを増やすのに当該技術分野で知られている幾つかの方法を使用することができる。適切な宿主系と成長条件を使用して、組換え発現ベクターを増殖して量的に増幅させることができる。既に述べたように、使用可能な発現ベクター又は誘導体として、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスなどのヒト又は動物のウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；λファージなどのバクテリオファージベクター；プラスミド及びコスミドベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
更に、挿入された配列の発現をモジュレートしたり、又は所望の特定の方法で発現されたタンパク質を修飾したりプロセシングする宿主細胞系を選択できる。特定のプロモーターからの発現を、特定の誘導物質の存在下で高めることができ、このようにして遺伝的に操作された構成成分タンパク質の発現を制御することができる。更に、異なる宿主細胞は、翻訳と翻訳後のタンパク質のプロセシングと修飾（例えば糖修飾、リン酸化など）の特徴的な特定のメカニズムを有する。外来タンパク質の所望の修飾とプロセシングが行われるのを確実にするために、適切な細胞系統又は宿主系を選択することができる。例えば、細菌系で発現させることにより、糖修飾されていないコアタンパク質を作ることができ、また、哺乳動物細胞での発現により、異種タンパク質の「天然の」糖修飾を確実にする。その上、異なるベクター/宿主発現系により、プロセシング反応を異なる程度に実施できる。
【０２０５】
他の特定の実施形態において、構成成分タンパク質、又はその断片、相同体もしくは誘導体を、ペプチド結合を介して異種のタンパク質配列と結合したタンパク質、断片、相同体又は誘導体を含む、融合タンパク質又はキメラタンパク質生成物として発現させることができる。このようなキメラ生成物は、当該技術分野で知られている方法により、適切なコードフレーム内で、所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を互いに連結させることにより、また、当該技術分野で一般に知られている方法により適切な宿主でキメラ生成物を発現させることにより、作ることができる。あるいは、タンパク質合成技術、例えばペプチド合成機を使用して、そのようなキメラ生成物を作ることができる。何らかの異種タンパク質をコードする配列に融合された、構成成分タンパク質の一部を含むキメラ遺伝子を作製してもよい。
【０２０６】
特定の実施形態において、構成成分タンパク質の相互作用ドメインと、任意に、２つのドメイン間のペプチドリンカーを含む融合タンパク質を提供し、そのようなリンカーは、結合ドメインの相互作用を促進させる。これらの融合タンパク質は、例えば複合体に対する特異的な抗体の生成において、（分子内の反応として複合体が形成されるために）相互作用が安定していることが望まれる場合に、特に有用である。
【０２０７】
特に、タンパク質構成成分の誘導体は、機能的に同等の分子を提供する、置換、付加又は欠失による配列の変化により作ることができる。ヌクレオチドのコード配列の縮重の結果、本発明の実施において、構成成分の遺伝子又はcDNAと実質的に同じアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を使用することができる。この別のDNA配列の例として、その配列内で、機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により改変されてサイレント変化が生じた、構成成分タンパク質遺伝子の全部又は一部を含むヌクレオチド配列を挙げることができるが、これに限定されない。同様に、本発明の誘導体として、アミノ酸残基が配列内で機能的に同等のアミノ酸残基に置換されてサイレント変化が生じた改変された配列を含む、構成成分タンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を主要アミノ酸配列として含む誘導体が挙げられるが、これに限定されない。例えば、配列内の1つ以上のアミノ酸残基を、機能的に同等に働く類似した極性の別のアミノ酸で置換してもよく、その結果、サイレント変化が生じる。配列内でのアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選ぶことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性が中性のアミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。プラスにチャージした（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。マイナスにチャージした（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【０２０８】
本発明のタンパク質構成成分誘導体と類似体は、当該技術分野で公知の様々な方法で製造することができる。結果的にそれらを製造する操作は、遺伝子又はタンパク質レベルで起こすことができる。例えば、当該技術分野で公知の多数のストラテジー(Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)のいずれかにより、クローン化した遺伝子配列を修飾できる。配列を、制限酵素で適切な部位で切断して、その後更に、必要に応じて酵素的に修飾し、単離し、インビトロで連結してもよい。構成成分タンパク質の誘導体、相同体又は類似体をコードする遺伝子の製造において、修飾された遺伝子が所望の活性をコードする遺伝子領域で元の翻訳リーディングフレームを保持し、翻訳停止シグナルによって中断されないことを確実にするよう、注意すべきである。
【０２０９】
更に、コードしている核酸配列をインビトロ又はインビボで突然変異させることができ、翻訳、開始、及び/又は終止配列を作ったり及び/又は壊したり、又はコード領域に変化を作ったり及び/又は新しい制限酵素部位を作ったり又はその前にある部位を壊したり、インビトロの修飾を更に容易にすることができる。当該技術分野で公知の突然変異を誘発するための技術を使うことができ、化学的突然変異誘発及びインビトロでの部位特異的突然変異誘発(Hutchinsonら, 1978, J. Biol. Chem 253: 6551-6558)、突然変異を含むＰＣＲプライマーでの増幅、キメラオリゴヌクレオチドの使用などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１０】
構成成分タンパク質又はその断片若しくは誘導体を発現する組換え細胞が同定されると、個々の遺伝子の生成物又は複合体を精製したり分析することができる。これは、タンパク質又は複合体の物理的及び/又は機能的な性質に基づいてアッセイすることにより行うことができ、生成物の放射能標識とその後のゲル電気泳動、イムノアッセイ、マーカー標識生成物とのクロスリンクによる分析などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
当該技術分野で公知の標準的な方法で、構成成分タンパク質と複合体を、複合体又はタンパク質を発現する天然の供給源又は組換え宿主細胞のいずれかから精製することができ、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、ゲル排除、逆相高圧、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、分画遠心法、示差的溶解度（differential solubility）、又はタンパク質を精製するのに使用される別の標準的な方法が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野で知られた適切なアッセイを用いて、機能的な性質を評価することができる。本発明の構成成分及び複合体の精製手順のより詳細な説明については、以下を参照されたい。
【０２１２】
あるいは、構成成分タンパク質又はその誘導体が同定されると、そのタンパク質がコードされていたキメラ遺伝子の核酸配列からタンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。その結果、当該技術分野で公知の標準的な化学的方法(例えば、Hunkapillerら, 1984, Nature 310: 105- 111)により、タンパク質とその誘導体を合成することができる。
【０２１３】
構成成分タンパク質配列の操作は、タンパク質レベルで行うことができる。本発明の範囲内で、複合体には、構成成分タンパク質、又は例えば糖修飾、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子又は他の細胞リガンドとの結合などの、翻訳中又は翻訳後に区別をつけて改変された誘導体及び類似体が含まれる。公知の技術により、様々な化学的な改変を行ってもよく、臭化シアンによる特異的な化学的切断、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１４】
特定の実施形態において、アミノ酸配列を改変して蛍光標識を含有させる。別の特定の実施形態において、タンパク質配列を改変してヘテロ官能性（heterofunctional）試薬にする。このようなヘテロ官能性試薬は、複合体のメンバーを架橋するのに使用することができる。
【０２１５】
更に、構成成分タンパク質の類似体及び誘導体の複合体は、化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含むか又はインビトロで所望の活性（例えば複合体の形成）を調節する、構成成分タンパク質の一部に相当するペプチドを、ペプチド合成機を使って合成することができる。更に、必要であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を、置換するか又は付加してタンパク質の配列の中に導入することができる。非古典的アミノ酸として、一般的なアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸(4-Abu)、2-アミノ酪酸(2-Abu)、6-アミノヘキサン酸(Ahx)、2-アミノイソ酪酸（2-Aib）、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サリコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、あるいはβ-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸及び一般的なアミノ酸類似体などのデザイナーアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。更に、アミノ酸はD（右旋性）又はL（左旋性）でもよい。
【０２１６】
天然の生成物が突然変異体であると考えられるか又は新しい種から精製される場合、インビトロで発現された構成成分タンパク質のアミノ酸配列と同じように天然源から精製された構成成分タンパク質のアミノ酸配列、又はインビボもしくはインビトロで合成された発現ベクターから精製された構成成分タンパク質のアミノ酸配列は、DNA配列の分析から決定するか、或いは精製されたタンパク質を直接配列決定することにより決定することができる。このような分析は、マニュアルで配列決定するか又は自動アミノ酸シークエンサーを使用して行うことができる。
【０２１７】
また、複合体を親水性分析(Hopp及びWoods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828)で分析することもできる。親水性の特徴は、タンパク質の疎水性領域と親水性領域を同定するのに使用することができ、また、結合実験、抗体合成などの実験操作用の基質の設計において疎水性領域と親水性領域の方向を予測するのに役立つ。また、副次的な構造分析も、特有の構造が想定される構造成分タンパク質の領域又はその誘導体を同定するために行うことができる(Chou及びFasman, 1974, Biochemistry 13: 222-23)。操作、翻訳、副次的な構造の予測、親水性及び疎水性の特徴の予測、オープンリーディングフレームの予測及びプロッティング、配列相同性の決定などは、当該技術分野で利用できるコンピューターソフトウエアプログラムを使って行うことができる。
【０２１８】
また、他の構造的分析、例えばX線結晶学(Engstrom, 1974 Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13)、質量分析及びガスクロマトグラフィー(Methods in Protein Science, J. Wiley及びSons, New York, 1997)、及びコンピューターモデリング（Fletterick及びZoller編, 1986, Current Communications in Molecular BiologyのComputer Graphics and Molecular Modeling, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New Yorkにある）を行うことができるが、これらに限定されない。
【０２１９】
ある実施形態において、複合体の少なくとも１つの構成成分は、組換えDNA技術で生成され、かつ天然に生じるタンパク質の誘導体である。ある実施形態において、その誘導体は融合タンパク質であり、ここで、上記天然で生じるタンパク質のアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列と融合される。この第２のアミノ酸配列は、タンパク質の視覚化と同じように、精製、免疫学的検出及び同定を容易にするペプチドタグでありうる。アフィニティークロマトグラフィーによる構成成分又はその構成成分を含む複合体の精製を容易にするために、異なる機能と親和性を持つ様々なペプチドタグを本発明に使用することができる。特定のペプチドタグはイムノグロブリンの定常領域を含む。別の実施形態において、タンパク質構成成分を発現する細胞からのタンパク質構成成分の分泌を促進させるため、構成成分をリーダー配列と融合させる。本発明で使用できる他のペプチドタグとして、FLAGエピトープ又はポリヒスチジンタグ、例えばHisx6タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
複合体の構成成分を同時発現する場合、免疫沈降、硫安分画、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む、当業者に公知の方法により、複合体を精製することができる。
【０２２１】
本明細書に記載した方法を、本発明の複合体の個々の構成成分を精製するのに使用することができる。また、それらの方法を、完全な複合体を精製するのに使用することもできる。一般的に、複合体の解離定数だけでなく精製条件によっても、精製の手順中に複合体が無傷のままであるかどうかが決まるであろう。そのような条件として、塩濃度、界面活性剤の濃度、pH及び酸化還元電位が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
複合体の少なくとも１つの構成成分がペプチドタグを含む場合、本発明は、ペプチドタグの特性に基づく本発明の複合体の精製方法も意図する。ひとつの方法は、タグとその結合パートナーの間の特異的な分子相互作用に基づく。別の方法は、タグ上に存在するエピトープに抗体を免疫特異的に結合させることに基づく。当該技術分野で周知のアフィニティークロマトグラフィーの原理は、これらの方法の両方に一般的に適用できる。別の実施形態において、免疫沈降を使って複合体を精製する。
タグとその結合パートナーの特異的な分子相互作用に基づくいくつかの方法について、以下のセクション4.3.5で述べる。セクション4.3.5で述べる実施形態は、複合体のタンパク質構成成分を別々に回収及び精製するのに使用でき、又は本発明の複合体を回収及び精製するのに使用できる。pHの低下又は変性条件を必要としない方法が、複合体の精製にとって最も好ましい。
【０２２３】
ある実施形態において、本発明の複合体の個々の構成成分を別々に発現させる。続いて、複合体の構成成分が互いに結合して複合体を生成するような条件下で、構成成分をインキュベーションし、複合体を生成させる。特定のより具体的な実施形態において、複合体形成の前に構成成分を精製する。別の実施形態において、構成成分を発現する細胞の上清（構成成分が分泌される場合）または構成成分を発現する細胞の細胞溶解物（構成成分が分泌されない場合）を、まず１つに合わせて、複合体を生じさせ、次にその複合体を精製する。互いに結合するという本発明の構成成分の能力に影響を与えるパラメーターとして、塩濃度、界面活性剤の濃度、pH、及び酸化還元電位が挙げられるが、これらに限定されない。複合体が形成されると、当業者に公知の方法により、複合体を精製又は濃縮できる。ある実施形態において、複合体を、濾過により、残っている個々の構成成分から分離する。フィルターの孔径は、個々の構成成分はフィルターを通過できるが複合体はフィルターを通過しないようなサイズであるべきである。複合体を濃縮するための他の方法として、ショ糖勾配遠心法及びクロマトグラフィーが挙げられる。
【０２２４】
4.3.1 構成成分の相同体、誘導体及び断片
ある実施形態において、本発明の複合体の少なくとも１つの構成成分は、本発明の複合体のタンパク質構成成分の、相同体、誘導体（例えば機能的に活性な誘導体）、断片（例えば機能的に活性な断片）である。本発明のある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分の相同体、誘導体又は断片は、他の構成成分と複合体を更に形成することができる。複合体の形成は、当業者に公知の方法でテストすることができる。そのような方法として、非変性PAGE、FRET及び蛍光偏光アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
ある実施形態において、複合体のタンパク質構成成分の断片は、天然のタンパク質のタンパク質構成成分の、少なくとも6(連続)アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、又は少なくとも500アミノ酸から成る。特定の実施形態において、そのようなフラグメントは、40アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸、300アミノ酸、400アミノ酸、又は500アミノ酸以下である。より具体的な実施形態において、機能的な断片は、本発明の複合体を形成でき、言い換えれば、その断片は依然として少なくとも１つの他のタンパク質構成成分と結合して、本発明の複合体を形成することができる。
【０２２６】
構成成分タンパク質の誘導体又は類似体として、同一サイズのアミノ酸配列にわたって、又は整列した配列と比較したときに（当業者に公知のコンピューター相同性プログラムによって配列比較が行われる）、様々な実施形態において、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%同一である、構成成分タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子、或いは、ストリンジェントな、中ストリンジェントな、又はストリンジェントでない条件下で、構成成分タンパク質をコードする配列にハイブリダイズできる核酸をコードする領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
また、構成成分タンパク質の誘導体又は類似体として、(i)同一サイズのアミノ酸配列にわたって、又は整列した配列と比較したときに（当業者に公知のコンピューター相同性プログラムによって配列比較が行われる）、様々な実施形態において、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%同一である、構成成分と実質的に相同な領域を含む分子、或いは、ストリンジェントな、中ストリンジェントな、又はストリンジェントでない条件下で、構成成分タンパク質をコードする配列にハイブリダイズできる核酸をコードする領域を含む分子；(ii)本発明の複合体を形成できる分子、が挙げられるが、これらに限定されない。更にまた、構成成分タンパク質の誘導体または類似体として、同一サイズのアミノ酸配列にわたって、又は整列した配列と比較したときに（当業者に公知のコンピューターの相同性プログラムによって配列比較が行われる）、様々な実施形態において、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%同一である、構成成分と実質的に相同な領域を含む分子、或いは、ストリンジェントな、中ストリンジェントな、又はストリンジェントでない条件下で、構成成分タンパク質をコードする配列にハイブリダイズできる核酸をコードする領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、誘導体を含む複合体は、RNA-核酸分解活性（例えば、本発明の複合体のプレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ-tRNA切断活性、及び/又は本発明の複合体のプレ-リボソームRNA切断活性）を有する。
【０２２８】
タンパク質構成成分の誘導体として、本発明の複合体のタンパク質構成成分と異種アミノ酸配列の融合タンパク質、本発明の複合体のタンパク質構成成分の突然変異体、及び本発明の複合体のタンパク質構成成分の化学的修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分の機能的な誘導体は、本発明の複合体を形成することができ、即ち、誘導体は、少なくとも１つの他のタンパク質構成成分と結合して、本発明の複合体を更に形成できる。
【０２２９】
天然の細胞のタンパク質複合体のメンバーである、相同体（例えば他の種から得られる構成成分タンパク質をコードする核酸）または他の関連する配列（例えばパラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションとクローニングにおける当該技術分野で周知の方法を使って、特定の核酸配列の全部又は一部をプローブとして用いて、低、中又は高ストリンジェントなハイブリダイゼーションにより、同定して得ることができる。
【０２３０】
ある実施形態において、最初のタンパク質の相同体は、その最初のタンパク質が結合するタンパク質と同じタンパク質に結合する。一定のより具体的な実施形態において、最初のタンパク質の相同体は、その最初のタンパク質が結合するタンパク質と同じタンパク質に結合し、ここで、相同体と最初のタンパク質の結合パートナーとの間の結合親和性は、最初のタンパク質と結合パートナーとの間の結合親和性の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%である。タンパク質間の結合親和性は当業者に公知の方法により決定することができる。
【０２３１】
ハイブリダイゼーションの条件として、温度、塩濃度、pH、ホルムアミド濃度などが挙げられ、当業者に周知であるが、これらに限定されない(例えばSambrookら, 1989, Chapters 9〜11, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照)。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションは水溶液中で行われ、水溶液のイオン強度は一定に保たれるが、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズされる配列間の配列の相同性の程度によって変わる。互いに100%同一で200塩基対よりも長いDNA配列において、ハイブリダイゼーションは、完全なハイブリッドの融解温度(Tm)より約15-25℃低い温度で行なわれる。融解温度（Tm）は、以下の式(Bolton及びMcCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1390 (1962))を使って計算できる：
Tm＝81.5℃−16.6(log10[Na＋])＋(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−(600/1)
ここで、(Tm)は、融解温度であり、[Na＋]は、ナトリウム濃度であり、 G+Cは、グアニンとシトシン含有量であり、1は、ハイブリッドの長さ（塩基対）である。配列間の不一致の影響は、Bonnerら(Bonnerら, 1973, J. Mol. Biol. 81: 123-135)による式を使って計算できる。即ち、ハイブリッド中の塩基の不一致が1％毎に、融解温度が1〜1.5℃下がる。
【０２３２】
従って、２つの配列のハイブリッドのハイブリダイゼーション温度をお互いの相同性の特定の割合で決定し、その決定したハイブリダイゼーション温度を、２つの配列の完全なハイブリッドが形成される温度と比較することにより、２つの配列間の配列の違いを推定することが可能になる。
【０２３３】
そのような高ストリンジェントな条件を使用する手順は次のとおりであるが、一例であり、これに限定されない。DNAを含む、フィルターのプレハイブリダイゼーションを、6X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% フィコール、0.02% BSA及び500μg/mlの変性したサケの精子DNA、で構成されるバッファーで、65℃で8時間〜一晩行う。フィルターを、100μg/mlの変性したサケの精子DNAと5-20 X 106 cpmの32P-標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液で、65℃で48時間、ハイブリダイゼーションする。フィルターの洗浄を、2X SSC、0.01%PVP、0.01%フィコール及び0.01%BSAを含む溶液で、37℃で1時間行う。その後、オートラジオグラフィーの前に50℃で45分間、0.1X SSCで洗浄する。使用してよい高ストリンジェントな他の条件は、当該技術分野で周知である。それとは別に、高ストリンジェントなもう一つの系は、以下の通りである：0.5M NaPO4、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1mM EDTA中、65℃で、フィルター結合DNAにハイブリダイゼーションし、68℃で0.1ｘSSC/0.1%SDSで洗浄する(Ausubel F. M.ら,編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., 及びJohn Wiley ＆ sons, Inc., New York, p.2.10.3)。使用してよい高ストリンジェントな他の条件は、当該技術分野で周知である。
【０２３４】
本発明の別の実施形態において、中又は低ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行い、そのような条件は、当業者に周知である(例えばSambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausubelら,編,Molecular Biology series of laboratory technique manualsのthe Current Protocols, 1987-1997 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley ＆ sons, Inc.を参照)。例となる低ストリンジェントな条件は、以下のバッファー系により提供される：35%ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02%PVP、0.02%フィコール、0.2%BSA、100μg/mlの変性したサケの精子DNA及び10%(重量/体積)硫酸デキストランを含むバッファーで、40℃で18〜20時間、ハイブリダイゼーションし、2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA及び0.1% SDSから成るバッファーで、55℃で1.5時間、洗浄し、2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA及び0.1% SDSから成るバッファーで、60℃で1.5時間、洗浄する。
【０２３５】
例示的な中ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、6X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02%PVP、0.02%フィコール、0.02%BSA及び500μg/mlの変性したサケの精子DNAで構成されるバッファーで、65℃で8時間〜一晩行う。100μg/mlの変性したサケの精子DNAと5-20 X 106 cpmの32P-標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液で65℃で48時間、フィルターをハイブリダイズする。2X SSC、0.01%PVP、0.01%フィコール及び0.01%BSAを含む溶液で37℃、1時間、フィルターの洗浄を行う。その後、オートラジオグラフィーの前に0.1X SSCで、50℃で45分間洗浄する。
【０２３６】
4.3.2 サブユニット間の架橋
本発明のある実施形態において、本発明の複合体の少なくとも２つの構成成分を、少なくとも１つの共有結合を介して互いに結合させる。本発明の複合体の構成成分間の共有結合は、構成成分の解離を抑制するので、本発明の複合体の安定性を高める。本発明の少なくとも２つの構成成分間を共有結合させるのに、当業者に公知の方法を用いることができる。
【０２３７】
特定の実施形態において、近接するサブユニット間に共有結合性の架橋を導入する。二量体の境界面の向かい合っている側面にあるアミノ酸の側鎖の間で、このような架橋ができる。二量体の境界面でタンパク質構成成分間の共有結合を作るのに、適切な架橋試薬と組合わせた二量体の境界面のアミノ酸残基の任意の官能基を使用することができる。二量体の境界面に存在するアミノ酸を使ってもよいし、或いは、部位特異的突然変異誘発により適切なアミノ酸を導入してもよい。
【０２３８】
例示的な実施形態において、二量体の境界面の向かい合っている側面にあるシステイン残基を酸化してジスルフィド結合を形成する。例えば、Reznikら, 1996, Nature Biotechnology 14: 1007- 1011, 1008ページを参照されたい。また、1,3-ジブロモアセトンを使って、二量体の境界面にある２つのスルフヒドリル基の間に不可逆な共有結合を作ってもよい。別のある実施形態において、二量体の境界面にあるリジン残基を使って、複合体のタンパク質構成成分間に共有結合を作る。リジン残基のεアミノ基間の共有結合を作るのに使用可能なクロスリンカーとして、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート；ジメチルアジピミダート-2HD1；ジスクシンイミジルグルタラート；N-ヒドロキシスクシンイミジル-2,3-ジブロモプロピオナートがあるが、これらに限定されない。
【０２３９】
4.3.3 融合複合体
特定の実施形態において、本発明の複合体の少なくとも２つの構成成分は、融合タンパク質、即ち融合複合体として発現される。当業者に公知の組換えDNA技術を使って、融合複合体をコードするDNAを作製することができる。2つ以上のオープンリーディングフレームが互いに一緒にインフレームでクローニングされることに注意すべきである。融合タンパク質を発現させて精製するのに、当業者に公知の方法を使うことができる。本明細書で例示的な方法を説明する。より特定の実施形態において、融合タンパク質を形成する２つの構成成分を、リンカーペプチドを介して互いに連結させる。従って、融合複合体は、第一の構成成分タンパク質のORF、リンカーペプチドをコードするORF及び第二の構成成分タンパク質をコードするORFによってコードされる。理論にとらわれることなく、リンカーペプチドは、空間的に近接している複合体の２つの構成成分を保持しており、従って２つの構成成分の相互に結合している比率が上がるので、本発明の複合体が安定化される。
【０２４０】
4.3.4 ペプチドタグ及び/又はリーダーペプチド融合
本発明の複合体のタンパク質構成成分は、ペプチドタグを含む融合タンパク質でありうる。ある実施形態において、リーダーペプチドをタンパク質構成成分と融合させてもよく、それにより分泌のための小胞体（ER）へのタンパク質構成成分の運搬が促進される。
【０２４１】
様々な実施形態において、そのような融合タンパク質は、本発明の複合体のタンパク質構成成分をコードする遺伝子配列をペプチドタグ又は適切なリーディングフレームのリーダーペプチドをコードする配列と連結させることにより、作製することができる。ゲノム配列を使う場合、改変された遺伝子が同じ翻訳リーディングフレーム内に保持され、翻訳停止シグナル及び/又は偽のメッセンジャーRNAスプライシングシグナルにより中断されないことを確実にするように注意すべきである。
【０２４２】
特定の実施形態において、ペプチドタグを、そのペプチドタグのアミノ末端で、タンパク質構成成分のORFのカルボキシル末端と融合させる。カルボキシル末端でなされた融合の正確な部位は重要ではない。例えば、ペプチドタグは、タンパク質構成成分をコードするORFの部分を置換してもよい。最適な部位は、日常的な実験により決定できる。
【０２４３】
当該技術分野で公知の様々なペプチドタグを、本発明の複合体のタンパク質構成成分の融合タンパク質を生成するのに使用することができ、例えば、イムノグロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列(Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 編集 Ausubelら, Greene Publish. Assoc. ＆ Wiley Interscience)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4: 220-229)、大腸菌マルトース結合タンパク質(Guanら, 1987, Gene 67: 21- 30)、及び様々なセルロース結合ドメイン(米国特許第5,496,934号、第5,202,247号、第5,137,819号; Tommeら, 1994, Protein Eng. 7: 117-123)などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのペプチドタグは、融合タンパク質に新規な構造的な特性、例えば多量体を形成する能力を生じさせることができる。ホモ二量体化又はホモ重合を促進させるペプチドタグは、普通はホモポリマーとして存在するタンパク質に通常由来する。CD8の細胞外ドメイン(Shiueら, 1988, J. Exp. Med. 168: 1993-2005)又はCD28(Leeら, 1990, J. Immunol. 145: 344-352)、又は鎖間のジスルフィド結合の部位を含むイムノグロブリン分子の一部などのペプチドタグは、多量体の形成を導くこともありうる。ある実施形態において、ホモ二量体又はホモ多量体の形成は、本発明の複合体の形成を妨害しうる。このような場合、ホモ二量体又はホモ多量体の形成を促進しないペプチドタグを使うべきである。
【０２４４】
他の可能なペプチドタグは、モノクローナル抗体が利用できる短いアミノ酸配列であり、よく知られた例として、FLAGエピトープ、アミノ酸408-439のmycエピトープ、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）エピトープが挙げられるが、これらに限定されない。他のペプチドタグは、特異的な結合パートナーにより認識され、従って結合パートナーに対する結合親和性により単離が容易になり、結合パートナーは、固定化され及び/又は固体の支持体にあることが好ましい。当業者に理解されているように、上記のペプチドタグのコード領域を得るために多くの方法、例えばDNAクローニング、DNA増幅及び合成方法を使用することができるが、これらに限定されない。ペプチドタグのいくつかとその検出及び単離用試薬は市販されている。
【０２４５】
ある実施形態において、異なるペプチドタグの組み合わせを、本発明の複合体のタンパク質構成成分の精製又は複合体の精製に使用する。ある実施形態において、少なくとも１つの構成成分は、少なくとも２つのペプチドタグ、例えばFLAGタグとHisタグを持つ。異なるタグを、一緒に融合してもよいし、異なる位置でタンパク質構成成分と融合してもよい。精製の手順において、異なるペプチドタグは、精製に、連続して又は同時に用いられる。ある実施形態において、少なくとも２つの異なる構成成分をペプチドタグと融合し、ここで、２つの構成成分のペプチドタグは同じでもよいし、異なってもよい。複合体の精製において、違うタグの構成成分を使用することにより、複合体のみを精製することを確実にし、また、複合していないタンパク質構成成分、例えば単量体又はホモ二量体などの量を最小限にする。
【０２４６】
特異的なペプチドタグは、イムノグロブリン分子の非可変部分である。典型的には、そのような部分は、少なくとも、イムノグロブリンの重鎖の定常領域の機能的なCH2及びCH3ドメインを含む。また融合は、定常領域のFc部分のカルボキシル末端、又は重鎖もしくは軽鎖のCH1にすぐ近くのアミノ末端領域を使って融合される。適切なイムノグロブリンに基づくペプチドタグは、IgG-1、-2、-3又は-4サブタイプ、IgA、IgE、IgD、又はIgMから得ることができるが、好ましくはIgG1である。好ましくは、タンパク質構成成分をヒトに対してインビボで使用しようとする場合、ヒトイムノグロブリンが使用される。軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするDNA配列は、周知であり、cDNAライブラリーから簡単に入手できる。特定の実施形態において、そのようなDNA配列をPCRを使って増幅することができる。例えば、Adamsら, Biochemistry, 1980,19 : 2711-2719; Goughら, 1980, Biochemistry, 19: 2702-2710; Dolbyら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 6027-6031; Rice ら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 7862-7865; Falknerら, 1982, Nature, 298 : 286-288 ;及びMorrisonら, 1984, Ann. Rev. Immunol, 2: 239-256を参照されたい。多くの免疫学的試薬と標識システムをイムノグロブリンの検出に使用できるので、当該技術分野で知られている様々な免疫学的技術、例えば酵素免疫測定法（ELISA）、免疫沈降、蛍光発色細胞ソーティング（FACS）などの使用により、本発明の複合体のタンパク質構成成分の融合タンパク質を容易に検出、定量できる。同様に、ペプチドタグが、簡単に利用できる抗体と一体になったエピトープであれば、そのような試薬を、ペプチドタグを含む本発明の複合体の融合タンパク質を検出、定量、単離するのに、上述の技術と一緒に使用することができる。
【０２４７】
特定の実施形態において、タンパク質構成成分を、マウスのイムノグロブリンG-1(IgG-1)のヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合する(Bowenら, J. Immunol. 156: 442-9)。このペプチドは３つのシステイン残基を含み、３つのシステイン残基は、普通、Ig分子の他のシステインと一緒にジスルフィド結合に含まれる。システインは、ペプチドに対してタグとしての機能を要求されないので、これらのシステイン残基の１つ以上を別のアミノ酸残基、例えばセリンで任意に置換してもよい。
【０２４８】
当該技術分野で知られている様々なリーダー配列を、細菌及び哺乳動物細胞から得られる本発明の複合体のタンパク質構成成分の効率的な分泌に使用することができる(von Heijne, 1985, J. Mol. Biol. 184: 99-105)。リーダーペプチドは、意図された宿主細胞に基づいて選択され、細菌、酵母、ウイルス、動物及び哺乳動物の配列を含んでもよい。例えば、ヘルペスウイルスグリコプロテインDリーダーペプチドは、様々な哺乳動物の細胞で使用するのに適切である。哺乳動物細胞で使用する好ましいリーダーペプチドは、マウスイムノグロブリンのκ鎖のV-J2-C領域から得ることができる(Bernardら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5812-5816)。
【０２４９】
公知の、又はライブラリー若しくは市販している供給業者から容易に入手可能な、所望のペプチドタグ又はリーダーペプチドをコードするDNA配列は、本発明の実施に適切である。
【０２５０】
4.3.5 本発明の複合体の精製
本発明の複合体は、当業者に公知の方法により精製できる。また、複合体の精製に関して述べた方法も、個々のタンパク質構成成分を精製するのに使用できる。ある実施形態において、複合体はそれ自体の発現系で形成され、ここで発現系は、例えば細胞又は無細胞発現系（TNT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega Corporation, Madison WIから市販されている)が可能である。タンパク質構成成分が発現されて複合体が形成されると、当業者に公知の方法により、発現系の他の構成成分と個々のタンパク質構成成分から複合体を精製する。発現系が細胞である場合、タンパク質構成成分が発現され、複合体が形成されると、細胞を溶解して、次に、溶解物から本発明のタンパク質複合体を精製する。ある他の実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分を発現させて個々に精製して、続いてその精製された構成成分を組合わせて複合体を形成させる。個々のタンパク質構成成分は、当業者に公知の方法で精製することができる。
【０２５１】
ある実施形態において、複合体に特異的な抗体を使うアフィニティークロマトグラフィーで複合体を精製する。他の実施形態において、複合体をその次の精製工程を行うことにより精製し、ここで、精製された複合体が単量体のタンパク質構成成分を含まないよう確実にするため、複合体に異なるタンパク質構成成分が存在することが各工程に必要となる。それぞれ個々の精製工程は、例えばタンパク質構成成分のペプチドタグに基づいてもよいし（タンパク質精製におけるペプチドタグの使用のより詳細な説明については以下を参照）、又はタンパク質構成成分に対して特異的な抗体を使用するアフィニティー精製でもよい。複合体の精製に使用される抗体が、タンパク質構成成分の結合の境界面に位置するエピトープを対象としないように注意すべきである。
【０２５２】
ある実施形態において、本発明の複合体を、複合体の少なくとも１つのタンパク質構成成分と融合するタンパク質タグを介して精製する。より具体的な実施形態において、複合体の２つのタンパク質構成成分をペプチドタグと融合させ、１つのタンパク質構成成分を、もう１つのタンパク質構成成分が融合したペプチドタグと異なるペプチドタグに融合させる。複合体をその１つのペプチドタグを介してまず精製し、その後もう１つのペプチドタグを介して精製して、単量体のタンパク質構成成分が精製された複合体に存在しないよう確実にする。
【０２５３】
イムノグロブリンの定常領域と融合されたタンパク質構成成分、又はイムノグロブリンの定常領域と融合された構成成分を含む複合体を精製するのに一般的に適用できる方法は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、即ち当該技術分野で周知の技術である。スタフィロコッカスプロテインAは、重鎖イムノグロブリンの第２及び第３定常領域の間に位置する領域に対して特異的に結合する42kDのポリペプチドである。イムノグロブリンの異なるクラス、サブクラス及び種のFcドメインの理由から、ヒトFc領域に対するプロテインAの親和性は強いが、親和性は他の種により変わりうる。あまり好ましくないサブクラスとしては、ヒトIgG-3及びほとんどのラットのサブクラスが挙げられる。特定のサブクラスに対して、精製でプロテインAの代わりに(連鎖球菌の)プロテインGを使うことができる。プロテイン-Aセファロース(Pharmacia又はBiorad)は、抗体のアフィニティー精製に一般的に使われる固相であり、基本的に同じ方法で、イムノグロブリンFcフラグメントに融合されるタンパク質構成成分の精製に使用できる。イムノグロブリンの定常領域に融合されるタンパク質構成成分、又はイムノグロブリンの定常領域に融合される構成成分を含む複合体は、固相上のプロテインAと特異的に結合し、更に汚染物質が洗い流される。イムノグロブリンの定常領域に融合される結合したタンパク質構成成分又はイムノグロブリンの定常領域に融合される構成成分を含む複合体を、当該技術分野で公知の様々なバッファー系で溶出することができ、pHを徐々に低くする、クエン酸、酢酸及びグリシン-HClバッファーの一連の操作が挙げられる。この方法は、イムノグロブリンの定常領域に融合されるタンパク質構成成分又はイムノグロブリンの定常領域に融合される構成成分を含む複合体と一緒に同時精製されるであろう抗体を、組換え細胞が産生する場合には、あまり好ましくない。例えば、Langone, 1982, J. Immunol. meth. 51: 3; Wilchekら, 1982, Biochem. Intl. 4: 629; Sjobringら, 1991, J. Biol. Chem. 26: 399; Antibodies A Laboratory Manual, Harlow及びLane編,
Cold Spring Harbor laboratory, 1988のp.617-618を参照されたい。
【０２５４】
或いは、ポリヒスチジンタグを使ってもよく、この場合、ポリヒスチジンタグに融合されるタンパク質構成成分又はポリヒスチジンタグに融合される構成成分を含む複合体を、金属キレートクロマトグラフィーで精製できる。ポリヒスチジンタグ、通常は６つのヒスチジンの配列であるが、２価の金属イオン、例えばニッケルイオン(Ni2+)に対して高い親和性を有し、固相、例えばニトリロ三酢酸-マトリックスに固定化できる。ポリヒスチジンはNi2+-NTA-アガロースに対して十分に特徴づけられた親和性を有し、２つの穏やかな処理：結合部位に対してイミダゾール（0.1〜0.2M)が樹脂と効果的に競合する処理、又はpHを6.0を少し下回るように低くすることによりヒスチジン側鎖をプロトン化して結合を破壊する処理、のどちらかで、ポリヒスチジンを溶出できる。この精製方法は、Ni2+-NTA-アガロースカラムに細胞培養の上清を載せる工程、汚染物質を洗い流す工程、及びポリヒスチジンタグに融合されるタンパク質構成成分又はポリヒスチジンタグに融合される構成成分を含む複合体をイミダゾール又は弱い酸で溶出する工程を含む。 Ni2+-NTA-アガロースは、Sigma (St. Louis)及びQiagenなどの市販している供給業者から得ることができる。また、ポリヒスチジンタグを認識する抗体も入手可能であり、ポリヒスチジンタグに融合されるタンパク質構成成分又はポリヒスチジンタグに融合される構成成分を含む複合体を検出及び定量するのに使用できる。
【０２５５】
使用可能な別の例示的なペプチドタグは、寄生虫である、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）から本来クローニングされた、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）配列である。一般的に、宿主細胞で発現された、タンパク質構成成分-GST融合体又はタンパク質構成成分-GST融合体を含む複合体を、グルタチオンアガロースビーズで吸収して、その後中性のpHで遊離の還元型グルタチオンの存在下で溶出することにより、細胞培養の上清から精製することができる。精製中のどんな段階であっても変性条件は必要ないので、複合体の精製にとって望ましいであろう。更に、GSTは一定の条件下で二量体を形成することが知られているので、二量体のタンパク質構成成分が得られる。Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4: 220-229を参照されたい。
【０２５６】
使用可能な別の有用なペプチドタグは、大腸菌のマルトース結合タンパク質（MBP）であり、malE遺伝子によりコードされる。タンパク質構成成分-MBP融合タンパク質又は構成成分MBP融合タンパク質を含む複合体は、アミロース樹脂に結合し、一方、汚染物質は洗い流される。結合され改変されたタンパク質構成成分-MBPは、マルトースによりアミロース樹脂から溶出される。例えば、Guanら, 1987, Gene 67: 21-30を参照されたい。
【０２５７】
タンパク質構成成分融合タンパク質を精製するための第二の方法は、入手可能なポリクローナル又はモノクローナル抗体のエピトープを含むペプチドタグに適用できる。免疫特異的結合、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー及び免疫沈降による、タンパク質の精製のための当該技術分野で知られている様々な方法を使用できる。例えばAntibodies A Laboratory ManualのChapter 13, Harlow及びLane編, Cold Spring Harbor laboratory, 1988;及びCurrent Protocols in ImmunologyのChapter 8, Sections I及びII, Coliganら編, John Wiley, 1991を参照されたい。これらの記載は両方とも参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
また、本発明の複合体のタンパク質構成成分は、複合体に特異的な抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降により精製することができる。更に、本発明の複合体を、複合体の構成成分の少なくとも１つに結合する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降により精製してもよい。特定の実施形態において、本発明の複合体を、複合体に特異的な抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降により精製してもよい。
【０２５９】
4.4 本発明の抗体
本発明は、本発明の複合体、Sen2、Senl5、Sen34、Sen54又はSen2ΔEx8に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
【０２６０】
本発明によれば、セクション4.2で説明した本発明のタンパク質複合体又はSen2、Senl5、Sen34、Sen54若しくはSen2ΔEx8を、免疫原として使用することができ、そのような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成できる。ある実施形態において、免疫原は本発明の複合体であり、ここで、複合体のタンパク質構成成分は、互いに共有結合で結合される。本発明のある実施形態において、本発明の複合体に結合する抗体の親和性は、複合体の構成成分のいずれかにそれぞれに対する抗体の親和性よりも高い。本発明のある実施形態において、本発明の複合体に結合する抗体の親和性は、複合体の構成成分のいずれかにそれぞれに対する抗体の親和性よりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1,000倍、少なくとも10,000倍又は少なくとも100,000倍、高い。本発明のある実施形態において、本発明の複合体に結合する抗体の親和性は、複合体の構成成分のいずれかにそれぞれに対する抗体の親和性よりも、多くとも2倍、多くとも5倍、多くとも10倍、多くとも100倍、多くとも1,000倍、多くとも10,000倍又は多くとも100,000倍、高い。特定の実施形態において、複合体に特異的な抗体及び抗体は、複合体の個々のタンパク質構成成分に結合しない。抗原、例えば複合体又はタンパク質構成成分に対する抗体の結合親和性は、本明細書で述べたいずれかの方法（例えばBIAcoreアッセイ）により又は当業者に公知の方法(例えばvan Cottら, 1992, Real-time biospecific interaction analysis of antibody reactivity to peptides from the envelope glycoprotein, gpl60, of HIV-1, J Immunol Methods 146 (2): 163-76を参照)により、決定することができる。
【０２６１】
本発明によれば、セクション4.1で述べたSen2ΔEx8は、免疫原として使用でき、そのような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を産生できる。
【０２６２】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Sen2ΔEx8に免疫特異的に結合するが、Sen2には結合しない。本発明のある実施形態において、Sen2ΔEx8に結合する抗体の親和性は、Sen2に対する抗体の親和性よりも高い。本発明のある実施形態において、Sen2ΔEx8に結合する抗体の親和性は、Sen2に対する抗体の親和性よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1,000倍、少なくとも10,000倍又は少なくとも 100,000倍、高い。本発明のある実施形態において、Sen2ΔEx8に結合する抗体の親和性は、Sen2に対する抗体の親和性よりも、多くとも2倍、多くとも5倍、多くとも10倍、多くとも100倍、多くとも1,000倍、多くとも10,000倍又は多くとも100,000倍、高い。これらの実施形態に従って、抗体の親和性を、本明細書で述べた方法又は当該技術分野で公知の方法（例えばBIAcoreアッセイ）を使って決定することができる。
【０２６３】
このような抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fabフラグメント及びFab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヒトタンパク質構成成分を含む複合体に対する抗体を産生する。別の実施形態において、上記第一のタンパク質構成成分の断片と上記第二のタンパク質構成成分の断片（断片は複合体の他の構成成分と相互作用するタンパク質ドメインを含む）とから形成された複合体を、抗体産生の免疫原として使用する。
【０２６４】
抗原と免疫特異的に結合する抗体を、抗体の合成における当該技術分野で公知の方法、特に、化学的合成又は好ましくは組換え発現技術により産生することができる。
【０２６５】
抗原に免疫特異的なポリクローナル抗体を、当該技術分野で周知の様々な手順により産生することができる。例えば、抗原（即ち本発明の複合体又は本発明の複合体の構成成分）を、様々な宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるがこれらに限定されない）に投与して、ヒト抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の製造を促すことができる。宿主の種によって、様々なアジュバンドを使って免疫学的応答を高めてもよく、アジュバントとしては、フロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機物のゲル、リゾレシチン、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)及びコリネバクテリウム・パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。また、このようなアジュバントは当該技術分野で周知である。
【０２６６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組合わせを含む、当該技術分野で公知の広範多様な技術を使って調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の技術、及びHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版1988) ; Hammerlingら, Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N. Y., 1981)で教示される技術を含む、ハイブリドーマ技術を使って産生することができる（上記文献は、参照によってそのまま組み込まれる）。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて産生された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、あらゆる真核、原核又はファージクローンを含む単一のクローン由来の抗体をいい、抗体を産生する方法によらない。
【０２６７】
ハイブリドーマ技術を使って特異的抗体を製造及びスクリーニングする方法は、日常的に行われており、当該技術分野で周知である。簡単に言えば、マウスを非マウス抗原で免疫することができ、免疫応答が検出されると、例えば抗原に特異的な抗体がマウス血清中に検出され、マウスの脾臓を回収して、脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術で適切なミエローマ細胞、例えばATCCから入手可能な細胞系統SP20から得られた細胞と融合する。ハイブリドーマを選択して、限界希釈によりクローニングする。次に、ハイブリドーマクローンについて、当該技術分野で公知の方法により、本発明のペプチドと結合できる抗体を分泌する細胞に対してアッセイを行う。腹水は、一般的に高レベルの抗体を含み、陽性のハイブリドーマクローンで免疫したマウスにより作ることができる。
【０２６８】
本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を含む方法により産生される抗体だけでなく、モノクローナル抗体を産生する方法も提供する。ここで、好ましくは、ハイブリドーマを、非マウス抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞をミエローマ細胞と融合することにより作製し、次に、抗原に結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合により生じたハイブリドーマをスクリーニングする。
【０２６９】
特定の特殊なエピトープを認識する抗体断片を、当業者に公知の技術で作製することができる。例えば、本発明のFab及びF(ab’)2断片を、パパイン（Fab断片を作る）又はペプシン（F(ab’)2断片を作る）などの酵素を使って、イムノグロブリン分子のタンパク質分解切断で作ることができる。F(ab’)2断片は、可変領域、軽鎖の定常領域及び重鎖のCH1ドメインを含む。更にまた、本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使って作製することができる。
【０２７０】
ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面に、その抗体ドメインが提示される。特に、VH及びVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー（例えば、作用を受けた組織のヒト又はマウスcDNAライブラリー）から増幅する。PCRで、VH及びHLドメインをコードするDNAをscFvリンカーと一緒に組み換えて、ファージミドベクターの中にクローニングする。ベクターを大腸菌に電気穿孔し、その大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法に使われるファージは、典型的には、fd及びM13を含む繊維状ファージであり、VH及びVLドメインは、通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIのどちらかに組換えで融合される。特定の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば標識抗原又は固相表面若しくはビーズに結合あるいは捕捉された抗原を使って、選択又は同定できる。本発明の抗体を作るのに使用可能なファージディスプレイ法の例として、Brinkmanら, 1995, J. Immunol. Methods 182: 41-50; Amesら, 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186; Kettleboroughら, 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958 ; Persicら, 1997, Gene 187: 9-18 ; Burtonら, 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; 国際特許出願PCT/GB91/01134;国際公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401及びW097/13844;米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号及び第5,969,108号に開示された方法が挙げられ、これらの文献のそれぞれは参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。
【０２７１】
上記文献に述べられているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離して、それをヒト抗体などの完全な抗体又は他の所望の抗原結合断片を作るのに使用することができ、また、例えば以下に述べるような、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む所望の宿主でその抗体コード領域を発現させることができる。また、Fab、Fab’及びF(ab’)2断片を組換えで製造する技術は、PCT公開公報WO 92/22324; Mullinaxら, 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869; Sawaiら, 1995, AJRI 34: 26-34; Betterら, 1988, Science 240: 1041-1043（これらの文献は参照によってそのまま組み込まれる）で述べられている方法などの、当該技術分野で公知の方法を使ってもよい。
【０２７２】
完全な抗体を作るために、VH又はVLヌクレオチド配列、制限酵素認識部位、及びその制限酵素認識部位を保護するフランキング配列を含むPCRプライマーを、scFvクローンでVH又はVL配列を増幅するのに使用することができる。当業者に公知のクローニング技術を使用して、PCR増幅されたVHドメインを、VH定常ドメイン、例えばヒトγ4定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、またPCR増幅されたVLドメインを、VL定常ドメイン、例えばヒトκ又はλ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。好ましくは、VH又はVLドメインを発現するベクターは、EF-lαプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン及びネオマイシンなどの分泌マーカーを含む。また、VH及びVLドメインは、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングしてもよい。次に、当業者に公知の技術を使って、重鎖転換ベクター及び軽鎖転換ベクターを株化細胞に同時形質移入して、全長抗体、例えばIgGを発現する安定な又は一過的な細胞系統を作る。
【０２７３】
ヒトにおけるインビボでの抗体の使用とインビトロの検出アッセイを含む、いくつかの使用においては、ヒト化抗体又はキメラ抗体を使用することが好ましいであろう。完全に、ヒト抗体とヒト化抗体は、ヒト患者の治療上の処置に特に望ましい。ヒトイムノグロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使う上述のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で公知の様々な方法により、ヒト抗体を作ることができる。また、米国特許第4,444,887号及び4,716,111号;及び国際公開公報WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、W098/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及びWO 91/10741も参照されたい。これら文献のそれぞれは、参照によって明細書にそのまま組み込まれる。
【０２７４】
また、ヒト抗体は、機能的な内因性イムノグロブリンを発現できないがヒトイムノグロブリン遺伝子を発現できる、トランスジェニックマウスを使って製造することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖イムノグロブリン遺伝子複合体を、マウス胚幹細胞に無作為に又は相同組換えで導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域及び多様性領域を、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚幹細胞に導入してもよい。相同組換えによるヒトイムノグロブリン遺伝子座の導入で、マウス重鎖及び軽鎖イムノグロブリン遺伝子を別々に又は同時に非機能的にすることができる。特に、JH領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体の産生を抑制する。改変された胚性幹細胞を増やして胚盤胞に顕微注入して、キメラマウスを作る。次に、キメラマウスを交配して、ヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を作る。トランスジェニックマウスを、選択した抗原で、例えば本発明のポリペプチドの全部又は一部で、標準的な方法で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、常套的なハイブリドーマ技術を使って、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが内部に持つヒトイムノグロブリン導入遺伝子は、B細胞が分化する間に再配列され、その後クラススイッチングと体細胞突然変異が起こる。従って、このような技術を使って、治療上有用なIgG、IgA、IgM及びIgE抗体を作ることが可能である。ヒト抗体を製造するこの技術の概要については、Lonberg及びHuszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65 93を参照されたい。ヒト抗体とヒトモノクローナル抗体を製造するこの技術の詳細な議論及びそのような抗体を作るプロトコルについては、例えば国際公開WO 98/24893、WO 96/34096及びWO 96/33735; 米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、及び第5,939,598号を参照されたい。これらの文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。更に、Abgenix社(Freemont, CA)及びGenpharm(San Jose, CA)などの会社と、上述した技術と同様の技術を使って、選択された抗原に対するヒト抗体を提供してもらうことを契約することができる。
【０２７５】
キメラ抗体は、その抗体の異なる部分が異なるイムノグロブリン分子由来である分子である。キメラ抗体の製造方法は当該技術分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229: 1202 ; Oiら, 1986, BioTechniques 4: 214; Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202;及び米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号、及び第6,311,415号を参照されたい。これらの文献は、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。
【０２７６】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合でき、ヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と非ヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを含む、抗体又はその変異体、或いはそれらの断片である。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域（Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)の全体を実質的に含み、CDR領域の全体又は実質的に全体が、非ヒトイムノグロブリン（即ちドナー抗体）の全体又は実質的に全体に対応し、またフレームワーク領域の全体又は実質的に全体は、ヒトイムノグロブリンの共通配列の全体又は実質体に全体である。また、好ましくは、ヒト化抗体は、イムノグロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒトイムノグロブリンの一部を含む。通常、抗体は、少なくとも重鎖の可変ドメインと軽鎖の両方を含むであろう。また、抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA及びIgEと、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含むアイソタイプとを含むイムノグロブリンのクラスから選択することができる。通常、定常ドメインは補体結合性定常ドメインであり、そこではヒト化抗体が細胞傷害性活性を示すことが望まれ、そのクラスは典型的にはIgG1である。そのような細胞傷害性活性が望まれない場合には、定常ドメインはIgG2クラスでもよい。ヒト化抗体は、１つ以上のクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当該技術分野の普通の技術の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワーク及びCDR領域は、親の配列、例えばドナーCDRと正確に一致する必要はなく、又は一致するフレームワークで、少なくとも１つの残基の置換、挿入又は欠失による突然変異が起こってもよく、その結果、その部位のCDR又はフレームワークの残基は、一致する抗体又は移入する抗体のどちらかと対応しない。しかしながら、そのような突然変異は多くないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％、たいてい90％、最も好ましくは95％以上が、親のフレームワーク及びCDR配列の残基と対応するであろう。ヒト化抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使って製造することができ、CDR-グラフティング(例えば欧州特許EP 239,400;国際公開WO 91/09967;及び米国特許第5,225,539号、第5,530,101号及び第5,585,089号を参照、各文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる)、ベニアリング(veneering)又はリサーフェシング（resurfacing）(例えば、欧州特許EP 592,106及びEP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 ; Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814;及びRoguskaら, 1994, PNAS 91: 969-973を参照、各文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる)、鎖シャフリング（chain shuffling）(例えば、米国特許第5,565,332号参照、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる)、及び以下の文献に開示される技術（例えば米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、国際公開WO 9317105、Tanら, J. Immunol. 169: 1119 25 (2002), Caldasら, Protein Eng. 13 (5): 353 60 (2000), Morea ら, Methods 20 (3): 267 79 (2000), Bacaら, J. Biol. Chem. 272 (16): 10678 84 (1997), Roguskaら., Protein Eng. 9 (10): 895 904 (1996), Coutoら, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s (1995), Coutoら, Cancer Res. 55 (8): 1717 22 (1995), Sandhu JS, Gene 150 (2): 409 10 (1994)及びPedersenら, J. Mol. Biol. 235 (3): 959 73 (1994)、各文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。しばしば、フレームワーク領域のフレームワーク残基が、CDRドナー抗体由来の対応する残基で置換されて、抗原結合が変化し、好ましくは改善されるであろう。これらのフレームワークの置換は、当該技術分野で周知の方法、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためにCDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングすること、及び特定の位置の、非一般的なフレームワーク残基を同定するために配列を比較することによって同定することができる(例えば、Queenら,米国特許第5,585,089号;及びRiechmannら, 1988, Nature 332: 323を参照、これらの文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる)。
【０２７７】
更に、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体又は本発明の複合体の構成成分は、その後、当業者に周知の技術を使って抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するのに使用される(例えば、Greenspan及びBona, 1989, FASEB J. 7 (5): 437-444;及びNissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438を参照されたい)。
【０２７８】
4.4.1 抗体をコードするポリヌクレオチド配列
本発明は、本発明の複合体又は本発明の複合体の構成成分と免疫特異的に結合する、抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、例えば上記に定義したような、高ストリンジェントな、中又は低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【０２７９】
当該技術分野で公知の方法によりポリヌクレオチドを得てもよいし、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。所望の抗原に対して免疫特異的な抗体のヌクレオチド配列は、例えば文献又はGenBankのようなデータベースから得ることができる。このような抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく（例えば、Kutmeierら, 1994, BioTechniques 17: 242で説明されている）、簡単に言えば、PCRにより、抗体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドを合成する工程、それらのオリゴヌクレオチドをアニーリング及びライゲーションする工程、次にライゲーションしたオリゴヌクレオチドを増幅する工程を統合することが必要となる。
【０２８０】
或いは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源から得られる核酸から作ってもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが利用できない場合でも、抗体分子の配列は公知であり、イムノグロブリンをコードする核酸を化学的に合成したり、配列の3’及び5’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使うPCR増幅により、又は例えば抗体をコードするcDNAライブラリーから得られたcDNAクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使うクローニングにより、適切な供給源（例えば抗体cDNAライブラリー、組織又は抗体を発現する細胞、例えば本発明の抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞から産生されたcDNAライブラリー、単離された核酸、好ましくはポリA+RNA）から、イムノグロブリンをコードする核酸を得ることができる。次に、PCRにより産生された増幅された核酸を、当該技術分野で周知の方法を使って複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０２８１】
抗体のヌクレオチド配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列を、核酸配列を操作するための当該技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどの方法を使って操作することができ（例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY及びAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYで説明されている技術を参照のこと、これらの文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）、異なるアミノ酸配列を有する抗体を産生したり、例えばアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を作ることができる。
【０２８２】
特定の実施形態において、１つ以上のCDRを、日常的な組換えDNA技術を使ってフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、天然のものでもよいし、共通フレームワーク領域であってもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である(ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えばChothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278 : 457-479を参照のこと)。好ましくは、フレームワーク領域とCDRの組合わせにより作られたポリヌクレオチドは、特定の抗原と免疫特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上述したように、1つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内で行ってもよく、また好ましくは、アミノ酸置換はその抗原に対する抗体の結合を改善する。更に、そのような方法を、鎖内ジスルフィド結合に関係する1つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸を置換又は欠失させるのに使用して、1つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いている抗体分子を作ることができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変は本発明に包含され、また当該技術分野内である。
【０２８３】
4.4.2 抗体の組換え発現
本発明の抗体、誘導体、類似体又はそれらの断片（例えば本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖又はそれらの一部、或いは本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作製を必要とする。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖、或いはそれらの一部（好ましくは、しかし必ずとは限らないが、重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが得られた場合、抗体分子の製造用ベクターを、当該技術分野で周知の技術を使って組換えDNA技術で製造することができる。例えば、米国特許第6,331,415号を参照されたい（参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が、本明細書で説明される。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列と適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを作製することができる。例えば、これらの方法として、インビトロの組換えDNA技術、合成技術及びインビボの遺伝的組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターと結合可能な、本発明の抗体分子、抗体の重鎖又は軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン又はそれらの一部、又は重鎖若しくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく(例えば国際公開WO 86/05807及びWO 89/01036;及び米国特許第5,122,464号を参照)、完全な重鎖、完全な軽鎖、又は完全な重鎖及び軽鎖の両方を発現させるためのそのようなベクターに抗体の可変ドメインをクローニングしてもよい。
【０２８４】
発現ベクターを常套的な技術により宿主細胞に移入し、次に形質移入された細胞を常套的な技術で培養して、本発明の抗体を製造する。従って、本発明は、場合により異種プロモーターと結合可能な、本発明の抗体又はそれらの断片、それらの重鎖又は軽鎖、それらの一部、又は本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖の抗体の発現に好ましい実施形態において、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、後に詳述するように、完全なイムノグロブリン分子を発現させるための宿主細胞内で同時発現させてもよい。
【０２８５】
本発明の抗体分子を発現するために、様々な宿主発現ベクター系を使用することができる（例えば米国特許第5,807,715号を参照のこと）。このような宿主発現系は、目的のコード配列が作られてその後精製されるビヒクルを意味するが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又は形質移入したときに、in situで本発明の抗体分子を発現することができる細胞をも意味する。これらには、抗体コード配列を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌及び枯草菌）などの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセスやピチア）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））に感染させた、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現産物を内部に持つ哺乳動物細胞系（例えばCOS、CHO、BHK、293、NSO及び3T3細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、特に完全な組換え抗体分子の発現において、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞を組換え抗体分子の発現に使用する。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な即時型遺伝子プロモーター要素などのベクターと組合わせた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物細胞は、抗体にとって有効な発現系である(Foeckingら, 1986, Gene 45: 101;及びCockettら, 1990, Bio/Technology 8: 2)。
【０２８６】
細菌系では、抗体分子を発現させようと意図する使用に応じて、多くの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量のそのような抗体を製造しようとする場合、抗体分子の医薬組成物を作るために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現に向いているベクターが望まれるであろう。そのようなベクターとして、大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら, 1983, EMBO 12: 1791)（抗体コード配列をベクターに、lacZコード領域を有するフレーム内に個々に連結することができ、その結果融合タンパク質が作られる）；pINベクター（Inouye及びInouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke及びSchuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられるが、これに限定されない。また、pGEXベクターを、融合タンパク質として外来のポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ（GST）で発現するのに使ってもよい。一般的に、そのような融合タンパク質は、溶解性であり、マトリックスのグルタチオンアガロースビーズに吸着して結合し、その後遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解された細胞から簡単に精製できる。pGEXベクターは、トロンビン又は因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計されるので、クローニングされたターゲット遺伝子産物をGST部分から遊離することができる。
【０２８７】
昆虫系では、オートグラファカルフォルニカ核多核体病ウイルス（AcNPV）を、ベクターとして外来遺伝子を発現するのに使用する。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞内で増殖する。抗体コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば多角体（polyhedrin）遺伝子）に個々にクローニングしてもよいし、AcNPVプロモーター（例えば多角体プロモーター）の制御下に置いてもよい。
【０２８８】
哺乳動物の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を使用できる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三ツ組三者間リーダー（tripartite leader）配列と連結できる。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロ又はインビボの組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域E1又はE3）に挿入することにより、感染された宿主内で、生存可能な、抗体分子を発現できる組換えウイルスが生じる(例えば、Logan及びShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: 355-359を参照)。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のため、特異的な開始シグナルを要求してもよい。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接する配列を含む。更に、その開始コドンは、完全な挿入の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同じ位相内になければならない。これらの外来性の翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものでよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることにより高めることができる（例えばBittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544を参照）。
【０２８９】
更に、宿主細胞の系統は、挿入された配列の発現をモジュレートし、又は所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾及びプロセシングするものを選択できる。そのようなタンパク質生成物の修飾（例えば糖修飾）及びプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であろう。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシングと修飾のための、特徴的なかつ固有のメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾とプロセシングを確実に行うために、適切な細胞系統又は宿主系を選択することができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞の機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物の宿主細胞として、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20及びT47D、NSO(イムノグロブリン鎖を内因的に作らないマウスのミエローマ細胞系統)、CRL7030及びHsS78Bst 細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
長期間、組換えタンパク質を多く生成し、発現が安定していることが好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系統を操作することができる。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーにより制御されたDNAで、形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作した細胞を1〜2日間、富裕培地で増殖することができ、次に選択培地に交換する。組換えプラスミドの選択マーカーは、その選択に耐性を与え、細胞が、プラスミドを細胞の染色体に安定に組み込み、次にクローニングされて細胞系統に増殖し得る細胞巣を形成するように成長することを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞系統を操作するのに有利に使用できる。このように操作された細胞系統は、抗体分子に直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニングと評価に特に有用であろう。
【０２９１】
多くの選択系が使用でき、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら, 1977, Cell 11: 223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska及びSzyalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22: 8-17)遺伝子が挙げられ、それぞれ、tk-、hgprt-又はaprt-細胞に使用できるが、これらの選択系に限定されない。また、以下の遺伝子の選択の基準として、代謝拮抗物質耐性を使用することができる：メトトレキサート耐性を与えるdhfr(Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 1527);ミコフェノール酸耐性を与えるgpt(Mulligan及びBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072);アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo(Wu及びWu, 1991, Biotherapy 3: 87-95 ; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573- 596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932;及びMorgan 及びAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11 (5): 155-2 15);及びハイグロマイシン耐性を与えるhygro(Santerreら, 1984, Gene 30: 147)。組換えDNA技術の分野で一般に知られている方法を、所望の組換えクローンを選択するのに日常的に使用することができ、また、そのような方法は、例えばAusubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 及びChapters 12 and 13, Dracopoliら, (編), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150: 1に説明されており、これらの文献は参照により本明細書にそのまま組み込まれる。
【０２９２】
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅により高めることができる（概説については、Bebbington及びHentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)を参照）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが上昇すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅される領域は抗体遺伝子と関連するため、抗体の産生もまた増加するだろう(Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257)。
【０２９３】
宿主細胞を、本発明の２つの発現ベクター、即ち重鎖由来のポリペプチドをコードする第一ベクター及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二ベクターで、同時形質移入することができる。この２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドを同等に発現できる同一の選択マーカーを含めることができる。それとは別に、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現できる単一のベクターを使用することができる。そのような状態の場合、毒性のない重鎖が過剰になるのを避けるため、軽鎖を重鎖の前に配置すべきである(Proudfoot, 1986, Nature 322: 52;及びKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2 197)。重鎖及び軽鎖のコード配列は、cDNA又はゲノムDNAを含んでもよい。
【０２９４】
本発明の抗体分子が組換え発現により製造されると、イムノグロブリン分子の精製の技術分野で知られた方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、特にプロテインA後の特異的抗原のアフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、又はタンパク質の精製の他の標準的な技術により精製することができる。更に、本発明の抗体又はその断片を、本明細書で述べた、又はそれ以外の精製を容易にするための当該技術分野で知られている、異種のポリペプチド配列に融合してもよい。
【０２９５】
4.4.3 本発明の抗体を使用する免疫学的方法
本発明の抗体は、当業者に公知の方法で使用することができる。ある実施形態において、本発明の抗体を、本発明の複合体又は本発明の複合体の構成成分を検出又は定量するのに使用する。このために、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、又は蛍光免疫測定を、本発明の抗体を使って行うことができる。
【０２９６】
抗原に対する抗体の親和性は、例えばBiacoreアッセイ（登録商標）を使って測定できる。
【０２９７】
4.5 スクリーニング方法
4.5.1 複合体形成のモジュレーター
本発明の複合体、複合体の構成成分タンパク質及び構成成分タンパク質をコードする核酸は、誘導体、アミノ酸及び核酸の断片と同じように、上記複合体と結合する化合物、又は上記複合体の量、活性若しくはタンパク質構成成分の組成をモジュレートする化合物についてのスクリーニングに使用することができ、従って、複合体活性及び/又は複合体形成（形成される複合体の量）及び/又はその複合体のタンパク質構成成分の組成のモジュレーター、即ち作用剤又は拮抗剤としての潜在的な用途を有する。
【０２９８】
従って、本発明はまた、本発明の複合体に結合し、本発明の複合体の量、活性又はタンパク質構成成分の組成をモジュレートする分子についてスクリーニングする方法に関する。本発明のある実施形態において、本発明の複合体の機能、活性又は形成を直接的又は間接的にモジュレートする分子についてスクリーニングする方法は、上記複合体又は複合体の機構を有する細胞又は生物を、モジュレーションに導く条件下で1種類以上の化合物に暴露する工程と、上記複合体のタンパク質構成成分の量、活性又は同一性を決定する工程を含み、ここで、上記化合物の不存在下における上記量、活性又は同一性に対する上記量、活性又は同一性の変化は、その化合物が複合体の機能、活性又は形成をモジュレートすることを示す。このようなスクリーニングアッセイは、当該技術分野で一般に知られている無細胞及び細胞を使用する方法を使って行うことができる。
【０２９９】
本発明は更に、本発明の複合体の構成成分の発現をモジュレートする分子、例えばSen2ΔEx8についてのスクリーニングの方法に関する。本発明の１つの実施形態において、本発明の複合体の構成成分の発現をモジュレートする分子についてのスクリーニング方法は、構成成分をコードする核酸を含む細胞又は生物を、モジュレーションに導く条件下で1種類以上の化合物に暴露させる工程と、上記複合体のタンパク質構成成分の量、活性又は同一性を決定する工程を含み、ここで、前記化合物の不存在下での量、活性又は同一性に対する上記量、活性又は同一性の変化は、その化合物が複合体の発現をモジュレートすることを示す。このようなスクリーニングアッセイは、当該技術分野で一般に知られている無細胞及び細胞を使用する方法を使って行うことができる。複合体又は構成成分の活性をアッセイの読み取りとして使う場合、その後のアッセイ、例えばウエスタンブロット分析又はノザンブロット分析を行って、構成成分のモジュレートされた発現レベルが、モジュレートされた活性の原因である、ということを証明することができる。
【０３００】
ライブラリーのスクリーニングは、様々な一般に知られた方法により行うことができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の文献を参照されたい：Parmley及びSmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218 ; Scott及びSmith, 1990, Science 249: 386-390; Fowlkesら, 1992, BioTechniques 13: 422-427; Oldenburgら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397; Yuら, 1994, Cell 76: 933-945; Staudtら, 1988, Science 241: 577-580; Bockら, 1992, Nature 355: 564-566; Tuerkら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988-6992 ; Ellingtonら, 1992, Nature 355: 850-852 ;米国特許第5,096,815号、第5,223,409号、第5,198,346号、すべてLadnerら; Rebar及びPabo, 1993, Science 263: 671-673;及び国際公開WO 94/18318。
【０３０１】
特定の実施形態において、複合体のタンパク質構成成分の断片及び/又は類似体、特にペプチド模倣体(peptidomimetic)は、複合体形成の競合又は非競合阻害剤として（それにより、複合体の活性又は形成を阻害する）、活性についてスクリーニングされる。
【０３０２】
スクリーニング方法には、放射性リガンド（例えば125I又は3H）、磁性リガンド（例えばフォトビオチンアセテートに共有結合的に付着した常磁性ビーズ）、蛍光リガンド（例えばフルオレセイン又はローダミン）又は酵素リガンド（例えばルシフェラーゼ又はβ-ガラクトシダーゼ）で、複合体の構成成分タンパク質を標識することを含めることができる。次に、溶液中で結合するこれらの反応物質を、当該技術分野で公知の多くの技術のうちの一つにより単離することができ、それらの技術として、非標識の結合パートナー（又は第二標識複合体部分に使用されたマーカーと区別できるマーカーで標識された結合パートナー）に対する抗血清を使う標識複合体部分の同時免疫沈降、イムノアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び勾配密度遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、標識された結合パートナーは、市販されているフィルターに保持されない、小さい断片又はペプチド模倣体である。結合すると、標識種はフィルターを通過することができないので、複合体形成の簡単なアッセイに提供される。
【０３０３】
ある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分を異なるフルオロフォアで標識して、構成成分が互いに結合することによりFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）が生じるようにする。化合物の添加により、化合物不存在下でのFRETと比較してFRETに差が生じる場合、その化合物は複合体形成のモジュレーターであると同定される。化合物存在下でのFRETが、化合物不存在下でのFRETと比較して減少する場合、その化合物は複合体形成の阻害剤であると同定される。化合物存在下でのFRETが、化合物不存在下でのFRETと比較して増加する場合、その化合物は複合体形成の活性化剤であると同定される。
【０３０４】
他のある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分をフルオロフォアで標識して、構成成分と別のタンパク質構成成分が結合して本発明の複合体を形成することにより、FP(蛍光偏光)が生じるようにする。化合物を添加することにより、化合物不存在下でのFPと比較してFPに差が生じる場合、その化合物は複合体形成のモジュレーターであると同定される。
【０３０５】
当該技術分野で一般に知られている方法は、複合体の構成成分のメンバーの少なくとも１つを標識するのに使用される。適切な標識方法として、放射標識されたアミノ酸、例えば3H-ロイシン又は35S-メチオニンの取り込みによる放射標識、クロラミンT方法、ボルトンハンター試薬などを使う125I又は131Iの翻訳後ヨウ素化による放射標識、又はホスホリラーゼを使う32Pでの標識及び無機放射標識リン、フォトビオチンアセテート及び太陽灯照射などでのビオチン標識が挙げられるが、これらに限定されない。複合体のメンバーの１つが固定化される場合、例えばセクション4.5.1.1に述べるように、遊離種が標識される。相互作用する種のどちらも固定化されない場合、両方の一部を単離して、より正確な定量を提供できるように、またホモマーの複合体の形成をヘテロマーの複合体と区別できるように、それぞれの種を区別できるマーカーで標識することができる。検出感度を改良したり、複合体の安定性を向上させるなどのため、修飾された構成成分のうちの１つに結合するアクセサリータンパク質を利用する方法が提供される。
【０３０６】
例えば、放射能検出のための液体シンチレーションカウンティング、酵素標識部分の酵素活性など、使用される標識に特有なアッセイ方法を使って複合体形成を定量することにより、複合体形成の物理的パラメーターを分析することができる。次に、その反応の結果を、スキャッチャード分析、ヒル分析及び当該技術分野で一般に知られている他の方法（例えばProteins, Structures, and Molecular Principles,第２版(1993) Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New Yorkを参照のこと)を使って分析する。
【０３０７】
スクリーニングされる化合物は、限られた数の特定化合物の混合物、化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどとして準備できる。また、スクリーニングされる試薬/分子/化合物には、複合体の活性又は形成をモジュレートすることができる、抗血清、アンチセンス核酸などのすべての形を含めることができる。例示的なスクリーニング用化合物とライブラリーは、セクション4.5.12に述べる。
【０３０８】
本発明の特定の実施形態において、Sen2ΔEx8、Clpl、Sen54、Senl5、Send34、CPSF、CFIm、CFIIm及びCstFを含む複合体の代わりに、Sen2ΔEx8、Clpl、Sen54、Senl5及びSen34を含む複合体の形成を促進する化合物が同定される。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体の形成を促進するが、Sen2含有複合体の形成は促進しない化合物が同定される。ある実施形態において、Sen2含有複合体の形成を促進するが、Sen2ΔEx8含有複合体の形成を促進しない化合物が同定される。
【０３０９】
ある実施形態において、化合物をプールでスクリーニングする。陽性のプールが同定されると、そのプールの個々の分子が別々に試験される。ある実施形態において、プールのサイズは少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、または少なくとも500個の化合物である。
【０３１０】
本発明のある実施形態において、スクリーニング方法は、候補の分子の構造を決定する工程を更に含む。候補分子の構造は、当業者に公知の方法で決定することができる。例示的な方法は、セクション0で説明される。
【０３１１】
4.5.1.1 無細胞アッセイ
ある実施形態において、本発明の複合体の形成又はモジュレーターの安定性を同定する方法は、インビトロ、特に無細胞系で行うことができる。より特定の実施形態において、複合体が精製される。ある実施形態において、候補の分子が精製される。
【０３１２】
特定の実施形態において、ライブラリーのメンバーを、固相に固定化された複合体と接触させる工程、タンパク質（又はコードする核酸若しくは誘導体）と結合するそれらのライブラリーメンバーを回収する工程により、行うことができる。このようなスクリーニング方法の例は、「パニング」方法と呼ばれ、一例として、Parmley及びSmith, 1988, Gene 73: 305-318 ; Fowlkesら, 1992, BioTechniques 13: 422-427; 国際公開WO 94/18318;及び上述した文献に説明されている。
【０３１３】
ある実施形態において、複合体の活性又は形成をモジュレート（即ち拮抗又は作用する）試薬を、結合阻害アッセイを使ってスクリーニングすることができ、ここで、試験する試薬の不存在下で複合体形成が起きる、水溶性の又は生理学的に結合する条件下で、複合体の形成をモジュレートする試薬の能力について、試薬をスクリーニングする。本発明の複合体の形成に干渉する試薬は、複合体の形成の拮抗剤であると同定される。複合体の形成を促進する試薬は、複合体の形成の作用剤であると同定される。複合体の形成を完全に遮断する試薬は、複合体形成の阻害剤として同定される。例示的な実施形態において、結合条件は、例えば、10-250mM NaCl、5-50mM Tris-HCI、pH5-8及び0.5% Triton X-100又は相互作用の特異性を改善する他の界面活性剤の塩溶液が挙げられるが、これに限定されない。金属キレート剤及び/又は二価カチオンを、結合を改善し及び/又はタンパク質分解を低減させるために添加してもよい。反応温度は、4、10、15、22、25、35又は42℃でよく、インキュベーション時間は、例示的には少なくとも15秒であるが、結合平衡を起こすためには、より長い時間が好ましい。再現可能な結合のための最適な結合条件を決定するために、日常的なタンパク質結合アッセイを使って、特定の複合体をアッセイすることができる。
【０３１４】
ある実施形態において、インビトロでの結合アッセイに対して別の一般的な方法が使用される。このアッセイでは、結合種の１つを、フィルター、マイクロタイタープレートウエル、試験管、クロマトグラフィーマトリックスなどに、共有結合的又は非共有結合的に固定化する。タンパク質を、当該技術分野で周知の方法、例えばmethod of Kadonaga and Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5889-5893、即ち、CNBr-セファロース4B(Pharmacia)などの臭化シアン誘導体化担体との結合を使って、共有結合的に固定化できるが、この方法に限定されない。必要ならば、スペーサーの使用により、基質による立体障害を減らすことができる。タンパク質と基質の非共有結合的な付着として、タンパク質の荷電している表面への付着、特異的抗体による付着、第三の関係ない相互作用タンパク質との結合等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１５】
複合体（又はその誘導体）のあるメンバーと何らかの方法（例えば前述した方法）で標識した複合体の別のメンバーとの結合についての、競合用の試薬（細胞抽出物又はライブラリープールを含む）のアッセイが、複合体形成の競争相手又は賦活剤についてのスクリーニングに提供される。特定の実施形態において、試薬と他のタンパク質構成成分の非特異的結合、又はプラスチック、固定担体などに試薬が吸収されることによる損失を抑えるためのブロッキング試薬が、アッセイ混合物に含まれる。ブロッキング試薬として、ウシ血清アルブミン、β-カゼイン、脱脂粉乳、デンハート試薬、フィコール、ポリビニルピロリジン、非イオン性界面活性剤(NP40、Triton X-100、Tween 20、Tween 80など)、イオン性界面活性剤（例えばSDS、LDSなど）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。適切なブロッキング試薬濃度により、複合体形成が可能になる。
【０３１６】
結合を行った後、未結合の標識されたタンパク質を上清から除去して、結合した標識タンパク質を保持している固定化タンパク質を十分に洗浄する。次に、結合した標識の量を、標識を検出する当該技術分野で標準的な方法を使って定量する。
【０３１７】
好ましい実施形態において、優れた安定性を有し、複合体を形成する能力を保持するペプチド誘導体（例えば、結合アッセイバッファーでのタンパク質分解に耐性になるように又は酸化的分解反応に耐性になるように改変された１種類以上の構成成分タンパク質）を、複合体の活性又は形成のモジュレーターについてのスクリーニングに使用する。そのような耐性分子は、例えばタンパク質分解切断部位でのアミノ酸の置換、タンパク質分解されやすい部位での化学的誘導体化アミノ酸の使用、及び酸化の対象になるアミノ酸残基の置換、即ちメチオニンとシステインの置換により、産生することができる。
【０３１８】
4.5.1.2 細胞を使用するアッセイ
ある実施形態において、結合し、相互作用し、又は複合体の活性若しくは形成を促進する分子をスクリーニングするために、複合体のタンパク質構成成分を発現する組換え細胞を使ってアッセイを行うことができる。ある実施形態において、少なくとも１種類のタンパク質構成成分を、組換え細胞で融合タンパク質として発現させ、ここでタンパク質構成成分は、精製とその次の定量、及び/又は免疫学的可視化と定量を容易にするために、ペプチドタグと融合される。
【０３１９】
本発明の特有の態様は、本発明の複合体の形成又は分解を、阻害又は促進する分子の同定に関連し、例えば、複合体を単離すること、及び国際公開WO 00/09716及びRigautら, 1999, Nature Biotechnology 17: 1030-1032（各文献は参照により本明細書にそのまま組み込まれる）に開示されたTAPアッセイを使って複合体のメンバーを同定することについて説明された方法を使用する。
【０３２０】
本発明の別の実施形態において、本発明の複合体の組換え構成成分タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物に、候補化合物を投与することにより、分子を同定する。ある実施形態において、複合体構成成分は、類似の内因性タンパク質構成成分と区別される。ある実施形態において、組換え構成成分タンパク質は融合タンパク質であり、ここで、タンパク質構成成分はペプチドタグに融合される。ある実施形態において、組換えタンパク質構成成分のアミノ酸配列は、内因性タンパク質構成成分のアミノ酸配列と異なるので、組換えタンパク質構成成分に特異的な抗体を使用して、タンパク質構成成分又は構成成分で形成される複合体のレベルを決定することができる。ある実施形態において、組換えタンパク質構成成分は、それぞれのタンパク質本来のプロモーターではないプロモーターから発現される。特定の実施形態において、組換えタンパク質構成成分は、通常は発現されない組織内で発現される。また、特定の実施形態において、化合物はトランスジェニック非ヒト動物内で組換えで発現される。
【０３２１】
ある実施形態において、本発明の複合体のタンパク質構成成分の変異体を細胞で発現し、ここで、タンパク質構成成分の変異体は、天然のタンパク質が本発明の複合体の他のタンパク質構成成分と結合する親和性よりも、低い結合親和性を有する。特定の実施形態において、タンパク質構成成分のドミナントネガティブ変異体が細胞で発現される。ドミナントネガティブ体は、他のタンパク質構成成分に結合するタンパク質構成成分のドメイン、即ち結合ドメインでありうる。理論にとらわれることなく、結合ドメインは、複合体の他のタンパク質構成成分との結合について、天然のタンパク質構成成分と競合し、それにより、全長タンパク質構成成分を含む複合体の形成が抑制される。それとは別に、細胞のドミナントネガティブ体のレベルが高くなり、複合体の量が増加すると、複合体は、ドミナントネガティブとして発現されるタンパク質構成成分によりその複合体に本来提供される結合ドメインを欠乏する。
【０３２２】
タンパク質構成成分の結合ドメインは、当業者に公知の標準的な技術で同定することができる。限定されない例において、別のタンパク質構成成分との二量体化に必要とされるタンパク質の領域を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発(Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989))を実施することができる。他の実施形態において、異なる欠失が起こったタンパク質構成成分の変異体が産生され、それらの連結した欠失領域がタンパク質全体に及ぶであろう。特定の実施形態において、それらの異なる欠失はお互いに重複する。タンパク質構成成分の突然変異体が産生されると、別のタンパク質構成成分と二量体を形成する能力について、その変異体をテストする。特定の変異体が、別のタンパク質構成成分と二量体を形成しない場合、又は天然のものと比較して低い親和性を持つ他のタンパク質構成成分と結合する場合、この変異体の突然変異は、二量体形成に関与するタンパク質領域内に存在すると同定される。タンパク質の適切な折りたたみを単に妨害するだけの突然変異を排除するため、当業者に知られた構造解析を行って、タンパク質の3次元構造を決定することができる。このような技術として、円二色性（CD）、NMR及びX線結晶構造解析が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２３】
ある実施形態において、本発明の複合体の構成成分の変異型は、細胞で誘導性プロモーターの下で発現することができる。当業者に公知の方法を使用して、構成成分をコードするヌクレオチド配列を変異させることができる。当業者に公知の誘導性プロモーターを使用できる。特に、本発明の複合体の構成成分の変異型は、低下した活性、例えば、低下したRNA-核酸分解性活性及び/又は複合体の他の構成成分に対する低下した親和性を有する。
【０３２４】
ある実施形態において、本発明のアッセイは、ハイスループット方式で行われる。
【０３２５】
4.5.2 新しい結合パートナーを同定するための複合体の使用
本発明のある実施形態において、本発明の複合体は、複合体の新しい構成成分を同定するのに使用される。ある実施形態において、本発明の複合体の新しい結合パートナーが同定され、それによって、RNAプロセシングに関係しているとみなされる。そのような新しい結合パートナーを同定するのに、当業者に公知の技術を使用することができる。ある実施形態において、本発明の複合体の結合パートナーは本発明の複合体に結合するが、本発明の複合体の個々のタンパク質構成成分には結合しない。特定の実施形態において、本発明の複合体の結合パートナーを同定するために、免疫沈降が用いられる。
【０３２６】
ある実施形態において、本発明のアッセイは、ハイスループット方式で行われる。
【０３２７】
4.5.3 中途終止コドン及びそのモジュレーターを同定するための複合体の使用
本発明のある実施形態において、本発明の複合体は、中途(pre-mature)終止コドンを含むmRNA又はプレ-mRNA分子を切断するのに使用される。本発明の特定の実施形態において、本発明の複合体は、mRNA又はプレ-mRNA分子を、中途終止コドンで又はその付近で切断するのに使用される。理論に縛られることなく、本発明の複合体は、mRNA又はプレ-mRNA分子を中途終止コドンで又はその付近で切断する。ある実施形態において、本発明の複合体は、中途終止コドンの500、400、300、200、100又は50ヌクレオチド内でmRNA又はプレ-mRNAを切断する。ある実施形態において、本発明の複合体は、中途終止コドンの1〜50、1〜100、1〜250、1〜500、10〜50、10〜100、25〜100、50〜100、50〜250、50〜500、100〜500又は250〜500ヌクレオチド内でmRNA又はプレ-mRNAを切断する。
【０３２８】
本発明のある実施形態において、本発明の複合体は、mRNA又はプレ-mRNA分子の中途終止コドンを同定するのに使用される。ある実施形態において、本発明の複合体は中途終止コドンの500、400、300、200、100又は50ヌクレオチド内でmRNA又はプレ-mRNAを切断する。ある実施形態において、本発明の複合体は、中途終止コドンの1〜50、1〜100、1〜250、1〜500、10〜50、10〜100、25〜100、50〜100、50〜250、50〜500、100〜500又は250〜500ヌクレオチド内でmRNA又はプレ-mRNAを切断する。
【０３２９】
中途終止コドンを同定するため、目的のmRNA又はプレ-mRNAを、複合体によるmRNA又はプレ-mRNAの切断を誘導する条件下で、本発明の複合体と一緒にインキュベートする。切断が起きると、切断生成物を分析して切断部位の位置を決定する。切断部位の位置は、当業者に公知の方法、例えばノザンブロット分析で決定できるが、これに限定されない。
【０３３０】
ある実施形態において、本発明の複合体は、本発明の複合体による中途終止コドンの切断のモジュレーターを同定するのに使用することができる。ある実施形態において、本発明の複合体を、化合物の存在下で複合体によるmRNA又はプレ-mRNAの切断を誘導する条件下で、目的のmRNAとプレ-mRNAと一緒にインキュベートし、ここで、mRNA又はプレ-mRNAは、中途終止コドンを有することが知られている。化合物が、生成された切断生成物の量を増加させる場合、この化合物は、本発明の複合体の中途終止コドンの切断活性の活性化剤であると同定される。化合物が、生成された切断生成物の量を減少させる場合、この化合物は、本発明の複合体の中途終止コドンの切断活性の阻害剤であると同定される。
【０３３１】
ある実施形態において、本発明のアッセイは、ハイスループット方式で行われる。
【０３３２】
4.5.4 複合体の機能のモジュレーター
本発明の複合体の活性をモジュレートする化合物を同定するのに当業者に公知の方法を使用することができる。ある実施形態において、プレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体の活性をモジュレートする化合物を同定することができる。他の実施形態において、3’末端プレ-mRNAプロセシング複合体の活性をモジュレートする本発明の方法を使って、化合物を同定することができる。他の実施形態でも、プレ-tRNA切断複合体の活性をモジュレートする本発明の方法を使って、化合物を同定することができる。更に他の実施形態において、前駆体リボソームRNAからの成熟リボソームRNAの生合成に関連する複合体の活性をモジュレートする本発明の方法を使って、化合物を同定できる。
【０３３３】
ある実施形態において、プレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体又は3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の基質は、エンドヌクレアーゼ反応によりレポーター遺伝子の発現が増加又は減少するように、レポーター遺伝子を含む。どのレポーター遺伝子も本発明の方法に使用することができる。例示的な方法を以下に述べる。プレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体の基質、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の基質、プレ-tRNA切断複合体の基質又は前駆体リボソームRNAから成熟リボソームRNAの生合成に関連する複合体の基質は、検出できるように標識された、複合体によって切断されることが知られているRNA分子でありうる。次に、複合体及びその基質を、複合体により基質の切断を誘導する条件下でインキュベーションし、その後その活性を、基質及び/又は切断生成物の量を測定することにより評価する。例えばセクション4.5.4.1を参照されたい。
【０３３４】
ある実施形態において、本発明のアッセイは、ハイスループット方式で行われる。
【０３３５】
プレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体又は3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の活性をモジュレートする化合物の能力を同定し、確認するために、様々なインビトロのアッセイを使用することができる。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性における化合物の影響を評価するため、複数のインビトロのアッセイを同時に又は連続的に行うことができる。
【０３３６】
ある実施形態において、プレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体を、エンドヌクレアーゼ反応を誘導する条件下で、検出できるように標識されたプレ-tRNA基質と一緒にインキュベーションする。しばらくして、反応を停止して、RNAをPAGEを使って分離する。ある実施形態において、RNAをゲル上で分離する前に、反応物からRNAを沈殿させる。切断生成物の量を、基質と生成物の間の長さの違いに基づいて決定することができる。ある実施形態において、RNA基質を放射性標識して、オートラジオグラフィーを使って検出することができる。プレ-tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体が活性であればあるほど、基質に対するより多くの切断生成物が検出される。
【０３３７】
ある実施形態において、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体を、エンドヌクレアーゼ反応を誘導する条件下で、検出できるように標識された3’末端プレ-mRNAと一緒にインキュベーションする。しばらくして、反応を停止し、RNAをPAGEを使って分離する。ある実施形態において、RNAをゲル上で分離する前に、反応物からRNAを沈殿させる。切断生成物の量を、基質と生成物間の長さの違いに基づいて決定することができる。ある実施形態において、RNA基質を放射性標識して、オートラジオグラフィーを使って検出することができる。3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体が活性であればあるほど、基質に対するより多くの断生成物が検出される。このようなアッセイは、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、rRNAエンドヌクレアーゼ又はtRNA切断活性のモジュレーターを同定するのに、同じように使用することができる。
【０３３８】
本発明の複合体の3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するために、複合体をその基質と一緒にインキュベーションすることができ、ここで、基質は検出できるように標識される。より特定の実施形態において、検出可能な標識は放射性標識であり、例えば33P又は32Pであるが、これらに限定されない。別の実施形態において、標識は蛍光標識である。検出可能に標識された基質を、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼによりプレ-mRNA基質の切断を誘導する条件下で、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼと一緒にインキュベーションする。検出可能に標識された基質を細胞内に顕微注入するか、又は細胞内に形質移入することができる。基質を、細胞抽出物と一緒にインキュベーションしてもよいし、又は精製された3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体と一緒にインキュベーションしてもよい。切断反応が起こるのに十分な時間が経った後、基質をPAGEを使って分離し、反応生成物と残った基質を可視化する。基質が放射性標識されている場合は、オートラジオグラフィーを使って反応生成物を可視化できる。ある実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも1分、5分、10分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間,10時間、12時間、18時間又は少なくとも14時間である。このようなアッセイは、tRNAエンドヌクレアーゼ、rRNAエンドヌクレアーゼ又はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性のモジュレーターを同定するのに、同じように使用できる。
【０３３９】
本発明の複合体のtRNA切断活性、又は前駆体リボソームRNAからの成熟リボソームRNAの生合成における本発明の複合体の活性をモジュレートする化合物を同定するため、複合体をその基質と一緒にインキュベーションすることができ、ここで、基質は検出できるように標識される。ある実施形態において、tRNA切断活性を有する複合体、又は前駆体リボソームRNAからの成熟リボソームRNAの生合成に関連する複合体を、複合体による基質の切断を誘導する条件下でインキュベーションし、その後、基質及び/又は切断生成物の量を測定することにより、活性を評価する。複合体及び基質を、化合物の存在下又は不存在下でインキュベーションすることができ、複合体のRNA核酸分解活性における化合物の作用を決定する。他の実施形態において、プレ-tRNA又はプレ-rRNAを本発明の複合体と一緒にインキュベーションし、どこの切断部位がRNAに存在するかを決定する。
【０３４０】
ある特定の実施形態において、アッセイを対照と同時に行い、即ち、アッセイを化合物の存在下及び不存在下で行い、エンドヌクレアーゼ反応での化合物の作用を決定する。アッセイは、化合物の存在下又は不存在下の工程を含み、エンドヌクレアーゼ反応におけるその化合物の作用を決定することができる。他の実施形態において、過去の値（historic value）を比較のために使用する。
【０３４１】
ある実施形態において、本発明は、以下の工程を含む方法を提供する：(i)細胞を使用するアッセイ、例えば以下に説明するようなアッセイにおいて、化合物を、tRNAスプライシング活性、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性及び/又はプレ-tRNA切断活性のモジュレーターであると同定する工程、及び(ii)本発明の精製された化合物を使う無細胞アッセイにおいて、tRNAスプライシング活性、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性及び/又はプレ-tRNA切断活性を改変する化合物の能力について、工程(i)で同定された化合物をテストする工程。
【０３４２】
tRNAエンドヌクレアーゼ活性についてのアッセイは、tRNA切断活性を決定するのに使用することができる。
【０３４３】
4.5.4.1 レポーター遺伝子の構築物、形質移入細胞及び細胞抽出物
本発明は、tRNAエンドヌクレアーゼ活性をテストする場合に、１つ以上の調節領域と操作可能に結合したtRNAイントロンを含むレポーター遺伝子を含む特定のベクターと、そのベクターで形質移入された宿主細胞を提供する。3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をテストする場合、基質は3’末端プレ-mRNAレポーターを含む（セクション4.5.4.1.3を参照のこと）。また本発明は、１つ以上の調節領域に隣接したレポーター遺伝子のインビトロでの翻訳を提供する。本発明の特有の態様を実施するための技術として、特に指示が無ければ、当業者により日常的に実施される分子生物学、微生物学、組換えDNA操作及び作製の従来技術を使用できる。例えば、Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版; DNA Cloning, Volume I及びII (Glover編 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait編 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (Hames及びHiggins編 1984); Transcription and Translation (Hames及びHiggins編 1984); Animal Cell Culture (Freshney編 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller及びCalos編 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Volume 154及び155 (それぞれ、Wu及びGrossman編, Wu編), (Mayer及びWalker編, 1987) ; lmmunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London, Scopes, 1987), Expression of Proteins in Mammalian Cells Using Vaccinia Viral Vectors in Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2 (Ausubel ら編 1991)を参照されたい。
【０３４４】
4.5.4.1.1 レポーター遺伝子
tRNAエンドヌクレアーゼ複合体又は3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼに対する化合物の作用を確認するため、当業者に周知のレポーター遺伝子をレポーター遺伝子の作製に使用することができる。レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の存在又は活性のいずれかにより容易に検出できるタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。レポーター遺伝子は入手してもよいし、当業者に周知の方法で検出される要素のヌクレオチド配列でもよい。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば文献又はGenBankなどのデータベースから得ることができる。或いは、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、適切な供給源由来の核酸から製造してもよい。特定のレポーター遺伝子をコードする核酸を含むクローンは入手できないが、レポーター遺伝子の配列が知られている場合は、レポーター遺伝子をコードする核酸を化学的に合成したり、適切な供給源（例えばcDNAライブラリー、又はレポーター遺伝子を発現する組織又は細胞由来の、産生されたcDNAライブラリー、単離された核酸、好ましくはポリA+RNA）からPCR増幅により得ることができる。レポーター遺伝子の核酸配列が決定されると、レポーター遺伝子の核酸配列を、ヌクレオチド配列の操作について当業者に周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを使って操作することができ(例えば、Sambrookらにより記載された技術, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY及びAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, NYに記載されている技術を参照のこと。これらの文献は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる)、異なるアミノ酸配列を有するレポーター遺伝子を作ること、例えばアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を引き起こすことができる。
【０３４５】
レポーター遺伝子の例として、ルシフェラーゼ（例えばホタルのルシフェラーゼ、ウミシイタケのルシフェラーゼ、コメツキムシのルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質（「GFP」）（例えば緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質）、β-ガラクトシダーゼ（「beta-gal」）、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(「CAT」)、アルカリフォスファターゼ（「AP」）が挙げられるが、これらに限定されない。以下の表２は、様々なレポーター遺伝子と、それらのレポーター遺伝子のアッセイ可能な産生物の特性を表にしたものである。好ましい実施形態において、レポーター構築物に使用されるレポーター遺伝子は、簡単にアッセイでき、目的の細胞又は生物には本来見られない活性を有する。
【表２】
Figure 0004990621
【０３４６】
特定のレポーター遺伝子及びこれらのレポーター遺伝子の特徴を、以下に更に詳細に説明する。
【０３４７】
ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼは、酸素と基質（ルシフェリン）の存在下で光を放射する酵素であり、培養細胞、個々の細胞、生物体全体及び遺伝子導入生物体における遺伝子発現のリアルタイムの、微光画像化に使用されている（Greer及びSzalay, 2002, Luminescence 17 (1) : 43-74で概説される)。
【０３４８】
本明細書で使用される、用語「ルシフェラーゼ」は、すべてのルシフェラーゼ、又はルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ由来の組換え酵素を包含する意図である。ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子は、例えばフォティナス（Photinus）及びルシオラ（Luciola）種から十分に特徴づけされている（例えば、Photinus pyralisについては国際公開WO 95/25798、Luciola cruciata及びLuciola lateralisについては欧州特許出願EP 0 524 448、Luciola mingrelicaについてはDevineら, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1173 (2): 121-132を参照)。他の真核生物のルシフェラーゼ遺伝子として、コメツキムシ（Photinus plagiophthalamus、例えばWoodら, 1989, Science 244: 700-702参照）、ウミシイタケ(sea panzy)（Renilla reniformis、例えばLorenzら, 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88 (10): 4438-4442参照）、及びツチボタル(Lampyris noctiluca、例えばSula-Newbyら, 1996, Biochem J. 313 : 761- 767参照)が挙げられるが、これらに限定されない。コメツキムシは、その種の異なるメンバーが異なる色の生物発光を放射する点で珍しく、546nm（緑）、560nm（黄緑）、578nm（黄色）、593nm（オレンジ）の光を放射する（例えば米国特許第6,475,719号、第6,342,379号及び第6,217,847号を参照のこと、これらは参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）。細菌のルシフェリン-ルシフェラーゼ系として、陸生のPhotorhabdus luminescensの細菌lux遺伝子（例えばManukhovら, 2000, Genetika 36 (3): 322-30を参照）及び海洋細菌Vibrio fischeriとVibrio harveyi(それぞれ、例えばMiyamotoら, 1988, J Biol Chem. 263 (26): 13393-9、及びCohnら, 1. 983, Proc Natl Acad Sci USA., 80 (1) : 120-3を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明に包含されるルシフェラーゼとして、米国特許第6,265,177号（Squirrellら、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）に開示される突然変異ルシフェラーゼが挙げられる。
【０３４９】
好ましい形態において、ルシフェラーゼは、上に挙げた文献に述べられているように、ホタルのルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ又はコメツキムシルシフェラーゼであり、これらの文献の記載は、参照によってそのまま組み込まれる。
【０３５０】
緑色蛍光タンパク質
緑色蛍光タンパク質（「GFP」）は、蛍光を発するために、別の基質又は補助因子を必要としない発色団の形成に関与するアミノ酸残基65〜67を有する、238アミノ酸タンパク質である(例えば、Prasherら, 1992, Gene 111: 229-233; Yangら, 1996, Nature Biotechnol. 14: 1252-1256;及びCodyら, 1993, Biochemistry 32: 1212- 1218を参照)。
【０３５１】
本明細書で使用される、用語「緑色蛍光タンパク質」又は「GFP」は、すべてのGFP（緑色以外の色を示す様々な形のGFPを含む）又はGFP活性を有するGFP由来の組換え酵素を包含することを意図する。好ましい実施形態において、GFPは緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、及び青色蛍光タンパク質を含む。GFPの天然の遺伝子は、生物発光クラゲAequorea victoriaからクローニングされる(例えば、Morinら, 1972, J. Cell Physiol. 77: 313- 318を参照)。野生型GFPは、主要励起ピーク395nm及び主要励起ピーク470nmを有する。470nmの吸収ピークにより、標準的なフルオレセインイソチオシアネート（FITC）フィルターセットを使ってGFPレベルのモニタリングが可能である。GFP遺伝子の突然変異体は、発現を高め、励起及び蛍光発光を変えるのに有用であることが分かっている。例えば、位置65のセリンに対して置換されたアラニン、グリシン、イソロイシン又はスレオニンを有する突然変異GFPは、最大限の励起のシフトで突然変異GFPになり、488nmで励起されると野生型タンパク質よりも大きい蛍光発光を発生する(例えばHeimら, 1995, Nature 373: 663-664; 米国特許第5,625,048号; Delagraveら, 1995, Biotechnology 13: 151-154; Cormackら, 1996, Gene 173: 33-38;及びCramerら, 1996, Nature Biotechnol. 14: 315-319を参照)。GFPを488nmで励起する能力により、標準的な蛍光発色セルソーティング（「FACS」）装置でのGFPの使用が可能になる。別の実施形態において、GFPは、クラゲ以外の生物、例えばウミシイタケ（Renilla reriformis）から単離されるが、これに限定されない。
【０３５２】
一般的にGFPで細胞を標識する技術は、米国特許第5,491,084号及び第5,804,387号（これらは参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）; Chalfieら, 1994, Science 263: 802-805; Heimら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12501-12504; Moriseら, 1974, Biochemistry 13: 2656-2662; Wardら, 1980, Photochem. Photobiol. 31: 611-615; Rizzutoら, 1995, Curr. Biology 5: 635-642;及びKaether及びGerdes, 1995, FEBS Lett 369: 267-271で説明されている。大腸菌及び線虫（C. elegans）のGFPの発現は、Tanら、米国特許第6,251,384号に開示されており、これは、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。植物細胞のGFPの発現は、Hu及びCheng, 1995, FEBS Lett 369: 331-33で議論されており、ショウジョウバエ（Drosophila）でのGFP発現は、Davisら, 1995, Dev. Biology 170: 726-729に記載されている。
【０３５３】
β-ガラクトシダーゼ
β-ガラクトシダーゼ（「beta-gal」）は、ラクトース、及びガラクトシド類似体であるo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（「ONPG」）とクロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド(「CPRG」)を含む、β-ガラクトシドの加水分解を触媒する酵素である(例えば、Nielsenら, 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80 (17): 5198-5202; Eusticeら, 1991, Biotechniques 11: 739-742;及びHendersonら, 1986, Clin. Chem. 32: 1637-1641を参照)。beta-gal遺伝子のタンパク質産生物は、細胞溶解物中でタンパク質分解に対して耐性で非常に安定しており、容易にアッセイできるので、beta-gal遺伝子はレポーター遺伝子として十分に機能する。ONPGを基質として使用する場合、beta-gal活性は、分光光度計又はマイクロプレートリーダーで定量することができる。
【０３５４】
本明細書で使用される、用語「β-ガラクトシダーゼ」又は「beta-gal」は、lacZ遺伝子産物、又はbeta-gal活性を有するbeta-gal由来の組換え酵素を含む、すべてのbeta-galを包含する意図である。beta-gal遺伝子のタンパク質産生物は、細胞溶解物中でのタンパク質分解に対して耐性で非常に安定しており、容易にアッセイできるので、beta-gal遺伝子はレポーター遺伝子として十分に機能する。ONPGが基質の場合の実施形態において、beta-gal活性は分光光度計又はマイクロプレートリーダーで定量することができ、420nmで変化するONPGの量を測定する。CPRGが基質の場合の実施形態において、beta-gal活性を、分光光度計又はマイクロプレートリーダーで定量することができ、570〜595nmで変化するCPRGの量を測定する。更に別の実施形態において、beta-gal活性は、Xgal及びIPTGを含むプレート上にbeta-gal構築物で形質転換した細菌細胞をプレーティングすることにより、視覚的に確認できる。細菌のコロニーが紺青色であると、高いbeta-gal活性が存在することを示し、コロニーが変化する薄暗い青色であると、beta-gal活性のレベルが変化していることを示す。
【０３５５】
β-グルクロニダーゼ
β-グルクロニダーゼ（「GUS」）は、非常に広範多様なβ-グルクロニドの加水分解を触媒し、かなり低い効率性を有し、いくつかのβ-ガラクツロニドを加水分解する。GUSは非常に安定であり、多くの界面活性剤及び広範多様なイオン条件を許容し、補助因子はなく、またイオン要求性もなく、pH、5.0〜7.8の間の最適な生理学的なpHでアッセイでき、かつ熱失活に対して適度に耐性である（例えば、米国特許第5,268,463号を参照、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）。
【０３５６】
ある実施形態において、GUSは大腸菌β-グルクロニダーゼ遺伝子由来である。本発明の別の実施形態において、β-グルクロニダーゼをコードする核酸は、大腸菌のβ-グルクロニダーゼ遺伝子に相同であり、及び/又は別の生物又は種由来でもよい。
【０３５７】
GUS活性は、蛍光発光又は分光分析のどちらか、又は米国特許第5,268,463号に開示された方法でアッセイすることができ、その記載は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。蛍光発光アッセイにおいて、4-トリフルオロメチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニドは、GUSに対して非常に感受性の高い基質である。蛍光発光の最大は、500nmに近く、青みがかった緑で、ほとんどの植物の化合物は、蛍光を発せず又は吸収しない。また、4-トリフルオロメチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニドは、中性pH付近ではるかに強い蛍光を発し、MUGを用いるよりもずっと容易に連続アッセイを行うことができる。4-トリフルオロメチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニドは、インビボで蛍光発光インジケーターとして使用できる。分光測定アッセイは、非常に直接的であり適度に感度がよい(Jeffersonら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8447-8451)。分光光度測定に好ましい基質は、p-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドであり、GUSで切断されると発色団p-ニトロフェノールを放出する。その発色団のpKa（約7.15）よりも大きいpHで、イオン化された発色団は、400〜420nmの光を吸収し、黄色を発する。
【０３５８】
β-ラクタマーゼ
β-ラクタマーゼは、β-ラクタムの加水分解の拡散律速触媒反応に関係する、ほぼ最適に近い酵素であり、細胞内レポーター酵素のタスクに適した加水分解を行う（例えば、Christensenら, 1990, Biochem. J. 266:853-861）。β-ラクタマーゼは、ペニシリン及びセファロスポリンなどのβ-ラクタム抗生物質のβ-ラクタム環を切断し、そのプロセスにおいて新しい荷電した部分を生ずる（例えば、O'Callaghanら, 1968, Antimicrob. Agents. Chemother. 8 : 57-63及びStratton, 1988, J. Antimicrob. Chemother. 22, Suppl. A: 23-35を参照)。非常に多くのβ-ラクタマーゼが、単離され、特徴付けされており、それらのすべては本発明に従って使用するのに適切であろう(例えば、Richmond及びSykes, 1978, Adv. Microb. Physiol. 9: 31-88 and Ambler, 1980, Phil. Trans. R. Soc. Lond. [Ser. B.] 289: 321- 331を参照、その記載は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる)。
【０３５９】
使用される例示的なβ-ラクタマーゼのコード領域は、米国特許第6,472,205号、 Kadonagaら, 1984, J. Biol. Chem. 259: 2149-2154、及びSutcliffe, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3737-3741に説明されており、これらの記載は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。本分野の当業者にとって直ちに明らかであるように、このβ-ラクタマーゼのコード領域と、β-ラクタマーゼ活性を有するペプチドについての他の類似配列は、本発明に従う使用において、同じくらいに適切であろう。蛍光発生的な基質（米国特許第6,472,205号、第5,955,604号及び第5,741,657号参照、これらの記載は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）と適切なβ-ラクタマーゼとの組合わせは、米国特許第4,740,459号（参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）で開示されているような、広範多様な異なるアッセイ系で使用することができる。
【０３６０】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）は、一般的に、哺乳動物細胞系のレポーター遺伝子として使用される。なぜならば、哺乳動物細胞はCAT活性の検出レベルを有していないからである。CATのアッセイには、放射標識されたクロラムフェニコールと適切な補助因子と一緒に細胞抽出物をインキュベーションする工程と、出発材料を、例えば薄層クロマトグラフィー（「TLC」）により生成物から分離し、その後シンチレーションカウンティングする工程を含む（例えば、米国特許第5,726,041号を参照、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）。
【０３６１】
ここで使用される、用語「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」又は「CAT」は、すべてのCAT、又はCAT活性を有するCAT由来の組換え酵素を包含する意図である。細胞の処理、ラジオアイソトープ、及びクロマトグラフ的な分離を必要としないレポーター系は、ハイスループットスクリーニングに受け入れられることが好ましく、レポーター遺伝子の安定性が重要な状況においては、レポーター遺伝子のCATが好ましいであろう。例えば、CATレポータータンパク質は、約50時間のインビボの半減期を有し、累積的変化タイプ対動力学的変化タイプの結果が望まれる場合に有利である。
【０３６２】
分泌型アルカリフォスファターゼ
分泌型アルカリフォスファターゼ（「SEAP」）酵素は、アルカリフォスファターゼの切断型であり、タンパク質の膜貫通ドメインの切断により、細胞から周囲の培地にSEAPを分泌することが可能になる。好ましい実施形態において、アルカリフォスファターゼは、ヒトの胎盤から単離される。
【０３６３】
本明細書で使用される、用語「分泌型アルカリフォスファターゼ」又は「SEAP」は、すべてのSEAP又はアルカリフォスファターゼ活性を有するSEAP由来の組換え酵素を包含することを意図する。SEAP活性は様々な方法により検出でき、蛍光基質の触媒反応の測定、免疫沈降、HPLC及び放射能測定検出が挙げられるが、これらに限定されない。この発光の方法は、熱量測定検出方法以上に感度が高いので、好ましい。SEAPを使用する利点は、SEAPタンパク質が細胞の外に分泌されるので、細胞溶解のステップが必要ないことであり、サンプリングとアッセイ手順の自動化を容易にする。C型肝炎ウイルスプロテアーゼの阻害剤についての細胞に基づく評価に使用するための、SEAPを使う細胞に基づくアッセイは、Pottsらの米国特許第6,280,940号に開示されており、参照によって本明細書にそのまま組み込まれる。
【０３６４】
4.5.4.1.2 tRNAイントロン
tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体により認識され切断されるヌクレオチド配列は、周知の分子生物学的方法を利用して、mRNAがフレーム外のレポーター遺伝子をコードするように、レポーター遺伝子のコード領域に挿入することができる。例えば、バルジ-ヘリックス-バルジ構造又は前駆体tRNAの成熟ドメインを含むヌクレオチド配列を、mRNAがフレーム外のレポーター遺伝子をコードするように、レポーター遺伝子のコード領域に挿入できる。あるいは、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体に認識され切断されるヌクレオチド配列を、レポーター遺伝子構築物の5’非翻訳領域、3’非翻訳領域、又は5’及び3’非翻訳領域の両方に挿入してもよい。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体により認識され切断されるヌクレオチド配列は、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、55ヌクレオチド、60ヌクレオチド、65ヌクレオチド、75ヌクレオチド、100ヌクレオチド、125ヌクレオチド、150ヌクレオチド又はそれ以上含んでもよい。ある実施形態において、ヌクレオチド配列は少なくとも10ヌクレオチドの長さである。
特定の実施形態において、tRNAイントロンを、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内に挿入する。別の実施形態において、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上のtRNAイントロンを、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内に挿入する。それとは別の実施形態において、tRNAイントロンを、レポーター遺伝子構築物の5’非翻訳領域、3’非翻訳領域、又は5’及び3’非翻訳領域内の両方に挿入する。別の実施形態において、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上のtRNAイントロンを、レポーター遺伝子構築物の5’非翻訳領域、3’非翻訳領域、又は5’及び3’非翻訳領域内の両方に挿入する。tRNAイントロンはバルジ-ヘリックス-バルジ構造を含めることができる。
【０３６５】
tRNAイントロンを含むレポーター遺伝子は、当業者に周知の方法で作ることができる。例えば、tRNAイントロンを含むレポーター遺伝子を、ホスホアミダイト又は他の液体若しくは固相の方法を使って化学的に合成できる。ホスホアミダイトの方法によりポリヌクレオチドを形成するのに使用される化学反応の詳細な内容は周知である（例えば、Caruthers ら, 米国特許第4,458,066号及び第4,415,732号; Caruthersら, 1982, Genetic Engineering 4: 1-17 ; Users Manual Model 392 and 394 Polyeucleotide Synthesizers, 1990, 6-1ページから6-22ページ, Applied Biosystems, Part No. 901237; Ojwangら, 1997, Biochemistry, 36: 6033-6045を参照）。合成後、tRNAイントロンを含むレポーター遺伝子は、当業者に公知の標準的な技術を使って精製できる（Hwangら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (23): 12997-13002及び本文献で参照される文献を参照のこと）。tRNAイントロンを含むレポーター遺伝子の長さとその合成方法に応じた、そのような精製技術としては、逆相高性能液体クロマトグラフィー（「逆相HPLC」）、高速液体クロマトグラフィー（「FPLC」）、及びゲル精製が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光受容体の一部、蛍光供与体の一部及び/又は消光剤で基質を標識する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第6,472,156号、第6,451,543号、第6,348,322号、第6,342,379号、第6,323,039号、第6,297,018号、第6,291,201号、第6,280,981号、第5,843,658号及び第5,439,797号を参照、これらの記載は参照によって本明細書にそのまま組み込まれる）。
【０３６６】
4.5.4.1.3 3’末端プレ-mRNA切断部位
3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼは、3’末端でプレ-mRNAを切断し、mRNAの3’末端に、その後ポリアデニル化を起こす。切断部位とポリアデニル化部位は、保存されたヘキサヌクレオチド、即ち上流のAAUAAAと下流のG/Uリッチ配列エレメントの間に位置する。当業者に公知の方法により、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの活性を検出、定量することができる。
【０３６７】
3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの活性についてのアッセイは、細胞内で、細胞抽出物を使って、又は精製された哺乳動物の3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体をインビトロで使って、行うことができる。3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の説明については、セクション4.2.2を参照されたい。
【０３６８】
アッセイを細胞で行う場合、その細胞は、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの活性を必要とするすべての構成成分を発現する。より特定の実施形態において、細胞は、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体のすべての構成成分を内生的に発現する、哺乳動物の細胞、例えばヒトの細胞である。他の実施形態において、細胞は、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の１つ以上の構成成分を組換えで発現するように改変されている。更に、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ反応の、検出可能な標識された基質を、当業者に公知の技術により細胞の中に微量注入又は形質移入（永久に又は一時的に）することができる。レポーター遺伝子構築物を基質として使用する場合、基質を、細胞の中に微量注入するか形質移入（永久に又は一時的に）するか、又は細胞を、レポーター遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれるように改変してもよい。
【０３６９】
ある実施形態において、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの活性を検出及び/又は定量するのに、3’末端プレ-mRNAレポーター遺伝子構築物を基質として使用する（図19参照）。ある実施形態において、3’末端プレ-mRNAレポーター遺伝子構築物は、２つのオープンリーティングフレーム（ORF）、即ち上流と下流のORFをコードし、ここで、２つのORFは、切断及びポリアデニル化シグナルにより分けられ、3’に位置するORFは、配列内リボソーム進入部位（IRES）に先行される。3’末端プレ-mRNAレポーター遺伝子構築物の例については、図18を参照されたい。切断が切断部位又はポリアデニル化部位で行われる場合、構築物の3’末端の下流のレポーター遺伝子は転写されない。従って、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼが活性化すればするほど、下流のレポーター遺伝子が発現しなくなる。3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの活性が低くなればなるほど、即ち、阻害剤の存在下では、下流レポーター遺伝子を含むRNAがもっと転写されるだろう。次に、下流のレポーター遺伝子はIRESを介して翻訳される。どのIRMSでも本発明の方法に使用できる。特定の実施形態において、IRESはC型肝炎ウイルス（HCV）のIRESである。基質は、当業者に公知の組換えDNA技術により作ることができる。
【０３７０】
ある実施形態において、3’末端プレ-mRNAレポーター遺伝子構築物の上流のレポーター遺伝子と下流のレポーター遺伝子との比を読み取る。従って、3’末端プレ-mRNA切断の増加により、上流のレポーター遺伝子：下流のレポーター遺伝子の比が増加するだろう。3’末端プレ-mRNA切断の減少により、上流レポーター遺伝子：下流レポーター遺伝子の比は減少するだろう。
【０３７１】
4.5.4.1.4 ベクター
レポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列及びtRNAイントロン、3’末端プレ-mRNA切断部位、プレ-tRNA切断部位又はrRNA切断部位をコードしているヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、即ち挿入されたタンパク質コード配列の転写と翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。また、必要な転写及び翻訳シグナルを、レポーター遺伝子により供給することができる。レポーター遺伝子を発現するのに様々な宿主-ベクター系を利用することができる。これらには、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、又はバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA又はコスミドDNAで形質転換された細菌、及び各種マーカーを使う形質転換により作られた安定な細胞系統が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、その強さと特異性の点で異なる。使用する宿主-ベクター系に応じて、多くの適切な転写及び翻訳要素の一つを使うことができる。
【０３７２】
ベクターへのDNA断片の挿入について先に述べた方法を、適切な転写/翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列から成るキメラ核酸を含む発現ベクターを作製するのに使用することができる。これらの方法として、インビトロの組換えDNAと合成技術及びインビボの組換え体（遺伝的組換え）が挙げられる。レポーター遺伝子構築物の発現は、レポーター遺伝子が組換えDNA分子で形質転換された宿主で発現されるように、第二の核酸配列によって制御することができる。例えば、レポーター遺伝子構築物の発現を、当該技術分野で公知のプロモーター/エンハンサー要素、例えば構成的プロモーター、組織特異的プロモーター又は誘導型プロモーターで制御できる。遺伝子発現を制御するのに使用できるプロモーターの具体的な例として、SV40初期プロモーター領域(Bernoist及びChambon, 1981, Nature 290: 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto ら, 1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296: 39-42)、β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター(Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75: 3727-3731)、又はtacプロモーター(DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 21-25);また「Useful proteins from recombinant bacteria」 Scientific American, 1980,242 : 74-94も参照されたい;ノパリン合成酵素プロモーター領域を含む植物発現ベクター(Herrera-Estrellaら, Nature 303: 209- 213)又はカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら, 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871)、及び光合成酵素リブロース２リン酸カルボキシラーゼのプロモーター (Herrera-Estrellaら, 1984, Nature 310: 115-120); 酵母又は他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal 4プロモーター、ADC(アルコールジヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物に使用されている、以下の動物の転写制御領域:膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら, 1984, Cell 38 : 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515);膵臓β細胞で活性なインシュリン遺伝子制御領域 (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122),リンパ球で活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域 (Grosschedlら, 1984, Cell 38: 647-658; Adamesら, 1985, Nature 318 : 533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), 精巣、乳房、リンパ球及びマスト細胞で活性なマウス乳がんウイルス制御領域 (Lederら, 1986, Cell 45: 485-495),肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域 (Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1: 268-276),肝臓で活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域 (Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235: 53-58; 肝臓で活性なα1-抗トリプシン遺伝子制御領域 (Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1: 161-171),骨髄細胞で活性なβ-グロブリン遺伝子制御領域(Mogramら, 1985, Nature 315: 338-340 ; Kolliasら, 1986, Cell 46: 89-94;脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質制御領域(Readheadら, 1987, Cell 48 : 703-712); 骨格筋で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314: 283-286),及び視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら, 1986, Science 234: 1372-1378)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７３】
特定の実施形態において、レポーター遺伝子、１つ以上の複製開始点、及び任意に、１つ以上の各種マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）に操作可能に結合したプロモーターを含むベクターを使用する。好ましい実施形態において、ベクターはCMVベクター、T7ベクター、lacベクター、pCEP4ベクター、5.0/Fベクター、又はテトラサイクリン-調節プロモーター（例えばInvitrogenのpcDNATM5/FRT/TO）を持つベクターである。
【０３７４】
本発明のレポーター遺伝子構築物を含む発現ベクターを、３つの一般的な方法により同定することができる：(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」核酸の機能の存在又は不存在、(c)挿入された配列の発現、及び(d)配列決定。一番目の方法において、発現ベクターに挿入されたレポーター遺伝子の存在は、挿入されたレポーター遺伝子に相同な配列を含むプローブを使う核酸ハイブリダイゼーションにより検出できる。二番目の方法において、組換えベクター/宿主系は、目的の核酸、即ちレポーター遺伝子構築物を、ベクターに挿入することによって生じる、特定の「マーカー」核酸機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける包埋体（occlusion body）の形成など)の存在又は不存在に基づいて、同定し、選択することができる。例えば、目的の核酸をベクターのマーカー核酸配列内に挿入する場合、挿入物を含む組換え体を、マーカー核酸機能の不存在により同定することができる。三番目の方法において、組換え発現ベクターを、組換え体により発現されたレポーター遺伝子産物をアッセイすることにより同定できる。このようなアッセイは、例えば特定のレポーター遺伝子の物理的又は機能的性質に基づくことができる。
【０３７５】
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子構築物は、安定な細胞系統の発現ベクターにクローン化される。好ましい実施形態において、安定な細胞系統発現ベクターは、部位特異的なゲノム組み込み部位を含む。別の好ましい実施形態において、レポーター遺伝子構築物は、エピソームの哺乳動物発現ベクターにクローン化される。
【０３７６】
4.5.4.1.5 形質移入
適切な遺伝子をコードするベクターが合成されると、宿主細胞を目的のベクターで形質転換又は形質移入する。安定な形質転換体の使用が好ましい。好ましい実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。より好ましい実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、目的の組織又は他の生物学的サンプルから単離された初代細胞である。本発明の方法で使用できる宿主細胞は、ハイブリドーマ、プレ-B細胞、293細胞、293T細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、K562細胞、3T3細胞が挙げられるが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、供給源由来、例えば組織由来の不死化細胞系統である。本発明で使用できる他の宿主細胞は、ウイルス性感染した細胞であるが、これに限定されない。
【０３７７】
形質転換は、宿主細胞の中にポリヌクレオチドを導入する公知の方法でよく、例えば、ウイルスにポリヌクレオチドをパッケージングすること、ウイルスで宿主細胞を形質導入すること、及びポリヌクレオチドの直接的取り込みによることが挙げられる。使用する形質転換の手順は、形質転換される宿主細胞に依存する。直接的取り込みによる哺乳動物の形質転換（即ち形質移入）は、Graham及びVan der Eb, 1978, Virol. 52: 546のリン酸カルシウム沈降法、又はその様々な公知の改変を使用して行うことができる。細胞に、特に哺乳動物細胞に、組換えポリヌクレオチドを導入する他の方法として、デキストランによる形質移入、リン酸カルシウムによる形質移入、ポリブレンによる形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソームでのポリヌクレオチドのカプセル化及びポリヌクレオチドの核への直接的な微量注入が挙げられる。このような方法は当業者に周知である。
【０３７８】
好ましい実施形態において、目的の構築物を含む安定な細胞系統は、ハイスループットスクリーニング用に作られる。このような安定な細胞系統は、選択可能なマーカーを含むレポーター遺伝子構築物を導入することにより作ることができ、富裕培地で1〜2日間細胞を成長させることができ、次に選択培地で細胞を成長させる。組換えプラスミドの選択マーカーは、その選択に耐性を与え、細胞が、プラスミドを細胞の染色体に安定に組み込み、次にクローニングされて細胞系統に増殖し得る細胞巣を形成するように成長することを可能にする。
【０３７９】
多くの選抜系を使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11: 223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22: 817）遺伝子が挙げられ、tk-、hgprt-又はaprt-細胞にそれぞれ使用できるが、これらに限定されない。また、メトトレキサート耐性を与えるdhfr遺伝子（Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）、ミコフェノール酸耐性を与えるgpt遺伝子（Mulligan及びBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）、アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo遺伝子（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150: 1）及びハイグロマイシン耐性を与えるhygro遺伝子（Santerreら, 1984, Gene 30: 147）の選択の基準として、抗-代謝産物耐性を使用することができる。
【０３８０】
4.5.4.1.6 無細胞抽出物
本発明は、無細胞系におけるレポーター遺伝子構築物の翻訳に関する。特に指示がない限り、本発明のこの特定の態様を実施するための手法として、当業者に常用されている、分子生物学、微生物学、ならびに組換えDNAの操作および作製に関する従来技術を使用するだろう。例えば、Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版；DNA Cloning, Volumes IおよびII(Glover, Ed. 1985);ならびにTranscription and Translation(Hames & Higgins, Eds. 1984)を参照のこと。
【０３８１】
当業者に周知であるいずれかの手法を用いて、in vitro翻訳用に無細胞抽出物を作製しうる。例えば、細胞を遠心分離し、この上清を澄ませることによって、in vitro翻訳反応用の無細胞抽出物を作製できる。特に、本発明に従って利用する細胞抽出物としては、S1抽出物（すなわち、1,000×g回転に由来する上清）からS500抽出物（すなわち、500,000×g回転に由来する上清）であり、好ましくはS10抽出物（すなわち、10,000×g回転に由来する上清）からS250抽出物（すなわち、250,000×g回転に由来する上清）でありうる。特定の実施形態において、本発明に従って利用する細胞抽出物は、S50抽出物（すなわち、50,000×g回転に由来する上清）からS100抽出物（すなわち、100,000×g回転に由来する上清）である。
【０３８２】
いずれの種を起源とする細胞からも無細胞翻訳抽出物を単離しうる。例えば、ヒト細胞、マウス培養細胞、ラット培養細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、またはライ麦胚から無細胞翻訳抽出物を単離しうる（例えば、KriegおよびMelton, 1984, Nature 308：203ならびにDignamら、1990 Methods Enzymol. 182：194−203を参照のこと）。あるいは、例えば、Promega,(Madison, WI)から、無細胞翻訳抽出物（例えば、ウサギ網状赤血球ライセートおよび小麦胚芽抽出物）を購入できる。好ましい実施形態において、無細胞抽出物は、ヒト細胞から単離した抽出物である。より好ましい実施形態において、ヒト細胞は、HeLa細胞である。
【０３８３】
4.5.5 レポーター遺伝子系アッセイ
4.5.5.1 細胞系アッセイ
宿主細胞にレポーター遺伝子構築物を含むベクターを形質転換または形質移入させ、化合物ライブラリーを、合成するかまたは購入し、あるいはその両方を行った後、哺乳動物tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、哺乳動物3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、またはrRNA切断活性をモジュレートする化合物を同定するために、この細胞をライブラリースクリーニングに用いる。
【０３８４】
tRNAエンドヌクレアーゼ活性のアッセイを、細胞内で細胞抽出物を使用するか、またはin vitroで精製した哺乳動物tRNAエンドヌクレアーゼ複合体を使用して、行うことができる。アッセイを細胞内で行った場合、この細胞は、tRNAエンドヌクレアーゼ活性に必要とされる全ての構成成分を発現する。特定の、より具体的な実施形態において、この細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）であり、tRNAエンドヌクレアーゼ複合体の全ての構成成分を内在的に発現する。別の実施形態において、この細胞は、tRNAエンドヌクレアーゼ複合体の1つ以上の構成成分を組換え発現するように改変されている。さらに、検出可能に標識したtRNAエンドヌクレアーゼ反応の基質を当業者に既知であるところのいずれかの方法によって細胞へ顕微注入または（永久にまたは一過的に）形質移入させうる。レポーター遺伝子構築物を、基質として使用する場合、この基質を細胞へ顕微注入するか、（永久的にまたは一過的に）形質移入させるか、あるいは細胞のゲノムにこのレポーター遺伝子が組み込まれるように細胞を改変させうる。
【０３８５】
プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をアッセイする場合、化合物または化合物ライブラリーのメンバーを、レポーター遺伝子とこのレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム内にtRNAイントロンを含むか、またはこのレポーター遺伝子構築物の5'側非翻訳領域、3'側非翻訳領域、もしくは5'側非翻訳領域と3'側非翻訳領域との2箇所にtRNAイントロンを含むか、あるいはこのレポーター遺伝子のmRNAのスプライス部位内にtRNAイントロンを含むレポーター遺伝子構築物を含むように遺伝子操作した細胞と接触させ、そしてこのレポーター遺伝子の発現を測定することによって、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性についてレポーター遺伝子系アッセイを行いうる。
【０３８６】
所定の基準範囲（レポーター遺伝子系アッセイにおける化合物の非存在下または対照）に対するレポーター遺伝子発現の変化は、特定の化合物が、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートすることを示す。所定の基準範囲（レポーター遺伝子系アッセイにおける化合物の非存在下または対照）に対するレポーター遺伝子発現の低下は、特定の化合物が、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性（例えば、tRNAイントロンの認識または切断）を低減または阻害することを示す。所定の基準範囲（レポーター遺伝子系アッセイにおける化合物の非存在下または対照）に対するレポーター遺伝子発現の増加は、特定の化合物が、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増強させることを示す。好ましい実施形態において、陰性対照（例えば、PBSまたはレポーター遺伝子の発現に影響がないことが知られている別の因子）および陽性対照（例えば、レポーター遺伝子の発現に影響することが知られている因子、好ましくはヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性に影響する因子）を、本明細書中に記載する細胞系アッセイに含める。特定の実施形態において、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは、ヒトプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体である。
【０３８７】
3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性についてのアッセイを、細胞内で細胞抽出物を用いるか、またはin vitroで、精製した哺乳動物3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体を用いて行うことができる。このアッセイを細胞内で行う場合、細胞は3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性に必要とされる全ての構成成分を発現する。特定の、より具体的な実施形態において、細胞は哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）であって、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の全ての構成成分を内在的に発現する。別の実施形態において、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の1つ以上の構成成分を組み換え発現するように細胞を改変させる。さらに、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ反応の検出可能に標識した基質を、当業者に公知であるいずれかの方法で細胞に（永久的にもしくは一過的に）顕微注入または形質移入させることができる。基質としてレポーター遺伝子構築物を使用する場合、細胞へこの基質を(永久的にもしくは一過的に)顕微注入させるかまたは形質移入させるか、あるいはレポーター遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれるように細胞を改変させうる。
【０３８８】
3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性についてのレポーター遺伝子系アッセイを、化合物または化合物ライブラリーのメンバーをレポーター遺伝子および3'末端プレ−mRNA切断部位を含むレポーター遺伝子構築物を含むように遺伝子操作した細胞と接触させ行いうる。特定の実施形態において、この3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼは、ヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体である。
【０３８９】
3'末端プレ−mRNAレポーター遺伝子構築物は、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）(上流ORFおよび下流ORF)をコードし、この2つのORFは、切断・ポリアデニル化シグナルによって分けられ、3'側に位置するORFはリボソーム内部進入部位（IRES）よりも前にある。3'末端プレ−mRNAレポーター遺伝子構築物の例については、図１８を参照のこと。切断・ポリアデニル化部位で切断が生じた場合、構築物の3'末端にある下流レポーター遺伝子は転写されない。従って、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼがより活性であるほど、発現される下流のレポーター遺伝子は減少する。3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性がより小さい（すなわち、インヒビター存在下）ほど、転写される下流レポーター遺伝子を含むRNAは増加する。そして下流レポーター遺伝子は、IRESを介して翻訳されうる。
【０３９０】
特定の実施形態において、3'末端プレ−mRNAレポーター遺伝子構築物の上流レポーター遺伝子と下流レポーター遺伝子との比率を読み取る。従って、3'末端プレ−mRNA切断の増加は、上流レポーター遺伝子：下流レポーター遺伝子の比率を増加させるだろう。3'末端プレ−mRNA切断の減少は、上流レポーター遺伝子：下流レポーター遺伝子の比率を減少させるだろう。
【０３９１】
化合物または化合物ライブラリーのメンバーを、レポーター遺伝子構築物を含むように遺伝子操作した細胞と接触させる工程を、生理学的条件下で行いうる。特定の実施形態において、化合物または化合物ライブラリーのメンバーを、水溶液の存在下で細胞に加える。本実施形態において、この水溶液は、バッファおよび塩の組合わせ（好ましくは、生理学的条件に近いかまたは模倣したもの）を含みうる。あるいは、この水溶液は、バッファ、塩の組合わせ、および界面活性剤（detergent）または界面活性剤(surfactant)を含みうる。この水溶液に使用しうる塩の例としては、KCl、NaCl、および／またはMgCl2が挙げられるが、これらに限定されない。この水溶液で使用しうる各塩の最適濃度は、使用する細胞および化合物によって決まり、慣習的な実験を用いて決定できる。化合物または化合物ライブラリーのメンバーをレポーター遺伝子構築物を含むように遺伝子操作したヒト細胞と接触させる工程を、少なくとも0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間、または少なくとも1日間行いうる。
【０３９２】
一つの実施形態において、本発明はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性または3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するための方法に関する。この方法は、以下の工程：(a)細胞内でレポーター遺伝子を含む核酸を発現させる工程であって、ここでこのレポーター遺伝子は、tRNAイントロンまたは3'末端プレ−mRNA切断部位を含む、工程；(b)細胞を化合物または化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程；および(c)レポーター遺伝子の発現を検出する工程、を包含する。この方法において、化合物の存在下においてレポーター遺伝子の発現が、所定の基準範囲または化合物の非存在下もしくは対照の存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比べて変化する場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される。別の実施形態において、本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性またはプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するための方法に関する。この方法は、以下の工程：(a)化合物ライブラリーのメンバーをレポーター遺伝子を含む核酸を含む細胞と接触させる工程であって、このレポーター遺伝子はtRNAイントロンまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位を含む、工程；および(b)レポーター遺伝子の発現を検出する工程、を包含する。この方法において、化合物の存在下においてレポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下もしくは対照の存在下におけるレポーター遺伝子の発現の所定の基準範囲と比べて変化する場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性または3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される。
【０３９３】
細胞系レポーター遺伝子アッセイにおけるレポーター遺伝子の発現および／またはこのレポーター遺伝子にコードされるタンパク質の活性を、当業者に周知であるいずれかの方法により検出しうる。レポーター遺伝子の発現は、例えば、この遺伝子にコードされるタンパク質および／またはRNAを定量することで容易に検出できる。従って、遺伝子発現を検出および／または可視化するための免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降およびそれに続くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）、免疫細胞化学など）ならびに／あるいは遺伝子をコードするmRNAをそれぞれ検出および／または可視化することで遺伝子発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーションなど）などを含む（これらに限定されない）、当該分野で標準的な多数の方法を用いることができる。このようなアッセイは、当該分野で常用的なものであり、周知である(例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ausubelら、eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと)。典型的な免疫アッセイを以下に簡潔に記載する（しかし、方法を限定することを意図しない）。
【０３９４】
免疫沈降プロトコルは一般的に、以下の工程：例えば、RIPAバッファ（1％NP−40またはTriton X−100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム（pH7.2）、1% Trasylol）にタンパク質ホスファターゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充した溶解用バッファに細胞の集団を溶解する工程、抗原を認識する抗体を細胞溶解液へ添加する工程、40℃で一定の間（例えば1時間〜4時間）インキュベートする工程、プロテインAセファロースビーズおよび／またはプロテインGセファロースビーズを細胞溶解液へ添加する工程、40℃で約1時間以上インキュベートする工程、溶解用バッファでこのビーズを洗浄する工程ならびにSDS／試料バッファにこのビーズを再懸濁する工程を包含する。特定の抗原を免疫沈降させる抗体の能力を、例えば、ウエスタンブロット分析で調べることができる。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるように変更できるパラメーター（例えば、細胞溶解液をセファロースビーズで前洗浄する）を知っているだろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる論述については、例えば、Ausubelら、eds,1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons,Inc., New York at 10.16.1を参照のこと。
【０３９５】
ウエスタンブロット分析は一般に以下の工程：タンパク質の試料を調製する工程、ポリアクリルアミドゲルでこのタンパク質試料を電気泳動する工程（例えば、抗原の分子量に依存して8%〜20%のSDS−PAGE）、このポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、PVDFまたはナイロンのようなメンブレンへタンパク質試料を転写する工程、ブロッキング溶液（例えば、3% BSAまたは無脂肪乳を含むPBS）でこのメンブレンをブロッキングする工程、洗浄バッファ（例えば、PBS−Tween 20）でこのメンブレンを洗浄する工程、洗浄バッファで希釈した一次抗体（抗原を認識する抗体）でこのメンブレンをブロッキングする工程、洗浄バッファでこのメンブレンを洗浄する工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、32Pもしくは125I）に結合させたブロッキングバッファで希釈した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、坑ヒト抗体）でこのメンブレンをブロッキングする工程、洗浄バッファでこのメンブレンを洗浄する工程、ならびに抗原の存在を検出する工程、を包含する。当業者は、検出するシグナルを増強させ、バックグラウンドノイズを低減するように変更することができるパラメーターを知っているだろう。ウエスタンブロットのプロトコルに関するさらなる論述について、例えば、Ausubelらeds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons,Inc., New York at 10.8.1を参照のこと。
【０３９６】
ELISAは、以下の工程：抗原を調製する工程、この抗原で96ウェルマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする工程、このウェルに酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合させた一次抗体（抗原を認識する）を添加し、一定の時間インキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程、を包含する。ELISAでは、目的の抗体は検出可能な化合物に結合されておらず；その代わりに、検出可能な化合物に結合された二次抗体（一次抗体を認識する）をウェルに加えることができる。さらに、抗原でウェルをコーティングする代わりに、抗体でウェルをコーティングしうる。この場合、コーティングしたウェルに目的の抗原を添加した後、検出可能な化合物に結合させた二次抗体を添加しうる。当業者は、検出するシグナルを増強させるように改変できるパラメーターおよび当該分野で公知であるELISAの別の変更物を知っているだろう。ELISAに関するさらなる論述について、例えば、Ausubelら、eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons,Inc., New York at 11.2.1を参照のこと。
【０３９７】
使用するレポーター遺伝子によって、レポーター遺伝子にコードされるタンパク質の活性を検出する方法は変化するだろう。種々のレポーター遺伝子のアッセイは、当業者に周知である。例えば、第5.2.1節に記載するように、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（「β−gal」）、β−グルクロニダーゼ（「GUS」）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）、およびアルカリホスファターゼ（「AP」）は、基質の存在下で分析できる酵素であり、ハイスループットスクリーニングになじみやすいだろう。例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（「β−gal」）、およびアルカリホスファターゼ（「AP」）の反応生成物を、光の造影（例えば、ルシフェラーゼ）、分光光度計の吸光度（例えば、β−gal）、または蛍光（例えば、AP）の変化でアッセイする。光出力、吸光度、および／または蛍光の変化についてのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適合される。例えば、β−gal活性をマイクロプレートリーダーを用いて測定できる。緑色蛍光タンパク質（「GFP」）の活性を、蛍光の変化で測定できる。例えば、488nmの蛍光を発する突然変異体GFPの場合、GFP活性に基づいて細胞を選別するために、標準的な蛍光活性化細胞選別（「FACS」）装置を使用することができる。
【０３９８】
レポーター遺伝子の発現レベルを陰性対照（例えば、PBSまたはレポーター遺伝子の発現に影響しないことが公知である別の因子）および、選択的に陽性対照（例えば、レポーター遺伝子の発現に影響することが公知である因子、好ましくは、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性に影響する因子）と比較して、レポーター遺伝子の発現変化を決定しうる。あるいは、レポーター遺伝子の発現レベルを所定の基準範囲と比較して、レポーター遺伝子の発現変化を決定しうる。
【０３９９】
4.5.5.2 無細胞アッセイ
レポーター遺伝子構築物を含むベクターを作製し、無細胞翻訳抽出物を、生成するか購入し、ならびに化合物ライブラリーを、合成するか購入するかまたはその両方を行った後、この無細胞翻訳抽出物と核酸とを、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物を同定するためにライブラリーのスクリーニングに使用する。レポーター遺伝子系アッセイを、無細胞様式で、化合物を無細胞抽出物およびレポーター遺伝子構築物を含むレポーター遺伝子構築物（3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性か、またはプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をアッセイするのかによって、レポーター遺伝子およびプレ−tRNAスプライシング部位または3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ部位を各々含む）と接触させ、このレポーター遺伝子の発現を測定することで行いうる。このようなレポーター遺伝子系アッセイにおける、所定の基準範囲、化合物の非存在下または対照に対するレポーター遺伝子の発現変化は、特定の化合物がtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたはプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートすることを示す。
【０４００】
無細胞抽出物中の化合物の活性を、レポーター遺伝子にコードされるレポータータンパク質の活性をアッセイするか、あるいは、例えば、in vitroで翻訳されたタンパク質を（例えば、35Sで標識したメチオニンを用いて）標識するか、ノーザンブロット分析、RT−PCR、または免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット分析もしくは免疫沈降）によって、レポーター遺伝子の発現を定量することによって決定できる。このような方法は、当業者に周知である。
【０４０１】
4.5.6 FRETアッセイ
蛍光共鳴エネルギー転移（「FRET」）を、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの複合体の活性の変化を検出するために使用できる。本明細書中に記載するFRETアッセイにおいて、本発明の複合体のサブユニットまたはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼもしくは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの複合体の基質を、発蛍光団で標識しうる。
【０４０２】
蛍光供与体部分と蛍光受容体部分または消光剤との間のFRETを得るために、これらの2つの部分は、空間的に互いに近接していなければならない。従って、特定の実施形態において、蛍光供与体部分と蛍光受容体部分または消光剤とが互いに、ほぼ0.5nm、ほぼ1nm、ほぼ5nm、ほぼ10nm、ほぼ20nm、ほぼ30nm、ほぼ40nm、ほぼ50nm、またはほぼ100nm離れるように、本発明の複合体の基質またはサブユニットを標識する。
【０４０３】
本明細書中に記載するFRETアッセイにおいてヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質として、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに認識され切除されるいずれかのヌクレオチド配列を用いうる。例えば、本明細書中に記載されるFRETアッセイにおいてヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質として、前駆体tRNAのバルジ−ヘリックス−バルジ構造または成熟ドメインを含むヌクレオチド配列を用いうる。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに認識され、切除されるヌクレオチド配列は、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、55ヌクレオチド、60ヌクレオチド、65ヌクレオチド、75ヌクレオチド、100ヌクレオチド、125ヌクレオチド、150ヌクレオチド、またはそれ以上を含みうる。特定の実施形態において、本明細書中に記載するFRETアッセイに用いるtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質は、tRNAイントロンを含む。この基質は、バルジ−ヘリックス−バルジ構造を含みうる。好ましい実施形態において、この基質は、イントロンを含むtRNA成熟ドメインを含む。
【０４０４】
特定の実施形態において、図１に示す基質をFRETアッセイに使用する。特に、図１Ｂおよび図１Ｃにそれぞれ示すハイブリダイズしたtRNA基質および環状にしたtRNA基質を、FRETアッセイに使用する。5'末端の発蛍光団と3'末端の発蛍光団とが空間的に近接し、蛍光共鳴エネルギー転移を生じるように、ハイブリダイズしたtRNA基質（図１Ｂ）のイントロンの5'末端および3'末端の自由末端または環状にしたtRNA基質（図１Ｃ）のイントロンの5'末端および3'末端の自由末端を、発蛍光団で標識しうる。そして、基質の切断によって、標識した5'末端と標識した3'末端が空間的に離され、蛍光共鳴エネルギー転移を減じるだろう。このように当業者は、FRETを測定し、切断されていない基質に対する切断された基質の濃度を決定できる。FRETが減少するにつれて、切断されていない基質の濃度は減少する。
【０４０５】
あるいは、3'末端または5'末端を発蛍光団で標識し、もう一方の端（すなわち、5'末端または3'末端）をそれぞれ発蛍光団の消光剤で標識する。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼによるイントロンの切断時に、消光剤および発蛍光団は互いに引き離され蛍光の測定可能な変化を生じる。この蛍光シグナルは、切断反応が進むにつれて増強される。
【０４０６】
特定の実施形態において、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の基質を、その切断によってFRETが減少するように標識する（すなわち、一つの端を発蛍光団の供与体で標識し、もう一方の端を発蛍光団の受容体で標識する）。あるいは、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の基質を、その切断によってシグナルを生じるように標識する。本実施形態において、この基質の一つの端を、発蛍光団で標識し、もう一方の端を消光剤で標識する。
【０４０７】
本発明によると、基質を一対の蛍光供与体部分と蛍光受容体部分で標識できる。基質を異なる対数の蛍光供与体部分と蛍光受容体部分を用いて標識できる。例えば、二対、三対、四対、五対またはそれ以上の対数の蛍光供与体部分と蛍光受容体部分を用いることができる。この場合好ましくは、これらの対の少なくとも一つは、他の対の少なくとも一つの蛍光受容体部分とは異なる発光スペクトルを有する蛍光受容体部分を有する。あるいは、少なくとも三対を用いる場合、第一の対、第二の対および第三の対の蛍光受容体部分は、他の二つの蛍光受容体部分と比べて異なる発光スペクトルを有する。基質を蛍光受容体部分、蛍光供与体部分および／または消光剤で標識する方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201号、同第6,280,981号、同第5,843,658号および同第5,439,797号を参照のこと、これらの開示はその全体が参考として援用される）。標識した基質を、当業者に周知の方法を用いてヒト細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞）へ顕微注入または形質移入させる（例えば、Adamsら1991, Nature 349:694−697を参照のこと）。
【０４０８】
4.5.6.1 標識した基質を用いた細胞系アッセイ
細胞へtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質または3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの基質を顕微注入または（例えば、リポソームもしくはエレクトロポレーションを用いて）形質移入させ、この細胞と化合物を接触させることによって、FRET細胞系アッセイを行いうる（例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光顕微鏡または蛍光発光検出器）。ここではこの基質を、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体またはプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体のいずれかによる基質の切断によってFRETまたは蛍光の発生が減少するように標識する。
【０４０９】
特定の実施形態において、消光剤が発蛍光団から放たれるシグナルを減じるかまたは除去するように発蛍光団と消光剤を空間的に近接させて基質を標識する。標識した基質を切断すると、消光剤と発蛍光団とが空間的に離れ、発蛍光団から放出されたシグナルが、増強または発生する。次いで、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性またはプレ−tRNAエンドヌクレアーゼ活性の化合物の効果をアッセイするために、標識した基質を細胞へ顕微注入または形質移入させる。別の実施形態において、基質を2つの異なる発蛍光団で標識できる。FRET細胞系アッセイを、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を細胞へ顕微注入するかまたは形質移入し、この細胞を化合物と接触させ、そして、例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光顕微鏡または蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定することによって行いうる。この場合において、基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、および3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいは基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、および3'末端を蛍光供与体部分で標識する。内在性tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、基質を切断し、蛍光供与体部分および蛍光受容体部分により、蛍光供与体部分の波長で検出可能な蛍光シグナルを生産する。内在性tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減少させる化合物は、基質の切断を阻害または減少させ、そして蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を陰性対照（例えば、PBS）と比べて増加させるだろう。内在性tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、基質の切断を高め、そして蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を陰性対照（例えば、PBS）と比べて減少させるだろう。好ましい実施形態において、本明細書中に記載するFRET細胞系アッセイに陰性対照（例えば、PBSまたは基質の切断に影響しないことが知られている別の因子）および陽性対照（例えば、基質の切断に影響することが知られている因子）を含める。
【０４１０】
あるいは、FRET細胞系アッセイを、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を細胞へ顕微注入するかまたは形質移入し、この細胞を化合物と接触させ、そして、例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光顕微鏡または蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定することによって行いうる。この場合において、基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、および3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいは基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、および3'末端を蛍光供与体部分で標識する。内在性tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、基質を切断し、蛍光供与体部分および蛍光受容体部分により、蛍光供与体部分の波長で検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。内在性tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減少させる化合物は、基質の切断を阻害または減少させ、そして蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を陰性対照（例えば、PBS）と比べて増加させるだろう。内在性tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、基質の切断を高め、そして蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を陰性対照（例えば、PBS）と比べて減少させるだろう。好ましい実施形態において、本明細書中に記載するFRET細胞系アッセイに陰性対照（例えば、PBSまたは基質の切断に影響しないことが知られている別の因子）および陽性対照（例えば、基質の切断に影響することが知られている因子）を含める。
【０４１１】
このアッセイを、tRNAエンドヌクレアーゼ反応の助けとなる条件を与える任意のバッファ系で行うことができる。このようなバッファ系は、当業者に周知である。特定の実施形態において、このバッファは、その中で細胞培養物を保持する培地である。培地中にマグネシウムイオンが存在することに注意を要する。
【０４１２】
特定の実施形態において、このアッセイを、少なくとも0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間、または少なくとも1日間行う。
【０４１３】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法に関する。この方法は、以下の工程：(a)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質をヒト細胞へ顕微注入または形質移入させる工程であって、この基質の5'末端を発蛍光団で標識し、3'末端を消光剤で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を消光剤で標識し、3'末端を発蛍光団で標識する、工程；(b)この細胞を化合物または化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程；ならびに(c)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。ここでこの方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光シグナルを検出できない場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物が同定される。別の実施形態において、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含むヒト細胞を化合物または化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、この基質の5'末端を発蛍光団で標識し、3'末端を消光剤で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を消光剤で標識し、3'末端を発蛍光団で標識する、工程；および(b)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。ここでこの方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光シグナルを検出できない場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物が同定される。
【０４１４】
別の実施形態において、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質をヒト細胞へ顕微注入または形質移入させる工程であって、ここでこの基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、3'末端を蛍光供与体部分で標識する、工程；(b)この細胞を化合物または化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程；ならびに(c)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。ここでこの方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において検出される蛍光シグナルが変化する場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を抑制または減じる抗増殖性化合物が同定される。別の実施形態において、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含むヒト細胞を化合物または化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、この基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、3'末端を蛍光供与体部分で標識する、工程；および(b)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。ここでこの方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光供与体部分の波長で蛍光受容体部分の蛍光発光が、増加する場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物が同定される。
【０４１５】
FRET細胞系アッセイにおけるヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼに対する化合物の活性を、当業者に周知の方法を用いて基質の蛍光発光スペクトルを測定することで決定できる。測定する蛍光発光スペクトルは、ある程度、用いる発蛍光団によって決まる。
【０４１６】
4.5.6.2 標識した基質を用いた無細胞アッセイ
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼについてのFRET無細胞アッセイを、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を無細胞抽出物（無細胞抽出物に関する上記第4.4.1.2節を参照のこと、好ましくはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または、精製したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、および化合物と接触させ、そして、例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定することによって行いうる。この場合において、基質の5'末端を発蛍光団で標識し、3'末端を消光剤で標識するか、あるいは基質の3'末端を発蛍光団で標識し、5'末端を消光剤で標識する。無細胞抽出物中のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、基質を切断し、検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減じる化合物は、基質の切断を阻害または減少させ、そして検出可能な蛍光シグナルの生産を陰性対照（例えば、PBS）と比べて抑制または減少させるだろう。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、基質の切断を増加させ、そして検出可能なシグナルの生産を陰性対照（例えば、PBS）と比べて増加させるだろう。
【０４１７】
あるいは、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼについてのFRET無細胞系アッセイを、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を無細胞抽出物（好ましくはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させ、そして、例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定することによって行いうる。この場合において、基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいは基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、3'末端を蛍光供与体部分で標識する。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、基質を切断し、蛍光供与体部分および蛍光受容体部分によって、蛍光供与体部分の波長で検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減じる化合物は、基質の切断を阻害または減少させ、そして陰性対照（例えば、PBS）と比べて蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を増強させるだろう。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、基質の切断を増加させ、そして陰性対照（例えば、PBS）と比べて蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を減少させるだろう。好ましい実施形態において、本明細書中に記載するFRET無細胞系アッセイに陰性対照（例えば、PBSまたは基質の切断に影響しないことが知られている別の因子）および陽性対照（例えば、基質の切断に影響することが知られている因子）を含める。
【０４１８】
ヒト3'末端mRNAエンドヌクレアーゼについてのFRET無細胞系アッセイを、ヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの基質を無細胞抽出物（無細胞抽出物に関する上記第4.4.1.2節を参照のこと、好ましくはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させ、そして、例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定することによって行いうる。この場合において、基質の5'末端を発蛍光団で標識し、3'末端を消光剤で標識するか、あるいは基質の3'末端を発蛍光団で標識し、5'末端を消光剤で標識する。無細胞抽出物中の3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼが、基質を切断し、検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減じる化合物は、基質の切断を阻害または減少させ、そして検出可能な蛍光シグナルの生産を陰性対照（例えば、PBS）と比べて阻害または減少させるだろう。3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、基質の切断を増加させ、そして検出可能なシグナルの生産を陰性対照（例えば、PBS）と比べて増加させるだろう。
【０４１９】
ヒト3'末端mRNAエンドヌクレアーゼについてのFRET無細胞系アッセイを、ヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの基質を無細胞抽出物（無細胞抽出物に関する上記第4.4.1.2節を参照のこと、好ましくはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼおよび化合物と接触させ、そして、例えば、ViewluxまたはAnalystのような蛍光発光検出器で基質の蛍光を測定することによって行いうる。この場合において、基質の5'末端を蛍光供与体で標識し、3'末端を蛍光受容体で標識するか、あるいは基質の3'末端を蛍光供与体で標識し、5'末端を蛍光受容体で標識する。無細胞抽出物中の3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼまたはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、基質を切断し、検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼまたはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減じる化合物は、基質の切断を抑制または減少させ、そして検出可能なシグナルの生産を陰性対照（例えば、PBS）と比べて増加させるだろう。3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼまたはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を高める化合物は、基質の切断を増加させ、そして検出可能な蛍光シグナルの生産を陰性対照（例えば、PBS）と比べて抑制または減少させるだろう。
【０４２０】
FRETアッセイを、tRNAエンドヌクレアーゼ反応の助けとなる条件を与える任意のバッファ系で行うことができる。このようなバッファ系は、当業者に周知である。特定に実施形態において、このバッファは、20mMトリス（pH7.0）、50mM KCl、0.1mM DTT、5mM MgCl2、および0.4% Triton X100を含む。バッファ系のpH、塩濃度、界面活性剤の濃度などがFRETに干渉しないように注意を要する。
【０４２１】
特定の実施形態において、このアッセイを、少なくとも0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間、または少なくとも1日間行う。
【０４２２】
一つの実施形態において、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)ヒト無細胞抽出物（好ましくは、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼをtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここでこの基質の5'末端を発蛍光団で標識し、3'末端を消光剤で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を消光剤で標識し、3'末端を発蛍光団で標識する、工程；ならびに(b)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。この方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光シグナルを検出できない場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物が同定される。別の実施形態において、本発明は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)ヒト無細胞抽出物（好ましくは、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼをtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここでこの基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、3'末端を蛍光供与体部分で標識する、工程；ならびに(b)tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。この方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光供与体部分の波長で検出される蛍光受容体部分の蛍光発光が、増加する場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する抗増殖性化合物が同定される。
【０４２３】
一つの実施形態において、本発明は、ヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)ヒト無細胞抽出物（好ましくは、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼを3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここでこの基質の5'末端を発蛍光団で標識し、3'末端を消光剤で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を消光剤で標識し、3'末端を発蛍光団で標識する、工程；ならびに(b)3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。この方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光シグナルを検出できない場合、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物が同定される。別の実施形態において、本発明は、ヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性を阻害または減じる抗増殖性化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：(a)ヒト無細胞抽出物（好ましくは、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製したヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼをtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここでこの基質の5'末端を蛍光供与体部分で標識し、3'末端を蛍光受容体部分で標識するか、あるいはこの基質の5'末端を蛍光受容体部分で標識し、3'末端を蛍光供与体部分で標識する、工程；ならびに(b)3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性を測定する工程、を包含する。ここでこの方法において、この化合物の非存在下または対照の存在下と比べてこの化合物の存在下において、蛍光供与体部分の波長で検出される蛍光受容体部分の蛍光発光が、減少する場合、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性を阻害する抗増殖性化合物が同定される。
【０４２４】
FRET無細胞系アッセイにおけるヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼに対する化合物の活性を、当業者に周知の方法を用いて基質の蛍光発光スペクトルを測定することで決定できる。測定する蛍光発光スペクトルは、ある程度、用いる発蛍光団によって決まる。
【０４２５】
4.5.6.3 標識した酵素を用いた細胞系アッセイ
FRET細胞系アッセイを、発蛍光団で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第1のサブユニット（複合体の構成成分についての表１を参照のこと）および消光剤で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第2の、異なるサブユニット（複合体の構成成分についての表1を参照のこと）を細胞に顕微注入または形質移入させ、この細胞と化合物とを接触させ、そして例えば、蛍光顕微鏡またはViewluxもしくはAnalystのような蛍光発光検出器でヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定することによって行いうる。好ましくは、顕微注入または形質移入した細胞は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの1つ以上のサブユニットを欠く。当業者に公知であるいずれかの方法を用いて、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの1つ以上のサブユニットの発現および／または機能を細胞から除去することができる。特定の実施形態において、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの1つ以上のサブユニットを一過的に除去するために、RNAiを使用する。標識したサブユニットでヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼを形成することによって、検出可能な蛍光が減少するだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または減少させる化合物は、検出可能な蛍光シグナルの生産を、陰性対照（例えば、PBS）と比べて減少または阻害させるだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増加させる化合物は、陰性対照（例えば、PBS）と比べて検出可能な蛍光を増加させるだろう。
【０４２６】
あるいは、FRET細胞系アッセイを、蛍光供与体部分で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第1のサブユニット（例えば、SEN2）および蛍光受容体部分で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第2の、異なるサブユニット（例えば、SEN34）を細胞に顕微注入し、この細胞と化合物とを接触させ、そして例えば、蛍光顕微鏡またはViewluxもしくはAnalystのような蛍光発光検出器でヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定することによって行いうる。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成によって、蛍光供与体部分および蛍光受容体部分によって、蛍光供与体部分の波長で検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または減少させる化合物は、陰性対照（例えば、PBS）と比べて蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を減少させるだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増加させる化合物は、陰性対照（例えば、PBS）と比べて蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を増加させるだろう。好ましい実施形態において、本明細書中に記載するFRET細胞系アッセイに陰性対照（例えば、PBSまたは基質の切断に影響しないことが知られている別の因子）および陽性対照（例えば、基質の切断に影響することが知られている因子）を含める。
【０４２７】
特定の実施形態において、この化合物と細胞を、少なくとも0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間、または少なくとも1日間インキュベートする。
【０４２８】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットを蛍光受容体部分、蛍光供与体部分および／または消光剤で標識する方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第6,472,156号、同第6,451,543号、同第6,348,322号、同第6,342,379号、同第6,323,039号、同第6,297,018号、同第6,291,201号、同第6,280,981号、同第5,843,658号および同第5,439,797号を参照のこと、これらの開示はその全体が参考として援用される）。
【０４２９】
3'末端プレ−mRNAプロセッシング、rRNAエンドヌクレアーゼ活性またはtRNAエンドヌクレアーゼ活性のモジュレーターを同定するために、このようなアッセイを同様に用いることができる。
【０４３０】
4.5.6.4 標識した酵素を用いた無細胞系アッセイ
FRET無細胞アッセイを、発蛍光団で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第1のサブユニット（複合体の構成成分について表１を参照のこと）および消光剤で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第2のサブユニット（複合体の構成成分について表1を参照のこと）をエンドヌクレアーゼの形成を助ける条件下in vitroで化合物と接触させ、そして例えば、ViewluxもしくはAnalystのような蛍光発光検出器でヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定することによって行いうる。標識したサブユニットでヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼを形成することによって、検出可能な蛍光の減少を生じるだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または減少させる化合物は、この化合物の非存在下または陰性対照（例えば、PBS）の存在下と比べて検出可能な蛍光シグナルの生産を増加させるだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増加させる化合物は、この化合物の非存在下または陰性対照（例えば、PBS）と比べて検出可能な蛍光を減少または阻害するだろう。
【０４３１】
あるいは、FRET無細胞アッセイを、蛍光供与体部分で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第1のサブユニット（例えば、SEN2）および蛍光受容体部分で標識したヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの第2の、異なるサブユニット（例えば、SEN34）を、エンドヌクレアーゼの形成を助ける条件下in vitroで化合物と接触させ、そして例えば、ViewluxもしくはAnalystのような蛍光発光検出器でヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの蛍光を測定することによって行いうる。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成によって、蛍光供与体部分および蛍光受容体部分によって蛍光供与体の波長で検出可能な蛍光シグナルを生産するだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を阻害または減少させる化合物は、この化合物の非存在下または陰性対照（例えば、PBS）の存在下と比べて蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を減少させるだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの形成を増加させる化合物は、この化合物の非存在下または陰性対照（例えば、PBS）の存在下と比べて蛍光供与体部分の波長における蛍光受容体部分の蛍光発光を増加させるだろう。好ましい実施形態において、本明細書中に記載するFRET無細胞アッセイに陰性対照（例えば、PBSまたは基質の切断に影響しないことが知られている別の因子）および陽性対照（例えば、基質の切断に影響することが知られている因子）を含める。
【０４３２】
3'末端プレ−mRNAプロセッシング、rRNAエンドヌクレアーゼ活性またはtRNAエンドヌクレアーゼ活性のモジュレーターを同定するために、このようなアッセイを同様に用いることができる。
【０４３３】
4.5.7 直接結合アッセイ
直接結合アッセイによって、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性またはプレ−rRNA切断活性をモジュレートする化合物を同定できる。特に、基質と本発明の複合体との相互作用を直接的にまたは間接的に減少もしくは阻害することによって、ヒトプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性またはプレ−rRNA切断活性を阻害する化合物。プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体を精製できる。このようなアッセイは、国際公開公報WO 02/083837およびWO 02/083953に記載され、これらの開示は、その全体が参考として本明細書に援用されている。簡潔にいえば、化合物ライブラリーを固体支持体（例えば、ポリマービーズ）に結合させることによって、直接結合アッセイを行いうる。固体支持体の各々は、その表面に実質的に1種類の化合物を結合させている。ライブラリーの複数の固体支持体を、検出可能な標識を有し、色素標識された基質：固体支持体に結合された化合物との複合体を形成する、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の基質に水溶液中で曝す。特定の化合物に対する基質の結合によって、この化合物を含む固体支持体（例えば、ビーズ）を標識し、これによって他の未標識固体支持体と物理的に区別することができる。標識された固体支持体を同定し、この固体支持体上の化合物の化学構造を、例えば、結合した化合物の構造と関連する固体支持体のコードを読み取ることによって決定できる。
【０４３４】
あるいは、直接結合アッセイを、標識したチューブもしくはマイクロタイターウェル、またはマイクロアレイにおいて、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の検出可能な標識を有する基質と溶液中に遊離した化合物または化合物ライブラリーのメンバーとを接触させることによって行いうる。プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の標識した基質に結合するライブラリー中の化合物は、検出可能に標識された複合体を形成するだろう。この複合体は、複合体化した基質の電気泳動、クロマトグラフィー、または熱安定性の性質における変化を区別する方法を含むが、これらに限定されない種々の方法によって、ライブラリー中の複合体化していない、未標識の化合物から、およびプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の複合体化していない、標識した基質から、同定し、取り出すことができる。
【０４３５】
4.5.8 蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光系アッセイを用いて、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の活性に対する化合物の効果を決定しうる。このようなアッセイにおいて、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の蛍光標識した基質を、無細胞抽出物（好ましくは、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物もしくはヒト3'末端プレ−mRNAプロセッシング抽出物）または精製したプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、精製した3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、精製したプレ−tRNA切断複合体もしくは精製したプレ−rRNA切断複合体および化合物もしくは化合物ライブラリーのメンバーと接触させ；そして放出された蛍光偏光を測定する。基質の切断後に放出される蛍光偏光の変化を識別できるほどこのアッセイに用いる基質の大きさが十分に大きいことが、本アッセイの重要な態様である。
【０４３６】
特定の実施形態において、当業者に公知である任意の方法によって、FPアッセイの基質を発蛍光団で標識しうる。
【０４３７】
プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体は、基質を切断し、放出される偏光の強度を変化させるだろう。励起時と発光時の間、蛍光標識した基質が回転しない場合にのみ、この基質を平面偏光で励起したとき固定平面に光を放つだろう。放出された光が偏りをなくす程度は、基質の回転量によって決まり、これは基質の大きさによって決まる。励起した時と蛍光を放つ時の間、小さな基質は、より大きな基質よりも回転する。蛍光標識した小さな基質は、迅速に回転し、その放出された光は、偏光をなくす。蛍光標識した大きな基質は、よりゆっくりと回転し、偏光を維持した発光を生じる。プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の活性を阻害する化合物は、基質の切断を阻害または減少させ、陰性対照（例えば、PBS）または化合物の非存在下と比べて基質の回転を減少させ、これによって偏光を維持した発光を生じるだろう。プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体またはプレ−rRNA切断複合体の活性を増強させる化合物は、基質の切断を増強させ、陰性対照（例えば、PBS）またはこの化合物の非存在下と比べて基質の回転を増加させ、これによって偏光をなくした発光をより生じるだろう。
【０４３８】
光の強度を90°離れた平面で測定し、これはしばしば、指定した水平強度および垂直強度である。ある装置において、励起フィルターは、発光フィルターが固定されている間、可動する。特定の別の装置では、水平強度および垂直強度を、ファイバーオプティックスにより同時に測定する。研究用の蛍光偏光装置は、例えば、Pan Vera、BMG Lab Technologies、およびLJL Biosystemsから商業的に利用できる。Abottは、臨床実験室の器具を提供する。蛍光偏光値を、以下の式：
【数１】
Figure 0004990621
【０４３９】
で決定する。
【０４４０】
蛍光偏光値は、しばしば1000で割り算され、ミリの単位の蛍光偏光度（mP）で表される。
【０４４１】
特定の実施形態において、図１に示すハイブリダイズしたtRNAまたは環状にしたtRNAを、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体の基質として使用する。本実施形態によると、ハイブリダイズしたtRNAもしくは環状にしたtRNAのイントロンの5'末端、またはハイブリダイズしたtRNAもしくは環状にしたtRNAのイントロンの3'末端、またはその両方を発蛍光団で標識する。切断時に、イントロンが、基質から放出されるために、結合した発蛍光団に対する上記分子の大きさが変化する。標識した分子の分子量が減少することによって、発蛍光団から放出される光の偏光度は増加する。偏光していない量を測定することによって、当業者は切断した基質の量を決定することができる。
【０４４２】
4.5.9 tRNAエンドヌクレアーゼ抑制アッセイ
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性における化合物または化合物ライブラリーのメンバーの効果を、tRNAエンドヌクレアーゼ抑制アッセイを用いて決定しうる。このようなアッセイにおいて、宿主細胞を、第1のレポーター遺伝子構築物およびサプレッサーtRNAを含むように操作し；サプレッサーtRNAの発現を誘導し；宿主細胞を化合物または化合物ライブラリーのメンバーと接触させ；そしてレポーター遺伝子の発現および／またはレポーター遺伝子にコードされたタンパク質の活性を測定する。第1のレポーター遺伝子構築物は、そのオープンリーディングフレームが分断されるように、オープンリーディングフレーム内にナンセンスコドンを有するレポーター遺伝子を含む。例えば、Sambrook(Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版；DNA Cloning, Volumes IおよびII(Glover編集. 1985)に記載される標準的な突然変異誘発技術を、当業者に周知である任意のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームにナンセンスコドンを導入するために用いうる。サプレッサーtRNAを含むように操作した宿主細胞に、第1のレポーター遺伝子構築物を形質移入する。あるいは、第1のレポーター遺伝子をサプレッサーtRNAと共に宿主細胞へ同時形質移入する。サプレッサーtRNAの発現を、制御可能な調節エレメント；例えば、テトラサイクリンに調節される調節エレメント（例えば、Buvoliら、2000, Molecular and Cellular Biology 20：3116−3124；Park and Bhandary, 1998, Molecular and Cellular Biology18:4418−4425を参照のこと）によって調節し、ならびにサプレッサーtRNAは、正確にスプライスされたサプレッサーtRNAのみが機能するように、アンチコドンステムにtRNAイントロンを含む。機能的サプレッサーtRNAの発現は、(i)サプレッサーtRNAの転写、および(ii)tRNAスプライシングによって決まる。機能的サプレッサーtRNAの発現は、レポーター遺伝子内のナンセンスコドンを抑制し、完全長の機能的レポーター遺伝子の発現を生じる。従って、完全長の、機能的レポーター遺伝子の発現は、機能的サプレッサーtRNAの発現に関連し、それは同様に、サプレッサーtRNAの転写およびtRNAスプライシングのレベルに関連する。完全長のレポーター遺伝子の発現およびこのレポーター遺伝子にコードされるタンパク質の活性を、当業者に周知であるか、または本明細書中に記載される任意の方法でアッセイできる。
【０４４３】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または減じる化合物は、機能的サプレッサーtRNAの産生を阻害または減少させ、そして所定の基準範囲または対照と比べてレポーター遺伝子の発現を減少させるだろう。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を増強する化合物は、機能的サプレッサーtRNAの産生を増強させ、そして所定の基準範囲または対照と比べてレポーター遺伝子の産生を増強させるだろう。
【０４４４】
サプレッサーtRNAの発現を誘導する工程を、宿主細胞を化合物と接触させる工程と同時に、または化合物を宿主細胞と接触させる工程の少なくとも5分前、少なくとも15分前、少なくとも0.5時間前、少なくとも1時間前、少なくとも1.5時間前、少なくとも2時間前、少なくとも3時間前、少なくとも4時間前、少なくとも5時間前、少なくとも6時間前、少なくとも8時間前、少なくとも10時間前もしくは少なくとも12時間前に行いうる。特定の実施形態において、およそ5分間、およそ15分間、およそ0.5時間、およそ1時間、およそ1.5時間、およそ2時間、およそ3時間、およそ4時間、およそ5時間、およそ6時間、およそ8時間、およそ10時間またはおよそ12時間、因子（例えば、テトラサイクリン）と共に宿主細胞をインキュベートすることによって、サプレッサーtRNAの発現を誘導する。別の実施形態において、およそ5分間、およそ15分間、およそ0.5時間、およそ1時間、およそ1.5時間、およそ2時間、およそ3時間、およそ4時間、およそ5時間、およそ6時間、およそ8時間、およそ10時間またはおよそ12時間、宿主細胞を化合物と接触させる。
【０４４５】
選択的に、宿主細胞を、第1のレポーター遺伝子とは異なり、ナンセンスコドンを含まないレポーター遺伝子を含む第2のレポーター遺伝子構築物を含むように操作する。特定の実施形態において、tRNAエンドヌクレアーゼ抑制アッセイに使用するレポーター遺伝子は、この赤色ルシフェラーゼおよび緑色のカミキリルシフェラーゼ（Green Click Beetle luciferase）であり、ここで赤色ルシフェラーゼは、ナンセンスコドンを含む。この2つのルシフェラーゼ遺伝子および制御した調節エレメント（例えば、テトラサイクリン制御調節エレメント）でその発現が制御されるサプレッサーtRNAを安定して発現するように宿主細胞を操作しうる。テトラサイクリンのような因子の非存在下において、サプレッサーtRNAは発現せず、緑色に対する赤色の比率は低い。テトラサイクリンのような因子の存在下では、サプレッサーtRNAは発現し、そして緑色に対する赤色の比率を増加させる。ハイスループットスクリーニングでは、細胞を化合物の存在下でプレートする。一定の期間の後、テトラサイクリンのような因子を含む培地を、サプレッサーtRNAの発現を誘導するために添加する。
【０４４６】
tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼを阻害する化合物は、化合物が存在しない対照と比べて緑色に対する赤色の比率を減少させるだろう。本アッセイにおいて、化合物がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートすると同定されると、上記の1つ以上のアッセイを用いて化合物の活性を確かめるために化合物を試験しうる。
【０４４７】
4.5.10 FISHアッセイ
tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を、ヒト細胞内でtRNAイントロンの持続性および量を検出するアッセイで決定しうる。細胞と共に化合物をインキュベートした後またはインキュベートしている間に、tRNAイントロンの量を異なる時点で定量する。tRNAイントロンを、tRNAイントロン特異的プローブを使用する蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法によって検出できる。特定の実施形態において、対照実験を平行して行う。この実験においてヒト細胞は、化合物と接触させない。
【０４４８】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのインヒビターの非存在下では、スプライシング反応は進み、細胞中のイントロンの濃度は低い。理論に拘束されることなく、スプライスされたイントロンは普通分解されるために、ヒト細胞中のtRNAイントロンの濃度は、検知閾値よりも低い。ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのインヒビターの存在下では、スプライシング反応は減速し、tRNAイントロンの量は増加する。このように、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼを阻害する化合物を、ヒト細胞中にtRNAイントロンのレベルを増加させるその能力によって同定できる。
【０４４９】
同様に、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の活性を、FISHを用いてポリアデニル化したmRNAの量を測定することによって決定できる。ポリアデニル化したmRNAの増加したレベルは、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の増加した活性を示す。従って、本アッセイが化合物の存在下で行われ、ポリアデニル化したmRNAのレベルが増加した場合、この化合物は3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体のアクチベーターである。化合物の存在下でポリアデニル化したmRNAのレベルが減少した場合、この化合物は3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体のアンタゴニストである。あるいは、切断部位の3'側であるプレ−mRNAの一部を検出でき；切断部位の3'側であるプレ−mRNAの一部の増加レベルは、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体の減少した活性を示す。したがって、本アッセイが化合物の存在下で行われポリアデニル化したmRNAのレベルが増加する場合、この化合物は3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体のアンタゴニストである。化合物の存在下でポリアデニル化したmRNAのレベルが減少する場合、この化合物は3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体のアクチベーターである。
【０４５０】
FISHを行うための方法は、当業者に周知であり、本発明と共に用いることができる。FISHの典型的な方法は、その全体が本明細書中に援用されるSarkarおよびHopper, 1998(Mol.Biol. Cell 9：3041−3055)に記載されている。
【０４５１】
特定の実施形態において、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼの活性への化合物の効果を決定するために、ハイスループットスクリーニングにFISHアッセイを用いる。特に、FISHに基づくハイスループットスクリーニングに96レンズ顕微鏡を使用できる。特定の実施形態において、96個の細胞培養物を、異なる化合物と共に96ウェルプレートでインキュベートする。その後、細胞を、tRNAイントロン特異的プローブまたは3'末端プレ−mRNA特異的プローブを使用してFISH分析に供し、96レンズ顕微鏡を使用して分析する。シグナルの存在または顕著に強いシグナルの存在は、細胞中にtRNAイントロンもしくは3'末端プレ−mRNAの各々が上昇したレベルで存在すること、そしてこの化合物が、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性またはプレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性の各々のインヒビターの候補であることを示している。
【０４５２】
理論に束縛されることなく、FISHアッセイは、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼのインヒビターとして化合物を直接的に同定する。従って、特定の実施形態において、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性または3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性の各々のインヒビターとしてFISHアッセイで同定した化合物は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのインヒビターの明らかな候補である。
【０４５３】
4.5.11 別のスクリーニングアッセイ
化合物の存在下において対照（好ましくは、陰性対照、より好ましくは、陰性対照および陽性対照）と比べてエンドヌクレアーゼによって切断されるtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断エンドヌクレアーゼまたはリボソームRNAエンドヌクレアーゼの各々の基質の量を検出するアッセイで、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断エンドヌクレアーゼまたはリボソームRNAエンドヌクレアーゼの活性を決定しうる。このようなアッセイを、エンドヌクレアーゼ活性を助ける条件下で化合物をtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断エンドヌクレアーゼもしくはリボソームRNAエンドヌクレアーゼの各々の標識した基質および無細胞抽出物または精製したtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断エンドヌクレアーゼもしくはリボソームRNAエンドヌクレアーゼと接触あるいはインキュベートさせ、そして切断された基質の量を測定することによって行いうる。基質を任意の検出可能な因子で標識できる。本発明に有用である標識としては、当業者に公知である技術を用いる蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（FITC）およびOregon Green（登録商標）のようなフルオレセインならびに誘導体、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッド、イソチオシアン酸テトラメチルロージミン（tetramethylrhodimine isothiocynate）(TRITC)、ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン(BODIPY(登録商標))および誘導体など）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDye(登録商標)など）のような分光学的標識、放射能標識（例えば、3H、125I、35S、14C、32P、33Pなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、コロイド状の金または着色したガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズもしくはナノ粒子−0.1〜1000nmの所定の大きさを有する無機イオンのナノクラスターのような分光学的な比色標識）のような分光標識が挙げられるが、これらに限定しない。
【０４５４】
例えば、当業者に公知である任意の方法で、基質を標識できる。特定の実施形態において、発蛍光団でRNAを部位特異的に標識することによって、基質を標識できる。より詳細な実施形態において、QinおよびPyle 1999(Methods 18(1):60−70)（その全体が本明細書中に援用されている）に記載される方法を用いて基質を標識する。基質を標識するための最適な方法は、常用の実験を用いて当業者によって決定されうる。特定の実施形態において、異なる方法、異なる標識および／または基質の異なる位置で基質を標識する。次いで、エンドヌクレアーゼのインヒビターもしくはアクチベーターそれぞれの存在下および非存在下でスプライシングアッセイに、それぞれ標識した基質を別個に供させる。スクリーニングアッセイに最適な標識とは、もっとも容易に検出することができ、インヒビターまたはアクチベーターの効果を再現可能に検出できる標識である。しかし、例えば、別の望ましい有利な点を提供するために、別の標識方法もまた用いることができる。
【０４５５】
特定の実施形態において、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間またはそれ以上、化合物を、標識した基質および無細胞抽出物または精製した本発明のエンドヌクレアーゼ複合体と接触あるいはインキュベートさせる。切断された基質の量は、エンドヌクレアーゼの活性に比例する。切断生成物の量は、当業者に公知である任意の方法で測定できる。
【０４５６】
特定の実施形態において、切断された生成物を、ゲル電気泳動によって未切断のRNA基質と区別する。切断された生成物の量を、切断された基質のシグナル強度を測定することによって定量できる。未切断の基質と比べて切断された生成物によって生産されるシグナルが強いほど、エンドヌクレアーゼはより活性である。このシグナル強度は、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージャー(phosphoimager)を使用して定量できる。化合物の存在下において、エンドヌクレアーゼの活性が減少した場合、すなわち、化合物の非存在下または陰性対照の存在下における反応と比べて、切断された生成物のシグナルが未切断の基質のものと比べて減少した場合、この化合物をエンドヌクレアーゼのインヒビターとして同定する。
【０４５７】
別の実施形態において、切断された生成物の量を、マススペクトロメトリーを使用して決定する。
【０４５８】
4.5.12 化合物
当該分野で公知である任意の分子を、本発明の複合体の量、活性またはタンパク質の構成成分組成をモジュレートする（増加させるまたは減少させる）その能力について、本発明の複合体の量、活性、またはタンパク質の構成成分組成の変化を検出することで試験できる。例えば、複合体の機構を発現する細胞から単離できる複合体の量の変化を検出することによって、複合体の量の変化を検出できる。別の実施形態において、化合物の非存在下と比べて化合物の存在下におけるシグナル強度（FRETまたはFPを使用した場合）の変化は、この化合物が複合体形成のモジュレーターであることを示す。複合体の活性をモジュレートする分子を同定するために、複合体を発現する細胞に候補分子を直接与えることができ、あるいは、候補タンパク質の場合には、それらをコードする核酸を、複合体の機構を発現する細胞内で候補タンパク質を生産するように、この核酸が組換え発現される条件下で与えることによって候補分子を与えることができ、次いでこの複合体を細胞から精製し、そして精製した複合体を、当該分野で周知の方法（上記の方法に限定しない）を用いて活性をアッセイする。
【０４５９】
特定の実施形態において、本発明は、複合体の量、活性またはタンパク質構成成分組成をモジュレート（例えば、阻害、アンタゴナイズ、もしくはアゴナイズ）する分子についての化学ライブラリーを用いたスクリーニングアッセイを提供する。この化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチド模倣体ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え体（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびin vitro 翻訳系ライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどでありうる。
【０４６０】
典型的なライブラリーは、いくつかの製造元（ArQule、Tripos/PanLabs、ChemDesign、Pharmacopoeia）から商業的に利用できる。ある場合には、これらの化学ライブラリーをコンビナトリアルストラテジーを用いて作製する。これはメンバー化合物が結合される基板上のライブラリーの各メンバーの性質をコードしており、この結果効果的なモジュレーターである分子の直接かつ即時の同定を可能とする。従って、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置は、化合物の組成を規定する。また、一つの例において、単一のプレート位置には、1〜20個の化学製品が存在し、これらの化学製品を目的の相互作用を含むウェルに投与することによってスクリーニングできる。よって、モジュレーションを検出した場合、相互作用する対のより小さなプールをモジュレーション活性についてアッセイできる。このような方法によって、多数の候補分子をスクリーニングできる。
【０４６１】
用いるのに適した多数の多様なライブラリーが、当該分野で公知であり、本発明に従って試験されるべき化合物を提供するためにもちいられ得る。あるいは、ライブラリーを標準的な方法を用いて構築することができる。化学（合成）ライブラリー、組換え発現ライブラリーまたはポリソーム系ライブラリーは、使用できるライブラリーの典型的な型である。
【０４６２】
ライブラリーは、固められるかもしくは適度に硬くされ（ある程度の剛性を有する）、または線状もしくは固められていないものでありうる。ライブラリーは、cDNAもしくはゲノム発現ライブラリー、ランダムペプチド発現ライブラリーもしくは化学合成ランダムペプチドライブラリー、または非ペプチドライブラリーでありうる。発現ライブラリーをアッセイを行う細胞に導入し、ここでライブラリー核酸は、それにコードされるタンパク質を生産するように発現される。
【０４６３】
一つの実施形態において、本発明に使用できるペプチドライブラリーは、in vitroで化学的に合成されたライブラリーでありうる。このようなライブラリーの例は、以下に示される：Houghtenら1991, Nature 354:84−86に遊離のヘキサペプチドの混合物について記載される。この遊離のヘキサペプチドの各ペプチドの第1および第2の残基は、個々にまた明確に規定された；Lam ら1991, Nature 354：82−84に「ワン・ビーズ、ワン・ぺプチド」アプローチが記載される。このアプローチでは、固相スプリット合成スキームによって、ペプチドのライブラリーが作製され、ここで集積の各ビーズは、その上に単一配列、ランダム配列のアミノ酸残基が固定されている；Medynski, 1994, Bio/Technology 12：709−710に、スプリット合成法およびT−バッグ合成法が記載される；およびGallopら1994, J. Medicinal Chemistry 37(9)：1233−1251。簡単に別の例の方法によって、使用するコンビナトリアルライブラリーが、以下の方法に従って調製されうる：Ohlmeyerら1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10922−10926；Erbら1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11422−11426；Houghtenら1992, Biotechniques 13：412；Jayawickremeら1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：1614−1618；またはSalmonら1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708−11712。PCT公報 WO 93/20242ならびにBrennerおよびLerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381−5383によって、化学ポリマーライブラリーのメンバー各々のオリゴヌクレオチド識別子を含む「コードコンビナトリアル化学ライブラリー」が記載される。
【０４６４】
好ましい実施形態において、スクリーニングするライブラリーは、生物学的発現ライブラリーである。このライブラリーは、ランダムペプチドが、（例えば、ジスルフィド結合を有する点をいかして）制限した、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーである。
【０４６５】
さらに、より一般的には、構造学的に制限した、有機多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーもまた用いることができる。
【０４６６】
用いることができる高次構造的に制限したライブラリーとしては、不変のシステイン残基（酸化環境でジスルフィド結合による架橋によってシスチンを形成する）、改変ペプチド（例えば、フッ素、金属、同位体標識を組み込みリン酸化されている）、1つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド、非ペプチド構造およびγ−カルボキシグルタミン酸が有意である画分を含むペプチドを含むライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０４６７】
非ペプチド（例えば、ペプチド誘導体）（例えば、1つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む）ライブラリーもまた用いることができる。このライブラリーの1つの例は、ペプトイドライブラリーである(Simon ら1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：9367−9371)。ペプトイドは、非天然のアミノ酸のポリマーであって、α炭素にも骨格のアミノ窒素にも結合しない天然に存在する側鎖を有する。ペプトイドは、ヒトの消化酵素で容易に分解されないため、薬剤としての用途に容易に適合可能であり都合がよい。用いることができるライブラリーの別の例は、ペプチドのアミド官能基がパーメチル化され化学的に変化したコンビナトリアルライブラリーを作製しており、Ostreshら1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11138−11142に記載される。
【０４６８】
本発明に従ってスクリーニングできるペプチドライブラリーのメンバーを、20個の天然に生じるアミノ酸を含むことに限定しない。特に、化学合成ライブラリーおよびポリソーム系ライブラリーは、（ライブラリー製造に使用するアミノ酸の前駆プールに含めることで）天然に存在する20個のアミノ酸に追加したアミノ酸を使用することができる。特定の実施形態において、ライブラリーメンバーは、1つ以上の非天然もしくは非典型的なアミノ酸または環状ペプチドを含む。非典型的なアミノ酸としては、一般的なアミノ酸のD−アイソマー、α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸；γ−Abu、ε−Ahx、6−アミノヘキサン酸；Aib、2−アミノイソ酪酸；3−アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、β−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、Nα−メチルアミノ酸、フルオロアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸および一般的なアミノ酸アナログが挙げられるが、これらに限定されない。さらに上記アミノ酸は、D型(右旋性)またはＬ型(左旋性)でありうる。
【０４６９】
特定の実施形態において、本発明の複合体の断片および／もしくはアナログ、またはそのタンパク質構成成分（特にぺプチド模倣体）を、複合体活性または複合体形成の競合的インヒビターあるいは非競合的インヒビターの活性についてスクリーニングする。
【０４７０】
本発明の別の実施形態において、複合体のモジュレーターを同定するためにコンビナトリアル化学を用いることができる。コンビナトリアル化学は、多数の化合物が構造的に類似しうる数百ものたくさんの化合物を含むライブラリーを作製することを可能とする。ハイスループットスクリーニングプログラムが、既知の標的に対する親和性によってこのように大きなライブラリーのスクリーニングを可能とするが、新しいアプローチは、より小さな規模であるが化学物質の最大の多様性を提供するライブラリーを得るために開発された。(例えば、Matter, 1997, Journal of Medicinal Chemistry 40:1219−1229を参照のこと)。
【０４７１】
タンパク質の所定のパネルに対する結合親和性について低分子の別々のライブラリーを試験するために、コンビナトリアル化学の一つの方法である、親和性フィンガープリンティングをこれまでに用いていた。スクリーニングで得たフィンガープリントを、他のタンパク質または目的のレセプター（本発明において、本発明のタンパク質複合体およびそのタンパク質構成成分）に対する個々のライブラリーメンバーの親和性を予測するために用いる。このフィンガープリントを、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得たフィンガープリントと比較して、ライブラリーの化合物が同様に反応するのかを予測する。例えば、複合体またはタンパク質構成成分との相互作用について大きなライブラリー中のすべてのリガンドを試験するよりも、活性を有することが知られている他の化合物と類似するフィンガープリントを有するリガンドのみを試験する。(例えば、Kauvarら1995, Chemistry and Biology 2：107−118；Kauvar, 1995, Affinity fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International. 8：25−28；ならびにKauvar, Toxic−Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical Immunoassay, D. Kurtz. L. StankerおよびJ. H. Skerritt. Editors, 1995, AOAC：Washington, D. C., 305−312を参照のこと)。
【０４７２】
完全にランダムな配列のペプチドをコードするペプチドライブラリーを構築する方法が、Kay ら1993, Gene128:59−65(Kay)に開示され、ここでこのペプチドは、先行する従来のライブラリーにコードされるペプチドよりも長い。Kayに開示されるライブラリーは、約20アミノ酸長よりも大きな完全に合成のランダムペプチドをコードする。複合体のモジュレーターを同定するために、このようなライブラリーは都合よくスクリーニングできる。(米国特許第5,498,538号(1996年3月12日)；およびPCT公報WO 94/18318(1994年8月18日)もまた参照のこと)。
【０４７３】
Gallopら1994, J. Med. Chem. 37：1233−1251に、種々の型のペプチドライブラリーの包括的な論評を見出すことができる。
【０４７４】
本発明の方法を用いてスクリーニングするライブラリーは、種々の型の化合物を含みうる。本発明の方法に従ってスクリーニングすることができるライブラリーの例としては、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（diversomer）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバマート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；炭水化物ライブラリー；ならびに低分子ライブラリー（好ましくは、低有機分子ライブラリー）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、スクリーニングするライブラリー中の化合物は、核酸またはペプチド分子である。非限定的な例において、ペプチド分子は、ファージディスプレイライブラリー中に存在しうる。別の実施形態において、化合物の型としては、天然には存在しないアミノ酸（例えば、D−アミノ酸）を含むペプチドを含むペプチドアナログ、α−アミノリン酸およびα−アミノリン酸または非ペプチド結合を有するアミノ酸のようなアミノ酸のリンアナログ（phosphorous analog）、ホスホロチオエートおよびPNAのような核酸アナログ、ホルモン、抗原、合成または天然の薬物、オピエート、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトースならびにガラクトースが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーもまた、本発明のアッセイに用いることができる。
【０４７５】
好ましい実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン（metathiazanone）、ピロリジン、モルホリノ化合物およびベンゾジアゼピンを含む（これらに限定されない）低有機分子ライブラリーである。別の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバマート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；または炭水化物ライブラリーを含む。コンビナトリアルライブラリー自体は、商業的に利用できる(例えば、ComGenex, Princeton, New Jersey；Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc. , St. Louis, Missouri；ChemStar, Ltd, Moscow, Russia；3D Pharmaceuticals, Exton, Pennsylvania；Martek Biosciences, Columbia, Maryland;などを参照のこと)。
【０４７６】
好ましい実施形態において、ライブラリーの化合物が、細胞内へ取り込まれやすいように、ライブラリーをあらかじめ選択する。例えば化合物を、大きさ、親油性、親水性および水素結合のような（これらに限定されない）化合物が細胞内へ入る可能性を増強させる特定のパラメーターに基づいて選択する。別の実施形態において、三次元または四次元のコンピューター計算プログラムで、化合物を分析する。
【０４７７】
本発明の方法に従って使用するコンビナトリアル化合物ライブラリーを合成しうる。薬理学的活性、生物学的活性もしくは他の活性についてスクリーニングできる、低有機化合物の大きな集積、またはライブラリーの作製に関する合成方法に大きな関心がある。大きなコンビナトリアルライブラリーの作製に適用する合成方法を、溶相または固相（すなわち、固体支持体上）で行う。固相合成によって、多工程の反応を行うことおよび高い収率で終了するように反応を駆動することを容易にする。それは、各反応工程後に過剰量の試薬を容易に添加および洗浄できるためである。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製およびスクリーニングを改善する傾向がある。しかし、より従来的な溶相化学は、固相化学よりも広範な有機反応を支持する。
【０４７８】
本発明のコンビナトリアル化合物ライブラリーを、Kilcoinら米国特許第6,190,619号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される装置を使用して合成しうる。米国特許第6,190,619号によって、複数の別個の化合物の同時合成または化合物のコンビナトリアルライブラリーのための複数の反応容器を保持することができる合成装置が開示される。
【０４７９】
一つの実施形態において、コンビナトリアル化合物ライブラリーを、溶液中で合成できる。Bogerら米国特許第6,194,612号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される方法によって、コンビナトリアルライブラリーの溶相合成のテンプレートとして有用である化合物を特徴付ける。テンプレートを、液体／液体抽出物または固体／液体抽出物を用いて未反応の反応物から反応生成物が容易に精製できるように設計する。このテンプレートを用いたコンビナトリアル合成により製造した化合物は、好ましくは低有機分子であろう。ライブラリー中のある化合物は、非ペプチドまたはペプチドの効果を模倣しうる。コンビナトリアル化合物ライブラリーの固相合成に対して、液相合成は多工程の固相合成の各工程をモニタするための特定のプロトコルを使用する必要はない(Egnerら1995, J. Org. Chem. 60：2652；Andersonら1995, J. Org. Chem. 60：2650；Fitchら1994, J. Org. Chem. 59：7955；Lookら1994, J. Org. Chem. 49：7588；Metzgerら1993, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 32：894；Youngquistら1994, Rapid Commun. Mass Spect. 8：77；Chu ら1995, J. Am. Chem. Soc. 117：5419；Brummelら1994, Science 264：399;およびStevanovicら1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3：431)。
【０４８０】
本発明の方法に有用であるコンビナトリアル化合物ライブラリーは、固体支持体上で合成したものでありうる。一つの実施形態において、スプリット合成方法、合成の間に固体支持体を分離および混合するプロトコルを、固体支持体上に化合物のライブラリーを合成するために用いる(例えば、Lam ら1997, Chem. Rev. 97：41−448；Ohlmeyerら1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10922−10926および本明細書中に引用される参考文献を参照のこと)。最終ライブラリーの各固体支持体は、その表面に結合した実質的に１つの型の化合物を有する。固体支持体でコンビナトリアルライブラリーを合成するための他の方法（ここで1つの生成物を、各支持体に結合させる）は、当業者に公知であろう（例えば、Nefziら1997, Chem. Rev. 97：449−472を参照のこと）。
【０４８１】
本明細書中で使用される場合、用語「固体支持体」は、特定の型の固体支持体に限定しない。むしろ多数の支持体が利用でき、当業者に公知である。固体支持体としては、シリカゲル、樹脂、被覆プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿織物、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミニウムゲル、および多糖が挙げられる。適切な固体支持体を、所望される最終用途および種々の合成プロトコルに対する適合性に基づいて選択しうる。例えば、ペプチド合成について、固体支持体は、p−メチルベンズヒドリルアミン(pMBHA)樹脂(Peptides International, Louisville, KY)、クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンを含むポリスチレン(例えば、Bachem Inc., Peninsula Laboratoriesなどから得られるPAM−樹脂)、スチレンとジビニル−ベンゼンを共グラフトさせたポリ(ジメチルアクリルアミド)(例えば、POLYHIPE樹脂（Aminotech, Canadaから得られる）)、ポリアミド樹脂(Peninsula Laboratoriesから得られる)、ポリエチレングリコールでグラフトしたポリスチレン樹脂(例えば、TENTAGELもしくはARGOGEL, Bayer, Tubingen, Germany)、ポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/Biosearch, Californiaから得られる)、またはセファロース(Pharmacia, Sweden)のよう樹脂でありうる。
【０４８２】
本発明のある実施形態において、化合物はリンカーを介して固体支持体に結合されうる。リンカーは固体支持体に統合されているかまたは一部でありえ、あるいは統合されておらず、固体支持体上で合成されるかまたは合成後に固体支持体上に結合されうる。リンカーは、固体支持体への化合物の結合点を与えるだけではなく、リンカーの特性に依存して、分子の別の群が、別の条件下で固体支持体から切断されることを可能にすることにも有用である。例えば、リンカーは特に、求電子切断、求核切断、光切断、酵素切断、金属による切断、還元条件下における切断または酸化条件下において切断されうる。好ましい実施形態において、化合物は、この化合物のハイスループットスクリーニングの前に、固体支持体から切断される。
【０４８３】
本発明の特定の実施形態において、化合物は、低分子である。
【０４８４】
4.5.13 化合物の構造の特徴づけ
ライブラリーが、化合物のアレイまたはマイクロアレイを含み、ここで各化合物が、アドレスまたは識別子を有する場合、この化合物を、陽性試料と個々の試験アッセイに適合された実際の化合物のリストとを相互参照することによって分析できる。
【０４８５】
ライブラリーが、ペプチドまたは核酸のライブラリーである場合、化合物の配列は、ペプチドまたは核酸のダイレクトシークエンスによって決定できる。このような方法は、当業者に周知である。
【０４８６】
本発明のスクリーニング方法によって同定した化合物を新たに特徴付けるために、多数の物理化学的技術が用いられうる。このような技術の例としては、質量分析法、NMR分光法、単結晶X線解析法および振動分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８７】
4.5.13.1 質量分析法
化合物の構造を明らかにするために、質量分析法（例えば、エレクトロスプレーイオン化法（「ESI」）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（「MALDI」）、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴法（「FT−ICR」））を用いることができる。
【０４８８】
ESI質量分析法（「ESI−MS」）は、MALDI方法とは異なり断片化をほとんど伴わずに分子イオンを生じるために、ESI−MSは非共有結合の分子間相互作用を調べることにより大きな有用性を有する(Xavierら2000, Trends Biotechnol. 18(8)：349−356)。ESI−MSは、HIV TatペプチドとTAR RNAを伴うタンパク質で形成された複合体を調べるために用いられている(Sannes−Loweryら1997, Anal. Chem. 69：5130−5135)。
【０４８９】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（「FT−ICR」）質量分析法は、高分解能スペクトル、同位体分離前駆イオン選択、および正確な質量数決定を提供する(Xavierら2000, Trends Biotechnol. 18(8)：349−356)。FT−ICRは、アミノグリコシド抗生物質と同種および同種ではないRNAとの相互作用を調べるために用いられている(Hofstadlerら1999, Anal. Chem. 71：3436−3440；およびGriffeyら1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：10129−10133)。本明細書中に議論されるすべての質量分析法についてもいえるように、FT−ICRは化合物を標識する必要はない。
【０４９０】
4.5.13.2 NMR分光法
NMR分光法は、化学シフトの変化、特に緩和効果を用いて測定した距離の変化を定性的に決定することで化合物の構造を決定する有用な技術である。NMRによるSARを、化合物の構造を明らかにするために用いることができる。
【０４９１】
本発明に用いることができるNMRの例としては、一次元NMR、二次元NMR、相関分光（「COSY」）、および核オーバーハウザー効果（「NOE」）分光が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物の構造を決定する方法は、当業者に周知である。
【０４９２】
4.5.13.3 単結晶X線解析法
化合物の構造を明らかにするために単結晶X線解析法を用いることができる。単結晶X線解析法の論評については、例えば、Blundellら2002, Nat Rev Drug Discov 1(1)：45−54を参照のこと。単結晶X線解析法の最初の工程は、結晶の形成である。結晶の形成を、高い精製度でかつ溶解性のサンプルを調製することによって始める。次いで、核生成を生じることが知られている複数の溶解変数（例えば、pH、イオン強度、温度、ならびに有機添加物、塩および界面活性剤の特定の濃度）を最適化することで、結晶化の条件を決定する。結晶化の工程をオートメーション化する技術が、高品質のタンパク質結晶の製造をオートメーション化するために開発された。結晶が形成されると、この結晶を回収し、データ収集のために調製する。次いでこの結晶を回析（例えば、多軸回析装置、高速CCD検出器、および検出器オフセット）で分析する。一般に、複数の結晶を、構造決定のためにスクリーニングしなければならない。
【０４９３】
4.5.13.4 振動分光法
振動分光法（例えば、赤外（IR）分光法またはラマン分光法）を、化合物の構造を明らかにするために用いることができる。赤外分光法は、量子力学的な選択規則に従って振動の励起を生じる化合物に吸収された赤外光（100〜10,000nmの波長）の振動を測定する。赤外光の吸収は、光の吸収が分子の双極子モーメントの変化を生じることを要する。任意の分子の赤外スペクトルは、多様な強度の吸収波長の特有のパターンである。このパターンは、化合物を同定するための分子フィンガープリントとみなされうる。
【０４９４】
標準的な強度（ダブルビーム装置）または予め測定した（「ブランク」）強度（シングルビーム装置）と比べて、化合物によって赤外光源を小さくする（混合振動数と振動数を分ける）ことによって生じた個々の光の振動の吸収を測定する走査方式で、赤外光スペクトルを測定できる。好ましい実施形態において、赤外光をパルス方式（「FT−IR」）で測定し、ここで干渉計によって生じる、全ての赤外光波長の混合ビームが、化合物を透過するか、または化合物で反射される。生じた干渉図形（この干渉図形を、電子シグナルのランダムノイズを平均化している間に、シグナル強度を増強させるためにその後のパルスから生じた干渉図形に加えてもよいし、加えなくてもよい）を、フリーエ変換または高速フリーエ変換アルゴリズムを用いてスペクトルへ数学的に変換させる。
【０４９５】
ラマン分光法は、入射ビームと比べて、散乱した可視光または紫外光の赤外振動の吸収による振動数の差を測定する。入射した単色光ビーム（普通はシングルレーザー振動）は、化合物に完全に吸収されず、一過的に電場と相互作用する。試料が散乱させたほとんどの光は変化しないが（レイリーの散乱）、一部の散乱光は入射および分子の振動周波の和または差である振動数を有するだろう。ラマン（非弾性）散乱の選択規則は、分子の分極率の変化を要する。赤外分光法およびラマン分光法の両方で、一部の振動遷移が観察できるが、多くはどちらかの方法を用いた場合にのみ観察できる。任意の分子のラマンスペクトルは、多様な強度の吸収波長の特有のパターンである。このパターンは、化合物を同定するための分子フィンガープリントとみなされうる。
【０４９６】
単色光を試料に透過させるか、または好ましくは試料で反射させ、レイリー散乱光を透過させ、そしてラマン散乱光の振動数を検出することによって、ラマンスペクトルを測定する。改良されたラマンスペクトロメーターが、Finkら米国特許第5,786,893号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０４９７】
それぞれビーズを処理するために可視顕微鏡とスペクトロメーターを統合し、空間的に分解した様式で、振動分光を測定できる。顕微鏡赤外スペクトロメーターが、Reffnerら米国特許第5,581,085号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。1つの試料で顕微鏡赤外分析および顕微鏡ラマン分析を同時に行う装置が、Sostekら米国特許第5,841,139号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０４９８】
4.6 二次アッセイ
プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、プレ−tRNA切断複合体、rRNAエンドヌクレアーゼもしくはプレ−rRNA切断複合体の活性または安定性をモジュレートする上記アッセイで同定した化合物（便宜上本明細書中において「リード」化合物と呼ぶ）をさらに、RNAに対する直接結合と生物学的活性の両方について試験できる。一つの実施形態において、このリード化合物をさらなるアッセイおよび／または動物モデルにおいて生物学的な活性について試験する。別の実施形態において、このリード化合物を、コンジェナーまたはアナログを設計するために用いる。別の実施形態において、リード化合物がヒトプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ、ヒト3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ、ヒトプレ−tRNA切断複合体、rRNAエンドヌクレアーゼまたはヒトプレ−rRNA切断複合体の活性をモジュレートしている機構を調べるために、突然変異誘発研究を行うことができる。さらに別の実施形態においては、創傷治癒に影響するリード化合物の能力について、モデル系においてこの化合物を試験する。
【０４９９】
4.6.1 表現型のまたは生理学的解読
上記アッセイで同定した化合物（便宜上本明細書中において「リード」化合物と呼ぶ）を、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼもしくは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼを含むかまたは含むように操作した宿主細胞を使用して機能解読系と組み合わせて生物学的活性について試験することができる。
【０５００】
一つの実施形態において、リード化合物の効果を、標的細胞の細胞増殖または生存能力を測定することでアッセイできる。このようなアッセイを、特定の増殖性疾患に関与する細胞型の典型的な細胞で実施できる。接触細胞の低レベルの増殖または生存率は、このリード化合物が、制御できない細胞増殖に特徴付けられる患者の病態を処置するのに効果的であることを示す。あるいは、患者に由来する細胞を培養する代わりに、腫瘍もしくは悪性の細胞系または内皮細胞系の細胞を使用して、リード化合物をスクリーニングしうる。細胞培養モデルの特定の例としては、肺癌, 初代ラット肺腫瘍細胞(Swaffordら1997, Mol. Cell.Biol., 17：1366−1374)および大細胞未分化癌細胞系(Mabryら1991, Cancer Cells, 3：53−58)；大腸癌の結腸直腸細胞系(ParkおよびGazdar, 1996, J. Cell Biochem. Suppl. 24：131−141)；乳癌の多数確立した細胞系(Hamblyら1997, Breast Cancer Res. Treat. 43：247−258；Gierthyら1997, Chemosphere 34：1495−1505；PrasadおよびChurch, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:14−19)；前立腺癌の多数のよく特徴付けされた細胞モデル(Webberら1996, Prostate, Part 1,29:386−394；Part 2, 30：58−64;およびPart 3,30:136−142；Boulikas, 1997, Anticancer Res. 17:1471−1505)；泌尿生殖器癌の連続ヒト膀胱癌細胞系(Ribeiroら1997, Int. J. Radiat. Biol. 72：11−20)；遷移性細胞カルシノーマの器官培養(Boothら1997, Lab Invest. 76：843−857)およびラット進行モデル(Vetら1997, Biochim. Biophys Acta 1360：39−44)；ならびに白血病およびリンパ腫の確立した細胞系(Drexler, 1994, Leuk. Res. 18：919−927, Tohyama, 1997, Int. J. Hematol. 65：309−317)が挙げられるが、これらに限定されない。細胞系のより具体的な例としては、癌細胞系Huh7(ヒト肝細胞癌細胞系)および癌細胞系Caco−2(大腸癌細胞系)が挙げられる。特定の実施形態において、リード化合物の形質転換細胞の癌細胞の増殖および／または生存能力への影響を、癌ではない、正常細胞の増殖および／または生存能力への化合物の影響と比較する。好ましくは、癌細胞または形質転換細胞の増殖および／もしくは生存能力に差次的に影響する化合物を、抗増殖性薬剤として選択する。
【０５０１】
リード化合物に曝した後に患者の細胞または細胞系の生存能力および／もしくは増殖を調べるために、当該分野で周知である多数のアッセイを用いることができる；例えば、ブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込み(例えば、Hoshinoら1986, Int. J. Cancer 38,369；Campanaら1988, J. Immunol. Meth. 107：79を参照のこと)または(3H)−チミジンの取り込み(例えば、Chen, J. , 1996, Oncogene 13：1395−403；Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270：18367−73を参照のこと)を測定することによって、直接細胞を計数することによって、癌原遺伝子（例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイクリンA、サイクリンD1、サイクリンD2、サイクリンD3、サイクリンEなど)のような既知遺伝子の転写、翻訳または活性の変化を検出することによって、細胞増殖をアッセイできる。このようなタンパク質およびmRNAおよび活性のレベルを、当業者に周知の方法で決定できる。例えば、タンパク質を、商業的に利用できる抗体を使用して、ウエスタンブロットまたは免疫沈降のような既知の免疫診断的方法で定量できる。mRNAを、当該分野で周知でありかつ常用される方法（例えば、ノーザン分析法、RNaseプロテクション法、逆転写に関連するポリメラーゼ連鎖反応法）を用いて定量できる。細胞の生存能力を、トリパンブルー染色または当該分野で公知である他の細胞死または細胞の生存能力のマーカーを用いて調べることができる。特定の実施形態において、細胞のATPレベルを、細胞の生存能力を決定するために測定する。分化を、例えば、形態の変化に基づいて視覚的に調べることができる。
【０５０２】
リード化合物をまた、細胞の形質転換（または悪性表現型への進行）を阻害するその能力についてin vitroで調べることができる。本実施形態において、形質転換した細胞の表現型を有する細胞を、リード化合物と接触させ、形質転換した表現型に関連する特性（in vivoで腫瘍形成能力に関連する一組のin vitroでの特性）（例えば、ソフトアガーにおけるコロニー形成、より丸びを帯びた細胞形態、基盤へのより弱い結合、接触阻止の喪失、アンカー依存性の喪失、プラスミノーゲンアクチベーターのようなプロテアーゼの放出、糖輸送の増加、血清要求物の減少、または胎児抗原の発現など（これらに限定されない）(Luriaら1978, General Virology, 第3版, John Wiley & Sons, New York, pp. 436−446を参照のこと)）の変化について調べる。
【０５０３】
侵襲性の喪失または接着性の減少をまた、リード化合物の抗癌効果を示すために調べることができる。例えば、転移性癌形成の1つの態様は、疾患の原発部位から離れ、第二の場所で新しいコロニーの増殖を確立する前癌性細胞または癌細胞の能力である。末梢部位へ浸潤する細胞の能力は、細胞の癌性状態の可能性を反映する。侵襲性の喪失を、例えば、E−カドヘリン媒介性細胞−細胞接着の誘導を含む、当該分野で公知である種々の技術で測定できる。このようなE−カドヘリン媒介性接着によって、表現型の変異および侵襲性の喪失を生じうる(Hordijkら1997, Science 278：1464−66)。
【０５０４】
侵襲性の喪失をさらに、細胞移動の阻害によって調べることができる。種々の2次元および3次元の細胞マトリックスを、商業的に利用できる(Calbiochem−Novabiochem Corp. San Diego, CA)。マトリックスを横断するまたはマトリックスに向かう細胞移動を、顕微鏡、タイムラプス（time−lapsed）写真撮影もしくはタイムラプスビデオ撮影を用いて、または細胞移動を測定することができる当該分野において任意の方法により、調べることができる。関連した実施形態において、侵襲性の喪失を、肝細胞増殖因子(HGF)に対する応答によって調べる。HGFに誘導された細胞分散は、Madin−Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞のような細胞の侵襲性に関連する。このようなアッセイによって、HGFに応答する細胞分散活性を失った細胞集団を同定する(Hordijkら1997, Science 278：1464−66)。
【０５０５】
あるいは、侵襲性の喪失を、化学走性容器を通過する細胞移動によって測定できる(Neuroprobe/Precision Biochemicals Inc. Vancouver, BC)。このようなアッセイにおいて、化学誘引因子を、容器の片側（例えば、下側の容器）でインキュベートし、細胞を反対側（例えば、上側の容器）を隔てるフィルター上にプレートする。細胞が上側の容器から下側の容器へと通過するために、この細胞はフィルターの小さな穴を通過して能動的に移動しなければならない。そして移動した細胞数のチェッカーボード分析は、侵襲性に関連しうる(例えば、Ohnishi, T. , 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun.193:518−25を参照のこと)。
【０５０６】
特定の実施形態において、リード化合物を、PBMC（末梢血単核細胞）に対するその効果（例えば、細胞毒性、遺伝子発現変化、および形態変化（これらに限定されない））について試験する。
【０５０７】
4.6.2 動物モデル
本明細書中に記載されるアッセイで同定したリード化合物を、増殖性疾患の動物モデルを使用して生物学的活性について試験できる。これらには、トランスジェニックマウスのような、機能解読系と組み合わせたtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼまたは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼを含むように操作した動物を含む。このような動物モデル系としては、ラット、マウス、トリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、本発明の方法に従って同定した化合物を、マウスモデル系で試験する。このようなモデル系は、SCIDマウスモデルまたはトランスジェニックマウスのように広範に用いられかつ当業者に周知である。
【０５０８】
本発明に従って同定した化合物の抗新生血管形成活性は、血管新生した腫瘍の種々の実験動物モデルを使用して決定することができる。本発明に従って同定した化合物の抗腫瘍活性は、動物モデルにこの化合物を投与し、そしてこの化合物が、この動物モデルにおいて癌細胞の増殖または拡散を減少させることに効果的であることを証明することによって決定できる。一般的にヒト癌の動物モデルの例としては、伴侶動物の自発的に生じる腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Vail & MacEwen, 2000, Cancer Invest 18(8)：781−92を参照のこと)。
【０５０９】
肺癌の動物モデルの例としては、Zhang & Roth(1994, In Vivo 8(5)：755−69)に記載される肺癌動物モデルおよびp53機能を崩壊させたトランスジェニックマウスモデル(例えば、Morrisら1998, J La State Med Soc 150(4)：179−85を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。乳癌の動物モデルの例としては、サイクリンD1を過剰発現するトランスジェニックマウス(例えば、Hosokawaら2001, Transgenic Res 10(5)：471−8を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。結腸癌の動物モデルの例としては、TCRβおよびp53のダブルノックアウトマウス（例えば、Kadoら、2001, Cancer Res 61(6):2395-8）が挙げられるが、これらに限定されない。膵臓癌の動物モデルの例としては、Panc02マウス膵臓腺癌の転移性モデル(例えば、Wangら2001, Int J Pancreatol 29(1)：37−46を参照のこと)および皮下に膵臓腫瘍を作製したnu−nuマウス(例えば、Ghanehら2001, Gene Ther 8(3)：199−208を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。非ホジキンリンパ腫の動物モデルの例としては、重症複合型免疫不全(「SCID」)マウス(例えば、Bryantら2000, Lab Invest 80(4)：553−73を参照のこと)およびIgHmu−HOX11トランスジェニックマウス(例えば、Houghら1998, Proc Natl Acad Sci USA 95(23)：13853−8を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。食道癌の動物モデルの例としては、ヒトパピローマウィルス16型のE7癌遺伝子を遺伝子導入したマウス(例えば、Herberら1996, J Virol 70(3):1873−81を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。結腸直腸癌の動物モデルの例としては、Apcマウスモデル(例えば、Fodde & Smits, 2001, Trends Mol Med 7(8)：369−73およびKuraguchiら2000, Oncogene 19(50)：5755−63を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１０】
特定の実施形態において、動物モデルは変質した、閑散としたまたは保護された組織の、血管創傷治癒のモデルシステムである。創傷治癒のモデルとしては、炎症、病変、潰瘍および床ずれが挙げられる。本発明のリード化合物を、創傷治癒の工程を促進、増進および／または増強するその能力について試験しうる。
【０５１１】
4.6.3 毒性
例えば、LD50（集団の50%が致死する服用量）ならびにED50（集団の50%で治療的に有効である服用量）を決定するために、本発明に従って同定した化合物の毒性および／または有効性を、細胞培養もしくは実験動物で標準的な薬学的手順によって決定しうる。本発明に従って同定した化合物の細胞毒性を調べるために使用されうる細胞および細胞系としては、末梢血単核細胞(PBMC)、Caco−2細胞、およびHuh7細胞が挙げられるが、これらに限定されない。毒性と治療効果との間の服用量比率は、治療指数であり、LD50／ED50の比率で表されうる。本発明に従って同定した化合物であって、大きな治療指数を示すものが、好ましい。本発明に従って同定した化合物であって毒性の副作用を示す化合物を使用しうるが、作用を受けない細胞の潜在的損傷を最小化するためにこのような薬剤が作用する組織部位を標的とし、そしてそれによって副作用を減少させる輸送系を設計することに注意すべきである。
【０５１２】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを、本発明に従って同定した化合物のヒトに使用するための投薬量の範囲を表すために用いうる。このような薬剤の投薬量は好ましくは、毒性をほとんどまたは全く有さないED50を含む循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、使用した剤形および用いた投与経路によって決まる投薬量内で変化しうる。本発明の方法で使用する任意の薬剤について、治療的に有効な服用量を、細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。細胞培養で決定するように、IC50（すなわち、最大で2分の1の症状を抑制を達成する化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るために、動物モデルで服用量を計算しうる。このような情報を、ヒトにおける有用な服用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿のレベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定しうる。
【０５１３】
4.6.4 コンジェナーまたはアナログの設計
所望される生物学的活性を示す化合物を、有用な薬理学的活性を有するコンジェナーまたはアナログの開発もしくは設計のために、リード化合物として使用できる。例えば、リード化合物を同定すると、より効果的でありうる化合物の変異体を設計するために分子モデリング法を用いうる。分子モデリング系の例は、CHARMおよびQUANTAプログラム(Polygen Corporation, Waltham, MA)である。CHARMは、エネルギーの最小限化および分子動力学的機能を果たす。QUANTAは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を行う。QUANTAは、分子間相互の動きの相互作用的な構造、改変、可視化および分析を可能とする。
【０５１４】
多数の論文によって、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングが論評される（例えば、Rotivinenら1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97：159−166；Ripka, 1998, New Scientist 54−57；McKinaly & Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29：111−122；Perry & Davies, OSAR：Quantitative Structure−Activity Relationships in Drug Design pp. 189−193(Alan R. Liss, Inc. 1989)；Lewis & Dean, 1989, Proc. R. Soc. Lond. 236：125−140および141−162；Askewら1989, J. Am. Chem. Soc. 111：1082−1090）。化学物質をスクリーニングし、グラフィックで示す別のコンピュータープログラムが、BioDesign, Inc.(Pasadena, California), Allelix, Inc.(Mississauga, Ontario, Canada),およびHypercube, Inc.(Cambridge, Ontario)のような会社から利用できる。これらはもともと特定のタンパク質に特異的な薬物に利用するために設計されたが、任意の同定された領域に特異的な薬物の設計に適合させることができる。アナログおよびコンジェナーを、生物学的活性についての上記スクリーニングを用いてヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに対する結合について試験しうる。あるいは、スクリーニングで確かめられたように、ほとんどまたは全く生物学的活性を有さないリード化合物もまた、生物学的活性を有する化合物のアナログおよびコンジェナーを設計するために用いられうる。
【０５１５】
4.7 本発明の医薬組成物
特定の実施形態において、本発明は、1つの担体と以下のうちの1つまたは以下のうちの2つ以上の組合せを含む組成物を提供する：(i)本発明の複合体の構成成分(例えば、ヒトSen2、ヒトSenl5、ヒトSen34、ヒトSen54、ヒトSen2ΔEx8、もしくはそれらの機能的に活性な断片の機能的に活性な誘導体；(ii)本発明の複合体、(iii)本発明の複合体の構成成分、もしくは本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、(iv)本発明の複合体の構成成分の発現をモジュレートする化合物、(v)本発明の複合体の形成をモジュレートする化合物、(vi)本発明の複合体のエンドヌクレアーゼ活性(例えば、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性および／もしくは3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性)をモジュレートする化合物、(vii)本発明の複合体のプレ−tRNA切断活性をモジュレートする化合物、ならびに／または(viii)本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性をモジュレートする化合物。本組成物は、さらに1つ以上の別の予防剤または治療剤を含んでよい。好ましい実施形態において、この組成物は医薬組成物である。本実施形態によると、この医薬組成物は好ましくは、無菌であり、意図される投与方法または用途に適した形態である。本発明は、本明細書中に記載される障害またはそれらの病状の予防、処置、管理もしくは改善における本発明の組成物の使用を包含する。
【０５１６】
本発明の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、Sen2、Clp1、Sen54、Senl5、およびSen34を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、Sen2、Sen54、Senl5、およびSen34を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、Sen2ΔEx8を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、Sen2ΔEx8およびSen54を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、Sen2ΔEx8、Sen54、Senl5およびSen34を含む。これらの実施形態によると、本発明の医薬組成物は、さらに以下を含みうる：(i)ヒトCPSF160；(ii)ヒトCPSF30；(iii)ヒトCstF64；および／または(iv)ヒトシンプレキン。
【０５１７】
別のタンパク質構成成分が、複合体の形態または複合体の形態ではなく存在しうる。別の実施形態において、医薬組成物は、Sen2、Clp1、Sen54、Senl5、Send34、CPSF、CFIm、CFIImおよびCstFを含む。別のタンパク質構成成分は、複合体の形態または複合体の形態ではなく存在しうる。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、Sen2ΔEx8、Clp1、Sen54、Senl5、Send34、CPSF、CFIm、CFIImおよびCstFを含む。別のタンパク質構成成分は、複合体の形態または複合体の形態ではなく存在しうる。
【０５１８】
さらに別の実施形態において、医薬組成物は、Sen2ΔEx8に特異的に結合する抗体を含む。さらにより具体的な実施形態において、この抗体は、Sen2に結合しない。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、Sen2ΔEx8をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０５１９】
さらに別の実施形態において、医薬組成物は、本発明の複合体の構成成分に特異的に結合する抗体を含む。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、本発明の複合体の構成成分をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、本発明の複合体に免疫特異的に結合する抗体を含む。より具体的な実施形態において、この抗体は、本発明の複合体の個々の構成成分と結合しない。
【０５２０】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物はまた、製薬上許容可能な担体を含む。
【０５２１】
本発明の組成物としては、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬物組成物(例えば、不純または未滅菌の組成物)および単位剤形の調製に用いられうる医薬組成物(すなわち、被験体または患者への投与に適した組成物)が挙げられるが、これらに限定されない。このような組成物は、予防的または治療的に有効量である本明細書中に開示される予防剤および／もしくは治療剤またはこれらの薬剤と製薬上許容可能な担体の組合せを含む。
【０５２２】
特定の実施形態において、用語「製薬上許容可能な」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関またはアメリカ薬局方に指定された規制機関あるいは一般的に認可された薬局方によって、動物、より具体的にはヒトへの使用が認可されたことを意味する。用語「担体」とは、治療剤と共に含まれるかまたは投与される、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイドアジュバント(完全および不完全))、賦形剤またはビヒクルをいう。このような薬学的担体は、水または油（石油、動物、植物もしくは合成のものを起源とするものを含む、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）のような無菌液でありうる。医薬組成物が、静脈内に投与される場合、水が好ましい担体である。塩水およびブドウ糖溶液およびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液に使用しうる。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望される場合、組成物はさらに、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含みうる。これらの組成物は、溶液、顕濁液、乳化剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粒剤、徐放性製剤などの形態でありうる。
【０５２３】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは単位剤形（例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェのような完全密閉の容器の中の、凍結乾燥粉末または無水濃縮物）に一緒に混合して供給される。組成物を点滴投与する場合、この組成物を無菌の薬用グレードの水または塩水を含む点滴ボトルを用いて投与することができる。組成物を注射で投与する場合、注射用の無菌水または塩水のアンプルを、投与前に成分を混合するために用意することができる。
【０５２４】
本発明の組成物を、中性または塩形態で調合しうる。製薬上許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオン用いて形成されたもの、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンを用いて形成されたものが挙げられる。
【０５２５】
投与の経路については、第4.9節を参照のこと。
【０５２６】
4.8 予防的使用および治療的使用
本明細書中に記載されるアッセイで同定した化合物であって、本発明の複合体の構成成分の発現、本発明の複合体の形成、本発明の複合体のRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性および／または本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)をモジュレートする化合物を、当業者に周知であるかまたは本明細書中に記載されるin vitroアッセイ(例えば、細胞系アッセイもしくは無細胞アッセイ)またはin vivoアッセイで、本明細書中に記載される障害(例えば、増殖性疾患または異常なRNA−核酸分解活性を特徴とするか、関連するか、もしくは引き起こされる障害)あるいは特定の障害の患者の細胞に対する化合物の効果について試験しうる。
【０５２７】
本発明は、増殖性疾患もしくは異常なRNA−核酸分解活性を特徴とするか、関連するか、もしくは引き起こされる障害またはそれらの1つ以上の病状を予防、処置、管理または改善する方法を提供する。この方法は、本発明の方法に従って同定した1つ以上の化合物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。一つの実施形態において、本発明は、増殖性疾患もしくは異常なRNA−核酸分解活性を特徴とするか、関連するか、もしくは引き起こされる障害またはそれらの1つ以上の病状を予防、処置、管理または改善する方法を提供する。この方法は、本発明の方法に従って同定した1つ以上の化合物の予防有効量あるいは治療有効量の服用量を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物を、増殖性疾患もしくは異常なRNA−核酸分解活性を特徴とするか、関連するか、もしくは引き起こされる障害またはそれらの1つ以上の病状を予防、処置、管理または改善するために以前に使用した場合、このような化合物を、このような増殖性疾患を予防、治療、または改善するために投与しない。特定の実施形態において、本発明の治療方法は、本発明の方法を用いてプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体または3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ複合体のアンタゴニストとして同定した化合物の有効量を投与する工程を包含する。アンタゴニストは、複合体を不安定化させ、複合体の形成を妨げまたは複合体の触媒活性を減少させる化合物でありうる。
【０５２８】
特定の別の実施形態において、本発明の方法を用いて3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼまたはプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのアゴニストとして同定した化合物の治療有効量を、創傷治癒を促進するために投与する。アゴニストは、複合体を安定化させるかまたは複合体の触媒活性を活性化させることによって作用しうる。
【０５２９】
特定の実施形態において、本発明の治療方法は、薬学的に有効量の以下の2つ以上を投与する工程を包含する：Sen2、Clpl、Sen54、Senl5、およびSen34。特定の実施形態において、本発明の治療方法は、薬学的に有効量のSen2、Clpl、Sen54、Senl5、およびSen34を投与する工程を包含する。これらの実施形態によると、本発明の医薬組成物はさらに、(i)ヒトCPSF160；(ii)ヒトCPSF30；(iii)ヒトCstF64；および／または(iv)ヒトシンプレキンを含んでよい。別の実施形態において、本発明の治療方法は、薬学的に有効量のSen2、Clpl、Sen54、Senl5、Send34、CPSF、CFIm、CFIImおよびCstFを投与する工程を包含する。別の実施形態において、治療方法は、Sen2ΔEx8ならびに選択的にSenl5、Sen34、Sen54およびClplを投与する工程を包含する。これらの実施形態によると、本発明の医薬組成物はさらに：(i)ヒトCPSF160；(ii)ヒトCPSF30；(iii)ヒトCstF64；および／または(iv)ヒトシンプレキンを含みうる。さらに別の実施形態において、本発明の治療方法は、薬学的に有効量のSen2ΔEx8、Clp1、Sen54、Senl5、Send34、CPSF、CFIm、CFIImおよびCstFを投与する方法を含む。異なるタンパク質構成成分が、複合体の形態か、または複合体の形態ではなく存在しうる。
【０５３０】
さらに別の実施形態において、本発明の治療方法は、Sen2ΔEx8に特異的に結合する薬学的に有効量の抗体を投与する工程を包含する。さらにより具体的な実施形態において、この抗体は、Sen2に結合しない。
【０５３１】
さらに別の実施形態において、本発明の治療方法は、Sen2ΔEx8をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする薬学的に有効量のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する。
【０５３２】
本発明は、増殖性疾患もしくは異常なRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる障害またはそれらの1つ以上の病状を予防、処置、管理または改善する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載されるスクリーニング方法を用いて同定した1つ以上の化合物、および1つ以上の別の治療剤（例えば、予防剤もしくは治療剤）を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。この治療剤は、現在用いているもの、用いていたもの、または増殖性疾患に関連する1つ以上の病状を予防、処置、管理あるいは改善するのに有用であることが知られているものである（本明細書中下記第4.8.3節に示される予防剤あるいは治療剤を含むが、これらに限定されない）。本発明の組合せ治療の治療剤(例えば、予防剤もしくは治療剤)を、差次的にまたは同時に投与しうる。特定の実施形態において、本発明の組合せ治療剤は、本発明にしたがって同定した化合物とこの化合物と同じ作用機構を有する少なくとも1つの別の治療剤とを含む。別の特定の実施形態において、本発明の組合せ治療剤は、本発明の方法に従って同定された化合物とこの化合物とは異なる作用機構を有する少なくとも1つの別の治療剤(例えば、予防剤または治療剤)とを含む。本発明の組合せ治療剤は、付加的効果または相乗的効果を有するように本発明の化合物と共に機能することによってこの化合物の予防効果もしくは治療効果を改善する。本発明の組合せ治療剤は、治療剤(例えば、予防剤または治療剤)に関連する副作用を減少させる。
【０５３３】
組合せ治療の予防剤または治療剤を、同一の医薬組成物で被験体に投与しうる。あるいは、組合せ治療の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物で同時に被験体に投与しうる。この予防剤または治療剤を、同一または異なる投与経路で被験体に投与しうる。
【０５３４】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイで同定した1つ以上の化合物を含む医薬組成物を、増殖性疾患またはその1つ以上の病状を予防、処置、管理もしくは改善するために、被験体、好ましくはヒトに投与する。本発明によると、医薬組成物はさらに、1つ以上の予防剤または治療剤を含みうる。これらは、現在用いているもの、用いていたもの、または増殖性疾患またはその1つ以上の病状を予防、処置、管理あるいは改善するのに有用であることが知られているものである。
【０５３５】
本発明の方法に従って同定された化合物を、増殖性疾患あるいはRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる障害の第1段階、第2段階、第3段階、第4段階または第5段階の治療として用いうる。本発明は、増殖性疾患あるいは異常なRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる障害またはそれらの1つ以上の病状に対する従来の治療では難治の被験体において、このような増殖性疾患を処置、管理あるいは改善する方法を提供する。本方法は予防または治療有効量の服用量で本発明の方法に従って同定された化合物をこの被験体に投与する工程を包含する。特に、治療に反応して、少なくとも重要な部分の癌細胞または異常なRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる細胞が殺されないか、またはそれらの細胞分裂が停止しない場合、癌または異常なRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレリボソーマルRNA切断活性)を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる障害は、治療手段では難治であると決定されうる。このような決定は、in vivoまたはin vitroにおいて癌細胞に対する処置の有効性をアッセイするために当該分野で公知である任意の方法によって、このような状況において当該分野で受け入れられている「難治」の意味を用いてなされうる。特定の実施形態において、癌細胞の数が、顕著に減少しないか、または増加した場合、癌は難治である。
【０５３６】
より具体的な実施形態において、本発明は、増殖性疾患の1つ以上の病状に対する既存の単一薬剤の治療では難治である被験体のこのような増殖性疾患を処置、管理または改善するための方法を提供する。この方法は、予防もしくは治療有効量の服用量で本発明の方法に従って同定された化合物および1つ以上の別の治療剤(例えば、予防剤もしくは治療剤)を予防もしくは治療有効量の服用量で被験体に投与する工程を包含する。本発明はまた、本発明の方法に従って同定された化合物を他の治療(例えば、放射線治療、化学療法または外科手術)と組み合わせて患者に投与することによって増殖性疾患を処置または管理するための方法を提供する。ここでこの患者は、他の治療では難治であること示され、それらの治療はもはや受けていない。本発明はまた、増殖性疾患および以前に別の治療を受けたことにより免疫抑制されている患者を処置または管理するための方法を提供する。本発明はまた、化学療法、放射線治療、ホルモン治療、および／もしくは生物学的治療／免疫療法が、処置または管理される被験体にとって、あまりに有毒（すなわち、容認できないもしくは耐えられない副作用を生じる）であることが示されたか、示されうる場合、癌のような増殖性疾患を処置または管理するための代替的な方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法に従って同定された化合物を投与することによって処置され、疾患活性を有さない患者において、癌のような増殖性疾患の再発を予防するための方法を提供する。
【０５３７】
本発明に包含される方法によって処置されうる増殖性疾患としては、新生物、腫瘍、転移、または制御されていない細胞増殖を特徴とする任意の疾患もしくは障害(例えば、乾癬および肺線維症)が挙げられるが、これらに限定されない。この癌は、一次癌または転移癌でありうる。
【０５３８】
本発明に包含される方法によって処置されうる癌の特定の例としては、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる癌としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性）、赤白血病白血病および骨髄異形成症候群のような白血病（これらに限定されない）、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病のような慢性白血病（これらに限定されない）；真性赤血球増加症；ホジキン疾患、非ホジキン疾患のようなリンパ腫（これらに限定されない）；くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化型骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫のような多発性骨髄腫（これらに限定されない）；ワルデンストロームマクログロブリン血症；診断未確定のM蛋白血症；良性M蛋白血症；H鎖病；骨肉腫（bonesarcoma）、骨肉腫（osteosarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性骨巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部肉腫、血管肉腫(angiosarcoma)(血管肉腫（hemangiosarcoma）)、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫のような骨と結合組織の肉腫（これらに限定されない）；神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠細胞腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫のような脳腫瘍（これらに限定されない）；腺癌、小葉(小細胞)癌、乳管内癌、髄様状乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌が挙げられるがこれらに限定されない乳癌；副腎褐色細胞腫および副腎皮質癌のような副腎癌（これらに限定されない）;乳頭状もしくは濾胞腺の甲状腺癌、髄様の甲状腺癌および脱分化甲状腺癌のような甲状腺癌（これらに限定されない）；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、悪性膵内分泌腫瘍、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイド腫瘍もしくは島細胞腫瘍のような膵臓癌（これらに限定されない）；クッシング疾患、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症のような脳下垂体癌（これらに限定されない）；虹彩の黒色腫、脈絡膜の黒色腫、および毛様体の黒色腫のような眼球の黒色腫、ならびに網膜芽細胞腫のような眼の癌（これらに限定されない）；扁平上皮癌、腺癌および黒色腫のような膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病のような外陰癌；扁平上皮癌、および腺癌のような子宮頸癌（これらに限定されない）；子宮内膜癌および子宮肉腫のような子宮癌（これらに限定されない）；卵巣上皮癌、境界腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍のような卵巣癌（これらに限定されない）；扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅性癌および燕麦細胞(小細胞)癌のような食道癌（これらに限定されない）；腺癌、腫瘤形成性(ポリープ様腺腫)、潰瘍性、表在拡大型、び慢性拡大型（diffusely spreading）、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫のような胃癌（これらに限定されない）；大腸癌；直腸癌；肝細胞癌および肝芽細胞腫のような肝臓癌（これらに限定されない）；腺癌のような胆嚢癌；乳頭状、結節型、および未分化型の胆管癌（これらに限定されない）；非小細胞肺癌、扁平上皮癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌のような肺癌；生殖細胞腫瘍、精上皮腫、脱分化型、典型的な型（classic)(典型的な型（typical）)、精母細胞性、非セミノーマ型、胎児性癌、奇形癌、絨毛癌(卵黄嚢腫瘍)のような睾丸癌（これらに限定されない）；腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫のような前立腺癌（これらに限定されない）；肛門癌；扁平上皮癌のような口腔癌（これらに限定されない）；基底癌；腺癌、粘表皮癌、および腺様嚢胞癌のような唾液腺癌（これらに限定されない）；扁平上皮癌、および疣贅性型のような咽頭癌（これらに限定されない）；基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、先端黒子型黒色腫のような皮膚癌（これらに限定されない）；腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌(腎盤および／もしくは子宮)のような腎臓癌（これらに限定されない）；ウイルムス腫瘍；移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫のような膀胱癌（これらに限定されない）。さらに、癌には、粘液肉腫、骨形成性肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendothelio sarcoma）、中皮腫、滑膜肉腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌を含む(このような障害の論評については、Fishmanら、1985, Medicine, 第２版, J. B. Lippincott Co., PhiladelphiaおよびMurphyら、1997, Informed Decisions:The Complete Book−of Cancer Diagnosis,Treatment , and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U. S. A.,Inc., United States of Americaを参照のこと)。アポトーシスの異常によって生じる癌も本発明の方法および組成物によって処置できることがさらに予期される。このような癌としては、濾胞性リンパ腫、p53突然変異による癌、ホルモン依存性の乳房、前立腺および卵巣の腫瘍、ならびに家族性大腸腺腫症および骨髄異形成症候群のような前癌性の病巣が挙げられうるが、これらに限定されない。
【０５３９】
本発明に包含される方法によって処置されうる創傷としては、ただれ、変質、潰瘍および床ずれが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４０】
4.8.1 タンパク質複合体の活性または形成を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
本発明の特定の実施形態において、被験体でアップレギュレートされた複合体のタンパク質構成成分に特異的なアンチセンス核酸の使用によって本発明の複合体の活性および形成を、阻害する。本発明は、構成成分タンパク質、もしくはその一部をコードする遺伝子またはcDNAにアンチセンスである、少なくとも6つのヌクレオチドの核酸の治療的あるいは予防的使用を提供する。本明細書中で用いられる場合「アンチセンス」核酸とは、配列相補性によって構成成分タンパク質のRNA(好ましくは、mRNA)の一部とハイブリダイズすることが可能である核酸をいう。このアンチセンス核酸は、構成成分タンパク質mRNAのコード領域および／または非コード領域に対して相補的でありうる。複合体の形成または活性を阻害するこのようなアンチセンス核酸は、治療剤としての有用性を有し、上記障害の処置または予防に使用できる。
【０５４１】
本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖のRNAもしくはDNAまたはそれらの改変体もしくは誘導体であるオリゴヌクレオチドでありえ、細胞に直接投与されるか、あるいは導入された外因性の配列の転写によって細胞内に生成されうる。
【０５４２】
別の実施形態において、本発明は、原核細胞または真核細胞における構成成分タンパク質の核酸配列の発現を阻害するための方法に関する。この方法は、本発明の構成成分タンパク質またはその誘導体のアンチセンス核酸を含む有効量の組成物を細胞に供給する工程を包含する。
【０５４３】
このアンチセンス核酸は、少なくとも6つのヌクレオチドであり、好ましくは、6個〜約200個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも100個のヌクレオチド、または少なくとも200個のヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドはDNAもしくはRNAもしくはキメラ混合体、またはそれらの誘導体型もしくは改変体型であり、一本鎖または二本鎖でありうる。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改変されうる。このオリゴヌクレオチドとして、ペプチド、細胞膜輸送(例えば、Letsingerら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:6553−6556；Lemaitreら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84：648−652；国際公開公報WO 88/09810を参照のこと)もしくは脳関門輸送(例えば、国際公開公報WO 89/10134を参照のこと)を容易にする因子、ハイブリダイゼーション・トリガー切断因子(例えば、Krolら、1988, BioTechniques 6：958−976を参照のこと)、またはインターカレート剤(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539−549を参照のこと)のような他の付着群が含まれうる。
【０５４４】
本発明の好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、一本鎖DNAとして供給される。このオリゴヌクレオチドを、当該分野で一般に知られている成分を用いて、このオリゴヌクレオチドの構造のいずれかの位置を改変しうる。
【０５４５】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルキューオシン（galactosylqueosine）、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン、5N−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチル−チオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン（queosine）、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つ改変された塩基部分を含みうる。
【０５４６】
別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも1つの改変された糖部分を含む。
【０５４７】
さらに別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタル（formacetal）または上記のアナログからなる群から選択される少なくとも１つの改変されたリン酸骨格を含む。
【０５４８】
さらに別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、2−a−アノマーオリゴヌクレオチドである。a−アノマーオリゴヌクレオチドは、一般的なβ−ユニットに対して相補的なRNAを有する特定の二本鎖ハイブリッドを形成し、この鎖は互いに平行である(Gautierら、1987, Nucl. Acids Res. 15：6625−6641)。
【０５４９】
このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション・トリガー架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション・トリガー切断因子など）に結合しうる。
【０５５０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知である標準的な方法（例えば、自動DNA合成機(例えば、Biosearch, Applied Biosystemsなどから商業的に利用できる)の使用）によって合成しうる。例えば、ホスホロチオエートオリゴ−ヌクレオチドを、Steinらの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16：3209)によって合成しえ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを、孔径制御した多孔性ガラスポリマー支持体(Sarinら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85：7448−7451)などの使用によって調製できる。
【０５５１】
特定の実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒RNA、またはリボザイムを含む(例えば、国際公開公報WO 90/11364；Sarverら、1990, Science 247：1222−1225を参照のこと)。別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、2'−0−メチルリボヌクレオチド(Inoueら、1987, Nucl. Acids Res. 15：6131−6148)、またはキメラRNA−DNAアナログ(Inoueら、1987, FEBS Lett. 215：327−330)である。
【０５５２】
代替的な実施形態において、本発明のアンチセンス核酸を、外因性配列からの転写によって細胞内で作製する。例えば、細胞に取り込まれるようにベクターを、in vivo導入し、その細胞内で、ベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸(RNA)を作製する。このようなベクターは、構成成分タンパク質をコードする配列を含むだろう。このようなベクターは、所望されるアンチセンスRNAを作製するように転写されうる限りは、エピゾームのままか、または染色体に組み込まれうる。このようなベクターを、当該分野で標準的な組換えDNA技術の方法によって構築できる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞内で複製および発現が可能であることが当該分野で公知である他のものでありうる。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）の細胞内で作用することが当該分野で公知である任意のプロモーターによってなされうる。このようなプロモーターは、誘導可能であるかまたは構成的でありうる。このようなプロモーターとしては、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1981, Nature 290:304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3'側の長い末端リピートに含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980, Cell 22：787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:1441−1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982, Nature 296：39−42)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５３】
本発明のアンチセンス核酸は、構成成分タンパク質遺伝子（好ましくは、ヒト遺伝子）のRNA転写物の少なくとも一部に対し相補的な配列を含む。しかし、好ましくはあるが、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で言及された場合、「RNAの少なくとも一部に対し相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズし、安定した二重鎖を形成することが可能であるほど十分な相補性を有する配列を意味し；二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖DNAの一本鎖を試験するか、あるいは三重鎖形成をアッセイしうる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方によって決まるだろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それに含まれうる構成成分タンパク質RNAとの塩基不一致は増し、また安定した二重鎖(または、場合に応じて三重鎖)を形成するだろう。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順を用いて、許容できる不一致の程度を確認できる。
【０５５４】
この構成成分タンパク質アンチセンス核酸を、タンパク質複合体を発現、または好ましくは、過剰発現する細胞型の障害を処置(または予防)するために用いることができる。
【０５５５】
構成成分タンパク質RNAを発現または過剰発現する細胞型を、当該分野で公知である種々の方法で同定できる。このような方法としては、構成成分タンパク質特異的核酸を用いたハイブリダイゼーション法(例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、もしくは in situハイブリダイゼーション)、または構成成分タンパク質にin vitro翻訳されるべき、この細胞型に由来するRNAの能力を免疫組織化学、ウエスタンブロット分析、ELISAなどによって観察する方法が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、処置前にタンパク質の発現について、患者の原発組織を、例えば、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーションまたはタンパク質もしくはmRNAの発現を検出するための多数の方法によって調べうる。
【０５５６】
製薬上許容可能な担体に有効量のタンパク質構成成分アンチセンス核酸を含む本発明の医薬組成物(第4.7節を参照のこと)を、本発明のタンパク質複合体を発現または過剰発現する型の疾患もしくは障害を有する患者に投与しうる。
【０５５７】
特定の障害または病状の処置に有効であるアンチセンス核酸の量は、障害または病状の性質によって決まり、標準的な臨床技術によって決定できる。可能であるならば、ヒトで試験および使用する前に、in vitroで、そして有用な動物モデル系でアンチセンスの細胞毒性を決定することが望ましい。
【０５５８】
特定の実施形態において、アンチセンス核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルによって投与する。本発明の種々の実施形態において、アンチセンス核酸を除放することができるような組成物を使用することが効果的でありうる。特定の実施形態において、特定の認識可能である中枢神経系の細胞型に抗体によって指向されたリポソームを利用することが望ましくありうる(Leonettiら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87:2448−2451；Renneisenら、1990, J. Biol. Chem. 265：16337−16342)。
【０５５９】
4.8.2 RNA干渉
特定の実施形態において、RNA干渉(RNAi)分子を、本発明の複合体の構成成分の発現を減少させるために使用する。RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)自体の配列に対応する遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNA(dsRNA)の能力である(例えば、CogoniおよびMacino, 2000, Genes Dev 10：638−643, Guru, 2000, Nature 404,804−808, Hammondら、2001, Nature Rev Gen 2：110−119, Shi, 2003, Trends Genet. 19:9−12, 米国特許第6,506,559号を参照のこと、それぞれその全体が本明細書中に参考として援用される)。RNAiはまた、転写後の遺伝子サイレンシングまたはPTGSと呼ばれる。理論にとらわれることなく、普通、細胞の細胞質内に見出されるRNA分子は、一本鎖mRNAの分子だけであるため、細胞はdsRNAを認識しそして21〜25塩基対（二重らせんの約二回転分）を含む断片へ切断する酵素を有する。この断片のアンチセンス鎖は、そのセンス鎖から十分に分離し、細胞の内在性mRNA分子の相補的センス配列とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、二本鎖領域のmRNAを切断する誘因となり、そしてポリペプチドへ翻訳されるべきmRNAの能力を破壊する。特定の遺伝子に対応するdsRNAを導入することによって、特定の組織および／または選択した時間に、細胞自体のその遺伝子の発現をノックアウトする。
【０５６０】
RNAi機構の現行モデルは、開始工程と作用工程の双方を包含する(HutvagnerおよびZamore, 2002, Curr Opin Genetics & Development 12：225−32；Hammondら、2001, Nature Rev Gen 2：110−9、それぞれその全体が本明細書中に参考として援用される)。開始工程において、インプットdsRNAを、21〜23ヌクレオチドの短小干渉RNA(siRNA)（これらは、「ガイドRNA」とも呼ばれる）へと消化する(Sharp, 2001, Genes Dev 15：485−490)。酵素のDicer（dsRNA特異的リボヌクレアーゼのRNase IIIファミリーのメンバー）が、ATP依存性、プロセッシブ方式でdsRNA（直接的にまたは導入遺伝子もしくはウイルスによって導入された)をプロセッシブに切断する場合に、siRNAが生成されるということを証拠が示す。連続的な切断の結果、RNAをそれぞれ3'側が2ヌクレオチドの突出を有する19〜21塩基対の二重鎖(siRNA)に分解する(Bernsteinら、2001, Nature 409：363−366；HutvagnerおよびZamore, 2002, Curr Opin Genetics & Development 12：225−232)。作用工程において、このsiRNA二重鎖は、ヌクレアーゼ複合体に結合し、RNA誘導サイレンシング複合体またはRISCとして知られる複合体を形成する。ATP依存性のsiRNA二重鎖の巻き解きが、RISCの活性化に必要である。次いで、この活性のあるRISCが、塩基対の相互作用によって相同の転写物を標的とし、siRNAの3'末端から約12ヌクレオチドまでのところでmRNAを切断する。切断の機構は、本データでは明らかではないが、各RISCは、単一のsiRNAとDicerとは異なると思われるRNaseを含むことが研究によって示される(HutvagnerおよびZamore, 2002, Curr Opin Genetics & Development 12：225−232)。いくつかの生物におけるRNAiの注目すべき効果のために、RNAi経路における増幅工程も提案されている。増幅は、より多くのsiRNAを生じるように、インプットdsRNAをコピーするか、またはsiRNA自体を複製することによって生じうる。代替的にまたは付加的に、増幅は、RISCの複数回におよぶターンオーバーの結果として生じうる。
【０５６１】
Elbashirとその同僚ら(Elbashirら、2001, Nature 411:494−498；Elbashirら、2001, EMBO 20:6877−6888)は、哺乳動物細胞でRNAiを誘導するsiRNAを設計するための手順を示した。簡単に言うと、目的のmRNAの中にアデニン−アデニン(AA)ジヌクレオチドで始まる21個のヌクレオチド配列を潜在的なsiRNA 標的部位として見出す。siRNA標的部位を選択するためのこのストラテジーは、UUジヌクレオチドが3'末端から突出したsiRNAが最も効果的であるという観察にに基づく。このストラテジーは、RNA pol IIIが短いポリ(U)テールを有するRNA分子を生成する4〜6個のヌクレオチドのポリ(T)領域で転写を終結するため、ヘアピンsiRNAを転写するようにRNA pol IIIの使用を適合できる。他のジヌクレチドが3'側から突出したsiRNAは、効果的にRNAiを誘導することを示すが、突出においてグアニン残基を有するsiRNAは推奨しない。それは、一本鎖のグアニン残基でsiRNAがRNaseに切断される可能性があるためである。AAジヌクレチドで開始することに加えて、siRNA標的部位のグアノシン残基とシチジン残基の割合が30〜70%の範囲内でなければならない。次いで、所望される遺伝子のみが標的となることを確実にするために、選択したsiRNA標的配列をESTデータベースに対するBLAST検索に供する。siRNAの調製および使用を補助するために様々な製品が商業的に利用できる(例えば、Ambion,Inc., Austin, Texas)。
【０５６２】
二本鎖(ds)RNAを、哺乳動物の遺伝子発現を干渉するために使用できる(Brummelkampら、Science 296：550−3, KrichevskyおよびKosik, 2002, PNAS 99：11926−9, Paddisonら、2002, PNAS 99:1443−8, Wianny & Zernicka−Goetz, 2000, Nature Cell Biology 2：70−75, 欧州特許第1144623号, 国際公開公報WO 02/055693, WO 02/44321, WO 03/006,477；それぞれその全体が本明細書中に参考として援用される)。
【０５６３】
4.8.3 他の抗癌治療および創傷治癒治療
本発明は、癌もしくはその1つ以上の病状を予防、処置、管理または改善する方法を提供する。本方法は、本発明の方法に従って同定した1つ以上の化合物および1つ以上の治療剤(例えば、予防剤もしくは治療剤)をそれを必要とする被験体に投与する工程を包含する。治療剤または予防剤としては、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬、無機分子、および有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６４】
有用であることが知られているか、あるいは癌または1つ以上のその病状を予防、処置、管理もしくは改善するために用いられていた、または現在用いられている任意の治療法(例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン治療、および／もしくは生物学的治療／免疫療法)を、本発明の方法に従って同定した化合物と組み合わせて用いることができる。このような薬剤(すなわち、抗癌剤)の例としては、血管新生インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターおよび免疫調節剤(例えば、化学療法剤)が挙げられるが、これらに限定されない。血管新生インヒビター(すなわち、抗血管新生薬剤)としては、アンジオスタチン(プラスミノーゲン断片)；抗血管新生アンチトロンビンIII;アンジオザイム(angiozyme)；ABT−627；Bay 12−9566;ベネフィン;ベバシズマブ；BMS−275291;軟骨由来インヒビター(CDI)；CAI；CD59補体断片；CEP−7055；Col 3；コンブレタスタチンA−4；エンドスタチン(XVIII型コラーゲン断片);フィブロネクチン断片；Gro−β；ハロフジノン；ヘパリナーゼ;ヘパリン六糖断片；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)；IM−862；インターフェロンα/β/γ；インターフェロン誘導タンパク質(IP−10);インターロイキン−12；クリングル5(プラスミノーゲン断片);マリマスタット;メタロプロテイナーゼインヒビター(TIMP)；2−メトキシエストラジオール；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC−1C11；ネオバスタット；NM−3；パンゼム；PI−88;胎盤リボヌクレアーゼインヒビター；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；血小板因子−4(PF4);プリノマスタット；プロラクチン16kD 断片；プロリフェリン（Proliferin）関連タンパク質(PRP)；PTK787/ZK 222594;レチノイド；ソリマスタット（solimastat）；スクアラミン；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；テトラヒドロコルチゾール−S；テトラチオモリブデン酸塩；サリドマイド；トロンボスポンジン−1(TSP−1)；TNP−470；トランスフォーミング成長因子β;バスキュロスタチン（vasculostatin）；バソスタチン(カルレティキュリン断片)；ZD6126；ZD6474；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター(FTI);およびビスホスホネートが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗血管新生薬剤は、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体およびその断片は含まない。
【０５６５】
本発明の方法に従って使用することができる抗癌剤の特定の例としては、アシビシン（acivicin）；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩（acodazole hydrochloride）；アクロニン（acronine）；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン（altretamine）；アンボマイシン（ambomycin）；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペリン；アザシチジン；アゼテパ（azetepa）；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット；ベンゾデパ（benzodepa）；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート（bisnafidedimesylate)；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナールナトリウム（brequinar sodium）；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン（cactinomycin）；カルステロン；カラセミド；カーベタイマー；カルボプラチン；カルムスチン;カルビシン塩酸塩（carubicin hydrochloride）；カルゼルシン（carzelesin）；セデフィンゴール；クロランブシル；シロルマイシン（cirolemycin)；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート（crisnatol mesylate）；シクロフォスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン;デザグアニン（dezaguanine）；デザグアニンメシレート（dezaguanine mesylate）；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；ドロモスタノロンプロピオナート；デュアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキセート；エフロールニチン塩酸塩；エルサミトラクシン（elsamitrucin）；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン（epipropidine）；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール（erbulozole）；エソルビシン塩酸塩(esorubicin hydrochloride）；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド;リン酸エトポシド；エトプリン（etoprine）；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル;フルロシタビン（flurocitabine）；ホスキドン（fosquidone）；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキン II(組換えインターロイキンII、またはrIL2を含む)、インターフェロンα−2a；インターフェロンα−2b；インターフェロンα−n1；インターフェロンα−n3；インターフェロンβ−Ia；インターフェロンγ−Ib；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチドアセテート；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩（losoxantrone hydrochloride）；マソプロコール；マイタンシン；メクロルエタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲステロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；ナトリウムメトトレキサート（methotrexate sodium）；メトプリン；メチュレデパ（meturedepa)；ミチンドミド；マイトカルシン（mitocarcin)；マイトクロミン（mitocromin）；マイトギリン（mitogillin）；マイトマルシン（mitomalcin）；マイトマイシン；マイトスペル（mitosper）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；マイコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン（pentamustine）；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド（perfosfamide）；ピポブロマン；ピポスルファン（piposulfan）；ピロキサントロン塩酸塩（piroxantrone hydrochloride）；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン（prednimustine）；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム（sparfosate sodium）；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン;スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌア（sulofenur）；タリソマイシン（talisomycin）；テコガランナトリウム（tecogalan sodium）；テガフール；テロキサントロン塩酸塩(teloxantrone hydrochloride）；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン（thiamiprine）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（trestolone acetate);リン酸トリシリビン（triciribine phosphate）；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロネート（trimetrexate glucuronate）；トリプトレリン；チュブロゾール塩酸塩（tubulozole hydrochloride）；ウラシルマスタード；ウレデパ（uredepa）；バプレオチド（vapreotide）；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビンエピジン硫酸塩（vinepidine sulfate）;ビングリシネートサルフェート（vinglycinate sulfate）；ビンロウロシンサルフェート（vinleurosine sulfate）；酒石酸ビノレルビン；ビンロシジンサルフェート（vinrosidine sulfate）；ビンゾリジンサルフェート（vinzolidine sulfate）；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩（zorubicin hydrochloride）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗癌剤としては、20−エピ−1,25ジヒドロキシビタミンD3；5−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン（acylfulvene）；アデシペノル（adecypenol）；アドゼレシン；アルデスロイキン；ALL−TKアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス（amidox）；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生インヒビター;アンタゴニトD;アンタゴニストG；アンタレリクス（antarelix）；抗−背側化形態形成遺伝子タンパク質−1；アンチアンドロゲン（前立腺癌）；アンチエストロゲン;アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィディコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；アラ−CDP−DL−PTBA;アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（asulacrine）；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン（axinastatin）1；アキシナスタチン 2；アキシナスタチン3；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタット；BCR/ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン（benzochlorin）；ベンゾイルスタウロスポリン（benzoylstaurosporine）；βラクタム誘導体;β−アレチン；ベタクラミシン（betaclamycin)B；ベツリン酸；bFGFインヒビター；ビカルタミド;ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド；ビストラテン（bistratene）A；ビゼレシン；ブレフラート（breflate）；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンC；カンプトテシン誘導体；カナリポックスIL−2；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700;軟骨由来のインヒビター；カルゼレシン（carzelesin）；カゼインキナーゼインヒビター(ICOS)；キャスタノスペルミン；セクロピンB；セトロレリクス；クロルン（chlorln）；クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシン（collismycin）A；コリスマイシンB；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クラムベスシジン（crambescidin）816；クリスナトール；クリプトフィシン（cryptophycin)8；クリプトフィシンA誘導体；クラシン（curacin)A；シクロペンタンスラキノン（cyclopentanthraquinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクホスファート;細胞障害性因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ（dacliximab）；デシタビン;デヒドロジデムニン（dehydrodidemnin）B；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ディデムニンB；ジドックス（didox）;ジエチルノルスペルミン（diethylnorspermine)；ジヒドロ−5−アザシチジン；ジヒドロタキソール,9−；ジオキサマイシン（dioxamycin）;ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルウリジン（doxifluridine）；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンSA；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ（edrecolomab）；エフロールニチン；エレメン;エミテフル;エピルビシン；エプリステリド;エストラムスチンアナログ;エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン（fluasterone）;フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩（fluorodaunorunicin hydrochloride）；ホルフェニメクス;ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン（gadolinium texaphyrin）；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼインヒビター;ゲムシタビン；グルタチオンインヒビター;ヘプスルファム（hepsulfam)；ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン（imidazoacridone）；イミキモド;免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子−1受容体インヒビター；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン;イオベン
グアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール,4−；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリン（isohomohalicondrin)B；イタセトロン；ジャスプラキノリド（jasplakinolide）；カハラリド（kahalalide)F；ラメラリン−Nトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム;レンチナン硫酸塩；レプトラスタチン（leptolstatin）；レトロゾール；白血病阻害因子;白血球αインターフェロン；リュープロリド+エストロゲン+プロゲストロン；リユープロレリン;レバミゾール;リアロゾール；直鎖型ポリアミンアナログ;親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリンアミド（lissoclinamide）7；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ラートテカン（lurtotecan）；ルテチウムテキサフィリン（texaphyrin）；リソフィリン（lysofylline);溶解ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンA；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシンインヒビター;マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；メノガリル；メルバロン（merbarone）；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；MIF インヒビター；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；不一致の二本鎖RNA；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；メトナフィド；マイトトキシン増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン；一リン酸化脂質A+結核菌細胞壁sk；モピダモール；多数の薬剤耐性遺伝子インヒビター；多数の腫瘍サプレッサー１に基づく治療；マスタード抗癌剤；マイカペロキシド（mycaperoxide）B；結核菌細胞壁抽出物；マリアポロン（myriaporone）；N−アセチルジナリン；N−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ（nagrestip）；ナロキソン+ペンタゾシン；ナパビン（napavin）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン（nemorubicin）；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン（nisamycin）；一酸化窒素 モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン（nitrullyn）；06−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン（okicenone）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（oracin）；口部サイトカインインデューサー；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキザウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（palauamine）；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン（parabactin）；パゼリプチン；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン；多硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン;ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセテート;ホスファターゼインヒビター；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンA；プラセチンB；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニソン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンJ2；プロテアソームインヒビター;プロテインA−ベースの免疫モジュレーター；プロテインキナーゼCインヒビター；プロテインキナーゼCインヒビター（微細藻類の）;タンパク質チロシンホスファターゼインヒビター；プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン接合体；rafアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター；rasインヒビター；ras−GAPインヒビター；レテリプチン脱メチル化；レニウム Re 186エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；RIIレチンアミド；ログレチミド；ロヒツカイン（rohitukine）；ロムルチド；ロキニメクス；ルビジノン（rubiginone）B1；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；SarCNU；サルコフィトール（sarcophytol)A；サルグラモスチム；Sdi1模倣体；セムスチン；増殖停止状態誘導インヒビター1；センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達インヒビター；シグナル伝達モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプタート；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンD；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポニジスタチン1;スクアラミン;幹細胞インヒビター；幹細胞分割インヒビター；スチピアミド（stipiamide）；ストロメリシンインヒビター;スルフィノシン（sulfinosine）；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（suradista）；スラミン；スワンソニン；合成グリコサミノグリカン;タリムスチン；5−フルオロウラシル；ロイコボリン；タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（tellurapyrylium）;テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（tetrazomine）；タリブラスチン（thaliblastine）；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体;チマルファシン；トロンボポエチンレセプターアゴニスト；チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン（topsentin）；トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳インヒビター；トレチノイン;トリアセチルウリジン；トリシリビン;トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド;チロシンキナーゼインヒビター；チルフォスチン；UBCインヒビター；ウベニメクス；尿生殖洞−誘導増殖阻害因子；ウロキナーゼレセプターアンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンB；ベクター系、赤血球遺伝子治療；サリドマイド；ベラレソール；ベラミン（veramine）；ベルジン（verdin）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ボロゾール；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられるが、これらに限定しない。
【０５６６】
本発明はまた、癌細胞を破壊するために本発明の方法に従って同定した1つ以上の化合物をx−線、ガンマ線および他の放射源の使用を含む放射線治療と組み合わせて投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、放射線処置を、外部ビーム放射線治療または遠隔治療（ここで、この放射線を遠隔地から向ける）として行う。別の好ましい実施形態において、放射線処置を、内科治療または近接治療（ここで、放射源を、癌細胞または腫瘍塊に近接させて体内に配置する）として行う。
【０５６７】
癌治療剤およびその投薬量、投与経路ならびに推奨される使用法は、当該分野で公知であり、the Physician's Desk Reference(第56版、2002)のような文献に記載されている。
【０５６８】
4.9 組成物および化合物の投与方法
本発明の方法を用いて同定した化合物もしくはその製薬上許容可能な塩、本発明の複合体、本発明の複合体の構成成分もしくは本発明の複合体の構成成分をコードする核酸、本発明の複合体または本発明の複合体の構成成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片あるいは本発明の複合体の構成成分の発現を干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、増殖性疾患、異常なRNA−核酸分解活性を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる障害または創傷治癒(例えば、ただれ、変質、潰瘍もしくは床ずれ)に関連する病状に罹患する患者（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）に投与できる。本節では、本発明の方法を用いて同定した化合物もしくはその製薬上許容可能な塩、本発明の複合体、本発明の複合体の構成成分もしくは本発明の複合体の構成成分をコードする核酸、本発明の複合体もしくは本発明の複合体の構成成分に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片または本発明の複合体の構成成分の発現を干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物としてまとめて言及する。特定の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を、増殖性疾患、異常なRNA−核酸分解活性を特徴とするか、関連するか、または引き起こされる障害または創傷治癒に関連する病状に対する予防手段として患者（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）に投与する。
【０５６９】
患者に投与する場合、本発明の治療方法および予防方法に使用する化合物を、好ましくは、選択的に製薬上許容可能なビヒクルを含む組成物の構成成分として投与する。この組成物を、経口または他の都合のよい経路（例えば、点滴もしくはボーラス注射、上皮もしくは粘膜の被膜(例えば、口腔粘膜、直腸、および腸の粘膜など)を介した吸収）によって投与し、また別の生物学的に活性な因子と共に投与しうる。投与は全身性または局所的なものでありうる。種々の送達系が知られており（例えば、リポソームのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなど）、化合物およびその製薬上許容可能な塩を投与するために用いることができる。
【０５７０】
投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、腟内、経皮的、直腸、吸入により、または局所的（特に、耳、鼻、眼もしくは皮膚）なものが挙げられるが、これらに限定されない。投与の様式は、主治医の判断に任せる。最良の例において、投与によって化合物またはその製薬上許容可能な塩を血流に放出させるだろう。
【０５７１】
特定の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、外科手術の間の局所的な点滴、局部適用（例えば、外科手術後創傷被服剤と結合させる）、注射、カテーテル、坐薬または移植物（この移植物は、メンブレン（例えば、シラスチック（sialastic）メンブレン、もしくはファイバー）を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン材料である）によって（限定はしない）行うことができる。
【０５７２】
特定の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を、脳室内注射、くも膜下腔内注射および硬膜外注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系へ導入することが望ましい場合がある。脳室内注射を、脳室内カテーテル（例えば、Ommaya容器のような容器に取り付けたもの）によって容易に行うことができる。
【０５７３】
経肺投与もまた、例えば、吸入剤またはネビュライザーおよびエアロゾル剤を用いた製剤の使用、または、フルオロ炭素もしくは経肺投与に適した合成界面活性剤の散布を介して、用いうる。特定の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を、従来の結合剤およびビヒクル（例えば、トリグリセリド）を用いて座薬として処方しうる。
【０５７４】
別の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を小胞（特に、リポソーム）で送達しうる(Langer, 1990, Science 249：1527−1533;Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez−BeresteinおよびFidler(編), Liss, New York, pp. 353−365(1989)；Lopez−Berestein,同書 pp. 317−327を参照のこと；一般的には同書中を参照のこと)。
【０５７５】
さらに別の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を、徐放系で送達しうる(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 上記, vol. 2, pp. 115−138(1984)を参照のこと)。Langerの論評1990, Science 249：1527−1533に議論される別の徐放系を用いうる。一つの実施形態において、ポンプを使用しうる(Langer,上記；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14：201；Buchwaldら、1980, Surgery 88:507；Saudekら、1989, N. Engl. J. Med. 321：574を参照のこと)。別の実施形態において、ポリマー材料を使用しうる(Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise(編), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall(編), Wiley, New York(1984)；RangerおよびPeppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23：61参照のこと；またLevyら、1985, Science 228:190；Duringら,1989, Ann. Neurol. 25:351；Howardら,1989, J. Neurosurg. 71：105参照のこと)。さらに別の実施形態において、徐放系を化合物またはその製薬上許容可能な塩の標的RNAの近傍に配置することで、体系的な服用量の一部のみを要求できる。
【０５７６】
本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を含む組成物(「化合物組成物」)はさらに、患者に適切な投与形態を提供するために適量の製薬上許容可能なビヒクルを含みうる。
【０５７７】
特定の実施形態において、用語「製薬上許容可能な」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関またはアメリカ薬局方に指定された規制機関あるいは一般的に認可された他の薬局方によって、動物、哺乳動物、より具体的にはヒトへの使用が認可されたことを意味する。用語「ビヒクル」とは、本発明の化合物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体をいう。このような薬学的ビヒクルは、例えば、水および油（石油、動物、植物もしくは合成のものを起源とするものを含み、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）のような液体でありうる。この薬学的ビヒクルは、塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などでありうる。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を用いうる。患者に投与する場合、この製薬上許容可能なビヒクルは、好ましくは滅菌したものである。本発明の化合物を静脈内に投与する場合、水が好ましいビヒクルである。塩水およびブドウ糖溶液およびグリセロール溶液もまた、液体ビヒクル（特に注射用溶液）として使用しうる。適切な薬学的ビヒクルはまた、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤を含む。所望される場合、化合物組成物はさらに、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含みうる。
【０５７８】
化合物組成物は、溶液、顕濁液、乳化剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体を含むカプセル剤、粒剤、徐放性製剤、座薬、乳剤、エアゾール剤、スプレー剤、懸濁剤または用途に適した任意の別の形態でありうる。一つの実施形態において、製薬上許容可能なビヒクルは、カプセルである(例えば、米国特許第5,698,155号を参照のこと)。適切な薬学的ビヒクルの別の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennaro, 編, Mack Publishing Co. Easton, PA,第19版 , 1995, pp. 1447−1676（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０５７９】
好ましい実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を、ヒトへの経口投与に適合させた医薬組成物として、常用の手順に従って処方する。経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、ドロップ剤、水溶性もしくは油性の懸濁剤、顆粒剤、粒剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシール剤の形態でありうる。経口投与される組成物は、薬学的に受け入れやすい調製物を提供するために、1つ以上の薬剤、例えば、甘味剤（例えば、フルクトース、アスパルテームもしくはサッカリン）；矯味剤（例えば、ペパーミント、ウインターグリーンの油、もしくはチェリー）;着色剤;および保存剤を含みうる。さらに、錠剤または丸剤の形態の場合、この組成物を、消化管での分解および吸収を遅らせるためにコーティングし、それによって長時間にわたって作用を維持することができる。任意に選択した透過性のメンブレンで包んだ浸透が盛んに進む化合物もまた、経口投与される組成物に適している。この後者のプラットホームにおいて、カプセルを囲む周囲の流体は、効果を与える化合物によって吸収される。この化合物は、孔を通して薬剤または薬剤の組成物を移動させるために膨張する。これらの送達プラットフォームは、即時に処方物を放出する場合の急激に変化するプロフィールに対して実質的にゼロオーダーの送達プロフィールを提供できる。例えば、グリセロールモノステアリン酸またはグリセロールステアリン酸のような遅延性材料もまた、使用しうる。経口用組成物は、標準的なビヒクル（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム）などを含みうる。このようなビヒクルは、好ましくは、薬用グレードである。典型的に、静脈内投与用の組成物は、滅菌した等張水性バッファを含む。必要であれば、この組成物はさらに可溶剤を含みうる。
【０５８０】
別の実施形態において、本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を、静脈内投与用に処方しうる。静脈内投与用の組成物は、注射箇所の痛みを減じるためにリグノカインのような局所麻酔剤を必要に応じて含みうる。一般的に、この成分を、別々にまたは単位剤形（例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェのような完全密閉の容器の中の、凍結乾燥粉末または無水濃縮物）に一緒に混合して供給する。本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を点滴投与する場合、この組成物を、例えば無菌の薬用グレードの水または塩水を含む点滴ボトルを用いて投与することができる。本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物を注射で投与する場合、注射用の無菌水または塩水のアンプルを、投与前に成分を混合するために用意できる。
【０５８１】
特定の疾患の処置に効果的である本発明の治療方法および予防方法で使用する化合物の量は、その疾患の性質によって決まり、標準的な臨床技術によって決めることができる。さらに、最適投薬量の範囲を同定することを助けるためにin vitroまたはin vivoアッセイを必要に応じて、用いうる。用いるべき正確な服用量はまた、投与経路、および疾患の重篤度によってきまり、主治医の判断および各患者の状況によって決定すべきである。しかし、経口投与に適切な投薬量範囲は一般的に、1日あたり体重1kgあたり約0.001mg〜約500mgの化合物またはその製薬上許容可能な塩である。本発明の特定の好ましい実施形態において、経口用の服用量は、1日あたり体重1kgあたり約0.01mg〜約100mg、より好ましくは、1日あたり体重1kgあたり約0.1mg〜約75mg、より好ましくは、1日あたり体重1kgあたり約0.5mg〜5mgである。本明細書中に記載される投薬量とは、投与した全量をいう；すなわち、2つ以上の化合物を投与した場合、あるいは化合物を治療剤と投与した場合、好ましい投薬量は投与した全量に相当する。経口用組成物は好ましくは、約10重量%〜約95重量%の活性成分を含む。
【０５８２】
静脈内(i.v.）投与用に適切な投薬量範囲は、1日あたり体重1kgあたり約0.01mg〜約100mg、1日あたり体重1kgあたり約0.1mg〜約35mg、および1日あたり体重1kgあたり約1mg〜約10mgである。鼻腔内投与用に適切な投薬量範囲は一般的に、1日あたり約0.01pg/体重kg〜1日あたり約1mg/体重kgである。坐薬は一般的に、1日あたり体重1kgあたり約0.01mg〜約50mgの本発明の化合物を含み、約0.5重量%〜約10重量%の範囲で活性成分を含む。
【０５８３】
皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下、脳内、腟内、経皮的投与または吸入による投与の推奨する投薬量は、1日あたり体重1kgあたり約0.001mg〜約200mgの範囲である。局所的投与の適切な服用量は、約0.001mg〜約1mgの範囲であり、投与箇所によって決まる。効果的な服用量をin vitroまたは動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線から推定しうる。このような動物モデルおよび系は当該分野で周知である。
【０５８４】
化合物およびその製薬上許容可能な塩を好ましくは、ヒトで使用する前に所望される治療活性または予防活性についてin vitroおよびin vivoでアッセイする。例えば、in vitroアッセイを、化合物、その製薬上許容可能な塩および／または別の治療剤を投与することが好ましいかを決定するために用いうる。安全性と有効性を示すために動物モデル系を用いうる。
【０５８５】
本発明に含まれるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質および複合体の典型的な服用量は、患者の体重の1kgあたり0.0001mg〜100mgである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重の1kgあたり0.0001mgと20mgの間、0.0001mgと10mgの間、0.0001mgと5mgの間、0.0001mgと2mgの間、0.0001mgと1mgの間、0.0001mgと0.75mgの間、0.0001mgと0.5mgの間、0.0001mgと0.25mgの間、0.0001mgと0.15mgの間、0.0001mgと0.10mgの間、0.001mgと0.5mgの間、0.01mgと0.25mgの間、0.01mgと0.10mgの間、または0.1mgと10mgの間である。
【０５８６】
4.10 本発明の診断方法
特定の実施形態において、本発明は、被験体における増殖性疾患の存在を診断するための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体における本発明の複合体の量を決定する工程を包含し、ここで被験体における本発明の複合体の増加したレベルは、増殖性疾患の存在または増殖性疾患発症の高まった危険性を示す。別の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体における本発明の複合体の構成成分(もしくはこの構成成分をコードする核酸)の量を決定する工程を包含し、ここで被験体における構成成分の減少したレベルは、増殖性疾患の存在または増殖性疾患発症の高まった危険性を示す。さらに別の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体の細胞の核中における本発明の複合体の構成成分の量を決定する工程を包含し、ここで被験体における構成成分の増加したレベルは、増殖性疾患の存在または増殖性疾患発症の高まった危険性を示す。
【０５８７】
複合体の構成成分、本発明の複合体の構成成分をコードする核酸を、当業者に公知である任意の方法で検出および定量できる。典型的な方法としては、タンパク質についてのウエスタンブロット分析、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫測定法)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイおよび核酸についてのPCR(特にRT−PCR)またはノーザンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８８】
本発明はまた、増殖性疾患あるいは異常なプレ−tRNAプロセシングおよび／もしくは3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、またはこれらによって引き起こされる障害を、本発明の複合体もしくはその構成成分、または本発明の複合体もしくはその構成成分に特異的に結合する本発明の方法に従って同定した化合物に免疫特異的に結合する抗体を使用して、検出、診断またはモニタするための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、増殖性疾患もしくは増加したプレ−tRNAプロセシングおよび／または3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、あるいはこれらによって引き起こされる障害を検出、診断またはモニタするための方法を提供する。本方法は以下の工程を包含する：(a)被験体(例えば、上記のような障害の被験体か、上記のような障害を有することが疑われる被験体)の細胞もしくは組織試料における本発明の複合体またはその構成成分のレベルを、複合体もしくはその構成成分に免疫特異的に結合する1つ以上の抗体またはその断片、あるいは複合体もしくはその構成成分に特異的に結合する、本発明の方法に従って同定した化合物を使用して測定する工程；ならびに(b)複合体またはその構成成分のレベルを対照レベル（例えば、正常な、癌ではない細胞もしくは組織試料のレベル）と比較する工程であって、ここで複合体もしくは構成成分の対照レベルに対する工程(a)で測定した複合体もしくは成分の測定レベルの増加は、被験体が増殖性疾患あるいは異常なプレ−tRNAプロセシングおよび／または3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、もしくはこれらによって引き起こされる障害を有することを示す、工程。
【０５８９】
本発明は、増殖性疾患あるいは異常なプレ−tRNAプロセシングおよび／もしくは3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、またはこれらによって引き起こされる障害を、このような障害の被験体か、このような障害を有することが疑われる被験体の細胞または組織試料から精製した複合体のRNA−核酸分解活性と、対照（例えば、正常な、癌ではない細胞もしくは組織試料から精製した複合体）のRNA−核酸分解活性を、当業者に周知であるか、または本明細書中に記載されるアッセイを用いて比較することによって、検出、診断あるいはモニタするための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、増殖性疾患あるいは増加したRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)に関連するか、これらを特徴とするか、もしくはこれらによって引き起こされる障害を検出、診断またはモニタするための方法を提供する。本方法は以下の工程を包含する：(a)当業者に周知であるか、または本明細書中に記載されるアッセイを用いて対照（例えば、正常な、癌ではない細胞もしくは組織試料から精製した複合体）のRNA−核酸分解活性に対する、被験体(例えば、上記のような障害の被験体か、上記のような障害を有することが疑われる被験体)の細胞もしくは組織試料から精製した本発明の複合体のRNA−核酸分解活性を測定する工程；ならびに(b)工程(a)で測定した複合体のRNA−核酸分解活性を、対照（例えば、正常な、癌ではない、細胞もしくは組織試料から精製した本発明の複合体）のRNA−核酸分解活性と比較する工程であって、ここで対照に対する(a)で測定したRNA−核酸分解活性の増加は、被験体が増殖性疾患あるいは増加したプレ−tRNAプロセシングおよび／または3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、もしくはこれらによって引き起こされる障害を有することを示す、工程。別の実施形態において、本発明は、減少したRNA−核酸分解活性(例えば、本発明の複合体のプレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性、3'末端プレ−mRNAエンドヌクレアーゼ活性、プレ−tRNA切断活性、および／もしくは本発明の複合体のプレ−リボソームRNA切断活性)に関連するか、これらを特徴とするか、またはこれらによって引き起こされる障害を検出、診断またはモニタするための方法を提供する。本方法は、以下の工程を包含する：(a)当業者に周知であるか、または本明細書中に記載されるアッセイを用いて、対照（例えば、正常な、癌ではない、細胞もしくは組織試料から精製した本発明の複合体）のRNA−核酸分解活性に対する、上記のような障害の被験体か、または上記のような障害を有することが疑われる被験体の細胞または組織試料から精製した本発明の複合体のRNA−核酸分解活性を測定する工程;(b)工程(a)で測定した複合体のRNA−核酸分解活性と対照（例えば、正常な、癌ではない、細胞もしくは組織試料から精製した複合体）のRNA−核酸分解活性とを比較する工程であって、ここで対照に対する工程(a)で測定したRNA−核酸分解活性の減少は、被験体が減少したプレ−tRNAプロセシングおよび／または3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、もしくはこれらによって引き起こされる障害を有することを示す、工程。
【０５９０】
本発明は、当業者に周知であるアッセイ(例えば、円二色性および核磁気共鳴)を用いて対照（例えば、正常な、癌ではない、細胞もしくは組織試料から精製した本発明の複合体）の構造に対する被験体(例えば、増殖性疾患または異常なプレ−tRNAプロセシングおよび／もしくは3'末端プレ−mRNAプロセシングに関連するか、これらを特徴とするか、またはこれらによって引き起こされる障害の被験体か、このような障害を有することが疑われる被験体)の細胞もしくは組織試料から精製した本発明の複合体の構造を比較することによって、このような障害を検出、診断あるいはモニタするための方法を提供する。
【実施例】
【０５９１】
5. 実施例
以下の実施例は、ヒトエンドヌクレアーゼ複合体を説明し、tRNAスプライシングとプレ−mRNA 3'末端形成との間の分子的な関係を示す。
【０５９２】
序論
細胞のRNAの成熟は、正常な細胞の増殖および分裂の調節に重要である。真核生物の成熟したRNAは、一連のプロセシング工程を介して大きな前駆体から生じる。例えば、初期のプレ−mRNAは、エンドヌクレアーゼによる切断およびポリアデニル化によるスプライシング、キャッピング、および3'末端の作製を受ける。前駆体転移RNA(プレ−tRNA)の成熟には、以下の複数の工程を要する。この工程は：1)RNase Pによる5'側リーダーの除去(Xiaoら、2002；FrankおよびPace, 1998)ならびにELAC2による3'側トレイラーの除去(Takakuら、2003)；2)3'末端へのCCAトリヌクレオチドの付加；3)多数のヌクレオチドの改変(HopperおよびPhizicky, 2003に論評される)を含む。さらに、いくつかのtRNAsは、成熟tRNA分子を作製するために除去されるべきイントロンを含む。
【０５９３】
イントロン含有プレ−tRNAは、生命の3つすべてのドメインに由来する数々の生物に見出される。下等な真核生物では、全tRNA遺伝子の約25%がイントロンを含み(Trottaら、1997)、一方ヒトでは、tRNA遺伝子の6%のみがイントロンを含む(LoweおよびEddy, 1997)。全ての真核生物tRNAイントロンは、14〜60ヌクレオチド長であり、アンチコドンループ（アンチコドンに対する3'側の1ヌクレオチド）を分断する(Ogdenら,1984)。全ての酵母プレ−tRNAではスプライス部位に配列保存性はないが、3'側スプライス部位はバルジループにつねに位置する(Baldiら、1992)。
【０５９４】
プレ−tRNAからのイントロンの除去は、いくつかの異なるタンパク質の活性を要する酵素反応である(Abelsonら、1998に論評される)。これらの酵素は古細菌および酵母で最も集中して調べられた。この第1工程は、進化的に保存されたtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、前駆体tRNAの5'側および3'側のスプライス部位を認識、切断することによって行われる(Trottaら、1997)。酵母では、5'側および3'側のエクソンをtRNAリガーゼによって、スプライス部位で2'リン酸を用いて2つのエクソンの結合を生じる一連の酵素反応を介して、ライゲートする(Westawayら、1988；Phizickyら、1986)。この独特のtRNA中間物を次いで、2'ホスホトランスフェラーゼで処理し、成熟tRNAを生じる(Culverら、1997)。
【０５９５】
酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは、SEN2、SEN34、SEN54およびSEN15遺伝子にコードされる4つのサブユニットのヘテロメリックな複合体である(Rauhutら、1990；Trottaら、1997)。4つ全てのサブユニットは、低レベルで存在し、細胞の生存能力に必須である(Trottaら、1997)。この酵母tRNAエンドヌクレアーゼ複合体の因子の構造および機能は、多数の実験結果から示唆されている。第一に、ヘテロメリックな古細菌酵素に対する酵母Sen2pおよびSen34pの酷似した配列保存は、これら2つのサブユニットそれぞれに5'および3'部位における切断のための明確な活性部位が含まれることを示唆した。この点に矛盾することなく、Sen2pの突然変異は、5'スプライス部位の切断における欠損を生じ(Hoら、1990)、Sen34pの保存されたヒスチジン残基における突然変異は、3'スプライス部位の切断における欠損を生じた(Trottaら、1997)。第二に、ツーハイブリッド分析によって、Sen2pとSen54pとの間およびSen34pとSen15pとの間の強い相互作用が示された(Trottaら、1997)。ヘテロメリックな古細菌tRNAエンドヌクレアーゼを用いた構造学的研究は、Sen2p−Sen54pとSen34p−Sen15pとの間の強い相互作用が保存されたカルボキシル−末端β−シートの相互作用に仲介されることを示唆した(Lykke−AndersenおよびGarrett, 1997；Liら,1998)。最後に、古細菌エンドヌクレアーゼに対する異種性サブユニットSen54pおよびSen15pの配列アライメントは、2つの酵母ヘテロダイマー（Sen54p−Sen2pおよびSen15p−Sen34p）のダイマー形成に必要とされるカルボキシル−末端付近の保存された構造要素を明らかにした(Lykke−AndersenおよびGarrett, 1997；Liら,1998)。あわせて、これらの結果によって、酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの立体配置のモデルを生じた(Liら、1998；Abelsonら,1998)。
【０５９６】
予備研究は、進化を通じてtRNAスプライシングが共通の機構であること示唆する。例えば、ヒト細胞系に由来する抽出物が、酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが活性である条件下で、正確なtRNAスプライシングを行うことが報告された(Laskiら、1983；Standringら、1981)。さらに、アフリカツメガエルの卵核胞から部分的に精製したtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは、酵母プレ−tRNAを認識し、正確に切断すること（2つの半分子とイントロンを形成する）が示された(Gandini−Attardiら、1990；Baldiら、1986；Otsukaら、1981)。さらに、アフリカツメガエルおよび酵母の酵素は、イントロン−エクソン境界部の局所的な構造を認識して切断部位に定着するようである(Baldiら、1992；Fabbriら、1998)。
【０５９７】
tRNAスプライシングの機構が酵母、古細菌およびより高等な真核生物の間でよく保存されているという証拠はあるが、ヒトのプレ−tRNAの成熟に関する酵素は知られていない。本実施例は、現在のヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの単離および特徴付けを説明する。さらに、本実施例は、SEN2サブユニットの選択的スプライシングから生じた異なるエンドヌクレアーゼ複合体の同定を記載する。この複合体は、タンパク質の組成およびプレ−tRNAを処理する能力においてtRNAエンドヌクレアーゼ複合体とは異なる。さらに、エンドヌクレアーゼ複合体が、mRNAの切断／ポリアデニル化に必要とされる因子と関連することは、プレ−tRNAスプライシングとメッセンジャーRNAの3'末端形成との間のこれまでに知られていなかった生化学的な関係を示唆する。
【０５９８】
5.1 ヒトエンドヌクレアーゼ複合体のサブユニット
5.1.1 材料および方法
5.1.1.1 HIS−FLAG−標識エンドヌクレアーゼ複合体サブユニットを発現する安定した細胞系の作製
エンドヌクレアーゼ複合体サブユニットは、タンパク質のSen2(80746)、Sen34(79042)、Sen54(283989)、Sen15(116461)、およびClp1(10978)を含む。Sen2のオープンリーディングフレームを特定のプライマー(順向:cgggatcccgcagaagcagttttccatgccccaaagagg(配列番号:21);逆向:gctctagattaaagatcgtcttggtcactcctctctcg(配列番号:22))を用いたPCR増幅で作製し、ハイグロマイシン耐性を与える遺伝子を含むHIS−FLAG−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。エンドヌクレアーゼ複合体の他の必要な構成成分を含む293T細胞をHis−Flag−Sen2をコードするHIS−FLAG−pcDNA3.1/Hygroプラスミド(His−Flag−Sen2ベクター)で形質転換させ、そしてHis−Flag−Sen2を発現する細胞系を作製するためにハイグロマイシンに対する耐性で安定したクローンを選択した。His−Flag−Sen34およびHis−Flag−Sen15を発現する293細胞系を同様に作製した。Sen34のオープンリーディングフレームを、Sen34に特異的なプライマー(順向:cgggatcccctggtggtggaggtggcgaacggccgctcc(配列番号:23)；逆向:gctctagatgcaggctggcccattgcagggaggtgtag(配列番号:24))を用いてPCR増幅で作製し、HIS−FLAG−Sen34ベクターを作製するためにHIS−FLAG−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。293T細胞をHIS−FLAG−Sen34ベクターで形質転換させ、そしてHis−Flag−Sen34を発現する細胞系を作製するためにハイグロマイシンに対する耐性によって安定したクローンを選択した。Sen15のオープンリーディングフレームを、Sen15に特異的なプライマー(順向:cgggatcccgaggagcgcggcgattccgagccga(配列番号:25)；逆向:cgcgctagctcatcttctaagagaaatattctgagggtctggcag(配列番号:26))を用いてPCR増幅によって作製し、HIS−FLAG−Sen15ベクターを作製するためにHIS−FLAG−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。293T細胞をHIS−FLAG−Sen15ベクターで形質転換させ、His−Flag−Sen15を発現する細胞系を作製するためにハイグロマイシンに対する耐性によって安定したクローンを選択した。Sen54のオープンリーディングフレームを、Sen54に特異的なプライマー(順向:atcgggatcccgagcccgagcccgagcccg(配列番号:27)；逆向:gctctagatcagtgccccacatcctggggc(配列番号:28))を用いてPCR増幅によって作製し、HIS−FLAG−Sen54ベクターを作製するためにHIS−FLAG−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。293T細胞をHIS−FLAG−Sen54ベクターで形質転換させ、His−Flag−Sen54を発現する細胞系を作製するためにハグロマイシンに対する耐性によって安定したクローンを選択した。Clp1のオープンリーディングフレームを、Clp1に特異的なプライマー(順向:cgggatcccggagaagaggctaatgatgatgacaagaag(配列番号:29)；逆向:gctctagactacttcagatccatgaaccggatatcc(配列番号:30))を用いてPCR増幅によって作製し、HIS−FLAG−Clp1ベクターを作製するためにHIS−FLAG−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。293T細胞をHIS−FLAG−Clp1ベクターで形質転換させ、His−Flag−Clp1を発現する細胞系を作製するためにハイグロマイシンに対する耐性によって安定したクローンを選択した。
【０５９９】
5.1.1.2 His−Flag−標識タンパク質を含む全細胞抽出物からのエンドヌクレアーゼ複合体の精製
全細胞抽出物をバッファB(250mM NaCl；30mM Tris−HCl, pH 7.0；1mM EDTA；5% グリセロール；0.1% トライトン X−100；プロテアーゼインヒビター(Roche, Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets))に細胞ペレットを再懸濁することによって調製した。細胞を10秒間、3回超音波処理し、そしてその後15分間、15,000gで遠心分離した。この上清を0.2μmのフィルターに通し、バッファBで予め洗浄した抗−Flagビーズ(Sigma)に加えた。抽出物を4℃で2時間、抗−Flagビーズとインキュベートした。上清を捨て、そしてビーズを10倍の総容積のバッファW(400mM NaCl；30mM Tris−HCl, pH 7.0；1mM EDTA；5% グリセロール；0.04% トライトン X−100)を用いて4℃で10分間、3回洗浄した。10倍の総容積のバッファ N(200mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2 mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100)で2回洗浄した後、結合したタンパク質を0.25mg/ml 3xFLAG ペプチド(Sigma)を含む3倍の総容積のバッファNを用いて4℃で1時間溶出した。NaCl(480mMの終濃度)の添加の後、溶出したタンパク質をバッファNBW(500mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2 mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100)で予め洗浄したNi−ビーズに加え、4℃で1時間インキュベートした。この上清を捨て、そしてNi−ビーズを、4℃で10分間、10倍の総容積のバッファ NB(200mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2 mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100, 15mM イミダゾール)を用いて3回洗浄した。結合したタンパク質を3倍の総容積のバッファNE(200mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2 mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100,250mM イミダゾール)を用いて溶出し、そして等量の80% グリセロールを、溶出したタンパク質に添加した。このタンパク質を−20℃で保管した。
【０６００】
5.1.2 結果
5.1.2.1 プレ−tRNAヒトエンドヌクレアーゼ複合体のサブユニットの同定
酵母Sen2、Sen54およびSen34をヒトタンパク質のデータベースに対してblast検索した。それぞれのタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを、図5、図6、および図7に示す。ヒトtRNAスプライシング複合体の新規の構成成分を同定するために、ヒトHis−Flag−Sen2融合タンパク質およびHis−Flag−Sen34融合タンパク質を発現する安定した細胞系を上記のように作製した。His−Flag−Sen2およびHis−Flag−Sen34と一緒に精製したポリペプチドをゲル電気泳動で単離し、同定した。形質転換していない293T細胞に由来する抽出物を、陰性対照として用いた。図9に示すように、2つの新規のタンパク質を見出し、His−Flag−Sen2およびHis−Flag−Sen34と一緒に精製された。これらはSen15およびClp1であった。Sen15およびClp1がエンドヌクレアーゼ複合体のサブユニットであることを確かめるために、His−Flag−Sen15タンパク質およびHis−Flag−Clp1タンパク質を発現する安定した細胞系を、上記のように作製した。His−Flag−Sen15およびHis−Flag−Clp1と一緒に精製したタンパク質をSDS−PAGEおよびその後の銀染色によって分析した。図9に示すように、エンドヌクレアーゼ複合体の構成成分（Sen2、Sen34、およびSen54）がHis−Flag−Sen15およびHis−Flag−Clp1と一緒に精製された。これはCpl1およびSen15がヒトエンドヌクレアーゼ複合体のサブユニットであることを示している。
【０６０１】
5.1.2.2 Sen2、Sen34、Sen15およびClp1と一緒に精製したタンパク質は、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する
エンドヌクレアーゼ複合体を、上記のようなHis−Flag−Sen2またはHis−Flag−Sen34を発現する安定した細胞系から精製した。酵母エンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた(Trottaら、1997, Cell 89,849−858)。His−Flag−Sen2およびHis−Flag−Sen34と一緒に精製した細胞抽出物の画分は、イントロン／エクソンの境界部で標識したフェニルアラニンプレ−tRNAの切断によって示されるように(図10)、エンドヌクレアーゼ活性を示す。プレ−tRNA基質の作製を、Trottaら、1997, Cell 89, 849−859に従って行った。同様に、His−Flag−Sen15およびHis−Flag−Clp1と一緒に精製した画分はまた、エンドヌクレアーゼ活性およびプレ−tRNA切断を示した(図10)。これはSen2、Sen34、Sen54、Sen15およびClp1が、プレ−tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体の構成成分であることを示す。
【０６０２】
5.1.2.3 ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットは核に局在化する
Sen2のオープンリーディングフレームを、特定のプライマー(cgggatccgcagaagcagttttccatgccccaaagagg(配列番号:21)、agaatagcggccgcttaaagatcgtcttggtcactcc(配列番号:31))を用いてPCR増幅によって作製し、myc−Sen2ベクターを作製するためにmyc−pcDNA3ベクターにクローン化した。Sen34のオープンリーディングフレームを、Sen34に特異的なプライマー(cgggatccctggtggtggaggtggcgaacggccgctcc(配列番号:23)、gctctagatgcaggctggcccattgcagggaggtgtag(配列番号:24))を用いてPCR増幅によって作製し、GFP−Sen34ベクターを作製するためにGFP−pcDNA3ベクターにクローン化した。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ構成成分の細胞内分布を調べるために、myc−Sen2およびGFP−Sen34ベクターを一過的にHela細胞に形質移入させ、そして免疫蛍光を前述したように行った(ChoiおよびDreyfuss, 1984,J. Cell. Biol. 99,1997−2004)。myc−Sen2pおよびGFP−Sen34pの両方が核に局在化していることが見出された(図11)。この核への局在化は、プレ−tRNAスプライシングが核で行われていることを示す。
【０６０３】
5.1.2.4 Sen2スプライス変異体は異なる組織および細胞系で発現される
ヒトSen2が、2つの異なる変異体へスプライシングされることが見出された(図12)。第一のスプライス型（Sen2WT）は、Sen2遺伝子の13個のすべてのエクソンを含む。第二のスプライス型は、エクソン7からエクソン9の選択的スプライシングを含み、エクソン8を抜いて、新規のスプライス変異体Sen2ΔEx8を形成する。異なる組織におけるSen2の選択的スプライス変異体の存在を決定するために、異なる組織から得たcDNAライブラリー(Clontech)を、エクソン8の外側に位置させるプライマー:(gagtacgtgctggtcgaggaagcg(配列番号:32)、gagtcccactttgggctcccagcc(配列番号:33))を用いてPCRによって調べる。図13に示すように、調べたすべての組織は、Sen2WTおよびSen2ΔEx8変異体の両方を含む。さらに、ヒト組織および癌細胞系にわたってSen2ΔEx8発現のプロファイルを決定するために、「BD MTE Human Multiple Tissue Expression Array」(BD, Clontech)をSen2のエクソン8に特異的なオリゴヌクレオチド(gctctgggatgtttaagtatttac(配列番号:34))でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの手順は、製造者の指示(BD, Clontech、使用者取り扱い説明書PT3307−1)に従って実施した。
【０６０４】
5.1.2.5 Sen2ΔEx8を含む複合体のプレ−tRNA切断活性の忠実性および正確性が損なわれる
His−Flag−Sen2ΔEx8を発現する安定した細胞系から精製した複合体を、例えば、第5.1.1.2.節に記載したように得た。形質転換していない293T細胞に由来する抽出物を陰性対照として使用し、His−Flag−Sen2またはHis−Flag−Sen34を安定して発現する293T細胞を陽性対照として使用した。酵母エンドヌクレアーゼをエンドヌクレアーゼ活性のさらなる陽性対照として使用した(Trottaら、1997, Cell 89：849−858)。プレ−tRNA 基質の作製をTrottaら、1997, Cell 89:849−859に従って行った。His−Flag−Sen2ΔEx8と一緒に精製した細胞抽出物の画分は、His−Flag−Sen2またはHis−Flag−Sen34と一緒に精製した画分と比べて、減少したエンドヌクレアーゼ活性を示す(図15)。これはSen2ΔEx8を含む複合体のプレ−tRNA切断活性の忠実性および正確性が損なわれたことを示す。His−Flag−Sen2ΔEx8と一緒に精製した画分は、His−Flag−Sen2またはHis−Flag−Sen34と一緒に精製した画分中のSen34タンパク質およびSen15タンパク質のレベルと比べて、減少したレベルのSen34タンパク質およびSen15タンパク質を含む(図14)。これはHis−Flag−Sen2ΔEx8が、Sen15およびSen34に対して減少した結合能を有することを示す。
【０６０５】
5.1.2.6 エンドヌクレアーゼ複合体は、3'末端プレ−mRNAプロセシング機構に関連する
His−Flag−Sen2、His−Flag−Sen2ΔEx8、His−Flag−Sen34、His−Flag−Clp1、His−Flag−Sen15を発現する安定した細胞系に由来する複合体を上記のように(例えば、第5.1.1.2節を参照のこと)精製した。His−Flag−Sen2、His−Flag−Sen2ΔEx8、His−Flag−Sen34、His−Flag−Clp1、His−Flag−Sen15で一緒に精製したタンパク質を、SDS−PAGEおよびその後の3'末端プレ−mRNAプロセシング複合体の構成成分（例えば、CPSF30、シンプレキン、CstF64）に対する抗体を用いたウエスタンブッロティングによって分析した。プレ−mRNAスプライシングSmB/B'タンパク質を認識するY12抗体を陰性対照に用いた。図17に示すように、3'末端プロセシング複合体の調べたすべての構成成分は、プレ−tRNAエンドヌクレアーゼ複合体に結合する。His−Flag−Sen2ΔEx8がCPSF30、シンプレキン、CstF64と強く結合しており、これはFlag−Sen2ΔEx8がプレ−mRNAプロセシングに深く関与していることを示している。一方、His−Flag−Sen2WTは3'末端プロセシング因子と弱く結合しており、これは野生型のSen2が主にプレ−tRNAスプライシングに関与していることを示す。
【０６０６】
5.2 ヒトtRNAスプライシングとプレ−mRNA 3'末端形成との間の関係
5.2.1 材料および方法
5.2.1.1 His−Flag−標識tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体サブユニットを発現する安定した細胞系の作製
HsSen2、HsSen2ΔEx8およびHsSen34のオープンリーディングフレームを、8個のヒスチジン残基とFlagエピトープからなるアミノ−末端ペプチドタグをコードする配列を付加することによって改変した。His−Flag−HsSen2、His−Flag−HsSen2ΔEx8またはHis−Flag−HsSen34をコードするプラスミドを用いて293細胞を形質移入した。このタンパク質を発現しているクローンを、ハイグロマイシン耐性によって選択した。
【０６０７】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体サブユニットは、タンパク質のHsSen2(受託番号NP_079541，図20 (配列番号2))、HsSen34（受託番号NP_076980, 図23(配列番号6))、HsSen54(受託番号XP_208944，図24(配列番号8))、HsSen15(受託番号NP_443197, 図22(配列番号4))、およびHsClp1(受託番号NM_006822，図25 (配列番号10))を含む。HsSen2、HsSen2ΔEx8、HsSen34、HsSen54、HsSen15、およびHsClp1のオープンリーディングフレームを特定のプライマーを用いてPCR増幅によって作製し、His−Flag−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。ヒスチジンおよびflagエピトープをフレーム内に有する、種々のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体サブユニットcDNAを含むHis−Flag−pcDNA3.1/Hygroプラスミドで、293細胞を形質移入させ、安定なクローンをハイグロマイシン耐性で選択した。
【０６０８】
5.2.1.2 His−Flag−標識複合体サブユニットを含む全細胞抽出物に由来するヒトエンドヌクレアーゼ複合体の精製
全細胞抽出物をバッファB(250mM NaCl；30mM Tris−HCl, pH 7.0；1mM EDTA；5% グリセロール；0.1% トライトン X−100；プロテアーゼインヒビター(Roche, Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets))に細胞ペレットを再懸濁することによって調製した。細胞を10秒間、3回超音波処理し、そしてその後15分間、15,000gで遠心分離した。この上清を0.2μmのフィルターを通過させ、バッファBで予め洗浄した抗−Flagビーズ(Sigma)に加えた。抽出物を4℃で2時間、抗−Flagビーズとインキュベートした。上清を捨て、そしてビーズを10倍の総容積のバッファ W(400mM NaCl；30mM Tris−HCl, pH 7.0；1mM EDTA；5% グリセロール；0.04% トライトン X−100)を用いて4℃で10分間、3回洗浄した。10倍の総容積のバッファ N(200mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2 mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100)で2回洗浄した後、結合したタンパク質を0.25mg/ml 3xFLAG ペプチド(Sigma)を含む3倍の総容積のバッファNを用いて4℃で1時間溶出した。NaCl(480mMの終濃度)の添加の後、溶出したタンパク質をバッファNBW(500mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100)で予め洗浄したNi−ビーズに加え、4℃で1時間インキュベートした。この上清を捨て、そしてNi−ビーズを、4℃で10分間、10倍の総容積のバッファ NB(200mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2 mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100, 15mM イミダゾール)を用いて3回洗浄した。結合したタンパク質を3倍の総容積のバッファNE(200mM NaCl；40mM Tris−HCl, pH 7.0；2mM MgCl2；5% グリセロール；0.05% トライトン X−100,250mM イミダゾール)を用いて溶出し、そして等量の80% グリセロールを溶出したタンパク質に添加した。この精製したタンパク質を−20℃で保管した。
【０６０９】
5.2.1.3 免疫蛍光顕微鏡検査
HeLa細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、次いでPBSで簡単に洗浄し、室温で20分間、2% ホルムアルデヒド／PBSで固定し、室温で5分間、0.5% トライトン X−100/PBS中で透過性にした。固定した細胞を、室温で1時間、3%ウシ血清アルブミン中でブロッキングした。免疫蛍光染色を、3%ウシ血清アルブミンを含むPBSで希釈した抗−myc抗体とインキュベートし、その後、フルオレセインイソチオシアネートと結合した特異的な二次抗体とインキュベートすることによって行った。すべてのインキュベーションは、室温で行った。画像をZeiss Axiovert 200エピ蛍光顕微鏡を用いて得て、windows v3.6ソフトウェアのIPLabを用いて保存した。
【０６１０】
5.2.1.4 哺乳動物細胞の培養、抗体
HeLa細胞および293細胞を、10%胎児ウシ血清(Invitrogen)を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。
【０６１１】
本実験に用いた抗体は以下のとおりであった：抗−CstF64(Dr.Wiluszより寄贈)、抗−myc(9E10)(BD−Pharmigen)、抗−シンプレキン(BD−Pharmigen)、Y12(Abcam)、抗−Flag(Sigma)、および抗−β−アクチン(Oncogene)。
【０６１２】
5.2.1.5 HsSen2ΔEx8の発現プロファイルの分析
異なる組織におけるHsSen2の選択的スプライス型の存在を決定するために、異なる組織から得たcDNAライブラリー(Clontech)を、エクソン8の外側に位置させるプライマー:(5'−gagtacgtgctggtcgaggaagcg−3'(配列番号：35),5'−gagtcccactttgggctcccagcc−3'(配列番号:36)を用いてPCRによって調べた。ヒト組織および癌細胞系の範囲にわたってHsSen2ΔEx8発現のプロファイルを決定するために、「BD MTE Human Multiple Tissue Expression Array」(BD, Clontech)をHsSen2のエクソン8に特異的なオリゴヌクレオチド(5'−gctctgggatgtttaagtatttac−3'(配列番号:37)でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、製造者の指示(BD, Clontech)に従って実施した。
【０６１３】
5.2.1.6 エンドヌクレアーゼアッセイ
酵母エンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として使用した。酵母（S. cerevisiae）エンドヌクレアーゼの精製を、Trottaら、1997に従って行った。RNA生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、8M尿素を含む12% ポリアクリルアミドゲルで分離し、乾燥させ、フィルムに感光させた。
【０６１４】
5.2.1.7 タンパク質の配列決定
目的のバンドを、10〜14.5% SDS−PAGE濃度勾配ゲルから切り出し、ゲル内トリプシン消化のためにthe City of Hope(Duarte, CA)のタンパク質配列決定機関に供し、その後機関プロトコルに従ってペプチドの配列決定をした。
【０６１５】
5.2.1.8 短い干渉RNA(siRNA)を用いたHsSen2の枯渇、定量的RT−PCR分析およびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(RPA)
SEN2のオープンリーディングフレームのエクソン8(siRNA−A)またはエクソン 9(siRNA−B)のいずれかに対応する2つの19塩基のオリゴヌクレオチド(センスおよびアンチセンス)を「siRNA Design Guidelines」(Ambion)を用いて設計した。このオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、pSilencer 2.0−U6ベクター(Ambion)にクローン化した。SEN2特異的配列(siRNA−AもしくはsiRNA−B)または不定の対照配列(Ambion)のいずれかをコードするこのベクターで、Fugene 6(Roche)を使用して293細胞を形質移入させた。それぞれのsiRNA種について、5つの別々の形質移入を行った。安定に発現している細胞系のプール(A1−5もしくはB 1−5で示す)を、200mg/mlのハイグロマイシンを使用して30日間選択を行い、その後、以下のいずれかのために6ウェルのディッシュへ継代した：(a)His−Flag−HsSen2またはHis−Flag−HsSen2ΔEx8でその後3日間の形質移入の後、2X SDSローディング色素を加え、SDS−PAGEで分け、そして抗−Flag Ab(Sigma；1：500)または抗−アクチンAb(Oncogene；1：2000)を用いたウエスタンブロット検出;あるいは(b)製造元のプロトコルに従ってTrizol(Sigma)を使用した全RNAの抽出。全RNAを定量的RT−PCR分析に使用した。RNA(5〜10mg)を、DnaseIで処理し、およびその後RETROscriptキット(Ambion)を用いて逆転写を行った。定量的PCRをDNA Engine Opticon 2(MJ Research)を使用して以下のオリゴヌクレオチドを用いて行った：前駆体tRNALeu(5'−gtcaggatggccgagtggtc−3'(配列番号:13)；5'−ccgaacacaggaagcagtaa−3'(配列番号:14));tRNAIle(5'−cggtacttataagacagtgc−3'(配列番号:15)、5'−gctccaggtgaggcttgaac−3'(配列番号:16))、GAPDHの3'UTR(5'−ccagcaagagcacaagag−3'(配列番号:17)；5'−tgaggaggggagattcagt−3'(配列番号:18))；GAPDHのAAUAAA切断およびポリアデニル化シグナルの配列下流(5'−caggtggaggaagtcagg−3'(配列番号:19)；5'−ctaaccagtcagcgtcagag3'−(配列番号:20))。定量は18s rRNA Ampliconの正規化に基づいた。
【０６１６】
上記の全RNAの10mgを、製造元のプロトコルに従ってRPA IIIキット(Ambion)を使用するRPAアッセイに用いた。アンチセンスリボプローブはGAPDHゲノムDNA配列のAAUAAA切断およびポリアデニル化部位の下流+1〜+204およびEF1aゲノムDNA配列の+4〜+247から得た。EF1Aのハイブリダイゼーション温度は44℃であり、GAPDHのハイブリダイゼーション温度は42℃であった。
【０６１７】
5.2.2 結果
5.2.2.1 酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットのヒトホモログ
tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットのヒトホモログを同定するために、ヒトタンパク質データベースのBLAST検索を、酵母（S. cererisiae）tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの4つすべてのサブユニットのタンパク質配列を使用して行った。3つのサブユニット（SEN54、SEN2および、SEN34）のヒトホモログ(図7A、6AおよびB)を同定したが、酵母SEN15のヒトホモログは同定できなかった。ヒトSen54(HsSen54)は、58 kDaの予測分子量を有し、ならびに酵母Sen54pとヒトSen54pとの間のアミノ酸保存はこのタンパク質のアミノ末端領域−およびカルボキシル−末端領域に限定されていた(図7A)。ヒトSen2(HsSen2)は51 kDaで、酵母のSen2よりも大きいと予測され、活性部位ドメインにのみ類似性の高い程度を示す(図6A)。反対に、酵母Sen34およびヒトSen34(図6B)は、タンパク質全体にわたって相同性が高い。重要なことに、酵母とヒトの間のSen2およびSen34（エンドヌクレアーゼ活性部位を有する2つのサブユニット(Trottaら、1997)）の配列アライメントは、Sen2およびSen34活性部位に対応する領域において類似性の最高の程度を示す。これらの知見は、酵母とヒトの間のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性部位サブユニットの顕著な保存性を示す。
【０６１８】
5.2.2.2 ヒトSen2転写物は選択的にスプライスされ少なくとも2つの異なるタンパク質生成物を形成する
tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体のサブユニットをコードする推定上のヒトSEN2およびSEN34遺伝子を示すために、ヒトSEN2およびSEN34のcDNAを単離した。驚くべきことに、ヒトcDNAライブラリーからPCR増幅で作製したSEN2クローンの配列決定によって、57個のヌクレオチドが欠失した変異体を同定した。この欠失は、ちょうどSEN2ゲノムDNA配列のエクソン8に対応しており(図12)、これがSEN2の選択的スプライス型であったことを示す。
【０６１９】
エクソン8に隣接のオリゴヌクレオチドを用いて異なるヒト組織から得たcDNAライブラリーのPCR分析を行い、完全長のSEN2またはエクソン8を欠失したSEN2(HsSen2ΔEx8)のいずれかの存在をモニタすることを行った。調べたすべての組織が、SEN2のアイソフォームの両方を有した(データは示さない)。ヒト多組織発現アレイを用いて、発明者らはヒト組織および癌細胞系のHsSen2ならびに HsSen2ΔEx8のRNAの発現をプロファイルした。ノーザンブロット分析をSEN2またはSEN2ΔEx8のいずれかに特異的なオリゴヌクレオチドを用いて行った。この結果は、両方のmRNAがすべての組織型において非常に低レベルで至る所に発現されることを示した(データは示さない)。
【０６２０】
5.2.2.3 ヒトエンドヌクレアーゼは2つの機能的に異なるアイソフォームを形成する
酵母エンドヌクレアーゼサブユニットのヒトホモログがtRNAスプライシング複合体の一部として機能するかを決定するために、ヒト細胞からエンドヌクレアーゼ複合体を精製するための方法を開発した(実験手順を参照のこと)。活性部位サブユニット（HsSen2またはHsSen34）、および選択的にスプライスされたサブユニット（HsSenΔEx8）のHis−Flag−標識ヒトホモログを発現する安定した293細胞系を作製した。安定した細胞系の全細胞抽出物に由来するタンパク質を、抗−FLAG M2アフィニティー樹脂およびその後にNi−NTAアガロース樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーで精製した。結合したタンパク質をイミダゾールで溶出し、酵母プレ−tRNAPheを切断する能力について試験した。この結果は、His−Flag−HsSen2またはHis−Flag−HsSen34のいずれかを発現する細胞から単離したタンパク質複合体が正確にプレ−tRNAPheを切断し5'エクソン、3'エクソンおよびイントロンを生じることを示した(図15、レーン4および5)。この切断の効率は、酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの効率と近似した(図15、レーン2とレーン4および5の比較)。形質移入していない293細胞から精製したタンパク質がプレ−tRNAを切断しなかったので(図15、レーン1)、切断活性の精製はエピトープ−標識サブユニットの発現によって決まった。全体として考えると、これらの結果は、HsSen2およびHsSen34は酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットのオルソログであり、ならびにプレ−tRNAを切断する酵素は進化的に保存されていることを明確に示す。
【０６２１】
His−Flag−HsSen2ΔEx8サブユニットを有するエンドヌクレアーゼ複合体をまた、上記のようにヒト細胞から精製した。驚くべきことに、His−Flag−HsSen2ΔEx8を含む複合体は前駆体tRNAを切断する能力を保持したが、切断の忠実性および正確性は著しく損なわれ、3'スプライス部位のみで切断した。さらに、HsSen2ΔEx8を含む複合体はプレ−tRNAからイントロンを放出できなかった(図15、レーン3)。さらに、tRNAPheのイントロン内で少数の切断事象が生じ、約53および42ヌクレオチド位置に移動する2つの生成物を生じた(図15、レーン3、＊)。この少数の切断生成物は他の前駆体tRNAでは検出されない(データ示さず)。従って、プレ−tRNAは、HsSen2を含む複合体の内在性基質であるが、HsSen2ΔEx8を含む複合体の内在性基質ではない。この重要な観察は、ヒトエンドヌクレアーゼサブユニットSEN2の遺伝子が2つの異なる活性部位を含むタンパク質であって、それぞれが異なるRNA切断特性を有するタンパク質をコードしうることを示唆する。
【０６２２】
5.2.2.4 ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットの局在化
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットの細胞下の局在化を顕微鏡で決定した。ヒトエンドヌクレアーゼの種々のエピトープ−標識サブユニットをコードする構築物を一過的にHeLa細胞に形質移入させ、免疫蛍光で分析した。この結果は、両方の活性部位サブユニット（HsSen2およびHsSen34)、ならびにHsSen2ΔEx8がもっぱら核内に局在化したことを示した(図26)。興味深いことに、HsSen2ΔEx8とHsSen34の両方はしばしば、ドット様構造の核小体に見出された(図26、アローヘッド(arrowhead))。
【０６２３】
5.2.2.5 ヒトエンドヌクレアーゼ複合体の構成成分の同定
上記の結果は、異なるRNA基質特異性を有する2つのエンドヌクレアーゼ複合体を同定した。これら複合体がさらに異なる機能を有する異なるサブユニットを有しうることを示すために、両方のエンドヌクレアーゼアイソフォームの組成をSDS−PAGEおよび銀染色で分析した。
【０６２４】
この分析は、HsSen2およびHsSen34の複合体の別の構成成分と類似した化学量論的組成で存在する18 kDaのタンパク質を同定した(図27Aおよび27B、バンド1)。このタンパク質のレベルはHsSen2ΔEx8精製複合体では著しく減少した(図27B)。このバンドに由来するペプチドは、染色体1に位置する遺伝子(NP 443197)にコードされる18kDaのタンパク質と一致した。酵母Sen15に対するアミノ酸配列アライメントは、酵母Sen15pに対してこれまでに見られなかった高い程度の類似性を示し、これはこのタンパク質が酵母Sen15pのヒトホモログであることを強く示唆するものであった(図7B)。
【０６２５】
HsSen15がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットであることを確かめるために、エピトープ−標識HsSen15を発現する安定した細胞系を作製し、そして精製した複合体を上記のようにエンド核酸分解活性について試験した。図4Dに示すように、この結果は、His−Flag−HsSen15複合体がイントロンならびに5'側および3'側のエクソンを放出する前駆体tRNAPheを正確に切断することを示した。切断の効率は、His−Flag−HsSen2およびHis−Flag−HsSen34の細胞系から精製したエンドヌクレアーゼの切断の効率と類似した(図15)。これはHsSen15がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの構成成分であることを示す。全体として考えると、これらの結果はHsSen2を含むヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体が酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのホモログからなる単純なタンパク質組成を有することを示す。
【０６２６】
3つの複合体（HsSen2、HsSen34およびHsSen2ΔEx8）のタンパク質組成の分析は、共通の2つのタンパク質を示した(図27Aおよび27B)。質量分析によって決定されるように、これらのタンパク質の1つは標識したHsSen2およびHsSen2ΔEx8と一緒に移動し、酵母Sen54タンパク質のヒトホモログを示す(図6A)。エクソン8の欠失は、HsSen54 サブユニットとのHsSen2ΔEx8の結合に影響しなかった(図27B)。標識したHsSen54によって精製したタンパク質複合体(図27D)は、化学量論的な量でHsSen2、HsSen34およびHsSen15のエンドヌクレアーゼサブユニットを含む。His−Flag−HsSen54複合体はイントロンおよび2つのエクソンを放出するプレ−tRNAを正確に切断する。これらの結果はHsSen54がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの内在性サブユニットであることを示す。
【０６２７】
上記のバンドに加えて、図27Dの銀染色したゲルから、バンド2に過剰量のタンパク質が存在することがわかる。このバンド（4つすべての標識サブユニットから精製したエンドヌクレアーゼ複合体に存在する）(図27パネルA、BおよびD)を質量分析で同定した。この結果によって、このバンドをヒトClp1タンパク質(HsClp1)と同定した。この結果は、HsClp1がもとは切断／ポリアデニル化反応のプレ−mRNAの切断に関与することが知られている切断因子IIm(CF IIm)の構成成分として単離されたために驚くべきことであった(de Vriesら、2000)。
【０６２８】
5.2.2.6 エンドヌクレアーゼ複合体はプレ−mRNA 3'末端プロセシング機構に関連する
tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼと結合するプレ−mRNA切断／ポリアデニル化タンパク質の同定は、エンドヌクレアーゼ複合体が多数のRNAプロセシング事象に関与することを示す。HsClp 1がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの真の構成成分であることを示すために、His−Flag−HsClp1で精製したタンパク質を単離し、SDS−PAGEおよび銀染色で分析した。意外なことに、HsSen2、HsSen34およびHsSen15の標識型で精製した複合体のタンパク質パターンとほぼ同一であるタンパク質パターンがみられた(図28A)。この結果は、HsClp1がヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体の内在性構成成分であることを明確に示す。
【０６２９】
tRNAエンド核酸分解活性について標識したHsClp1で精製した複合体を分析した。図28Bに示すように、この精製した複合体はイントロン、ならびに5'側および3'側のエクソンを放出する前駆体−tRNAPheを正確に切断した。切断の効率は、His−FlagHsSen2およびHis−Flag−HsSen34で精製した複合体の切断効率と類似した(図15)。従って、プレ−mRNA 3'末端形成におけるその役割に加えて、HsClp1はヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに関連する。
【０６３０】
上記のこの結果は種々のRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する異なる複合体を形成するエンドヌクレアーゼを同定したことを示す。mRNA 3'末端形成に関与する複合体を同定するために、複合体のプレ−mRNA 3'末端プロセシング機構のさらなる構成成分の存在を示した。異なるエピトープで標識したエンドヌクレアーゼ複合体のサブユニットを用いて精製した複合体をシンプレキンおよびCstF64（ヒトプレ−mRNA3'末端プロセシング複合体の構成成分）に特異的な抗体を用いてウエスタンブッロティングによって分析した。Y12抗体(プレ−mRNAスプライシングsnRNP SmB/B'タンパク質を認識することが知られている)を陰性対照として用いた。意外なことに、この結果(図29)は、プレ−mRNA 3'末端プロセシング複合体の試験したすべての構成成分がプレ−tRNAエンドヌクレアーゼ複合体に結合したことを示す。近似した量の3'末端複合体をすべてのHis−Flag−標識tRNAエンドヌクレアーゼサブユニットから精製した。精製条件は非常にストリンジェントであり、2つのアフィニティークロマトグラフィー工程(実験手順を参照のこと)用いたため、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼとプレ−mRNA 3'末端プロセシング因子との間の相互作用は非常に強固なものである。tRNAエンドヌクレアーゼと結合する3'末端因子の量をより正確に決定するために標準的な塩条件下で免疫沈降も行った。1%程度の3'末端プロセシング因子がtRNAエンドヌクレアーゼと結合することを示した。エンドヌクレアーゼは種類の豊富な微量タンパク質であるため、これは大部分のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼがヒト細胞内のプレ−mRNA 3'末端形成複合体と結合することを示唆する。さらに、His−Flag−HsSen2ΔEx8およびHis−Flag−HsClp1は大部分の3'末端形成複合体と結合できた(図29、レーン8および11をレーン7、9、10と比較する)。
【０６３１】
5.2.2.7 SEN2の枯渇はtRNAスプライシングおよびプレ−mRNA 3'末端形成の欠損を生じる
上記のこの結果はtRNAスプライシングとプレ−mRNA切断とポリアデニル化との間の生化学的な関係を示す。一つの説として、エンドヌクレアーゼ複合体の一つがmRNA 3'プロセシングに関与した場合、エンドヌクレアーゼの量の減少によってプレ−tRNAスプライシングおよびプレ−mRNA 3'末端プロセシングの両方に欠損を生じるだろう。この仮説を試験するために、HsSen2およびHsSen2ΔEx8の細胞内レベルを、siRNAターゲティングによって枯渇させた。SEN2遺伝子生成物を約50%枯渇させること(図30A)によって、対照siRNAと比較してプレ−tRNALeuおよびプレ−tRNAIleのレベルの増加が引き起こされたことが見出された(図30B)。この結果は、HsSen2のプレ−tRNAのプロセシングにおける役割と一致する。さらに、2つの独立した方法（定量的RT−PCRおよびリボヌクレアーゼプロテクション(RPA)）を用いて、3'側の切断およびポリアデニル化シグナルの伸張した配列を含むGAPDH RNAレベルの劇的な増加を観察した(図30B−C)。さらに、3'側の伸張した配列を含むEF1A RNAレベルの同様の増加を観察した(図30C上パネル)。これらの結果は、HsSen2／HsSen2ΔEx8の異なる領域を標的としたいくつかのsiRNAを用いることで観察されたため、従ってSEN2遺伝子生成物のノックダウンによるものであって、siRNAのオフターゲット効果によるものではないと考えられる(図30;データは示さない)。全体として考えると、これは活性部位サブユニットのHsSen2またはそのスプライス変異体のHsSen2ΔEx8は、プレ−tRNAおよびプレ−mRNAのプロセシングに関与しており、RNA成熟の2つの基本的なプロセスをつなげていることの強力な証拠である。siRNA実験に関連して用いたプライマーを図30Dに示す。
【０６３２】
5.2.3 考察
生きているすべての生物は、イントロンで分断された前駆体tRNAの集団を含む。従って、プレ−tRNAからのイントロンの除去(すなわち、エンドヌクレアーゼ切断)は、基本的な生物学的プロセスである。プレ−tRNAからのイントロンの除去は酵母（Saccharomyces cerevisiae）で詳細に研究されているが、ヒトプレ−tRNAのイントロン除去の機構はこれまでに知られていなかった。本明細書中に示した結果は、ヒトtRNAエンドヌクレアーゼ複合体の構成成分を規定し、tRNAエンドヌクレアーゼ触媒サブユニットが異なるRNAプロセシング事象で機能できるという興味深い可能性を示す。
【０６３３】
5.2.3.1 ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットの同定
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのタンパク質組成、局在および機能を本明細書中に記載したように決定した。この酵素をはじめに、酵母tRNA エンドヌクレアーゼの2つの活性部位サブユニットのエピトープ標識ヒトホモログを用いて単離した。本明細書中でこれらの精製した複合体が、正確に前駆体tRNAを処理し、5'側および3'側のスプライス部位で切断し、イントロンを放出することを示した。この結果は、HsSen2およびHsSen34がtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの活性部位サブユニットのオルソログであることを強く示唆する。tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのタンパク質組成もまた本明細書中で記載したように同定した。この複合体は酵母の酵素サブユニット（Sen2p、Sen34p、Sen15p、およびSen54p）のオルソログからなる。HsClp1（プレ−mRNA 3'末端プロセシングに関与するタンパク質）がまた、ヒトtRNAエンドヌクレアーゼ複合体の不可欠なメンバーであるという知見は予期しない結果であった。
【０６３４】
5.2.3.2 ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのモデル
酵母tRNAエンドヌクレアーゼの構成のモデルはM.jannaschiiの古細菌エンドヌクレアーゼの構造に基づいた(Liら,1998)。この酵母酵素は、それぞれ異なる活性部位を含む2つのダイマー（Sen54p−Sen2pおよびSen34p−Sen15p）からなるヘテロテトラマーであると示された。4量体化は、活性部位エンドヌクレアーゼサブユニットのアミノ−末端ドメインとカルボキシル−末端ドメインとの間に形成される極性溝による、Sen54pサブユニットおよびSen15pサブユニットのループL10内の酸性残基の相互作用によって生じると考えられる(Liら、1998)。タンパク質のカルボキシル−末端領域に位置し、ちょうど酵母のループL10配列およびβ9配列に対応するHsSen54およびHsSen15の最も保存された領域を図1Cおよび4Cに示す。
【０６３５】
5.2.3.3 HsSen2の選択的にスプライスされたアイソフォームの同定
発明者らのヒトエンドヌクレアーゼ複合体の研究によって、エクソン8を欠くSEN2の活性部位サブユニットの選択的にスプライスされたアイソフォームを発見した。エクソン8のアミノ酸配列は、古細菌および酵母のエンドヌクレアーゼに見出される保存されたα2−ヘリックスに対応し(図6A)、4量体酵素の形成に重要な構造要素である。このα2−ヘリックスは、異種性サブユニットの保存されたループL10が相互作用できる極性溝を形成できるように活性部位サブユニットのアミノ−末端ドメインおよびカルボキシル−末端ドメインに方向性を与える(図6A；Liら,1998；BujnickiおよびRychlewski, 2000；Lykke−AndersenおよびGarrett, 1997)。従って、一つの説として、HsSen2ΔEx8のこのα2−ヘリックスの脱落は、この活性部位サブユニットの構造を変化させ、結果としてHsSen15／HsSen34 ヘテロダイマーのループL10との安定した相互作用ができなくなるだろう。この説に一致して、HsSen2ΔEx8複合体の組成の分析によって、精製したHsSen2複合体と比べてHsSen15タンパク質およびHsSen34タンパク質のレベルの顕著な減少が明らかとなった(図27B)。この観察は、ヒトおよび酵母のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの構造モデルにさらなる支持を与える。
【０６３６】
さらにこれらの結果は、選択的スプライシングによるサブユニットの相互作用の変化が、異なるRNAプロセシング事象を可能とする多数のエンドヌクレアーゼ複合体を作製するために高等な真核生物が用いたストラテジーであるという興味深い可能性を示す。この説は、HsSen2ΔEx8を含むエンドヌクレアーゼ複合体は適切にプレ−tRNAを切断しないが、エンド核酸分解活性は保持している(図15、レーン3)という結果によって支持される。従って、おそらくHsSen2ΔEx8複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼではないが、未だに知られていないRNA基質のプロセシングに関与していると考えられる。
【０６３７】
5.2.3.4 tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの局在
本研究において、活性部位サブユニットのHsSen2およびHsSen34がもっぱら核に局在し、これは高等な真核生物においてtRNA成熟は核で生じるということを示唆するこれまでの結果と一致することを示した。例えば、RNase Pは、HeLa細胞の核小体において一過的な結合によって核質に局在することが示された(Jacobsonら、1997)。さらに、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性がHeLa細胞の可溶性核タンパク質と作用する(Laskiら、1983；Standringら、1981)。最後に、アフリカツメガエルにおいて、イントロンを含むtRNAは核で成熟および修飾され、エンドヌクレアーゼは卵母細胞の卵核胞に見出される可溶性タンパク質である(De RobertisおよびOlson, 1979；Otsukaら、1981;Mattocciaら、1979)。エンドヌクレアーゼサブユニットの局在に加え、大部分のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼは、mRNA 3'末端形成機構の核に局在するタンパク質と結合することが見出される。全体的に考えると、これらのデータはtRNAスプライシングが高等な真核生物の核で生じるというモデルを強く支持する。これは、エンドヌクレアーゼの核膜画分への局在(Peeblesら、1983；Rauhutら、1990)およびエンド核酸分解切断後のtRNAの5'側および3'側のエクソンを結合させる酵母tRNAスプライシングリガーゼの核エンベロープの内膜への免疫局在性(ClarkおよびAbelson,1987)によって支持される酵母tRNAスプライシングのモデルと一致する。
【０６３８】
近年、酵母のtRNAスプライシングが細胞質で生じていることを示唆する2つの証拠が示された。Yoshihisaおよびその同僚らは、tRNAエンドヌクレアーゼの画分がミトコンドリアの表面に結合していること、および温度感受性突然変異のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが細胞質ゾルにイントロンを含むtRNAを蓄積させたことを示した(Yoshihisaら、2003)。さらに、ゲノムワイドGFP融合局在研究の分析は、エンドヌクレアーゼのGFP−標識サブユニット（ySen2、ySen54およびySen15）がもっぱらミトコンドリアに局在することを示した(Huhら、2003)。さらに、tRNAスプライシングリガーゼに融合したGFP−標識は細胞質の至る所に局在する。全体として考えると、これらの観察はtRNAスプライシングが酵母の細胞質内で生じるというモデルと一致する。このモデルは、発明者らが本明細書中で示したヒト酵素の核への局在と対照となる。従って、tRNAスプライシングの局在化は、酵母とヒトで異なるように制御されうると考えられる。HeLa細胞における発明者らの知見に一致して、発明者らはまたGFP標識HsSen2およびGFP標識HsSen34が初期のニューロンの核に局在することを見出した(データは示さない)。
【０６３９】
活性部位サブユニットは、核小体内のドット様構造に局在しうる(図26、アローヘッド)。これはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが一過的に核小体に局在する可能性を示唆する。予備実験において、アクチノマイシンDを用いたHeLa細胞の処理によって、核内のGFPで標識したHsSen2またはHsSen34の局在が変化し、核質および核小体の両方の局在を分散させた(データは示さない)。これはtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが、核質と核小体との間を循環しうることを示唆する。この観察は高等な真核生物におけるtRNAスプライシングの制御について重要な意味を有しうる。
【０６４０】
5.2.3.5 エンドヌクレアーゼはtRNAスプライシングとプレ−mRNA3'末端形成との間の生化学的なつながりを提供する
tRNA前駆体のスプライシングにおけるHsClp1の役割の証明は驚くべきものであり、tRNAスプライシングのプロセスとmRNA 3'末端形成のプロセスとの間のつながりを示唆する。Kellerおよびその同僚らはもともと、プレ−mRNAの3'末端プロセシングに関与することが知られているCFIImの構成成分としてHsClp1タンパク質を同定した(de Vriesら、2000)。プレ−mRNAの3'末端の作製は、プレ−mRNAがエンド核酸分解によって切断され、その後ポリアデニル化され成熟mRNAを生じるという、2工程の反応であると考えられる。プレ−mRNA 3'末端プロセシング複合体は、切断およびポリアデニル化特異的因子(CPSF)、切断刺激因子(CstF)、2つの切断因子（CFImおよびCFIIm）ならびにポリ(A)ポリメラーゼ(PAP)からなる(WahleおよびRuegsegger, 1999；CalvoおよびManley, 2003；Zhaoら,1999aに論評される)。HsClp1は、CFIImのサブユニットであると示され、CFImおよびCPSFと相互作用する場合に架橋として作用すると考えられる(de Vriesら、2000)。酵母において、Clp1はまた、3'末端プロセシングに関与することが示されている(Minvielle−SebastiaおよびKeller, 1999)。
【０６４１】
これまでに報告されているいくつかの証拠は、tRNAプロセシングとプレ−mRNA 3'末端形成との間のつながりと一致する。O'ConnorおよびPeeblesは、条件的pta1対立遺伝子を含む酵母が前駆体tRNAのプロセシングに欠損があったことを示した(O'ConnorおよびPeebles, 1992)。その後、Pta1pを酵母プレ−mRNA 3'末端プロセシング機構の構成成分として同定した(Prekerら、1997；Zhaoら,1999b)。PTA1のヒトホモログ（シンプレキン）が切断刺激因子(CstF)と結合することが見出された(TakagakiおよびManley, 2000；Zhaoら,1999b)。さらに、プレ−tRNA 3'末端プロセシングとプレ−mRNA 3'末端形成とは、ヒトにおいて遺伝子学的につながっている。TakakuらはELAC2が、前駆体tRNA転写物の3'末端プロセシングを担う酵素であることを示した(Takakuら、2003；Zhaoら、1999b；Takakuら、2003)。これまでの研究は、ELAC2がCPSF73（プレ−mRNA切断およびポリアデニル化特異的因子に属するタンパク質）と高程度の類似性を有していることを示した(Simardら、2002；Tavtigianら,2001)。これは、CPSF73がプレ−mRNA 3'末端プロセシングに関与するエンドヌクレアーゼでありうることを示唆している。従って、これらの本質的に異なるRNA処理（プレ−tRNAスプライシング、プレ−tRNA 3'末端成熟およびプレ−mRNA 3'末端形成）の機構(すなわち、エンドヌクレアーゼ)はすべて、共通の祖先から生じたものでありうる。このパラダイムは、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼが昔のRNAプロセシング酵素であるという見解(BelfortおよびWeiner, 1997；TrottaおよびAbelson, 1998)によって支持される。
【０６４２】
これはプレ−tRNAプロセシングとプレ−mRNA 3'末端プロセシングとの間の生化学的なつながりを最初に示したものである。HsClp1が、2つの異なるヒトエンドヌクレアーゼ複合体（HsSen2 tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体およびSEN2の選択的なスプライス型（HsSen2ΔEx8）で形成されるエンドヌクレアーゼ複合体）のサブユニットであることを本明細書中に示した。意外なことに、標識HsClp1で一緒に精製したtRNAエンドヌクレアーゼは5'側および3'側のスプライス部位で特異的に前駆体tRNAを切断し、イントロンを放出する。これはHsClp1タンパク質が、ヒト細胞における前駆体tRNAの切断の機構と深く関連することを示唆している。
【０６４３】
さらに、ヒトエンドヌクレアーゼ複合体が、3'末端プロセシング因子のサブセット（CPSF160、CPSF30、CstF64、シンプレキンを含むが、PAPおよびSmタンパク質は含まない）と結合することが見出された(図29およびデータは示さない)。タンパク質構成成分のこの特定のセットは、エンドヌクレアーゼ複合体がスプライシングまたはポリアデニル化とは対照的に、プレ−mRNAの切断に関与しうることを示唆する。興味深いことに、HsSen2ΔEx8複合体はHsSen2複合体よりも、シンプレキンおよびCstF64とより強く結合した。選択的にスプライスしたSEN2とプレ−mRNA 3'末端プロセシングとの間のより強い関連の有意性はわからないが、切断反応における変化した基質特異性および精製した画分中のプレ−mRNA 3'末端プロセシング因子の存在は、HsSen2ΔEx8が初めにプレ−mRNAのプロセシングに関与しうることを示唆する。この説に一致して、SEN2遺伝子生成物のsiRNAによる枯渇によって、いくつかの異なるmRNA転写物についての定量的RT−PCRおよびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの両方で検出されるように内在性のmRNA転写物の3'末端プロセシングに欠損を生じ、末端が伸張した生成物の蓄積を生じる(図30A−C)。図30に示すように、プレ−tRNAおよびプレ−mRNA 3'末端の処理におけるHsSen2ΔEx8に対する野生型Sen2の役割を、siRNA−Aを用いて野生型HsSen2を特異的にターゲッティングすることで識別する試みがなされたが、しかし理由は明らかではないが、このsiRNAは両方のSEN2型の枯渇を引き起こした。
【０６４４】
全体として考えると、上記のSEN2 siRNAターゲティングの結果および2つの機構間の物理的な関連の証拠は、tRNAスプライシングおよびプレ−mRNA 3'末端形成は、哺乳動物細胞のエンドヌクレアーゼ複合体の同一の構成成分によって触媒されるというモデルを支持する。これはこのエンドヌクレアーゼ複合体がmRNA、tRNA、および潜在的に他のRNA基質の形成において作用することを示唆する。プレ−tRNAスプライシングをmRNAの3'末端の形成に結び付けるこの概念は、細胞が様々な増殖条件に反応して産生されるプレ−tRNAの量を感知して成熟mRNAレベルをモジュレートしうるために、興味深い。これは、細胞において多数のRNAプロセシング活性を制御する複合体で、翻訳効率を調節する最初の例である。
【０６４５】
参考文献
Figure 0004990621
Figure 0004990621
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Figure 0004990621
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均等物
本発明の範囲は、本明細書に記載された特定の実施形態によって制限されないものとする。実際、記載された発明の他に本発明の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。そのような変更は添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。
【０６４６】
本明細書中では種々の刊行物が引用されているが、その開示の全体は、参照により本明細書に取り入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０６４７】
【図１】HTS蛍光スクリーニングの基質である。エンドヌクレアーゼtRNAはパネルA中に示され、ハイブリダイズしたtRNA基質はパネルBに示される。環状に順序を変えたtRNA基質はパネルCに示される。５’ssは５’スプライス部位を示し、３’ssは３’スプライス部位を示す。
【図２】酵母でのプレ-tRNAからのイントロンの除去の概略図である。酵母でのtRNAイントロンの除去には、3つの酵素の作用が必要である。第1のステップにおいては、tRNAエンドヌクレアーゼは前駆体tRNAを５’及び３’スプライス部位で認識し切断する。この酵素は、SEN54、SEN2、SEN34及びSEN15タンパク質からなるヘテロ四量体である。上記産物である５’エクソン及び３’エクソンが一連の酵素の段階を通じてtRNAリガーゼによって連結し、最終的には2つのエクソンがスプライス部位で２’リン酸と共に結合する。この特異なtRNA中間体は、２’リン酸をNAD受容体に転移する２’ホスホトランスフェラーゼによってプロセシングされて成熟tRNAを生じる。
【図３】酵母tRNAスプライシングホロ酵素の概略図である。古細菌の構造研究及びそれに続く酵母のサブユニットを用いたツーハイブリッド相互作用実験を通じて、酵母tRNAエンドヌクレアーゼの4つのサブユニットの相互作用モデルが提唱された(Li et al., 1998 Science 280,279-284)。異種サブユニットであるSEN54及びSEN15と活性部位サブユニットSEN2及びSEN34との各々の二量化は、各サブユニットのC末端に保存されているβシートの相互作用によって達成される。二量体を含む活性部位は、その後2つの活性部位含有サブユニット中にある、N末端及びC末端ドメインの間に形成された、塩基性グルーヴをもつ保存された荷電ループL10の相互作用を通して集まる。
【図４】酵母tRNAエンドヌクレアーゼによるtRNAの切断モデルである。tRNAの切断は、Sen2サブユニットに含まれる活性部位による５’スプライス部位の触媒反応及びSen34による３’スプライス部位の触媒反応を通じて起こる。
【図５】ヒト(Hs)Sen2（配列番号38）及び変異HsSen2（配列番号39）、並びに酵母Saccaromyces cerevisiae（ScSen2p（配列番号40））tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼSen2サブユニットのアミノ酸配列の整列である。四角で囲んであるアミノ酸残基は、YPGGY（配列番号56）活性部位モチーフを示し、丸く囲んであるアミノ酸残基は活性部位ヒスチジンを示し、下線を引いたアミノ酸残基は、酵母の推定される膜貫通ドメインを示す。
【図６】ヒトと酵母との間における、tRNAエンドヌクレアーゼ活性部位サブユニットSen2及びSen34の配列の保存である。Aは、Saccaromyces cerevisiae（ScSen2(配列番号41)）、Schizosaccaromyces pombe (SpSen2(配列番号42))及びH. sapiens (HsSen2(配列番号57))中におけるSen2アミノ酸配列の比較である。Bは、S. cerevisiae (ScSen34(配列番号43))、S. pombe (SpSen34(配列番号44)) 及びH. sapiens (HsSen34(配列番号58))中のSen34アミノ酸配列の比較である。
【図７】ヒトと酵母との間における、tRNAエンドヌクレアーゼサブユニットSen15及びSen54の配列の保存である。Aは、S. cerevisiae（ScSen54(配列番号45)）、S. pombe (SpSen54(配列番号44))及びH. sapiens (HsSen54(配列番号57))中におけるSen54アミノ酸配列の比較である。Bは、S. cerevisiae（ScSen15(配列番号47)）、S. pombe (SpSen15(配列番号48))及びH. sapiens (HsSen15(配列番号4)中におけるSen15アミノ酸配列の比較である。
【図８】種々の種(配列番号10、及び配列番号49〜54)由来のClp1のタンパク質の配列の整列である。hClp1は進化的に保存されており、ATP/GTP結合モチーフを有している。H. sapiens (tr: Q92989(配列番号10))、D. melanogaster (tr:Q9V6Q1(配列番号49))、C. elegant (sp: P52874(配列番号50))、A. thalana 1 (gb:AB010077(配列番号51))、 A. thaliana 2 (tr: QSR06(配列番号52))、S. pombe (tr: Q10299(配列番号53)) 及びS. cerevisiae (tr: Q08685(配列番号54)) のClp1p配列の整列を、clustalxで作成した。黒及び灰色の四角はそれぞれ、同一残基及び類似残基を示す。コンセンサス配列-A/G-X-X-X-X-G-K- S/T-をもつWalker Aモチーフ及びWalker Bモチーフを示す。
【図９】tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体のタンパク質成分の同定である。His-Flag-Sen2又はHis-Flag-Sen34又はHis-Flag-Senl5又はHis-Flag-Clpl又はHis-Flag-Sen54又はHis-Flag-Sen2ΔEx8タンパク質を、実施例5.1.2.に記載のとおりに精製した。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34、His-Flag-Senl5、His-Flag-Clpl、His-Flag-Sen54、His-Flag-Sen2ΔEx8と同時精製したタンパク質は、SDS-PAGE、続いて銀染色法で解析した。Sen2、Sen34、Senl5、Sen54及びClplはtRNAスプライシング複合体のタンパク質成分として同定される。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物は、陰性対照として用いた。
【図１０Ａ−Ｂ】tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を含む細胞抽出物分画の精製。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34及びHis-Flag-Senl5タンパク質を実施例5.1.2.に記載のとおりに精製した。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物を、陰性対照として用いた。酵母のエンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた。A: His-Flag-Sen2又はHis-Flag-Sen34と同時精製した分画は、エンドヌクレアーゼ活性を示し、標識されたtRNAをイントロン/エクソン境界で切断する。B: His-Flag-Senl5と同時精製した分画は、エンドヌクレアーゼ活性を示し、標識されたtRNAをイントロン/エクソン境界で切断する。
【図１０Ｃ】tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を含む細胞抽出物分画の精製。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34及びHis-Flag-Senl5タンパク質を実施例5.1.2.に記載のとおりに精製した。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物を、陰性対照として用いた。酵母のエンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた。C: Flag-His-HsClplと同時精製したタンパク質は、プレ-tRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【図１１】ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性部位サブユニットは、細胞核に局在している。Myc-Sen2 (上部パネル) 及び GFP-Sen34 (下部パネル) ベクターを、Hela細胞に一時的にトランスフェクトし、免疫蛍光法で視覚化する。
【図１２】エンドヌクレアーゼ活性部位サブユニットSen2pは2つの明確に異なった形態へと選択的にスプライスされる。Sen2p WTは、全ての13のSen2pエクソンを含み、一方そのスプライス変異体であるSen2ΔEx8は（これもSen2ΔEx8と表す）、エクソン8以外の全てのエクソンを含む。古細菌のエンドヌクレアーゼとヒトSen2ΔEx8サブユニットとの活性部位の整列は、エクソン8のアミノ酸配列が、古細菌エンドヌクレアーゼの保存されたαへリックスにぴったりと対応することを意味する。上記のαへリックスは、活性部位サブユニットのN末端及びC末端ドメインを正しい位置に置く役割を果たして塩基性グルーヴを形成し、この塩基性グルーヴに対して異種Sen15サブユニットのループL10が相互作用すると提案されている。
【図１３】選択的にスプライスされたエンドヌクレアーゼサブユニットSen2ΔEx8は、多くのヒト組織で発現している。A :実施例5.2.3に記載される、Hela細胞及び白血病組織、肝臓、腎臓、骨髄、リンパ球、脳、胃、脂肪細胞組織中の野生型Sen2及びスプライス変異Sen2ΔEx8の発現のPCR解析。B : Sen2ΔEx8に特異的なオリゴヌクレオチドでプローブした70組織種のノーザンブロット解析によって、組織のアレイ中でSen2ΔEx8が発現していることが明らかになる。
【図１４】Sen2ΔEx8はSen15及びSen34への結合能が低下している。実施例5.1.2のとおりに、His-Flag-Sen2ΔEx8、His-Flag-Sen34又はHis-Flag-Sen2タンパク質を精製した。293細胞から調製した抽出物を陰性対照として使用した。His-Flag-Sen2ΔEx8又はHis-Flag-Sen34又はHis-Flag-Sen2と同時精製したタンパク質を、SDS-PAGEに続いて銀染色法で解析した。
【図１５】Sen2ΔEx8を含むエンドヌクレアーゼは、プレ-tRNA切断活性が欠損している。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34及びHis-Flag-Sen2ΔEx8タンパク質を、実施例5.1.2のとおりに精製した。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物を陰性対照として用いた。酵母エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた。His-Flag-Sen2又はHis-Flag-Sen34と同時精製した分画は、標識されたtRNAをイントロン/エクソン境界で切断し、エンドヌクレアーゼ活性を示すが、His-Flag-Sen2ΔEx8と同時精製した分画は、エンドヌクレアーゼ活性を欠失していることを示す。
【図１６】ヒトエンドヌクレアーゼ複合体の、2つの異なる複合体の会合モデル。ヒトホロ酵素は5つのサブユニットからなると考えられ、保存された相互作用エレメントが存在しているために、上記酵素は酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに類似した方法でへテロ四量体化することができる。Sen2ΔEx8はSen54タンパク質と共に二量体化することができるが、Sen34、Sen15と安定した相互作用を形成することはできない。この精製酵素は、in vitroでプレ-tRNAを切断することができるが、切断様式は異常である。従って、この酵素は、in vivoではプレ-mRNAといった他の種類のRNA基質をプロセシングする機能を果たす可能性がある。
【図１７Ａ】ヒトエンドヌクレアーゼ複合体は、プレ-mRNA３’末端プロセシング因子に関与する。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen2ΔEx8 、His-Flag-Sen34、His-Flag-Clp1、His-Flag-Sen15と同時精製したタンパク質をSDS-PAGEで解析し、CPSF30、シンプレキン、CstF64といった３’末端プレ-mRNAプロセシング複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングした。プレ-mRNAスプライシングSmB/B’タンパク質を認識するY12抗体を、陰性対照として用いた。His-Flag-Sen2ΔEx8は、 CPSF30、シンプレキン、CstF64と強く関連し、Flag-Sen2ΔEx8が主にプレ-mRNAプロセシングに関わっていることを示す。
【図１７Ｂ】His-Flag-HsSen2、His-Flag-HsSen2ΔEx8、His-Flag-HsSen34、His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1、と同時精製したタンパク質をSDS-PAGEで解析し、シンプレキン、CstF64に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングした。SmB/B’タンパク質を認識するY12抗体を陰性対照として用いた。Cstf-64タンパク質の2つのイソ型を認識する、CstF64に対する抗体が293細胞株に存在することに留意されたい(Wallace et al., 1999, PNAS 96:6763-6768)。
【図１８】ヒトエンドヌクレアーゼは異なった種類のRNAをプロセスする。Sen2タンパク質は、Sen54、Sen34、Sen15およびClp1と複合体を形成し、プレ-tRNAからイントロンを除去する。Clp1タンパク質はまた、プレ-mRNAの成熟に関与する別の複合体の一部分ともなり得るので、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの全てのサブユニットが、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与する因子と複合体を形成することが示唆される。Sen2ΔEx8は、Sen34及びSen15と共に複合体を形成することはできず、プレ-tRNA切断は欠損しているが、Clp1と相互作用することはできる。この相互作用の結果、Sen2ΔEx8は、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与する。
【図１９】３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの例示的な基質を表す。プレ-mRNA分子を線で示す。３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位の位置及び内部リボソーム侵入部位を示す。2つのレポーター遺伝子、蛍ルシフェラーゼ（FLuc）又はウミシイタケルシフェラーゼ（RLuc）の読み取り枠を四角で表す。
【図２０】ヒトSen2の核酸配列(配列番号1)及びアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【図２１】ヒトSen2ΔEx8核酸配列(配列番号11)及びアミノ酸配列(配列番号12)を示す。
【図２２】ヒトSen15の核酸配列(配列番号3)及びアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【図２３】ヒトSen34の核酸配列(配列番号5)及びアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
【図２４】ヒトSen54の核酸配列(配列番号 7)及びアミノ酸配列(配列番号 8)を示す。
【図２５】ヒトClp1の核酸配列(配列番号9)及びアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図２６】ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットの局在。Hela細胞を、GFP-HsSen34（左パネル）、Myc-HsSen2（中央パネル）又はMyc-HsSen2ΔEx8（右パネル）をコードするベクターで一過的にトランスフェクトし、myc-エピトープに対する抗体を用いて間接的な免疫蛍光顕微鏡検査法で解析した。
【図２７】ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体のタンパク質成分の同定。His-Flag-HsSen2及びHis-Flag-HsSen34（A）と共に、又はHis-Flag-HsSen2ΔEx8及びHis-Flag-HsSen2（B）と同時精製したタンパク質をSDS-PAGE及びそれに続く銀染色法で解析した。パネルA、レーン3及びパネルB、レーン2の大きいバンドは各々、His-Flag-HsSen2及びHis-Flag-HsSen2ΔEx8に対応する。これらのバンドは、内在性のHsSen54と重複する。星印で印を付けた幾つかのバンドは、コントロールである、トランスフェクトされていない293細胞の精製において検出され、これによって精製プロトコルの非特異性の混入物を示す（Hu et al., 2003）。バンド1及び2は、タンパク質配列によってHsSen15及びHsClp1として各々同定された。（C）His-Flag-HsSen15と共に同時精製した細胞抽出物分画のエンドヌクレアーゼ活性を、標識したプレ-tRNApheを用いて試験した。切断産物を、変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。293細胞抽出物を陰性対照として使用した。（D）His-Flag-HsSen54と同時精製したタンパク質を、上記のとおりにSDS-PAGE及びそれに続く銀染色法で解析した。HsSen54精製物に存在する、幾つかの付加的なバンドについては、現在検討中であることに留意されたい。
【図２８】HsClp1及びHsSen15は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体の純粋なタンパク質成分である。（A）His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1と同時精製したタンパク質をSDS-PAGE及びそれに続く銀染色法で解析した。His-Flag-HsSen2と同時精製するタンパク質（左パネル）を、His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1との比較のために示す。（B）His-Flag-HsSen15と同時精製した細胞抽出物分画のエンドヌクレアーゼ活性を、標識したプレ-tRNApheを用いて試験した。切断産物を変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。293細胞抽出物を陰性対照として用いた。
【図２９】ヒトエンドヌクレアーゼは、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに不可欠な因子と関連する。His-Flag-HsSen2、His-Flag-HsSen2ΔEx8、His-Flag-HsSen34、 His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1と同時精製したタンパク質をSDS-PAGE及びそれに続く、シンプレキン、CstF64に対する抗体を用いたウエスタンブロッテイング法で解析した。SmB/B’タンパク質を認識するY12抗体を陰性対照として用いた。使用したCstf-64に対する抗体は、293細胞株中に存在する、このタンパク質の2つのイソ型を認識することが注目される(Wallace et al., 1999)。
【図３０Ａ−Ｃ】ヒトエンドヌクレアーゼは、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与する。(A) SEN2エクソン8に特異的なsiRNA-A、又はSEN2エクソン9に特異的なSiRNA-Bを安定して発現している幾つかの293細胞株を、His-Flag-HsSen2（レーン1-3）又はHis-Flag-HsSen2ΔEx8のいずれかを用いてトランスフェクトした。全ての細胞抽出物は、これらの細胞から調製し、抗-FLAG（上）抗体又は抗-アクチン（下）抗体を用いたウェスタンブロット解析によって解析した。(B) siRNA-A又はsiRNA-Bを安定して発現している293細胞の定量的RT-PCR解析をパネルAに示す。白いバーは対照siRNAに対応し、黒いバーは対照siRNA-A1に対応し、灰色のバーはsiRNA-B2に対応する。(C)（上）EF1A及びGAPDH３’-伸張mRNAのリボヌクレアーゼ保護アッセイ。10マイクログラムの酵母総RNA（レーン6）、293細胞から得たmRNA（レーン5）又は293細胞が安定して発現している、siRNA-B1（レーン2）、siRNA-A1（レーン3）又はsiRNA-A2（レーン4）は、EF1A又はGAPDH３’末端切断及びポリアデニル化部位のいずれかの下流のアンチセンスに対応するリボプローブにハイブリダイズし、リボヌクレアーゼで消化された。レーン1は、EF1A又はGAPDH各々のための投入プローブの1:250又は1:100希釈を示す。（下）ホスフォイメージャーを用いた定量化による、３’末端伸張EF1A（灰色のバー）及びGAPDH（黒いバー）のプレ-mRNAの存在量の測定。データは、293の総RNA保護産物（レーン5）に対する倍率差としてプロットされた。
【図３０Ｄ】ヒトエンドヌクレアーゼは、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与する。（D）siRNA実験に用いるプライマーの概略図。

Claims (37)

  1. ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する精製された複合体であって、該複合体が、
    (i) Sen2(配列番号2)、又は、Sen2をコードする核酸(配列番号１)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2(配列番号2)及び第一異種アミノ酸配列を含む第一融合タンパク質、
    (ii) Sen15(配列番号4)、又は、Sen15をコードする核酸(配列番号3)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(配列番号4)及び第二異種アミノ酸配列を含んでなる第二融合タンパク質、
    (iii) Sen34(配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(配列番号6)及び第三異種アミノ酸配列を含んでなる第三融合タンパク質、
    (iv) Sen54(配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(配列番号7))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(配列番号8)及び第四異種アミノ酸配列を含んでなる第四融合タンパク質、及び
    (v) Clp1(配列番号10)、又は、Clp1をコードする核酸(配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いは、Clp1(配列番号10)及び第五異種アミノ酸配列を含んでなる第五融合タンパク質、
    を含み、ここで、該高ストリンジェントな条件が、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH=7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール(Ficoll)、0.02％BSA及び100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファ中、65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール及び0.01％BSAからなるバッファ中、37℃で45分間の洗浄、並びに0.1×SSCからなるバッファ中、50℃で45分間の洗浄を含む、前記複合体。
  2. 前記複合体が、以下の、
    (i) Sen2(配列番号2)、或いはSen2(配列番号2)及び第一異種アミノ酸配列を含んでなる第一融合タンパク質、
    (ii) Sen15(配列番号4)、或いはSen15(配列番号4)及び第二異種アミノ酸配列を含んでなる第二融合タンパク質、
    (iii) Sen34(配列番号6)、或いはSen34(配列番号6)及び第三異種アミノ酸配列を含んでなる第三融合タンパク質、
    (iv) Sen54(配列番号8)、或いはSen54(配列番号8)及び第四異種アミノ酸配列を含んでなる第四融合タンパク質、及び
    (v) Clp1(配列番号10)、或いはClp1(配列番号10)及び第五異種アミノ酸配列を含んでなる第五融合タンパク質、
    を含む、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記複合体がさらに、以下の、
    (i) 切断−ポリアデニル化特異性因子、
    (ii) 切断因子Im、
    (iii) 切断因子IIm、及び/又は
    (iv) 切断刺激因子、
    の一以上を含む、請求項１または２に記載の複合体。
  4. 前記複合体がさらに、以下の、
    (i) 切断−ポリアデニル化特異性因子160(CPSF160)、
    (ii) 切断−ポリアデニル化特異性因子30(CPSF30)、
    (iii) 切断刺激因子64(CstF64)、
    (iv) シンプレキン(symplekin)、
    (v) 切断−ポリアデニル化特異性因子100(CPSF100)、
    (vi) 切断−ポリアデニル化特異性因子73(CPSF73)、
    (vii) 切断因子Im(CFIm)、
    (viii) 切断刺激因子50(CstF50)、及び/又は
    (ix) 切断刺激因子77(CstF77)、
    の一以上を含む、請求項１または２に記載の複合体。
  5. 前記複合体が、以下の、
    (i) Sen2(配列番号2)、
    (ii) Sen15(配列番号4)、
    (iii) Sen34（配列番号6)、
    (iv) Sen54((配列番号8)、及び
    (v) Clp1(配列番号10)、
    を含む、請求項１に記載の複合体。
  6. 前記複合体がSen2(配列番号2)を含む、請求項１−４のいずれかに記載の複合体。
  7. 前記複合体がSen15(配列番号4)を含む、請求項１，２，３または４のいずれかに記載の複合体。
  8. 前記複合体がSen34（配列番号6)を含む、請求項１，２，３または４のいずれかに記載の複合体。
  9. 前記複合体がSen54（配列番号8)を含む、請求項１，２，３または４のいずれかに記載の複合体。
  10. 前記複合体がClp1(配列番号10)を含む、請求項１，２，３または４のいずれかに記載の複合体。
  11. 前記複合体が第一融合タンパク質を含む、請求項１，２，３または４のいずれかにの記載の複合体。
  12. 前記複合体が第二融合タンパク質を含む、請求項１，２，３，４または１１のいずれかに記載の複合体。
  13. 前記複合体が第三融合タンパク質を含む、請求項１，２，３，４，１１または１２のいずれかに記載の複合体。
  14. 前記複合体が第四融合タンパク質を含む、請求項１，２，３，４，１１,１２または１３のいずれかに記載の複合体。
  15. 前記複合体が第五融合タンパク質を含む、請求項１,２，３,４，１１,１２,１３または１４のいずれかに記載の複合体。
  16. 前記異種アミノ酸配列がペプチドタグである、請求項１１−１５のいずれかに記載の複合体。
  17. (i) Sen2(配列番号2)のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    (ii) Sen15(配列番号4)のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    (iii) Sen34(配列番号6)のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    (iv) Sen54(配列番号8)のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
    （ｖ） Clp1(配列番号10)のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    を含む、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する精製された複合体。
  18. 前記複合体の少なくとも２つのタンパク質が、互いに共有結合されている、請求項１−１７のいずれかに記載の複合体。
  19. 前記複合体の少なくとも２つのタンパク質が、互いに非共有結合されている、請求項１−１７のいずれかに記載の複合体。
  20. 前記異種アミノ酸配列は異なる、請求項１−４および６−１６のいずれかに記載の複合体。
  21. 請求項１−２０のいずれかに記載の複合体及びキャリヤを含む、組成物。
  22. 細胞から、請求項１〜２０のいずれかに記載の複合体を精製する方法であって、該方法が、
    (a) 細胞抽出物又は細胞からの核抽出物を調製する工程、ただし、上記細胞が、上記複合体の全てのタンパク質成分を発現し、及び
    (b) 上記ペプチドタグによって複合体を精製する工程
    を含む、前記方法。
  23. 複合体の形成を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)以下の(i)−(iv)のタンパク質を含むtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する複合体の形成に導く条件下、化合物の存在下で、
    (i) Sen2(配列番号2)、又は、Sen2をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いは、Sen2(配列番号1)及び第一異種アミノ酸配列を含む第一融合タンパク質、
    (ii) Sen15(配列番号4)、又は、Sen15をコードする核酸(配列番号3)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(配列番号4)及び第二異種アミノ酸配列を含んでなる第二融合タンパク質、
    (iii) Sen34(配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(配列番号6)及び第三異種アミノ酸配列を含んでなる第三融合タンパク質、
    (iv) Sen54(配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(配列番号7))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(配列番号8)及び第四異種アミノ酸配列を含んでなる第四融合タンパク質、及び
    （ｖ） Clp1(配列番号10)、又は、Clp1をコードする核酸(配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いは、Clp1(配列番号10)及び第五異種アミノ酸配列を含んでなる第五融合タンパク質、
    をインキュベートする工程、並びに
    (b)該形成された複合体の量を測定する工程、ただし、該化合物の不在下で測定された該複合体の量に対する、工程(b)で測定された該複合体の量の差が、該化合物が該複合体の形成を増加または減少することを示す、
    を含む、前記方法。
  24. 前記方法が、個々の前記タンパク質の量に対する前記形成された複合体間の比を比較する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 工程(a)中、前記タンパク質を等モル量でインキュベートする、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記化合物を、前記複合体の形成の阻害について試験する、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記化合物が前記複合体に直接結合する、請求項２３に記載の方法。
  28. 複合体の安定性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)該複合体の維持に導く条件下、化合物の存在下で、請求項１−２０のいずれかに記載の複合体をインキュベートする工程、及び
    (b)該複合体の量を測定する工程、ただし、該化合物の不在下で測定された該複合体の量に対する、工程(b)で測定された該複合体の量の差が、該化合物が該複合体の安定性を増加または減少することを示す、
    を含む、前記方法。
  29. ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)化合物又は化合物ライブラリーのメンバーを、請求項１−２０のいずれかに記載の複合体及びレポーター遺伝子含有核酸と接触させる工程であって、ここで、該レポーター遺伝子がバルジ-ヘリックス-バルジ構造又は前駆体tRNAの成熟ドメインを持つtRNAイントロンを含み、かつ、遺伝子発現に必要なすべての要素が存在する、該工程、及び
    (b)該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下の該レポーター遺伝子の発現が、該化合物の不在下又は対照の存在下の該レポーター遺伝子の発現に対して変化している場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物が同定される、該工程、
    を含む、前記方法。
  30. ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)請求項１−２０のいずれかに記載の複合体を、核酸を含むtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を発蛍光団で及び３'末端を消光剤で標識され、かつ、該核酸がバルジ-ヘリックス-バルジ構造又は前駆体tRNAの成熟ドメインを持つtRNAイントロンを含む、該工程、及び
    (b)該tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、蛍光シグナルが、該化合物の不在又は対照の存在に対して該化合物の存在下で変化している場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物が同定される、該工程、
    を含む、前記方法。
  31. ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)請求項１−２０のいずれかに記載の複合体を、核酸を含むtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を蛍光供与体部分で及び３'末端を蛍光受容体部分で標識され、かつ、該核酸がバルジ-ヘリックス-バルジ構造又は前駆体tRNAの成熟ドメインを持つtRNAイントロンを含む、該工程、及び
    (b)該tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、該化合物の存在下の該蛍光供与体部分の波長での該蛍光供与体部分の蛍光放射が、該化合物の不在又は対照の存在に対して変化している場合、該tRNAスプライシング活性を増加または減少する化合物が同定される、該工程、
    を含む、前記方法。
  32. 前記化合物がtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を減少する、請求項２９、３０または３１に記載の方法。
  33. 前記化合物が前記複合体に直接結合する、請求項２９、３０または３１に記載の方法。
  34. ３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)化合物ライブラリーのメンバーを、請求項１−２０のいずれかに記載の複合体、及びレポーター遺伝子と３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位とを含む核酸、と接触させる工程であって、ここで、該レポーター遺伝子が該３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位の３'に位置し、かつ、遺伝子発現に必要なすべての要素が存在する該工程、及び
    (b)該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下の該レポーター遺伝子の発現が、該化合物の不在下又は対照の存在下の該レポーター遺伝子の発現に対して変化している場合、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性を増加または減少する化合物が同定される、該工程、
    を含む、前記方法。
  35. ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)請求項１−２０のいずれかに記載の複合体を、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を発蛍光団で及び３'末端を消光剤で標識される、該工程、及び
    (b)該３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、蛍光シグナルが、該化合物の不在又は対照の存在に対して該化合物の存在下で変化している場合、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物が同定される、該工程、
    を含む、前記方法。
  36. ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性を増加または減少する化合物を同定する方法であって、該方法が、
    (a)請求項１−２０のいずれかに記載の複合体を、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を蛍光供与体部分で及び３'末端を蛍光受容体部分で標識される、該工程、及び
    (b)該３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、該化合物の存在下の該蛍光供与体部分の波長での該蛍光供与体部分の蛍光放射が、該化合物の不在又は対照の存在に対して変化している場合、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を増加または減少する化合物が同定される、該工程、
    を含む、前記方法。
  37. 前記化合物が３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を減少する、請求項３４、３５または３６に記載の方法。
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