CN1156573C - 一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法 - Google Patents
一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法 Download PDFInfo
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本发明公开了一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法，其步骤是：首先合成编码聚赖氨酸的DNA链，将合成的DNA链在65℃褪火形成双链的短DNA片段；其次是通过基因拼接，构建融合蛋白的表达载体pPICGLT；第三是表达载体pPICGLT经限制性内切酶StuI线性化后，用原生质体转化法转化进酵母中；第四是酵母重组子的筛选，提取酵母的基因组DNA作检测；第五是融合蛋白的表达、纯化，转化子在30℃下MM培养基中培养72小时，每24小时加一次甲醇；第六是融合蛋白与介体的连接；第七是葡萄糖传感器的制备；第八是电化学检测。本发明制备葡萄糖传感器测量线性范围宽，可达45mmol/L，且响应信号大，保存期长。
Description
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法。
葡萄糖测定在医疗诊断、发酵工业中占有相当重要的地位。葡萄糖电极也是最早报道的、研究和应用最多、最广泛的生物传感器。1984年Cass等首先报道了一种以二茂铁衍生物作为电子媒介体的葡萄糖传感器，由此开创了酶一介体生物反应以及介体生物传感器的研究领域，这类生物传感器被称为第二代传感器。经与丝网印刷技术结合，构成能大批量生产的、性能优良的一次性(disposable)酶电极。其主导产品便携式血糖酶电极已经拥有大约50％世界市场份额，是迄今开发最为成功的生物传感器。然而，这类酶电极存在一个弱点，那就是线性范围比较狭窄，检测上限一般在20-25mmol/L，不能满足高血糖病患者的需要。
本发明的目的是提供了一种用葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法，线性范围宽，响应信号大，解决了传统葡萄糖传感器线性范围狭窄的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：所说的基因修饰的葡萄糖氧化酶是指在基因水平上，将能与介体二茂铁甲酸特异接合的聚赖酸肽引入葡萄糖氧化酶的C末端。经过表达、纯化，得到的融合蛋白用于制备葡萄糖传感器。其步骤是：
1、该合成的DNA链应编码聚赖氨酸并且该两端具有克隆所需要的酶切位点：
5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′
5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-3
2、通过基因拼接，构建融合蛋白的表达载体pPICGLT(GLT代表所构成的融合蛋白，即含有连接肽和聚赖氨酸链的葡萄糖氧化酶)：上述合成的DNA链在65℃褪火7分钟形成双链的短DNA片段(片段1)；质粒pGEM-TGL(2)DNA用限制性内切酶SnaB I和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收约1.7Kb左右片段，为片段2；质粒pPIC9 DNA用SnaB I和NOt I双酶切回收8.0kb左右的片段，为片段3。片段1、片段2、片段3用T4DNA连接酶连接，得到融合蛋白的表达载体pPICGLT(GLT代表GOD-(Ser-Gly)5-(Lys)10)(见附图1)。
3、表达载体pPICGLT经限制性内切酶Stul线性化后，用原生质体转化法转化进酵母Pichiapastoris GS115中。
4、酵母重组子的筛选：提取酵母的基因组DNA作PCR(聚合酶链式反应)检测。
5、融合蛋白GLT的表达、纯化，转化子在30℃下MD培养基(酵母基本氯源培养基(YNB)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，生物素400μg/L)培养基中培养至OD600＝1.2-1.5，2000转/分离心收集酵母细胞。将细胞重悬于10ml液体MM(YNB 1.7g/L，硫酸铵5g/L，甲醇12ml/L，生物素400μg/L，酪蛋白水解物10g/L，pH 5.6)培养基中，每24小时向培养物中补加2ml甲醇，培养约72小时。离心收取上清液。用强阴离子交换柱Q-Sephorose Fast Flow纯化柱纯化。
6、融合蛋白GLT与介体的连接，融合蛋白中的聚赖氨酸链上的氨基与与介体二茂铁甲酸上的羧基通过缩水反应连接。
7、葡萄糖传感器的制备：取经介体修饰的酶各2μl滴于工作电极的工作面积上。在室温下干燥后，在电极表面覆盖一层醋酸纤维膜，切成单个的电极，置于4℃干燥器中备用。
8、电化学检测：循环伏安检测和计时电流检测参照Model 270/250电化学软件用户手册确定实验过程。将制备好的介体酶电极与电化学系统连接，用微量注射器取20μl待测样品滴于电极表面，立即启动电化学系统进行循环伏安扫描。扫描参数如下：起始电压(EIi＝-0.5V，终止电压(Eλ)＝+0.5V，扫描速度为20mV/S。样品中含有0.1mol/L氯化钾，起支持电解质的作用。计时电流法用来记录响应电流，在固定的电压下(+0.45V，相对于Ag/AgCl参比电极)，加入20μl样品溶液后，电化学检测便开始启动，加缓冲液可得到背景电流值。在第30秒的电流值被记录下来进行实验分析。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：线性范围宽，可达45mmol/L，且响应信号大，保存期长。
图1为融合蛋白表达载体pPICGLT的构建流程图。
图2为融合蛋白琼脂糖电泳检测从重组酵母的基因组中PCR扩增的GLT基因示意图。M：1Kb DNA梯度分子量标准；1：阳性对照；2，3：PCR产物：4：阴性对照。
图3为三种酶电极的循环伏安检测图。a)Fc-GLT电极；b)Fc-GODc电极；c)Fc-GODw电极。(起始电压，终止电压(EI)＝-0.5V(Eλ)，扫描速度＝+0.5VmV/s)。
图4为三种酶电极的线性范围。a)Fc-GLT电极；b)Fc-GODc电极；c)Fc-GODw电极。(工作电压＝450mV)
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
根据图1、图2、图3、图4可知，其具体步骤是：
1、合成(上海生工公司)编码聚赖氨酸的DNA链(两端含有克隆所需要的酶切位点)：
5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′
5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-3
2、通过基因拼接，构建融合蛋白的表达载体pPICGLT：上述合成的DNA链在65℃褪火7分钟形成双链的短DNA片段(片段1)；质粒pGEM-TGOL DNA用限制性内切酶SnaB I和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收约1.7Kb左右片段，为片段2；质粒pPIC9 DNA用SnaB I和NOt I双酶切回收8.0kb左右的片段，为片段3。酶切体系(60μl)：10×buffer 6μl，质粒DNA 45μl，0.1％BSA 6μl，限制性内切酶3μl。
酶切产物经琼脂糖电泳(8％)检测，用胶回收试剂盒(Sangon，Uniq-10)回收目的片段。片段1、片段2、片段3用T4DNA ligase连接，得到融合蛋白的表达载体pPICGLT(GLT代表GOD-(Ser-Gly)5-(Lys)10)(见附图1)。连接体系中片段1、片段2、片段3的DNA含量之比为3∶1∶1。
连接体系(20μl)：
1.7Kb DNA 8μl，
8.0kb DNA 9μl，
10×缓冲液 2μl
T4DNA连接酶 1μl
3、表达载体pPICGLT经限制性内切酶Stu I线性化后，用原生质体转化法转化进酵母Pichiapastoris GS115中。
Stu I酶切体系：
pPICGLT DNA 44μl
10×缓冲液 6μl
StuI 4μl
灭菌的双蒸水 6μl
原生质体转化法的步骤：将50ml GS115培养物培养至细胞至OD600＝0.2，于2000转/分离心5分钟收集细胞，依次用10ml水、10ml SCE溶液(1mol/L山梨醇，1mmmol/L EDTA，10mmmol/L柠檬钠)洗涤，重悬细胞于10ml SK溶液(1mol/L山梨醇，67mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.5)中，加入20μl裂解酶(Lyticase)30℃作用30分钟。原生质体依次用10ml山梨醇(1mol/L)洗两次，10ml CaS(10mmol/L CaCl2，1mol/L山梨醇)洗一次，重悬原生质体于0.6ml的CaS中。取100ul原生质体、10ul质粒DNA、5ul鲑鱼精DNA混合在室温下温育20分钟，而后加入1.2ml PEG(3350)继续温育15分钟，于3000g/min离心4分钟，收集原生质体，加入150ul SOS(1mol/L山梨醇，10mmol/LCaCl2，0.3*YPD)，室温下温育30分钟，使细胞壁再生。用1mol/L山梨醇稀释至0.5ml，加入保温于56℃的上层琼脂培养基，然后倒在RD平板上，迅速用混合液盖满整个平板，室温下放置4分钟，让琼脂糖硬化，表面应非常平，没有突起。于室温下倒置平板2-3小时，让多余的水分挥发，而后在28-30℃温箱中孵育4-7天，进行筛选。
4、酵母重组子的筛选
提取酵母转化子的基因组DNA作PCR检测。酵母基因组的提取方法具体操作步骤如下：首先制备原生质体，方法同上，重悬原生质体于8ml 1ysis缓冲液中(含1％SDS，10mmol/L pH7.4 Tris-HCl，10mmol/L EDTA，0.05mol/LNaCl)，加入70μl蛋白酶K(15mg/ml)和80μl RNA酶，在37℃下温育2小时，并于70℃下10分钟以终止反应，而后加入1/10体积的5mol/L的冰冷醋酸钾缓冲液。置于冰上30分钟。于4℃下16，000转/分离心去除白色沉淀，加入等体积的酚-氯仿溶液(酚∶氯仿；异戊醇＝25∶24∶1)抽取DNA，将上清转移至一离心管，加入2倍的100％冷乙醇沉淀DNA，离心以回收DNA并将其溶于2倍的TE缓冲液，加入1/10体积的冷3mol/L NaAc和0.6倍异丙醇中沉淀DNA，离心去上清。最后将DNA溶于100-200ul的缓冲液中。
PCR体系(50μl)：
10×缓冲液 5μl
Mg2+ 3μl
上游引物* 1μl
上游引物* 1μl
dNTP 4μl
酵母基因组DNA 1μl
Taq DNA聚合酶 0.3μl
DDW 34.7μl
(*上游引物：5’TACGTAAGCAATGGCATTGAAGCCAGC-3’
*下游引物：5’-GGCCGCCTTCTTTTTCTTCTTTTTCTTCTTCTTCTTA-3’)
PCR热循环条件：反应在PE480热循环仪上进行。94℃，3分钟，1个循环，94℃，1分钟，57℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环。凝胶电泳条件：0.5×TBE缓冲液(配制0.7％琼脂糖凝胶，0.5μg/μL溴化乙锭预染色，60V稳压电泳1-2小时，核酸分子量对照为1kb DNA梯度分子量标准。紫外灯下观察和记录结果(见附图2)。
5、融合蛋白的表达、纯化
转化子在30℃下MM培养基(基本氯源培养基YNB0.17g，(NH4)2SO40.5g，5％甲醇)培养72小时，每24小时加一次甲醇，GLT融合基因在AOX1启动子的作用下在PichiapastriesGS115中表达。蛋白质的纯化步骤如下：
装柱→用20％乙醇洗柱→用双蒸水洗柱→用0.02mol/L柠檬酸缓冲平衡层析柱→上样→梯度洗脱(洗脱液为0一0.1mol/L或0-0.2mol/LNaCl溶液，洗脱速度为1.8ml/min)→分步收集(每管7ml)→检测收集管中样品的酶活和蛋白含量→收集具有酶活性的样品(约100ml)。收集到的蛋白质经超滤浓缩-20℃保藏备用。过柱洗脱时，用UV700蛋白/核酸检测仪检测(上海六一仪器厂)在线检测蛋白质浓度。检测GOD酶活的方法如下：以Sigma公司商品GOD(A.niger)作标准曲线。用pH5.6、0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液配制2mg/ml葡萄糖、2mg/ml邻联苯二茴香胺和100U/ml辣根过氧化物酶溶液。在5ml离心管中分别加入1ml葡萄糖溶液、2ml甘油及邻联苯二茴香胺和辣根过氧化物酶溶液各100μl。30℃保温10分钟后，加入20μlGOD标准溶液或样品，迅速摇匀。在30℃下反应30分钟后，加入2ml 5mol/L盐酸终止反应，测定OD525。
6、融合蛋白与介体的连接
蛋白与介体的连接具体操作步骤如下：80mg GOD溶解于4ml的(N-(2-羧羧乙基)-哌嗪-N-2(丙磺酸))(0.15mol/L)缓冲液中形成微混的pH7.3左右的溶液(若有必要，可适当用0.1mol/LHCl或0.15mol/L的Na-HEPES调节pH值)加入100mg的碳二亚胺(EDC)和480mg尿素，pH值重新调节为7.2-7.3，随后加入60mg的葡萄糖氧化酶，将溶液装入玻璃瓶中，用石蜡封好置于冰上过夜。用0.1mol/L，pH6.0的柠檬酸缓冲液透析48小时，在此过程中透析液更换4-8次，以除去没有反应的二茂铁甲酸和其他的小分子物质。将被二茂铁甲酸修饰过的融合蛋白、野生型酶、商品酶分Fc-GLT、Fc-GODW Fc-GODc。
7、葡萄糖传感器的制备
实验中丝网印刷电极包括一个工作电极和一个Ag/AgCl参比电极。在15×15CM的PVC(聚氯乙烯片)上，印刷30个电极，电极的印刷电极过程。电极在使用前依次用酒精和水冲洗。取三种经介体修饰的酶各2μl滴于工作电极的工作面积上，在室温下干燥后，在电极表面覆盖一层醋酸纤维膜，切成单个的电极，置于4℃干燥器中备用。
8、电化学检测
循环伏安检测和计时电流检测参照Model 270/250电化学软件用户手册确定实验过程。将制备好的介体酶电极与电化学系统连接，用微量注射器取20μl待测样品滴于电极表面，立即启动电化学系统进行循环伏安扫描。扫描参数如下：起始电压(Ei)＝-0.5V，终止电压(Eλ)＝+0.5V，扫描速度为20mV/S。样品中含有0.1mol/L氯化钾，起支持电解质的作用(结果见附图3)。计时电流法用来记录响应电流，在固定的电压下(+0.45V，相对于Ag/AgCl参比电极)，加入20μl样品溶液后，电化学检测便开始启动，加缓冲液可得到背景电流值。在第30秒的电流值被记录下来进行实验分析。测量均为三支电极重复测定结果的平均值。
Claims (2)
1、一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法，它包括下列步骤：
A、该合成的DNA链应编码聚赖氨酸并且该两端具有克隆所需要的酶切位点：
5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′
5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-3；
B、通过基因拼接，构建融合蛋白的表达载体pPICGLT，上述合成的DNA链在65℃褪火形成双链的短DNA片段，质粒pGEM-TGL DNA用限制性内切酶SnaB I和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收片段，质粒pPIC9 DNA用SnaB I和NOtI双酶切回收片段；
C、表达载体pPICGLT经限制性内切酶Stul线性化后，用原生质体转化法转化进酵母Pichia pastoris GS115中；
D、酵母重组子的筛选，提取酵母的基因组DNA作PCR检测；
E、融合蛋白GLT的表达、纯化，转化子在30℃下在MD培养基中培养，离心收集酵母细胞，将细胞重悬于10ml液体MM培养基中，每24小时向培养物中补加2ml甲醇，培养约72小时，离心收取上清液，用强阴离子交换柱Q-Sephorose Fast Flow纯化柱纯化；
F、融合蛋白GLT与介体的连接，融合蛋白中的聚赖氨酸链上的氨基酸与介体二茂铁甲酸上的羧基通过缩水反应连接；
G、葡萄糖传感器的制备，取经介体修饰的酶各2μl滴于工作电极的工作面积上，在室温下干燥后，在电极表面覆盖一层醋酸纤维膜，切成单个的电极，置于4℃干燥器中备用；
H、电化学检测，将制备好的介体酶电极与电化学系统连接，用微量注射器取20μl待测样品滴于电极表面，启动电化学系统进行循环伏安扫描，电化学检测便开始启动，加缓冲液在30秒的电流值被记录下来进行实验分析。
2、根据权利要求1所述的一种用葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法，其特征是融合蛋白与介体的连接，首先将80mg GOD溶解于4ml的NaHEPES缓冲液中形成微混的pH7.3的溶液，其次加入100mg的碳二亚胺和480mg尿素，pH7.2-7.3，第三是加入60ml的葡萄糖氧化酶，将溶液装入玻璃瓶中，用石蜡封好，第四是用0.1mol/L，pH6.0的柠檬酸缓冲液透析48小时，透析更换4-8次。
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