CN115397474A - 用于改善治疗剂递送的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了设计用于提供来自工程化细胞的治疗性蛋白表达的表达构建体。所述工程化细胞可被封装到可植入元件中，所述可植入元件允许所述治疗性蛋白从所述胶囊中释放，同时保护所述细胞免受植入所述胶囊的患者的免疫系统的影响。

Description

用于改善治疗剂递送的方法

相关申请的引用

本申请要求于2020年2月11日提交的美国临时申请号62/972,944的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号R01DK120459、美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的批准号MCB-1615562和CBET-1805317、美国国防部(Department of Defense)授予的批准号HR001119S0027和N6600119C4020下由政府支持下进行的。政府对本发明拥有某些权利。

序列表的引用

本申请含有序列表，该序列表以ASCII格式电子提交并且在此以全文引入的方式并入。在2021年2月8日创建的ASCII副本被命名为RICEP0069WO_ST25，并且大小为74.0千字节。

背景

本公开的开发部分地由德克萨斯癌症预防和研究机构(Cancer Prevention andResearch Institute of Texas，CPRIT)以批准号RR160047资助，并由威尔士基金会(WelchFoundation)以批准号C-1995资助。

技术领域

本公开总体上涉及生物学、医学、生物工程和细胞封装领域。更具体地，本公开涉及用于递送各种大小和功能的生物分子的组合物和方法。该方法涉及细胞工程以及生物材料合成。

背景技术

单克隆抗体是最畅销的生物药品类别之一。然而，缺乏将稳定抗体或细胞因子的长期产生整合到水凝胶装置中的技术，该水凝胶装置在装置的外壳上使用免疫调节药物来防止免疫攻击。

发明内容

本文提供了封装在核-壳免疫调节藻酸盐中的工程化细胞的组合物。这些组合物为癌症免疫治疗或自身免疫病症提供了如细胞因子或单克隆抗体等各种生物和治疗性分子的自适应且可程序化持续递送。

在一个实施例中，本文提供了工程化细胞或包含工程化细胞的可植入元件，其中工程化细胞包含具有编码治疗性蛋白的编码序列的外源核酸。在一些方面，外源核酸被整合到工程化细胞的染色体中。在一些方面，治疗性蛋白是抗体或细胞因子。

在一些方面，治疗性蛋白是抗体。在一些方面，抗体的重链和抗体的轻链由两个可操作地连接到两个不同启动子的不同开放阅读框表达。在某些方面，两个启动子是工程化细胞中强组成型启动子。在一些方面，开放阅读框中的每一个开放阅读框均存在于单独的外源核酸上。在一些方面，开放阅读框中的每一个开放阅读框均存在于相同的外源核酸上。在一些方面，重链和轻链在单个开放阅读框中表达，每条链的编码序列由内部核糖体进入位点分开。在一些方面，启动子是工程化细胞中强组成型启动子。

在一些方面，工程化细胞进一步包含至少一个编码选择标记的编码序列。在一些方面，选择标记是抗生素抗性基因。在一些方面，编码选择标记的编码序列存在于每个包含编码治疗性蛋白的编码序列的外源核酸上。在一些方面，编码选择标记的编码序列可操作地连接到与可操作地连接到编码治疗性蛋白的编码序列的启动子分开的启动子。在一些方面，编码选择标记的编码序列可操作地连接到与编码治疗性蛋白的编码序列相同的启动子。在一些方面，编码选择标记的编码序列和编码治疗性蛋白的编码序列由内部核糖体进入位点分开。在一些方面，抗体是抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗TNFα或抗VEGF抗体。

在一些方面，治疗性蛋白是细胞因子。在一些方面，细胞因子是IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12a、IL-12b、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IL-20、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、LT-β、CD70、CD153、CD178、TRAIL、TNF-α、TNF-β、SCF、M-CSF、MSP、4-1BBL、LIF或OSM。在一些方面，细胞因子是IL-2。

在一些方面，细胞因子编码序列可操作地连接到阻抑型启动子。在一些方面，工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于阻抑型启动子的转录阻抑物的编码序列，其中转录阻抑物编码序列可操作地连接到由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。在一些方面，细胞因子编码序列在其5′非翻译区中包含翻译调控性高级结构。在一些方面，工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于高级结构的RNA结合翻译阻抑物的编码序列，其中RNA结合翻译阻抑物编码序列可操作地连接到由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。在一些方面，细胞因子编码序列在其3′非翻译区中包含一个或多个miRNA结合位点。在一些方面，工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于miRNA结合位点的miRNA编码序列，其中miRNA编码序列可操作地连接到由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。在一些方面，工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于细胞因子的泛素连接酶的编码序列，其中泛素连接酶编码序列可操作地连接到由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。在一些方面，细胞因子编码序列可操作地连接到小分子激活的启动子。在一些方面，细胞因子编码序列包含激活性或抑制性小分子依赖性功能性高级结构。在一些方面，细胞因子编码序列包含小分子辅助关闭系统序列。在一些方面，细胞因子编码序列可操作地连接到由合成转录因子激活的合成启动子。在一些方面，合成转录因子包含融合到转录激活结构域的无催化活性Cas9(dCas9)。在一些方面，合成转录因子编码序列可操作地连接到小分子激活的启动子。在一些方面，合成转录因子编码序列包含激活性或抑制性小分子依赖性功能性高级结构。在一些方面，合成转录因子编码序列包含小分子辅助关闭系统序列。

在一些方面，细胞因子从细胞因子产生细胞(例如，IL-2产生RPE细胞)的产生响应于第二组分的水平而受到调控。在一些方面，第二组分可以是蛋白，如干扰素-(IFN-γ)。在一些方面，在检测到第二组分(例如，蛋白，例如，IFN-γ)，例如，检测到第二组分的水平(例如，阈值水平)后，在细胞因子产生细胞(例如，IL-2产生RPE细胞)中触发降解事件，例如，凋亡。

在一些方面中，本公开进一步包含一种对反馈环的特征进行建模的方法。例如，建模方法(例如，算法)可用于预测反馈环中事件的时间，例如，对第二组分(例如，蛋白，例如，IFN-γ)的检测和凋亡通路的启动之间的时间延迟在长度上可能会有所不同。

在一些实施例中，反馈环的控制包含响应于靶基因对转录阻抑物的表达。在一些实施例中，转录阻抑物是EKRAB。在一些实施例中，靶基因是IFN-γ响应基因(例如，RPE65)。在一些实施例中，促凋亡基因在转录阻抑物的控制下表达。在一些实施例中，促凋亡基因是bax。

在一些方面，工程化细胞表达不止一种治疗性蛋白。在一些方面，工程化细胞表达三种治疗性蛋白。在一些方面，工程化细胞表达四种治疗性蛋白。

在一些方面，工程化细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、视网膜色素上皮(ARPE-10)细胞、间充质干细胞(MSC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、鼠骨髓瘤NS0和Sp2/0细胞、BABL/3T3细胞、MDCK细胞或PER.C6细胞。

在一些方面，外源核酸是表达载体。在某些方面，表达载体是pcDNA3.1。在一些方面，外源核酸是病毒载体。在一些方面，病毒载体是慢病毒载体。

在一些方面，外源核酸是转座子系统。在一些方面，转座子系统是piggyBac表达系统。

在一些方面，工程化细胞进一步包含具有编码自杀开关的编码序列的外源核酸。在一些方面，自杀开关是融合到利米度塞(rimiducid)诱导的开关的嵌合半胱天冬酶-9。

在一些方面，工程化细胞被进一步工程化以增加其免疫原性。在一些方面，工程化细胞释放治疗性蛋白。

在一些方面，可植入元件包含内区域和外区域，其中工程化细胞存在于内区域中。在一些方面，外区域被配置以便阻碍宿主免疫效应分子或细胞与抗原性剂在植入的初始或屏蔽阶段的接触，但允许宿主免疫效应分子或细胞与抗原性剂在植入的随后或未屏蔽阶段的接触。在一些方面，外区域包含可降解实体。在一些方面，屏蔽阶段持续不超过1小时、12小时、1天、2天、3天、6天或12天。在一些方面，屏蔽阶段持续介于0.5天和30天、1天和14天以及1天和7天之间。在一些方面，外区域的厚度与屏蔽阶段的长度/持续时间相关。

在一些方面，可植入构建体提供治疗性蛋白的持续释放。在一些方面，可植入构建体提供治疗性蛋白的基本上非脉冲式释放。在一些方面，可植入元件进一步包含聚合物水凝胶。在一些方面，外区域包含聚合物水凝胶。在一些方面，内区域包含聚合物水凝胶。在一些方面，内区域和外区域包含相同的聚合物水凝胶。在一些方面，内区域和外区域包含两种不同的聚合物水凝胶。在一些方面，聚合物水凝胶包含壳聚糖、纤维素、透明质酸或藻酸盐。

在一些方面，可植入元件包含产生单一类型的治疗性蛋白的工程化细胞。在一些方面，可植入元件包含产生多种治疗性蛋白的工程化细胞。在一些方面，可植入元件包含各自产生不同治疗性蛋白的第一工程化细胞和第二工程化细胞。在一些方面，第一工程化细胞产生第一治疗性抗体，而第二工程化细胞产生第二治疗性蛋白。

在一些方面，可植入元件包含至少约10,000、15,000或20,000个工程化细胞。在一些方面，可植入元件进一步包含另外的治疗剂。在一些方面，另外的治疗剂是化学治疗剂或免疫调节剂。

在一个实施例中，本文提供了包含根据本实施例中任一项所述的工程化细胞的生物反应器。在一个实施例中，本文提供了可植入元件的制剂，其包含根据本实施例中任一项所述的多个可植入元件。在一些方面，该制剂是药学上可接受的制剂。

在一个实施例中，本文提供了向患者提供可植入元件的方法，该方法包含将根据本实施例中任一项所述的可植入元件植入受试者体内或向受试者提供该可植入元件。在一些方面，该方法治疗患者的包含不想要的细胞增殖在内的病症。

在一个实施例中，本文提供了向患有癌症的患者施用免疫检查点抑制剂的方法，该方法包含将根据本实施例中任一项所述的可植入元件植入该患者的腹膜内间隙，其中该可植入元件被配置成释放该免疫检查点抑制剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L1抗体、PD-1抗体或CTLA4抗体。在一些方面，该方法进一步包含向患者施用抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在一些方面，癌症是结肠直肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肺癌、胃癌、皮肤癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

在一个实施例中，本文提供了治疗患者癌症的方法，该方法包含将根据本实施例中任一项所述的可植入元件植入患者的腹膜内间隙，其中该可植入元件被配置成以足以促进免疫效应细胞介导的对癌症的攻击但不足以促进癌症中的Treg水平的水平释放治疗性蛋白。在一些方面，治疗性蛋白是免疫检查点抑制剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L1抗体、PD-1抗体或CTLA4抗体。在一些方面，该方法进一步包含向患者施用抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在一些方面，癌症是结肠直肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肺癌、胃癌、皮肤癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

在以下编号的实施例中进一步描述本公开：

1.一种工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞包含具有编码治疗性蛋白的编码序列的外源核酸。

2.根据实施例1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外源核酸整合到所述工程化细胞的染色体中。

3.根据实施例1或2所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述治疗性蛋白是抗体或细胞因子。

4.根据实施例3所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述治疗性蛋白是抗体。

5.根据实施例4所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述抗体的重链和所述抗体的轻链由两个可操作地连接到两个不同启动子的不同开放阅读框表达。

6.根据实施例5所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述两个启动子是所述工程化细胞中强组成型启动子。

7.根据实施例5或6所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述开放阅读框中的每一个开放阅读框均存在于单独的外源核酸上。

8.根据实施例5或6所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述开放阅读框中的每一个开放阅读框均存在于相同的外源核酸上。

9.根据实施例4所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述重链和所述轻链在单个开放阅读框中表达，每条链的所述编码序列由内部核糖体进入位点分开。

10.根据实施例9所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述启动子是工程化细胞中的强组成型启动子。

11.根据实施例1至10中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码选择标记的编码序列。

12.根据实施例11所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述选择标记是抗生素抗性基因。

13.根据实施例11或12所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中编码所述选择标记的编码序列存在于每个包含编码治疗性蛋白的编码序列的外源核酸上。

14.根据实施例13所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中编码所述选择标记的所述编码序列可操作地连接到与可操作地连接到编码所述治疗性蛋白的所述编码序列的所述启动子分开的启动子。

15.根据实施例13所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中编码所述选择标记的所述编码序列可操作地连接到与编码所述治疗性蛋白的所述编码序列相同的启动子。

16.根据实施例15所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中编码所述选择标记的所述编码序列和编码所述治疗性蛋白的所述编码序列由内部核糖体进入位点分开。

17.根据实施例4至16中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述抗体是抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗TNFα或抗VEGF抗体。

18.根据实施例3所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述治疗性蛋白是细胞因子。

19.根据实施例18所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子是IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12a、IL-12b、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IL-20、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、LT-β、CD70、CD153、CD178、TRAIL、TNF-α、TNF-β、SCF、M-CSF、MSP、4-1BBL、LIF或OSM。

20.根据实施例18或19所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列可操作地连接到阻抑型启动子。

21.根据实施例20所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于所述阻抑型启动子的转录阻抑物的编码序列，其中所述转录阻抑物编码序列可操作地连接到由于通过所述细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。

22.根据实施例18或19所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列在其5′非翻译区中包含翻译调控性高级结构。

23.根据实施例22所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于所述高级结构的RNA结合翻译阻抑物的编码序列，其中所述RNA结合翻译阻抑物编码序列可操作地连接到由于通过所述细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。

24.根据实施例18或19所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列在其3′非翻译区中包含一个或多个miRNA结合位点。

25.根据实施例20至24中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子的产生响应于第二组分的水平而受到调控。

26.根据实施例25所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述第二组分是蛋白，例如，IFN-γ。

27.根据实施例25或26所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中对所述第二组分的检测触发细胞中的降解事件(例如，凋亡)。

28.根据实施例24所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于所述miRNA结合位点的miRNA的编码序列，其中所述miRNA编码序列可操作地连接到由于通过所述细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。

29.根据实施例18或19所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码可结合于所述细胞因子的泛素连接酶的编码序列，其中所述泛素连接酶编码序列可操作地连接到由于通过所述细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。

30.根据实施例18至29中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列可操作地连接到小分子激活的启动子。

31.根据实施例18至30中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列包含激活性或抑制性小分子依赖性功能性高级结构。

32.根据实施例18至31中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列包含小分子辅助关闭系统序列。

33.根据实施例18至31中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列可操作地连接到由合成转录因子激活的合成启动子。

34.根据实施例33所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子包含融合到转录激活结构域的无催化活性Cas9(dCas9)。

35.根据实施例33或34所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子编码序列可操作地连接到小分子激活的启动子。

36.根据实施例33至35中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子编码序列包含激活性或抑制性小分子依赖性功能性高级结构。

37.根据实施例33至36中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子编码序列包含小分子辅助关闭系统序列。

38.根据实施例1至19中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞表达不止一种治疗性蛋白。

39.根据实施例1至38中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞表达三种治疗性蛋白。

40.根据实施例1至38中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞表达四种治疗性蛋白。

41.根据实施例1至40中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、视网膜色素上皮(ARPE-10)细胞、间充质干细胞(MSC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、鼠骨髓瘤NS0和Sp2/0细胞、BABL/3T3细胞、MDCK细胞或PER.C6细胞。

42.根据实施例1至41中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外源核酸是表达载体。

43.根据实施例42所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述表达载体是pcDNA3.1。

44.根据实施例1至41中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外源核酸是病毒载体。

45.根据实施例44所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

46.根据实施例1至41中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外源核酸是转座子系统。

47.根据实施例46所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述转座子系统是piggyBac表达系统。

48.根据实施例1至47中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含具有编码自杀开关的编码序列的外源核酸。

49.根据实施例48所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述自杀开关是融合到利米度塞诱导的开关的嵌合半胱天冬酶-9。

50.根据实施例1至49中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞被进一步工程化以增加其免疫原性。

51.根据实施例1至50中任一项所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞释放所述治疗性蛋白。

52.根据实施例1至51中任一项所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述可植入元件包含内区域和外区域，其中所述工程化细胞存在于所述内区域中。

53.根据实施例52所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域被配置以便阻碍宿主免疫效应分子或细胞与所述抗原性剂在植入的初始或屏蔽阶段的接触，但允许宿主免疫效应分子或细胞与所述抗原性剂在植入的随后或未屏蔽阶段的接触。

54.根据实施例52或53所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域包含可降解实体。

55.根据实施例53所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述屏蔽阶段持续不超过1小时、12小时、1天、2天、3天、6天或12天。

56.根据实施例53所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述屏蔽阶段持续介于0.5天和30天、1天和14天以及1天和7天之间。

57.根据实施例53至56中任一项所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域的厚度与所述屏蔽阶段的长度/持续时间相关。

58.根据实施例1至57中任一项所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述可植入构建体提供所述治疗性蛋白的持续释放。

59.根据实施例1至57中任一项所述的可植入元件，其中所述可植入构建体提供治疗性蛋白的基本上非脉冲式释放。

60.根据实施例1至59中任一项所述的可植入元件，进一步包含聚合物水凝胶。

61.根据实施例60所述的可植入元件，其中所述外区域包含聚合物水凝胶。

62.根据实施例60所述的可植入元件，其中所述内区域包含聚合物水凝胶。

63.根据实施例60至62中任一项所述的可植入元件，其中所述内区域和所述外区域包含所述相同的聚合物水凝胶。

64.根据实施例60至62中任一项所述的可植入元件，其中所述内区域和所述外区域包含两种不同的聚合物水凝胶。

65.根据实施例60至64中任一项所述的可植入元件，其中所述聚合物水凝胶包含壳聚糖、纤维素、透明质酸或藻酸盐。

66.根据实施例1至65中任一项所述的可植入元件，其中所述可植入元件包含产生单一类型的治疗性蛋白的工程化细胞。

67.根据实施例1至65中任一项所述的可植入元件，其中所述可植入元件包含产生多种治疗性蛋白的工程化细胞。

68.根据实施例1至65中任一项所述的可植入元件，其中所述可植入元件包含各自产生不同治疗性蛋白的第一工程化细胞和第二工程化细胞。

69.根据实施例68所述的可植入元件，其中所述第一工程化细胞产生第一治疗性抗体并且所述第二工程化细胞产生第二治疗性蛋白。

70.根据实施例1至65中任一项所述的可植入元件，其中所述可植入元件包含至少约10,000、15,000或20,000个工程化细胞。

71.根据实施例1至70中任一项所述的可植入元件，其中所述可植入元件进一步包含另外的治疗剂。

72.根据实施例1至71中任一项所述的可植入元件，其中所述另外的治疗剂是化学治疗剂或免疫调节剂。

73.一种生物反应器，包含根据实施例1至51中任一项所述的工程化细胞。

74.一种可植入元件的制剂，包含多个根据实施例1至72中任一项所述的可植入元件。

75.根据实施例74所述的制剂，其中所述制剂是药学上可接受的制剂。

76.一种向患者提供可植入元件的方法，所述方法包含将根据实施例1至72中任一项所述的可植入元件植入受试者体内或向所述受试者提供所述可植入元件。

77.根据实施例76所述的方法，其中所述方法治疗所述患者的包含不想要的细胞增殖在内的病症。

78.一种向患有癌症的患者施用免疫检查点抑制剂的方法，所述方法包含将根据实施例1至72中任一项所述的可植入元件植入所述患者的腹膜内间隙，其中所述可植入元件被配置成释放所述免疫检查点抑制剂。

79.根据实施例78所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-L1抗体、PD-1抗体或CTLA4抗体。

80.根据实施例78或79所述的方法，进一步包含向所述患者施用抗癌疗法。

81.根据实施例80所述的方法，其中所述抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

82.根据实施例78至81中任一项所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肺癌、胃癌、皮肤癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

83.一种治疗患者癌症的方法，所述方法包含将根据实施例1至72中任一项所述的可植入元件植入所述患者的腹膜内间隙，其中所述可植入元件被配置成以足以促进免疫效应细胞介导的对所述癌症的攻击但不足以促进所述癌症中的Treg水平的水平释放所述治疗性蛋白。

84.根据实施例83所述的方法，其中所述治疗性蛋白是免疫检查点抑制剂。

85.根据实施例84所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-L1抗体、PD-1抗体或CTLA4抗体。

86.根据实施例83至85中任一项所述的方法，进一步包含向所述患者施用抗癌疗法。

87.根据实施例86所述的方法，其中所述抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

88.根据实施例83至87中任一项所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肺癌、胃癌、皮肤癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

如本文所用，就特定组分而言，“基本上无”在本文中用于意指没有任何特定组分被有意图地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染产生的特定组分的总量因此远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是一种用标准分析方法不能检测到特定组分的量的组合物。

本说明书中使用的“一个/一种(a/an)”可以意指一个或多个。如本文在权利要求中所使用的，当与词语“包含(comprising)”结合使用时，词语“一个/一种(a/an)”可以指一个或多于一个。

尽管本公开支持仅指备选方案和“和/或”的定义，但除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是相互排斥的，否则权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”。如本文所用，“另一个”可意指至少第二个或更多个。

在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有改变、用于确定该值的方法、在研究对象中存在的改变或在规定值的10％内的值。

根据以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解的是，虽然指出了本发明的优选实施例，但详细的描述和具体的实例仅以图示的方式给出，因为根据该详细的描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合本文呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1——单基因、双载体系统的示意图。

图2——单载体、双基因系统的示意图。

图3——双顺反子单ORF系统的示意图。

图4——三顺反子单ORF系统的示意图。

图5——使用操纵子/阻抑物的双ORF自调控系统的示意图。

图6——使用RNA结合蛋白的双ORF自调控系统的示意图。

图7——使用miRNA的双ORF自调控系统的示意图。

图8——使用泛素连接酶的双ORF自调控系统的示意图。

图9——示出通过RT-PCR监测的用0、1或10ng/mL重组人IFN-γ治疗20小时的RPE细胞中的RPE水平的图。

图10——示出EKRAB和BAX降解速率随时间变化的图，允许在凋亡激活之前的可调延迟。

图11A至B——示出IL-2浓度的预测药代动力学模型的图。图11A绘示了腹膜内间隙和全身的IL-2浓度随时间的预测动态，而图11B预测了剂量和峰值IL-2浓度之间随时间的差异。

图12——示出表达在STAT5诱导启动子(GFP，IL-2)和缺乏IL-2(GFP)的对照细胞的控制下被转染以表达IL-2和GFP的IL-2αβγ受体的HEK293细胞的流式细胞术分析的图。

图13A至D——响应于STAT5激活而执行IL-2产生的阻抑的四种合成回路拓扑结构的示意图。

图14A至C——调控的细胞因子回路表征。图14A是示出本文所描述的示范性回路的归一化剂量反应和响应时间(插图)的图。图14B描绘了用于建模的示范性方程。图14C是a＝0.35时每个回路的腹膜内IL-2浓度的受激药代动力学图。按比例调整剂量以确保相似的峰值IL-2浓度。插图示出了对产生和细胞死亡的灵敏度分析。

图15A至D——示范性表达系统的示意图。图15A绘示了用于EKRAB表达的盒，并且图15B至D绘示了用于IL-2和fTA表达的盒。

具体实施方式

本文提供了稳定表达目标分子的工程化细胞。这是通过用工程化质粒转染实现的，以稳定产生许多纳米抗体、细胞因子和抗体，包括抗VEGF、抗TNF-α、抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA4抗体，作为用于癌症免疫治疗、自身免疫病症治疗和工业生物反应器的装置。

许多载体系统可用于稳定产生细胞因子、纳米抗体或抗体，包括piggybac转座子系统、慢病毒载体和pcDNA3.1载体系统，从而能够在许多哺乳动物细胞系中产生它们。例如，在抗体表达的情况下，重链和轻链可以使用两个不同的启动子表达自两个不同的载体，每个载体都具有选择标记。可替代地，重链和轻链可以使用两个不同的启动子表达自单一载体。在另一个替代方案中，重链和轻链可表达为双顺反子开放阅读框，两条链的编码序列由IRES分开。在这种情况下，选择标记表达自相同的载体，但表达自单独的开放阅读框。在另一个备选方案中，重链、轻链和选择标记可以表达为三顺反子开放阅读框，两条链中每一条链的编码序列和选择标记由IRES元件分开。

在基因系统表达细胞因子的实施例中，期望细胞因子产生的水平是自调控的以防止细胞因子毒性水平的分泌。一种实现这一点的途径是将操纵子位点引入第一ORF中细胞因子基因与其启动子之间的DNA区。使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码转录阻抑物，该转录阻抑物结合于操纵子位点。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制转录阻抑物表达的启动子可以是STAT转录因子(图5)。这样，当已经有足够的细胞因子存在时，细胞可以感测其环境中的细胞因子并减少其细胞因子的产生。

另一种可能的策略是将形成高级结构的序列引入细胞因子基因的5′非翻译区(5′UTR)。然后使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码RNA结合蛋白，该RNA结合蛋白结合于高级结构并抑制翻译。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制RNA结合蛋白表达的启动子可以是STAT转录因子(图6)。

另一种可能的策略是将合成微RNA(miRNA)靶位点的若干重复引入细胞因子基因的3′非翻译区(3′UTR)。然后使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码miRNA。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制miRNA表达的启动子可以是STAT转录因子(图7)。

另一种可能的策略是使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码合成泛素连接酶，该泛素连接酶靶向细胞因子并导致泛素介导的蛋白水解。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制泛素连接酶表达的启动子可以是STAT转录因子(图8)。在这种情况下，如果有必要这样做，可以修饰细胞因子基因以包括额外的蛋白结构域，以便使细胞因子可被合成泛素连接酶识别。理想地，任何额外的蛋白结构域的添加都不会改变细胞因子的免疫功能。

这些自调控的控制策略可以与基于小分子的策略组合以提供对细胞因子产生的额外水平的控制。使用小分子激活的启动子(诸如TRE/四环素(tetracycline)系统)来驱动细胞因子的表达将允许由小分子的施用对细胞因子产生的外部调控。使用小分子依赖性核糖开关使细胞因子表达的转录后控制也是可能的——可以将短序列添加到细胞因子基因的5′或3′UTR，该细胞因子基因形成小分子依赖性功能性高级结构，诸如移码适体或mRNA切割适体酶，从而允许对细胞因子产生的类似外部控制，因为有在添加小分子后开启移码或切割的这些系统的实例和在小分子存在的情况下关闭的实例。通过将可以被小分子稳定的去稳定结构域的序列添加到细胞因子基因的开头或结尾也有可能在蛋白水平上实现这种类型的控制，这将导致每当小分子不存在时细胞因子的靶向降解。通过用小分子辅助关闭(SMASh)系统的序列扩增细胞因子的基因也有可能实现相反的情况，该SMASh系统包括去稳定结构域和非哺乳动物蛋白酶，该非哺乳动物蛋白酶从细胞因子切割去稳定结构域，除非存在会阻止切割并导致细胞因子降解的小分子蛋白酶抑制剂。所有这些对蛋白结构的修饰也可以间接地通过改为修饰激活控制细胞因子表达的启动子的合成转录因子来完成，这将确保所有这些蛋白修饰留在治疗性细胞内而不是被分泌并可能生成对这些非天然蛋白结构域的免疫响应。用于此意图的一种可能的合成转录因子是转录激活因子VP64、p65和Rta(VPR)与催化失活的Cas9(dCas9)之间的融合体，当与向导RNA(gRNA)共表达时，其将VPR络合物定位于与gRNA互补的合成启动子以激活细胞因子基因的转录。

考虑了各种类型的细胞可封装在修饰藻酸盐核-壳中。双层水凝胶可以用免疫调节小分子装饰以防止不期望的免疫响应。核-壳藻酸盐平台具有一系列尺寸，这一系列尺寸允许核-壳的最优形成，同时也经由细胞扩散使营养物获取提高到最大限度。可以修饰核-壳以允许定时降解。

I.由工程化细胞表达的治疗剂

本文所描述的封装的细胞组合物可含有由细胞产生或分泌的治疗剂。治疗剂可包括核酸(例如，RNA、DNA或寡核苷酸)、蛋白(例如，抗体、酶、细胞因子、激素、受体)、脂质、小分子、代谢剂、寡糖、肽、氨基酸、抗原。在实施例中，封装的细胞组合物包含经基因工程化以产生或分泌治疗剂的细胞或多个细胞。

在一个实施例中，封装的细胞组合物包含产生或分泌蛋白的细胞。蛋白可以是任何大小，例如大于约100Da、200Da、250Da、500Da、750Da、1kDa、1.5kDa、2kDa、2.5kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa、90kDa、95kDa、100kDa、125kDa、150kDa、200kDa、200kDa、250kDa、300kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa或更大。在实施例中，蛋白由单个亚基或多个亚基(例如，二聚体、三聚体、四聚体等)组成。由细胞产生或分泌的蛋白可以例如通过糖基化、甲基化或其它已知的天然或合成蛋白修饰来修饰。蛋白可以作为先驱蛋白或以非活性形式产生或分泌，并且可能需要进一步修饰以将其转化为活性形式。

由细胞产生或分泌的蛋白可以包括抗体或抗体片段，例如，抗体的Fc区或可变区。抗体可以是免疫检查点抑制剂。示范性抗体包括抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗TNFα和抗VEGF抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是纳米抗体。示范性抗体和纳米抗体序列提供于表A中。

免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么调低信号。可以通过免疫检查点阻断靶向的免疫检查点蛋白包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、CXCL9、CXCR5、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)、HLA-DRB1、ICOS(也称为CD278)、HLA-DQA1、HLA-E、吲哚胺2，3-双加氧酶1(ID01)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3，也称为CD223)、Mer酪氨酸激酶(MerTK)、NKG7、OX40(也称为CD134)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1，也称为CD274)、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活V结构域Ig抑制子(VISTA，也称为C10orf54)。特别是，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是药物，诸如小分子、重组形式的配体或受体，或抗体，诸如人抗体(例如，国际专利公开WO2015/016718；Pardoll，《自然综述癌症(Nat RevCancer)》，12(4)：252-264，2012；两者均以引用的方式并入本文)。可以使用已知的免疫检查点蛋白抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员将知道的，对于本公开中所提及的某些抗体可以使用替代和/或等效名称。此类替代和/或等效名称在本公开的上下文中是可互换的。例如，众所周知，帕博利珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等价名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所熟知。

在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一实施例中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一实施例中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示范性抗体描述于美国专利第8,735,553号、第8,354,509号和第8,008,449号，其全部以引用的方式并入本文。其它用于本文所提供的方法中的PD-1轴拮抗剂是本领域熟知的，诸如描述于美国专利申请公开号2014/0294898、2014/022021和2011/0008369中，其全部以引用的方式并入本文。

在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施例中，抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

是一种描述于WO2006/121168的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck 3475、帕博利珠单抗、

和SCH-900475，是描述于WO2009/114335的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是一种描述于WO2009/101611的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是一种描述于WO2010/027827和WO2011/066342的PD-L2-Fc融合可溶性受体。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4在T细胞的表面上被发现，并且当结合于抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86时充当“断开”开关。CTLA-4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，并且这两种分子都结合于抗原呈递细胞上的CD80和CD86，分别也称为B7-1和B7-2。CTLA-4向T细胞传送抑制信号，而CD28传送刺激信号。细胞内CTLA-4也在调控性T细胞中被发现，并且可能对它们的功能是重要的。通过T细胞受体和CD28进行的T细胞激活导致B7分子的抑制性受体CTLA-4的表达增加。

在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，美国专利第8,119,129号；PCT出版物号WO 01/14424、WO 98/42752、WO 00/37504(CP675，206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))；美国专利第6,207,156号；Hurwitz等人(1998)《美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》，95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncology)》，22(145)：摘要第2505号(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)《癌症研究(Cancer Res)》，58：5301-5304中公开的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中。前述出版物中的每一个出版物的教导在此以引入的方式并入。也可以使用与本领域公认的这些抗体中的任何一个抗体竞争结合于CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利第8,017,114号；全部以引入的方式并入本文。

示范性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 01/14424)。在其它实施例中，该抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施例中，该抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域和伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一实施例中，该抗体与上述抗体竞争与CTLA-4抗体上的相同表位结合和/或与上述抗体结合于CTLA-4抗体上的相同表位。在另一实施例中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。其它用于调节CTLA-4的分子包括诸如描述于美国专利第5844905、5885796号和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752的CTLA-4配体和受体，全部以引用的方式并入本文，和诸如描述于美国专利第8329867号的免疫粘附素，以引用的方式并入本文。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是淋巴细胞激活基因3(LAG-3)，也称为CD223。人LAG-3的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP-002277。LAG-3在激活的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞的表面上被发现。当结合于抗原呈递细胞表面上的II类MHC时，LAG-3充当“断开”开关。LAG-3的抑制既激活效应T细胞又激活抑制剂调控性T细胞。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人LAG-3抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗LAG-3抗体。示范性抗LAG-3抗体是瑞拉利单抗(relatlimab)(也称为BMS-986016)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 2015/116539)。其它示范性抗LAG-3抗体包括TSR-033(参见，例如，WO 2018/201096)、MK-4280和REGN3767。MGD013是描述于WO 2017/019846的抗LAG-3/PD-1双特异性抗体。FS118是描述于WO 2017/220569的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是T细胞激活V结构域Ig抑制子(VISTA)，也称为C10orf54。人VISTA的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_071436。VISTA在白细胞上被发现并抑制T细胞效应功能。在一些实施例中，该免疫检查点抑制剂是抗VISTA3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人VISTA抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗VISTA抗体。示范性抗VISTA抗体是JNJ-61610588(也称为奥瓦利单抗(onvatilimab))(参见，例如，WO 2015/097536、WO2016/207717、WO 2017/137830、WO 2017/175058)。VISTA也可用选择性靶向PD-L1和VISTA两者的小分子CA-170抑制(参见，例如，WO 2015/033299、WO 2015/033301)。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)。人IDO的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_002155。在一些实施例中，该免疫检查点抑制剂是小分子IDO抑制剂。示范性小分子包括BMS-986205、艾卡哚司他(epacadostat)(INCB24360)和那伏莫德(navoximod)(GDC-0919)。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是CD38。人CD38的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_001766。在一些实施例中，该免疫检查点抑制剂是抗CD38抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人CD38抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗CD38抗体。示范性抗CD38抗体是达雷妥尤单抗(daratumumab)(参见，例如，美国专利第7,829,673号)。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是ICOS，也称为CD278。人ICOS的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_036224。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗ICOS抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人ICOS抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗ICOS抗体。示范性抗ICOS抗体包括JTX-2011(参见，例如，WO 2016/154177、WO 2018/187191)和GSK3359609(参见，例如，WO2016/059602)。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。人TIGIT的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_776160。在一些实施例中，该免疫检查点抑制剂是抗TIGIT抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人TIGIT抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗TIGIT抗体。示范性抗TIGIT抗体是MK-7684(参见，例如，WO 2017/030823、WO 2016/028656)。

可以在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是OX40，也称为CD134。人OX40的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_003318。在一些实施例中，该免疫检查点抑制剂是抗OX40抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本方法的抗人OX40抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗OX40抗体。示范性抗OX40抗体是PF-04518600(参见，例如，WO 2017/130076)。ATOR-1015是靶向CTLA4和OX40的双特异性抗体(参见，例如，WO 2017/182672、WO 2018/091740、WO 2018/202649、WO 2018/002339)。

可在本文所提供的方法中靶向的另一种免疫检查点蛋白是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)，也称为TNFRSF18和AITR。人GITR的完整蛋白序列具有Genbank登录号NP_004186。在一些实施例中，该免疫检查点抑制剂是抗GITR抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。适用于本发明方法的抗人GITR抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法生成。可替代地，可以使用本领域公认的抗GITR抗体。示范性抗GITR抗体是TRX518(参见，例如，WO 2006/105021)。

由细胞产生或分泌的蛋白可以包括细胞因子。细胞因子可以是促炎细胞因子或抗炎细胞因子。细胞因子的实例包括IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12a、IL-12b、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IL-20、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、LT-β、CD70、CD153、CD178、TRAIL、TNF-α、TNF-β、SCF、M-CSF、MSP、4-1BBL、LIF、OSM等。例如，细胞因子可以包括任何细胞因子，其描述于M.J.Cameron和D.J.Kelvin，《细胞因子、趋化因子及其受体(Cytokines，Chemokines，andTheir Receptors)》(2013)，美国兰德斯生物医学出版公司(Landes Biosciences)，其以引用的方式整体并入本文。示范性细胞因子序列提供于表B中。

封装的细胞组合物可包含表达单一类型的治疗剂，例如，单一蛋白或核酸的细胞，或可表达不止一种类型的治疗剂(例如，多种蛋白或核酸)。在实施例中，可植入构建体包含表达两种类型的治疗剂(例如，两种类型的蛋白或核酸)的细胞。

在实施例中，封装的细胞组合物包含表达单一类型的蛋白的细胞，或可表达不止一种类型的蛋白，例如多种蛋白。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达两种类型蛋白的细胞。

在实施例中，封装的细胞组合物包含表达单一类型的抗体或抗体片段的细胞或可表达不止一种类型的抗体或抗体片段，例如，多种抗体或抗体片段。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达两种类型抗体或抗体片段的细胞。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达三种类型抗体或抗体片段的细胞。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达四种类型抗体或抗体片段的细胞。

在实施例中，封装的细胞组合物包含表达单一类型细胞因子的细胞或可表达不止一种类型的细胞因子，例如，多种细胞因子。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达两种类型细胞因子的细胞。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达三种类型细胞因子的细胞。在实施例中，封装的细胞组合物包含表达四种类型细胞因子的细胞。

II.用于生成工程化细胞的载体系统

本领域技术人员将具备通过标准重组技术构建载体的良好能力。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)，诸如逆转录病毒载体(例如，衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体，包括其可复制、复制缺陷和无肠形式、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头状瘤病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体。

特别是，pcDNA3.1、慢病毒和Piggybac表达系统可用于在哺乳动物细胞中表达单克隆抗体、纳米抗体和细胞因子，诸如，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞、视网膜色素上皮(ARPE-10)细胞、间充质干细胞(MSC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、鼠骨髓瘤NS0和Sp2/0细胞、BABL/3T3细胞、MDCK细胞和PER.C6细胞。所有载体都可以使用Sanger测序进行定序确认。

A.表达载体

在一些情况下，可以使用哺乳动物表达载体，诸如设计用于在多种细胞类型中进行高水平组成型表达的载体。例如，pcDNA3.1载体是一种质粒，其具有可操作连接到目标分子的编码序列的CMV启动子、BGH polyA信号和用于哺乳动物选择的新霉素(neomycin)抗性基因。具有pcDNA3.1主链的构建体可以转化为DH5α大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞。

B.转座子系统

转座子，诸如piggyBac，通过在各种生物体中的插入诱变和转基因而广泛用于基因组工程。piggyBac转座子由转座酶结合并含有一对重复序列。在某些实施例中，第一重复通常位于核酸表达盒的上游，而第二重复通常位于核酸表达盒的下游。因此，第二重复代表与第一重复相同的序列，但与第一重复相比显示出相反的阅读方向(互补双链序列的5′和3′端被交换)。然后将这些重复称为“反向重复”(IR)，因为这两个重复只是反向重复的序列。在某些实施例中，重复可以在上述核酸表达盒的上游和下游出现多个。优选地，位于上述核酸表达盒上游和下游的重复的数量是相同的。在某些实施例中，重复是短的，介于10至20个碱基对之间，优选15个碱基对。

重复(IR)位于插入细胞DNA中的核酸表达盒的两侧。核酸表达盒可包括基因的开放阅读框的全部或部分(即，蛋白编码基因的那部分)、一个或多个单独或与开放阅读框的全部或部分一起的表达控制序列(即，核酸中的调控区)。优选的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、边界控制元件、基因座控制区或沉默子。在优选的实施例中，核酸表达盒包含可操作地连接到开放阅读框的至少一部分的启动子。

转座酶可以作为多肽存在。可替代地，转座酶作为包括编码转座酶的编码序列的多核苷酸存在。多核苷酸可以是RNA，例如编码转座酶的mRNA，或DNA，例如编码转座酶的编码序列。当转座酶作为编码转座酶的编码序列存在时，在本发明的一些方面，编码序列可以存在于包括转座子的相同载体上，即，以顺式存在。在本发明的其它方面，转座酶编码序列可以存在于第二载体上，即，以反式存在。在某些优选的实施例中，转座酶是哺乳动物piggyBac转座酶。

转座酶识别位于转座子载体两端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，将内容物从原始位点移走，并通过“剪切”和“粘贴”机制将它们整合到TTAA染色体位点中。

Piggybac构建体可以转化为Stbl3大肠杆菌感受态细胞。

C.病毒系统

在生成重组病毒载体时，非必需基因通常被异源(或非原生)蛋白的基因或编码序列取代。病毒载体是一种利用病毒序列将核酸和可能的蛋白引入细胞的表达构建体。某些病毒经由受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞，以及整合到宿主细胞基因组中并稳定且有效地表达病毒基因的能力使其成为将外来核酸转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。下面描述了可用于递送本发明某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。

逆转录病毒由于其有将其基因整合到宿主基因组中，转移大量的外来遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型并被包装在特殊细胞系中的能力而有希望作为基因递送载体。

为了构建逆转录病毒载体，将核酸代替某些病毒序列插入病毒基因组以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建了一种含有gag、pol和env基因但不没有LTR和包装组分的包装细胞系。当将含有cDNA重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入特定细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，然后将病毒颗粒分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染各种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。

慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，其还含有其它具有调控或结构功能的基因。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并可用于体内和离体基因转移两者以及核酸序列的表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒-其中合适的宿主细胞用两种或多种携带包装功能的载体，即gag、pol和env以及rev和tat转染-描述于美国专利第5,994,136号，其以引用的方式并入本文。

第三代慢病毒可以通过接种HEK293T细胞(ATCC)并使用JetPrime(Polyplus转染)用编码期望抗体的质粒和包装质粒pMLg/PRRE(Addgene质粒#12251)、pRSV-Rev(Addgene质粒#12253)和pMD2.g(Addgene质粒#12259)分别以2∶5∶2.5∶3的比例共转染细胞而生成。转染后8小时用新鲜培养基替换培养基，并且48小时后收集含病毒培养基。根据制造商的方案，使用Lenti-X浓缩器(Clontech)浓缩病毒。为了生成抗体表达稳定细胞系，用相应的病毒转导HEK293细胞并用1mg/ml遗传霉素(geneticin)选择两周。用抗生素选择之后，进行分选以收集表达最高量抗体的细胞。

慢病毒构建体可以转化成Stbl3大肠杆菌感受态细胞。

III.抗体的表征和纯化

可以培养封装的细胞并测定上清液的靶蛋白产生水平。

A.抗体的纯化

根据制造商的方案，可以使用HiTrap MabSelect SuRe(通用电气医疗集团(GEHealthcare))纯化抗体。这些柱预装有Mab Select，其是一种用于从大样本体积中捕获mAbs的生物过程树脂。

B.酶联免疫吸附测定(ELISA)

根据制造商的方案，可以使用ELISA试剂盒(英杰(Invitrogen)，目录#991000)对由细胞分泌的抗体量进行量化。ELISA试剂盒特异于所产生的抗体的克隆，并且可以是夹心形式以增加灵敏度。

C.PD-1/PD-L1阻断测定

根据制造商的方案，前述哺乳动物细胞系中表达的抗PD-1和抗PD-L1抗体的效力和稳定性可以通过使用PD-1/PD-L1阻断生物测定法(目录#J1250，普洛麦格公司(Promega))进行测量。由两种基因工程化细胞系组成的该测定法测量生物制剂阻断免疫检查点信号的能力和设计用于阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体的效力和稳定性。

D.CTLA阻断试验

根据制造商的方案，前述哺乳动物细胞系中表达的抗CTLA4抗体的效力和稳定性可以通过使用CTLA4阻断生物测定法(目录#JA3001，普洛麦格公司)进行测量。该测定法与上面所描述的PD-1/PD-L1非常相似，指示它反映了设计用于阻断CTLA-4与其配体CD80和CD86相互作用的生物制剂的作用机制。

E.蛋白印迹法

可以在还原和非还原条件下进行对从表达不同质粒构建体的细胞分泌的重链和轻链多肽的蛋白印迹分析(Ho等人，2012)。可将蛋白消化并在凝胶上电泳，接着用靶向重链和轻链的抗体进行定量。

F.对抗体特异性产生率的评价

抗体特异性产生率将使用以下方程计算：

其中m_mAb代表分泌的抗体，N₀代表初始活细胞值，N代表最终活细胞值并且t代表培养天数(Chusainow等人，2009)。

G.糖基化模式分析

根据先前描述的方案，可以使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法分析纯化的单克隆抗体的糖基化模式(Ho等人，2012)。糖蛋白的表征包括通过肽图谱、结构测定以及总糖含量来鉴定糖基化位点。

H.聚集分析

可以使用如先前描述的尺寸排阻层析分析纯化的抗体的聚集(Ho等人，2012)。

IV.细胞因子活性的表征

可以使用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒(赛默飞世尔(ThermoFisher)目录#C34554)评估白细胞介素的生物活性。这包括收集含有分泌的白细胞介素的细胞上清液，接着与分离的脾细胞共培养7天，同时与CFSE温育，CFSE是一种细胞膜染料，用于通过染料稀释监测不同代的增殖细胞。至少6代细胞可以过荧光信号中的不同峰来鉴定。

V.控制药物递送和释放动力学

载体系统可以进一步包含阻滞疗法的自杀开关，类似于为CAR T细胞设计的自杀开关。两种工程化蛋白将位于封装的细胞内，当暴露于一种称为利米度塞的小分子药物时这两种工程化蛋白发生二聚化。该药物激活一种称为半胱天冬酶-9的蛋白，这诱导了细胞死亡。

用小分子化学诱导二聚化(CID)是一种用于生成蛋白功能开关以改变细胞生理学的有效技术。高特异性、高效的二聚体是利米度塞(AP1903)，其具有两个相同的尾对尾排列的蛋白结合表面，每个蛋白结合表面对FKBP12的突变体或变体具有高亲和力和特异性：FKBP12(F36V)(FKBP12v36、FV36或FV)。将一个或多个FV结构域连结到一个或多个通常依赖于同源二聚化的细胞信号传导分子上可以将该蛋白转化为利米度塞控制。例如，提供了一种分子开关，其提供了用利米度塞激活促凋亡多肽，诸如，例如，半胱天冬酶-9的选择，其中嵌合促凋亡多肽包含利米度塞诱导的开关。

在开关技术的一个实施例中，同源二聚体，诸如AP1903(利米度塞)激活安全开关，导致修饰细胞的凋亡。在该实施例中，例如，包含FKBP12多聚化区的嵌合促凋亡多肽，诸如，例如，半胱天冬酶-9在细胞中表达。在使细胞与结合于Fv区的二聚体接触后，嵌合多肽发生二聚化或多聚化，并激活细胞。细胞例如可以是表达抗体或细胞因子的工程化细胞。

另外，可以将新抗原引入细胞表面，从而倘若细胞从胶囊中逃脱或胶囊降解标记细胞以进行破坏。

此外，跨膜传感器可以工程化到细胞因子分泌细胞中，以产生反馈环以调控细胞因子输出。跨膜传感器响应于目标蛋白的不同浓度，并在诱导型启动子的帮助下使用负反馈环来抑制目标细胞因子的转录。这允许对目标蛋白的局部递送进行微调，并确保目标蛋白没有过表达。所使用的藻酸盐生物材料允许穿过内壳和外壳的快速扩散以对该感知-响应基因细胞回路提供实时反馈。

在开关技术的另一实施例中，来自细胞因子产生细胞(例如，IL-2产生RPE细胞)的细胞因子的产生响应于第二组分的水平而受到调节。例如，第二组分可以是蛋白，诸如干扰素γ(IFN-γ)。随着治疗的完成，IFN-γ可以由受试者中的肿瘤细胞局部产生。在一些实施例中，在检测到第二组分(例如，IFN-γ)后完成对细胞因子产生细胞(例如，IL-2产生RPE细胞)的破坏。在一些实施例中，来自细胞因子产生细胞的细胞因子(例如，IL-2)的水平保持恒定或增加直到对第二组分(例如，IFN-γ)的检测为止。在一些实施例中，在检测到第二组分(例如，IFN-γ)后，细胞因子产生细胞被工程化以激活凋亡通路。使凋亡通路与对该反馈环中第二组分的检测相结合可提供对可植入元件的灵敏度和响应时间的控制。

在一些实施例中，使用算法(例如，预测建模)来预测该反馈环的某些特征。例如，对第二组分(例如，IFN-γ)的检测和凋亡通路的启动之间的时间延迟在长度上可能会有所不同。

在一些实施例中，反馈环的控制包含响应于靶基因对转录阻抑物的表达。在一些实施例中，转录阻抑物是EKRAB。在一些实施例中，靶基因是IFN-γ响应基因(例如，RPE65)。在一些实施例中，促凋亡基因在转录阻抑物的控制下表达。在一些实施例中，促凋亡基因是bax。

VI.使用核-壳藻酸盐水凝胶进行的细胞封装

关于细胞封装材料和方法的公开至少可以在美国专利第9,555,007号；美国专利出版物2019/0184067；美国专利出版物2017/0355799；美国专利出版物2016/0280827；和PCT出版物WO2019/067766中找到，每一个都以全文引用的方式并入本文。

“水凝胶”是指当有机聚合物(天然或合成)经由共价键、离子键或氢键交联产生三维开放晶格结构时形成的物质，该三维开放晶格结构截留水分子形成凝胶。生物相容水凝胶是指形成对活细胞无毒的凝胶的聚合物，并允许氧和营养物到截留细胞的充分扩散以维持活力。

“藻酸盐”是集合术语，用于指由β-D-甘露糖醛酸盐和α-L-古洛糖醛酸盐以任何M/G比形成的线性多糖，以及其盐和衍生物。如本文所用，术语“藻酸盐”涵盖任何具有如下所示结构的聚合物以及其盐。

“生物相容”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物，它们通常对接受者无毒并且不会对受试者造成任何显著的不利影响。

“可生物降解”通常是指在生理条件下通过水解或酶促作用会降解或溶蚀为能够被受试者代谢、消除或排泄的较小单位或化学物质的材料。降解时间是聚合物组成和形态的函数。

“抗炎药物”是指直接或间接减轻组织炎症的药物。该术语包括但不限于免疫抑制的药物。该术语包括抗增殖免疫抑制药物，诸如抑制淋巴细胞增殖的药物。

“免疫抑制药物”是指抑制或防止受试者对外来物质的免疫响应的药物。免疫抑制药物通常通过抑制T细胞激活、破坏增殖或抑制炎症来发挥作用。正在接受免疫抑制的人据说是免疫受损的。

“哺乳动物细胞”是指源自适合移植入相同或不同受试者的哺乳动物受试者的任何细胞。该细胞可以是异种、自体或同种异体的。该细胞可以是直接从哺乳动物受试者获得的原代细胞。该细胞还可以是源自从受试者获得的细胞的培养和扩增的细胞。例如，细胞可以是干细胞。永生化细胞也包括在该定义之内。在一些实施例中，该细胞已被基因工程化以表达重组蛋白和/或核酸。

“自体的”是指取自相同个体的移植的生物物质。

“同种异体的”是指取自同一物种的不同个体的移植的生物物质。

“异种的”是指取自不同物种的移植的生物物质。

“移植”是指将细胞、组织或器官从另一来源转移到受试者。该术语不限于特定的转移模式。封装的细胞可以通过诸如通过注射或手术植入等任何合适的方法进行移植。

A.用于封装细胞的生物相容聚合物

所公开的组合物由封装待移植细胞的生物相容水凝胶形成聚合物形成。可用于形成合适水凝胶的材料的实例包括多糖，诸如藻酸盐、胶原、壳聚糖、纤维素硫酸钠、明胶和琼脂糖、水溶性聚丙烯酸酯、聚膦嗪、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(烯化氧)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以及每一者的共聚物和共混物。参见，例如，美国专利第5,709,854号、第6,129,761号和第6,858,229号。

一般而言，这些聚合物至少部分可溶于诸如水、缓冲盐溶液或含水醇溶液等具有带电侧基团的水溶液，或其单价离子盐。带有可与阳离子反应的酸性侧基团的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙酸乙烯酯)和磺化聚合物，诸如磺化聚苯乙烯。也可以使用具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物的反应形成的酸性侧基团的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基团和磺酸基团。

带有可与阴离子反应的碱性侧基团的聚合物的实例是聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和一些亚氨基取代的聚磷腈。聚合物的铵盐或季铵盐也可以由主链氮或侧链亚氨基形成。碱性侧基团的实例是氨基和亚氨基。

生物相容水凝胶形成聚合物优选是水溶性胶凝剂。在优选的实施例中，水溶性胶凝剂是多糖胶、更优选聚阴离子聚合物。

工程化细胞优选使用阴离子聚合物诸如藻酸盐封装以提供水凝胶层(例如，核)，其中水凝胶层随后与聚阳离子聚合物(例如，氨基酸聚合物诸如聚赖氨酸)交联以形成壳。参见，例如，Goosen等人的美国专利第4,806,355号、第4,689,293号和第4,673,566号；Lim等人的美国专利第4,409,331、第4,407,957、第4,391,909和第4,352,883号；Rha等人的美国专利第4,749,620号和第4,744,933号；和Wang等人的美国专利第5,427,935号。可用于交联水凝胶形成聚合物诸如藻酸盐的氨基酸聚合物包括阳离子聚(氨基酸)诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸以及其共聚物和共混物。

1.多糖

已经探讨了若干种哺乳动物和非哺乳动物多糖用于细胞封装。适于细胞封装的示范性多糖包括藻酸盐、壳聚糖、透明质酸(HA)和硫酸软骨素。藻酸盐和壳聚糖在某些溶液条件下形成交联水凝胶，而HA和硫酸软骨素优选被修饰成含有可交联基团以形成水凝胶。

在优选的实施例中，封装细胞的生物相容水凝胶形成聚合物是藻酸盐。藻酸盐是主要源自褐藻的无支链阴离子多糖家族，无支链阴离子多糖以干重的大约20％至40％存在于细胞外和细胞内。1，4-连接的α-1-古洛糖醛酸盐(G)和β-d-甘露糖醛酸盐(M)以均聚(GGG嵌段和MMM嵌段)或杂聚嵌段结构(MGM嵌段)排列。褐藻的细胞壁还含有5％至20％的岩藻依聚糖，其是一种以I-岩藻糖四硫酸酯嵌段为主要组分的支链多糖硫酸酯。商业藻酸盐通常从冲上岸的藻类中提取，并且其特性取决于收获和提取过程。

藻酸盐在存在二价阳离子的情况下经由离子交联形成凝胶。尽管通过藻酸盐前体(分子量、组成和大分子单体浓度)的变化可以在一定程度上控制水凝胶的特性，但当二价阳离子被单价离子替代时，藻酸盐不降解，而是溶解。另外，藻酸盐不促进细胞相互作用。

特别优选的组合物是含有细胞的微胶囊，这些细胞固定在带有聚赖氨酸壳的藻酸盐的核中。优选的微胶囊还可以含有另外的外部藻酸盐层(例如，包膜)以形成多层藻酸盐/聚赖氨酸-藻酸盐/藻酸盐-细胞微胶囊。参见Lim等人美国专利第4,391,909号关于与聚赖氨酸交联的海藻酸钠水凝胶的描述。其它适用作代替聚赖氨酸的交联剂的阳离子聚合物包括聚(β-氨基醇)(PBAA)(Ma M等人《先进材料(Adv.Mater.)》23：H189-94(2011)。

壳多糖通过对一种天然的非哺乳动物多糖几丁质部分去乙酰化而制成，几丁质与哺乳动物多糖非常相似，使得其对于细胞封装来说具有吸引力。壳聚糖通过乙酰化残基的水解主要由溶菌酶降解。更高程度的去乙酰化导致更慢的降解时间，但由于疏水性增加，细胞粘附更好。在稀酸条件(pH＜6)下，壳聚糖带正电荷且呈水溶性，而在生理pH下，壳聚糖呈中性且疏水，导致固体物理交联水凝胶的形成。多元醇盐的添加使得能够在中性pH下封装细胞，在该情况下凝胶化变得依赖于温度。

壳聚糖具有许多可被修饰的胺和羟基。例如，壳聚糖已通过接枝甲基丙烯酸进行修饰以产生可交联大分子单体，同时还接枝乳酸以增强其在生理pH下的水溶性。这种交联的壳聚糖水凝胶在存在溶菌酶和软骨细胞的情况下降解。可光聚合的壳聚糖大分子单体可以通过用光反应性叠氮基苯甲酸基团修饰壳聚糖来合成。在不存在任何引发剂的情况下暴露于UV后，形成反应性氮烯基团，其彼此反应或与壳聚糖上的其它胺基团反应以形成偶氮交联。

透明质酸(HA)是一种存在于全身许多组织中的糖胺聚糖，其在胚胎发育、伤口愈合和血管生成中起重要作用。另外，HA通过细胞表面受体与细胞相互作用以影响细胞内信号传导通路。总之，这些特质使得HA对于组织工程支架来说具有吸引力。HA可以用诸如甲基丙烯酸酯和硫醇等可交联部分进行修饰以进行细胞封装。交联的HA凝胶仍然容易被透明质酸酶降解，该透明质酸酶将HA分成不同分子量的寡糖片段。耳廓软骨细胞可以封装在光聚合HA水凝胶中，其中凝胶结构由大分子单体浓度和大分子单体分子量控制。另外，光聚合HA和葡聚糖水凝胶保持未分化的人胚胎干细胞的长期培养。HA水凝胶也已通过迈克尔型加成反应机制制造，其中丙烯酸酯化的HA与PEG-四硫醇反应，或硫醇修饰的HA与PEG二丙烯酸酯反应。

硫酸软骨素占了在包括皮肤、软骨、肌腱和心瓣膜在内的许多组织中发现的结构蛋白聚糖的很大比例，使其成为对于一系列组织工程应用来说具有吸引力的生物聚合物。可以通过用甲基丙烯酸酯基团修饰硫酸软骨素来制备光交联的硫酸软骨素水凝胶。水凝胶特性容易由聚合之前溶液中甲基丙烯酸酯取代的程度和大分子单体浓度控制。此外，带负电荷的聚合物产生增加的溶胀压力，允许凝胶吸收更多的水而不牺牲其机械特性。也可以使用硫酸软骨素和诸如PEG或PVA等惰性聚合物的共聚物水凝胶。

2.合成聚合物

聚乙二醇(PEG)一直是产生用于细胞封装的大分子单体的最广泛使用的合成聚合物。许多研究已经使用聚(乙二醇)二(甲基)丙烯酸酯来封装多种细胞。可生物降解PEG水凝胶可以由用(甲基)丙烯酸酯官能团封端的聚(α-羟基酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(α-羟基酯)的三嵌段共聚物制备以实现交联。PLA和聚(8-己内酯)(PCL)一直是在产生用于细胞封装的生物可降解PEG大分子单体方面最常用的聚(α-羟基酯)。降解曲线和速率通过可降解嵌段的长度和化学性质来控制。酯键也可能被血清中存在的酯酶降解，这加速了降解。

可生物降解PEG水凝胶也可以由PEG-双-[2-丙烯酰氧基丙酸酯]的前体制造。作为线性PEG大分子单体的替代物，可以使用每分子含有多个反应性乙烯基的聚(甘油-琥珀酸)-PEG的PEG基树形高分子。这些材料吸引人的特征是控制支化程度的能力，因此影响了水凝胶的整体结构特性及其降解。降解将通过树形高分子主链中存在的酯键发生。

生物相容水凝胶形成聚合物可以含有聚磷酸酯或聚磷酸盐，其中磷酸酯键易于水解降解，导致磷酸盐的释放。例如，可以将磷酸酯掺入可交联PEG大分子单体——聚(乙二醇)-二-[乙基磷脂酰(乙二醇)甲基丙烯酸酯](PhosPEG-dMA)的主链，以形成可生物降解水凝胶。碱性磷酸酶——一种由骨细胞合成的ECM组分的添加增强了降解。降解产物磷酸与介质中的钙离子反应产生不溶性磷酸钙，诱导水凝胶内的自钙化。聚(6-氨基乙基丙烯磷酸酯)——一种聚磷酸酯可以用甲基丙烯酸酯修饰以产生多乙烯基大分子单体，其中降解速率由聚磷酸酯聚合物的衍生程度控制。

聚磷腈是带有由交替的单键和双键分开的氮和磷组成的主链的聚合物。每个磷原子共价键合到两个侧链。适于交联的聚磷腈具有大部分是酸性且能够与二价或三价阳离子形成盐桥的侧链基团。优选的酸性侧基团的实例是羧酸基团和磺酸基团。水解稳定的聚磷腈由具有羧酸侧基团的单体形成，这些羧酸侧基团由诸如Ca2+或Al3+等二价或三价阳离子交联。通过掺入具有咪唑、氨基酸酯或甘油侧基团的单体，可以合成通过水解降解的聚合物。可生物溶蚀聚膦嗪具有至少两种不同类型的侧链、能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基团和在体内条件下水解的侧基团，例如，咪唑基团、氨基酸酯、甘油和葡糖基。侧链的水解导致聚合物的溶蚀。水解侧链的实例是未取代和取代的咪唑以及基团通过氨基键键合到磷原子的氨基酸酯(两个R基团以这种方式连结的聚磷腈聚合物称为聚氨基磷腈)。对于聚氨基磷腈，聚磷腈主链上的“R”基团中的一些“R”基团是咪唑环，其通过环氮原子连结到主链中的磷。

B.免疫调节外用

本文所描述的封装的细胞组合物可包含减少或抑制与或对安置于其内的治疗剂的反应(例如，诸如，免疫调节反应)的材料。例如，可植入构建体包含区域或层，该区域或层屏蔽治疗剂使其免于暴露于诸如宿主组织、宿主细胞或宿主细胞产物等周围环境。在实施例中，与例如未安置于可植入构建体内的类似治疗剂相比，可植入构建体使针对安置于其内的治疗剂的宿主响应(例如，免疫响应)的影响降到最低。

封装的细胞组合物可包含可渗透、半渗透或不可渗透材料以控制溶液流入和流出可植入构建体。例如，该材料可以是可渗透的或半渗透的，以允许诸如营养物和废物等小分子自由进出构建体。另外，该材料可以是可渗透的或半渗透的，以允许抗原或治疗剂从可植入构建体转运出来。示范性材料包括聚合物、金属、陶瓷及其组合。

在实施例中，封装的细胞组合物包含聚合物(例如，天然存在的聚合物或合成聚合物)。例如，聚合物可以包含聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙稀、聚碳氟化合物、尼龙、聚乙炔、聚氯乙烯(PVC)、聚烯烃、聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚羟基链烷酸酯、

聚四氟乙烯、聚乙二醇、聚砜、聚丙烯腈、胶原蛋白、纤维素、纤维素聚合物、多糖、聚乙醇酸、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乳酸乙醇酸)(PLGA)、聚二恶烷酮(PDA)、聚(乳酸)、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖或其共混物或共聚物。在实施例中，可植入构建体包含多糖(例如，藻酸盐、纤维素、透明质酸或壳聚糖)。在实施例中，封装的细胞组合物包含藻酸盐。在一些实施例中，聚合物的平均分子量为从约2kDa至约500kDa(例如，从约2.5kDa至约175kDa、从约5kDa至约150kDa、从约10kDa至约125kDa、从约12.5kDa至约100kDa、从约15kDa至约90kDa、从约17.5kDa至约80kDa、从约20kDa至约70kDa、从约22.5kDa至约60kDa或从约25kDa至约50kDa)。封装的细胞组合物可包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的聚合物，例如，本文所描述的聚合物。

在实施例中，封装的细胞组合物包含金属或金属合金。示范性金属或金属合金包括钛(例如，镍钛诺、镍钛合金、热记忆合金)、铂、铂族合金、不锈钢、钽、钯、锆、铌、钼、镍-铬、钴、钽、铬钼合金、镍-钛合金和钴铬合金。在实施例中，可植入构建体包含不锈钢级。封装的细胞组合物可包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的金属或金属合金，例如，本文所描述的金属或金属合金。

在实施例中，封装的细胞组合物包含陶瓷。示范性陶瓷包括碳化物、氮化物、二氧化硅或氧化物材料(例如，氧化钛、氧化铪、氧化铱、氧化铬、氧化铝和氧化锆)。封装的细胞组合物可包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的陶瓷，例如，本文所描述的陶瓷。

在实施例中，封装的细胞组合物可包含玻璃。封装的细胞组合物可包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的玻璃。

封装的细胞组合物内的材料可进一步例如用化学修饰进行修饰。例如，可以用提供特定特征诸如免疫调节或抗纤维化特征的化学修饰对材料进行涂敷或衍生化。示范性化学修饰包括小分子、肽、蛋白、核酸、脂质或寡糖。封装的细胞组合物可包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的例如用本文所描述的化学修饰进行化学修饰的材料。

在一些实施例中，用特定密度的修饰对材料进行化学修饰。化学修饰的比密度可以描述为每给定面积连结的化学修饰的平均数量。例如，本文所描述的可植入构建体中、上或内的材料上的化学修饰的密度可以为每平方μm或平方mm 0.01、0.1、0.5、1、5、10、15、20、50、75、100、200、400、500、750、1,000、2,500或5,000个化学修饰。

在实施例中，材料的化学修饰可包括接头或其它连结部分。这些接头可以包括交联剂、含胺接头、含酯接头、光不稳定接头、含肽接头、含二硫化物接头、含酰胺接头、含磷酰基接头或其组合。接头可能是不稳定的(例如，可水解的)。示范性接头或其它连结部分总结于《生物结合技术》(第3版，Greg T.Hermanson、Waltham、MA：爱思唯尔股份有限公司(Elsevier，Inc)，2013)，其以全文引用的方式并入本文。

C.胶囊

胶囊可以是两层或三层胶囊。优选地，胶囊的平均直径大于1mm、优选地1.5mm或更大。在一些实施例中，胶囊的直径可以大至8mm。

通过调节大胶囊渗透性来选择细胞活力所必需的分子进入胶囊的速率和治疗产物和废料离开胶囊膜的速率。也对大胶囊通透性进行修饰以限制免疫细胞、抗体和细胞因子进入微胶囊。

已经表明，由于不同的细胞类型具有不同的代谢需求，因此必须基于封装在水凝胶中的细胞类型来优化膜的渗透性。微胶囊的直径是影响对细胞胶囊的免疫响应以及穿过胶囊膜的质量传递的重要因素。

本文所描述的封装的细胞组合物可以采取任何合适的形状或形态。例如，可植入构建体可以是球体、类球体、管、绳、线、椭圆体、圆盘、圆柱体、片、圆环体、立方体、类体育场体、圆锥体、角锥体、三角形、矩形、正方形或棒。封装的细胞组合物可包含弯曲或平坦的区段。在实施例中，可以通过使用模具制备封装的细胞组合物，得到定制的形状。

封装的细胞组合物在大小上可能会有所不同，这取决于例如植入的用途或位点。例如，可植入构建体的平均直径或大小可大于0.1mm，例如，大于0.25mm，0.5mm、0.75mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm或更大。在实施例中，封装的细胞组合物可具有区段或区，其平均直径或大小大于0.1mm，例如，大于0.25mm，0.5mm、0.75mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm或更大。在实施例中，可植入构建体的平均直径或大小可小于1cm、例如，小于50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、7.5mm、5mm、2.5mm、1mm、0.5mm或更小。在实施例中，可植入构建体可具有区段或区，其平均直径或大小小于1cm，例如，小于50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、7.5mm、5mm、2.5mm、1mm、0.5mm或更小。

封装的细胞组合物包含至少一个能够防止封入的治疗剂暴露于外部环境(例如，宿主效应细胞或组织)的区域。在实施例中，封装的细胞组合物包含内区域(IZ)。在实施例中，封装的细胞组合物包含外区域(OZ)。在实施例中，内区域(IZ)或外区域(OZ)可以是可溶蚀的或可降解的。在实施例中，内区域(IZ)是可溶蚀的或可降解的。在实施例中，外区域(OZ)是可溶蚀的或可降解的。在实施例中，封装的细胞组合物包含内区域(IZ)和外区域(OZ)两者，其中的任一者都可以是可溶蚀的或可降解的。在实施例中，封装的细胞组合物包含内区域(IZ)和外区域(OZ)，其中外区域是可溶蚀的或可降解的。在实施例中，封装的细胞组合物包含内区域(IZ)和外区域(OZ)，其中内区域是可溶蚀的或可降解的。任一区域，例如，内区域或外区域的厚度可与“屏蔽”阶段的长度或持续时间相关，在该“屏蔽”阶段，封装的治疗剂被保护或屏蔽免受外部环境(例如，宿主效应细胞或组织)的影响。

封装的细胞组合物的区域(例如，内区域或外区域)可以包含可降解的实体，例如，能够降解的实体。可降解实体可包含酶切割位点、光不稳定位点、pH敏感位点或其它可随时间被溶蚀或包含的不稳定区。在实施例中，可降解实体在暴露于第一条件(例如，暴露于第一环境，例如，第一pH或第一酶)后相对于第二条件(例如，暴露于第二环境，例如，第二pH或第二酶)优先降解。在一个实施例中，可降解实体在暴露于第一条件后相对于第二条件降解快至少2、5、10、20、30、40、50、60、70、80或100倍。在实施例中，可降解实体是酶切割位点，例如，蛋白水解位点。在实施例中，可降解实体是聚合物(例如，合成聚合物或天然存在的聚合物，例如，肽或多糖)。在实施例中，可降解实体是用于内源宿主组分的底物，例如，降解酶，例如，重塑酶，例如，胶原酶或金属蛋白酶。在实施例中，可降解实体包含包埋在聚合物中的可裂解接头或可裂解段。

在实施例中，封装的细胞组合物包含孔或开口以准许诸如小分子(例如，营养物或废物)、蛋白或核酸等物体的通过。例如，封装的细胞组合物中或上的孔可以大于0.1nm且小10μm。在实施例中，可植入构建体包含孔或开口，其尺寸范围为0.1μm至10μm、0.1μm至9μm、0.1μm至8μm、0.1μm至7μm、0.1μm至6μm、0.1μm至5μm、0.1μm至4μm、0.1μm至3μm、0.1μm至2μm。

本文所描述的封装的细胞组合物可包含在任何封入的材料中或上化学修饰。示范性化学修饰包括小分子、肽、蛋白、核酸、脂质或寡糖。可植入构建体可包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的例如用本文所描述的化学修饰进行化学修饰的材料。封装的细胞组合物可以部分涂敷有化学修饰，例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％涂敷有化学修饰。

在实施例中，配制封装的细胞组合物，使得治疗剂的释放持续时间是可调的。例如，封装的细胞组合物可以以某种方式配置为随时间例如以持续或受控的方式释放特定量的治疗剂。在实施例中，封装的细胞组合物包含可降解的区域(例如，内区域或外区域)，并且这通过逐渐停止对封装的细胞的免疫保护或引起治疗剂的逐渐释放来控制从构建体中治疗性释放的持续时间。

在一些实施例中，用特定密度的修饰对封装的细胞组合物进行化学修饰。化学修饰的比密度可以描述为每给定面积连结的化学修饰的平均数量。例如，可植入构建体上或中的化学修饰的密度可以为每平方μm或平方mm 0.01、0.1、0.5、1、5、10、15、20、50、75、100、200、400、500、750、1,000、2,500或5,000个化学修饰。

可以配制或配置封装的细胞组合物用于植入受试者的任何器官、组织、细胞或部位。例如，封装的细胞组合物可以植入或安置到受试者的腹膜内间隙中。封装的细胞组合物可以植入或安置于受试者的肿瘤或其它生长物上，或植入或安置于离受试者的肿瘤或其它生长物约0.1mm、0.5mm、1mm、0.25mm、0.5mm、0.75、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、1cm、5cm、10cm或更远处。可以配置封装的细胞组合物用于植入或被植入或安置于皮肤、粘膜表面、体腔、中枢神经系统(例如，脑或脊髓)、器官(例如，心、眼、肝、肾、脾、肺、卵巢、乳房、子宫)、淋巴系统、脉管系统、口腔、鼻腔、胃肠道、骨骼、肌肉、脂肪组织、皮肤或其它区域上或中。

可以配制封装的细胞组合细胞组合物用于任何时间段。例如，封装的细胞组合物可使用1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长。可以配置可植入构建体用于有限暴露(例如，少于2天，例如，少于2天、1天、24小时、20小时、16小时、12小时、10小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或更短)。可以配置封装的细胞组合物用于长期暴露(例如，至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年或更长)。可以配置封装的细胞组合物用于永久暴露(例如，至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年或更长)。

D.细胞

本文所描述的封装的细胞组合物可含有细胞，例如，工程化细胞。细胞源自任何哺乳动物器官或组织，包括脑、神经、神经节、脊柱、眼、心、肝、肾、肺、脾、骨骼、胸腺、淋巴系统、皮肤、肌肉、胰腺、胃、肠、血液、卵巢、子宫或睾丸。

细胞可源自供体(例如，同种异体细胞)，源自受试者(例如，自体细胞)或源自另一物种(例如，异种细胞)。在实施例中，细胞可以在细胞培养物中培育，或从已建立的细胞培养系制备，或源自供体(例如，活供体或尸体)。在实施例中，细胞经基因工程化。在另一实施例中，细胞未经基因工程化。细胞可包括干细胞，诸如重编程干细胞或诱导性多能细胞。示范性细胞包括间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞(例如，原代成纤维细胞)。HEK细胞(例如，HEK293T)、Jurkat细胞、HeLa细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、HUVEC细胞、NIH3T3细胞、CHO-K1细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、PC-3细胞、HCT 116细胞、A549MCF-7细胞、HuH-7细胞、U-2 OS细胞、HepG2细胞、Neuro-2a细胞和SF9细胞。

包括在可植入构建体中的细胞可以产生或分泌治疗性治疗剂。在实施例中，包括在可植入构建体中的细胞可以产生或分泌单一类型的治疗剂或多种治疗剂。在实施例中，可植入构建体可以包含用包含治疗剂的表达序列的核酸(例如，载体)转导或转染的细胞。例如，细胞可以用慢病毒转导或转染。引入(例如，通过转导或转染)细胞的核酸可以掺入核酸递送系统，诸如质粒，或可以直接递送。在实施例中，引入细胞中的核酸(例如，作为质粒的一部分)可以包括增强治疗剂表达和/或指导靶向或分泌的区，例如，启动子序列、激活子序列或细胞信号传导肽或细胞输出肽。示范性启动子包括EF-1a、CMV、Ubc、hPGK、VMD2和CAG。

本文所描述的封装的细胞组合物可包含细胞或多个细胞。在多个细胞的情况下，浓度和总细胞数可以根据许多因素而变化，诸如细胞类型、植入位置和封装的细胞组合物的预期寿命。在实施例中，包括在封装的细胞组合物中的细胞总数大于约2、4、6、8、10、20、30、40、50、75、100、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000或更多。在实施例中，包括在封装的细胞组合物中的细胞总数大于约1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹、1.0×10¹⁰或更多。在实施例中，包括在封装的细胞组合物中的细胞总数少于约10000、5000、2500、2000、1500、1000、750、500、250、200、100、75、50、40、30、20、10、8、6、4、2或更少。在实施例中，包括在封装的细胞组合物中的细胞总数t小于约1.0×10¹⁰、1.0×10⁹、1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²或更少。在实施例中，多个细胞作为聚集体存在。在实施例中，多个细胞作为细胞分散体存在。

封装的细胞组合物内所含的细胞的具体特征可以例如在掺入可植入构建体之前和/或之后测定。例如，可评估细胞活力、细胞密度或细胞表达水平。在实施例中，细胞活力、细胞密度和细胞表达水平可以使用诸如细胞显微术、荧光显微术、组织学或生物化学测定等标准技术进行测定。

E.制作胶囊的方法

用于将细胞封装在水凝胶中的方法是熟知的。在优选的实施例中，水凝胶是多糖。例如，用于将哺乳动物细胞封装在藻酸盐聚合物中的方法是众所周知的，并在下面简要描述。参见，例如，Lim的美国专利第4,352,883号。

藻酸盐可在水中、在室温下与二价阳离子离子交联形成水凝胶基质。将含有待封装的生物材料的水溶液悬浮在水溶性聚合物的溶液中，悬浮液形成通过与多价阳离子接触而被构造成离散的微胶囊的液滴，然后将微胶囊的表面与聚氨基酸交联在封装的材料周围形成半透膜。

带有带电侧基团的水溶性聚合物通过使聚合物与含有相反电荷的多价离子的水溶液反应而交联，如果聚合物具有酸性侧基团，多价离子则是多价阳离子或如果聚合物具有碱性侧基团，多价离子则是多价阴离子。用于使聚合物与酸性侧基团交联以形成水凝胶的优选阳离子是二价和三价阳离子，诸如铜、钙、铝、镁、锶、钡和锡，尽管也可以使用二、三或四官能有机阳离子，诸如烷基铵盐，例如，R3N+--VVV--+NR3。将这些阳离子的盐的水溶液添加到聚合物中以形成柔软、高度溶胀的水凝胶和膜。阳离子的浓度越高，或化合价越高，聚合物的交联程度越大。已证明低至0.005M的浓度使聚合物交联。较高的浓度受到盐的溶解度的限制。

用于交联含有碱性侧链的聚合物以形成水凝胶的优选阴离子是二价和三价阴离子，诸如低分子量二羧酸，例如对苯二甲酸、硫酸根离子和碳酸根离子。如关于阳离子所描述的，将这些阴离子的盐的水溶液添加到聚合物中以形成柔软、高度溶胀的水凝胶和膜。

多种聚阳离子可用于络合并由此将聚合物水凝胶稳定成半渗透性表面膜。可以使用的材料的实例包括具有诸如胺或亚胺基团等碱性反应性基团，优选分子量介于3,000和100,000之间的聚合物，诸如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。这些可商购得到。一个聚阳离子是多聚(L-赖氨酸)；合成多胺的实例是：聚乙烯亚胺、聚(乙烯胺)和聚(烯丙胺)。还有天然聚阳离子，诸如多糖、壳聚糖。

可用于通过与聚合物水凝胶上的碱性表面基团反应形成半透膜的聚阴离子包括丙烯酸、甲基丙烯酸和丙烯酸的其它衍生物的聚合物和共聚物、诸如磺化聚苯乙烯等带有SO3H侧基团的聚合物和带有羧酸基团的聚苯乙烯。

在优选的实施例中，使用封装器(诸如Inotech封装器)由含有悬浮细胞的藻酸盐溶液制造藻酸盐胶囊。在一些实施例中，藻酸盐与诸如Ca2+、Ba2+或Sr2+等多价阳离子进行离子交联。在特别优选的实施例中，藻酸盐使用BaCl2进行交联。在一些实施例中，胶囊在形成后进一步纯化。在优选的实施例中，用例如HEPES溶液、Krebs溶液和/或RPMI-1640培养基洗涤胶囊。

细胞可以直接从供体、从来自供体的细胞的细胞培养物或从建立的细胞培养系获得。在优选的实施例中，细胞直接从供体获得，洗涤并与聚合物材料结合直接植入。使用组织培养领域技术人员已知的技术对细胞进行培养。

可以使用诸如组织学和荧光显微镜等标准技术对细胞粘附和活力进行评估。可使用上述技术和功能测定的组合对植入细胞的功能进行测定。例如，在肝细胞的情况下，可以通过将套管放置于受体的胆总管中来进行体内肝功能研究。然后可以增量收集胆汁。胆色素可通过高压液相色谱进行分析寻找未衍生化的四吡咯，或无论有没有用P-葡萄糖醛酸苷酶处理，通过与重氮化的偶氮二吡咯邻氨基苯甲酸乙酯反应转化为偶氮二吡咯后，可通过薄层色谱法进行分析。双结合和单结合胆红素也可以在结合胆红素经碱性甲醇分解后通过薄层色谱法进行测定。一般而言，随着功能性移植肝细胞数量的增加，结合胆红素的水平将增加。也可以对血液样本进行简单的肝功能测试，诸如白蛋白产生。可以使用本领域技术人员已知的技术进行相似的器官功能研究以根据需要确定植入后细胞功能的程度。例如，胰腺的胰岛细胞可以以与专门用于植入肝细胞的方式类似的方式递送，以通过适当分泌胰岛素来实现葡萄糖调控以治愈糖尿病。也可以植入其它内分泌组织。

一个或多个要植入细胞的位点基于个体需要确定，所需的细胞数量也是如此。对于具有器官功能的细胞，例如，肝细胞或胰岛细胞，可以将混合物注射到肠系膜、皮下组织、腹膜后腔、腹膜前间隙和肌内间隙中。

当需要时，可以用生理上可接受的盐如硫酸钠或类似的试剂处理或温育微胶囊，以便增加微胶囊的耐久性，同时保持或不过度损害微胶囊中所含的细胞的生理反应性。所谓“生理上可接受的盐”是指对封装在微胶囊中的细胞的生理反应性没有过度有害的盐。一般而言，此类盐是具有阴离子的盐，该阴离子充分结合钙离子以稳定胶囊，而基本上不损害其中所含的细胞的功能和/或活力。优选硫酸钠和硫酸钾等硫酸盐，最优选硫酸钠。温育步骤在含有有效稳定胶囊的量的生理盐的水溶液中进行，而基本上不损害如上所描述的其中所含的细胞的功能和/或活力。一般而言，包括量为从约0.1或1毫摩尔高达至约20或100毫摩尔，最优选约2至10毫摩尔的盐。温育步骤的持续时间并不是关键，可以为从约1或10分钟至约1或2小时或更长(例如，过夜)。进行温育步骤的温度同样也不是关键，通常为约4℃高达至约37℃，优选室温(约21℃)。

VII.疾病或病症的治疗

可以将封装的细胞施用，例如，注射或移植到对其有需要的患者中以治疗疾病或病症。在一些实施例中，该疾病是增殖性疾病。在实施例中，该增生性疾病是癌症。癌症可以是上皮、间充质或血液恶性肿瘤。癌症包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未迁移至受试者身体中除原始恶性肿瘤或肿瘤的位点以外的位点的那些细胞或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，由转移、恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于原始肿瘤的位点的继发性位点引起的那些细胞或肿瘤)。在实施例中，癌症是实体瘤(例如类癌、癌或肉瘤)、软组织肿瘤(例如，血红素恶性肿瘤)或转移性病变，例如，本文所公开的癌症中的任何一种癌症的转移性病变。在实施例中，癌症是纤维化或促结缔组织增生性实体瘤。

示范性癌症包括癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。在实施例中，癌症影响身体系统，例如，神经系统(例如，外周神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS))、血管系统、骨骼系统、呼吸系统、内分泌系统、淋巴系统、生殖系统或胃肠道。在一些实施例中，癌症影响身体的一部分，例如，血液、眼、大脑、皮肤、肺、胃、口、耳、腿、脚、手、肝、心、肾、骨、胰腺、脾、大肠、小肠、脊髓、肌肉、卵巢、子宫、阴道或阴茎。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。

癌症的其它实例包括但不限于：急性儿童淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴细胞性白血病、儿童急性髓性白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、胰腺外分泌癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、戈谢病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、妊娠期非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨-/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行性肾盂和输尿管癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦登斯特陆巨球蛋白血症、肾母细胞瘤和除瘤形成外的位于以上列出的器官系统中的任何增殖性疾病。

在实施例中，可植入构建体用于治疗受试者的自身免疫性疾病(例如，糖尿病、多发性硬化、狼疮、闭塞、囊袋收缩)。在一些实施例中，该疾病是糖尿病(例如，1型糖尿病或2型糖尿病)。在一些实施例中，该病状是纤维化。在一些实施例中，该病状是炎症。

本文所描述的可植入构建体可用于调节(例如，上调)受试者的免疫响应的方法。例如，在施用于受试者后，可植入构建体(或安置于其内的抗原和/或治疗剂)可以调节(例如，上调)受试者的免疫系统组分的水平(例如，增加组分的水平或降低组分的水平)。可通过本文所描述的方法调节的示范性免疫系统组分包括T细胞(例如，侵入性T细胞、杀伤T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、γδT细胞、辅助T细胞)、B细胞、抗体或其它另一组分。

本文所描述的可植入构建体可以进一步包含另外的药剂，诸如抗增殖剂、抗癌剂、抗炎剂、免疫调节剂或镇痛剂，例如，用于联合疗法。另外的药剂可以安置于可植入构建体中或上，或可以由安置于可植入构建体中或上的细胞产生。在实施例中，另外的药剂是小分子、蛋白、肽、核酸、寡糖或其它制剂。

在实施例中，另外的药剂是抗癌剂。在一些实施例中，抗癌剂是小分子、激酶抑制剂、烷化剂、血管破坏剂、微管靶向剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、抗血管生成剂或抗代谢物。在实施例中，抗癌剂是紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)或卡巴他赛(cabazitaxel))。在实施例中，抗癌剂是蒽环霉素(anthracycline)(例如，亚德里亚霉素(doxorubicin))。在一些实施例中，抗癌剂是铂基制剂(例如，顺铂(cisplatin)或奥沙利铂(oxaliplatin))。在一些实施例中，抗癌剂是嘧啶类似物(例如，吉西他滨(gemcitabine))。在一些实施例中，抗癌剂选自喜树碱、伊立替康(irinotecan)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506、5-FU、亚叶酸或其组合。在其它实施例中，抗癌剂是蛋白生物制品(例如，抗体分子)或核酸疗法(例如，反义或抑制性双链RNA分子)。

VIII.药用组合物

本公开以包含可植入构建体的药用组合物为特征，该可植入构建体包含区域(例如，内区域和任选的外区域，两者都可以是可降解的)和治疗剂以及任选的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，可植入构建体在药用组合物中以有效量提供。在一些实施例中，有效量是治疗有效量。在一些实施例中，有效量是预防有效量。

本文所描述的药用组合物可通过药理学领域已知的任何方法制备。一般而言，此类制备方法包括以下步骤：使可植入构建体与载体和/或一种或多种其它辅助成分缔合，然后，如果必要和/或需要，将产品成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单位。

药用组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量大批制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药用组合物的离散量。可植入构建体的量一般可以等于将向受试者施用的抗原和/或治疗剂的剂量和/或这种剂量的适当分数，例如，这种剂量的二分之一或三分之一。

本发明的药用组合物中的可植入构建体、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量会有所变化，这取决于所治疗的受试者的身份、大小和/或状况以及进一步取决于组合物施用的途径。举例来说，组合物可包含介于0.1％和100％(w/w)之间的任何组分。

可植入构建体及其药用组合物可以经口、经肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)、通过吸入雾化、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入型容器施用或植入。在一些实施例中，所提供的化合物或组合物是可静脉内和/或经口施用的。在实施例中，可植入构建体皮下注射。在实施例中，将可植入构建体注射到腹膜内间隙中。在实施例中，将可植入构建体注射到腹膜内间隙中。

如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、眼内、玻璃体内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、腹膜内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物经口、皮下、腹膜内或静脉内施用。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油质悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，例如像1，3-丁二醇溶液中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂当中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌、不挥发性油按常规用作溶剂或悬浮介质。

对于眼科用途，所提供的化合物、组合物和装置可以配制成微粉化悬浮液或配制在矿脂等软膏中。

在实施例中，抗原性、治疗性或另外的药剂以持续的方式释放。为了延长特定药剂的作用，通常期望减缓从注射时对该药剂的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。药剂的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可能取决于晶体尺寸和结晶形式。可替代地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中来实现。

尽管本文所提供的药用组合物的描述主要涉及适合施用于人的药用组合物，但本领域技术人员将理解的是，此类组合物普遍适合施用于各种各样的动物。对适合施用于人的药用组合物的修饰以使该组合物适合施用于各种动物是很好理解的，并且普通技术兽医药理学家可以通过普通实验设计和/或执行此类修饰。

本文所提供的可植入构建体通常配制成剂量单位形式，例如，单一单位剂型，以便于施用和剂量均匀。然而，将理解的是，本发明组合物的总日使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者或生物体的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病和病症的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；受试者的年龄、体重、健康总体状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与所采用的具体治疗剂联合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。

从可植入构建体释放的有效量的治疗剂可以包含每单位剂型(例如，每可植入构建体)约0.0001mg至约3000mg、约0.0001mg至约2000mg、约0.0001mg至约1000mg、约0.001mg至约1000mg、约0.01mg至约1000mg、约0.1mg至约1000mg、约1mg至约1000mg、约1mg至约100mg、约10mg至约1000mg、或约100mg至约1000mg治疗剂。

所施用的治疗剂的剂量水平可足以每天递送从约0.001mg/kg至约100mg/kg、从约0.01mg/kg至约50mg/kg、优选从约0.1mg/kg至约40mg/kg、优选从约0.5mg/kg至约30mg/kg、从约0.01mg/kg至约10mg/kg、从约0.1mg/kg至约10mg/kg、并且更优选从约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重，每天一次或多次，以获得期望的治疗效果。

将要了解的是，如本文所描述的剂量范围为向成人施用所提供的药物组合物提供了指导。施用于例如儿童或青少年的量可由执业医师或本领域技术人员确定，并且可低于或与施用于成人的量相同。

IX.实例

包括以下实例以展示本发明的优选实施例。本领域技术人员应当了解，以下实例中所公开的技术代表发明人发现的在本发明实践中发挥良好作用的技术，因此可被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。

实例1-单基因、双载体系统

如图1所示，抗体的重链(HC)和轻链(LC)将表达自两种不同的载体。HC将使用人巨细胞病毒(CMV)启动子表达，而LC将使用CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子表达。HC的载体也将使用较弱的SV40启动子表达的博莱霉素(zeocin)选择标记，并且LC的载体也表达新霉素选择标记盒。

实例2-单载体、双基因系统

如图2所示，LC和HC将分别使用CAG和CMV启动子表达自单个载体。将使用较弱的SV40启动子在相同载体上表达新霉素选择标记盒。

实例3-双顺反子单ORF系统

如图3所示，LC和HC将使用CAG启动子表达，由内部核糖体进入位点(IRES)分开。较弱的SV40启动子将用于表达存在于相同载体上的新霉素选择标记盒。

实例4-三顺反子单ORF系统

如图4所示，将生成三顺反子载体以在CAG启动子控制下由两个IRES介导的相同转录物中表达LC、HC和新霉素选择标记盒。

实例5-自调控基因系统

在基因系统表达细胞因子的实施例中，期望细胞因子产生的水平是自调控的以防止细胞因子毒性水平的分泌。一种实现这一点的途径是将操纵子位点引入第一ORF中细胞因子基因与其启动子之间的DNA区。使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码转录阻抑物，该转录阻抑物结合于操纵子位点。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制转录阻抑物表达的启动子可以是STAT转录因子(图5)。这样，当已经有足够的细胞因子存在时，细胞可以感测其环境中的细胞因子并减少其细胞因子的产生。

另一种可能的策略是将形成高级结构的序列引入细胞因子基因的5′非翻译区(5′UTR)。然后使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码RNA结合蛋白，该RNA结合蛋白结合于高级结构并抑制翻译。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制RNA结合蛋白表达的启动子可以是STAT转录因子(图6)。

另一种可能的策略是将合成微RNA(miRNA)靶位点的若干重复引入细胞因子基因的3′非翻译区(3′UTR)。然后使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码miRNA。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制miRNA表达的启动子可以是STAT转录因子(图7)。

另一种可能的策略是使用第二ORF，其在由于通过细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子的控制下编码合成泛素连接酶，该泛素连接酶靶向细胞因子并导致泛素介导的蛋白水解。例如，如果细胞因子是IL-2，那么控制泛素连接酶表达的启动子可以是STAT转录因子(图8)。在这种情况下，如果有必要这样做，可以修饰细胞因子基因以包括额外的蛋白结构域，以便使细胞因子可被合成泛素连接酶识别。理想地，任何额外的蛋白结构域的添加都不会改变细胞因子的免疫功能。

实例6-原位感知并报告IFN-γ工程化细胞系

为了更好地阐明疗法的原位药效学，开发了一种用于检测干扰素γ(IFNγ)介导的响应的基于RPE细胞的传感器。我们确认了暴露于重组人IFNγ的RPE细胞中RPE65的下调(图9)，这支持了我们提出的研究的可行性，该研究旨在开发一种基于RPE细胞的IFNγ-响应传感器，该传感器利用对IFNγ转录签名的检测并且可以封装在TMTD胶囊中用于原位监测治疗效能。

为了开发适合药效学研究的INFγ响应的细胞传感器，将RPE细胞工程化以将海肾荧光素酶基因(lux)的表达与RPE65——一种IFNγ响应的有效标记的表达联系起来(图9)。然后在ETR操纵子的控制下转染RPE、RPE-IL-2和RPE-LL-2-ks以表达lux，该ETR操纵子由红霉素(erythromycin)依赖性反式阻抑物(EKRAB)和用于选择意图的嘌呤霉素(puromycin)抗性基因调控。然后通过监测在不存在EKRAB的情况下组成型表达的荧光素酶信号来选择并筛选细胞。将所得稳定细胞系工程化以整合用于表达EKRAB的盒和RPE65的3′位的杀稻瘟菌素(blasticidin)抗性基因，如先前所示。将用杀稻瘟菌素和在用重组IFNγ和/或红霉素处理后通过监测荧光素酶信号确认的稳定细胞系来选择细胞以确认EKRAB整合。染色体整合将经由基因组PCR进行验证。除用于肿瘤体积监测的萤火虫荧光素酶的信号外，该报告子也可以利用腔肠素作为底物，这使得使用IVIS成像能够来特异性测量IFNγ报告子胶囊的活性。

实例7-将IFNγ检测与凋亡诱导相关联的基因回路的设计

为了响应于IFNγ响应检测而实现凋亡的诱导，将如实例6中所描述的设计并构建基因回路，其中转录阻抑物EKRAB的表达与IFNγ响应靶基因RPE65的表达相关联(图9)。另外，促凋亡bax基因将在转录阻抑物的控制下表达。结果，RPE65的下调导致EKRAB表达的降低和BAX表达的增加。

设计一种预测响应于IFNγ将实现超过10倍的bax表达激活的计算模型，假定EKRAB阻抑为100倍，希尔系数为2，RPE65阻抑为5倍(图9)。该模型还预测了调节转录阻抑物降解速率允许将回路响应时间在3和30小时之间调整(图10)。这种可调延迟与在较高剂量下高达10天的可调PK延迟组合(图11A至B)将允许我们根据需要基于PK/PD体内研究实现IFNγ检测和疗法终止之间的期望延迟。

为了实现这一目标，表达IL-2的RPE细胞(RPE/IL-2细胞)将被工程化以表达连接到RPE65的转录调控子。具体而言，将生成一系列细胞系，其中将制备EKRAB或TetR，其通过内部核糖体进入位点(IRES)与用于检测意图的荧光报告子(iRFP)的表达相关联，并含有用于选择意图的杀稻瘟菌素抗性基因。为此，将构建含有在不同IRES变体控制下编码EKRAB/TetR和iRFP的基因的整合盒，并融合到不同的降解决定子标签以调节半衰期，如先前所示。使用已知程序，将所得构建体整合到RPE/IL-2细胞的染色体中RPE65的3′位，生成一系列表达与RPE65表达相关联的EKRAB或TetR的细胞系。将使用模块化组装工具包，其通过即插即用方法能够快速产生大型DNA盒。在EKRAB/TetR控制下瞬时转染以表达GFP并用重组IFNγ和/或红霉素/四环素处理后，将使用杀稻瘟菌素和通过监测iRFP信号确认的稳定细胞系来选择细胞以确认EKRAB/TetR整合。染色体整合将经由基因组PCR进行验证。接下来，将转染表达EKRAB/TetR的稳定细胞系，以在EKRAB/TetR(分别为ETR和TO)的控制下表达促凋亡基因bax。通过IRES连接到荧光报告子(eqFP650)并含有用于选择意图的嘌呤霉素抗性的编码bax的盒将用于通过2A自切割肽连接到eqFP65。将使用嘌呤霉素和扩增以选择单克隆群体的单克隆来选择细胞。细胞暴露于重组IFNγ和/或红霉素/四环素后，通过监测早期和晚期凋亡的eqFP650信号和标记(膜联蛋白V和PI结合)来确认稳定细胞系，以验证bax表达。

然后，将通过使用蛋白印迹法和ELISA测定法监测细胞荧光、蛋白水平(包括IL-2水平)以及通过测序分析来验证回路。然后将确立培养基中IFNγ的浓度、IL-2产生以及早期和晚期凋亡的标记之间的关系。这些测量的结果将用于完善回路的数学模型。结合在此开发的PK/PD模型，这些结果允许进一步完善回路的设计规则，预计将产生最优体内性能。这些设计规则将影响着EKRAB/TetR翻译速率和降解速率预计在体内表现最优稳定细胞系的选择。

进一步地，本研究中生成的细胞系将如使用卵巢癌小鼠模型所述在体内进行确认。在IP癌症小鼠模型中的每一个IP癌症小鼠模型中，将植入10组以确保重现性和统计学显著性。初期试验将侧重于使用ID8Fluc肿瘤，并将使用KPC和BP肿瘤模型验证导联，以确保对具有各种突变负荷的肿瘤的效能。对于每项IP肿瘤研究，将使用5组10只小鼠来评估抗肿瘤效能和安全性。然后将确定IL-2剂量与IL-2产生细胞的自毁时间之间的相关性。因此，我们将测试含有本研究中开发的细胞系和适当对照(RPE-IL2-IFNγ-KS和假手术对照)的胶囊的5个剂量。每组将注射额外3只小鼠以确保10组都具有类似大小的肿瘤。将进行130只C57BL/6小鼠研究(N＝(5个实验组)*(n＝13)＝65只小鼠)。每项IP癌症研究将重复至少一次，以确保结果的重现性。在这些研究结束后，将收集血液和IP细胞及积液用于基于流式细胞术测量的免疫剖析，并对胶囊进行外植、成像并使用ELISA进行蛋白产生测定。

本研究将生成感知-响应细胞装置，其诱导凋亡的延迟激活，因此终止对IFNγ响应检测的治疗响应。预测建模和实验测试的整合将允许定义细胞控制系统的设计规则，以在检测到期望的IFNγ响应激活水平后对凋亡响应进行最优调整。这些结果将支持体内平台的设计，该体内平台用于暂时调控IL-2递送持续时间以解决患者特异性可变性。

实例8-工程化用于体内连续反馈调控递送的基于细胞的平台

为了设计基于在检测到IL-2受体后生成的反馈信号连续调控IL-2产生的细胞装置，将表达中间亲和力IL-2βγ受体的RPE细胞工程化以响应于STAT5激活(其在IL-2βγ受体激活后由JAK-STAT信号传导激活)而阻抑IL-2表达。该框架将提供将IL-2水平保持在激活中间亲和力受体所需的浓度的机制。假设这些细胞装置中的IL-2表达将在激活中间亲和力受体的IL-2浓度积累后立即停止，这防止了导致毒性的IL-2浓度积累而导致血管渗漏综合征。为此，设计不同的回路拓扑结构以实现自调整的IL-2产生。该策略将允许施用更大剂量的胶囊或细胞数量更多的胶囊，而没有免疫抑制效应的风险，也不会达到毒性剂量，从而为患者带来更强大且持久的治疗方案。

为了确立IL-2反馈控制机制的可行性，评价了响应于IL-2水平而由STAT5介导的报告基因(GFP)的控制。将表达IL-2αβγ受体的HEK-293细胞(HEK-Blue^TMIL-2细胞，InvivoGen)工程化以在STAT5诱导型启动子下组成型表达IL-2和GFP。含有STAT5(TTCtggGAA)的一致性结合位点的STAT5响应元件(STAT5-RE)以串联排列放置。流式细胞仪分析揭示了与缺乏IL-2的对照细胞相比，GPF信号显著增加(图12)，表明了所提出的基于IL-2介导的STAT5依赖性输出调控的方法的可行性。

为了响应于高亲和力IL-2受体的激活而实现IL-2阻抑，设计了四种响应于STAT5激活而执行IL-2产生阻抑的合成回路拓扑结构，如图13A至D所示：(A)IL-2在基础条件下组成型表达。STAT5激活EKRAB的表达，这阻抑了IL-2的表达；(B)IL-2在基础条件下被tTA激活。STAT5激活EKRAB的表达，这阻抑了tTA的表达；(C)IL-2被tTA激活，并且STAT5激活EKRAB的表达。tTA和EKRAB在预期导致系统双稳态的拨动开关状配置中彼此阻抑；(D)IL-2在基础条件下被tTA激活。STAT5激活EKRAB的表达，这阻抑了tTA的表达。在不存在STAT5的情况下(在非诱导性条件下)，预期tTA自扩增环会加速tTA的稳态产生。

为了对这些设计进行计算评估，组装包括蛋白产生和降解的数学模型。在模型的第一次迭代中，JAK-STAT信号传导在现象学上建模，假定细胞外IL-2的水平和转录活性STAT5的分数之间由希尔方程所描述的瞬态响应。在假定将细胞置于具有外部控制的IL-2水平的环境中并确定这些IL-2浓度的变化影响细胞内IL-2的产生的情况下，首先评估开环设置中的拓扑结构。初步结果显示，不同的拓扑结构导致不同的开环剂量反应曲线(图14A)和响应时间的差异(图14A，插图)。我们的结果表明，拓扑结构“A”对细胞外IL-2的变化响应最快，而拓扑结构“C”的剂量反应曲线最陡，这一特征通常表示闭环模型的稳健性。

接着，通过引入IL-2输出通量并使IL-2的IP水平成为STAT信号的输入，将细胞内模型与PK模型耦接(图14B)。假定在植入之前胶囊内的细胞产生高水平的IL-2，导致初始条件和植入后受到阻抑得到的这种模型的结果表明进入IP间隙的IL-2通量将降低细胞暴露于的IL-2水平，导致部分去阻抑和持续的IL-2产生(图14C)。灵敏度分析表明，所有负反馈回路对剂量变化和由于植入后细胞死亡而导致的产量降低具有改进的鲁棒性(图14C，插图)。细胞死亡后IL-2的部分去阻抑可延长治疗窗。这些初步结果支持拓扑结构“A”的实验测试。

为了实验性地测试四种回路拓扑结构(图13)，RPE细胞将被工程化以通过用人IL-2RβIL-2Rγ基因稳定转染RPE细胞来表达IL-2信号传导通路，从而生成响应于导致中间亲和力IL-2受体(RPE-ILR)激活的IL-2剂量的细胞系。如图12所示，稳定的细胞系将通过在STA5响应元件控制下的GFP瞬时转染来验证。

为了开发和表征IL-2反馈控制系统并微调数学模型，将生成表达主调控子EKRAB的RPE主细胞系，其要么由STAT5调控以构建拓扑结构A、B和D(图15A，顶部)要么在由STAT5激活并由tTA阻抑的杂合启动子的控制下以构建拓扑结构C(图15B，底部)。EKRAB的表达将通过用于检测意图的内部核糖体进入位点(IRES)与荧光报告子(iRFP)的表达相关联。本研究中使用的IRES导致1∶3的蛋白表达比。表达系统将包括通过2A自身切割肽连接到iRFP的用于选择意图的杀稻瘟菌素抗性基因。所得EKRAB表达盒将经由质粒转染整合到RPE-IL2R细胞的基因组中。将使用杀稻瘟菌素和扩增并筛选以选择单克隆群体的单个克隆来选择细胞。因为初步建模结果表明回路组分的表达水平作为相关设计参数，所以通过在监测瞬时后监测iRFP信号的tTA表达和用重组IL-2处理(以激活STAT5)来筛选单克隆群体，以选择在瞬时转染/IL-2处理后显示最大iRFP动态范围的细胞系。所得单克隆群体(STAT RE_EKRAB[图15A，顶部]和STAT RE_TetO_EKRAB[图15A，底部])将用作回路组分的后续整合的主细胞系。

主细胞系STAT RE_EKRAB和STAT RE_TetO_EKRAB将被工程化以建立“着陆垫”以供快速、方便地插入编码IL-2、tTA的盒——一种监测IL-2表达(GFP)和嘌呤霉素抗性基因的荧光报告子(图14B)。将使用能够通过一对正交丝氨酸整合酶进行基因组整合的双整合酶盒交换系统(DICE)。首先，将制备由报告基因(eqFP650)和经由自切割肽2A连接并在哺乳动物泛素C(UBC)启动子控制下的选择性标记(博莱霉素抗性基因，Zeo)组成的着陆垫盒。该盒的两侧是phiC31整合酶和Bxb1整合酶的attP识别位点。CRISPR-Cas9编辑工具将用于将着陆垫盒整合到AAVS1基因座中，其是一种人细胞中成熟、安全港基因座。将用博莱霉素和通过流式细胞术筛选的单克隆群体来选择所得细胞以供“着陆垫”的稳定整合。染色体整合将经由基因组PCR进行验证。

含有“着陆垫”的主细胞系随后将用于通过将eqFP650_Zeo盒与一系列含有编码来自不同启动子/操纵子变体(图18B-D，浅灰色)的IL-2/tTA的基因且两侧是phiC31和Bxb1整合酶位点的盒交换而生成用于表达IL-2/tTA的细胞系。将采用通过即插即用方法快速产生大型DNA盒的模块化组装工具包。回路组分(即，来自不同启动子/操纵子变体的tTA和IL-2)的表达将允许调节合成速率。具体来说，STAT RE_EKRAB细胞将用编码(i)ETR_IL-2_IRES_GFP[图18B]、(ii)7TO_IL-2_IRES_GFP_ETR_tTA[图14C]和(iii)7TO_IL-2_IRES_GFP_ETR_7TO_tTA[图14D]的“目的载体”转染以生成拓扑结构A、拓扑结构B、拓扑结构3。STAT RE_TetO_EKRAB细胞将用编码(i)7TO_IL-2_IRES_GFP_ETR_tTA[图14C]的“目的载体”转染以生成拓扑结构4。所有转染反应将包括编码Phi31和Bxb1整合酶的载体。

另外，将通过使用蛋白印迹法和ELISA测定法监测细胞荧光、蛋白水平(包括IL-2水平和IFNγ水平)以及通过测序分析来验证回路。随细胞数量和培养时间的变化的STAT5活性(通过监测iRFP信号评价)和IL-2产生(通过监测IL-2蛋白水平和GPF信号评价)之间的相关性将被确立。这些结果将用于完善数学模型。结合IL-2转运的PK模型，该模型将用于制定用于IL-2体内产生的稳健反馈调控系统的设计规则，这又将指导选择具有最优回路设计和回路组分表达水平的稳定细胞系。

另外，为了探索基于IL-2受体介导的反馈不断调整IL-2表达并基于IFNγ响应的检测暂时调控细胞装置的基于细胞的IL-2递送平台的用途，IL-2产生细胞系将用拓扑结构A进行工程化，以首先整合编码TetR的盒和通过RPE65的3′位的2A自切割肽连接到iRFP的杀稻瘟菌素抗性基因。对所得细胞进行选择和表征，并在通过IRES和用于选择意图的嘌呤霉素抗性连接到荧光报告子(eqFP650)的TO的控制下用bax编码质粒转染。含有IL-2介导的和IFNγ介导的对照系统两者的细胞系将通过使用蛋白印迹法和ELISA测定法监测随小分子诱导剂变化的细胞荧光、蛋白水平(包括IL-2水平)来验证。

为此目的构建的细胞疗法将使用卵巢癌小鼠模型进行验证。在IP癌症小鼠模型中的每一个IP癌症小鼠模型中，将植入10组以确保重现性和统计学显著性。初期试验将侧重于ID8Fluc肿瘤，随后将使用KPC和BP肿瘤模型验证导联，以确保对具有各种突变负荷的肿瘤的效能。预期IL-2给药与肿瘤疗法或毒性结局无关。因此，将进行5个构建体和适当对照(RPE-IL2-REG-KS(5个剂量)和假手术对照)的给药。本研究中有130只C57BL/6小鼠(N＝(5个实验组)*(n＝13)＝65只小鼠)。每项IP癌症研究将重复至少一次，以确保结果的重现性。在这些研究结束时，将收集血液和IP细胞及积液用于基于流式细胞术测量的免疫剖析，并对胶囊进行外植、成像并使用ELISA进行蛋白产生测定。

* * *

根据本公开，本文公开且要求保护的所有方法可以在无需过度实验的情况下进行并执行。虽然已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法和方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，显而易见的是，某些化学且生理相关的药剂可以替代本文所描述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献在其提供对本文所述的那些内容补充的示范性程序或其它细节的程度上明确地以引用的方式并入本文。

CN107474135A，“一种抗(PD-1)纳米抗体PD-1/Nb20及其制备方法和应用(n anti-(PD-1)nanobody PD-1/Nb20，and a preparing method and applications thereof.)”2017：中国(China)。

Cao，J.等人，酵母中的多功能且按需生物制品联合产生(Versatile and on-demand biologics co-production in yeast.)《自然通信(Nat Commun)》，2018.9(1)：页码77。

Chusainow，J.等人，“对单克隆抗体产生CHO细胞系的研究：什么造就了稳定的高产生者？(A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines：what makes astable high producer？)”《生物技术和生物工程(Biotechnol Bioeng)》，2009.102(4)：页码1182-96。

药物数据库贝伐单抗获自：https：//www.drugbank.ca/drugs/DB00112。

Efimov，G.A.等人，“细胞类型限制性抗细胞因子疗法：来自一种致病源的TNF抑制(Cell-type-restricted anti-cytokine therapy：TNF inhibition from onepathogenic source.)”《美国国家科学研究院学报(Proc Natl Acad Sci U S A)》，2016.113(11)：页码3006-11。

Ho，S.C.等人，“用于增强表达CHO细胞系的高单克隆抗体的生成的IRES介导的三顺反子载体(IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation ofhigh monoclonal antibody expressing CHO cell lines.)”《生物技术杂志(JBiotechnol)》，2012.157(1)：页码130-9。

Kazemi-Lomedasht，F.等人，“使用VEGF特异性纳米抗体对人内皮细胞中的血管生成的抑制(Inhibition of angiogenesis in human endothelial cell using VEGFspecific nanobody.)”《分子免疫学(Mol Immunol)》，2015.65(1)：第58-67页。

项目，G.纳武单抗获自：https：//www.genome.jp/dbgetbin/www_bget？dr：D10316。

Roybal，K.T.等人，“使用合成刻痕受体工程化具有定制治疗反应程序的T细胞(Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs UsingSynthetic Notch Receptors.)”《细胞(Cell)》，2016.167(2)：页码419-432e16。

Somle，A.等人，“用于感测并抑制炎症的合成哺乳动物治疗基因回路(ASynthetic Mammalian Therapeutic Gene Circuit for Sensing and SuppressingInflammation.)”《分子疗法(Mol Ther)》，2017.25(1)：页码102-119。

Wan，R.等人，“抗CTLA4纳米抗体的筛选和抗肿瘤作用(Screening and antitumoreffect of an antiCTLA4 nanobody.)”《肿瘤报告(Oncol Rep)》，2018.39(2)：页码511-518。

Zhang，F.等人，“用于免疫检查点阻断的新型PD-L1纳米抗体的结构基础(Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade.)”《细胞发现(Cell Discov)》，2017.3：页码17004。

Claims (27)

1.一种工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞包含具有编码治疗性蛋白的编码序列的外源核酸，其中所述治疗性蛋白是细胞因子，其中所述细胞因子编码序列可操作地连接到阻抑型启动子，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码转录阻抑物的编码序列，所述转录阻抑物能够结合于所述阻抑型启动子，并且其中所述转录阻抑物编码序列可操作地连接到由于通过所述细胞因子受体的信号传导而被激活的启动子。

2.根据权利要求1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外源核酸整合到所述工程化细胞的染色体中。

3.根据权利要求1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述工程化细胞进一步包含至少一个编码选择标记的编码序列。

4.根据权利要求1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列可操作地连接到小分子激活的启动子。

5.根据权利要求1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列包含激活性或抑制性小分子依赖性功能性高级结构。

6.根据权利要求1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列包含小分子辅助关闭系统序列。

7.根据权利要求1所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述细胞因子编码序列可操作地连接到由合成转录因子激活的合成启动子。

8.根据权利要求7所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子包含融合到转录激活结构域的无催化活性Cas9(dCas9)。

9.根据权利要求7所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中合成转录因子编码序列可操作地连接到小分子激活的启动子。

10.根据权利要求7所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子编码序列包含激活性或抑制性小分子依赖性功能性高级结构。

11.根据权利要求7所述的工程化细胞或包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述合成转录因子编码序列包含小分子辅助关闭系统序列。

12.根据权利要求1所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述可植入元件包含内区域和外区域，其中所述工程化细胞存在于所述内区域中。

13.根据权利要求12所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域被配置以便阻碍宿主免疫效应分子或细胞与所述抗原性剂在植入的初始或屏蔽阶段的接触，但允许宿主免疫效应分子或细胞与所述抗原性剂在植入的随后或未屏蔽阶段的接触。

14.根据权利要求12所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域包含可降解实体。

15.根据权利要求13所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述屏蔽阶段持续介于0.5天和30天、1天和14天或1天和7天之间。

16.根据权利要求13所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域的厚度与所述屏蔽阶段的长度/持续时间相关。

17.根据权利要求1所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述可植入构建体提供所述治疗性蛋白的持续释放。

18.根据权利要求1所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述可植入构建体提供所述治疗性蛋白的基本上非脉冲式释放。

19.根据权利要求1所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其进一步包含聚合物水凝胶。

20.根据权利要求19所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述外区域包含聚合物水凝胶。

21.根据权利要求19所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述内区域包含聚合物水凝胶。

22.根据权利要求19所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述内区域和所述外区域包含相同的聚合物水凝胶。

23.根据权利要求19所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述内区域和所述外区域包含两种不同的聚合物水凝胶。

24.根据权利要求1所述的包含所述工程化细胞的可植入元件，其中所述可植入元件包含至少约10,000、15,000或20,000个工程化细胞。

25.一种生物反应器，其包含根据权利要求1所述的工程化细胞。

26.一种可植入元件的制剂，其包含多个根据权利要求1所述的可植入元件。

27.一种向患者提供可植入元件的方法，所述方法包含将根据权利要求1所述的可植入元件植入受试者体内或向所述受试者提供根据权利要求1所述的可植入元件。

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