JP2006500030A - リボスイッチ、その使用方法、ならびにリボスイッチとともに用いるための組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願第60/412,468号(2002年9月20日提出)の利益を主張する。米国特許仮出願第60/412,468号(2002年9月20日提出)は、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所National Institutes of Healthにより授与される補助金NIH GM48858およびNIH GM559343ならびに米国国立科学財団National Science Foundationにより授与される補助金NSF EIA-0129939下での政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は一般的に、遺伝子発現の分野に、特に遺伝子発現の調節の領域にある。
細胞は、種々の遺伝子発現パターンによる多数の生化学的シグナルおよび環境的合図に応答しなければならないので、精確な遺伝子制御は生体系の不可欠な特徴である。遺伝子制御のほとんどの既知のメカニズムは、化学的または物理的刺激を感知し、そして次に関連DNAまたはメッセンジャーRNA配列との選択的相互作用により遺伝子発現を変調するタンパク質因子の使用を包含する。タンパク質は、複雑な形状をとり、生体系にそれらの化学的および物理的環境を精確に感知させる種々の機能を実行し得る。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、転写開始を変調するためにDNAを結合することにより(例えばlacリプレッサータンパク質;Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164)、あるいは転写終結(例えばPyrRタンパク質;Switzer, R.L., et al., 1999, Progl. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367)または翻訳(例えばTRAPタンパク質;Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802)を制御するためにRNAを結合することにより作用する。タンパク質因子は、種々のメカニズム、例えばアロステリック変調または翻訳後修飾により環境刺激に応答し、そしてこれらのメカニズムの採用時に、高応答性遺伝子スイッチとして役立つよう適合される(例えばPtashne, M., and Gann, A. (2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照)。
ある種の天然mRNAは代謝産物感受性遺伝子スイッチとして役立つ、ということが発見されたが、この場合、RNAは小有機分子を直接結合する。この結合過程はmRNAの立体配座を変え、これが種々の異なるメカニズムにより遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然「リボスイッチ」の修飾バージョン(種々の核酸工学処理戦略を用いて作製される)は、特定のエフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝子スイッチとして用いられ得る。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物は、本明細書中ではトリガー分子と呼ばれる。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法のための標的である。さらにリボスイッチの構成は、天然スイッチの実際の小片を新規の非免疫原性遺伝子制御素子を構築するために用いさせ、例えばアプタマー(分子認識)ドメインは、新規の認識ドメインがユーザー定義エフェクター化合物による遺伝子変調を引き起こすよう、他の非天然アプタマーと交換され得る(またはそうでなければ修飾される)。変更スイッチは、治療レジメンの一部となる(タンパク質合成を開始させるかまたは停止し、あるいは調節する)。新規構築遺伝子調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物体の代謝工学処理のような領域に、ならびに改良型の遺伝子療法治療に適用され得る。
開示された方法および組成物は、特定の実施形態およびそこに含まれる実施例の下記の詳細な説明に対する、そして図面ならびにそれらの上記のおよび下記の説明に対する参照により、より容易に理解され得る。
細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主コード領域の5’−非翻訳領域(5’−UTR)内に主として置かれる遺伝子制御素子である。構造的プロービング試験(さらに下記で考察される)は、リボスイッチ素子が一般的に2つのドメイン:リガンド結合ドメインとして役立つ天然アプタマー(T. Hermann, D.J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763)、ならびに遺伝子発現に関与するRNA素子(例えばシネ−ダルガルノ(SD)素子;転写ターミネーターステム)と連係する「発現プラットフォーム」からなる、ということを明示する。これらの結論は、in vitroで合成されたアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドと結合する、という観察から引き出される(実施例2、3および6参照)。さらに構造的プロービング研究は、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが、独立して検査した場合に特定の二次−および三次−構造フォールドを取る、即ち完全5’リーダーRNAの情況で検査した場合のアプタマー構造と本質的に同一である、ということを示唆する。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと関係なくフォールドするモジュラー単位である、ということを意味する(実施例2、3および6参照)。
細菌は、転写の終結のために主に2つの方法を用いる。ある種の遺伝子は、Rhoタンパク質に依存性である終結シグナルを組み入れる(J.P. Richardson, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1577, 251)が、一方、他のものはRho−非依存性ターミネーター(内在性ターミネーター)を用いて、転写延長複合体を非安定化する(I. Gusarov, E. Nudler, Molecular Cell 1999, 3, 495; E. Nudler, M.E. Gottesman, Genes to Cells 2002, 7, 755)。後者のRNA素子は、富GCステム−ループとその後の6〜9個のウリジル残基の鎖から成る。内在性ターミネーターは細菌ゲノム全体に広く行き渡っており(F. Lillo, et al., 2002, 18, 971)、そして典型的には遺伝子またはオペロンの3’末端に位置する。興味深いことに、5’−UTR内に位置する内在性ターミネーターに関して漸増数の例が観察されつつある。
開示された方法および組成物のために用いられ得る、ともに用いられ得る、そのための調製に用いられ得る、あるいはその生成物である材料、組成物および構成成分が開示される。これらのおよびその他の材料が本明細書中で開示され、そして、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の種々の個々のおよび集合的組合せおよび置換の各々に対する特定の参照は明瞭には開示され得ないが、しかし各々は特に意図され、本明細書中に記載される、と理解される。例えばリボスイッチまたはアプタマードメインが開示され、考察され、そして多数の分子、例えばリボスイッチまたはアプタマードメインに対してなされ得る多数の修飾が考察される場合、リボスイッチまたはアプタマードメインの各々のおよび全ての組合せおよび置換、ならびに可能である修飾は、特に別記されない限り、特定的に意図される。したがって分子A、BおよびCの一クラスが、分子D、EおよびFの一クラスと同様に開示され、そして組合せ分子の一例A−Dが開示される場合には、各々が独立して列挙されない場合でも、各々は独立して、そして集合的に意図される。したがってこの例では、組合せA−E、A−F、B−D、B−E、B−F、C−D、C−EおよびC−Fが特に意図され、そしてA、BおよびC;D、EおよびF;ならびに実例組合せA−Dの開示から開示されると考えられるはずである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも特に意図され、開示される。したがって例えばA−E、B−FおよびC−Eの亜群が特に意図され、そしてA、BおよびC;D、EおよびF;ならびに実例組合せA−Dの開示から開示されると考えられるべきである。この概念は、この適用の全ての態様に当てはまり、例としては、開示組成物の製造および使用方法における過程が挙げられるが、これらに限定されない。したがって実施され得る種々の付加的過程が存在する場合、これらの付加的過程の各々は、開示された方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せを用いて実施され、そしてこのような組合せの各々は特に意図され、開示されると考えられるべきである、と理解される。
リボスイッチは、発現されるRNA分子の一部であり、そしてトリガー分子により結合される場合、状態を変える発現制御素子である。リボスイッチは、典型的には2つの別個のドメインに切断され得る:1つは標的(アプタマードメイン)を選択的に結合するもの、そしてもう1つは遺伝子制御に影響を及ぼすもの(発現プラットフォームドメイン)である。それは、遺伝子発現の代謝産物依存性アロステリック制御を生じるこれら2つのドメイン間の動的相互作用である。単離および組換えリボスイッチ、このようなリボスイッチを含有する組換え構築物、このようなリボスイッチと操作可能的に連結される非相同配列、ならびにこのようなリボスイッチ、リボスイッチ組換え構築物および非相同配列と操作可能的に連結されるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物が開示される。非相同配列は、例えば当該タンパク質またはペプチド、例えばレポータータンパク質またはペプチドをコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは天然リボスイッチであり、あるいはそれらに由来する。
アプタマーは、特定の化合物および化合物のクラスと選択的に結合し得る核酸セグメントおよび構造物である。リボスイッチは、トリガー分子の結合時に、リボスイッチの状態または構造の変化を生じるアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチにおいて、アプタマードメインに連結された発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインと結合すると、変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源に由来し、例えばリボスイッチの天然アプタマードメイン、人工アプタマー、工学処理、選定、進化または誘導アプタマー(単数または複数)ドメインであり得る。リボスイッチ中のアプタマーは一般に、例えばステム構造により、連結発現プラットフォームドメインの一部と相互作用し得る少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合時に、生成するかまたは崩壊される。
P1ステムおよびその構成鎖は、発現プラットフォームおよびRNA分子とともに用いるためにアプタマードメインを適合する再に修飾され得る。広範囲におよび得るこのような修飾は、本明細書中ではP1修飾と呼ばれる。P1修飾は、アプタマードメインのP1修飾の配列および/または長さに対する変化を含む。
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含有するRNA分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは一般に、例えばステム構造を形成することにより、連結アプタマードメインの一部と相互作用し得る少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合時に生成するかまたは崩壊され得る。ステム構造は一般に、発現調節構造であるか、またはその形成を防止する。発現調節構造は、その構造を含有するRNA分子の発現を可能にし、防止し、増強しまたは抑制する構造である。例としては、シネ−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、ならびに安定およびプロセシングシグナルが挙げられる。
トリガー分子は、リボスイッチを活性化し得る分子および化合物である。これは、リボスイッチを活性化し得るリボスイッチおよびその他の化合物のための天然または正常トリガー分子を包含する。天然または正常トリガー分子は、現実に所定のリボスイッチのためのトリガー分子、またはいくつかの非天然リボスイッチの場合には、そのためにリボスイッチが設計されるかまたはそれを用いてリボスイッチが選択されるトリガー分子である(例えばin vitro選択またはin vitro進化技法のように)。非天然トリガー分子は、非天然トリガー分子と呼ばれ得る。
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る化合物、およびこのような化合物を含有する組成物も開示される。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により、遺伝子発現を制御するよう機能する。化合物は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するために用いられ得る。リボスイッチのためのトリガー分子(ならびにその他の活性化化合物)は、リボスイッチを活性化するために用いられ得る。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチを非活性化するかまたは遮断するために用いられ得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチの存在からトリガー分子を除去することによっても、非活性化され得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体の結合により遮断され得る。
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適切な方法で成し遂げられ得る。例えば検定は、リボスイッチを活性化するかまたは非活性化することが既知の化合物の存在下で、そして試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を査定するために実施され得る。試験化合物の非存在下で観察されるのと同様に活性化または非活性化が観察されない場合には、試験化合物はリボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定される。
を有する化合物が挙げられる。
を有する化合物が挙げられる。
を有する化合物が挙げられる。R2およびR3が各々NH3 +であり、そしてR1がO-である上記のような化合物も意図される。
を有する化合物が挙げられる。R1がホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである上記のような化合物も意図される。
開示リボスイッチは、任意の適切な発現系中で用いられ得る。組換え発現は、ベクター、例えばプラスミドを用いて有用に成し遂げられ得る。ベクターは、リボスイッチコード配列に操作可能的に連結されたプロモーター、ならびに発現されるRNA(例えばタンパク質をコードするRNA)を含み得る。ベクターは、転写および翻訳に必要とされるその他の素子も含み得る。本明細書中で用いる場合、ベクターは、外因性DNAを含有する任意のキャリアを指す。したがってベクターは、分解を伴わずに外因性核酸を細胞に輸送する作用物質であり、それが送達される細胞中の核酸の発現を生じるプロモーターを含む。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物を保有するのに適した種々の原核生物および真核生物発現ベクターが産生され得る。このような発現ベクターとしては、例えばpET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUCおよび酵母ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば種々のin vivoおよびin vitro情況で用いられ得る。
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経栄養性ウイルス、シンドビスおよびその他のRNAウイルス、例えばHIV主鎖を伴うこれらのウイルスが挙げられる。それらをベクターとして用いるのに適するようにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスとしては、ネズミマロニー白血病ウイルス(MMLV)およびベクターとしてMMLVの望ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスより大きな遺伝子有効搭載量、即ち導入遺伝子またはマーカー遺伝子を保有し、この理由のために、一般的に用いられるベクターである。しかしながらそれらは非増殖細胞では有用でない。アデノウイルスベクターは助けて働くのが相対的に安定且つ容易であり、高力価を有し、エーロゾル処方物中で送達され、そして非分裂細胞をトランスフェクトし得る。ポックスウイルスベクターは大型であり、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、それらは熱安定性であり、そして室温で保存され得る。好ましい実施形態は、ウイルス抗原により引き出される宿主生物の免疫応答を抑制するよう工学処理されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン8または10に関するコード領域を保有する。
レトロウイルスは、任意の型、亜科、属または親和性を含めたレトロウイルス科のウイルス科に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、概して、Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)(この記載内容は、参照により本明細書中で援用される)により記載されている。遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第4,868,116号および第4,980,286号;PCT出願WO 90/02806およびWO 89/07136;ならびにMulligan(Science 260: 926-932 (1993))に記載されている(これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される)。
複製欠陥アデノウイルスの構築が記載されている(Berkner et al., J. Virology 61: 1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57: 267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61: 1226-1239 (1987); Zhang “Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15: 868-872 (1993))。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、それらが初期感染細胞内で複製され得るが、しかし新規の感染性ウイルス粒子を生成できないため、それらが他の細胞型に蔓延し得る程度にそれらが限定される点である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮細胞、CNS実質細胞および多数のその他の組織部位への直接in vivo送達後に高効率遺伝子移入を達成することが示された(Morsy, J. Clin. Invest. 92: 1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92: 381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92: 1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4: 154-159 (1993); La Salle, Science 259: 988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267: 25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4: 461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6: 75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73: 1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994); Zabner, Cell 75: 207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5: 1287-1291 (1993);およびRagot, J. Gen. Virology 74: 501-507 (1993))。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合することにより遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠陥アデノウイルスと同一方法で、受容体媒介性エンドサイトーシスによりウイルスがインターナライズされる(Chardonnet and Dales, Virology 40: 462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12: 386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55: 442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51: 650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65: 6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73: 309-319 (1993))。
哺乳類宿主細胞中のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えばウイルス、例えばポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスのゲノムから、あるいは非相同哺乳類プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから得られる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含有するSV40制限断片として得られるのが便利である(Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限断片として得られるのが便利である(Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982))。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターも本明細書中で有用である。
ベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達され、そして一旦送達されれば、発現されるか否かを確定するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質をコードする大腸菌lacZ遺伝子である。
バイオセンサーリボスイッチも開示される。バイオセンサーリボスイッチは、それらのコグネイトトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する工学処理リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルまたはそれより上で誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、in vivoまたはin vitroでの使用のために意図され得る。例えばシグナルとして役立つかまたはシグナル生成に関与するタンパク質をコードするレポーターRNAと操作可能的に連結されるバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ/レポーターRNAをコードする核酸構築物を保有するよう細胞または生物体を工学処理することにより、in vivoで用いられ得る。in vitroで用いるためのバイオセンサーリボスイッチの一例は、それからのシグナルがリボスイッチの活性化状態によって変化する立体配座依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマーを用いる。
リボスイッチの活性化を査定するために、またはバイオセンサーリボスイッチのために、レポータータンパク質またはペプチドが用いられ得る。レポータータンパク質またはペプチドは、その発現がリボスイッチにより調節されるRNAによりコードされ得る。実例は、いくつかの特定のレポータータンパク質の使用を記載する。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとともに用いるために容易に適合され得る。レポータータンパク質は、検出され得るかまたは検出可能なシグナルを生成し得る任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくはタンパク質またはペプチドの存在は、標準技法(例えばラジオイムノアッセイ、放射能標識、イムノアッセイ、酵素活性に関する検定、吸光度、蛍光、発光およびウエスタンブロット)を用いて検出可能であり得る。さらに好ましくはレポータータンパク質のレベルは、低レベルでも、標準技法を用いて容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびそれらの誘導体、例えばホタルPhotinus pyralisからのホタルルシフェラーゼ(FL)、ならびにウミシイタケRenilla reniformisからのウミシイタケルシフェラーゼ(RL)が挙げられる。
立体配座依存性標識は、標識が会合される分子または化合物(例えばリボスイッチ)の形態または立体配座における変化に基づいた蛍光強度または波長における変化を生じる全ての標識を指す。プローブおよびプライマーの情況において用いられる立体配座依存性標識の例としては、分子ビーコン、Amplifluor、FRETプローブ、切断FRETプローブ、TaqManプローブ、スコルピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ、例えば三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖FRETプローブ、蛍光水溶性共役ポリマー、PNAプローブおよびQPNAプローブがあげられるが、これらに限定されない。このような標識、特にそれらの機能の原理は、リボスイッチとともに用いるために適合され得る。いくつかの型の立体配座依存性標識は、Schweitzer and Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12: 21-27 (2001)に再検討されている。
リボスイッチ活性化、非活性化または遮断の検出および定量を、あるいはリボスイッチの活性化、非活性化または遮断時に産生される核酸またはタンパク質の発現を助けるために、検出標識が検出プローブまたは検出分子中に組入れられるか、あるいは発現核酸またはタンパク質中に直接組入れられ得る。本明細書中で用いる場合、検出標識は、直接または間接的に、核酸またはタンパク質と会合され、そして直接または間接的に、測定可能、検出可能なシグナルを生じる任意の分子である。多数のこのような標識は、当業者に既知である。開示された方法に用いるのに適した検出標識の例は、放射性同位元素、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体およびリガンドである。
本明細書中で考察されるように、相同性および同一性という用語は、類似性と同一の事柄を意味する、と理解される。したがって例えば相同性という語の使用が2つの配列(例えば非天然配列)間で用いられる場合、これは必ずしも、これら2つの配列間の進化関係を示すわけではないが、しかしむしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目している、と理解される。2つの進化的に関連する分子間の相同性を確定するための方法の多くは、それらが進化的に関連するか否かにかかわらず、配列類似性を測定する目的のために、任意の2つまたはそれ以上の核酸またはタンパク質にルーチンに適用される。
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、少なくとも2つの核酸分子間の、例えばプライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子間の配列駆動性相互作用を意味する。配列駆動性相互作用は、ヌクレオチド特異的方法での2つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体間に起こる相互作用を意味する。例えばCと相互作用するG、またはTと相互作用するAは、配列駆動性相互作用である。典型的には配列駆動性相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面で生じる。2つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知の多数の条件およびパラメーターにより影響を及ぼされる。例えば反応の塩濃度、pHおよび温度は全て、2つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響を及ぼす。
核酸ベースのものである本明細書中に開示される種々の分子、例えばリボスイッチ、アプタマー,ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が存在する。開示核酸は、例えばヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換物から作製され得る。これらのおよびその他の分子は本明細書中で考察されるが、これらに限定されない。例えばベクターが細胞中で発現される場合、発現mRNAは典型的にはA、C、GおよびUから作製される、と理解される。同様に、例えば外因性送達により核酸分子が細胞または細胞環境中に導入される場合、核酸分子は細胞環境中の核酸分子の分解を低減するヌクレオチド類似体から作製されるのが有益である、と理解される。
ヌクレオチド置換基は、ヌクレオチドと類似の機能特性を有するが、しかしホスフェート部分を含有しない分子、例えばペプチド核酸(PNA)である。ヌクレオチド置換基は、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン方式で相補的核酸を認識し、そしてハイブリダイズ(して塩基対合)するが、しかしリン酸部分以外の部分により一緒に連結される分子である。ヌクレオチド置換基は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に従い得る。
固体支持体は、分子(例えばトリガー分子)およびリボスイッチ(あるいは開示された方法で用いられるかまたはそれにより生成されるその他の構成成分)が会合され得る固体状態基板または支持体である。リボスイッチおよびその他の分子は、直接または間接的に固体支持体と会合され得る。例えば分析物(例えばトリガー分子、試験化合物)は、固体支持体の表面に結合されるか、または固体支持体上に固定された捕捉剤(例えば分析物を結合する化合物または分子)と会合され得る。別の例として、リボスイッチは固体支持体の表面に結合されるか、または固体支持体上に固定されたプローブと会合され得る。アレイは、多数のリボスイッチ、プローブまたはその他の分子が、アレイ、格子またはその他の組織化パターンで会合された支持体である。
上記の物質ならびにその他の物質は、開示された方法を実施し、あるいは開示方法の実施を手助けするために有用なキットとして、任意の適切な組合せで一緒に包装され得る。所定のキット中のキット構成成分が意図され、開示方法において一緒に用いるために適合されるならば有用である。例えば、化合物を検出するためのキットであって、1つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットが開示される。キットは、リボスイッチの活性化を検出するための試薬および標識も含有し得る。
開示方法を実施するために実施し、または調製することにより生成される混合物が開示される。例えばリボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物が開示される。
開示方法を実施するために、あるいは方法の実施を手助けするために有用な系が開示される。系は一般に、製造物品、例えば構造物、機械、装置等の組合せを含む。開示されるまたは開示から明らかであるこのような組合せが意図される。例えばバイオセンサーリボスイッチ、固体支持体およびシグナル読取装置を含む系が開示され、意図される。
開示方法でもちいられる、開示方法により生成される、あるいは開示方法から生成されるデータ構造が開示される。データ構造は一般に、組成物または媒質中で収集され、組織化されおよび/または具体化される任意の形態のデータ、情報および/または対象である。電子形態で、例えばRAM形態でまたは保存ディスク上に保存されるリボスイッチ構造および活性化測定値は、データ構造の一型である。
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断するための方法が開示される。このような方法は、例えばリボスイッチならびにリボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断し得る化合物またはトリガー分子を接触させることを包含し得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により、遺伝子発現を制御するよう機能する。化合物は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するために用いられ得る。リボスイッチのためのトリガー分子(ならびにその他の活性化化合物)は、リボスイッチを活性化するために用いられ得る。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチを非活性化するかまたは遮断するために用いられ得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチの存在からトリガー分子を除去することによっても、非活性化され得る。したがってリボスイッチの非活性化の開示方法は、例えばリボスイッチの存在またはリボスイッチとの接触からトリガー分子(またはその他の活性化化合物)を除去することを包含し得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体の結合により遮断され得る。
リボスイッチは、小有機分子を結合する目的のために進化してきた新規の種類の構造化RNAである。リボスイッチの天然結合ポケットは、代謝類似体で、または天然代謝産物の形状−空間を模倣する化合物により標的化され得る.リボスイッチは、(1)多数のグラム陽性およびグラム陰性細菌、例えば炭疽菌Bacillus anthracis中に見出され、(2)これらの細菌における遺伝子発現の基本的調節物質であり、(3)同時的耐性を進化させるとは思われない多重コピー中に存在し、そして(4)ヒトに存在することがいまだ立証されていない。特徴のこの組合せは、新規の抗菌化合物に関してリボスイッチを興味深い標的にする。さらにリボスイッチの小分子リガンドは、薬剤候補を製造するための誘導体化のための有用な部位を提供する。
1.枯草菌は、外因的供給SAM類似体の非存在下で、グルコース最少培地中で培養され得る。
2.枯草菌は、外因的供給SAM類似体の存在下で、グルコース最少培地中で培養され得る(高用量が選択され、その後、推定薬剤化合物の濃度範囲を試験するよう意図された実験が反復され得る)。
3.大腸菌は、外因的供給SAM類似体の存在下で、グルコース最少培地中で培養され得る(高用量が選択され、その後、推定薬剤化合物の濃度範囲を試験するよう意図された実験が反復され得る)。
レポーターを作製するための一方法は、リボスイッチドメインへのSAM結合時の蛍光タグの放出を触媒するドメインを付加することにより、リボスイッチに第三機能を付加することである。最終レポーター構築物では、この触媒ドメインは、蛍光シグナルを生成するための触媒ドメインの正確なフォールディングを可能にすることにより、リガンド結合事象を中継する連絡モジュールによりvitJ SAMリボスイッチに連結され得る。これは、下記のように成し遂げられ得る。
1.標準方法によりin vitroでRNAを転写する。RNA全体に亘って放射能を組み入れるために[α−32P]UTPを含む。
2.標準方法により変性PAGE上で全長RNAを精製する。
3.触媒活性のための十分なマグネシウム(20 mM)を含有するが、しかしSAMを含有しないネガティブ選択緩衝液中で全長RNA(〜100 pmol)をインキュベートする。室温(〜23℃)で4時間、利己的分子の出現を阻止するために必要な場合には、温度周期またはアルカリ変性を用いて、インキュベートする。
4.変性PAGE上で全長RNAを精製し、SAMの非存在下で反応するRNAを廃棄する。
5.20 mMMgおよびSAMを含有するポジティブ選択緩衝液中でインキュベートする(23℃でpH7.5)。室温で20分間インキュベートする。
6.変性PAGE上で切断RNAを精製して、SAMを結合し、RNAの自己切断を可能にしたスイッチを回収する。
7.RNAをDNAに逆転写する。
8.RNAの切断部分を再導入したプライマーを用いてDNAをPCR増幅する。
A.実施例1:補酵素B 12 (AdoCbl)リボスイッチ
本実施例は、補酵素B12を結合することにより遺伝子発現を制御するリボスイッチの試験および分析を記載した。
i.化学物質およびオリゴヌクレオチド
補酵素B12(5’−デオキシ−5’−アデノシルコバラミンまたは「AdoCbl」)およびその類似体メチルコバラミン、二シアン化コビンアミドおよびシアノコバラミンをSigmaから購入した。トリチウム化AdoCblを、前に記載されたように調製した(Brown and Zou, Thermolysis of coenzymes B12 at physiological temperatures: activation parameters for cobalt-carbon bond homolysis and a quantitative analysis of the perturbation of the homolysis equibrium by the ribonucleoside triphosphate Reductase from Lactobacillus leichmannii. J. Inorg. Biochem. 77, 185-195 (1999))。AdoCbl類似体B6、N6−ジメチル−AdoCbl、N6−メチル−AdoCbl、N1−メチル−AdoCbl、3−デアザ−AdoCbl、PurCbl、2’−デオキシ−AdoCblおよび13−エピ−AdoCblに関する情報に関しては、Toraya, In: Chemistry and Biochemistry of B12. Banerjee, R. Ed. (Wiley, New York) pp. 783-809 (1999)を参照されたい。
PCRにより生成された鋳型からin vitro転写により前駆体mRNAリーダー分子を調製し(下記のin vivo発現構築物および検定の節参照)、そして前に記載された方法を用いて5’32P標識した(Soukup and Breaker, Allosteric nucleic acid catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 3t8-325 (2000))。約20 nMの標識RNA前駆体を、図1の簡単な説明に記載したようにインキュベートした。前に記載されたものと同様の反応条件を用いて、随伴消化を実行した(Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999))。リガンドの光誘導性分解を防止するために、アルミ箔で各試験管を包むことにより、光への曝露からインキュベーションを保護した。
Dispo平衡透析機(ED−1、 Harvard Bioscience)装置を用いて、各平衡透析実験を実行した。この場合、2つの小室(aおよびb)は各々、25 μLの平衡緩衝液(50 mMトリス−HCl[pH8.3, 25℃]、20 mMMgCl2)を含入した。5,000ダルトン分子量カットオフを有する透析膜により、小室を分離した。各実験(I〜IV、囲み)において、100 pmolの3H−AdoCblを小室aに包含し、そして他の添加剤は各小室に関して(+)と記した場合には含入された。各過程において、平衡を25℃で10時間進行させた後、試料を定量するか、あるいはその後の操作を実行した。各小室からの5または10 μLの溶液を用いて、液体シンチレーション計数により定量を達成した。
アルミ箔で各装置を包むことにより、光への曝露から透析試料を保護した。
大腸菌K−12菌株を全てのbtuB−lacZ発現検定のために用い、そしてTop10細胞(Invitrogen)をプラスミド調製のために用いた。大腸菌MC4100菌株(S. Gottesman, NIHから寄贈)からのコロニーPCRにより、EcoRI−BamHI断片として、btuBリーダー配列を包含するDNA(ヌクレオチド−70〜450)を増幅した。野生型構築物および突然変異体構築物を、lacZ(β−ガラクトシダーゼ)の第9コドンを有するフレーム中で、プラスミドpRS414(R. Simons, UCLAから寄贈;Simons et al., Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions. Gene 53, 85-96 (1987))中に挿入した。所望の配列変化を導入した適切なDNAプライマーを用いて、突然変異部位の領域上流および下流を別々に増幅した。その結果生じた断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、次に併合して、全長構築物の末端に対応するプライマーを用いてPCRにより増幅した。その結果生じた構築物をクローン化し、シーケンシングした。その配列が確証された構築物を発現分析のために用い、そして、in vitro転写のためのPCR由来DNAのその後の調製のための鋳型として用いた。
btuBリーダーmRNAの202−ヌクレオチドリーダー配列における代謝産物依存性立体配座。図1A:変性10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いたbtuBリーダーの自発的RNA切断産物の分離。5’−32P−標識mRNAリーダー分子(矢印)を、20 μMのAdoCblの存在下(+)または非存在下(−)で、20 mMMgCl2、50 mMトリス−HCl(pH8.3, 25℃)中で25℃で41時間インキュベートした。反応を受けていないRNA、アルカリによる部分消化物およびRNアーゼT1(G特異的切断)による部分消化物を含有するレーンを、それぞれNR、OHおよびT1により同定する。選択グアノシン残基後の切断に対応する生成物帯域の位置を、中黒矢頭により同定する。明青色矢頭標識1〜8は、自発的RNA切断の速度の増大または低減を経験するエフェクター誘導性構造変調を示す9つの位置のうちの8つを同定する。リン光画像解析装置(Molecular Dynamics)を用いて画像を生成し、そしてImageQuantソフトウェアを用いることにより切断収量を定量した。図1B:AdoCb1の存在下でのbtuB mRNAの202−ヌクレオチドリーダー配列に関する配列および二次構造モデル。推定塩基対合素子をP1〜P9と呼ぶ。偽結び目を形成する能力を有するP4およびP9のループ中の相補的ヌクレオチドを並置する。明青色矢頭により、構造変調の9つの特定部位を同定する。星印は、B12ボックス(ヌクレオチド141〜162)の境界を定める。開始コドン(ヌクレオチド241〜243)の5’にじかに接して存在するコード領域および38ヌクレオチドは、202−ヌクレオチド断片中に含まれなかった。315−ヌクレオチド断片は、202−ヌクレオチド断片、リーダー配列の残りの38ヌクレオチド、ならびにコード領域の最初の75ヌクレオチドを含む。
btuBリーダー配列単独が代謝産物を感知し、そしてそれに応答するために十分であるか否かを査定するために、RNAの構造依存性自発的切断に頼る分子プロービング戦略を用いた(Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup et al., Generating new ligand-binding RNAs by affinity maturation and disintegration of allosteric ribozymes. RNA 7, 524-536 (2001))。RNAホスホジエステルリンケージが自発的に切断される主要メカニズムは、隣接リン中心上の2’−酸素による内部求核攻撃を包含する。所定のRNAリンケージのU−酸素、リンおよび5’−酸素原子の精確な「直列」位置決定は、生産的求核攻撃が起こるには不可欠であるため(Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup et al., Generating new ligand-binding RNAs by affinity maturation and disintegration of allosteric ribozymes. RNA 7, 524-536 (2001); Westheimer, Pseudo-rotation in the hydrolysis of phosphate esters. Acc. Chem. Res. 1, 70-78 (1968); Usher, On the mechanism of ribonuclease action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 661-667 (1969); Usher and McHale, Hydrolytic stability of helical RNA: a selective advantage for the natural 3’,5’-bond. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1149-1153 (1976); Dock-Bregeon and Moras, Conformational changes and dynamics of tRNAs: evidence from hydrolysis patterns. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 113-121 (1987))、所定のリンケージで自発的切断が起こる比率はRNAの二次および三次構造に大いによっている。特に安定塩基対合構造に関与するヌクレオチドにより形成されるRNAリンケージは、それらが直列立体配座にめったに適合しないため、自発的切断を受けることはめったにないが、一方、相対的非構造化領域にまたは三次構造化領域におかれるヌクレオチドは、はるかに高レベルの自発的切断を経験する。したがってそのリガンドの非存在下および存在下でのRNA受容体のプロービングは、RNA構造モデルに関する証拠を提供するために、そして所定のRNAリガンド相互作用に関する解離定数を確定するためにさえ、用いられ得る(Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup et al., Generating new ligand-binding RNAs by affinity maturation and disintegration of allosteric ribozymes. RNA 7, 524-536 (2001))。
mRNAリーダーの構造的変更がAdoCblにより選択的に誘導される場合(非特異的作用による変調とは対照的に)には、RNAは典型的受容体−リガンド相互作用の特性を示すに違いない。したがって各部位での相対程度の構造変調のプロットは、エフェクターに関する見掛けの解離定数(見掛けのKD)を生じると予測され、これは、RNAの半分をそれらの変更構造状態に変換するために必要とされるエフェクターの濃度を反映する。さらに単一結合事象は観察される全体的構造変化をもたらし、次に各変調部位に関して算定される個々の(Kr)値は単一値に集中するはずであり、一方、これらの値は、構造変調が非特異的作用に起因する場合には、変化すると思われる。
遺伝子応答に対する選択性を提供するためには、他の代謝産物により誘発されることから遺伝子スイッチを排除するために、btuB mRNAリーダーはAdoCblに関する明確な結合ポケットを形成しなければならない。このRNAの分子認識能力を探求するために、10の類似体に関するAdoCblの結合親和性を間接的に確定した(図4A)。これを、AdoCblまたは種々の類似体の存在下でのインキュベーション時の部位2(ヌクレオチドU68)での自発的切断の程度をかくていすることにより達成した(図4B)。コバラミン化合物が5’−デオキシ−5’−アデノシル部分を欠く場合、RNAは構造的変調を受けることができない、ということが判明した。この部分上の個々の官能基の重要性は、他の類似体の機能により明示される。要するに、アデニン環のN1、N3およびN6位置での修飾は結合の有意の崩壊を引き起こすが、一方、近接リボース部分の2“−ヒドロキシル基は重要な分子認識素子ではない。面白いことに、コリン環(化合物11)の位置13での化学量論の変化は、このin vitro検定における、そして細胞の内側でも、調節エフェクターとして分子を不活性にさせる。これらの知見は、btuB mRNAリーダーがAdoCblに関する結合ポケットを形成し、そしてRNAがエフェクターと多数の接触をなして、高度の分子特異性を保証する、ということを示す。
AdoCblの存在は、btuB mRNAのリボソーム結合および翻訳効率の低減を引き起こす(Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000))。結果は、この遺伝子制御過程がbtuB mRNAとのAdoCblの選択的結合により媒介される、ということを示す。突然変異体RNAリーダーのin vitroでのエフェクター結合機能を、細胞内側のエフェクター誘導性遺伝子制御を支持するそれらの能力と比較した。予測どおり、野生型mRNAリーダーはエフェクター誘導性構造変調を示し、平衡透析系における3H−AdoCblの不均等分布を誘導し、そしてAdoCblで処理され、適切なレポーター構築物を保有する大腸菌の下向き調節を可能にする(図5Aに要約)。しかしながら進化的に保存された「B12ボックス」中の単一突然変異(A150T)の導入(Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000))は、「ml」と呼ばれるこの構築物のin vivoエフェクター結合およびin vivo遺伝子制御機能を完全に排除し(図5B)、このことは、遺伝子制御に対するエフェクター結合の必要性と一致する。
代謝産物の濃度を直接感知するmRNAによる遺伝子制御は、細胞代謝の状態をモニタリングするための新規の確立されたパラダイムである。原核生物におけるアミノアシルtRNAの感知もそれらの対応するアミノアシルtRNAシンセターゼの5’−非翻訳領域とのtRNAの直接結合により達成されると考えられる(Henkin, tRNA-directed transcription antitermination. Mol. Microbiol. 3, 381-387 (1994))が、しかし結合はワトソン/クリック塩基対合により媒介されると思われる。btuBの場合、mRNAはAdoCblエフェクターを直接結合し、そしておそらくはリボソーム結合を防止することにより、翻訳開始に対して抵抗性になる(Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000))。タンパク質受容体が分子認識にまたは遺伝子発現を変調するために必要とされない場合には、この簡単な「リボスイッチ」メカニズムはその建築において最も経済的である。タンパク質を包含する類似の系と比較したbtuB遺伝子制御構成成分の組織化的簡易性を考えると、mRNAは、天然および非生物学的調節エフェクターに対して直接応答するようより容易に工学処理されと思われる。
本実施例は、チアミンピロリン酸を結合することにより遺伝子発現を制御するリボスイッチの試験および分析を記載した。
1.化学物質およびオリゴヌクレオチド
TPP、チアミン一リン酸(TP)、チアミン、オキシチアミン、アンプロリウムおよびベンフォチアミンは、Sigmaから購入した。チアミンジスルフィドおよび4−メチル−5−β−ヒドロキシエチルチアゾール(THZ)は、TCI Americaから購入した。3H−標識チアミンは、American Radiolabeled Chemicals, Inc. (10 Ci mmol-1)から購入した。合成DNAは、Yale UniversityのKeck Foundation Biotechnology Resource Centerにより合成された。DNAを変性(8 M尿素)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製し、そして10 mMトリス−HCl(pH7.5, 23℃)、200 mMNaClおよび1 mMEDTA中での粉砕−浸漬により、ゲルから単離した。エタノールを用いた沈降によりDNAを回収した。
大腸菌thiCEFGHオペロン(Vander Horn et al., Structural genes for thiamine biosynthetic enzymes (thiCEFGH) in Echerichia coli K-12. J. Bacteriology 175, 982-992 (1993))のヌクレオチド−83〜238を、EcoR1−BglII断片として大腸菌MC4100菌株(S. Gottesman, NIHから入手)からPCRにより増幅した。DNAを、lacZのプロモーターレスコピーを含有するEcoR1−およびBamH1−消化pRS414プラスミドDNA(R. Simons, UCLAから入手;Simons et al., Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions Gene 53, 85-96 (1987))に結繋し、lacZの第9コドンとthiCの第9コドンとのインフレーム融合を生じた。同様にthiMの調節領域(ヌクレオチド−67〜163)を、EcoR1−BamH1断片としてPCRにより増幅し、プラスミドpRS414中に挿入したが、この場合、thiMの第6コドンはlacZの第9コドンとともにインフレームで存在する。全てのその後の操作のために、Top10細胞(Invitrogen)中でプラスミドを形質転換した。部位特異的突然変異誘発は全て、QuikChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)および適切な変異原性DNAプライマーを用いて、thiCおよびthiM調節領域中に導入した。突然変異は全て、DNAシーケンシング(USB Thermosequenase)により確証した。
thiCまたはthiM mRNAリーダー配列とのインフレームlacZ融合を含有する大腸菌細胞(Top10;Invitrogen)を、M9グルコース最少培地(+50 μg/mlビタミン検定カザミノ酸;Difco)中で中期対数期に増殖させた。付加チアミン(100 μM)を用いて、または用いずに、培養を増殖させた。アリコート(1 mL)をβ−ガラクトシダーゼ酵素検定のために取り出し、これをMiller (Miller, In: A Short Course in Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, p.72. (1992)により記載されたのと同様の方法で実行した。全ての検定を2回反復して、二重反復試験し、Miller単位値はこれらの分析の平均を示した。
適切なDNAプライマーおよびプラスミドpRS414thiCまたはpRS414thiMをそれぞれ用いて、PCRにより,thiCおよびthiM mRNAリーダーの断片のin vitro転写のための鋳型を生成した。T7RNAポリメラーゼにより転写を促すために、この段階で、ジヌクレオチド配列GGをDNA構築物中に導入した(各RNA構築物の5’末端に対応する)。RNAをin vitro転写により調製し、前に記載されたように5’32P標識した(Seetharaman et al., Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures. Nature Biotechnol. 19, 336-341 (2001))。
RNA構築物の直列プロービングを実行することにより、各構築物に関する見掛けのKD値の確定を達成したが、この場合、リガンドの濃度は、弱結合リガンドに関して、10 nM〜100 nM、または10 mMまで変化した。特にRNA構築物の自発的切断のTPP依存性変調を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により可視化した。5’−32P−標識RNA(20 nM)を、100 μMのTPPの存在下(+)または不存在下(−)で、20 mMMgCl2、50 mMトリス−HCl(pH8.3, 25℃)中で25℃で約40時間インキュベートした。いくつかのRNAは、反応を受けていないか、アルカリによる部分消化物を受けたか、あるいはRNアーゼT1(G特異的切断)による部分消化物を受けた(図6a参照)。特定部位で切断されたRNAの分画対リガンドの対数濃度の複合プロット(例えば図7a)を生成して、見掛けのKDの概算値を提供した。分画切断値を、各部位に関して測定された最高および最低切断値に対して正規化した。
Dispo平衡透析機(ED−1、 Harvard Bioscience)を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000ダルトン分子量カットオフ膜により、小室aおよびbを分離した。小室bへの、指示されたような100 nM3H−チアミンを含有する25 μLの平衡緩衝液[50 mMトリス−HCl(pH8.3, 25℃)、20 mMMgCl2、100 mMKCl]の付加により、ならびに20 μMRNAを含有しないかまたは含入する等容積の平衡緩衝液の付加により、平衡を開始した。平衡を23℃で10時間進行させた、アリコートを各小室から取り出して、液体シンチレーション計数により定量した。
i.mRNAによる代謝産物結合
図6Aは、165thiM RNAの自発的切断のTPP依存性変調がポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により可視化されたことを示す。100 μMTPPの存在下(+)または非存在下(−)で、20 mMのMgCl2、50 mMのトリス−HCl(25℃でpH8.3)中で25℃で約40時間、5’P標識RNA(矢印、20 nM)をインキュベートした。NR、-OHおよびT1はそれぞれ、無反応、アルカリによる部分消化またはRNアーゼT1による部分消化(G特異的切断)を受けたRNAを示す。選定G残基後の切断を表す生成物帯域に番号を付けて、中黒矢頭により同定する。星印は、シネ−ダルガルノ(SD)配列を包含するRNA構造の変調を同定する。リン光画像解析装置(Molecular Dynamics)を用いてゲル分離物を分析し、そしてImageQuantソフトウェアを用いて定量した。
図7Aは、TPPの異なる濃度(c)に関してプロットした165thiM(左)および240thiC(右)内のいくつかの部位でのRNA切断の自発的変調の程度を示す。赤色矢印は、RNAの半最大変調(見掛けのKD)を得るために必要なTPPの概算濃度を示す。図7Bは、指示したようにTPP、TPおよびチアミンを用いて両RNAに関してプロットした見掛けのKD値の対数を示す。矩形データは、切頭化RNA91thiMおよび111thiCとともにTPPを用いて生成した。図7Cは、165thiMの自発的切断のパターンが、PAGE分析(左)により示されるような、そして指示したような3つのレーンに関する相対的リン光画像解析装置計数を表すグラフ(右)により示されるようなチアミンとTPPリガンドとの間で異なる、ということを示す。RNAプロービング分析に関する詳細は、図6Aと関連して上記したものと同様である。グラフは、ImageQuantソフトウェアにより作成した。
図8Aは、チアミンのいくつかの類似体の化学構造を示す。TDはチアミンジスルフィドであり、THZは4−メチル−5−β−ヒドロキシエチルチアゾールである。図8Bは、指示したようにTPPおよび種々の化学類似体(各々40 μM)を用いた165thiM RNA構造プロービングのPAGE分析を示す。RNAスパニングヌクレオチド〜113−〜150内の有意の構造変調の位置を、中白矢頭により示す。星印は、特定の化合物の存在下で切断される(底部)RNAの正規化分画を比較するために用いられる部位(C144)を同定する。RNAプロービング分析に関する詳細は、図6Aに関連して上記したものと同様である。図8Cは、分子認識のために重要であるTPPの特徴の要約を示す。図8Dは、トレーサーとして3H−チアミンを用いた平衡透析を示す。指示どおりに小室b中のRNA構築物の存在下での平衡時に確立された2−小室系(aおよびb)中のトリチウム分布に関する比率をプロットする(非TPP結合突然変異体M3の説明に関しては下記参照)。平衡の開始時に、表示したように、100 μMのTPPまたはオキシチアミンを小室aに付加した。
図9Aは、構築物M1〜M8中に存在する突然変異を165thiM RNAと比較して示す。P8*は、P1およびP8ステムの部分(橙色)間の推定塩基対合素子である。図9B(上部)は、直列プロービング実験(10 μMのTPP)のPAGE分析により、ならびにβ−ガラクトシダーゼ発現検定により示した場合の、野生型(WT)、M1およびM2 RNAのin vitro結合および遺伝子制御機能を示す。PAGEゲル上での標識は、図6Aに関連して上記したのと同様である。バーは、培地中のTPPの存在下(+)および非存在下(−)での遺伝子発現のレベルを表す。図9Cは、表形態で示したWT〜M9の類似分析の要約である。SD状態「n.d.」(測定せず)は、TPPの非存在下および存在下で検出された自発的切断のレベルが検出の限界に近い(M6、M7およびM8)か、あるいはその領域がWTと比較して非定型構造(M9)を取ることを示す。
その配列および考え得る二次構造が細菌および古細菌のいくつかの種において保存されている前に同定された(Miranda-Rios et al., A conserved RNA structure (thi box)is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9736-9741 (2001))「thiボックス」ドメインを含む大腸菌のthiMおよびthiC mRNAの5’−非翻訳領域を包含するβ−ガラクトシダーゼ融合構築物を調製した。thiMおよびthiC翻訳融合構築物は、そうでなければチアミンの供給源を欠く最少培地中で宿主細胞が増殖される場合、それぞれ18−110倍のβ−ガラクトシダーゼ活性のチアミン依存性抑制を示す。thiMリーダーを含有する転写融合物はチアミンによる抑制を受けないが、しかしthiCリーダーを含有する同様の融合物はチアミンによる16倍変調を生じ、このことは、thiCを用いて観察された遺伝子制御の有意部分が転写のレベルで起きることを示唆する。
1.序論
現代生物は、代謝要求および環境変化に応答する数百の遺伝子の発現を調整しなければならない。各遺伝子産物は、時間的に、定量的にそしてしばしば空間的に調節されねばならない。さらに遺伝子制御過程は、動的、迅速で、そして変化を受ける特定条件に選択的に応答性でなければならない。したがって生物は、多数の環境シグナルを継続的に定量する遺伝子調節因子の見張り番を要する。多数の考え得る生化学的または物理的合図のうちの1つであり得る特定のシグナルの測定時に、これらの調節因子は生物の遺伝子の特定のサブセットの発現を変調しなければならない。
細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主コード領域の5’−非翻訳領域(5’−UTR)内に主に置かれる遺伝子制御素子である。構造的プロービング試験(以下でさらに考察)は、リボスイッチ素子は一般に2つのドメイン:即ちリガンド結合ドメイン(本明細書中ではアプタマードメインと呼ばれる)として役立つ天然アプタマー(T. Hermann, D.J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763)、ならびに遺伝子発現に関与するRNA素子(例えばシネ−ダルガルノ(SD)素子;転写ターミネーターステム)と連動する「発現プラットフォーム」から成る、ということを明示した。これらの結論は、in vitroで合成されたアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドを結合する、という観察から引き出される(実施例2および6参照)。さらに構造的プロービング研究は、独立して試験した場合、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが特定の二次および三次構造襞を採用し、全5’リーダーRNAの情況で試験した場合のアプタマー構と本質的に同一である、ということを示唆する。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームとは無関係にフォールディングするモジュラー単位であることを意味する(実施例2および6参照)。
細菌は主に、転写の終結のために2つの方法を用いる。ある種の遺伝子は、Rhoタンパク質に依存性である終結シグナルを組み入れる(J.P. Richardson, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1577, 251)が、一方、他のものはRho−非依存性ターミネーター(内在性ターミネーター)を用いて、転写延長複合体を非安定化する(I. Gusarov, E. Nudler, Molecular Cell 1999, 3, 495; E. Nudler, M.E. Gottesman, Genes to Cells 2002, 7, 755)。後者のRNA素子は、富GCステム−ループとその後の6〜9個のウリジル残基の鎖から成る。内在性ターミネーターは細菌ゲノム全体に広く行き渡っており(F. Lillo, et al., 2002, 18, 971)、そして典型的には遺伝子またはオペロンの3’末端に位置する。興味深いことに、5’−UTR内に位置する内在性ターミネーターに関して漸増数の例が観察されつつある。
RFN素子と呼ばれる高度保存RNAドメインは、リボフラビンおよびFMNの生合成および輸送に関与する細菌遺伝子において同定された(M.S. Gelfand, et al., Trends in Genetics 1999, 15, 439; A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141)。この素子は、突然変異がFMN媒介性調節の損失を生じた場合、枯草菌のribDEAHTオペロン(以後「ribD」)の遺伝子操作のために必要とされる(Y.V. Kil, et al., Moleclar & General Genetics 1992, 233, 483; V.N. Mironov, et al., Molecular & General Genetics 1994, 242, 201)。これらのデータは、タンパク質ベースのFMNセンサーまたはFMNそれ自体(G.D. Stormo, Y. Ji, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98, 9465)が、ribD遺伝子発現を抑制するためにRFN素子と相互作用する、ということを提唱した。しかしながらこのような相互作用がどのように起こるか、あるいは発現が作用を及ぼされるメカニズムについては分からなかった。FMNを特異的に結合するRNA配列は定方向進化実験により同定された(C.T. Lauhon, J.W. Szostak, Jouornal of the American Chemical Society 1995, 117, 1246, M. Roychowdhury-Saha, et al., Biochemistry 2002, 41, 2492)が、しかしそれらはRFN素子に対する明白な類似点を示さなかった。
RNAポリマー中の各ヌクレオチド間リンケージは、SN2−様メカニズムにより自発的加水分解を受け易く、この場合、2’酸素が隣接リン中心を攻撃して、鎖切断を引き起こす。この反応は、攻撃求核性分子、リン中心および5’−酸素脱離基(直列立体配座)間の180°配向を要する(G.A. Soukup, R.R. Breaker, RNA 1999, 5, 1308; V. Tereshko, et al., RNA 2001, 7, 405)。塩基対合されるかまたは別の方法で構造的に束縛されるヌクレオチドは、典型的にはこれらの立体配置をとることができず、したがって低比率の自発的切断を示す。これに反して、構造的に束縛されないヌクレオチドは、非常に高い比率の自発的切断を示す。これらの観察は、所定のあるなポリマーに関して関連した比率の自発的切断を確立し、そしてこれを二次−および三次構造モデルと相関させる「直列プロービング」と呼ばれる構造的プロービング方法に利用されてきた(V. Tereshko, et al., RNA 2001, 7, 405)。
RFN素子がFMNのためのアプタマーとして役立つ場合、それは、関連リガンドを弁別する何らかの能力を有する飽和性受容体の特徴を示すべきである。FMNに関する見掛けの解離定数(見掛けのKD)に関する値を得るために、微量のribD RNAおよび漸増濃度のFMNを用いて、直列プロービング検定を反復した;RNA構造の半最大変調と相関するリガンド濃度は、見掛けのKDを反映すべきである。これらの実験は、ribD RNAが、〜5 nMの見掛けのKDを示す飽和性リガンド結合部位を含有する、ということを示す。さらにRNAは、およそ3のオーダーの大きさにより、脱リン酸化形態のFMN(リボフラビン)を弁別する。アプタマーは、リン酸基との生産的相互作用を成すFMNのための結合ポケットを生成しなければならないため、ribD mRNAのこの例外的リガンド特異性は意外である。
a.FMNリボスイッチにより媒介されるin vitro転写終結
T7RNAポリメラーゼまたは枯草菌RNAポリメラーゼを用いて、in vitro転写により、ribDリーダー領域に関する主要転写産物の相対量を調べた。ribDリーダー領域は、ribDコード領域の直ぐ上流に古典的内在性ターミネーターを含有する。興味深いことに、内在性ターミネーターで終結した転写体は、付加的タンパク質因子の非存在下で、FMNにより特定的に誘導される。さらにRFN素子における突然変異は、この現象を阻害する。ターミネーターの左半分は、RFN素子の一部との代替的塩基対合相互作用を形成し、それによりアンチターミネーター素子を形成する。内在性ターミネーターの配列変化はFMN誘導性終結を排除し、一方、アンチターミネーターの変化は構成的終結を生じる。合わせて考えると、これらの観察は、余分量のFMNの条件中にFMNがribD転写体と直接相互作用する機械的モデルと一致する。複合物形成はその後、5’−UTR内の転写終結を誘導し(図12)、これが、ORFが転写されるのを防止することにより遺伝子発現を妨げる。FMN制限の条件中、アンチターミネーター構造はribD発生期転写体内に形成され、これが下流遺伝子の合成を可能にする。
リボスイッチ媒介性転写終結の分子的詳細は、このどちらかといえば極度に簡素化されたモデルが意味するより複雑であると思われる.例えばターミネーターまたはアンチターミネーター立体配座を形成するための「決定」が転写中に1回だけ起きるとすると、調節メカニズムは精確な転写動力学、ならびに適切なRNAフォールディング経路に頼ると思われる。さらにRNA受容体と相互作用するFMNの動力学は、重要な因子であると思われる。RNAがFMNに対して有する親和性は工学処理アプタマーと比較して例外的に強いが、しかし、リガンド会合の動力学は遺伝子調節のより重要な決定因子であり得る。実際、これらのパラメーターはすべて、内在性ターミネーター全体に適切な制御を発揮するために、協力すると思われる。本明細書中に記載されたように用いるためにリボスイッチを適合し、設計するに際しては、転写速度の影響が考慮されるべきである。
内在性ターミネーターは、コンピューター援用検索アルゴリズムにより同定され得る(F. Lillo, et al., 2002, 18, 971)。このようなバイオインフォーマティック分析を用いて、内在性ターミネーターおよび代替的アンチターミネーター構造素子を含有すると予測されるリボスイッチRNAのサブセットが同定され得る(M. Mandal, et al., Cell 2003, 113; A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141; F.J. Grundy, T.M. Henkin, Molecular Microbiology 1998, 30, 737; S. Kochhar, H. Paulus, Microbiology 1996, 142, 1635; D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949)。したがってFMNリボスイッチに関して上記した結果は、多数のその他のリボスイッチRNAにより用いられるメカニズムを示す。実際SAM−およびTPP−依存性リボスイッチは、相互排他的内在性ターミネーターおよびアンチターミネーター構造の形成により、終結全体に制御を発揮することが実証されている(例えば実施例7参照)。さらにSAMリボスイッチアプタマー内のらせんを崩壊し、その後回復する突然変異は、それぞれSAM結合の損失および回復を生じる。併発的にこれらの突然変異は、リガンド結合機能にしたがって、SAM誘導性転写終結の崩壊または回復も生じる。リボスイッチは、本明細書中に記載された原理に従って、古典的内在性ターミネーターとはかなりの程度異なる転写終結シグナル全体に制御を発揮するよう適合され、設計され得る。本明細書中の他の箇所に記載したように、発現制御ステム構造を有する発現プラットフォームドメインは、アプタマーの制御鎖(P1b)が発現プラットフォームの調節鎖(P1c)とともにステム構造を形成し得るよう、アプタマードメインのP1ステムを設計することにより、アプタマードメインに釣り合わされ得る。
リボスイッチによる遺伝子制御の代替的メカニズムは、翻訳開始の変調である。転写終結と違って、RNAポリメラーゼにより完全mRNAが合成されるが、しかし発現は、代謝産物濃度があるレベルに達するまで、リボスイッチにより防止される。ほとんどの場合、リボスイッチは高濃度の標的代謝産物の存在下で翻訳開始を妨げる、ということが観察された。しかしながらリボスイッチは、リボスイッチ構造のアロステリック変調が翻訳活性化を引き起こすよう、設計され、適合され得る。翻訳制御の調節メカニズムを、大腸菌からのTPPリボスイッチに関していかに簡単に説明する。
thiボックスと呼ばれる保存RNA素子は、チアミンの生合成および輸送に関与するmRNAの5’−UTR内で同定された(D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949; J. Miranda-Rios, M. Navarro, M. Soberon, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98, 9736)。遺伝子実験は、この構造素子が、リゾビウム属のリゾビウムメリロチRhizobium melilotiチアミン生合成遺伝子のチアミン依存性調節に必要とされるということを確証した(J. Miranda-Rios, M. Navarro, M. Soberon, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98, 9736)が、古典的遺伝子実験により調節因子は未だ同定されていなかった。したがってthiボックスは、チアミンまたはその誘導体に応答するリボスイッチの一部として役立ち得ると考えられる。
FMNアプタマーに関して上記したように,thiMおよびthiCリーダーへのTPPの直接結合を、直列プロービング検定により実証した(実施例2参照)。チアミン、チアミン一リン酸(TP)またはピロリン酸誘導体(TPP)の付加は、thi素子を包含する領域において特に,thiM RNAの構造的再配列を引き起こす(図13)。生物活性形態のチアミンであるTPPが500 nMの見掛けのKDでリガンド間の最良の親和性を示し、一方、TPおよびチアミンがそれぞれ3 μMおよび40 μMの見掛けのKDでthiMと会合することは有意である。thiCリーダー領域に類似するRNAの直列プロービング検定は、チアミンおよびそのリン酸化形態間のより劇的な弁別をさえ明示し、チアミンおよびTPPの結合間の1,000倍より大きい差を示す。これらのデータは、TPP合成が調節のために必要であるということを示唆した遺伝子実験と一致する(E. Webb, et al., Journal of Bacteriology 1996, 178, 2533; E. Webb, D. Downs, Journal of Biological Chemistry 1997, 272, 15702)。さらにまたこの計は、リン酸基との生産的接触を成す天然RNAアプタマーの別の例を提供する。
thiMリーダー領域に類似するRNAを合成し、区画が3000ダルトン分子量カットオフ透析膜により分離される2小室平衡透析装置の片側に入れた。小室間が平衡されたら、thiM含有小室内に3H−チアミンを選択的に保持した(実施例2参照)。この作用は、余分量の非標識チアミンを提供することにより排除され得たが、しかしチアミンの近似化学類似体であるオキシチアミンを補足した場合には逆転され得なかった。さらにthiMの突然変異バージョンは、RNA含有小室に3H−チアミンをシフトできなかった。総合して、これらのデータは安定thiM:チアミン複合体の生成を示すが、この場合、RNAの配列およびリガンドの化学的形態は最大結合親和性のために重要である。
thiMに関する直列プロービングデータの精査は、構造変調の2つの意外なパターンを明示する。第一に、チアミンまたはTPPを含有する反応間の自発的断片化の相対比率は、thi素子の内部ループ内で異なる(図13)。この領域におけるヌクレオチドは、TPPの存在下で、しかしチアミンを用いずに構造次元の増大を選び、このことは、この領域がともかくもピロリン酸認識ポケットの形成に関与することを意味する。第二に、SD配列の領域は、TPPの存在下で構造的に変調されるようになるthi素子の外側の唯一の部分である。
バイオインフォーマティックス分析は、リボスイッチRNAの間で頻発するthiMのものと類似の分子メカニズムと一致する。特にアンチSDおよびアンチ−アンチSD構造は、いくつかのリボスイッチクラス、例えばFMN(A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141)、リシン、TPP(D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949)、補酵素B12(実施例1参照)およびSAMに関して提唱されている.概してグラム陰性生物からのリボスイッチは、翻訳全体に制御を発揮する発現プラットフォームのほうを選ぶようであり、一方、グラム陽性細菌からのリボスイッチは、転写終結を制御する発現プラットフォームを優先的に用いると思われる。後者は、グラム陽性生物における多重遺伝子転写単位により大きく依存することを示し、これは、遺伝子産物が不必要である場合、長いオペロンの転写を妨げるためにより効率的であり得る。
FMN、TPP、リシンおよびAdoCblリボスイッチRNAは、進化的に隔たった微生物の間に広く行き渡っており、このことは、これらのRNA遺伝子素子に関する古い起源を意味する(A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141; D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949; D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949)。SAM、グアニンおよびアデニンリボスイッチは、多数の異なる属においても表示されるが、しかしそれらは、2〜3のグラム陰性細菌を除いて、主にグラム陽性細菌に限定されると思われる(実施例6参照)。全ての場合に、リボスイッチクラスの構造および配列保存は、アプタマードメインに限定される(図11)。これは、進化により有意に修飾されなかったアプタマーRNAが標的化学物質を結合するその能力を保存しなければならないと仮定すると、予測されない。これに反して、発現プラットフォーム間には、同一クラスのリボスイッチ間でも、そして同一生物内でも、少なからぬ配列および構造多様性が存在する。合わせて考えると、これらのデータは、リボスイッチアプタマードメインのリガンド結合特性が広範囲の進化という時間の物差しを通して保持されてきた、ということを暗示する。
リボスイッチは、原核生物酵素補因子の生合成および輸送に関与する多数の遺伝子の制御に利用される。枯草菌総ゲノム含量のほぼ2%を表す少なくとも69の遺伝子はリボスイッチRNAの制御下にあり(表1)、これは原核生物における遺伝子制御のためのリボスイッチRNAの広範囲の使用を例示する(M. Mandal, et al., Cell 2003, 113)。多数のリボスイッチ媒介性遺伝子は、ほとんどの増殖条件下で不可欠である、と予測される。リボスイッチ機能による妨害は、次に、生命代謝経路の劇的不安定化をそしておそらくは増殖の停止を生じる、と予測される。したがって標的代謝産物に非常によく似た化合物はリボスイッチRNAと結合し、遺伝子発現の低減を引き起こす、と思われる。遺伝子発現のこの類似体誘導性崩壊が十分である場合には、このような化合物は抗菌的用途の候補であり得る。
1.要約
代謝産物結合mRNAによる遺伝子制御は、原核生物においては広範囲に及んでいる。これらの「リボスイッチ」は、典型的にはmRNAの非コード領域に位置し、そこでそれらはそれらの標的化合物を選択的に結合し、そしてその後、遺伝子発現を変調する。原核生物のチアミンピロリン酸結合ドメインのコンセンサス配列および構造と調和する真菌および植物において同定されたmRNA素子が開示される。シロイヌナズナでは、チアミン生合成遺伝子の3’−UTR中のコンセンサスモチーフ残基および単離RNAドメインは、in vitroで対応する補酵素と結合する。これらの結果は、代謝産物結合mRNAはおそらくは真核生物遺伝子調節に関与し、そしていくつかのリボスイッチは古い形態の遺伝子制御を代表するものであり得る、ということを示唆する。
リボスイッチは、原核生物のある種のメッセンジャーRNAの5’−非翻訳領域に見出され得る遺伝子制御素子である(実施例1〜3参照)。これらの遺伝子スイッチは、2つの意外な特性を示す。第一に、mRNAはタンパク質の助けを借りずに、標的代謝産物に関する高選択性結合部位を形成し得る。第二に、代謝産物結合は、遺伝子発現の変更をもたらすRNA構造のアロステリック再組織化を引き起こす。多数の他の遺伝子制御系と違って、リボスイッチは、代謝産物結合タンパク質を必要とせずにセンサーとして役立ち、したがってmRNAによりコードされる遺伝子情報とその化学的環境との間の直接的連結を提供する。
B12−およびSAM依存性リボスイッチとの配列類似性を示す原核生物において同定された多数のRNA素子が開示される。これらのRNAモチーフが相対的にサイズが大きくそして配列が複雑であると仮定すると、同一素子の多数の進化的再発明が起きたとは考えられない。さらにこれらの遺伝子スイッチの代謝産物トリガーは、タンパク質の出現前の時点に存在したと予測される(White, 1976; Benner et al., 1989; Jeffares et al., 1998)。これは、タンパク質の出現前の、そして代謝がRNAにより完全に誘導された時代であると考えられる古代RNAワールドにおいて生じた既知のクラスの代謝産物感知RNAと一致する(Joyce, 2002)。
細胞の化学的および物理的環境における変化に応答する遺伝子発現の精確な制御は、生化学的センサー素子と遺伝子情報を保有するかまたは解釈する分子との間の選択的相互作用を要する。このような環境変化に応答するほとんどの既知の遺伝子因子は、タンパク質である(Ptashne and Gann 2002)。しかしながら多数の試験(例えば実施例1〜3および6〜8参照)は、天然RNA分子も小有機化合物を認識し、隣接遺伝子の発現を制御するためにアロステリック変化を利用する、ということを実証した。リボスイッチと呼ばれるこれらの代謝産物結合RNAドメインは、典型的にはmRNAの5’−UTR内に埋め込まれ、そして標的化合物の生合成または移入に関与するタンパク質の発現を制御する。リボスイッチは、イオウ代謝に関与する細菌における基本的代謝経路を制御するに際して、そして種々の補酵素およびプリンの生合成に際しても重要な役割を演じ得る(実施例6参照)。さらにリボスイッチは、系統発生学的に真正細菌生物の間に広く行き渡り、そして生化学的データは、リボスイッチが真核生物の遺伝市中にも存在する、ということを示唆する(実施例4参照)。
i.化学物質およびオリゴヌクレオチド
L−リジン、全ての類似体(但しL−α−ホモリシン(化合物6、図20A)、トリチウム化リジン(L−リジン−[4,5−3H(N)])を除く)および4つのジペプチドを、Sigmaから購入した。前に報告されたもの(Dong, Z. 1992, Tetrahedron Lett. 33: 7725-7726)から改作したプロトコールを用いて、L−α−ホモリシンを合成した。TLCおよびNMRにより、合成L−α−ホモリシンの純度および完全性を確証した。
枯草菌lysC5’−UTRとの配列類似性により、Lボックスドメインを同定した。最終的には、パターン(WAGAGGNGC[10]A[3]RKTA[50]RRGR[10]CCGARR[40]GG[13]VAA[13]YTGTCA[36]TGRWG[2]CTWY)との縮重マッチに関して検索するためにプログラムを用いたが、しかしながらこのパターンの低完全バージョンを反復細分とともに用いて、Lボックスモチーフのコンセンサス配列および構造を同定した。括弧内の数字は可変ギャップであり、強制最大長を示す。ヌクレオチド表記法を以下に示す:Y=ピリミジン;R=プリン;W=AまたはT;K=GまたはT;V=A、GまたはC。図18に示した系統発生を生じる場合、このパターンの6までの違反は許される。
T7 RNAポリメラーゼおよび適切なPCR DNA鋳型を用いて、in vitro転写により、枯草菌315 lysC、237 lysCおよび179 lysC RNAを調製した。前記(Seetharaman et al., 2001, Nature Biotechnol. 19, 336-341)と同様のプロトコールを用いて、RNA転写体を脱リン酸化し、その後、5’32P標識した。標識前駆体RNA(〜2 nM)を、実施例1および2に記載したのと同様の条件を用いて直列プロービングに付した。反応物(10 μL)を、L−リジンまたは各実験に関して示したような種々の類似体の存在下または非存在下で、50 mMトリス−HCl(pH8.5, 25℃)、20 mMMgCl2および100 mMKClを含有する緩衝液中で25℃で40時間インキュベートした。変性10%PAGEを用いて、自発的切断産物を分離し、これを、Molecular Dynamicsリン光画像解析装置およびImageQuantソフトウェアを用いることにより、検出し、定量した。
Dispo平衡透析機(ED−1、 Harvard Bioscience)を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000MWCO膜により、2つの小室aおよびbを分離した。緩衝液の最終組成は、50 mMトリス−HCl(pH8.5, 25℃)、20 mMMgCl2および100 mMKClを含有した(各小室に30 μL送達)。3H−リシン(平衡前50 nM初期濃度;40 Ci/mmol; 15,000 cpm)を小室aに付加することにより、検定を開始した。存在する場合、RNA(179 lysC)を小室bに導入して、濃度を10 μMとした。25℃で10時間平衡後、各小室からの3 μl アリコートを、液体シンチレーション計数器による定量のために取り出した。さらに3 μLの緩衝液をaに送達し、そして指示通りに50 μM非標識L−リジン、D−リジン、L−オルニチンまたはL−リジンヒドロキサメートを含有する等容量の緩衝液をbに送達することにより、競合検定を確立した。25℃でさらに10時間インキュベーション後、トリチウム分布の定量のために、3 μlのアリコートを再び取り出した。
前に記載したもの(Landick, R., et al., 1996, Methods Enzymol. 274: 334-353)から適合された1回転写の方法を用いて、転写終結検定を実行した。発生期RNAの最初のC残基が位置17まで遭遇されないよう、lysC5’−UTR転写のための鋳型を変更した。ApAジヌクレオチド(1.35 μM)、GTPおよびUTP(各々2.5 μM)+非標識ATP(1 μM)および[α−32P]−ATP(4 μCi)の混合物の付加により重合を開始し、これを10分間インキュベートした。各々150 μMの4つのNTPの付加により休止複合体を再開させ、そしてヘパリン(0.1 mg/mL)を同時に付加して、新規鋳型上でポリメラーゼが転写を開始するのを防止する。転写混合物は、20 mMトリス−HCl(pH8.0, 23℃)、20 mM NaCl、14 mMMgCl2、0.1 mMEDTA、0.01 mg/mLBSA、1% v/vグリセロール、4 pmolDNA鋳型、0.045 U/μL 大腸菌RNAポリメラーゼ(Epicenter, Madison, WI)および10 mMのL−リジンまたは各実験に関して指示されたようなリジン類似体も含有した。反応物を37℃でさらに20分間インキュベートし、生成物を、変性6%PAGEとその後のリン光画像解析装置を用いた分析により検査した。
本明細書中の他の箇所に記載したものと同様の方法を用いてin vivoでリジンリボスイッチの機能を査定するために、lysC5’−UTRとlacZレポーター遺伝子の融合体を用いた。要するにプロモーターおよび転写鋳型の最初の315個のヌクレオチドを含むlysC5’−UTRを、PCRによりEcoRI−BamHI断片として調製した。所望の突然変異を保有するプライマーを用いて、野生型構築物のPCR増幅により、配列変異体M1〜M3、G39AおよびG40Aを生成した。PCR産物を、lacZレポーター遺伝子の直ぐ上流のpDG1661中でクローン化し、その結果生じたクローンの完全性をシーケンシングにより確証した。枯草菌1A40菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OHから入手)中でのpDG1661変異体の形質転換を実施し、クロラムフェニコール耐性に関して選択し、スペクチノマイシン感受性に関してスクリーニングすることにより、正確な形質転換体を同定した。
i.Lボックス:遺伝子制御に重要である保存mRNA素子
リボスイッチは典型的には、代謝産物結合「アプタマー」ドメインならびに遺伝子発現に必要なmRNA素子をつなぎ合わせる「発現プラットフォーム」の密接な並置により形成される。発現プラットフォームとして役立つRNA配列および構造構成成分は、進化を通して有意に変化するが、しかしアプタマードメインはそのリガンド結合コアの配列組成を主要二次構造特徴とともに大いに保持する。これは、関連RNAドメインを同定するための、そして所定クラスのリボスイッチに関するコンセンサス配列および構造を確立するための系統発生学的分析の使用を可能にする。
リボスイッチは、タンパク質から作製されるそれらの等価物遺伝因子と同様に、精確遺伝子制御を達成するために、それらの標的代謝産物に対する十分な特異性および親和性を示さねばならない。lysC Lボックスドメインの分子認識特質を調べるために、100 μMでリシンの種々の類似体を用いて、一連の直列プロービング検定を実施した。リジン類似体コレクションの特性を検査したが、この場合、各化合物はL−リジンと比較して、最小化学的変化を保有する(図20A)。アミノ酸に対するほぼ全ての化学的変化は、化合物が179lysC RNAの構造変調を引き起こすことができないようにさせる(図20B)。おそらく最も顕著なのは、単一炭素中心での立体化学的立体配置によりL−リジンとは異なるD−リシンの存在下では、RNAは構造変調を受けない、ということである。
種々の濃度のL−リジンを用いて179lysCに関する直列プロービング検定を実行することにより、解離定数(KD)の概算を行なった(図21A)。構造変調の部位は、リガンドの漸増濃度に応答した漸進的低レベルの自発的切断を示す。RNA切断程度対L−リジン濃度のプロット(図21B)は、約1 μMアミノ酸が混合物中に存在する場合に、半最大構造変調が起こる、ということを示し、したがってその標的リガンドに関する179lysCの見掛けのKDを反映する。
今日までに検査された多数のリボスイッチに関しては、リガンド結合に応答して遺伝子発現を制御するのに役立つアプタマードメインの直ぐ下流に存在する識別可能組の構造が認められる。典型的には、この「発現プラットフォーム」の構造は、アプタマードメインに結合する代謝産物により変調される。代替的構造はその後、転写または翻訳過程の変調をもたらす。例えば大腸菌のthiM mRNA上のTPPリボスイッチは、隣接コード領域のシネ−ダルガルノ配列と結合するリボソームを妨害すると思われる発現プラットフォームを保有する(実施例2参照)。同様に枯草菌からの種々のリボスイッチの発現プラットフォームは、転写終結を誘導するステム−ループ構造のリガンド誘導性形成を受ける(例えば実施例3、6および7)。
他のリシン類似体とは違って、L−リジンヒドロキシメートおよび抗菌化合物チオシン(S−(2−アミノエチル)−L−システイン;図22A、差込図)は、転写終結の増大を生じる(図22B、左)。これら2つの化合物は、試験した類似体のいずれかの最良の見掛けのKD値を示し、L−リジンヒドロキシメートおよびチオシンに関する値はそれぞれ、〜100 μMおよび〜30 μMである(データは示されていない)。先行試験において、枯草菌(Vold, B., et al., 1975, J. Bacteriol. 121: 970-974; Lu, Y., et al., 1992, FEMS Microbiol. Lett. 92: 23-27)および大腸菌(Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170)において、チオシンに対する耐性を生じ、そしてlysC発現の低下を生じる一連の突然変異体が同定された。これらの突然変異は全て、リジンアプタマードメインにマッピングされ(選定枯草菌突然変異体に関しては図22A参照)、そして全て、構造の保存素子または塩基対合完全性の崩壊を引き起こすと思われる。
枯草菌におけるリシン生合成の調節解除を生じる第一の突然変異体は、ほぼ30年前に同定された(Vold, B., et al., 1975, J. Bacteriol. 121: 970-974)が、しかしながら遺伝子調節のメカニズムは依然として解決されていない。枯草菌からのlysC mRNAの5’−UTRは、アミノ酸リジンに応答するリボスイッチとして役立つ、ということが実証されたことを、本明細書中に開示した。最初の試験で単離された抑制突然変異体は、リガンドがもはやRNAに結合されないよう、リボスイッチのアプタマードメインの崩壊を生じる。さらに、突然変異体lysC断片レポーター遺伝子融合体を用いたin vivo発現試験は、これらのリボスイッチ突然変異がほとんど、リジンおよびいくつかのその他のアミノ酸に対する生合成経路における第一段階を触媒するアスパルトキナーゼの非調節化過剰発現を引き起こすようである、ということを示す。2つのより顕著なメカニズム、即ち翻訳媒介性転写減衰およびTボックス依存性メカニズム(Henkin, T.M., and Yanofsky, C. 2002, BioEssayts 24: 700-707)はともに、非アミノアシル化tRNAの存在を感知する。実際、枯草菌における20の共通アミノ酸のうちの18は、Tボックス素子の使用により間接的に検出されると思われる。興味深いことに、任意の生物中に既知のtRNAlys依存性T−ボックスは認められず、そしておそらくは本明細書中に記載したリジンリボスイッチは、対応するTボックスの不存在下で、このアミノ酸に関する遺伝子センサーとして役立つ。さらに、いくつかの生物からのnhaC遺伝子と結び付けられるリジンリボスイッチの遺伝子分布は、このRNA遺伝子素子が細胞pHの重要な調節物質であり得る、ということを示す。
1.要約
リボスイッチは、それらの対応する標的に関する精密センサーとして役立つある種のメッセンジャーRNA内の代謝産物結合ドメインである。mRNA構造のアロステリック再配列はリガンド結合により媒介され、そしてこれが遺伝子発現の変調を引き起こす。グアニンを選択的に認識し、そして5 nMという低い濃度で飽和されるようになるリボスイッチの一クラスを、本明細書中に開示する。枯草菌では、このmRNAモチーフは、ほとんどプリン輸送およびプリンヌクレオチド生合成に関与する17の遺伝子を一緒にコードする少なくとも5つの別個の転写単位上に位置する。これらの知見は、代謝産物を感知し、そしてタンパク質因子を必要とせずに遺伝子発現を制御するmRNAのさらなる例を提供する。さらに、リボスイッチはある種の細菌における多数の基礎代謝経路の調節に寄与する、ということがここに明らかになる。
タンパク質因子および核酸の相互作用が、現代細胞における遺伝子発現のための複雑な調節ネットワークを導く、ということは広範に理解されている。ほとんどの場合、タンパク質因子は遺伝子発現ネットワークを保持するのにぴったりの作用物質であると思われる。タンパク質は複雑な形状をとり、生体系にそれらの化学的および物理的環境を精確に感知させる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には転写開始を変調するためにDNAを結合することにより(例えばlacリプレッサータンパク質;Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164)、あるいは転写終結(例えばPyrRタンパク質;Switzer, R.L., et al., 1999, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367)または翻訳(例えばTRAPタンパク質;Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802)を制御するためにRNAを結合することにより作用する。タンパク質因子は、種々のメカニズムにより、例えばアロステリック変調または翻訳後修飾により環境刺激に応答し、そして高応答性遺伝子スイッチとして役立てるためにこれらのメカニズムを利用するのに熟達している(例えばPtashne, M., and Gann, A. (2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY参照)。
i.化学物質およびオリゴヌクレオチド
グアニンおよびその類似体キサンチン、ヒポキサンチン、アデニン、グアノシン、7−メチルグアニン、N2−メチルグアニン、1−メチルキサンチン、3−メチルキサンチン、8−メチルキサンチン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、アロプリノール、2−アミノ−6−メルカプトプリン、ルマジンおよびグアニン−8−3H塩酸塩を、Sigmaから購入した。イノシン、尿酸、2−アミノ−6−ブロモプリン、O−メチルグアニンおよびプテリンを、Aldrichから購入した。
デフォルトパラメーターを用いたGenBankのBLASTN検索を実行することにより、xpt−pbuX5’−UTRとの配列類似性によりGボックスドメインを同定した。パターン(<<<<[2]TA[6]<<<[2]ATNNGG[2]>>>[5]GTNTCTAC[3]<<<<<[3]CCNNNAA[3]>>>>>[5]>>>>)との縮重マッチに関して検索することにより、これらのヒットを拡大した。急角度括弧は塩基対合を示す。括弧内の数字は可変ギャップであり、強制最大長を示す。図23に示した系統発生を生じる場合、このパターンの合計4つまでの違反は許された。BS3−xptドメイン(xpt−pbuXリーダーのドメイン)のみがグアニンと結合することが示された、ということに留意することは、この場合に重要である。VV1代表物の分子特異性がアデニンに対してであり、グアニンではない、ということが実証された(未発表データ)。グアニン結合RNAアプタマーがアデニンと結合するよう変更され得る(例えばグアニンとのワトソン−クリック対合相互作用を成すためにC残基がアプタマーにより用いられる場合、CからUへの変化)考え得る自明の手段を仮定すると、その他の代表物も分子認識を変更した、ということは除外され得ない。
T7 RNAポリメラーゼおよび適切なPCR DNA鋳型を用いて、in vitro転写により、枯草菌201xptリーダーおよび切頭化93xptアプタマーRNAを調製し、その後、前記(Seetharaman, S. et al., 2001, Nature Biotechnol. 19, 336-341)と同様のプロトコールを用いて、5’32P標識した。標識前駆体RNA(〜2 nM)を、実施例2に記載したのと同様の条件を用いて直列プロービングに付した。反応物(10 μL)を、各実験に関して示したようにプリンの存在下または不存在下で、50 mMトリス−HCl(pH8.5, 25℃)、20 mMMgCl2および100 mMKClを含有する緩衝液中で25℃で40時間インキュベートした。1 nM〜10 μMの範囲のプリン濃度を典型的には用いたが、しかし貧結合リガンドに関しては300 μMという高い範囲であった。変性10%PAGEを用いて、自発的切断産物を分離し、Molecular Dynamicsリン光画像解析装置を用いてその結果を調べた。ImageQuantソフトウェアを用いることにより、自発的切断収量の定量を達成した。直列プロービングに関する2 nMより低いRNAの濃度はシグナルレベルが不十分なために容易に使用できないため、この濃度に近い見掛けのKD値は最大可能値を示す。
Dispo平衡透析機(ED−1、 Harvard Bioscience)を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000MWCO膜により、2つの小室aおよびbを分離した。緩衝液の最終組成は、50 mMトリス−HCl(pH8.5, 25℃)、20 mMMgCl2および100 mMKClを含有した(各小室に30 μL送達)。小室aは3H−グアニンも含有したが、一方、小室bも各実験に関して指示したような300 nMのxptRNA構築物を含有した。25℃で10時間平衡後、各小室からの5 μl アリコートを、液体シンチレーション計数器による定量のために取り出した。適切な場合には、さらに5 μLの緩衝液をaに送達し、そして500 nM非標識プリンを含有する等容量の緩衝液をbに付加した。25℃でさらに10時間インキュベーション後、トリチウム分布の定量のために、5 μlのアリコートを再び取り出した。
本明細書中の他の箇所に記載したのと同様のアプローチを用いて、遺伝子操作を実行した。要するに、枯草菌1A40菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH)からのxpt−pbuXオペロンの転写開始部位に関してnt−121〜+197を包含するDNA構築物を、EcoR1−BamH1断片としてPCR増幅した。生成物を、lacZレポーター遺伝子の直ぐ上流の部位でpDG1661中にクローン化した。適切なプライマーおよびQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いることにより、工学処理pD1661内に突然変異体を作製した。プラスミド突然変異体を、菌株1A40のamyE遺伝子座に組み込んだ。形質転換体を、クロラムフェニコール(5 μg/ml)耐性に関して選択し、スペクチノマイシン(100 μg/ml)に対する感受性に関してスクリーニングした。シーケンシングにより、各構築物の完全性を確証した。
0.4% w/vグルコース、20 g/L(NH4)2SO4、25 g/LK2HPO4・3H2O、6 g/LKH2PO4、1 g/Lクエン酸ナトリウム、0.2 g/LMgSO4・7H2O、0.2%グルタミン酸塩、5 μg/mlクロラムフェニコール、50 μg/mlL−トリプトファン、50 μg/mlL−リシンおよび50 μg/mlL−メチオニンを含有する最少培地中で、37℃で振盪しながら枯草菌細胞を増殖させた。プリンを付加し、最終濃度を0.5 mg/mlとした。中期対数期の細胞(〜0.1のA595)を遠心分離により収穫し、各実験に関する指示通りに、プリン(0.5 mg/mL)の非存在下または存在下で最小倍地中に再懸濁した。グアニンの貧溶解性は、この濃度での検出可能レベルの沈殿生成を生じるが、しかし細胞増殖の悪影響は観察されなかった。別記しない限り、細胞をさらに3時間インキュベートしたの地、β−ガラクトシダーゼ検定を実施する。図28Cに示したデータを、上記と同様に生成したが、但し、β−ガラクトシダーゼ検定は、指示された時間で実施した。
i.いくつかの枯草菌mRNAの5’−UTR中の保存ドメイン
xpt−pbuXオペロンは、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチンにより調節される。これらのプリン化合物は化学的類似性を共有し、そしてプリン回収の経路において互いに隣接する。プリンオペロンと対比して、xpt−pbuXオペロンの調節は、アデニンデアミナーゼが不活性である菌株中では、依然としてアデニンの影響を受けない(Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540-2550)。これらの観察は、非同定タンパク質因子がグアニン認識に関与し得る、という推測を促した(Ebbole, D.J., and Zalkin, H. 1987, J. Biol. Chem. 262, 8274-8287)が、しかしながらこのような遺伝因子は同定されていない。さらにxpt−pbuX mRNAの5’−UTRはかなり大きく(185ヌクレオチド)、これはリボスイッチドメインを収容するには十分である。
枯草菌のxpt−pbuX5’−UTRを基礎にした2つのRNA構築物を調製して、mRNAがグアニンまたはその最も近似の類似体を選択的に結合するか否かを調べた。T7RNAポリメラーゼに関するプロモーター配列ならびにさらなる操作を可能にするいくつかのヌクレオチド付加および突然変異を導入されたプライマーを用いて、PCRにより、xpt−pbuXmRNAの完全5’UTRならびに最初の4つのコドンに対応する二本鎖DNA鋳型を生成した(図24B;実験手順も参照)。UTRの5’半分を包含する切頭形態のこの構築物も、PCRにより作製した。転写時に、短い方のDNA鋳型は93xptと呼ばれる93−ヌクレオチド転写体を生成し、一方、長い方の鋳型は201xptと呼ばれる201−ヌクレオチド転写体を産生する。
精確な代謝恒常性を保持するために、細胞はその標的代謝産物の濃度を感知できなければならないが、しかしそうでなければ遺伝子変調を不注意に誘発し得る他の化合物との調節的掛け合いの防止もしなければならない。実際、他のリボスイッチの特質は、密接に関連する代謝産物間を弁別する能力である。例えばFMNおよびTPPリボスイッチは、非リン酸化補酵素前駆体チアミンおよびリボフラビンを〜1,000倍弁別する(実施例2および3参照)。
平衡透析を用いて、xpt−pbuXオペロンからのGボックスRNAは、その他のプリンおよびプリン類似体全体で選択的にグアニンを結合する、というさらなる証拠を提供した。トリチウム化グアニンにおける実質的シフトは、余分量の機能性RNAが一方の消失に付加された場合に、2−小室透析装置において起きると予測される(図27A)。さらにこのシフト平衡は、余分量の非標識競合体リガンドの付加時に単一体に戻る必要がある。予測どおり、90%より多いとリチウム化グアニンが93xptRNAと共局在化され、その後、余分量の非標識グアニンが導入されると、再分布する、ということが観察された。これに反して、過剰非標識類似体の存在は、3H−グアニンおよびRNAの共局在化に影響を及ぼさない(図27B)。ヌクレオシドグアノシン(9−リボシルグアノシン)でさえ2つの小室間のグアノシンの等分布を回復できないが、これは、塩基単独のためのぴったりとしたポケットを形成するためのRNAフォールディングと一致する。
種々の突然変異をGボックスドメインに導入して、いくつかの構造阻止および保存ヌクレオチドの重要性を調べた(図28A)。平衡透析を用いることにより、93xptRNAの情況で、グアニン結合に及ぼすこれらの突然変異の影響を確定した。3つのステムを独立して崩壊させる突然変異(M1、M4およびM6)は、中心接合部に2つの突然変異を保有する変異体RNA(M3)の場合と同様に、結合機能の損失を引き起こす(図28B)。これに反して、塩基対合を回復する補償的突然変異を作ることにより(M2、M5およびM7)、破壊的ステム突然変異の作用は大いに逆転される。これらの結果は、ステム構造は重要であるが、しかしこれらの素子の精確な配列組成はあまり重要性を有さないということを示す系統発生学的分析と一致する(図23)。
xpt−pbuXオペロンのGボックスRNAはその標的に対して並外れた親和性および選択性を示すグアニン感知リボスイッチの重要な構造素子である、ということをわれわれの知見は示す。枯草菌では、この一般的リボスイッチモチーフは、少なくとも5つの転写単位を制御すると思われる(図23)。この新規同定レギュロンにおける遺伝子産物のいくつかの精確な機能は明白に限定されてはいないが、しかし枯草菌からの、ならびにその他の生物からの既知の遺伝子は大部分がプリン代謝に関連する。本明細書中に開示された結果に基づいて、この大型purオペロンの5’−UTR内のGボックスドメインがグアニン依存性リボスイッチ調節に関与しており、そして遺伝子調節メカニズムは、xpt−pbuXオペロンに関して本明細書中に提唱されたのと同様であり得ると思われる。
グアニンが代謝産物結合mRNAにより感知されるというこの論証は、リボスイッチの既知のクラスを拡大し、そしてある種の細菌RNAが全ての生体系の基本である重要な補酵素およびその他の化合物の濃度のモニタリングに関与する、という付加的証拠を提供する。
リボスイッチは、ある種のメッセンジャーRNAに関する遺伝子制御素子として役立つ代謝産物結合RNA構造である。これらのRNAスイッチは、3つの生物界の全てにおいて同定されており、そして典型的にはそのタンパク質産物が標的代謝産物の生合成、輸送または利用に関与する遺伝子の制御に責任を負う。本明細書中に開示したように、細菌に見出される高度保存RNAドメインは、顕著に高い親和性および特異性で、補酵素S−アデノシルメチオニン(SAM)に応答するリボスイッチとして役立つ。SAMリボスイッチはSAMの導入時に構造的再組織化を受け、そしてこれらのアロステリック変化が枯草菌における26の遺伝子の発現を調節する。このそして関連する知見は、小代謝産物およびアロステリックmRNA間の直接相互作用は、細菌における遺伝子調節の有意の且つ広範な形態である、ということを示す。
i.SAM応答性リボスイッチの同定
過去に同定されたリボスイッチにより感知される化合物の各々(補酵素B12、TPP、FMN)は、現代タンパク質酵素により補酵素として用いられる。興味深いことに、これらの補酵素は、RNAワールドにおいて古代リボザイムにより補酵素としてもそれらが用いられ得たという推測を支持するために用いられてきたRNAと有意の構造類似性を有する(S.A. Benner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7054(1989); H.B. White III, J. Mol. Evol. 7, 101(1976); D.C. Jeffares, et al., J. Mol. Evol. 46, 18(1998))。現代リボスイッチが、RNAワールドにおいて生じたRNA制御系の直接の子孫である場合には、それれは代謝産物を感知し、そしてそれらが制御する代謝経路は現代生化学過程に対する基本的重要性を有する。この仮説をさらに査定するために、それらの生化学的特質を確定するために、そしてゲノムワイドのレベルでの遺伝子制御におけるそれらの役割を確立するために、付加的リボスイッチに関する検索を実施した。
代謝産物に応答する遺伝子スイッチは、生理学的濃度に関連した解離定数(KD)でその標的を結合できなければならない。さらに代謝産物受容体は、同一環境中で生じると思われる密生津に関連した化合物を精確に弁別するか、または遺伝子発現の望ましくない変調を合えて行なうことができなければならない。したがってSAMに対するyitJRNAの親和性を、ならびにこの標的と構造的に類似する生物学的関連化合物を弁別するRNAの能力を査定した(図30a)。
系統発生学的で得たを用いて、SAM結合アプタマードメインに関する二次構造モデルを確立した(F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998))。このモデルに関するさらなる支持を提供するために、これらの突然変異体アプタマーを基礎にした変異体リボスイッチと融合した場合の、124yitJRNAの結合機能に及ぼす、そしてlacZレポーター遺伝子のSAM媒介性遺伝子制御に及ぼす破壊的および補償的突然変異(図32a)の影響を調べた。アプタマーの保存コア(M1)を変更する、あるいは4つの主要塩基対合領域(M2、M4、M6およびM8)の各々における塩基対合を崩壊する突然変異は、平衡透析により確定した場合、SAM結合機能の損失を大々的に生じる(図32b)。これらのステムにおける塩基対合を回復する補償的突然変異(M3、M5、M7、M9)は、少なくとも一部の結合活性を回復する。
本明細書中に開示した細菌リボスイッチは、転写終結または翻訳開始を変調することにより遺伝子発現を制御し得る(実施例2および3参照)が、一方、真核生物におけるいくつかの推定リボスイッチは、いくつかの異なるメカニズムのうちの1つを用い得る。枯草菌では、SAM結合アプタマードメインは、典型的には推定転写ターミネーターヘアピンから直ぐ上流に存在し(F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998))、これは、SAM結合がほとんど、FMN−およびTPP依存性リボスイッチに関して前に記載されたように、転写終結を誘導すると思われる、ということを意味する(実施例3参照)。
SAMリボスイッチにより制御されるレギュロンを含む11の転写単位(F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998))は、イオウ代謝、アミノ酸代謝およびSAM生合成に対して中心部にある少なくとも26個の遺伝子を包含すると思われる。枯草菌からの11の転写単位は全てコンセンサスSボックス素子を保有するが、しかしこれらのうちの1つ(cysH)からの遺伝子発現は、その他のSボックスRNAの場合のように、培地へのメチオニンの付加により変調されない、ということを近年の報告は示す(M.C. Mansilla, et al., J. Bacteriol. 182, 5885 (2000))。枯草菌cysHからのアプタマードメインは、同一生物からのyitJの場合より2等級以上低い大きさである親和性でSAMと結合する(図34a)。しかしながら炭疽菌からのcysH相同体は、yitJの場合に釣り合うKDを示し(図34b)、このことは、枯草菌cysHアプタマーが枯草菌cysHアプタマーが、多少劣化された結合親和性を有する1つまたは複数の突然変異を蒙ったことを意味する。
最新の生化学的およびバイオインフォーマティックスデータは、枯草菌がリボスイッチ制御下の少なくとも68個の遺伝子(その総遺伝子補体のほぼ2%)を有する、ということを示す。さらにこれらのmRNAの各々は、生物学において普遍的である生物学的化合物に応答している。基本的代謝過程に関する遺伝子制御素子がRNAにより形成される、という事実は、このポリマーが化学的環境を精確にモニタリングするために必要とされる構造的精巧さを有し、そして代謝産物結合事象を遺伝子応答に変換する、ということを示す。原子レベルでのリボスイッチ構造のさらに詳細な分析は、代謝産物結合がアロステリック再組織化RNA遺伝子スイッチをいかに促すかを確定するに際して多大な有用性を有する。
i.DNAオリゴヌクレオチドおよび化学物質
合成DNAは、エール大学のKeck Foundation Biotechnology Resource Centerから購入した。in vitro転写によるRNAの調製を実行した(Seetharaman, S. et al., Nat. Biotechnol. 19, 336-341 (2001))し、生成物を実施例2に記載したように精製した。SAM、SAMの種々の類似体およびS−アデノシル−L−メチオニン−メチル−3H(3H−SAM)は、Sigmaから購入した。
転写開始部位に関してヌクレオチド−380〜+15を包含するyitJDNA構築物を、枯草菌染色体DNA(菌株168)のPCR増幅時にEcoR1およびBamH1制限部位を精製したプライマーを用いて調製した。生成物を、lacZレポーター遺伝子の直ぐ上流にリボスイッチを置くこれらの制限部位を用いて、pDG1661(26参照;Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH)中にクローン化した。適切な突然変異原性プライマーおよびQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いることにより、突然変異体を作製した。シーケンシングにより、全配列を確証した。
枯草菌1A234菌株を、Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OHから入手した。濃化培地(2XYTブロスまたはトリプトース血液寒天ベース)または限定培地(0.5% w/vグルコース、20 g/L(NH4)2SO4、183 g/LK2HPO4・3H2O、60 g/LKH2PO4、10 g/Lクエン酸ナトリウム、2 g/LMgSO4・7H2O、5 μMMnCl2、50 μg/Lトリプトファンおよび50 μg/Lグルタミン酸塩)中で、37℃で振盪しながら細胞を増殖させた。メチオニンを、ルーチン増殖のために50 μg/Lに付加した。0.1のA595へのルーチン増殖条件下でのインキュベーションによりメチオニン限定条件下での増殖を確立し、この時点で、遠心分離により細胞をペレット化し、最小培地中に再懸濁して、2つのアリコートに分割し、50 μg/L(+メチオニン)または0.75 μg/L(−メチオニン)を補足した。培養をさらに3時間インキュベートした後、β−ガラクトシダーゼ検定を実施した。枯草菌中でのpDG1661変異体(DNA構築物参照)の形質転換を、他の箇所に記載したように実施した(H. Jarmer, et al., FEMS Microbiol. Lett. 206, 197 (2002))。クロラムフェニコール(5 μg/mL)耐性に関して選択し、スペクチノマイシン(100 μg/mL)感受性に関してスクリーニングすることにより、正確な形質転換体を同定した。amyE特異的プライマーを用いて、PCRにより、二重交差組換えによる適正な部位特異的ゲノム挿入を確証した。
50 mMトリス−HCl(pH7.5, 23℃)、15 mMMgCl2、2 mMスペルミジン、5 mMDTTの存在下で37℃で2時間、〜3 pmolの特定鋳型DNA、200 μMの各NTP、5 μCi[α−32P]UTP(1 Ci=37 GBq)および50単位のT7 RNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を含有する転写反応物(10 μL)をインキュベートした。SAMおよびその類似体を付加して、最終濃度を50 μMとした。各々の場合に、GGで開始し、推定天然転写開始を包含し(F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998))、そして隣接オープンリーディングフレームの最初の13コドンを含む転写体を産生した対応するプライマーを用いて、PCRにより、枯草菌のSボックスレギュロン中の11のリボスイッチドメインの全てに関して転写鋳型を生成した。変性6%PAGEにより転写産物を分離し、リン光画像解析装置により可視化した。併合終結および全長RNAと比較した終結帯域中のRNAの比率を確定することにより、終結収量を概算した。
グアニンを認識し、そしてほとんどの他のプリン類似体を弁別するリボスイッチの一クラスが、近年同定された(実施例6参照)。グアニンリボスイッチのコンセンサス配列および構造特徴を保有する代表的RNAは、原核生物の多数の遺伝子の5’−非翻訳領域(UTR)に置かれるが、この場合、それらはプリンサルベージおよび生合成に関与するタンパク質の発現を制御する。本実施例は、この系統発生学的収集物の3つの代表物が、グアニンに関するよりも数等級良好な大きさである見掛けの解離定数(見掛けのKD)に関する値を有するアデニンと結合することを示す。アデニンに対する選択は、リボスイッチのコア中の単一ヌクレオチド置換のためであり、この場合、各代表物はほとんど、ワトソン/クリック塩基対を形成することによりその対応するリガンドを認識すると思われる。さらに枯草菌のydhL遺伝子に関連したアデニン特異的リボスイッチは、遺伝子「オン」スイッチとして機能し、この場合、アデニン結合は、内在的転写ターミネーターステムの形成を妨げる構造的再配列を引き起こす。
i.リボスイッチドメイン間の系統発生学的比較
比較配列戦略を用いて、「Gボックス」と呼ばれる保存配列素子を保有する多数の原核生物種からの一連の遺伝子間領域を同定した(実施例6参照)。枯草菌は少なくとも5つのこれらのモチーフを保有するが、これも、遺伝学技法を用いて同定された(Johansen, L.E., et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209)。系統発生学の各代表物は、3つの潜在的塩基対合素子(P1〜P3)、ならびに今日までに同定された例の90%より多くに保存されている24という多数のヌクレオチドを有する。強調されたGボックスモチーフに共通の特徴を有するこの系統発生学のサブセットを、本明細書中に提示する(図35A)。選定代表物をより詳細に試験すると、それらは直ぐ下流の遺伝子のmRNA転写体により包含され、したがってあるmRNAの5’−UTR中に位置するRNA素子として存在する。
xptアプタマーはそのリガンドと多数の接触を成し、そして7つという多数の水素結合がRNA−リガンド複合体の形成に関与する、ということが確立された(実施例6参照)。さらに立体的衝突も、RNAにより結合され得る代謝産物の範囲を制限するのを手助けすると思われる、という証拠が存在する。この接触アレイは、グアニンの種々の側とRNAの遠位部分との間に多数の相互作用を生成することにより確立され得るに過ぎない。
興味をそそる仮説は、xptの位置74のC残基がグアニンとワトソン/クリック塩基対を形成しており、したがってこれらの水素結合のうちの3つを形成すると考えられるという可能性である。U突然変異は、枯草菌ydhLならびにウエルシュ菌C. perfringensおよびビブリオブルニフィカスV. vulnificusからの2つのRNAにおける対応する位置に存在するため、これらのRNAはアデニン応答性リボスイッチとして役立ち得る、とわれわれは考える。この仮説は、後者2つの遺伝子(add)がアデニンデアミナーゼ酵素をコードする、という認識によりさらに支持された。アデニンは、アデニンデアミナーゼの発現レベルを確定するためにその濃度がモニタリングされている代謝産物であるに違いない、ということは理にかなっていると思われる。
リボスイッチの別の特質は、アプタマードメインがそれらの対応する標的化合物に対する緊密な結合を示し、そしてそれらが、いくつかの場合には、見掛けのKDにおける大きさのオーダーで類似体を弁別する、というものである。例えば枯草菌xptからのグアニンリボスイッチは、〜5 nMのグアニンに関する見掛けのKDを示すが、しかし少なくとも100,000分の1の見掛けのKDでアデニンを結合する。直列プロービング検定を用いて、これら2つのプリンに関する枯草菌80ydhL RNAの結合親和性を確定した。予測どおり、RNAは、漸増濃度のアデニンの存在下で自発的RNA切断断片のパターンの漸進的変化を示す(図37A)が、しかし10 μMという高い漸増グアニン濃度を用いた場合はパターンは変わらないままである(下記参照)。
xptおよびydhL RNAはワトソン/クリック塩基対合相互作用によりグアニンまたはアデニンに対するそれらの特異性を引き出しているという考えを、分子工学処理アプローチを用いてより詳細に調べた。同様のアプローチは、グアニンからアデニンへの脱塩基ハンマーヘッド形リボザイム構築物のリガンド奪回特異性を変えるために、以前用いられた(Wilson, K.S. & Hippel, P.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8793-8797)。Gボックスアプタマーの野生型(93xptおよび80ydhL)および突然変異体(93xptCからUへおよび80ydhL UからCへ)形態をともに生成し、グアニンおよびアデニンとの結合親和性に関して試験した(図39)。突然変異は、xpt配列に関してヌクレオチド位置74に対応し(図35B)、これはグアニンおよびアデニン間の分子弁別の決定因子であると推測される。
ほとんどの場合、リボスイッチは、交互塩基対構造間のアロステリック相互転換により、原核生物における遺伝子発現を制御する。例えば大腸菌のthiM遺伝子からのTPPリボスイッチは、リガンドの存在下でmRNAのシネ−ダルガルノ配列を封鎖するために交互塩基対合を用いて、おそらくは、翻訳開始低減を生じる(実施例2参照)。これに反して、枯草菌からのTPPリボスイッチは、リガンド結合事象を利用して、塩基対合パターンを変更し、そして転写延長を中止させる内在性ターミネーターステムを形成する(Gusarov, I & Nudler, E. Mol. Cell. 4, 495-504 (1999); Mironov, A.S. et al. Cell 111, 747-756 (2002))。同様に、転写ターミネーターの代謝産物媒介性形成は、FMN(実施例3および6参照)、SAM(実施例7参照)、グアニン(実施例6参照)およびリシン(実施例5参照)に応答するリボスイッチのある種の例により用いられるメカニズムである。
i.アデニンリボスイッチの構造および進化
グアニン−およびアデニン特異性GボックスRNA間の配列および生化学的類似性は、それらが二次および三次構造全体において類似している、ということを示す。xptおよびydhLアプタマーに単一突然変異を作ることによりこれらのアプタマーのリガンド特異性を容易に交換し得ることは、このような変化が天然集団において高頻度で起こり得る、ということを示唆する。しかしながら、xptまたはydhLリボスイッチの単一塩基変異体はどちらも、in vivoでの遺伝子制御における対応する特異性変化を示さないという事実は、リボスイッチ特異性における有用な交換を成すためには多数の突然変異が必要であり得る、ということを示唆する。
2−フルオロアデニンの毒性作用に耐える枯草菌の突然変異体株が、近年報告された(Johansen, L.E., et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209)。ydhL遺伝子産物の過剰発現を引き起こすこれらの突然変異を、アデニンリボスイッチドメインにマッピングした。いずれの場合も、変化(欠失)は、ターミネーターステムの一部を排除することにより、あるいはターミネーターステムとそしてアデニンアプタマードメインの一部をともに排除することにより、リボスイッチ機能を破壊する、と予測される。両方の場合に、変異体は、リボスイッチがそのデフォルト状態を取るのを妨げ(転写終結)、これが遺伝子発現の非変調活性化を引き起こす。
枯草菌からのアデニンリボスイッチは、その作用メカニズムに関しても注目に値する。今日までに調べられたリボスイッチの大多数において、代謝産物結合は遺伝子発現の低下を引き起こす。これは、完全mRNAの転写を防止するためのターミネーターステムのリガンド媒介性形成により、あるいはシネ−ダルガルノ配列を封鎖し、そして翻訳開始を妨げることにより生じる。ほとんどの場合、十分レベルの特定の代謝産物の蓄積は理論的に、化合物の生合成または移入に関与する遺伝子を止めるためのシグナルを提供るはずあるので、遺伝子発現の下向き調節が予測される(Grundy, F.J. & Henkin, T.M. et al., Frontiers Biosci. 8, D20-31 (2003)。)
i.プリン類似体
グアニン、アデニン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、ヒポキサンチン、キサンチン、1−メチルアデニン、プリン、6−メチルアミノプリン、N6−N6ジメチルアデニン、6−メルカプトプリン、3−メチルアデニン、グアニン−8−3Hおよびアデニン−2,8−3Hを、Sigmaから購入した。6−シアノプリンおよび8−アザアデニンを、Aldrichから購入し、2−クロロアデニン、8−クロロアデニンをBiolog Life Science Institute, Germanyから購入した。
オリゴヌクレオチドは、エール大学のHHMI Keck Foundation Biotechnology Resource Centerが合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、そして10 mMトリス−HCl(pH7.5, 23℃)、200 mMNaClおよび1 mMEDTAを含有する緩衝液中での粉砕/浸漬により、ゲルから溶離した。エタノールを用いてDNAを沈降させ、脱イオン水中に再懸濁し、使用するまで−20℃で保存した。
実施例6に記載したように、T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitro転写し、脱リン酸化し、そして32Pで5’末端標識することにより、対応するPCR DNA鋳型から、RNA構築物を合成した。典型的直列プロービング検定では、2 nMの標識RNAを、各実験に関して示したのと同じプリン化合物の不存在下または存在下で、20 mMMgCl2、50 mMトリス−HCl(pH8.5, 25℃)および100 mMKClを含有する緩衝液中で25℃で40時間インキュベートした。別記しない限り、1 nM〜10 μMの範囲のプリン濃度を用いた。各インキュベーションの終了時に、変性(8 M尿素)10%PAGE上で自発的切断産物を分離し、リン光画像解析装置を用いて可視化し、そしてImageQuaNTソフトウェア(Molecular Dynamics)を用いて定量した。
Dispo平衡透析機(Harvard Bioscience)を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000MWCO膜により、小室AおよびBを分離した。小室Aは、50 mMトリス−HCl(pH8.5, 25℃)、20 mMMgCl2および100 mMKClを含有する緩衝液中に100 nMの濃度で30 μlの3H−グアニンまたは3H−アデニンを含有した。3 μMの濃度でRNAを含有する上記の緩衝液の30 μlアリコートを、小室Bに送達した。25℃で10時間平衡を進行させた。その後、5 μlを各小室から取り出し、液体シンチレーション計数により定量した。
ydhLの翻訳開始部位に関してヌクレオチド−468〜+9を包含するDNA構築物を、EcoR1−BamH1制限部位を導入されたプライマーを用いて、枯草菌1A40菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH)からPCR増幅した。野生型構築物を、lacZレポーター遺伝子の直ぐ上流のEcoR1−BamH1制限部位でpDG1661中にクローン化し、シーケンシングして、その完全性を確証した。その結果生じたプラスミドを、適切なプライマーを用いたQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)による部位特異的突然変異誘発のための鋳型として用いた。プラスミド突然変異体を、枯草菌1A40菌株のamyE遺伝子座に組み込んで、形質転換体を、実施例6に記載したのと同様に確証した。
0.4% w/vグルコース、20 g/L(NH4)2SO4、25 g/LK2HPO4、6 g/LKH2PO4、1 g/Lクエン酸ナトリウム、0.2 g/LMgSO4・7H2O、0.2%グルタミン酸塩、5 μg/mlクロラムフェニコール、50 μg/mLL−トリプトファン、50 μg/mLL−リシンおよび50 μg/LL−メチオニンを含有する最少培地中で、37℃で絶えず振盪しながら、形質転換枯草菌細胞を中期対数期に増殖させた。グアニンまたはアデニンを付加して、最終濃度を0.1 mg/mlとした。中期対数期の細胞を収穫し、プリンの存在下または非存在下で最少培地中に再懸濁し、各実験に関して指示したようなさらなる時間の間増殖させ、この時点で、1 mlの細胞を、Miller (Miller, In: A Short Course in Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, p.72. (1992)により記載された方法の変法を用いて、β−ガラクトシダーゼ酵素検定に付した。
図41は、リボスイッチの配列および型を示す。これらの配列のアラインメントは、本明細書中に開示されたものと同様であり、他の図面に開示された領域は、図41における同一領域に対応する。
(1)誤って注釈されたORFであり得る非常に短い仮説的遺伝子。
(2)考え得るSボックス「偽遺伝子」。Sボックスは指示オペロンの反対鎖5’上にある。
Claims (19)
- コード領域と操作可能的に連結されるリボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含む調節可能遺伝子発現構築物であって、当該リボスイッチがRNAの発現を調節し、かつ、当該リボスイッチとコード領域が非相同である構築物。
- 前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項1記載の構築物。
- 前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメインがP1ステムを含み、P1ステムがアプタマー鎖および制御鎖を含み、発現プラットフォームドメインが調節鎖を含み、調節鎖、制御鎖またはその両方がステム構造を形成するよう設計されている、請求項1記載の構築物。
- 天然リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチ。
- 前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項4記載のリボスイッチ。
- 前記リボスイッチが天然グアニン応答リボスイッチ、アデニン応答リボスイッチ、リジン応答リボスイッチ、チアミンピロホスフェート応答リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答リボスイッチまたはS−アデノシルメチオニン応答リボスイッチから得られる、請求項4記載のリボスイッチ。
- トリガー分子により活性化され、トリガー分子により活性化されるとシグナルを生じる、請求項4記載のリボスイッチ。
- 試料およびリボスイッチを接触させることを包含する当該化合物の検出方法であって、当該化合物により活性化されるとリボスイッチがシグナルを生じ、試料が当該化合物を含有する場合にリボスイッチがシグナルを生じる前記方法。
- 前記化合物により活性化されるとリボスイッチが立体配座を変え、立体配座の変化が立体配座依存性標識によりシグナルを生じる、請求項8記載の方法。
- 前記化合物により活性化されるとリボスイッチが立体配座を変え、立体配座の変化がリボスイッチに連結されたRNAの発現の変化を引き起こし、発現の変化がシグナルを生じる、請求項8記載の方法。
- 前記リボスイッチに連結されたRNAから発現されるレポータータンパク質によりシグナルが生成される、請求項10記載の方法。
- 遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造:
R13はH、H2であるかまたは存在せず、
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8およびR9は、各々独立して、C、N、OまたはSであり、
を有し、
当該化合物はグアニン、ヒポキサンチンまたはキサンチンではなく、
当該細胞がグアニン応答リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、当該化合物がグアニン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。 - 遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造:
R13はH、H2であるかまたは存在せず、
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8およびR9は、各々独立して、C、N、OまたはSであり、
を有し、
当該化合物はアデニン、2,6−ジアミノプリンまたは2−アミノプリンではなく、
当該細胞がアデニン応答リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、当該化合物がアデニン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。 - R2およびR3が各々NH3 +であり、そしてR1がO-である、請求項14記載の方法。
- 遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造:
R2およびR3は、各々独立して、C、OまたはSであり、
R4はCH3、NH2、OH、SH、Hであるかまたは存在せず、
R5はCH3、NH2、OH、SHまたはHであり、
R6はCまたはNであり、
を有し、
当該化合物がTPP、TPまたはチアミンではなく、
当該細胞がチアミンピロリン酸応答リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、当該化合物がチアミンピロリン酸応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。 - R1がホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである、請求項16記載の方法。
- 以下のステップ:
(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制するための化合物を試験し、この場合、抑制はリボスイッチにより、
(b)細胞と、過程(a)における遺伝子発現を抑制した化合物とを接触させることにより遺伝子発現を抑制する
を含む方法であって、上記細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、上記化合物がリボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。 - リボスイッチの同定方法であって、以下のステップ:
化合物の存在および不存在下でRNA分子の直列自発的切断を査定する
を含み、
上記RNA分子が当該化合物により調節された遺伝子によりコードされ、
上記RNA分子の直列自発的切断のパターンの変化がリボスイッチを示す前記方法。
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