ES2894333T3 - Inhibidores de SGK1 en el tratamiento del síndrome de QT Largo - Google Patents

Inhibidores de SGK1 en el tratamiento del síndrome de QT Largo Download PDF

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Abstract

Un inhibidor de SGK1 para uso en un método para tratar a un sujeto con síndrome de QT Largo, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de SGK1.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de SGK1 en el tratamiento del síndrome de QT Largo
Descripción
Campo de la Tecnología
La presente invención se refiere al tratamiento de afecciones cardíacas tales como el síndrome de QT Largo y la enfermedad cardiovascular por la inhibición de SGK1.
Declaración de Interés del Gobierno
Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno bajo la subvención N° R01 HL094677-01A1 (PI: Rosenzweig; 1/15/10-12/31/13; Role of Serum and Glucocorticoid-Regulated Kinase-1 in Electrical Remodeling) otorgada por NHLBPI y la subvención N° R21 HL104370-01 otorgada por NHLBI (PI: Rosenzweig; 7/01/10-6/30/12; Computational discovery of SGK1 inhibitors for the treatment of heart disease). El gobierno puede tener ciertos derechos sobre esta invención.
Antecedentes
La incidencia anual de muerte cardíaca súbita en los Estados Unidos está en el intervalo de 180.000 a 250.000 por año y es poco probable que disminuya en el futuro con el aumento de la edad de la población, así como con un aumento en los factores de riesgo cardíaco tales como diabetes mellitus y la obesidad. Las alteraciones en los flujos iónicos constituyen la base celular de las arritmias que subyacen a las muertes arrítmicas repentinas. Estas alteraciones conducen habitualmente a un aumento del tiempo de repolarización de las células del miocardio y a un aumento de la duración del potencial de acción. Esto corresponde a un aumento del intervalo QT en un electrocardiograma de superficie. Se ha observado una prolongación en el intervalo QT en diversas afecciones, incluyendo la isquemia miocárdica, en respuesta a la administración de fármacos de comúnmente utilizados, tales como eritromicina y haloperidol (como un efecto secundario no intencionado) y como afección congénita.
Se han identificado muchas causas genéticas para el síndrome de QT Largo (LQTS), con la mayoría de las mutaciones observadas en los genes que codifican tres canales iónicos cardíacos principales (KCNQ1, KCNH2 y SCN5a). Desafortunadamente, no existen terapias actuales para el tratamiento del LQTS que aborden el problema mecánico subyacente, a saber, la prolongación del potencial de acción y la repolarización del miocardio. Adicionalmente, la mayoría de los medicamentos antiarrítmicos prolongan la repolarización del miocardio y los fármacos que acortan el intervalo QT son raros y tienen efectos muy pequeños. Por lo tanto, los medicamentos que alteran la función de los canales iónicos que conducen al acortamiento del potencial de acción y a la repolarización del miocardio serían una nueva clase de agentes en el tratamiento de pacientes con LQTS genético y adquirido.
El pez cebra recapitula varios aspectos clave de la repolarización del miocardio humano y tiene un largo historial de uso exitoso para la selección de fármacos de alto rendimiento. Recientemente se demostró que los modelos de pez cebra de LQTS adquirido, así como LQTS genético, pueden utilizarse para seleccionar moléculas pequeñas que pueden acortar la repolarización del miocardio, rescatando así el LQTS del pez cebra. En particular, el mutante breakdance (bkd) porta una mutación en el gen KCNH2 con bloqueo cardíaco 2:1 observado debido al potencial de acción prolongado y fenocopias de LQT2 humano. Se ha realizado con éxito la selección de alto rendimiento de moléculas pequeñas que rescatan el fenotipo de bkd.
Además, la enfermedad cardiovascular es responsable de 600.000 muertes al año en los Estados Unidos, por lo que es la principal causa de muerte tanto en hombres como en mujeres. Los costos estimados anuales totales asociados con la enfermedad de la arteria coronaria solo ascienden a 109 billones de $.
La insuficiencia cardíaca (HF) es un síndrome clínico de prevalencia creciente que puede adquirirse, por ejemplo, después de un infarto de miocardio o sobrecarga de presión como en la hipertensión y estenosis valvular, o puede ser genético debido a mutaciones de novo o heredadas. Si bien existen terapias basadas en la evidencia para la HF sistólica, no ha habido una nueva clase de medicamentos aprobados para la HF en aproximadamente una década. Por lo tanto, existe una necesidad clínica sustancial no satisfecha de nuevos enfoques terapéuticos en la HF.
Las miocardiopatías son un grupo de enfermedades que afectan a los músculos del corazón, también conocidos como miocardios. La miocardiopatía dilatada debilita el corazón y afecta a su capacidad de bombear suficiente sangre a los órganos. Esto puede conducir a insuficiencia cardíaca y a la muerte, así como a problemas en otras partes del cuerpo. Aproximadamente el 25-30% de la insuficiencia cardíaca puede deberse a mutaciones genéticas que pueden ocurrir de novo en los individuos afectados o pueden ser familiares y hereditarias. Aunque las causas genéticas de la miocardiopatía dilatada (DCM) son diversas, los genes afectados más comúnmente codifican componentes estructurales del citoesqueleto y/o sarcómero. El tratamiento de la miocardiopatía dilatada es limitado e incluye tratamiento farmacológico para aliviar los síntomas, implantación de dispositivos y trasplantes de corazón. Sin embargo, estos pueden tener efectos secundarios no deseados o ser ineficaces. Por consiguiente, existe la necesidad de opciones de tratamiento adicionales para tratar la miocardiopatía dilatada.
Sumario
La presente invención es como se define en las reivindicaciones.
Se ha encontrado ahora que la inhibición de SGK1 en un modelo de pez cebra de síndrome genético, congénito de QT Largo tiene efectos beneficiosos. Los resultados dados en los Ejemplos 2 y 3 muestran que la inhibición de SGK1 demostró un rescate significativo del bloqueo AV 2:1. Basándose en estos descubrimientos, se describen en esta memoria métodos para tratar el síndrome de QT Largo con inhibidores de SGK1.
En un aspecto, la presente invención es un inhibidor de SGK1 para uso en un método para tratar a un sujeto con el síndrome de QT Largo, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de SGK1. En algunas realizaciones, el síndrome de QT Largo es genético. En una o más realizaciones, el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una mutación en el gen KCNQ1, el gen KCNH2 o el gen SCN5a. En algunas realizaciones, el síndrome de QT Largo se adquiere (por ejemplo, como un efecto secundario de fármacos tales como eritromicina o haloperidol).
La presente invención proporciona un cierto número de ventajas sobre los métodos actuales de tratamiento del síndrome de QT Largo (genético y adquirido). Por ejemplo, la presente invención describe la observación inesperada de que la inhibición de SGK1 puede rescatar el fenotipo 2:1 en mutantes bkd (breakdance). La presente invención también presenta un nuevo objetivo terapéutico para el síndrome de QT Largo.
Además, se ha encontrado ahora que SGK1 se activa de forma persistente en un modelo de ratón de la insuficiencia cardíaca inducida por sobrecarga de presión. Los resultados dados en los Ejemplos 2 y 3 demuestran que la inhibición genética de SGK1 mitigó el desarrollo de insuficiencia cardíaca y fibrosis (cicatrización) después de la constricción aórtica y redujo los cambios bioquímicos asociados con la insuficiencia cardíaca en el canal de sodio que conducen a arritmia. En base a estos descubrimientos, en esta memoria se describen métodos para tratar enfermedades cardiovasculares con inhibidores de SGK1.
Inhibidores de SGK1 adecuados incluyen: un compuesto de molécula pequeña; un anticuerpo anti-SGK1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; un péptido que inhibe la función de SGK1; un miARN; un ARNip; un ARNhc; un ARNdc; un ARN antisentido dirigido al ADN o ARN de SGK1; o un polinucleótido que codifica cualquiera de los inhibidores anteriores.
Se ha encontrado también ahora que SGK1 se activa en los corazones de pacientes con DCM (véase el Ejemplo 6). También se ha encontrado que la inhibición de SGK1 en un modelo murino de DCM genético humano debido a una mutación en la cadena pesada de miosina (MHC-F764L) mitiga el desarrollo de DCM genético. En base a estos descubrimientos, se describen métodos para tratar a un sujeto con miocardiopatía dilatada con inhibidores de SGK1.
La presente invención proporciona un cierto número de ventajas sobre los métodos actuales de tratamiento de HF, incluyendo miocardiopatía dilatada. Por ejemplo, la presente invención describe la observación inesperada de que la inhibición de SGK1 puede tener un efecto protector sobre las células cardíacas. La presente invención también describe la observación de que SGK1 se activa en la miocardiopatía dilatada humana y que la inhibición de SGK1 mitiga los efectos de la miocardiopatía dilatada.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 muestra el porcentaje de rescate del bloqueo AV 2:1 en el pez cebra mutante bkd- / - tratado con morfolino de SGK1 (500 mM) o ARNm de SGK1 -DN (500 mM) en la fase de células 1 -2 y puntuado para el fenotipo en 99 horas después de la fertilización. El número total de peces se indica encima de las columnas correspondientes.
La Figura 2 muestra que el inhibidor 2 de SGK1 (también identificado como Compuesto 1A o Compuesto 5377051) rescata el fenotipo de bloqueo AV 2:1 del pez cebra mutante bkd- / - de una manera dependiente de la dosis. El rescate máximo se produce a 45 mM sin un aumento significativo de la toxicidad observado en las dosis testadas (línea gris, círculos en blanco, derecha). El porcentaje de rescate a esta concentración es comparable al rescate por morfolino.
La Figura 3 muestra ensayos basados en células para la inhibición de SGK1.
La Figura 4A muestra un gráfico de las relaciones de peso del corazón a peso corporal (HW/BW) en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de TAC.
La Figura 4B muestra un gráfico del grosor de la pared del ventrículo izquierdo (LV) en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de TAC.
La Figura 4C muestra un gráfico de acortamiento fraccional (FS) en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de TAC.
La Figura 4D muestra un gráfico de dilatación del LV (LVDD) en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de TAC.
La Figura 4E muestra un gráfico del área de fibrosis normalizada en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de TAC.
La Figura 4F muestra la histología de las células cardíacas en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de TAC.
La Figura 5 muestra un gráfico del tamaño del infarto (normalizado a AAR) en ratones inhibidos por SGK1 y de tipo salvaje después de una lesión isquémica.
La Figura 6 muestra un gráfico que demuestra que la inhibición de SGK1 mejora la función cardíaca en ratones MHC-F764L (* p < 0,05).
La Figura 7 muestra gráficos con respecto a SGK1 que regula la función del canal Nav 1.5: A) La expresión de SGK1 constitutivamente activo (SGK1-CA) en células HEK-Nav1.5 conduce a un aumento en la densidad de Ina, mientras que la inhibición por expresión de una forma muerta de quinasa negativa dominante de SGK-1 (SGK1 -DN) conduce a una disminución en la densidad de Ina (*: p < 0,05 por ANOVA de una vía, n = 7-11 para cada una de las afecciones); B) La expresión de SGK1-CA en células HEK- Nav 1.5 conduce a un desplazamiento hiperpolarizante de las curvas de activación e inactivación del estado estacionario para Ina; C) La mutación de un nuevo sitio putativo T1590A de SGK1 conduce a la anulación del aumento de Ina con la activación de SGK1.
La Figura 8 muestra gráficos con respecto a la inhibición de SGK1 en cardiomiocitos cultivados por compuestos de plomo como sigue: A) Inhibición de la actividad de SGK1 evaluada por fosforilación de GSK3-beta en CMs infectadas por Ad.SGK1-CA. Se evaluaron diferentes concentraciones de 5377051 a las 48 horas después del tratamiento con inmunotransferencia (izquierda) y se cuantificaron (derecha); B) El efecto de los inhibidores de SGK1 sobre la fosforilación de GSK3-beta inducida por Akt en CMs infectadas por Ad.-myr-Akt se evaluó mediante inmunotransferencia; C) Comparación de la potencia de 10 compuestos micromolares 5377051, 6410136 con el inhibidor publicado EMD63863.
La Figura 9 muestra la inhibición de la actividad de SGK1 en CMs transfectadas por Ad.SGK1-CA por el inhibidor 6410136.
Descripción Detallada
La presente invención se refiere al tratamiento del síndrome de QT Largo (genético o adquirido), por la inhibición de SGK1. La presente invención demuestra que la inhibición de SGK1 in vivo tiene un efecto protector y puede aliviar los síntomas asociados con el síndrome de QT Largo; puede reducir y aliviar los síntomas asociados con insuficiencia cardíaca, arritmia, lesión isquémica, infarto isquémico, fibrosis cardíaca, proliferación vascular, reestenosis, miocardiopatía dilatada genética o adquirida e insuficiencia del stent.
Síndrome de QT Largo
El síndrome de QT Largo puede ser genético (p. ej., provocado por una mutación en el gen KCNQ1, el gen KCNH2 o el gen SCN5a). Alternativamente, el síndrome de QT Largo no está asociado con una mutación genética y se adquiere como resultado de la exposición a un estímulo externo. Por ejemplo, el síndrome de QT Largo adquirido puede ser un efecto secundario de fármacos tales como eritromicina o haloperidol. El síndrome de QT Largo adquirido también se asocia con otras afecciones cardíacas tales como la isquemia miocárdica.
Miocardiopatía Dilatada
La miocardiopatía dilatada genética se caracteriza por una mutación en uno cualquiera de un cierto número de genes. A continuación, en la Tabla 1, se da una lista de genes que se sabe que están asociados con la miocardiopatía dilatada genética. La Tabla 1 está adaptada de Hershberger et al. J. Am. Coll. Cardiol. 19 de abril de 2011; 57(16) 1641-1649. Las miocardiopatías genéticas tratables mediante la invención descrita, es decir, mediante la inhibición de SGK1, incluyen las caracterizadas por una mutación enumerada en la Tabla 1.
Tabla 1. Genes asociados con la Miocardiopatía Dilatada Genética
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
La miocardiopatía dilatada adquirida se refiere a la miocardiopatía dilatada que tiene causas externas o ambientales y no es provocada por mutaciones genéticas. También es algo a lo que se alude como "insuficiencia cardíaca".
SGK1
La serina/treonina-proteína quinasa (SGK1) (también conocida como suero/quinasa regulada por glucocorticoides 1) es una proteína quinasa que desempeña un papel en la respuesta de una célula al estrés. In vivo, SGK1 activa determinados canales de potasio, sodio y cloruro. Por ejemplo, la proteína es conocida por regular el transportador de mio-inositol durante el estrés osmótico.
Inhibidores de SGK1
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "inhibidor de SGK1" se refiere a cualquier agente que pueda bloquear, detener, interferir con o reducir la actividad biológica de SGK1.
Inhibidores de SGK1 se conocen en la técnica y pueden incluir moléculas pequeñas. Aunque las moléculas pequeñas pueden tener cualquier peso molecular, generalmente incluyen moléculas que tienen menos de aproximadamente 5.000 dalton.
Por ejemplo, inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas se describen en el documento de EE.UU. 2008/0262096 por Mederski et al. El documento US 2008/0262096 describe compuestos de ácido escuárico de fórmula (A),
en los que
las variables R, R1, R1', R2 y X se definen en la memoria descriptiva como se describe a continuación:
Figure imgf000006_0001
en la que
R designa H o A,
R1, R1', cada uno independientemente entre sí, designan H, A, Hal, CN, NO2 , C(=O)A, CHO, CH(OH)A, NH2, NH(C=O)A, COOH, COOA o SO2NH2, CONH2 o CONA2,
R2 designa OH, OA, Hal, CF3 , NO2 o SO2NH2,
A designa alquilo no ramificado o ramificado que tiene 1-10 átomos de C, en el que 1-7 átomos de H pueden estar reemplazados por F,
X está ausente o designa CH2, CHA, CA2 o
Figure imgf000006_0002
Hal designa F, Cl, Br o I,
m designa 0, 1 o 2, y
n designa 1, 2, 3 o 4,
en que está excluida bis(4-hidroxifenilamino)ciclobut-3-eno-1,2-diona.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas también se han descrito en el documento de EE.UU. 2009/0221712 por Gericke et al. El documento US 2009/0221712 describe hidrazidas mandélicas de la Fórmula (B), en la que las variables R1-R11 se definen en la memoria descriptiva como se describe a continuación:
Figure imgf000006_0003
en la que
R1, R2, cada uno independientemente entre sí, designan H, CHO o acetilo,
R3, R4, R5, R6 , R7, R8, R9, R10, R11, cada uno independientemente entre sí, designan H, A, OSO2A, Hal, NO2, OR12, N(R12)2, CN, O-COA, -[C(R12)2]n COOR12, O-[C(R12)2]nCOOR12, SO3H, -[C(R12))2]n Ar, -CO-Ar, O-[C(R2 h]n Ar, -[C(R12)2]nHet, -[C(R12)2]nCECH, O-[C(R12)]nC-CH, -[C(R12)2]nCON(R12)2, -[C(R12)2]nCONR12N(R12)2 , O-[C(R12)2]nCON(R12)2, O-[C(R2)2]n CONR2N(R2)2 , NR12COA, NR12CON(R12)2, NR12SO2 A, N(SO2 A)2 , COR12, S(O)m Ar, SO2NR2 o S(O)mA,
R3 y R4 juntos también designan CH=CH-CH=CH,
R3 y R4, R7 y R8 o R8 y R9 juntos también designan alquileno que tiene 3, 4 o 5 átomos de C, en el que uno o dos grupos CH2 pueden estar reemplazados por oxígeno,
A designa alquilo no ramificado o ramificado que tiene 1 -6 átomos de C, en el que 1 -7 átomos de H pueden estar reemplazados por F, o alquilo cíclico que tiene 3-7 átomos de C,
Ar designa fenilo, naftilo o bifenilo, cada uno de los cuales está no sustituido o está mono-, di- o tri-sustituido con Hal, A, OR12, N(R12)2, NO2, CN, fenilo, CON(R12)2, NR12COA, NR12CON(R12)2 , NR12SO2 A, COR12 , SO2N(R12)2, S(O)mA, -[C(R12)2]n-COOR12 y/u -O[C(R12)2]n-COOR12,
Het designa un heterociclo mono- o bi-cíclico saturado, insaturado o aromático que tiene de 1 a 4 átomos de N, O y/o S, que puede estar mono-, di- o tri-sustituido con Hal, A, OR12, N(R12)2, NO2, CN, COOR12CON(R12)2, NR12COA, NR12SO2A, COR12, SO2NR12, S(O)mA, =S, =NR12y/u =O (oxígeno de carbonilo),
R12 designa H o A,
Hal designa F, Cl, Br o I,
m designa 0, 1 o 2,
n designa 0, 1,2 o 3, y
o designa 1,2 o 3.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas se han descrito, además, en el documento de EE.UU. 2008/0167380 por Gericke et al. El documento US 2008/0167380 describe acil hidrazidas de Fórmula (C), en la que R1-R9 se definen en la memoria descriptiva tal como se describe a continuación:
Figure imgf000007_0001
en la que
R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7, R8 y R9, cada uno independientemente entre sí, designan H, A, OSO2A, Hal, NO2, OR10, N(R10)2, CN, -[C(R10)2]nCOOR10, O-[C(R10)2]oCOOR10, SO3H, -[C(R10)2]nAr, -CO-Ar, O-[C(R10)2]nAr, -[C(R10)2]nHet, -[C(R10)2]nCECH, O-[C(R10)2]nCECH, -[C(R10)2]nCON(R10)2, -[C(R10)2]nCONR10N(R10)2 , O-[C(R10)2]nCON(R10)2, O-[C(R10)2]oCONR10N(R10)2, NR10COA, NR10CON(R10)2 , NR10SO2A, N(SO2A)2, COR10, S(O)mAr, SO2NR10 o S(O)mA, o
R1y R2, R2 y R3 , R3 y R4 o R4 y R5 juntos también designan CH=CH-CH=CH,
A designa alquilo no ramificado o ramificado que tiene 1 -6 átomos de C, en el que 1 -7 átomos de H pueden estar reemplazados por F, o alquilo cíclico que tiene 3-7 átomos de C,
Ar designa fenilo, naftilo o bifenilo, cada uno de los cuales está no sustituido o está mono-, di- o tri-sustituido con Hal, A, OR10, N(R10)2, NO2, CN, fenilo, CON(R10)2, NR10COA, NR10CON(R10)2, NR10SO2A, COR10, SO2N(R10)2, S(O)mA, -[C(R10)2]n-COOR10 y/u -O[C(R10)2]o-COOR10,
Het designa un heterociclo mono- o bi-cíclico saturado, insaturado o aromático que tiene de 1 a 4 átomos de N, O y/o S, que puede estar mono-, di- o tri-sustituidos con Hal, A, OR10, N(R10)2, NO2, CN, COOR10, CON(R10)2, NR10COA, NR10SO2A, COR10, SO2NR10 S(O)mA, =S, NR10 y/u =O (oxígeno de carbonilo),
R10 designa H o A,
Hal designa F, Cl, Br o I,
m designa 0, 1 o 2,
n designa 0, 1,2 o 3, y
o designa 1,2 o 3.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas también se describen en el documento de EE.UU. 2008/0234348 por Mederski et al. El documento US 2008/0234348 describe compuestos de ácido escuárico de la Fórmula (D), en los que R1, R2, R2', R2"y X se definen en la memoria descriptiva tal como se describe a continuación:
Figure imgf000007_0002
en la que
R1 designa H, A, Hal, CN, NO2, C(=O)A, CHO, CH(OH)A, NH2, NH(C=O)A, COOH, COOA, SO2NH2, CONH2, CONA2, (CH2)mAr o Het,
R2 designa o H, OA, Hal, CF3, SO2NH2, NHAc o NHSO2A, R2 ', R2", cada uno independientemente entre sí, indica H o Hal,
Ac designa acetilo,
Ar designa fenilo no sustituido o mono-, di- o tri-sustituido con Hal, A, OH, OA, NH2, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, NHCOA, NHCONH2, NHSO2A, SO2NH2 y/o S(O)mA,
Het designa furilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazolilo, tiazolilo o indolilo, cada uno de los cuales está no sustituido o está mono-, di- o tri-sustituido con A, Hal, OH y/u OA,
A designa alquilo no ramificado o ramificado que tiene 1-10 átomos de C, en el que 1-7 átomos de H pueden estar reemplazados por F,
X está ausente o designa CH2, CHA, CA2 o
Figure imgf000008_0001
Hal designa F, Cl, Br o I,
m designa 0, 1 o 2, y
n designa 1,2, 3 o 4.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas se describen adicionalmente en el documento de EE.UU. 2009/0253767 por Klein et al. El documento US 2009/0253767 describe derivados de aminoindazolilurea de Fórmula (E), en la que R1, R2, R3, R4, R5, X e Y se definen en la memoria descriptiva como se describe a continuación:
Figure imgf000008_0002
en la que
R1, R2 , cada uno independientemente entre sí, designan H, A, -[C(R7)2]nAr, -[C(R7)2]nHet, -COHet o -COAr,
R3, R4, R5 , cada uno independientemente entre sí, designan H, A, Hal, OH, OA, -[C(R7)2]nAr, -[C(R7)2]nHet, OAr, OHet, SH, SA, SAr, SHet, NH2, NHA, NAA', NHAr, N(Ar)2, NHHet, N(Het)2, NAAr, NAHet, SOA, SOAr, SOHet, SO2A, SO2Ar, SO2Het, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr, COHet, SO3H, SO2NH2, SO2NHAr, SO2N(Ar)2, SO2NHHet o SO2N(Het)2,
X designa -CR7 R8-, -CR7R8CR9R1- o -CR7R8C(OR9)R10-
Y designa Ar o Het,
R7, R8 , R9, R10, cada uno independientemente entre sí, designan H o A,
R11 designa alquilo con 1-6 átomos de C, en que 1-5 átomos de H pueden estar reemplazados por F,
A, A', cada uno independientemente entre sí, designan alquilo que tiene 1 -10 átomos de C, que no está sustituido o está mono-, di- o tri-sustituido con R3, =S, =NR7 y/u =O (oxígeno de carbonilo) y en donde uno, dos o tres grupos CH2 pueden estar reemplazados por O, S, SO, SO2, NH, NR11 y/o por grupos -CH=CH- y/o, además, 1-7 átomos de H pueden estar reemplazados por F y/o Cl, o alquilo cíclico que tiene 3-7 átomos de C,
Ar designa fenilo, naftilo o bifenilo, cada uno de los cuales está no sustituido o está mono-, di-, tri- o tetra-sustituido con A, Hal, OH, OA, Ar', OAr', Het, OHet, SH, SA, SAr', SHet, NH2, NHA, NAA', NHAr', N(Ar')2, NHHet, N(Het)2, NAAr', NAHet, SOA, SOAr', SOHet, SO2A, SO2Ar', SO2Het, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr', COHet, SO3H, SO2NH2, SO2NHAr', SO2N(Ar')2, SO2NHHet y/o SO2N(Het)2,
Het designa un heterociclo mono- o bi-cíclico, insaturado o saturado, o aromático, que tiene 1 a 4 átomos de N, O y/o S, que puede estar mono-, di- o tri-sustituido con A, Hal, OH, OA, Ar, OAr, Het', OHet', SH, SA, SAr', SHet', NH2, NHA, NAA', NHAr, N(Ar')2, NHHet', N(Het')2, NAAr', NAHet', SOA, SOAr', SOHet', SO2A, SO2Ar', SO2Het', NO2 , CN, COOH, COOA, CONH2 , CONHA, CONA2 , NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr', COHet', SO3H, SO2NH2, SO2NHAr', SO2N(Ar')2, SO2NHHet' o SO2N(Het')2, =S, =NR7 y/u =O (oxígeno de carbonilo),
Ar' designa fenilo, que está no sustituido o está mono-, di-, tri- o tetra-sustituido con A, Hal, OH, OA, O-fenilo, SH, SA, NH2, NHA, NAA', NH-fenilo, SOA, SO-fenilo, SO2A, SO2-fenilo, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, CO-fenilo, SO3H, SO2NH2, SO2NH-fenilo y/o SO2N(fenilo)2,
Het' designa un heterociclo mono- o bi-cíclico, saturado, insaturado o aromático que tiene de 1 a 4 átomos de N, O y/o S, que pueden estar mono-, di- o tri-sustituido con A, Hal, OH, OA, NH2, NHA, NAA', SOA, SOAr', SO2A, SO2AC NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr', SO3H, SO2NH2, SO2NHAr', SO2N(Ar')2, =S, =NR7 y/u =O (oxígeno de carbonilo),
Hal designa F, Cl, Br o I, y
n designa 0, 1 o 2.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas también se describen en el documento de EE.UU. 2010/0063115 por Klein et al. El documento US 2010/0063115 describe derivados de aminoindazolilurea de Fórmula (F), en la que L, X, Y, R3 , R4 y R5 se describen en la memoria descriptiva:
Figure imgf000009_0001
en la que
L designa R1, R2 o -(X)mR3,
X designa CR7R8 , CR7R8CR9R10, CR7 R8C(OR9)R10, NR7, O, NR6CR7 R8, CR7 R8NR9, OCR7 R8, OCR7R8CR9R10, CR7 R8O, CR7R8CR9R10O, NR6CR7R8CR9R10, CR7 R8SO2, NR7CONR8 , NR7CONR8CR9 R10, COCR7 R8 , CONR7 , CONR7CR8R9 , NR7CR8 R9CONR10, NR7CO o NR7COCR8R9,
Y designa H, A, Ar o Het,
R1 designa CR9=CR9R10 o CR12=CR13R14,
R2 designa Ce CR12 o C=C-Het,
R3, R4, R5 , cada uno independientemente entre sí, designan H, A, Hal, OH, OA, -[C(R7)2]nAr, -[C(R7)2]nHet, OAr, OHet, S H, SA, SAr, SHet, NH2, NHA, NAA', NHAr, N(Ar)2, NHHet, N(Het)2, NAAr, NAHet, SOA, SOAr, SOHet, SO2A, SO2Ar, SO2Het, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr, COHet, SO3H, SO2NH2, SO2NHAr, SO2N(Ar)2, SO2NHHet o SO2N(Het)2,
R6, R7 , R8, R9, R10, cada uno independientemente entre sí, designan H o A,
R11 designa alquilo que tiene 1-6 átomos de C, en el que 1-5 átomos de H pueden estar reemplazados por F, R12, R13, R14, cada uno independientemente entre sí, designan H o Ar,
A, A', cada uno independientemente entre sí, designan alquilo que tiene 1 -10 átomos de C, que está no sustituido o está mono-, di- o tri-sustituido con R3 , =S, =NR7 y/u =O (oxígeno de carbonilo) y en el que uno, dos o tres grupos CH2 pueden estar reemplazados por O, S, SO, SO2 , NH, NR11 y/o por grupos -CH=CH y/o, además, 1-7 átomos de H pueden estar reemplazados por F y/o Cl,
o alquilo cíclico que tiene 3-7 átomos de C,
Ar designa fenilo, naftilo o bifenilo, cada uno de los cuales está no sustituido o está mono-, di-, tri- o tetra-sustituido con A, Hal, OH, OA, Ar', OAr', Het, OHet, S H, SA, SAr', S Het, NH2, NHA, NAA', NHAr', N(Ar')2, NHHet, N(Het)2, NAAr', NAHet, SOA, SOAr', SOHet, SO2A, SO2Ar', SO2Het, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr', COHet, 50aH, SO2NH2, SO2NHAr', SO2N(A^)2, SO2NHHet y/o SO2N(Het)2,
Het designa un heterociclo mono- o bi-cíclico, saturado, insaturado o aromático que tiene de 1 a 4 átomos de N, O y/o S, que pueden estar mono-, di- o tri-sustituidos con A, Hal, OH, OA, Ar, OAr, Het', OHet', SH, SA, SAr', SHet', NH2, NHA, NAA', NHAr', N(Ar')2, NHHet', N(Het')2, NAAr', NAHet', SOA, SOAr', SOHet', SO2A, SO2Ar', SO2Het, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr', COHet', SO3H, SO2NH2, SO2NHAr', SO2N(Ar')2, SO2NHHet' o SO2N(Het')2, =S, =NR7 y/u =O (oxígeno de carbonilo),
Ar' designa fenilo, que está no sustituido o está mono-, di-, tri- o tetra-sustituido con A, Hal, OH, OA, O-fenilo, SH, SA, NH2, NHA, NAA', NH-fenilo, SOA, SO-fenilo, SO2A, SO2-fenilo, NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, CO-fenilo, SO3H, SO2NH2, SO2NH-fenilo y/o SO2N(fenilo)2,
Het' designa un heterociclo mono- o bi-cíclico, saturado, insaturado o aromático que tiene de 1 a 4 átomos de N,
O y/o S, que pueden estar mono-, di- o tri-sustituidos con A, Hal, OH, OA, NH2, NhA, NAA', SOA, SOAr', SO2A, SO2Ar', NO2, CN, COOH, COOA, CONH2, CONHA, CONA2, NHCOA, NACOA, NHCONH2, NHCONHA, NHCONA2, NHSO2A, NASO2A, CHO, COA, COAr', SO3H, SO2NH2, SO2NHAr', SO2N(Ar')2, =S, =NR7 y/u =O (oxígeno de carbonilo),
Hal designa F, Cl, Br o I,
m designa 0, 1,2 o 3, y
n designa 0, 1 o 2.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas se describen aún adicionalmente en el documento WO 2008/021725 por Drewry et al. El documento WO 2008/021725 describe derivados de piridina isoquinolina de fórmula (G) en la que X, Y y
R se definen en la memoria descriptiva:
Figure imgf000010_0001
en la que
X es O o S
Y es O o S
R se selecciona de:
Figure imgf000010_0002
(CH2)nR1, en donde n es 1,2 o 3 y R1 es arilo;
heteroarilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C3 y oxo; y
arilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste
en alquilo d-3, alcoxi d-3, halo, haloalquilo Cr3, hidroxialquilo d-3, -C(O)NH2, -OH, -CN, hal (CH2)pS(O)2NH2 y -(CH2)qNRaRb; en donde:
p es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
q es 1,2, 3, 4, 5 o 6;
Ra es H o alquilo C1-3 ; y
Rb es H o alquilo C1-3.
Inhibidores de SGK1 de moléculas pequeñas adicionales pueden incluir compuestos de la Fórmula 1:
Figure imgf000010_0003
en donde
n es 1,2, 3, 4 o 5; cada uno de los R se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un halógeno, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6, haloalcoxi C1-C6, CN, CO2H, CO2(alquilo C1-C6),
CO2(haloalquilo C1-C6), -OH, -NH2, -NH(alquilo C1-C6), -N(alquilo Ci-C6)2 , -SH y -S(alquilo C1-C6); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Algunos ejemplos de pequeñas moléculas inhibidoras de la SGK1 son
Figure imgf000011_0001
y/o
Figure imgf000011_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Estos tres compuestos fueron adquiridos de ChemBridge (San Diego, CA) (números de catálogo 5377051 para 1A, 1B 6333540 para, y 6347949 para 1C).
Ejemplos adicionales de inhibidores de SGK1 pueden incluir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen selectivamente a una proteína SGK1. El término "anticuerpo" pretende abarcar todos los tipos de anticuerpos policlonales y monoclonales (p. ej,, anticuerpos humanos, quiméricos, humanizados, primatizados, revestidos, de cadena sencilla, de dominio (dAbs)) y fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos (p. ej., Fv, Fc, Fd, Fab, Fab', F(ab'), dAb). (Véase, p. ej., Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). En una realización particular, un anticuerpo específico para SGK1 es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. Anticuerpos específicos para SGK1 también pueden enlazarse directa o indirectamente a un agente citotóxico.
Se han producido varios anticuerpos que se unen selectivamente a SGK1 y están disponibles comercialmente (p. ej. de Abcam®, Cell Signaling Technology®, EMD Millipore, Sigma-Aldrich®, y Santa Cruz Biotechnology, Inc.).
Otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que pueden servir como inhibidores de SGK1 también pueden producirse, construirse, modificarse por ingeniería genética y/o aislarse por métodos convencionales u otras técnicas adecuadas. Por ejemplo, anticuerpos que son específicos para una proteína SGK1 (y, por lo tanto, sirven como inhibidores de SGK1) se pueden generar contra un inmunógeno apropiado, tal como una proteína SGK1 recombinante de mamífero (p. ej., ser humano) o una porción de la misma (incluyendo moléculas sintéticas, p. ej., péptidos sintéticos). Se ha descrito una diversidad de métodos (véase, p. ej., Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975 ) y Eur. J. Immunol .6: 511-519 (1976 ); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., Patente de e E.UU. N° 4.172.124; Harlow, E. y D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano '94), Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: Nueva York, NY), Capítulo 11, (1991)).
Los anticuerpos también se pueden producir mediante la inmunización de un huésped adecuado (p. ej., ratón) con células que expresan SGK1 (p. ej,, células/líneas celulares cardiovasculares) o células modificadas por ingeniería genética para expresar SGK1 (p. ej., células transfectadas). (Véase, p. ej., Chuntharapai et al., J. Immunol., 152:1783-1789 (1994); Chuntharapai et al. Patente de EE.UU. N° 5.440.021). Para la producción de anticuerpos monoclonales, se puede producir un hibridoma condensando una línea celular inmortal adecuada (p. ej., una línea celular de mieloma tal como SP2/0 o P3X63Ag8.653) con células productoras de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos se pueden obtener de la sangre periférica o, preferiblemente, del bazo o de los ganglios linfáticos, de seres humanos u otros animales adecuados inmunizados con el antígeno de interés. Las células condensadas (hibridomas) pueden aislarse utilizando condiciones de cultivo selectivas y clonarse mediante dilución limitada. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden seleccionarse mediante un ensayo adecuado (p. ej., ELISA).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir por escisión enzimática o por técnicas recombinantes. Por ejemplo, la escisión de papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. También se pueden utilizar otras proteasas con la especificidad para el sustrato requerida para generar fragmentos Fab o F(ab')2. Los anticuerpos también se pueden producir en una diversidad de formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o más codones de parada aguas arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de cadena pesada de F(ab')2 puede ser diseñado para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región de bisagra de la cadena pesada. Los anticuerpos de cadena sencilla y los anticuerpos humanos, quiméricos, humanizados o primatizados (injertados con CDR) o revestidos, así como los anticuerpos de cadena sencilla quiméricos, injertados con CDR o revestidos, que comprenden porciones derivadas de diferentes especies, y similares también están abarcados por la presente invención y el término "anticuerpo". Las diversas porciones de estos anticuerpos se pueden unir químicamente mediante técnicas convencionales o se pueden preparar como una proteína contigua utilizando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una cadena quimérica o humanizada pueden expresarse para producir una proteína contigua. Véase, p. ej., Cabilly et al., Patente de EE.UU. N° 4.816.567; Cabilly et al., Patente europea N° 0.125.023 B1; Boss et al., Patente de EE.UU. N° 4.816.397; Boss et al., Patente europea N° 0.120.694 B1; Neuberger, M.S. et al., documento WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., Patente europea N° 0.194.276 B1; Winter, Patente de EE.UU. N° 5.225.539; Winter, Patente europea N° 0.239.400 B1; Queen et al., Patente europea N° 0451 216 B1; y Padlan, E.A. et al., EP 0519596 A1. Véase también, Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), con respecto al anticuerpo primatizado, y Ladner et al., Patente de Estados Unidos N° 4.946.778 y Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)) con respecto a los anticuerpos de cadena sencilla.
Los anticuerpos humanizados pueden producirse utilizando tecnología de ADN sintético o recombinante utilizando métodos estándares u otras técnicas adecuadas. Las secuencias de ácido nucleico (p. ej., ADNc) que codifican regiones variables humanizadas también se pueden construir utilizando métodos de mutagénesis por PCR para alterar secuencias de ADN que codifican una cadena humana o humanizada, tal como un molde de ADN de una región variable previamente humanizada (véase, p. ej., Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K. et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B.L .et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); y Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)). Utilizando estos u otros métodos adecuados, también se pueden producir fácilmente variantes. En una realización, se pueden mutar regiones variables clonadas (p. ej., dAbs) y se pueden seleccionar secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada (p. ej., de una fagoteca; véase, p. ej., Krebber et al., documento US 5.514.548; Hoogenboom et al., documento WO 93/06213, publicado el 1 de abril de 1993).
Se pueden utilizar otros métodos adecuados para producir o aislar anticuerpos de la especificidad requerida, incluyendo, por ejemplo, métodos que seleccionan un anticuerpo recombinante o fragmento de unión a anticuerpo (p. ej., dAb) de una colección (p. ej., una colección de presentación de fagos), o que se basan en la inmunización de animales transgénicos (p. ej., ratones). Animales transgénicos capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos son bien conocidos en la técnica (p. ej., Xenomouse® (Abgenix, Fremont, CA)) y pueden producirse utilizando métodos adecuados (véase, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Lonberg et al., Patente de EE.UU. N° 5.545.806; Surani et al., Patente de EE.UU. 5.545.807; Lonberg et al., documento WO 97/13852).
Los inhibidores de SGK1 son también agentes que inhiben (reducen, disminuyen, evitan, bloquean, detienen o interfieren con) la expresión de una proteína SGK1. En una o más realizaciones, el inhibidor de SGK1 es un miARN, un ARNip; un ARNhc; un ARNdc; o un ARN antisentido dirigido al ADN SGK1 o ARNm; un polinucleótido que codifica el miARN, ARNip; ARNhc; ARNdc; o ARN antisentido; o un equivalente de cada uno de ellos.
Agentes (moléculas pequeñas, péptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos) que inhiben la expresión del gen SGK1 (p. ej., transcripción, procesamiento de ARNm, traducción) pueden ser inhibidores eficaces de SGK1. Por ejemplo, ácidos ribonucleicos pequeños de interferencia (ARNip) y, de manera similar, ácidos ribonucleicos cortos de la horquilla (ARNhc) que se procesan en moléculas de tipo ARNip cortos en una célula, pueden prevenir la expresión (traducción) de la proteína SGK1. Las moléculas de ARNip pueden ser polinucleótidos que generalmente tienen una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 nucleótidos y están diseñadas para unirse a una secuencia de ARN específica (p. ej., ARNm de SGK1). Los ARNip silencian la expresión génica de una manera específica para la secuencia, uniéndose a un ARN diana (p. ej., un ARN que tiene la secuencia complementaria) y provocando que el ARN sea degradado por endorribonucleasas. Moléculas de ARNip capaces de inhibir la expresión del producto del gen SGK1 pueden producirse mediante métodos adecuados. Existen varios algoritmos que pueden utilizarse para diseñar moléculas de ARNip que se unen a la secuencia de un gen de interés (véase, p. ej., Mateeva O. et al. Nucleic Acids Res. 35(8): Epub, 2007; Huesken D. et al., Nat. Biotechnol.23:995-1001; Jagla B. et al., RNA 11: 864-872, 2005; Shabalinea S.A. b Mc Bioinformatics 7:65, 2005; Vert J.P. et al. BMC Bioinformatics 7: 520, 2006). Se encuentran disponibles vectores de expresión que pueden expresar de manera estable ARNip o ARNhc. (Véase, p. ej., Brummelkamp, T.R., Science 296: 550-553, 2002, Lee, N.S., et al., Nature Biotechnol. 20: 500-505, 2002; Miyagishi, M. y Taira, K. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; Paddison, P.J., et al., Genes & Dev. 16:948-958, 2002; Paul, C.P., et al., Nature Biotechnol. 20: 505-508; 2002; Sui, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520, 2002; Yu, J.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002; Elbashir, S.M., et al., Nature 411:494-498, 2001).
Los "ARN de interferencia cortos" (ARNip) se refieren a moléculas de ARN de doble cadena (ARNdc), generalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que son capaces de mediar en la interferencia de ARN (ARNi). "Interferencia de ARN" (ARNi) se refiere a la supresión de la expresión génica específica para la secuencia o específica para el gen (síntesis de proteínas) que está mediada por ARN de interferencia corto (ARNip). Tal como se utiliza en esta memoria, el término ARNip incluye ARN corto de la horquilla (ARNhc). Un ARNip dirigido a un gen o al ARNm de un gen puede ser un ARNip que reconoce el ARNm del gen y dirige un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) al ARNm, lo que conduce a la degradación del ARNm. Un ARNip dirigido a un gen o al ARNm de un gen también puede ser un ARNip que reconoce el ARNm e inhibe la traducción del ARNm. Un ARNip puede modificarse químicamente para aumentar su estabilidad y seguridad. Véase, p. ej., Dykxhoorn y Lieberman (2006) Annu. Rev. Biomed. Ing. 8:377-402 y la Publicación de Solicitud de Patente de Ee .UU. N°: 2008/0249055.
"ARNs de doble cadena" (ARNdc) se refieren a moléculas de ARN de doble cadena que pueden tener cualquier longitud y pueden escindirse intracelularmente en moléculas de ARN más pequeñas, tales como ARNip. En células que tienen una respuesta de interferón competente, el ARNdc más largo, tal como los de más de aproximadamente 30 pares de bases de longitud, puede desencadenar la respuesta de interferón. En otras células que no tienen una respuesta de interferón competente, el ARNdc puede utilizarse para desencadenar ARNi específico.
"MicroARN" (miARN) se refieren a moléculas de ARN de cadena sencilla de 21 -23 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión génica. Los miARNs son codificados por genes a partir de cuyo ADN se transcriben, pero los miARNs no se traducen en proteína (ARN no codificante); en cambio, cada una de las transcripciones primarias (un pri-miARN) se procesa en una estructura corta de tallo-bucle denominada pre-miARN y finalmente en un miARN funcional. Las moléculas de miARN maduras son parcialmente complementarias a una o más moléculas de ARN mensajero (ARNm) y su función principal es regular a la baja la expresión génica.
ARNip, ARNdc y miARN para inhibir la expresión de genes SGK1 se pueden diseñar siguiendo procedimientos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Dykxhoorn y Lieberman (2006) Annu. Rev. Biomed. Eng. 8:377-402; Dykxhoorn et al. (2006) Gene Therapy 13:541-52; Aagaard y Rossi (2007) Adv. Drug Delivery Rev. 59:75-86; de Fougerolles et al. (2007) Nature Reviews Drug Discovery 6:443-53; Krueger et al. (2007) Oligonucleotides 17:237-250; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2008/0188430; y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2008/0249055.
El suministro de ARNip, ARNdc o miARN a una célula se puede realizar con métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Dykxhoorn y Lieberman (2006) Annu. Rev. Biomed. Eng. 8:377-402; Dykxhoorn et al. (2006) Gene Therapy 13:541-52; Aagaard y Rossi (2007) Adv. Drug Delivery Rev. 59:75-86; de Fougerolles et al. (2007) Nature Reviews Drug Discovery 6:443-53 ; Krueger et al. (2007) Oligonucleotides 17:237-250; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2008/0188430; y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 2008/0249055.
Oligonucleótidos antisentido (p. ej., ARN, ADN, ribosondas) también se pueden utilizar como inhibidores de SGK1 para inhibir la expresión de SGK1. Los oligonucleótidos antisentido son generalmente ácidos nucleicos de cadena sencilla cortos (~ 13 a ~ 25 nucleótidos) que se hibridan específicamente a una secuencia de ácido nucleico diana (p. ej., ^RNm o ADN) e inducen la degradación del ácido nucleico diana (p. ej., degradación del ARN a través de mecanismos dependientes de RNasa H) u obstaculizan estéricamente la progresión de la maquinaria de corte y empalme o de la traducción. (Véase, p. ej., Dias N. y Stein C.A., Mol. Can. Ther. 1:347-355, 2002). Hay un cierto número de diferentes tipos de oligonucleótidos antisentido que pueden utilizarse como inhibidores de SGK1, incluyendo oligonucleótidos de metilfosfonato, oligonucleótidos de fosforotioato, oligonucleótidos que tienen un hidrógeno en la posición 2' de la ribosa reemplazado por un grupo O-alquilo (p. ej., un metilo), ácido nucleico de poliamida (PNA), oligómeros de fosforodiamidato morfolino (el resto desoxirribosa se reemplaza por un anillo de morfolina), PN (reemplazo N 3 '^ P5' del oxígeno en la posición 3' de la ribosa por un grupo amina) y oligonucleótidos quiméricos (p. ej., 2'-O-metilo/fosforotioato). Se pueden diseñar oligonucleótidos antisentido para que sean específicos para una proteína SGK1 utilizando algoritmos predictivos. (Véase, p. ej., Ding, Y. y Lawrence, C.E., Nucleic Acids Res., 29:1034-1046, 2001; Sczakiel, G., Front. Biosci., 5:D194-D201, 2000; Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res., 28:2455-2461, 2000; Patzel, V., et al. Nucleic Acids Res., 27:4328-4334, 1999; Chiang, M.Y., et al., J. Biol. Chem., 266:18162-18171, 1991; Stull, R.A., et al., Nucleic Acids Res., 20:3501-3508, 1992; Ding, Y. y Lawrence, C.E., Comput. Chem., 23:387-400,1999; Lloyd, B.H., et al., Nucleic Acids Res., 29:3664-3673, 2001; Mir, K.U., y Southern, E.M., Nat. Biotechnol., 17:788-792,1999; Sohail, M., et al., Nucleic Acids Res., 29:2041-2051, 2001; Altman, R.K., et al., J. Comb. Chem., 1:493-508, 1999). Los oligonucleótidos antisentido se pueden producir mediante métodos adecuados; por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos (p. ej., ADN, ARN, PNA) utilizando un sintetizador automático de ácidos nucleicos (p. ej., de Applied Biosystems) (véase también Martin, P., Helv. Chim. Acta 78:486-504, 1995). Los oligonucleótidos antisentido también se pueden expresar de forma estable en una célula que contiene un vector de expresión apropiado.
Células diana (p. ej., células cardíacas) pueden captar oligonucleótidos antisentido mediante el proceso de endocitosis por adsorción. Por lo tanto, en el tratamiento de un sujeto (p. ej., mamífero), se pueden suministrar oligonucleótidos SGK1 antisentido a células diana (p. ej., miocitos cardíacos y/u otras células cardíacas) mediante, por ejemplo, inyección o infusión. Por ejemplo, los oligonucleótidos purificados o ARNip/ARNhc pueden administrarse solos o en una formulación con un vehículo de suministro de fármacos adecuado (p. ej., liposomas, polímeros catiónicos (p. ej., dendrímeros de poli-L-lisina PAMAM, nanopartículas de polialquilcianoacrilato y polietilenimina) o acoplado a un péptido de soporte adecuado (p. ej., factor de transcripción homeótico, el péptido Antennapedia, proteína Tat del VIH-1, péptido E5CA).
Se apreciará que los oligonucleótidos se pueden hacer utilizando bases no estándares (p. ej., aparte de adenina, citidina, guanina, timina y uridina) o estructuras de cadena principal no estándares para proporcionar propiedades deseables (p. ej., aumento de resistencia a nucleasa, unión más estrecha, estabilidad o una Tm deseada). Técnicas para hacer que los oligonucleótidos sean resistentes a las nucleasas incluyen las descritas en la publicación PCT WO 94/12633. Se puede producir una amplia diversidad de oligonucleótidos modificados útiles, incluyendo oligonucleótidos que tienen una cadena principal de péptido-ácido nucleico (PNA) (Nielsen et al. (1991) Science 254: 1497) o que incorporan 2'-O-metil ribonucleótidos, nucleótidos de fosforotioato, nucleótidos de metil fosfonato, nucleótidos de fosfotriéster, nucleótidos de fosforotioato, fosforamidatos. Otro ejemplo de la modificación es el reemplazo de un átomo de oxígeno fosforílico no puenteante por un átomo de azufre que aumenta la resistencia a la digestión por nucleasas. También se puede lograr una estabilidad incrementada de polinucleótidos antisentido utilizando moléculas con cadenas principales sustituidas con 2-metioxietilo. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N°s 6.451.991 y 6.900.187.
También se pueden utilizar ribozimas como inhibidores de SGK1 para inhibir la expresión de SGK1. Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen actividad enzimática. Una clase de ribozimas es capaz de escindir repetidamente otras moléculas de ARN separadas en dos o más trozos de una manera específica para la secuencia de bases de nucleótidos. Véase Kim et al., Proc Natl Acad Sci USA, 84:8788 (1987); Haseloff y Gerlach, Nature, 334:585 (1988); y Jefferies et al., Nucleic Acid Res, 77: 1371 (1989). Ribozimas de este tipo tienen típicamente dos dominios funcionales: un dominio catalítico y una secuencia de unión que guía la unión de ribozimas a un ARN diana a través del apareamiento de bases complementarias. Una vez que una ribozima diseñada específicamente se une a un ARNm diana, escinde enzimáticamente el ARNm diana, lo que típicamente reduce su estabilidad y destruye su capacidad para traducir directamente una proteína codificada. Después de que una ribozima ha escindido su ARN diana, se libera de ese ARN diana y, posteriormente, puede unirse y escindir otra diana. Es decir, una sola molécula de ribozima puede unirse y escindir repetidamente nuevas dianas.
De acuerdo con la presente invención, una ribozima puede fijar como objetivo cualquier parte del ARNm que codifica SGK1. Métodos para seleccionar una secuencia diana de ribozimas y diseñar y fabricar ribozimas son generalmente conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. N° 4.987.071; 5.496.698; 5.525.468; 5.631.359; 5.646.020; 5.672.511; y 6.140.491. Por ejemplo, ribozimas adecuadas pueden diseñarse en diversas configuraciones tales como motivos de cabeza de martillo, motivos de horquilla de pelo, motivos del virus de la hepatitis delta, motivos del intrón del grupo I o motivos del ARN de la ARNasa P. Véanse, p. ej., las Pat. de EE.UU. N° 4.987.071; 5.496.698; 5.525.468; 5.631.359; 5.646.020; 5.672.511; y 6.140.491; Rossi et al., AIDS Res Human Retroviruses 8:183 (1992); Hampel & Tritz, Biochemistry 28: 4929 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res, 18:299 (1990); Perrotta & Been, Biochemistry 31:16 (1992); y Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849 (1983).
Las ribozimas se pueden sintetizar mediante los mismos métodos utilizados para la síntesis normal de ARN. Por ejemplo, se describen métodos adecuados en Usman et al., J Am Chem Soc, 109:7845-7854 (1987) y Scaringe et al., Nucleic Acids Res, 18:5433-5441 (1990). Las ribozimas modificadas se pueden sintetizar mediante los métodos descritos, p. ej., en la Pat. de EE.UU. N° 5.652.094; Publicaciones Internacionales N°s WO 91/03162; WO 92/07065 y WO 93/15187; Solicitud de Patente Europea N° 92110298.4; Perrault et al., Nature, 344:565 (1990); Pieken et al., Science, 253:314 (1991); y Usman & Cedergren, Trends Biochem Sci, 17:334 (1992).
Configuraciones de "ribozimas triplex" permiten una escisión incrementada de la diana en relación con las ribozimas expresadas convencionalmente. Ejemplos de ribozimas triplex incluyen ribozimas de la horquilla y ribozimas de cabeza de martillo. Métodos para preparar y utilizar ribozimas triplex se encuentran, p. ej., en Aguino-Jarguin et al. (2008) Oligonucleotides 18(3):213-24 y Publicación de Solicitud de Patente de EE.u U. N° 2005/0260163.
Se han descrito proteínas que tienen la capacidad de translocar ácidos nucleicos deseados a través de una membrana celular. Típicamente, proteínas de este tipo tienen subsecuencias anfifílicas o hidrófobas que tienen la capacidad de actuar como soportes de translocación de membrana. Por ejemplo, las proteínas del homeodominio tienen la capacidad de translocarse a través de las membranas celulares. Se encontró que el péptido internalizable más corto de una proteína homeodominio, Antennapedia, era la tercera hélice de la proteína, desde la posición de aminoácido 43 a 58 (véase, p. ej., Prochiantz (1996) Current Opinion in Neurobiology 6:629-634. Otra subsecuencia, el dominio h (hidrófobo) de péptidos señal, se encontró que tiene características de translocación de la membrana celular similares (véase, p. ej., Lin et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:14255-14258). Subsecuencias de este tipo pueden utilizarse para translocar oligonucleótidos a través de una membrana celular. Los oligonucleótidos se pueden derivar convenientemente con secuencias de este tipo. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador para enlazar los oligonucleótidos y la secuencia de translocación. Se puede utilizar cualquier enlazador adecuado, p. ej., un enlazador peptídico o cualquier otro enlazador químico adecuado.
La presente invención proporciona, en una realización, un polipéptido señuelo que imita a un dominio necesario para la acción de SGK1. Un polipéptido señuelo de una proteína para inhibir la interacción entre la proteína y un sustrato es un polipéptido que se une al sustrato pero no lleva a cabo la actividad biológica que normalmente llevaría a cabo una unión de este tipo. En una realización, un polipéptido señuelo es un fragmento de la proteína SGK1. Por ejemplo, un polipéptido señuelo puede comprender un fragmento de 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-45 o más de 45 aminoácidos del mismo que regula el transportador de mio-inositol durante el estrés osmótico. Un polipéptido señuelo también puede surgir de otras modificaciones de una proteína SGK1, por ejemplo, mediante glicosilación o fosforilación, o diseñando sistemas similares que imitan péptidos, tales como el uso de peptoides, D-aminoácidos o ppéptidos. Un péptido señuelo que imita la proteína SGK1 también puede surgir de una alteración de la cadena principal de SGK1. Inhibidores de SGK1 también pueden incluir un ADNc o ARNm que codifica una porción o la secuencia codificante completa de SGK1 que ha sido mutada de una manera que interferirá con o inhibirá la actividad de la SGK1 endógena, una construcción comúnmente denominada "dominante negativo".
Los inhibidores de SGK1 descritos en esta memoria para un uso terapéutico se pueden administrar con un soporte farmacéutico aceptable. "Soportes farmacéuticos" aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir, pero no se limitan a cualquiera de los soportes farmacéuticos estándares, tales como solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Soportes farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes que no interactúan con el inhibidor de SGK1. Pueden emplearse técnicas de formulación farmacéutica estándares, tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Soportes farmacéuticos adecuados para administración parenteral incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, solución salina bacteriostática (solución salina que contiene aproximadamente 0,9% mg/ml de alcohol bencílico), solución salina tamponada con fosfato, solución de Hank, lactato de Ringer y similares. Las formulaciones también pueden incluir pequeñas cantidades de sustancias que potencian la eficacia del ingrediente activo (p. ej., agentes emulsionantes, solubilizantes, tamponadores del pH, humectantes). Se conocen en la técnica métodos de composiciones de encapsulación (tales como en un recubrimiento de gelatina dura o ciclodextrano). Para la inhalación, el agente se puede solubilizar y cargar en un dispensador adecuado para su administración (p. ej., un atomizador o nebulizador o un dispensador de aerosol presurizado).
Agentes que tienen especificidad para la unión a SGK1, incluyendo moléculas pequeñas, o cualquier otro inhibidor de SGK1 descrito en esta memoria se pueden identificar en una selección, por ejemplo, una selección de alto rendimiento de compuestos químicos y/o colecciones (p. ej., colecciones de compuestos químicos, péptidos, ácidos nucleicos). Los compuestos o moléculas pequeñas se pueden identificar a partir de numerosas colecciones disponibles de compuestos químicos, por ejemplo, del Repositorio Químico del National Cancer Institute y el Repositorio de Moléculas Pequeñas de Colecciones Moleculares (PubChem), así como las colecciones del Instituto de Química y Biología Celular de la Universidad de Harvard y otras colecciones que están disponibles de fuentes comerciales (p. ej., Chembridge, Peakdale, CEREP, MayBridge, Bionet). Bibliotecas o colecciones de moléculas de este tipo también se pueden preparar utilizando métodos químicos bien conocidos, tales como métodos bien conocidos de química combinatoria. Las colecciones se pueden seleccionar para identificar compuestos que se unen a e inhiben SGK1. Los compuestos identificados pueden servir como compuestos principales para una diversificación adicional utilizando métodos bien conocidos de química médica. Por ejemplo, una colección de compuestos que son variantes estructurales del plomo puede prepararse y seleccionarse para la unión de SGK1 y/o actividad inhibidora. Esto puede resultar en el desarrollo de una relación estructura-actividad que vincula la estructura de los compuestos a la actividad biológica. Compuestos que tienen una actividad inhibidora y de unión adecuada se pueden desarrollar adicionalmente para uso in vivo. Ensayos adecuados para SGK1 se describen, por ejemplo, en el Ejemplo 3 del documento US 2008/0234348 (Mederski et al.), documento WO 2008/021725 (Drewry et al.) y documento Wo 2005/106491 (Golz et al.).
El término "tratamiento" quiere dar a entender la administración de una composición farmacéutica para el propósito de tratamiento terapéutico al reducir, aliviar o revertir al menos un efecto o síntoma adverso.
El término "administrar" significa proporcionar al sujeto una cantidad eficaz del inhibidor de SGK1, eficaz para tratar una enfermedad o afección en el sujeto. Métodos de administración de composiciones farmacéuticas son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a microinyección, administración intravenosa o parenteral. Las composiciones están destinadas a la administración sistémica, tópica, oral o local, así como por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular. La administración puede realizarse de forma continua o intermitente durante el curso del tratamiento. Métodos para determinar los medios y dosis de administración más efectivos son bien conocidos por los expertos en la técnica y variarán con el vector utilizado para la terapia, el polipéptido o la proteína utilizado para la terapia, el propósito de la terapia, la célula diana que se esté tratando y el sujeto que esté siendo tratado. Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples con el nivel de dosis y el patrón seleccionados por el médico tratante. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar antes a un sujeto que ya padece una enfermedad o afección relacionada con la apoptosis.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de compuesto (p. ej., un inhibidor de SGK1) suministrada con una frecuencia suficiente para proporcionar un beneficio médico al paciente. En una realización, una cantidad eficaz de un inhibidor de SGK1 es una cantidad suficiente para tratar o mejorar un síntoma del síndrome de QT Largo o una enfermedad mediada por complejos inmunes. Cantidades eficaces ejemplares de un inhibidor de SGK1 oscilan entre 0,1 ug/kg de peso corporal y 100 mg/kg de peso corporal; alternativamente 1,0 ug/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal.
Un "sujeto" incluye mamíferos, p. ej., seres humanos, animales de compañía (p. ej., perros, gatos, aves y similares), animales de granja (p. ej., vacas, ovejas, cerdos, caballos, aves de corral y similares) y animales de laboratorio (p. ej., ratas, ratones, cobayas y similares). En una realización preferida de los métodos descritos, el sujeto es un ser humano.
La presente invención se define adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración.
Ejemplos
Ejemplo 1
La actividad de SGK1 regula el flujo de sodio mediado por Nav1.5
Células HEK 293 con un gen SCN5A transfectado de forma estable (al que se alude como HEK-Nav1.5) fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido que expresa ya sea una forma constitutivamente activa de SGK1 (SGK1 S422D, al que se alude como SGK1-CA), una forma negativa dominante de SGK1 (SGK1 K127M, al que se alude como SGK1 -DN) o el vector con un casete vacío. 48 horas después de la transfección, las células se estudiaron mediante pinza de voltaje de célula completa.
La expresión de SGK1 -CA condujo a un aumento, mientras que la expresión de SGK1 -DN condujo a una disminución de la densidad de corriente de Ina (Fig. 7A), en comparación con el plásmido vacío. El hecho de que la inhibición de SGK1 en células transfectadas con SGK1-DN condujera a una disminución en la densidad de corriente de Ina sugirió que existe una actividad de SGK1 de referencia que impulsa el flujo de sodio en la célula.
Además, las células HEK-Nav1.5 transfectadas con SGK1-CA tenían desplazamientos hacia la izquierda (hiperpolarizantes) de sus curvas de activación y de inactivación de estado constante (Fig. 7B). También se espera que esto aumente la corriente de 'ventana', lo que provocará un aumento en Ina.
Habían sido identificados tres sitios de consenso para la fosforilación en Nav 1.5, incluyendo dos sitios en el enlazador entre los subdominios I y II, y un sitio no descrito previamente en el dominio C-terminal. Se ha demostrado que los dos primeros sitios influyen en las propiedades biofísicas del canal en experimentos de expresión de oocitos. La mutación de las serinas a alaninas (para abolir la fosforilación de SGK1) también abolió los desplazamientos de hiperpolarización en las curvas de activación e inactivación arriba descritas. La mutación del residuo C-terminal (T1590A) en un residuo no fosforilable evitó los efectos de la activación de SGK1 sobre la densidad de corriente de Ina (Fig. 7C). En conjunto, los datos sugieren que SGK1 regula Ina de múltiples formas diferentes, y la inhibición de SGK1 puede ser una forma novedosa de reducir Ina en condiciones patológicas.
Ejemplo 2
La Inhibición Genética de SGK1 Rescata el Fenotipo 2:1 en el Pez Cebra Mutante Bkd
El pez cebra breakdance mutante (Bkd-/-) es un modelo único de la prolongación del potencial de acción debido a una mutación en el canal Zerg (pez cebra HERG), que recapitula el síndrome LQT2 humano y se ha utilizado en selecciones de alto rendimiento para identificar moléculas que pueden acortar la duración del potencial de acción. La manifestación fenotípica del intervalo QT prolongado en el pez Bkd -/- es la presencia de bloqueo AV funcional 2:1, y las selecciones anteriores han aprovechado este fenotipo fácilmente cuantificable para detectar el ‘rescate’ del bloqueo AV 2:1.
Se cruzaron adultos Bkd-/-(Breakdance) y los embriones resultantes fueron criados en tampón E3 a 25°C. 24 horas después de la fertilización (hpf) a los animales se les eliminó el corion con pronasa y se sembraron por pocillo en placas de 96 pocillos en un volumen final de 200 pL. A 48 hpf, los compuestos se añadieron a la concentración apropiada. Los peces cebra se puntuaron visualmente a 72 hpf en cuanto a la presencia o ausencia de bloqueo AV 2:1. Para la curva de respuesta a la dosis, los peces a 48 hpf se trataron durante 24 horas a la concentración deseada (de un patrón de 20 mM en DMSO) y se puntuaron para la supresión del fenotipo breakdance. La inhibición genética de SGK1 se logró mediante la inyección de 500 pM de morfolino de SGK1 o ARNm negativo dominante en SGK1 en la fase de 1 -2 células y los peces se puntuaron para el rescate del bloqueo AV 2:1 en la fase de 99 hpf.
Peces Bkd-/- a los que se inyectaron 500 pM de morfolino de SGK1 o ARNm de SGK1-DN (que ha demostrado previamente inhibir la actividad de SGK1 de una forma negativa dominante) demostraron un rescate significativo del bloqueo AV 2:1. El morfolino de SGK-1 mostró el rescate del 58% de los mutantes (en comparación con el 5% de reversión espontánea en las inyecciones de control de morfolino revuelto). SGK1-DN fue incluso más potente para rescatar el fenotipo (90% de rescate) (Fig. 1). Estos resultados demostraron que la inhibición de SGK1 podría rescatar el fenotipo de bloqueo AV 2:1 en este modelo de pez cebra de LQTS. Esto puede deberse al acortamiento de la duración del potencial de acción y a la repolarización del miocardio por modulación de la función del canal iónico.
Ejemplo 3
El Compuesto 1A es Eficaz para Revertir el bloque 2:1 en Mutantes bkd
El pez Bkd-/- tratado con el compuesto 1A a las concentraciones indicadas en la Fig. 2 fue eficaz para rescatar el fenotipo de bloqueo AV 2:1 con un rescate del 58% observado a una concentración de 45 pM con una toxicidad mínima y estable en concentraciones superiores a 50 pM.
Para los Ejemplos 4 y 5, para testar los beneficios de la inhibición de SGK1, una forma mutante negativa dominante quinasa-muerta de SGK1 se expresó genéticamente en los corazones de ratones, bajo el control del promotor de la cadena alfa pesada de miosina. Estos ratones eran normales al inicio del estudio, y posteriormente se sometieron a sobrecarga de presión inducida por constricción aórtica transversal (TAC) o ligadura quirúrgica transitoria de una arteria coronaria, para inducir un ataque cardíaco.
Ejemplo 4
La Inhibición SGK1 Mitiga el Efecto de la Sobrecarga de Presión
Para la TAC, ratones macho de 12 semanas de edad se anestesiaron y se sometieron a toracotomía, momento en el que el transversal fue constreñido al diámetro de una aguja 25G roma. Los ratones se recuperaron y la función cardíaca fue seguida por ecocardiografía. Siete semanas después de la cirugía, se sacrificó a los ratones para realizar estudios de tejidos, incluido el análisis de la fibrosis.
Siete semanas después de la TAC, las relaciones de peso del corazón a peso corporal (HW/BW) y del espesor de pared del ventrículo izquierdo (LV) aumentó menos en SGK1 inhibida (SGK1-DN) que en animales de la camada de tipo salvaje (WT) (Figuras 4A y 4B). La ecocardiografía siete semanas después de la TAC reveló una función cardíaca reducida (acortamiento fraccional, FS) y un aumento de la dilatación del LV (LVDD) en ratones WT, pero no SGK1-DN (Figuras 4C y 4D). Los ratones SGK1-DN también tenían significativamente menos fibrosis que los ratones WT después de la TAC (Figura 4E). Por lo tanto, la inhibición de SGK1 protege contra el desarrollo de insuficiencia cardíaca, dilatación cardíaca y fibrosis después de la sobrecarga de presión, lo cual simula eventos que se producen en seres humanos en respuesta a hipertensión o estenosis valvular.
Ejemplo 5
La Inhibición de SGK1 Reduce Lesiones y Mejora la Función Después de una Lesión Isquémica (Ataque al Corazón)
Para la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) que simula un ataque al corazón que recibe terapia de reperfusión, el patrón actual de cuidado, ratones de 12 semanas de edad inhibidos en SGK1 (SGK1-DN) y controles WT se sometieron a 30 minutos de isquemia (con ligadura coronaria izquierda reversible) seguida de 24 horas de reperfusión. Veinticuatro horas después de la IRI, se analizó el tamaño del infarto en los corazones y se evaluó el "área en riesgo" (AAR) mediante inyección de microesferas fluorescentes en el momento del infarto y se evaluó el área del infarto mediante tinción con TTC. La cuantificación demostró que había una reducción significativa (40%, p < 0,04) en el tamaño del infarto con inhibición crónica de SGK1 en comparación con los ratones WT (Figura 5). Esta reducción en el tamaño del infarto (en respuesta al mismo estímulo isquémico) se asoció con una función cardíaca mejorada medida por ecocardiografía (FS, p < 0,05) durante al menos dos semanas después de la IRI.
Ejemplo 6
SGK1 se Activa en la Miocardiopatía Dilatada Humana (DCM)
Se examinó el tejido ventricular de pacientes con enfermedad cardíaca hipertensiva que murieron por causas no cardíacas (HHD), así como explantes de pacientes con insuficiencia cardíaca y miocardiopatía dilatada (DCM) en el momento del trasplante ortotópico. Los corazones de donantes sanos no utilizados sirvieron como controles. Las cohortes se emparejaron por edad y sexo. Las angiografías coronarias habían confirmado la ausencia de enfermedad coronaria epicárdica significativa en los pacientes con DCM, y la gravimetría confirmó una tendencia hacia un aumento de la masa del LV en pacientes con HHD (CTRL 363 ± 133 g, Hh D 518 ± 112 g, p = 0,07). En los corazones HHD, hubo un aumento en SGK1 total (1,22 ± 0,12, p < 0,04) sin un cambio en pSGK1 en comparación con los controles. Los corazones DCM tuvieron un aumento de 2,3 veces en pSGK1 (2,3 ± 0,85 veces, p < 0,005 frente a los controles) sin alteraciones en la SGK1 total. Este sitio de fosforilación es indicativo de la activación de SGK1 y se correlaciona bien con la actividad de la quinasa. Por lo tanto, estos estudios demuestran que SGK1 se activa en DCM humano.
Ejemplo 7
La Inhibición de SGK1 Mitiga la DCM Genética
Para determinar si la activación de SGK1 es funcionalmente importante en DCM, se seleccionó un modelo bien caracterizado de DCM genética provocada por una mutación en la cadena pesada de miosina (MHC-F764L). Si bien este modelo es el resultado de una mutación específica, el gen implicado está comúnmente mutado en la miocardiopatía y es un miembro de la clase de proteínas estructurales (implicadas en la función del citoesqueleto y del sarcómero) que está mutado más comúnmente en DCM. SGK1 se activó o inhibió en ratones MHC-F764L mediante la reproducción de dos ratones que expresaban un mutante SGK1 constitutivamente activo (SGK1-CA) o dominante negativo (SGK1-DN). Los heterocigotos (hets) MHC-F764L tienen una disfunción del LV significativa en comparación con WT (Figura 6, p < 0,05). A las 12 semanas, la activación de SGK1 (SGK1-CA) empeoró el acortamiento fraccional (FS) en hets MHC-F764L, mientras que la inhibición de SGK1 (SGK1-DN) mejoró sustancialmente FS (Figura 6, p < 0,05).
Ejemplo 8
Descubrimiento de Inhibidores de SGK1 de Moléculas Pequeñas
El uso de una plataforma de descubrimiento de fármacos de cálculo, tres rondas iterativas de testar inhibidores pronosticados se realizaron en un ensayo de quinasa en-solución basado en la polarización utilizando proteína purificada SGK1 recombinante y los inhibidores para identificar tres inhibidores ‘condujeron a compuestos' que se comportan bien en solución. Brevemente, este ensayo utiliza un péptido fosforilado que está marcado con un colorante verde fluorescente: éste tiene un peso molecular bajo, por lo tanto, un valor de polarización de fluorescencia mínimo. Este trazador se une a un anticuerpo fosfo-específico formando un complejo de alto peso molecular con un alto valor de polarización. En la reacción de la quinasa, la quinasa fosforila un péptido competitivo no marcado y compite con el trazador marcado por la unión con el anticuerpo. Con una mayor actividad de la quinasa, se une menos trazador marcado al anticuerpo, lo que a su vez da como resultado una disminución de la polarización de la fluorescencia. En primer lugar, se validó la reproducibilidad y el intervalo dinámico del ensayo utilizando diferentes concentraciones de una SGK-1 purificada con GST recombinante y se determinó que la CE70 de la quinasa recombinante era de 1 ng. Este ensayo se utilizó luego en un formato de validación de alto rendimiento para evaluar los inhibidores de moléculas pequeñas de 1a y 2a generación identificados utilizando la plataforma CADD de los autores de la invención. La selección de la actividad inicial se realizó a una concentración de 50 M para asegurar que se encontraban todos los compuestos con actividad y varios compuestos tenían un potencial inhibidor de SGK1 demostrable.
Estos inhibidores se caracterizaron adicionalmente utilizando un sistema de cardiomiocitos basado en células (Figura 3).
2 x 106 miocitos ventriculares de rata neonatal (NRVMs) se sembraron en placas de 60 mm en DMEM que contenía suero de caballo al 10%, suero bovino fetal al 5%, 1% de L-glutamina y 1% de antibiótico penstrep. 24 h después de la siembra se cambió el medio a DMEM que contenía 1% de L-glutamina, y 24 h después las células fueron infectadas con virus SGK-CA y tratadas con diversas concentraciones de inhibidores de SGK 5377051 (Compuesto 1A) y 6410136 ( Chembridge compuesto n° de catálogo 6410136). 12 h después de la infección y el tratamiento, se cambió el medio y las células se trataron de nuevo. 12 h después del segundo tratamiento, se recolectaron NRVM y se lisaron en 300 uL de tampón de lisis celular (Cell Signalling) que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa y PMSF a 4 grados C durante 1 h con agitación. Los lisados se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo contra fosfo (ser38)-glicógeno sintasa quinasa beta (p-GSK3p), un sustrato de SGK1 bien establecido. Para la electroforesis en gel, se cargaron 50 ug de proteína por pocillo, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se bloquearon y se incubaron con anticuerpos primarios GAPDH y P-GSK3p. Como era de esperar, Ad. SGK1 -CA provocó un aumento de p-GSK3p, que fue inhibido tanto por 5377051 como por 6410136, lo que sugiere la inhibición de SGK1 en CM (Fig. 8A, Fig. 9). Los inhibidores de SGK1 redujeron de forma reproducible y eficaz la fosforilación de GSK-3p impulsada por SGK1 a concentraciones en el intervalo nM de 10-100 nM (Figura 3). Por el contrario, ninguno de los inhibidores tuvo un efecto significativo sobre la fosforilación de GSK-3p mediada por Akt incluso a concentraciones significativamente más altas en un ensayo similar basado en cardiomiocitos (Figura 3).
Debido a que SGK1 y Akt están estructuralmente relacionados, pero tienen papeles muy diferentes en el corazón, con Akt se consideró que era cardioprotector contra el estrés, se evaluaron los inhibidores para determinar si tienen un efecto fuera del objetivo en Akt en los CM. Los NRVMs se infectaron con Akt constitutivamente activo impulsado por adenovirus (myr-Akt) o adenovirus de control, y se trataron con los inhibidores como anteriormente. Se evaluaron nuevamente los niveles de p-GSK3p, un sustrato común para Akt y SGK1. Si bien la infección de NRVMs con Ad.myr-Akt provocó un aumento esperado en p-GSK3p, ni 5377051 ni 6410136 provocaron una inhibición significativa de esta actividad (Fig. 8B).
La actividad de 5377051 y 6410136 se comparó con un inhibidor de SGK1 EMD 638683 informado anteriormente en este ensayo celular y se encontró que los compuestos de plomo de la presente invención fueron mejores o al menos equivalentes en su capacidad para la inhibición de SGK1 (Fig. 8C).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de SGK1 para uso en un método para tratar a un sujeto con síndrome de QT Largo, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de SGK1.
2. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 1, en
Figure imgf000019_0001
donde el síndrome de QT Largo es genético.
3. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 1, en
Figure imgf000019_0002
donde el síndrome de QT Largo es adquirido.
4. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 2, en
Figure imgf000019_0003
donde el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una mutación en el gen KCNQ1.
5. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 2, en donde el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una mutación en el gen KCNH2.
6. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 2, en donde el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una mutación en el gen SCN5a.
7. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 4, en donde el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una pérdida de función en el gen KCNQ1.
8. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 5, en donde el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una pérdida de función en el gen KCNH2.
9. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 6, en donde el síndrome genético de QT Largo se caracteriza por una ganancia de función en el gen SCN5a.
10. Un inhibidor de SGK1 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en donde el inhibidor de SGK1 es un compuesto de acuerdo con la Fórmula 1:
Figure imgf000019_0004
en donde
n es 1, 2, 3, 4 o 5;
cada uno de los R se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un halógeno, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6, haloalcoxi C1-C6, CN, CO2H, CO2(alquilo C1-C6), CO2(haloalquilo C1-C6), -OH, -NH2, -NH(alquilo C1-C6), -N(alquilo C1-C6)2, -SH y -S(alquilo C1-C6);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 10, en donde el inhibidor de SGK1 se selecciona de:
Figure imgf000020_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Un inhibidor de SGK1 para uso según las reivindicaciones 1-9, en donde el inhibidor de SGK1 es un anticuerpo anti-SGK1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
13. Un inhibidor de SGK1 para uso según la reivindicación 12, en donde el anticuerpo anti-SGK1, o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humano, quimérico, humanizado, primatizado, revestido, de cadena sencilla o dominio (dAb), o fragmento de unión a antígenos.
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