CN1298949A - 一种由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种由酵母菌(pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法,是重组基因生物工程技术领域中通过酵母菌发酵制备人体血清白蛋白的方法之一。首先把改进的分泌信号基因和其它四种基因,用基因处理方法得到基因组合质粒,其次培养出一种不含或含极少量空隙蛋白酶的酵母菌,并取其甲醇应用表型为Muts菌种发酵制备人体血清白蛋白溶液,最后通过过滤等提纯方法获得产量高杂质少的人体血清白蛋白。
Description
本发明属于重组基因生物工程技术领域中的由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法。
人体血清白蛋白是人体血液中含量最高的蛋白，这种蛋白的主要功能是维持血液的胶态渗透压。同时它还是铜离子，镍离子，钙离子，胆红素，原卟啉，长链脂肪酸，前列腺素，类固醇激素，甲状腺素，三碘甲状腺素和谷胱甘肽等物质的载体。因此血清白蛋白是治疗胎儿成红细胞症，血清白蛋白贫血症，蛋白贫血症，严重烧伤症和大出血等疾病的主要药品，在临床医疗上有重要价值。另外人体血清白蛋白与钙片和鱼油等组成的补品有促进青少年骨质生长，维护成年人和老年人骨质健康，帮助产妇身体恢复和加强人体免疫系统的功效。
现在市场上的人体血清白蛋白是从人体血液中提取出来的，人体血液供应量有限且来源不稳定，而且从人体血浆中提取的白蛋白及药物有携带如艾滋病和乙型肝炎等传染病毒的危险，因此世界各国，尤其是美国和日本等发达国家都投入了大量的人力物力来研究和开发生产人体血清白蛋白的替换方法。
近二十年来，重组基因工程技术的发展日新月异，使由替换方法来生产人体血清白蛋白的设想成为现实。
目前，国外已有用酵母菌来制备人体血清白蛋白的方法。Etcheverry等在发面酵母菌中生产出人体血清白蛋白(Etcheverry et al.Bio/Technology，Aug 1986，P726，Arijum Singh EPA123,544)。但他们生产的人体血清白蛋白存在于细胞内，而且产量低(6mg/L)。Sreekrishna等将人体血清白蛋白的编码基因放入酵母菌(Pichia Pastoris)的AOXI启动基因和人体血清白蛋白的分泌信号基因中，在酵母菌(Pichia Pastoris)溶液中人体血清白蛋白产量高达3.4g/L(5,707,828).Okabayashi等应用酵母菌(Pichia Pastoris)的AOXII启动基因，将产量提高到5g/L(JP-A-3-83,595，JP-A-4-293,495).Kobayashi等又通过控制温度和酸碱度等方法将产量进一步提高到7g/L(US 5,759,819)。
但Sreekrishna和Okabayashi等都发现在细胞内仍然有一部分分泌信号未裂解的人体血清白蛋白，这可能是由于分泌信号裂解蛋白酶效率低等因素造成的。另外还发现在发酵液中存在被部分裂解的人体血清白蛋白产品，这可能是由空隙蛋白酶的裂解作用而造成的。因此，如能改进分泌信号和空隙蛋白酶裂解这两项关键技术，用酵母菌(Pichia Pastoris)制造人体血清白蛋白的技术就会得到重大进展。
为解决这两个关键问题，本发明的目的在于从解决提高分泌信号裂解效率和培养出不含或含极少量的空隙蛋白酶的酵母菌品种入手，达到提高产量和降低杂质为目标，而建立一种由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法。
本发明的详细内容如图1至图5所示。
本发明首先应用一段改进了的分泌信号基因和其他四段基因组成了一个基因表达盒子，并采用标准基因处理方法将其放入pPIC9基因媒介体中，得到图3所示的一种由酵母菌(Pichia pastoris)表达人体血清白蛋白的基因组合质粒(或称基因媒介体)pPIC9/sH SA。
其次，培养出一种不含或含极少量空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA品种(Pichiapastoris中的一种)。
再次，根据酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的甲醇应用表型的不同，采取不同发酵方法制备人体血清白蛋白溶液，本发明采取甲醇应用表型为Muts菌种，采用发酵方法制备人体血清白蛋白溶液。
最后，将上述方法制备的人体血清白蛋白发酵溶液，用切向流过滤，活性炭过滤，正离子交换液相色谱，酒精沉淀提纯，这样制备出来的人体血清白蛋白产量高杂质少。上述四个步骤的具体说明如下。
第一步 五段基因组成的基因表达盒子，包含一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色体中提取的启动基因，一段改进了的分泌信号基因，一段人体血清白蛋白的编码基因，一段基因转录终止基因，一段与酵母菌染色体同系的基因。这五段基因表述如下：1)一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色体中提取的启动基因，这段基因是从酵母菌(PichiaPastoris)的1号醇氧化酶(AOXI)的5’控制基因中提取出来的(见图1)，它是目前用酵母菌(Pichia Pastoris)制造重组蛋白的最佳启动基因。2)一段改进了的分泌信号基因，分泌信号基因将会被转化成一段分泌信号蛋白，这可以使携带分泌信号的蛋白通过酵母菌(Pichia Pastoris)的分泌系统进入溶液中，从而达到提高产量的目的。分泌信号蛋白在被排出细胞前需要被细胞内的蛋白酶裂解，如果裂解效率低，就会导致产量低。pPIC9基因媒介体中的发面酵母菌α-配偶因素信号包含89个氨基酸，且有三个蛋白酶裂解信号，其中一个是KEX2裂解信号，另外两个是不明蛋白酶的裂解信号(图2分别用↑和↓表示)。本发明在α-配偶因素信号的基础上将碳端的四个氨基酸EAEA(即GLUALA GLU ALA)的编码基因切去，得到改进了的分泌信号基因，这种改进了的分泌信号只需要KEX2蛋白酶即可被裂解，避免了需要另外两个不明蛋白酶裂解的必要性，从而提高了分泌信号的裂解效率。3)一段人体血清白蛋白的编码基因，这段基因有多种来源，我们是用RT-PCR的方法从人体基因库中提取出来的。 4)一段基因转录终止基因。我们用了TAA TAA两个连续终止信号。5)一段从酵母菌(Pichia Pastoris)染色体的AOXI的3′提取的与酵母菌同系的基因，这段基因有帮助信息RNA成熟的功能。
用标准基因处理方法，将人体血清白蛋白的编码基因和基因转录终止基因放入已包含启动基因，与酵母菌染色体同系的基因和改进了的分泌信号基因的pPIC9基因媒介体中，得到图3所示的一种由酵母菌(Pichia pastoris)表达人体血清白蛋白的基因组合质粒pPIC9/sHSA。
这种基因组合质粒的具体组装步骤为：人体血清白蛋白(HSA)编码基因是用RT-PCR的方法从人体基因库中提取出来的。这样得到的双股基因有一个在5’的XhoI核酸内切酶切点和一个在3’的EcoRI核酸内切酶切点。并且在XhoI切点(C↑TCGAG)后和HSA编码基因前有AAAAGA核酸，这个双股基因还在HSA编码基因后有TAATAA核酸。将从人体基因库中提取出来的人体血清白蛋白编码基因用XhoI和EcoRI切断后，用琼脂糖胶电泳分离，切出所要的双股基因(～2100碱基对)。然后用琼脂胶基因提纯试剂盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提纯。
pPIC9基因媒介体有一个XhoI和一个EcoRI核酸内切酶切点(见图5)，将pPIC9用XhoI和EcoRI切断后，用琼脂糖胶电泳分离，切出所要的双股基因(～9300碱基对)，然后用琼脂胶基因提纯试剂盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提纯。
用标准的基因连接方法将上述两个双股基因连接起来，之后用标准的转化方法把TOP10大肠杆菌用上述的连接混合液转化，然后用含氨必西林的琼脂板来筛选所要的菌落，共选6个这样的菌落，再用2ml的含氨必西林的LB肉汤培养液培养这些菌落。8小时后用离心方法获取菌落，并初步提纯基因组合质粒，这样得到的基因组合质粒可用核酸内切酶裂解或基因顺序分析仪来测定，并选出一个基因顺序正确的菌落，生产并提纯50ng基因组合质粒，再将其用SacI核酸内切酶将其线性化，最后用酒精沉淀提纯出基因组合质粒。
第二步 改进的不含或含极少量空隙蛋白酶的酵母菌品种。目前市场有多种酵母菌(Pichia Pastoris)，例如野生型酵母菌(Pichia Pastoris)GS115(his4)和KM71(aoxlΔ：SARG4his4.arg4)，但这些酵母菌都产生空隙蛋白酶，其中蛋白酶A最为明显，这个蛋白酶不但自身有裂解人体血清白蛋白的缺点，而且它还有产生如羟基蛋白酶Y和蛋白酶B等空隙蛋白酶裂解人体血清白蛋白的副作用，因此由这些酵母菌(Pichia Pastoris)制备出的人体血清白蛋白在细胞培养液中有很多被部分裂解了，这样就降低了产量和纯度。
酵母菌HXU12(his4，ura3)来源于GS115(his4)，但它的URA3基因被破坏掉了，因此HXU12(his4，ura3)有抵抗5-氟乳清酸能力；PDR421基因媒介体包含一段不完全的PEP4基因(见图4)。在HXU12(his4，ura3)酵母菌的基础上，用PDR421基因媒介体将其蛋白酶A的编码基因(PEP4)打乱，当它被插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色体中时，就会得到HX4(his4，pep4)酵母菌，它有两个不完全而且无裂解功能的PEP4基因，这样得到的HX4(his4，pep4)酵母菌的空隙蛋白酶裂解功能被大大降低，对我们是有利的。然后，HX4(his4，pep4)酵母菌与在前面获得的基因组合质粒pPIC9/sHSA重组后，得到包含人体血清白蛋白基因的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA，它不含或含极少量的空隙蛋白酶，于是在发酵液中就不含裂解的人体血清白蛋白，从而提高了人体血清白蛋白的产量和纯度。
HX4(his4，pep4酵母菌的组装：
首先用BglII核酸内切酶将PDR421线性化，并用标准的酒精沉淀方法提纯这种媒介体，然后用Spheroblast方法(Cregg et al.Pichia Protocol，Methods in Molecular Biology，103：27-40)，将PDR421插入HXU12的PEP4基因中，并用含组氨酸的琼脂板筛选所需的酵母菌菌落，于是得到了HX4(his4，pep4)酵母菌。
HX4/pPIC9/sHSA酵母菌的组装：
用标准的Spheroblast的方法，将pPIC9/sHSA插入HX4(his4，pep4)酵母菌的染色体中，就组装成HX4/pPIC9/sHSA酵母菌，然后用MGY琼脂板筛选所需的酵母菌菌落，将约100个长成的菌落用MM琼脂板鉴别其甲醇应用表型，这样就得到Mut+(长得快)和Muts(长得慢)两个甲醇应用表型的酵母菌，之后冷冻保存。
第三步由甲醇应用表型为Muts酵母菌HX4/pPIC9/sHSA发酵制备人体血清白蛋白溶液。
在酵母菌(Pichia pastoris)族中，HX4/pPIC9/sHSA酵母菌比GS115(his4)酵母菌脆弱，本发明在酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的发酵溶液中加入适量的(1M)山梨醇和(10g/L)酪蛋白氨基酸，适当调节温度和酸碱度等条件，使酵母菌得以健康生长。酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的甲醇应用表型的不同，其发酵方法也不同，对应的人体血清白蛋白产量也不同，如下表所示。
菌落 甲醇应用表型 发酵时间(h) 产量(g/L) 蛋白杂质％
57 Mut+ 75 1.21 17
63 Mut+ 82 0.98 22
67 Muts 188 10.5 4.5
72 Muts 204 9.7 5.2
从表中看出，这样发酵处理后，菌落67甲醇应用表型为Muts的发酵液中人体血清白蛋白含量高达10.5g/L，杂质低到4.5％
选出甲醇应用表型为Muts菌种进行发酵，其方法如下：1)把冷冻的含1/3丙三醇(体积)的HX4/pPIC9/sHSA在冰上解冻，然后将1ml上述酵母菌悬浮液加入含50ml的MGY培养液的容量为250ml的摇瓶中。2)在30℃和250c/min摇速的条件下，培养酵母菌20至40小时。3)将这50ml培养液加入含4％丙三醇的500ml基本盐和微量元素混合溶液的发酵罐中，温度控制在25℃，搅拌速度控制在800c/min，酸碱度用氨水(30％)控制在pH5.8，含氧度控制在35％，气压控制在1.2个大气压。4)当丙三醇被用尽后，含氧量应快速增加(1分钟内提高到90％以上)，这时将丙三醇溶液以15ml/h的速度加入发酵罐中，维持4小时。5)停止丙三醇泵，待丙三醇被用光后立刻以1ml/h的速度加入甲醇溶液。6)用甲醇控制仪将甲醇浓度控制在0.5％，维持约200小时。
第四步 对上述方法制备的人体血清白蛋白溶液进行提纯，就可获得产量高杂质低的人体血清白蛋白，提纯步骤简单易行，具体如下：1)用切向流过滤的方法过滤并浓缩第三步发酵制备的人体血清白蛋白溶液至原体积的1/8。2)将提纯步骤1)的溶液加热至55℃，恒温30分钟。3)将提纯步骤2)的溶液用活性炭过滤。4)将提纯步骤3)的溶液用正离子交换液相色谱提纯。5)将提纯步骤4)中得到的溶液用酒精沉淀。6)过滤并用空气干燥提纯步骤5)中的沉淀物。经过这些提纯操作步骤后，获得的人体血清白蛋白，就是本发明方法所得到的人体血清白蛋白。
本发明的积极效果：本发明方法由酵母菌(Pichia pastoris)制备的人体血清白蛋白，具有产量高，杂质低，不含内毒素，不含传染病毒等特点，因此，由酵母菌(Pichia pastoris)来制造人体血清白蛋白，在医疗方面有重大的实用价值。所用原料价格低，制备方法简单，易于工业化生产，经济效益明显。
附图说明图1从酵母菌(pichia Pastoris)1号醇氧化酶(AOXI)的5’控制基因中提取启动基因。
图2 从发面酵母菌中提取出来的α-配偶因素信号的氨基酸顺序。其中用↑符号表示KEX2蛋白酶裂解处，用↓符号表示不明蛋白酶的裂解处，，碳端的四个氨基酸EAEA(即GLUALA GLU ALA)的编码基因被切去，就得到改进的分泌信号基因。
图3 由pPIC9基因媒介体组装的pPIC9/sHSA基因组合质粒。其中1--5’AOX1启动基因2--α-配偶因素信号基因(pPIC9/sHSA中为改进的)3--3’AOX1TT基因4--HIS4基因5--3’AOX1基因(与酵母菌染色体同系基因)6--ColE1基因7--氨咔青霉素抗性基因8--人体血清白蛋白的编码基因和基因转录终止基因。
图4 PDR421基因媒介体，其中1--URA3基因 2--氨咔青霉素抗性基因 3--部分PEP4基因。当PDR421基因媒介体被插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色体中时，就会得到两个不完全而且无裂解功能的PEP4基因。这样得到的HX4(his4，pep4)酵母菌的空隙蛋白酶裂解功能被大大降低。它与基因组合质粒pPIC9/sHSA组装得到酵母菌HX4/pPIC9/sHSA不含或含少量的空隙蛋白酶。
图5插入人体血清白蛋白编码基因的pPIC9的核酸内切酶切点。其中：↑--Xho1的核酸内切酶切点 ↓-EcoR1的核酸内切酶切点。
最佳实施例
从发面酵母菌中提取出来的α-配偶因素信号的氨基酸顺序中，切去碳端四个氨基酸EAEA(即GLU ALA GLU ALA)的编码基因，得到改进的分泌信号基因及用标准基因处理方法，将人体血清白蛋白的编码基因和基因转录终止基因放入已包含启动基因，与酵母菌染色体同系的基因和改进了的分泌信号基因的pPIC9基因媒介体中，得到图3所示的一种由酵母菌(Pichia pastoris)表达人体血清白蛋白的基因组合质粒pPIC9/sHSA。
把PDR421插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色体中时，得到HX4(his4，pep4)酵母菌，与基因组合质粒pPIC9/sHSA组装得到不含或含少量的空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA。
选择甲醇应用表型为Muts的菌种制备人体血清白蛋白发酵溶液。
采取切向流过滤，正离子交换液相色谱等提纯方法制备人体血清白蛋白。
Claims (5)
1.一种由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法，是通过培养酵母菌溶液实现的，其特征在于首先应用一段改进了的分泌信号基因和其他四段基因组成一个基因表达盒子，采用标准基因处理方法将其放入pPIC9基因媒介体中，得到一种由酵母菌(Pichiapastoris)表达人体血清白蛋白的基因组合质粒(或称基因媒介体)pPIC9/sHSA，其次培养出一种不含或含极少量空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA品种(Pichia pastoris中的一种)，再次取酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的甲醇应用表型为Muts菌种，采用发酵方法制备人体血清白蛋白溶液，最后将上述方法制备的人体血清白蛋白发酵溶液，用切向流过滤，活性炭过滤，正离子交换液相色谱，酒精沉淀提纯，制备出产量高杂质少的人体血清白蛋白。
2.按权利要求1所述的一种由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法，其特征在于一段改进了的分泌信号基因和其他四段基因组成一个基因表达盒子，包含一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色体中提取的启动基因，一段改进了的分泌信号基因，一段人体血清白蛋白的编码基因，一段基因转录终止基因，一段与酵母菌染色体同系的基因，这五段基因表述如下；
一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色体中提取的启动基因，这段基因是从酵母菌(PichiaPastoris)的1号醇氧化酶(AOXI)的5’控制基因中提取出来的；
一段改进了的分泌信号基因，是在pPIC9基因媒介体中的α-配偶因素信号的基础上将碳端的四个氨基酸EAEA(即GLU ALA GLU ALA)的编码基因切去，得到改进了的分泌信号基因；
一段人体血清白蛋白的编码基因，这段基因有多种来源，我们是用RT-PCR的方法从人体基因库中提取出来的；
一段基因转录终止基因，用了TAA TAA两个连续终止信号；
一段从酵母菌(Pichia Pastoris)的AOXI的3′提取的与该酵母菌染色体同系的基因；
用标准基因处理方法，将人体血清白蛋白的编码基因和基因转录终止基因放入已包含启动基因，与酵母菌染色体同系的基因和改进了的分泌信号基因的pPIC9基因媒介体中，得到一种由酵母菌(Pichia pastoris)表达的人体血清白蛋白的基因组合质粒pPIC9/sHSA
这种基因组合质粒的具体组装步骤为：
人体血清白蛋白(HSA)编码基因是用RT-PCR的方法从人体基因库中提取出来的，这样得到的双股基因有一个在5’的XhoI核酸内切酶切点和一个在3’的EcoRI核酸内切酶切点，并且在XhoI切点(C↑TCGAG)后和HSA编码基因前有AAAAGA核酸，这个双股基因还在HSA编码基因后有TAATAA核酸，将从人体基因库中提取出来的人体血清白蛋白编码基因用XhoI和EcoRI切断后，用琼脂糖胶电泳分离，切出所要的双股基因(～2100碱基对)，然后用琼脂胶基因提纯试剂盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提纯；
pPIC9基因媒介体有一个XhoI和一个EcoRI核酸内切酶切点，将pPIC9用XhoI和EcoRI切断后，用琼脂糖胶电泳分离，切出所要的双股基因(～9300碱基对)，然后用琼脂胶基因提纯试剂盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提纯；
用标准的基因连接方法将上述两个双股基因连接起来，再用标准的转化方法把TOP10大肠杆菌用上述的连接混合液转化，然后用含氨必西林的琼脂板来筛选所要的菌落，再用2ml的含氨必西林的LB肉汤培养液培养这些菌落，8小时后用离心方法获取菌体，并初步提纯基因组合质粒，再用基因顺序分析仪选出一个基因顺序正确的菌落，生产并提纯50ng基因组合质粒，再将其用SacI核酸内切酶将其线性化，最后用酒精沉淀提纯基因组合质粒。
3.按权利要求1所述的一种由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法，其特征在于改进的不含或含极少量空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA品种，是在HXU12(his4，ura3)酵母菌的基础上，用PDR421基因媒介体将其蛋白酶A的编码基因(PEP4)打乱，PDR421基因媒介体包含一段不完全的PEP4基因，当它被插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色体中时，就会得到有两个不完全而且无裂解功能的PEP4基因的HX4(his4，pep4)酵母菌，然后，HX4(his4，pep4)酵母菌与在前面获得的基因组合质粒pPIC9/sHSA组装后，得到所需要的不含或含极少量的空隙蛋白酶酵母菌HX4/pPIC9/sHSA；
HX4(his4，pep4)酵母菌的组装：
首先用BglII核酸内切酶将PDR421线性化，并用标准的酒精沉淀方法提纯这种媒介体，然后用Spheroblast方法(Cregg et al.Pichia Protocol，Methods in Molecular Biology，103：27-40)，将PDR421插入HXU12的PEP4基因中，并用含组氨酸的琼脂板来筛选所需的酵母菌菌落，得到HX4(his4，pep4)酵母菌；
HX4/pPIC9/sHSA酵母菌的组装：
用标准的Spheroblast的方法，将pPIC9/sHSA插入HX4(his4，pep4)酵母菌的染色体中，就完成了HX4/pPIC9/sHSA酵母菌的组装，然后用MGY琼脂板来筛选所需的酵母菌菌落，将约100个长成的菌落用MM琼脂板来鉴别其甲醇应用表型，这样就得到Mut+(长得快)和Muts(长得慢)两个甲醇应用表型的酵母菌，之后冷冻保存。
4.按权利要求1所述的一种由酵母菌(Pichia pastoris)制备人体血清白蛋白的方法，其特征在于由酵母菌(Pichia pastoris)的甲醇应用表型为Muts菌种发酵的方法制备人体血清白蛋白溶液，是在酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的发酵溶液中加入适量的(1M)山梨醇和(10g/L)酪蛋白氨基酸，适当调节温度和酸碱度等条件，使酵母菌得以健康生长；
甲醇应用表型为Muts菌种发酵方法如下：1)把冷冻的含1/3丙三醇(体积)的HX4/pPIC9/sHSA在冰上解冻，然后将1ml上述酵母菌悬浮液加入一个含50ml的MGY培养液的容量为250ml的摇瓶中；2)在30℃和250c/min摇速的条件下，培养酵母菌20至40小时；3)将这50ml培养液加入含丙三醇浓度为4％的500ml基本盐和微量元素混合溶液的发酵罐中，温度控制在25℃，搅拌速度控制在800c/min，酸碱度用氨水(30％)控制在pH5.8，含氧度控制在35％，气压控制在1.2个大气压；4)当丙三醇被用尽后，含氧量应快速增加(1分钟内提高到90％以上)，这时将丙三醇溶液以15ml/h的速度加入发酵罐中，维持4小时；5)停止丙三醇泵，待丙三醇被用光后立刻以1ml/h的速度加入甲醇溶液；6)用甲醇控制仪将甲醇浓度控制在0.5％，维持约200小时。
5.按权利要求1和权利要求4所述的方法，其特征在于如下的提纯方法：1)用切向流过滤的方法过滤并浓缩发酵制备的人体血清白蛋白溶液至原体积的1/8；2)将提纯步骤1)的溶液加热至55℃，恒温30分钟；3)将提纯步骤2)的溶液用活性炭过滤；4)将提纯步骤3)的溶液用正离子交换液相色谱提纯；5)将提纯步骤4)中得到的溶液用酒精沉淀；6)过滤并用空气干燥提纯步骤5)中的沉淀物经过这六个步骤提纯后，获得本发明方法所制备的人体血清白蛋白。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321573A (zh) * | 2003-11-24 | 2012-01-18 | 西北生物治疗药物公司 | 用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法 |
| WO2020099949A1 (en) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Sudershan Biotech Pvt Ltd | Recombinant vector, host cell and process for production of human serum albumin |
-
1999
- 1999-12-07 CN CN 99126781 patent/CN1298949A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321573A (zh) * | 2003-11-24 | 2012-01-18 | 西北生物治疗药物公司 | 用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法 |
| CN1886498B (zh) * | 2003-11-24 | 2013-10-30 | 西北生物治疗药物公司 | 用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法 |
| CN102321573B (zh) * | 2003-11-24 | 2015-01-14 | 西北生物治疗药物公司 | 用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法 |
| WO2020099949A1 (en) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Sudershan Biotech Pvt Ltd | Recombinant vector, host cell and process for production of human serum albumin |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |