CN109983121A - 治疗性多肽的假型化溶瘤病毒递送 - Google Patents

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Abstract

本文描述了假型化溶瘤病毒，所述假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸。在一些实施方案中，所述假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子和一种或多种治疗性分子的核酸。本文还提供了含有所述假型化溶瘤病毒的药物组合物和使用所述假型化溶瘤病毒治疗癌症的方法。

Description

治疗性多肽的假型化溶瘤病毒递送
相关申请的引用
本申请要求2016年6月30日提交的美国临时申请号62/357,195的优先权，所述申请的内容以引用的方式整体并入本文。
以电子方式提交的文本文件的说明
随此以电子方式提交的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名称：ONCR_004_02WO_ST25.txt；记录日期：2017年6月30日；文件大小：193千字节)。
发明背景
患有某些血液肿瘤和实体瘤的患者仍然需要新的疗法。使用双特异性抗体来将细胞毒性T细胞引导至肿瘤细胞以及使用嵌合抗原受体(CAR)来将抗原特异性工程化到免疫效应细胞上证明可提供治疗益处。此外，溶瘤病毒技术是对实体瘤的当前护理标准的有用补充，预期具有安全性特征并且具有感染、复制和溶解肿瘤细胞的能力。然而，所述双特异性抗体、CAR和溶瘤病毒的抗肿瘤功效不是最理想的，从而表明对肿瘤学、抗体和溶瘤病毒疗法的进一步发展的持续需求。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含重组核酸的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸包含：(i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域对靶细胞上表达的细胞表面抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域特异性地结合至肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原是选自表2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含重组核酸的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸包含：(i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域结合至细胞表面上表达的抑制性抗原。在一些实施方案中，所述治疗性分子结构域特异性地结合至PD1、PDL1或CD47。在一些实施方案中，所述重组核酸还包含编码治疗性多肽的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是免疫调节剂多肽。在一些实施方案中，所述免疫调节剂多肽是选自细胞因子、共刺激分子、免疫检查点多肽、抗血管生成因子、基质金属蛋白酶(MMP)或核酸。
在一些实施方案中，所述免疫检查点多肽包含(i)PD-1、PDL-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、神经纤毛蛋白或CCR4的抑制剂；(ii)GITR、OX-40或CD28的激动剂；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方案中，所述免疫检查点多肽包含MMP，其中所述MMP是MMP9。在一些实施方案中，所述免疫检查点多肽包含细胞因子，其中所述细胞因子是选自IL-15、IL-12和CXCL10。
在一些实施方案中，本文中由衔接分子接合的效应细胞是T细胞、NKT细胞、NK细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述效应分子的活化结构域特异性地结合至CD3、CD4、CD5、CD8、CD16、CD28、CD40、CD134、CD137或NKG2D。
在一些实施方案中，本文提供的重组核酸是多顺反子序列。在一些实施方案中，所述多顺反子序列是双顺反子序列或三顺反子序列。在一些实施方案中，所述多顺反子序列包含微小核糖核酸病毒-2a样序列，并且其中所述第一核酸序列和第二核酸序列由存在于所述重组核酸中的单一启动子序列表达。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含重组核酸序列的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸序列包含(i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域对靶细胞上表达的肿瘤细胞抗原具有特异性，其中在所述效应细胞上表达的抗原是CD3，并且其中所述肿瘤细胞抗原是CD19。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：44至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含SEQID NO：43。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-12。在此类实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ IDNO：54至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-15。在此类实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：53至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是CXCL10。在此类实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：55至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是MMP9。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含重组核酸序列的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸序列包含(i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域对抑制性抗原具有特异性，其中在所述效应细胞上表达的抗原是CD3，并且其中所述抑制性抗原是PDL1。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO：50至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：49。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-12。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：63至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-15。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：62至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是CXCL10。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：64至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是MMP9。在一些实施方案中，所述衔接分子还包含第三结合结构域。在一些实施方案中，所述第三结合结构域包含免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：52至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：51。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含重组核酸序列的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸序列包含(i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域对抑制性抗原具有特异性，其中在所述效应细胞上表达的抗原是CD3，并且其中所述抑制性抗原是SIRP1α。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO：46或48至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：45或47。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-12。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：58或59至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-15。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：56或57至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是CXCL10。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：60或61至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是MMP9。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：65或66至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列还包含(ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是与IgG1 Fc结构域连接的抗PDL1 scFv。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：68或70至少90％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：67或69。
在一些实施方案中，本发明的假型化溶瘤病毒是选自腺病毒、单纯疱疹病毒1(HSV1)、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MV)、拉沙病毒(LASV)或新城疫病毒(NDV)。在一些实施方案中，与参考病毒相比，所述假型化溶瘤病毒在人受试者中包含降低的亲神经性活性和/或神经毒性活性。在一些实施方案中，所述参考病毒是i)非假型化溶瘤病毒，或ii)痘苗病毒。在一些实施方案中，所述假型化溶瘤病毒是减毒溶瘤病毒。在一些实施方案中，所述病毒不是痘苗病毒。
在一些实施方案中，本发明的假型化溶瘤病毒包含单一重组核酸。在一些实施方案中，所述假型化溶瘤病毒包含多种重组核酸。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒选择性地感染靶细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是肿瘤细胞，并且其中所述溶瘤病毒能够在所述肿瘤细胞内选择性地复制。
在一些实施方案中，所述衔接多肽是二分多肽并且包含抗体、抗体结构域、人免疫球蛋白重链可变结构域、双可变结构域抗体(DVD-Ig)、Tandab、双抗体、柔性抗体(flexibody)、对接锁定抗体(dock-and-lock antibody)、Scorpion多肽、单链可变片段(scFv)、BiTE、DuoBody、Fc工程化IgG、Fcab、Mab2或DART多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的假型化溶瘤病毒中的任一种。在一些实施方案中，所述假型化溶瘤病毒诱导免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答对靶细胞具有选择性细胞毒性。在一些实施方案中，所述靶细胞是实体瘤细胞或血液癌症细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞表达一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述一种或多种肿瘤抗原是选自表2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的溶瘤病毒或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述有需要的受试者施用一种或多种另外的疗法。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的疗法包括外科手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的一种或多种肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的溶瘤病毒或本文所述的药物组合物，其中所述一种或多种肿瘤表达肿瘤抗原。
在一些实施方案中，本发明提供了一种针对治疗选择患者的方法，所述方法包括：(a)确定源自所述患者的一种或多种肿瘤细胞上肿瘤抗原的表达；以及(b)如果从所述患者获得的肿瘤细胞表达所述一种或多种肿瘤抗原，则施用本文所述的溶瘤病毒或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种肿瘤抗原是选自表2。在一些实施方案中，本发明提供了一种将衔接多肽和治疗性多肽递送至肿瘤部位的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本文所述的溶瘤病毒或本文所述的药物组合物。
附图说明
图1示出CD19-CD3二分多肽的氨基酸序列，所述多肽包含针对CD19的第一单链可变片段(scFv)，所述第一单链可变片段连接至针对CD3的第二scFv。
图2示出由双顺反子基因编码的CD19-CD3-IL15构建体的氨基酸序列。第一基因编码二分多肽，所述多肽包含针对CD19的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。编码IL-15的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图3示出由多顺反子基因编码的CD19-CD3-IL12构建体的氨基酸序列。第一基因编码二分多肽，所述多肽包含针对CD19的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。编码IL-12的p35亚基的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列，并且编码IL-12的p40亚基的第三基因通过T2A自裂解多肽接头连接。
图4示出由双顺反子基因编码的CD19-CD3-CXCL10构建体的氨基酸序列。第一基因编码二分多肽，所述多肽包含针对CD19的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。编码CXCL10的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图5示出SIRP1α-CD3二分多肽的氨基酸序列，所述多肽包含第一蛋白质，所述第一蛋白质包含通过单个氨基酸接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。
图6示出SIRP1α-CD3-LL二分多肽的氨基酸序列，所述多肽包含第一蛋白质，所述第一蛋白质包含通过G4S基序接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。
图7示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-IL15构建体的氨基酸序列。所述第一基因编码二分多肽，所述多肽包含通过单个氨基酸接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。编码IL-15的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图8示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-IL15-LL构建体的氨基酸序列。所述第一基因编码二分多肽，所述多肽包含通过G4S基序接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。编码IL-15的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图9示出由多顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-IL12构建体的氨基酸序列。所述第一基因编码二分多肽，所述多肽包含通过单个氨基酸接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。编码IL-12的p35亚基的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列，并且编码IL-12的p40亚基的第三基因通过T2A自裂解多肽接头连接。
图10示出由多顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-IL12-LL构建体的氨基酸序列。所述第一基因编码二分多肽，所述多肽包含通过G4S基序接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。编码IL-12的p35亚基的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列，并且编码IL-12的p40亚基的第三基因通过T2A自裂解多肽接头连接。
图11示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-CXCL10构建体的氨基酸序列。所述第一基因编码二分多肽，所述多肽包含通过单个氨基酸接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。编码CXCL10的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图12示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-CXCL10-LL构建体的氨基酸序列。所述第一基因编码二分多肽，所述多肽包含通过G4S基序接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。编码CXCL10的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图13示出PDL1-CD3二分多肽的氨基酸序列，所述多肽包含针对PDL1的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。
图14示出由双顺反子基因编码的PDL1-CD3-IL15构建体的氨基酸序列。第一基因编码二分多肽，所述多肽包含针对PDL1的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。编码IL-15的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图15示出由多顺反子基因编码的PDL1-CD3-IL12构建体的氨基酸序列。第一基因编码二分多肽，所述多肽包含针对PDL1的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。编码IL-12的p35亚基的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列，并且编码IL-12的p40亚基的第三基因通过T2A自裂解多肽接头连接。
图16示出由双顺反子基因编码的PDL1-CD3-CXCL10构建体的氨基酸序列。第一基因编码二分多肽，所述多肽包含针对PDL1的第一scFv，所述第一scFv连接至针对CD3的第二scFv。编码CXCL10的第二基因通过T2A自裂解多肽接头连接至二分基因序列。
图17示出PDL1-CD3-Fc三联多肽的氨基酸序列，所述多肽包含针对CD3的第一scFv，所述第一scFv通过G4S基序接头连接至针对PDL1的第二scFv，所述第二scFv进而通过IgG1铰链连接至人IgG1的CH2-CH3结构域。
图18示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-MMP9-SL构建体的氨基酸序列(图18A)和由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-MMP9-LL构建体的氨基酸序列(图18B)。
图19A-19C示出CD19-CD3 BiTE构建体(图19A)、SIRP1α-CD3 BiTE构建体(图19B)和PDL1-CD3-Fc三联T细胞衔接器(图19C)CD3+T细胞的结合。
图20示出图19中所示的T细胞衔接器构建体结合的定量。
图21示出通过使用抗CD3抗体OKT3，CD19-CD3 BiTE构建体(图21A)、SIRP1α-CD3BiTE构建体(图21B)和PDL1-CD3-Fc三联T细胞衔接器(图21C)的CD3特异性结合。
图22示出SIRP1α-CD3 BiTE构建体的CD47结合SIRP1α臂的特异性。
图23A-图23B示出CD19-CD3和SIRP1α-CD3 BiTE构建体(图23A)与Raji细胞(CD19+CD47+)的结合。结合％在图23B中定量。
图24A-图24B示出CD19-CD3和SIRP1α-CD3 BiTE构建体(图24A)与U2OS细胞(CD19-CD47+)的结合。结合％在图24B中定量。
图25A-图25B示出CD19-CD3和SIRP1α-CD3 BiTE构建体(图25A)与GBM30-luc细胞(CD19-CD47+)的结合。结合％在图25B中定量。
图26A-图26B示出CD19-CD3和SIRP1α-CD3 BiTE构建体(图26A)与U251细胞(CD19-CD47+)的结合。结合％在图26B中定量。
图27A-图27C示出PDL1-Fc-CD3三联T细胞衔接器与U251细胞的结合。将PDL1-Fc-CD3构建体的结合(图27B)与抗PDL1抗体的结合(图27A)进行比较。结合不是由FcγR介导的，因为U251细胞不表达FcγRI、FcγRII或FcγRIII(图27C)。
图28示出Raji细胞的CD19-CD3 BiTE、SIRP1α-CD3 BiTE和PDL1-CD3-Fc三联T细胞衔接器介导的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)。
图29示出THP1细胞的CD19-CD3 BiTE和PDL1-CD3-Fc三联T细胞衔接器介导的TDCC。
图30示出U251细胞的CD19-CD3 BiTE和PDL1-CD3-Fc三联T细胞衔接器介导的TDCC。
图31示出与骨桥蛋白-融合对照构建体相比，293F细胞的SIRP1α-CD3 BiTE介导的TDCC。
图32示出来自溶瘤-HSV载体的SIRP1α-CD3 BiTE构建体的表达。示出具有短接头的SIRP1α-CD3 BiTE构建体(泳道1-4和泳道5-6中的ONCR085，在图5中示出)和具有长接头的SIRP1α-CD3 BiTE构建体(泳道7-8中的ONCR087，在图6中示出)的表达。
图33示出来自溶瘤-HSV载体的PDL1-CD3-Fc BiTE构建体的表达。纯化的PDL1-CD3-Fc BiTE蛋白在泳道1-4中示出。浓缩的病毒上清液在泳道5-6中示出。
图34A-图34B示出病毒产生的SIRP1α-CD3、SIRP1α-CD3-LL和PDL1-CD3-Fc BiTE构建体对U251细胞的TDCC。在与所指示的BiTE构建体和CD8+ T细胞一起孵育后的U251细胞培养物的照片在图34A中示出。通过细胞杀伤的％测量并通过流式细胞术定量的病毒产生的BiTE构建体的活性在图34B示出。
图35示出Amicon超滤有效地从样品中除去病毒，如通过用多克隆抗HSV抗体蛋白质印迹所确定的，并且表明BiTE杀伤是由于BiTE而非病毒感染。
图36示出假型化溶瘤病毒和重组溶瘤病毒的产生以及通过相应假型化溶瘤病毒和重组溶瘤病毒感染靶细胞的草图表示。
图37示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(SL)构建体的氨基酸序列，其中第一基因编码与IgG1 Fc结构域连接的抗PDL1 scFv，并且第二基因编码二分多肽，所述多肽包含通过单个氨基酸接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。
图38示出由双顺反子基因编码的SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(LL)构建体的氨基酸序列，其中第一基因编码与IgG1 Fc结构域连接的抗PDL1 scFv，并且第二基因编码二分多肽，所述多肽包含通过G4S基序接头连接至针对CD3的scFv的SIRP1α的前120个氨基酸。
图39示出SIRP1α-CD3-PDL1-Fc表达质粒的示意图。产生了两种质粒构建体，一种用于SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(SL)并且一种用于SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(LL)。
图40示出SIRP1α-CD3 BiTE(SL)、SIRP1α-CD3 BiTE(LL)以及来自转染的293 T细胞的上清液的抗PDL1-Fc化合物的纯化。图40A示出通过考马斯(Coomassie)评估的抗PDL1-Fc化合物的纯化。图40B示出使用抗His检测抗体通过蛋白质印迹评估的SIRP1α-CD3 BiTE化合物的纯化。
图41示出PD1/PDL1阻断测定的结果。所述测定的示意图在图41A-图41B中示出。使用由转染的293细胞产生的抗PDL1-Fc化合物的PD1/PDL1阻断测定的结果在图41C中示出。
具体实施方式
本公开提供了新颖的工程化溶瘤病毒，特别是假型化溶瘤病毒，所述假型化溶瘤病毒产生用于治疗包括实体瘤(例如，晚期实体瘤)和血液恶性肿瘤的癌症的多分多肽和/或其他治疗性多肽。在一些实施方案中，通过假型化或其他重组技术对所述溶瘤病毒进行工程化以调节病毒的向性，从而产生对肿瘤细胞和/或周围肿瘤间质具有特异性的病毒感染和/或用于如本文提供的其他有益目的。在一些实施方案中，由本文所述的溶瘤病毒产生的多分和/或治疗性多肽介导或增强溶瘤病毒的抗肿瘤作用，如通过效应细胞介导的靶细胞(例如，肿瘤细胞)溶解。本文所述的溶瘤病毒可具有多重(例如双重)作用模式，包括由于多分多肽的表达所致的靶细胞的效应细胞介导的细胞溶解，以及病毒介导的靶细胞的破坏。本公开进一步提供了包含工程化的溶瘤病毒的治疗组合物和用于治疗实体瘤和血液恶性肿瘤的方法。
综述
在一些实施方案中，本发明提供了假型化溶瘤病毒、其组合物以及用于治疗癌症的方法。本文提供的假型化溶瘤病毒包含编码衔接多肽和/或其他治疗性分子(例如，治疗性多肽)的重组核酸。通常，所述衔接多肽充当效应细胞衔接器，并且通常包含针对在效应细胞上表达的活化分子的第一结构域(例如，活化结构域或衔接结构域)和第二结构域，所述第二结构域针对靶细胞抗原(例如，抗原识别结构域)或其他细胞表面分子(例如，治疗性分子结构域)。还提供了二分、三联或多分多肽(例如，包含一个或多个衔接结构域、一个或多个抗原识别结构域或一个或多个治疗性分子结构域，以及任选的一个或多个其他功能结构域。
还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的人受试者递送治疗有效量的本文提供的溶瘤病毒或其药物组合物的步骤。此类方法任选地包括向人受试者递送另外的癌症疗法的步骤，所述癌症疗法如外科手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
定义
除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。
在本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词“包含(comprise)”或变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的要素或整数或一组要素或整数，但是不排除任何其他要素或整数或其他组的要素或整数。
如本申请中使用，术语“约”和“大约”可作为等效形式使用。在本申请中与或不与约/大约一起使用的任何数字意欲涵盖由相关领域普通技术人员了解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所阐述的参考值的任一方向上的(大于或小于)30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
如本文说明书中所用，“受试者(subject)”或“受试者(subjects)”或“个体”包括但不限于哺乳动物，如人或非人哺乳动物，包括家养动物、农业动物或野生动物，以及鸟类和水生动物。在一些实施方案中，受试者是家畜如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；禽类如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及家养动物如狗和猫。在一些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠，仓鼠)、兔、灵长类动物或猪，如近交系猪等。在特定实施方案中，所述受试者是人。“患者”是患有疾病、病症或疾患或处于发展疾病、病症或疾患的风险或否则需要本文提供的组合物和方法的受试者。所述术语均不要求或均不限于特征为在健康护理工作者(例如医生、注册护士、执业护士、助理医师、护理员或安养院工作人员)监督下(例如始终或间断性)的情形。
如本文所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗或改善疾病或疾患，特别是癌症的任何成功标志。治疗(Treating)或治疗(treatment)可在体外和/或体内进行，并且可包括将本文所述的溶瘤病毒或其组合物递送至患者或有需要的受试者。在一些实施方案中，治疗包括例如减轻、延迟或缓解疾病或疾患的一种或多种症状的严重程度，和/或降低受试者或患者经历疾病、缺陷、病症或不良疾患的症状的频率。本文中，“治疗或预防”在本文中用于指产生疾病或疾患的某种水平的治疗或改善并且考虑针对所述目的的一系列结果(包括但不限于完全预防疾患)的方法。
如本文所用，“预防”是指患者或受试者中疾病或疾患(例如，肿瘤形成)的预防，并且也可称为“预防性治疗”。疾病发展的预防可指疾病症状的完全预防、疾病发作的延迟或随后发展的疾病的症状严重程度的减轻。作为非限制性说明性实例，如果处于发展肿瘤或其他形式的癌症风险的个体用本发明的方法治疗并且之后不发展肿瘤或其他形式的癌症，则所述疾病已在所述个体中至少预防一段时间。
术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”在本文中可互换使用，并且是指足以提供有益作用或以其他方式减少有害的无益事件的溶瘤病毒或其组合物的量(例如足以治疗疾病的量或剂量)。包含在治疗有效量或治疗有效剂量内的溶瘤病毒的确切量或剂量将取决于多种因素，包括：治疗目的；受试者或患者的体重、性别、年龄和一般健康状况；施用途径；施用的定时；以及待治疗疾病的性质。本领域技术人员使用已知技术可确定给定受试者或患者的治疗有效量(参见，例如Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar，Dosage Calculations(1999))。
“假型”是指病毒颗粒，其中病毒颗粒的一部分(例如，包膜或衣壳)包含异源蛋白，如源自异源病毒或非病毒蛋白的病毒蛋白。非病毒蛋白可包括抗体及其抗原结合片段。优选地，假型化病毒能够i)相对于非假型化病毒改变向性，和/或ii)减少或消除非有益作用。例如，在一些实施方案中，与非假型化病毒相比，假型化病毒表现出降低的毒性或减少的非肿瘤细胞或非肿瘤组织感染。
术语“靶向部分”在本文中是指与病毒颗粒连接的异源蛋白，所述病毒颗粒能够结合至选定细胞类型的细胞表面上的蛋白质，以指导所述病毒颗粒与所选细胞类型之间的相互作用。靶向部分可以是共价或非共价连接的，并且通常与包膜蛋白，例如E1、E2或E3连接。代表性靶向部分包括抗体、其抗原结合片段和受体配体。病毒“包膜”蛋白或“Env”蛋白是指存在于病毒粒子的表面脂质双层上的任何多肽序列，并且其功能是介导对易于感染的宿主细胞的吸附和渗透。
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。载体可包括指导细胞中的自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。在一些实施方案中，所述载体是病毒(即，病毒载体或溶瘤病毒载体)，并且转移的核酸序列是编码衔接分子和/或治疗性分子的重组核酸序列。病毒载体有时可称为“重组病毒”或“病毒”。术语“溶瘤病毒”和“溶瘤载体”在本文中可互换使用。
“核酸基因组”或“病毒基因组”是指病毒颗粒的核酸组分，所述核酸组分编码病毒颗粒的基因组，包括基因组的复制和/或整合所需的任何蛋白质。在一些实施方案中，病毒基因组充当病毒载体并且可包含与启动子可操作地连接的异源基因。启动子对所述基因可以是天然或异源的，并且可以是病毒或非病毒起源。本文所述的病毒基因组可基于任何病毒，可以是RNA或DNA基因组，并且可以是单链或双链的。优选地，核酸基因组来自弹状病毒科。
如本文所用，“逆转录病毒载体”是指基于逆转录病毒科的病毒的病毒载体。在它们的野生型(WT)形式中，逆转录病毒载体通常含有核酸基因组。本文提供了假型化逆转录病毒载体，所述载体也包含异源基因，如本文所述的重组核酸序列。
术语“抗体片段或其衍生物”包括含有至少一个CDR并且能够特异性地结合至靶抗原的多肽序列。所述术语进一步涉及单链抗体或其片段、合成抗体、抗体片段，如骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)等，或者这些中任一者的化学修饰的衍生物。在一些实施方案中，通过使用例如单独或组合的一个或多个氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或任何其他修饰(例如翻译后和化学修饰，如糖基化和磷酸化)进一步修饰抗体或其一个或多个相应的免疫球蛋白链。用于在潜伏在免疫球蛋白链的氨基酸序列下的DNA序列中引入此类修饰的方法为本领域技术人员所熟知。
如根据本公开使用的术语“单链”是指两个或更多个多肽序列的共价连接，优选地呈由单一核酸分子编码的共线性氨基酸序列的形式。
术语“结合至”和“与......相互作用”在本文中可互换使用，并且是指至少两个“抗原相互作用位点”与彼此的相互作用。“抗原相互作用位点”是指能够与抗原或一组抗原特异性相互作用的多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的基序。结合/相互作用也被理解为定义“特异性相互作用”或“特异性结合”。
术语“特异性结合”或“特异性相互作用”是指能够与如本文定义的靶分子的至少两个氨基酸特异性相互作用和/或结合的抗原相互作用位点。所述术语涉及抗原相互作用位点区分本文定义的靶分子的特定区域(例如表位)，以使得它不与或基本上不与具有相似结构的多肽交叉反应的能力。在一些实施方案中，所述表位是线性的。在一些实施方案中，所述表位是构象表位、结构表位或由人靶分子的两个区域或其部分组成的不连续表位。在本公开的上下文中，构象表位由在一级序列中分开的两个或更多个离散氨基酸序列限定，所述氨基酸序列在折叠的蛋白质的表面上聚集在一起。可例如通过评估所述组构建体与目标多肽以及多个在常规条件下或多或少(结构上和/或功能上)密切相关的多肽的结合来测试一组研究中的抗原结合构建体的特异性和/或交叉反应性(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988和Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)。仅结合至目标多肽/蛋白质并且不与或基本上不与任何其他多肽结合的那些构建体被认为对目标多肽/蛋白质具有特异性。抗原相互作用位点与特定抗原的特异性相互作用的实例包括在结合至其特异性受体时诱导信号配体的相互作用、配体对其受体(如与特定细胞因子受体结合的细胞因子)的特异性以及抗体的抗原结合位点与抗原表位的结合等。
在一些情况下，抗原相互作用位点与特定抗原的特异性相互作用产生信号的起始，例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等。在一些实施方案中，特异性结合包括“锁钥原理”。因此，在一些实施方案中，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序与抗原中的特定基序相互作用并且由于它们的一级、二级或三级结构或者由于所述结构的二级修饰而彼此结合。在一些实施方案中，所述抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用产生所述位点与所述抗原的简单结合。
溶瘤病毒
溶瘤病毒能够感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中复制和溶解肿瘤细胞，并且进一步能够在连续的复制循环中扩散至其他肿瘤细胞。虽然过去的溶瘤病毒疗法在临床前模型和临床研究中显示出前景，但这些溶瘤病毒(如痘苗)的抗肿瘤功效并不是最理想的。例如，这些病毒在整个肿瘤中表现出有限的病毒传播和/或肿瘤内抗肿瘤T细胞应答的有限活化。因此，本公开提供了一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒1)促进效应细胞(例如，T细胞)的肿瘤浸润和活化，和2)有效地溶解未感染病毒的肿瘤细胞(也称为旁观者杀伤)。
在一些实施方案中，提供了病毒载体，所述病毒载体具有包括以下性质中的一种或多种的优点：
(i)所述载体是溶瘤性的并且与其他先前描述的溶瘤病毒载体相比，具有特别高的溶瘤活性；
(ii)所述载体优先在肿瘤细胞中复制并且与其他溶瘤病毒载体相比具有特别高的复制能力；
(iii)所述载体感染活跃分裂的细胞以及静息细胞；
(iv)所述载体诱导强烈的先天、体液和细胞免疫应答；
(v)所述载体纯粹通过细胞质复制，即作为RNA病毒，它们不能整合到宿主细胞基因组中或重组成具有复制能力的病毒；
(vi)所述载体易于包装；和/或
(vii)天然病毒糖蛋白可与外来包膜蛋白互换。
本发明的一些实施方案涉及重组水疱性口炎病毒(VSV)和VSV载体。VSV基因组包括5种基因，l、m、n、p和g，所述基因编码蛋白质L、M、N、P和G，并且对于病毒的繁殖是必需的。N是包装VSV基因组RNA的核蛋白。VSV基因组被复制为RNA-蛋白质复合物，并且L和P一起形成聚合酶复合物，所述聚合酶复合物复制VSV基因组并转录VSV mRNA。M是基质蛋白，其在脂质包膜与核衣壳之间提供结构支持并且对于细胞膜处的颗粒萌芽是重要的。G是包膜蛋白，其并入病毒包膜中并且对于病毒的感染性和向性是必需的。
假型化溶瘤病毒
在一些实施方案中，本发明提供了能够被假型化或以其他方式工程化的溶瘤病毒。“假型化病毒”是指其中所述病毒外壳蛋白(例如，包膜蛋白)中的一种或多种已被置换或修饰的病毒。在一些实施方案中，假型化病毒能够感染相应的非假型化病毒不能感染的细胞或组织类型。在一些实施方案中，与非假型化病毒相比，假型化病毒能够优先感染细胞或组织类型。
通常，病毒具有它们最有效感染的天然宿主细胞群体。例如，逆转录病毒具有有限的天然宿主细胞范围，而腺病毒和腺相关病毒能够有效地感染相对较宽范围的宿主细胞，尽管一些细胞类型难以被这些病毒感染。病毒表面上的蛋白质(例如，包膜蛋白或衣壳蛋白)介导附着至和进入易感宿主细胞，并且由此确定病毒的向性，即，特定病毒感染特定细胞或组织类型的能力。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒在病毒表面上包含单一类型的蛋白质。例如，逆转录病毒和腺相关病毒具有覆盖其膜的单一蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒在病毒表面上包含多于一种类型的蛋白质。例如，腺病毒被包膜蛋白和远离病毒表面延伸的纤维包被。
病毒表面上的蛋白质可结合至细胞表面分子如硫酸肝素，从而将病毒定位至潜在宿主细胞的表面。病毒表面上的蛋白质还可介导病毒与宿主细胞上表达的特异性蛋白质受体之间的相互作用，所述相互作用诱导病毒蛋白质的结构变化以介导病毒进入。或者，病毒表面上的蛋白质与细胞受体之间的相互作用可促进病毒内化到内体中，其中内体腔的酸化诱导病毒外壳的重折叠。在任一情况下，病毒进入潜在宿主细胞需要病毒表面上的至少一个分子与细胞表面上的至少一个分子之间的有利相互作用。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含病毒外壳(例如，病毒包膜或病毒衣壳)，其中存在于病毒外壳表面上的蛋白质(例如，病毒包膜蛋白或病毒衣壳蛋白)调节潜在靶细胞对病毒进入的识别。在一些情况下，确定病毒进入的潜在靶细胞的这一过程称为宿主向性。在一些实施方案中，宿主向性是细胞向性，其中受体的病毒识别在细胞水平下发生；或组织向性，其中细胞受体的病毒识别在组织水平下发生。在一些情况下，病毒的病毒外壳识别存在于单一细胞类型上的受体。在其他情况下，病毒的病毒外壳识别多种细胞类型(例如，2、3、4、5、6或更多种不同细胞类型)上存在的受体。在一些情况下，病毒的病毒外壳识别存在于单一组织类型上的细胞受体。在其他情况下，病毒的病毒外壳识别多种组织类型(例如，2、3、4、5、6或更多种不同组织类型)上存在的细胞受体。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含病毒外壳，所述病毒外壳已被修饰以并入来自不同病毒的表面蛋白，以促进病毒进入特定细胞或组织类型。此类溶瘤病毒在本文中称为假型化溶瘤病毒。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含病毒外壳，其中第一病毒的病毒外壳与第二病毒的病毒外壳交换，其中所述第二病毒的病毒外壳允许假型化溶瘤病毒感染特定细胞或组织类型。在一些实施方案中，病毒外壳包含病毒包膜。在一些情况下，病毒包膜包含磷脂双层和蛋白质，如从宿主膜获得的蛋白质。在一些实施方案中，病毒包膜还包含用于识别和附着至由宿主细胞表达的受体的糖蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳包含衣壳。在一些情况下，衣壳由称为原体的低聚蛋白质亚基组装。在一些实施方案中，衣壳由一种类型的原体或蛋白质组装，或由两种、三种、四种或更多种类型的原体或蛋白质组装。
在一些实施方案中，出于溶瘤疗法的目的，限制或扩大易受溶瘤病毒转导的细胞的范围是有利的。为此，已开发出许多病毒，其中内源性病毒外壳蛋白的(例如，病毒包膜蛋白或衣壳蛋白)已被来自其他病毒的病毒外壳蛋白或嵌合蛋白置换。在一些实施方案中，所述嵌合蛋白包含并入病毒粒子所必需的病毒蛋白的部分，以及被设计为与特定宿主细胞蛋白(如靶向部分)相互作用的蛋白质或核酸。
在一些实施方案中，本文所述的假型化溶瘤病毒是假型化的，以限制或控制病毒向性(即，以减少假型溶瘤病毒能够感染的细胞或组织类型的数量)。被采用来限制向性的大多数策略都使用了嵌合病毒外壳蛋白(例如，包膜蛋白)连接的抗体片段。这些病毒对溶瘤疗法的发展显示巨大前景。在一些实施方案中，本文所述的假型化溶瘤病毒是假型化的，以扩展病毒向性(即，以增加假型溶瘤病毒能够感染的细胞或组织类型的数量)。用于扩展病毒(例如，包膜病毒)的细胞向性的一种机制是通过形成表型混合的颗粒或假型，其是通常在感染两种或多种病毒的细胞中的病毒组装过程中发生的过程。例如，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)。HIV1感染表达CCR4与适当的共受体的细胞。然而，HIV1通过表型混合并入异源糖蛋白(GP)而形成假型，以使得病毒可感染不表达CD4受体和/或适当共受体的细胞，从而扩展病毒的向性。若干研究已经表明，在感染异嗜性小鼠白血病病毒(MLV)、双嗜性MLV或单纯疱疹病毒的细胞中产生的野生型HIV-1产生具有扩展的宿主范围的表型混合的病毒粒子，从而表明已经产生了假型化病毒粒子。病毒GP的表型混合也已显示在合并感染的细胞培养物中在HIV-1与VSV之间发生。这些早期观察结果是随后设计携带异源GP的基于HIV-1的慢病毒载体的关键。
用于假型化慢病毒的替代GP的列表越来越多，各自具有特定的优点和缺点。VSVG-蛋白(VSV-G)广泛用于假型慢病毒使得这种GP实际上成为比较其他病毒GP形成假型的有效性的标准。慢病毒假型的另外非限制性实例包括带有狂犬病病毒来源的GP的假型、带有淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒GP的假型化慢病毒、带有甲病毒GP的慢病毒假型(例如，用RRV和SFV GP假型化的慢病毒载体，用辛德毕斯病毒GP假型化的慢病毒载体)、带有丝状病毒GP的假型以及含有杆状病毒GP64的慢病毒载体假型。
在一些实施方案中，工程化的(例如，假型化的病毒通常通过结合至肿瘤细胞上表达的蛋白质、脂质或碳水化合物而能够结合至肿瘤和/或肿瘤细胞。在此类实施方案中，本文所述的工程化的病毒可包含将病毒引导至特定宿主细胞的靶向部分。在一些情况下，在特定细胞或组织类型(例如，肿瘤或肿瘤细胞，或肿瘤相关间质或间质质细胞)上差异表达或以其他方式存在的本领域中已知或尚待鉴别的任何细胞表面生物材料可用作本发明的溶瘤病毒的潜在靶标。在特定实施方案中，所述细胞表面材料是蛋白质。在一些实施方案中，靶向部分结合指示疾病的细胞表面抗原，所述疾病如癌症(例如，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病、黑素瘤等)；自身免疫性疾病(例如，重症肌无力、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病等)；感染性疾病，包括被HIV、HCV、HBV、CMV和HPV感染；以及遗传疾病，包括镰状细胞性贫血、囊性纤维化、泰-萨二氏病(Tay-Sachs)、J3-地中海贫血、神经纤维瘤病、多囊性肾病、血友病等。在某些实施方案中，靶向部分靶向对特定细胞或组织类型具有特异性的细胞表面抗原，例如，存在于神经、肺、肾脏、肌肉、血管、甲状腺、眼部、乳腺、卵巢、睾丸或前列腺组织中的细胞表面抗原。
用于靶向的示例性抗原和细胞表面分子包括，例如P-糖蛋白、Her2/Neu、促红细胞生成素(EPO)、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGF-R)、钙粘蛋白、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD8、CD19、CD20、CD33、CD34、CD45、CD117(c-kit)、CD133、HLA-A、HLA-B、HLA-C、趋化因子受体5(CCR5)、干细胞标志物ABCG2转运蛋白、卵巢癌抗原CA125、免疫球蛋白、整联蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、捕获树突状细胞特异性细胞间粘附分子3的非整联蛋白(DC-SIGN)、甲状腺球蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌原性分化促进因子-1(MyoD-1)、Leu-7(CD57)、LeuM-1、由单克隆抗体Ki-67(Ki-67)定义的细胞增殖相关的人核抗原、病毒包膜蛋白、HIV gp120、转铁蛋白受体等。用于靶向的另外的抗原和细胞表面分子示于表2中。
在一些实施方案中，本文提供的假型化溶瘤病毒能够选择性地进入肿瘤细胞、在肿瘤细胞中复制和/或溶解肿瘤细胞。这样一种实施方案在图36中示出，其中假型化溶瘤病毒由于并入源自不同(即，异源)病毒的病毒糖蛋白而进入靶细胞，所述病毒糖蛋白允许假型化溶瘤病毒进入靶细胞。相比之下，由于包膜蛋白的非允许性质，非假型化溶瘤病毒不能进入靶细胞。在一些情况下，假型化溶瘤病毒选择性地进入肿瘤细胞、在肿瘤细胞中复制和/或溶解肿瘤细胞的能力是由于降低的或另外无效的细胞干扰素(IFN)应答。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒产生衔接分子和/或治疗性分子(如免疫调节多肽)，其干扰或损害细胞IFN应答，从而增强假型化或工程化病毒的复制。
本文所述的假型化溶瘤病毒可源自多种病毒，其非限制性实例包括痘苗病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒1(HSV1)、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MV)、拉沙病毒(LASV)和新城疫病毒(NDV)。在一些实施方案中，本文所述的假型化溶瘤病毒可感染基本上任何细胞类型。用于溶瘤疗法的示例性慢病毒是用来自VSV的包膜蛋白G蛋白(GP)包被的猿猴免疫缺陷病毒。在某些情况下，这种病毒被称为VSV G假型化慢病毒，并且已知感染几乎通用组的细胞。
在一些实施方案中，本发明的假型化溶瘤病毒是针对健康脑细胞(即神经元)假型化的VSV病毒，并且表现出显著降低的毒性。由于亲神经性是溶瘤性VSV的所有应用中的剂量限制因素，因此根据本发明的一些实施方案的载体的用途是它们用于所有肿瘤类型的实体瘤。
在一些实施方案中，假型化VSV载体具有一种或多种关键属性，包括：(i)所述VSV不是细胞毒性的；(ii)通过超速离心浓缩所述载体而不损失感染性；以及(iii)所述载体显示出对肿瘤细胞的向性，而神经元和其他非肿瘤细胞的感染效率低下。为了增加在治疗用途中使用可复制病毒期间的安全性，本发明的一些实施方案提供了一种载体系统，所述载体系统确保复制、溶瘤和VSV病毒的产生仅发生在被至少两种复制缺陷型互相互补的载体感染的细胞中。
在一些实施方案中，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质(例如，病毒外壳蛋白或核心遗传物质)是从DNA病毒、RNA病毒或两种病毒类型中获得的。在一些实施方案中，DNA病毒是单链(ss)DNA病毒、双链(ds)DNA病毒，或含有ss和ds DNA区域的DNA病毒。在一些实施方案中，RNA病毒是单链(ss)RNA病毒或双链(ds)RNA病毒。在一些实施方案中，ssRNA病毒进一步分类为正义RNA病毒或负义RNA病毒。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自以下科中的任一者的dsDNA病毒：肌尾噬菌体科、短尾噬菌体科、长尾噬菌体科、异疱疹病毒科、疱疹病毒科、软体动物疱疹病毒科、脂毛噬菌体科、古噬菌体科、腺病毒科、瓶状病毒科(Ampullaviridae)、囊泡病毒科、非洲猪瘟病毒科、棒状病毒科、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、Clavaviridae、覆盖噬菌体科、微小纺锤形噬菌体科、球状病毒科、滴状病毒科、唾液腺肥大病毒科(Hytrosaviridae)、虹彩病毒科、马赛病毒科、拟菌病毒科、线头病毒科、潘多拉病毒科、乳头瘤病毒科、藻类去氧核糖核酸病毒科、芽生噬菌体科、多去氧核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、球脂状病毒科或复层噬菌体科。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自以下科中的任一者的ssDNA病毒：指环病毒科、虹彩病毒科(Bacillariodnaviridae)、双核糖核酸病毒科、圆环病毒科、双生病毒科、丝状噬菌体科、微小噬菌体科、矮化病毒科、细小病毒科或Spiraviridae。
在一些实施方案中，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自含有ssDNA和dsDNA区域的DNA病毒。在一些情况下，DNA病毒来自多形性病毒(pleolipovirus)群。在一些情况下，多形性病毒包括西班牙盐盒菌多形性病毒1、盐几何菌多形性病毒1、盐红菌多形性病毒1、盐红菌多形性病毒2、盐红菌多形性病毒3或盐红菌多形性病毒6。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自以下科中的任一者的dsRNA病毒：双核糖核酸病毒科、金色病毒科、囊状噬菌体科、内源核糖核酸病毒科、低毒性病毒科(Hypoviridae)、Megavirnaviridac、分体病毒科、微小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、轮状病毒或整体病毒科。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自以下科中的任一者的正义ssRNA病毒：甲型线形病毒科、Alphatetraviridae、Alvernaviridae、动脉炎病毒科、星状病毒科、双核糖核酸病毒科、乙型线形病毒科、雀麦镶嵌病毒科、杯状病毒科、Carmotetraviridae、修道院病毒科、冠状病毒科、二顺反子病毒科、黄病毒科、丙型线形病毒科、传染性软化病毒科、光滑病毒科、黄症病毒科、海洋RNA病毒科、海洋病毒科、裸露核糖核酸病毒科、野田病毒科、Permutotetraviridae、微小核糖核酸病毒科、马铃薯Y病毒科、杆状套病毒科、伴生豇豆病毒科、披膜病毒科、番茄丛矮病毒科、芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae)或帚状病毒科。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自以下科中的任一者的负义ssRNA病毒：玻那病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、炮弹病毒科、尼亚玛尼病毒科(Nyamiviridae)、沙粒病毒科、本雅病毒科、蛇形病毒科或正粘病毒科。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自溶瘤DNA病毒获，所述溶瘤DNA病毒包含为二十面体或复合体的衣壳对称。在一些情况下，二十面体溶瘤DNA病毒是裸露的或包含包膜。溶瘤DNA病毒的示例性科包括腺病毒科(例如，腺病毒，基因组大小为36-38kb)、疱疹病毒科(例如，HSV1，基因组大小为120-200kb)和痘病毒科(例如，痘苗病毒和粘液瘤病毒，基因组大小为130-280kb)。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自溶瘤RNA病毒，包括具有二十面体或螺旋衣壳对称的那些。在一些情况下，二十面体溶瘤病毒是裸露的而无包膜并且包括呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒，具有22-27kb的基因组)和微小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒，基因组大小为7.2-8.4kb)。在其他情况下，螺旋溶瘤RNA病毒被包膜并包括弹状病毒科(例如，VSV，基因组大小为13-16kb)和副粘病毒科(例如MV和NDV，基因组大小为16-20kb)。
在一些情况下，用于产生假型化溶瘤病毒的遗传物质获自病毒，如艾贝尔森白血病病毒、艾贝尔森鼠白血病病毒、艾贝尔森病毒、急性喉气管支气管炎病毒、阿德莱德河病毒、腺相关病毒群、腺病毒、非洲马瘟病毒、非洲猪瘟病毒、AIDS病毒、艾刘蒂貂病微病毒、α逆转录病毒、甲病毒、ALV相关病毒、阿马帕里病毒、口蹄疫病毒、水生呼肠孤病毒属、虫媒病毒、C组虫媒病毒、A组虫媒病毒、B组虫媒病毒、沙粒病毒群、阿根廷出血热病毒、阿根廷出血热病毒、动脉炎病毒、星状病毒、侏猴疱疹病毒群、奥耶斯基氏病病毒、奥拉病毒、Ausduk病病毒、澳洲蝙蝠狂犬病病毒、禽腺病毒、禽成红细胞增多症病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽白血病病毒、禽淋巴瘤病病毒、禽成髓细胞瘤病毒、禽副粘病毒、禽肺炎脑炎病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽肉瘤病毒、禽C型逆转录病毒群、禽肝病毒、禽痘病毒、B病毒、B19病毒、Babanki病毒、狒狒疱疹病毒、杆状病毒、巴马森林病毒、比巴鲁病毒、贝里马病毒、乙型逆转录病毒、双RNA病毒、比得纳病毒、BK病毒、黑港渠病毒、蓝舌病毒、玻利维亚出血热病毒、博马病病毒、羊边境病病毒、博尔纳病毒、牛α疱疹病毒1、牛α疱疹病毒2、牛冠状病毒、牛流行热病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛白血病病毒、牛乳头炎病毒、牛乳头瘤病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛细小病毒、牛合胞病毒、牛C型肿瘤病毒、牛病毒性腹泻病毒、Buggy Creek病毒、子弹状病毒群、布尼奥罗病毒超群、布尼亚病毒、伯基特氏淋巴瘤病毒、勃旺巴热、CA病毒、杯状病毒、加州脑炎病毒、骆驼痘病毒、金丝雀痘病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、犬微小病毒、犬细小病毒、卡尼奥德尔加蒂图病毒、山羊关节炎病毒、山羊脑炎病毒、山羊疱疹病毒、羊痘病毒、心病毒、豚鼠疱疹病毒1、猕猴疱疹病毒1、猕猴疱疹病毒1、弥猴疱疹病毒2、金迪普拉病毒、钱吉诺拉病毒、斑点叉尾鮰病毒、沙勒维尔病毒、水痘病毒、基孔肯亚病毒、黑猩猩疱疹病毒、鲢鱼呼肠孤病毒、大马哈鱼病毒、科卡尔病毒、银大马哈鱼呼肠孤病毒、媾疹病毒、科罗拉多蜱传热病毒、科罗拉多壁虱热病毒、哥伦比亚SK病毒、普通感冒病毒、接触传染性脓疱病毒、接触传染性脓疱性皮炎病毒、冠状病毒、科里帕塔病毒、鼻炎病毒、牛痘病毒、柯萨奇病毒、CPV(细胞质型多角体病毒)、蟋蟀麻痹病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、哮吼相关病毒、隐病毒、质型多角体病毒、巨细胞病毒、巨细胞病毒组、细胞质多角体病毒、鹿乳头瘤病毒、δ逆转录病毒属、登革热病毒、浓核病毒、依赖病毒属、多里病毒、diploma病毒、果蝇C病毒、鸭乙型肝炎病毒、1型鸭肝炎病毒、2型鸭肝炎病毒、十二指肠病毒、杜文海格病毒、畸翅病毒DWV、东部马脑炎病毒、东部马脑脊髓炎病毒、EB病毒、埃博拉病毒、类埃博拉病毒、艾柯病毒、艾柯病毒、艾柯病毒10型、艾柯病毒28型、艾柯病毒9型、鼠痘病毒、EEE病毒、EIA病毒、EIA病毒、脑炎病毒、脑心肌炎病毒群、脑心肌炎病毒、肠道病毒、酶升高病毒、酶升高病毒(LDH)、流行性出血热病毒、兽疫出血病病毒、埃-巴二氏病毒、马α疱疹病毒1型、马α疱疹病毒4型、马疱疹病毒2型、马流产病毒、马动脉炎病毒、马脑病病毒、马传染性贫血病毒、马麻疹病毒、马鼻肺炎病毒、马鼻病毒、Eubenangu病毒、欧洲麋鹿乳头瘤病毒、欧洲猪瘟病毒、埃弗格赖德病毒、依埃契病毒、猫疱疹病毒1型、猫杯状病毒、猫纤维肉瘤病毒、猫疱疹病毒、猫免疫缺陷病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫白血病/肉瘤病毒、猫白血病病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、猫肉瘤病毒、猫合胞体病毒、丝状病毒、弗兰德斯病毒、黄病毒、口蹄疫病毒、摩根堡病毒、四角汉坦病毒、禽腺病毒1型、禽痘病毒、弗兰德病毒、γ逆转录病毒、GB肝炎病毒、GB病毒、德国麻疹病毒、盖塔病毒、长臂猿白血病病毒、腺热病毒、山羊痘病毒、银鱼病毒(golden shinnervirus)、枯叶蛾病毒、鹅细小病毒、颗粒体病毒、格罗斯病毒、地松鼠乙型肝炎病毒、A组虫媒病毒、瓜纳瑞托病毒、豚鼠巨细胞病毒、豚鼠C型病毒、汉坦病毒、汉坦病毒、文蛤呼肠孤病毒、野兔纤维瘤病毒、HCMV(人巨细胞病毒)、血细胞吸附病毒2型、日本血凝病毒、出血热病毒、亨德拉病毒、亨尼帕病毒、嗜肝DNA病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒组、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus)、丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus)、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、非甲非乙型肝炎病毒、肝炎病毒、肝炎病毒(非人)、肝脑脊髓炎呼肠孤病毒3型、肝病毒、苍鹭乙型肝炎病毒、疱疹B病毒、单纯疱疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、疱疹病毒、疱疹病毒7型、蛛猴疱疹病毒、人疱疹病毒、疱疹病毒感染、松鼠猴疱疹病毒、猪疱疹病毒、水痘疱疹病毒、高地J病毒、牙鲆弹状病毒、猪瘟病毒、人腺病毒2型、人α疱疹病毒1型、人α疱疹病毒2型、人α疱疹病毒3型、人B嗜淋巴细胞病毒、人β疱疹病毒5型、人冠状病毒、人巨细胞病毒组、人泡沫病毒、人γ疱疹病毒4型、人γ疱疹病毒6型、人甲型肝炎病毒、人疱疹病毒1组、人疱疹病毒2组、人疱疹病毒3组、人疱疹病毒4组、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、人乳头瘤病毒、人T细胞白血病病毒、人T细胞白血病病毒I型、人T细胞白血病病毒II型、人T细胞白血病病毒III型、人T细胞淋巴瘤病毒I型、人T细胞淋巴瘤病毒II型、人T细胞嗜淋巴细胞病毒1型、人T细胞嗜淋巴细胞病毒2型、人T嗜淋巴细胞病毒I型、人T嗜淋巴细胞病毒II型、人T嗜淋巴细胞病毒III型、姬蜂病毒、婴儿胃肠炎病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、传染性造血器官坏死病毒、传染性胰腺坏死病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、流感病毒pr8、昆虫虹彩病毒、昆虫病毒、虹彩病毒、日本B病毒、日本脑炎病毒、JC病毒、胡宁病毒、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒、克麦罗沃病毒、基勒姆大鼠病毒、克拉马斯病毒、科隆各病毒、朝鲜出血热病毒、昆巴病毒、科萨努尔森林病病毒、孜拉加奇病毒、拉克罗斯病毒、乳酸脱氢酶升高病毒、乳酸脱氢酶病毒、拉各斯蝙蝠病毒、叶猴病毒、兔细小病毒、拉沙热病毒、拉沙病毒、潜伏大鼠病毒、LCM病毒、渗漏病毒、慢病毒、兔痘病毒、白血病病毒、白血病病毒、结节性皮肤病病毒、淋巴结病相关病毒、淋巴隐病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、淋巴组织增生性病毒组、马丘波病毒、疯痒病毒、哺乳动物B型肿瘤病毒组、哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒组、哺乳动物D型逆转录病毒、乳腺肿瘤病毒、马普埃拉病毒、马尔堡病毒、马尔堡样病毒、梅森菲舍猴病毒、哺乳动物腺病毒、马亚罗病毒、ME病毒)、麻疹病毒、梅南高病毒、孟高病毒、门戈病毒、米德尔堡病毒、挤奶人结节病毒、水貂肠炎病毒、小鼠微小病毒、MLV相关病毒、MM病毒、莫科拉病毒、软疣痘病毒、传染性软疣病毒、猴B病毒、猴痘病毒、单分子负链RNA病毒、麻疹病毒、埃尔冈山蝙蝠病毒、小鼠巨细胞病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠K病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、小鼠微小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠脊髓灰质炎病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠痘病毒、莫桑比克病毒、穆坎博病毒、粘膜病病毒、腮腺炎病毒、鼠β疱疹病毒1型、鼠巨细胞病毒2型、鼠巨细胞病毒组、鼠脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒、鼠白血病病毒、鼠结节诱发病毒、鼠多瘤病毒、鼠肉瘤病毒、鼠巨细胞病毒、墨累谷脑炎病毒、粘液瘤病毒、粘液病毒、新城疫病毒、腮腺炎粘液病毒、内罗毕绵羊病病毒、内罗病毒、那尼那病毒、纳里瓦病毒、恩杜莫病毒、利瑟林病毒、纳尔逊湾病毒、向神经病毒、新世界沙粒病毒、新生儿肺炎病毒、纽卡斯尔病病毒、尼帕病毒、非细胞病变性病毒、诺沃克病毒、核多角体病毒(NPV)、乳头颈病毒、阿尼昂-尼昂病毒、奥克尔布病毒、致癌病毒、致癌病毒样颗粒、致癌RNA病毒、环状病毒、口疮病毒、奥罗普切病毒、正嗜肝DNA病毒、正粘病毒、正痘病毒、正呼肠孤病毒属、欧伦哥病毒、绵羊乳头瘤病毒、绵羊卡他热病毒、枭猴疱疹病毒、巴尼亚姆病毒、乳头瘤病毒、sylvilagi乳头瘤病毒、乳多空病毒、副流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、副粘病毒、副痘病毒、副痘苗病毒、细小病毒、细小病毒B19、细小病毒群、瘟病毒、白蛉病毒属、海豹瘟热病毒、小脱氧核糖核酸病毒、小核糖核酸病毒、猪巨细胞病毒-鸽痘病毒、皮里病毒、那皮舒纳病毒、小鼠肺炎病毒、肺炎病毒、脊髓灰质炎病毒(poliomyelitis virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、多DNA病毒、多面体病毒、多瘤病毒(polyoma virus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、牛多瘤病毒、长尾猴多瘤病毒、人多瘤病毒2型、弥猴多瘤病毒1型、鼠多瘤病毒1型、鼠多瘤病毒2型、狒狒多瘤病毒1型、狒狒多瘤病毒2型、sylvilagi多瘤病毒、猿疱疹病毒1型、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪C型病毒、痘病毒、痘病毒、天花病毒、希望山病毒、前病毒、假牛痘病毒、伪狂犬病病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔肾空泡病毒、兔乳头瘤病毒、狂犬病毒、浣熊细小病毒、浣熊痘病毒、兰尼克特病毒、大鼠巨细胞病毒、大鼠细小病毒、大鼠病毒、劳舍尔病毒、重组痘苗病毒、重组病毒、呼肠孤病毒、呼肠孤病毒1型、呼肠孤病毒2型、呼肠孤病毒3型、爬虫类C型病毒、呼吸道感染病毒、呼吸道合胞体病毒、呼吸道病毒、网状内皮增生症病毒、棒状病毒、鲤鱼棒状病毒、细长病毒、鼻病毒、根前毛壶菌病毒、裂谷热病毒、莱利病毒、牛瘟病毒、RNA肿瘤病毒、罗斯河病毒、轮状病毒、麻疹病毒、劳斯肉瘤病毒、风疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒、俄罗斯秋季脑炎病毒、SA 11猿猴病毒、SA2病毒、萨比亚病毒、鹭山病毒、松鼠猴疱疹病毒1型、唾液腺病毒、白蛉热病毒组、圣德吉姆巴病毒、SARS病毒、SDAV(涎泪腺炎病毒)、海豹痘病毒、塞姆利基森林病毒、汉城病毒、绵羊痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔乳头瘤病毒、猿猴泡沫病毒、猿猴甲型肝炎病毒、猿猴人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴副流感病毒、猿猴T细胞嗜淋巴细胞病毒、猿猴病毒、猿猴病毒40、单纯疱疹病毒、辛诺柏病毒、辛德比斯病毒、天花病毒、南美出血热病毒、麻雀痘病毒、泡沫病毒、松鼠纤维瘤病毒、松鼠猴逆转录病毒、SSV 1病毒组、STLV(猿猴T嗜淋巴细胞病毒)I型、STLV(猿猴T嗜淋巴细胞病毒)II型、STLV(猿猴T嗜淋巴细胞病毒)III型、牛丘疹口炎病毒、颌下腺病毒、猪α疱疹病毒1型、猪疱疹病毒2型、猪痘病毒、沼泽热病毒、猪痘病毒、瑞士小鼠白血病病毒、TAC病毒、(塔卡里伯复合病毒)、塔卡里伯病毒、塔纳痘病毒、沙鼠痘病毒、丁鲷呼肠孤病毒、泰勒脑脊髓炎病毒、蒂勒病毒、索戈托病毒、索托帕拉雅病毒、蜱传脑炎病毒、刁曼病毒、披膜病毒、环曲病毒、肿瘤病毒、图帕伊阿病毒、火鸡鼻气管炎病毒、火鸡痘病毒、C型逆转录病毒、D型肿瘤病毒、D型逆转录病毒组、溃疡性疾病弹状病毒、乌纳病毒、尤库尼米病毒组、痘苗病毒、空泡病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、天花病毒、重型天花病毒、天花病毒、瓦信义秀病病毒(Vasin Gishu disease virus)、VEE病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉出血热病毒、水疱性口炎病毒、水泡病毒、Vilyuisk病毒、蝰蛇逆转录病毒、病毒性出血性败血症病毒、绵羊梅迪维斯纳病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、田鼠痘病毒、VSV(水疱性口炎病毒)、沃洛尔病毒、瓦里各病毒、疣病毒、WEE病毒、西尼罗河病毒、西部马脑炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、瓦塔罗阿病毒、冬季呕吐病毒、土拨鼠乙型肝炎病毒、绒毛猴肉瘤病毒、伤瘤病毒、WRSV病毒、亚巴猴肿瘤病毒、亚巴病毒、亚塔痘病毒、黄热病病毒以及尤格波格丹诺夫奇病毒。
产生假型化溶瘤病毒的方法
在一些情况下，使用本领域中熟知的方法产生本文所述的假型化溶瘤病毒。在一些情况下，所述方法涉及一个或多个转染步骤和一个或多个感染步骤。在一些情况下，用本文所述的假型化溶瘤病毒感染细胞系如哺乳动物细胞系、昆虫细胞系或植物细胞系以产生一种或多种病毒。示例性哺乳动物细胞系包括：293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293 H细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTM T-RExTM 293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM 293-F细胞、FreeStyleTM CHO-S细胞、GripTiteTM 293 MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTM Jurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系、T-RExTM-HeLa细胞系、3T6、A549、A9、AtT-20、BALB/3T3、BHK-21、BHL-100、BT、Caco-2、Chang、克隆9、克隆M-3、COS-1、COS-3、COS-7、CRFK、CV-1、D-17、Daudi、GH1、GH3、H9、HaK、HCT-15、HEp-2、HL-60、HT-1080、HT-29、HUVEC、I-10、IM-9、JEG-2、Jensen、K-562、KB、KG-1、L2、LLC-WRC 256、McCoy、MCF7、VERO、WI-38、WISH、XC或Y-1。示例性昆虫细胞系包括果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、High FiveTM细胞或细胞。示例性植物细胞系包括藻类细胞，例如像褐囊藻。
本领域技术人员已知的任何方法用于大规模生产重组溶瘤载体和载体构建体，如假型化溶瘤载体。例如，主要和工作种子储备液可在GMP条件下在合格的初级CEF中或通过其他方法制备。在一些情况下，将细胞接种在大表面积烧瓶上，生长至接近汇合，并以选定的MOI感染。然后可纯化产生的病毒。在一些情况下，收获细胞并通过机械破坏释放细胞内病毒。在一些实施方案中，通过大孔深度过滤除去细胞碎片和/或用核酸内切酶消化宿主细胞DNA。在一些情况下，随后将病毒颗粒纯化并通过切向流过滤浓缩，然后渗滤。所得到的浓缩病毒可通过用含有一种或多种稳定剂的缓冲液稀释来配制，填充到小瓶中并冻干。组合物和制剂可储存以供稍后使用。在一些实施方案中，通过添加一种或多种稀释剂来复原冻干的病毒。
衔接分子
在一些实施方案中，本文提供的溶瘤病毒载体是假型化溶瘤病毒，其被进一步工程化为包含编码衔接分子(例如，衔接多肽)的多核苷酸序列。本发明的衔接分子包含至少两个结构域，所述结构域各自能够结合至不同的细胞表面分子。在一些实施方案中，衔接多肽包含抗原识别结构域和活化结构域，所述结构域识别分别由靶细胞和效应细胞表达的特定细胞表面蛋白(例如，细胞表面受体或配体)。如本文所用，“抗原识别结构域”是结合靶细胞的细胞表面上存在的一个或多个分子(例如，肿瘤抗原)的多肽，并且“活化结构域”是结合至效应细胞的细胞表面上存在的一个或多个分子(例如，活化分子)的多肽。活化结构域也可称为“衔接结构域”。
在一些实施方案中，衔接多肽包含治疗性分子结构域和活化结构域。治疗性分子结构域是结合至效应细胞上表达的特定细胞表面蛋白(例如，细胞表面受体或配体)并且与由活化结构域识别的细胞表面蛋白不同的多肽。在特定实施方案中，所述治疗性分子结构域结合至细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白是效应细胞功能的负调控因子(例加，免疫检查点分子或其他抑制性分子)。用于通过治疗性结构域靶向的示例性细胞表面抗原包括CD47、PD1、PDL1、CTLA4、TIM2、LAG3、BTLA、KIR、TIGIT、OX40、FITR、CD27、SLAMF7和CD200。
在一些实施方案中，活化结构域与效应细胞的表面上存在的分子的结合产生所述效应细胞的活化。在某些实施方案中，活化结构域与效应细胞上的分子的结合以及抗原识别结构域与靶细胞上存在的分子的结合使效应细胞紧密接近靶细胞，并且由此促进效应细胞对靶细胞的破坏。在某些实施方案中，活化结构域与效应细胞上的活化分子的结合以及治疗性分子结构域与效应细胞上存在的抑制性分子的结合增强效应细胞的活化，并且由此促进效应细胞对一种或多种旁观者靶细胞的破坏。
在某些实施方案中，衔接分子是蛋白质，例如，工程化的蛋白质。在一些实施方案中，衔接分子是二分多肽。在一些实施方案中，衔接分子是三联或多分多肽。在此类实施方案中，衔接分子可包含一个或多个活化结构域和/或抗原识别结构域，或其他结构域，包括一个或多个共刺激结构域、一个或多个二聚化或三聚化结构域、或能够结合在细胞表面上表达的分子的其他结构域。或者，一个或多个另外的结构域任选地存在于单独多肽上。在一些实施方案中，衔接分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，衔接分子是三功能抗体、Fab2、双特异性scFv如双特异性T细胞衔接器(BiTE)、二价微型抗体、双特异性双抗体、DuoBody或Mab2。在某些实施方案中，衔接分子是二分T细胞衔接器(BiTE)或三联T细胞衔接器(TiTE)。
在一些实施方案中，衔接分子的活化结构域、抗原识别结构域和/或治疗性分子结构域包含抗体或其抗原结合片段，例如，单链可变片段(scFv)、单克隆抗体、Fv、Fab、微型抗体、双抗体。在一些实施方案中，衔接分子的活化结构域、抗原识别结构域和/或治疗性分子结构域包含配体、肽、识别可溶性TCR并与其相互作用的肽，或其组合。在一些实施方案中，这些抗体来源的片段或衍生物可通过化学、生物化学或分子生物学方法进行修饰。相应的方法是本领域已知的并且尤其描述于实验室手册中(参见Sambrook等人；MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1989和第3版2001；Gerhardt等人；Methods for General and Molecular Bacteriology；ASMPress，1994；Lefkovits；Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebookof Techniques；Academic Press，1997；Golemis；Protein-Protein Interactions：AMolecular Cloning Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)。在一些情况下，用于构建本文所述的衔接分子的多肽、抗体或其抗原结合片段是人源化或去免疫化构建体。用于多肽且特别是抗体构建体的人源化和/或去免疫化的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，对于本文所述的任何衔接器，相应结构域处于从N-末端至C-末端的任何顺序。例如，在一些实施方案中，衔接分子可包含N-末端活化结构域和C-末端抗原识别结构域。在一些实施方案中，衔接分子可包含N-末端抗原识别结构域和C-末端活化结构域。在一些实施方案中，衔接分子可包含N-末端活化结构域和C-末端治疗性分子结构域。在一些实施方案中，衔接分子可包含N-末端治疗性分子结构域和C-末端活化结构域。在某些实施方案中，对T细胞进行修饰以分泌在活化结构域的N-末端具有抗原识别结构域或治疗性分子结构域的衔接分子。
在特定实施方案中，衔接分子的两个或更多个结构域通过接头连接。在一些情况下，所述接头具有任何合适的长度，并且这种参数在本领域中进行常规优化。例如，接头具有足以确保第一结构域和第二结构域中的每一个可彼此独立地保留其差异结合特异性的长度和序列。术语“肽接头”是指定义的构建体的第一结构域(例如，活化结构域)和第二结构域域(例如，抗原识别结构域或治疗性分子结构域)的氨基酸序列通过其连接在一起的氨基酸序列。在一些情况下，这种肽接头的一种技术特征是所述肽接头不包含任何聚合活性和/或不促进二级结构的形成。此类肽接头是本领域中已知的并且描述于例如Dall′Acqua等人(Biochem.(1998)37，9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29，21-30)；以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)中。在一些实施方案中，本发明的肽接头包含少于5个氨基酸、少于4个氨基酸、少于3个氨基酸、少于2个氨基酸或1个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头是单个氨基酸接头。在此类实施方案中，单个氨基酸通常是甘氨酸(Gly)。在一些实施方案中，优选也不促进任何二级结构的肽接头。用于制备融合的、可操作地连接的构建体的方法及其在哺乳动物或细菌细胞中的表达是本领域中熟知的(参见例如，国际PCT公布号WO 99/54440；Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.1989 and 1994；以及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
在一些实施方案中，衔接分子是单链双特异性抗体构建体。术语“单链双特异性抗体构建体”是指包含两个抗体来源的结合结构域的构建体。所述结合结构域中的一个包含能够与效应细胞上表达的活化分子(例如，CD3)特异性地结合/相互作用的抗体或其抗原结合片段或衍生物的重链(VH)和轻链(VL)的可变区(或其部分)。第二结合结构域包含能够与靶细胞上表达的靶抗原(例如，CD19)或由效应细胞表达的抗原(例如，抑制剂分子特异性地结合/相互作用的抗体或其抗原结合片段或衍生物的重链(VH)和轻链(VL)的可变区(或其部分)。在特定实施方案中，两种抗体或抗原结合片段或衍生物中的每一种包含至少一个互补决定区(CDR)，特别是CDR3。在一些实施方案中，单链双特异性抗体构建体是双特异性scFv或双抗体。
在具体实施方案中，单链双特异性抗体构建体是单链双特异性scFv。scFv通常含有通过接头肽连接的VH和VL结构域。在一些实施方案中，单链双特异性scFv包含信号肽以允许从细胞分泌，然后是通过一个或多个接头肽(Lx、Ly、Lz)连接的两个scFv。双特异性单链分子是本领域已知的并且描述于国际PCT公布号WO 99/54440；Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970；Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025；Kufer，Cancer Immunol.Immunother.，(1997)，45，193-197；Loftier，Blood，(2000)，95，6，2098-2103；以及Bruhl，J.Immunol.，(2001)，166，2420-2426中。
在一些实施方案中，编码单链双特异性scFv多肽的多核苷酸的分子形式包含编码信号肽的核酸序列(如SEQ ID NO：2和4的信号序列)，随后是两个或更多个抗体来源的区(例如，第一scFv和第二scFv)。每个抗体来源的区(例如，scFv)包含一个VH链和一个VL链。在具体实施方案中，两个或更多个抗体来源的区是scFv并且通过肽接头连接以形成单链双特异性scFv构建体。在一些实施方案中，双特异性scFv是串联双-scFv或双抗体。双特异性scFv可以不同的形式排列，包括以下：VHO-Lx-VLa-Ly-VH-Lz-ViJ3、VLa-Lx-VHa-Ly-VH-Lz-ViJ3、VLa-Lx-VH-Ly-VL-Lz-VH、VH-Lx-VLa-Ly-VL-Lz-VH、VH-Lx-VL-Ly-VH-Lz-VLa、VLa-Lx-VL-Ly-VH-Lz-VH、VH-Lx-VH-Ly-VL-Lz-VLa、VLa-Lx-VH-Ly-VL-Lz-VH、VH-Lx-VLa-Ly-VH-Lz-VL、VL-Lx-VLa-Ly-VH-Lz-VH、VH-Lx-VH-Ly-VLa-Lz-VL、VL-Lx-VH-Ly-VLa-Lz-VH。
在一些实施方案中，衔接分子包含多个(例如，2、3、4、5或更多个)抗原结合结构域，以允许靶向多种抗原。在一些实施方案中，衔接分子包含多个(例如，2、3、4、5或更多个)活化结构域以活化效应细胞。在一些实施方案中，衔接分子包含多个(例如，2、3、4、5或更多个)治疗性分子结构域以活化效应细胞。
在本公开的具体实施方案中，衔接分子包含用于分离和/或制备重组产生的构建体的另外结构域，如标签或标记。标签或标记可以是短肽序列，如组氨酸标签(SEQ ID NO：12)，或者可以是能够被成像的标签或标记，如荧光或放射性标记。
在特定实施方案中，本发明的衔接分子与靶细胞上表达的靶抗原和效应细胞上表达的活化分子(例如，特异性地结合至人CD3复合物的两个区域之一或其部分的活化结构域)的一种或多种特定构象/结构表位特异性地结合或相互作用。在特定实施方案中，本发明的衔接分子与效应细胞上表达的活化分子和效应细胞上表达的不同细胞表面蛋白的一种或多种特定构象/结构表位特异性地结合/相互作用。因此，在一些情况下特异性通过本领域已知的方法以及如本文公开和描述的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀(RIP)、电化学发光(ECL)、免疫放射测定(IRMA)、酶免疫测定(EIA)和肽扫描。
活化分子和靶细胞抗原
在一些实施方案中，衔接分子的活化结构域与效应细胞的细胞表面上的活化分子的结合产生效应细胞的活化。如本文所用，术语“效应细胞”是指能够促进靶细胞的死亡的任何哺乳动物细胞类型。在特定实施方案中，本发明的效应细胞是免疫细胞，如T细胞、B细胞、先天淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞(NKT)、粒细胞(例如，嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞)、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。示例性效应细胞类型包括T细胞、NK细胞、NKT细胞和巨噬细胞。
在一些实施方案中，效应细胞的活化可产生以下中的一种或多种：(i)效应细胞的增殖增加；(ii)效应细胞的一种或多种细胞表面蛋白的表达或活性的变化；(iii)由效应细胞表达的一种或多种细胞内蛋白质的表达或活性的变化；(iv)由效应细胞产生和/或分泌的因子(如细胞因子、趋化因子或活性氧物质)的量或性质的变化；(v)效应细胞的形态的变化；(vi)效应细胞的趋化潜能的变化，如通过一种或多种趋化因子受体的表达增加或减少；(vii)效应细胞的功能活性的变化，如增加的细胞溶解活性和/或增加的吞噬活性。效应细胞或效应细胞群体的活化可通过本领域已知的任何方式确定。例如，增殖、蛋白质表达、产生或分泌的变化可通过流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀或免疫荧光来确定，并且细胞形态的变化可通过本领域已知的多种类型的显微术来确定。
技术人员将认识到，活化分子的性质可根据效应细胞的性质而变化，尽管不同组的效应细胞可共享某些类型的活化分子的表达。例如，T细胞表达与NK细胞或巨噬细胞不同的表面受体，即不同的活化受体。作为说明性实例，CD3是由T细胞表达的活化受体，所述活化受体不由NK细胞或巨噬细胞表达；而CD1、CD16、NKG2D和/或NKp30是由NK细胞表达的活化受体，所述活化受体不由T细胞表达。因此，在一些情况下，活化T细胞的衔接分子具有与活化NK细胞、巨噬细胞、NKT细胞或其他类型的效应细胞的衔接分子不同的活化结构域。示例性活化分子如下文所述并显示在表1中。
在一些实施方案中，效应细胞是T细胞，并且衔接分子的活化结构域结合至由T细胞表达的活化分子。T细胞谱系包含许多T细胞亚型，包括NKT细胞、细胞毒性T细胞(Tc或CTL)、记忆T细胞、辅助T细胞(例如，Th1、Th2、Th17、Th9和/或Th22细胞)、抑制性T细胞(例如，调性控T细胞(Treg))、粘膜相关的不变T细胞和γδT细胞。在一些情况下，由一种T细胞亚型表达的一种或多种表面受体不由另一种T细胞亚型表达。在一些情况下，由一种T细胞亚型表达的一种或多种表面受体由至少一种其他T细胞亚型表达。在一些情况下，由一种T细胞亚型表达的一种或多种表面受体通常由所有或大多数T细胞亚型表达。例如，CD3是T细胞受体(TCR)复合物的信号传导组分，并且在多种T细胞亚型中表达。由T细胞(例如，NKT、Tc、记忆T细胞或辅助T细胞)表达的示例性活化分子包括但不限于CD3的一种或多种组分(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ξ)、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD40、CD57、CD69、CD70、CD73、CD81、CD82、CD134、CD137、CD152或CD278。在一些实施方案中，效应细胞是NKT细胞。在此类实施方案中，活化分子包括但不限于CD3或不变的TCR。
在一些实施方案中，效应细胞是NK细胞，并且衔接分子的活化结构域结合至由NK细胞表达的活化分子。由NK细胞表达的示例性活化分子包括但不限于CD16、CD94/NKG2(例如，NKG2D)、NKp30、NKp44、NKp46或杀伤活化受体(KAR)。
表1：示例性活化分子
在一些实施方案中，衔接分子与靶细胞和效应细胞的结合(例如，活化结构域与效应细胞上的分子的结合以及抗原识别结构域与靶细胞上存在的分子的结合)使效应细胞紧密接近靶细胞，并且由此促进效应细胞对靶细胞的破坏。如本文所用，术语“靶细胞”是指应被杀伤、攻击、破坏和/或控制的哺乳动物细胞。特别地，靶细胞是与相同细胞类型的正常细胞相比以某种方式改变的细胞，如癌细胞、细菌感染的细胞、病毒感染的细胞、真菌感染的细胞和/或自身免疫性细胞。在特定实施方案中，本发明的靶细胞是癌细胞(例如，肿瘤细胞)。靶细胞的破坏(即，死亡)可通过本领域已知的任何方式来确定，如流式细胞术(例如，通过膜联蛋白V、碘化丙锭或其他方式)、细胞计数和/或显微术以确定靶细胞的细胞形态。
在一些实施方案中，衔接分子的抗原识别结构域经由抗原识别结构域与由靶细胞表达的表面抗原(例如，靶细胞抗原)之间的相互作用将靶细胞(例如，肿瘤细胞)带至效应细胞附近。在一些实施方案中，靶细胞抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)，并且仅由肿瘤细胞表达。在一些实施方案中，靶细胞抗原是肿瘤相关抗原(TAA)，并且由肿瘤细胞和一种或多种类型的正常细胞或非肿瘤细胞表达。在一些情况下，TSA也存在于一种或多种类型的正常细胞或非肿瘤细胞中，但主要由肿瘤细胞表达。在一些情况下，肿瘤抗原(例如，TSA或TAA)存在于一种癌症类型中。在一些情况下，肿瘤抗原存在于多种癌症类型中。在一个实施方案中，肿瘤抗原在血癌细胞上表达。在另一个实施方案中，肿瘤抗原在实体瘤细胞上表达。在一些实施方案中，实体瘤是成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌、除非小细胞肺癌以外的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾脏癌症、皮肤癌、除成胶质细胞瘤以外的脑癌、肾癌、甲状腺癌等。在更具体的实施方案中，肿瘤抗原由个体中的肿瘤细胞表达。
示例性肿瘤抗原(例如，TSA或TAA)包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、CD10(也称为脑啡肽酶、膜金属内肽酶(MME)、中性内肽酶(NEP)或常见急性淋巴细胞性白血病抗原(CALLA))、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、ras、p53、v-raf鼠肉瘤病毒致癌基因同源物Bl(BRAF)、钙结合酪氨酸-(Y)-磷酸化调控(CABYR)、富含半胱氨酸的分泌蛋白3(CRISP3)、CSAG家族成员2(CSAG2)、癌/睾丸抗原2(CTAG2)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、铁蛋白、重多肽1；睾丸特异性表达(FTHL17)；G抗原1(GAGE1)、乳酸脱氢酶C(LDHC)、黑素瘤抗原家族A(MAGEA)1、MAGEA3、MAGEA4、(黑素瘤抗原家族B，6)MAGEB6、有丝分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MHC I类多肽相关序列A(MICA)、粘蛋白(MUC)1、细胞表面相关(MUC1)、MUC16、NLR家族、含热蛋白结构域的蛋白4(NLRP4)、纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)、PDZ结合激酶(PB)、黑素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、性别决定区Y-盒(SOX)-2、SOX10、SOX11、与细胞核相关的精子蛋白X-连锁家族成员Al(SPANXA1)、滑膜肉瘤、X(SSX)断裂点2(SSX2)、SSX4、SSX5、睾丸特异性10(TSGA10)、睾丸特异性丝氨酸激酶6(TSSK6)、tubby样蛋白(TULP2)、X抗原家族成员2(XAGE2)、锌指蛋白165(ZNF165)、黑素瘤缺乏因子2(AIM2)、BMI1多梳环指癌基因(BMI1)、环氧合酶-2(COX-2)、酪氨酸相关蛋白(TRP)-1、TRP-2、糖蛋白100(GP100)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、zeste增强子同源物2(EZH2)、人LI细胞粘附分子(LICAM)、Livin、多重耐药蛋白3(MRP-3)、巢蛋白、少突胶质细胞转录因子(OLIG2)、由T细胞识别的抗原(ART)-1、ART4、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原(SART)-1、SART2、SART3、B-细胞周期蛋白、β-连环蛋白、神经胶质瘤相关致癌基因同源物1(Glil)、小窝蛋白-1(Cav-1)、组织蛋白酶B、分化簇(CD)-74、上皮钙依赖性粘附(E-钙粘蛋白)、EPH受体A2(EphA2)、EphA2/上皮激酶(EphA2/Eck)、fos相关抗原1(Fra-l/Fosl 1)、神经节苷脂/GD2、GD3、乙酰葡糖胺基转移酶-V(GnT-V，β1，6-N)、人表皮生长因子受体2(Her2/Neu)、抗体Ki67(Ki67)的核增殖相关抗原、人Ku异二聚体蛋白亚基(u70/80)、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、由T细胞识别的黑素瘤抗原(MART-1)、普洛斯彼罗同源框蛋白1(PROXl)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、存活蛋白、尿激酶型纤溶酶原活化剂受体(UPAR)、维尔姆斯氏肿瘤蛋白1(WT-1)、叶酸受体a、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CSPG4、EGP2、EGP40、EpCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、HLA-AI、HLA-A2、IL-1Rα、KDR、λ、Lewis-Y、MCSP、间皮素、NCAM、NKG2D配体、PSC1、PSMA、ROR1、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA、VEGF、VEGF受体、P-糖蛋白、促红细胞生成素(EPO)、钙粘蛋白、CD4、CD8、CD45、CD117(c-kit)、CD133、HLA-A、HLA-B、HLA-C、趋化因子受体5(CCR5)、干细胞标志物ABCG2转运蛋白、免疫球蛋白、整联蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、捕获树突状细胞特异性细胞间粘附分子3的非整联蛋白(DC-SIGN)、甲状腺球蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌原性分化促进因子-1(MyoD-1)、Leu-7(CD57)、LeuM-1、由单克隆抗体Ki-67(Ki-67)定义的细胞增殖相关的人核抗原、病毒包膜蛋白、HIV gp120和转铁蛋白受体。其他示例性肿瘤抗原是存在于肿瘤的胞外基质内的抗原，如纤连蛋白的癌胚变体、腱生蛋白、或肿瘤的坏死区。
表2：示例性靶细胞抗原
在某些实施方案中，衔接分子的抗原识别结构域特异性地结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在某些实施方案中，抗原识别结构域包含抗体或其抗体片段或抗原结合片段或部分，例如像对TAA或TSA具有特异性的单克隆抗体、Fv、scFv、Fab、微型抗体或双抗体。在某些实施方案中，衔接分子的抗原识别结构域是对TAA或TSA具有特异性的scFv。在一个具体实施方案中，TAA或TSA在癌细胞上表达。在一个实施方案中，TAA或TSA在血癌细胞上表达。在另一个实施方案中，TAA或TSA在实体瘤的细胞上表达。在更具体的实施方案中，实体瘤是成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌、除非小细胞肺癌以外的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾脏癌症、皮肤癌、除成胶质细胞瘤以外的脑癌、肾癌、甲状腺癌等。在更具体的实施方案中，TAA或TSA由个体中的肿瘤细胞表达。在一些实施方案中，衔接分子的抗原识别结构域对表2中所示的一种或多种靶细胞抗原具有特异性。
EphA2
在一些实施方案中，EphA2被称为EPH受体A2(肝配蛋白A型受体2；EPHA2；ARCC2；CTPA；CTPP1；或ECK)，其是人中由蛋白质-酪氨酸激酶家族的肝配蛋白受体亚家族中的EPHA2基因编码的蛋白质。这种亚家族中的受体通常包含单个激酶结构域和包含富含Cys的结构域和2个纤连蛋白III型重复的细胞外区域；本公开的抗体的实施方案靶向这些结构域中的任一个。示例性人EphA2核酸序列在登录号NM_004431中，并且示例性人EphA2多肽序列在登录号NP_004422中，两者的序列均以引用的方式整体并入本文。示例性人EphA2核酸序列在登录号NM_004448.2中，并且示例性人EphA2多肽序列在登录号NP_004439中，两者的序列均以引用的方式整体并入本文。
Eph家族(酪氨酸激酶受体家族中最大的一族)包含EphA(EphA1-10)或EphB(EphB1-6)受体亚类，所述受体根据其序列同源性及其对其配体肝配蛋白(Eph受体相互作用蛋白)的结合亲和力进行分类。人EphA2基因位于染色体1上，编码表观分子量为130kDa的976个氨基酸的受体酪氨酸激酶，与小鼠EphA2具有90％氨基酸序列同源性。Eph家族含有细胞外保守的N-末端配体结合结构域，接着是具有表皮生长因子样基序和两个纤连蛋白III型重复的富含半胱氨酸的结构域。细胞外基序之后是跨膜区和细胞质区，其涵盖近膜区、酪氨酸激酶结构域、无菌α基序(SAM)和突触后结构域(圆盘大和封闭小带蛋白(PDZ)结构域-结合基序)。EphA2显示与其他Eph受体的25％-35％序列同源性，并且酪氨酸残基在近膜和激酶结构域内是保守的。
在皮肤、骨髓、胸腺、子宫、睾丸、前列腺、膀胱、肾、小肠、结肠、脾脏、肝脏、肺和脑中观察到EphA2 mRNA表达。结肠、皮肤、肾脏和肺中的EphA2表达相对于骨髓超过10倍。EphA2也在外胚层细胞的原肠胚形成和发育中后脑中的早期胚胎发生过程中表达。在皮肤中，EphA2存在于表皮和毛囊的角质形成细胞中，但不存在于真皮细胞(成纤维细胞、血管细胞和炎性细胞)中。EphA2也在青春期雌性小鼠的增殖性乳腺中表达，并且在发情周期中差异表达。除了在胚胎和正常成人组织中表达外，EphA2还在若干癌症中过表达，所述癌症如乳腺癌、胃癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、前列腺癌、食道癌、肾癌、结肠癌和外阴癌。特别地，在恶性癌症来源的细胞系和晚期癌症形式中检测到高水平的EphA2。鉴于许多不同类型癌症的临床前模型和临床标本中的EphA2过表达，EphA2表达水平的增加在癌症结果的预测和癌症临床管理中都具有信息性。与癌细胞相比，EphA2在正常细胞中的差异表达也表明其作为治疗靶标的重要性。
HER2
在一些实施方案中，HER2被称为人表皮生长因子受体2(Neu、ErbB-2、CD340或pi85)，其是人中由表皮生长因子受体(EFR/ErbB)家族中的ERBB2基因编码的蛋白质。HER2含有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和与多种信号传导分子相互作用的细胞内结构域。HER2是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的成员。受体的二聚化导致受体的细胞质结构域内的酪氨酸残基的自身磷酸化，并起始多种信号传导途径，从而导致细胞增殖和肿瘤发生。HER2的扩增或过表达在大约15％-30％的乳腺癌和10％-30％的胃/胃食管癌中发生，并且充当预后和预测生物标志物。HER2过表达也见于其他癌症，如卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌和头颈癌中。HER2在15％-30％的浸润性乳腺癌中过表达，其具有预后和预测意义。在胃癌研究中，使用IHC测定的HER2蛋白的过表达在23％中发现并且使用FISH在27％的200个切除的肿瘤中确定基因扩增。HER2过表达与胃癌的较差结果直接相关。在260例胃癌的研究中，HER2过表达是独立的阴性预后因子，并且HER2染色强度与肿瘤大小、浆膜侵袭和淋巴结转移相关。其他研究也证实了HER2过表达在胃癌中的不利影响。HER2过表达据报道在0％-83％的食道癌中，与鳞状细胞癌(0％-56％)相比，腺癌中阳性率(10％-83％)的趋势更高。在20％-30％的卵巢癌患者中观察到HER2的过表达。在子宫内膜浆液性癌中，报告的HER2过表达率在14％与80％之间的范围内，其中HER2扩增(通过荧光原位杂交[FISH])在21％至47％的范围内。本公开的抗体的实施方案靶向细胞外配体结合结构域。
双唾液酸神经节苷脂GD2
双唾液酸神经节苷脂GD2是主要在细胞表面上表达的含唾液酸的鞘糖脂。这种碳水化合物抗原的功能尚不完全清楚；然而，它被认为在肿瘤细胞与细胞外基质蛋白的附着中起重要作用。正常胎儿和成人组织中的GD2表达主要限于中枢神经系统、外周神经和皮肤黑素细胞，尽管已经在一些正常组织的基质组分和脾脏的白髓中描述了GD2表达。在恶性细胞中，GD2在成神经细胞瘤和大多数黑素瘤中均匀表达，并且在各种其他肿瘤(包括骨和软组织肉瘤、小细胞肺癌和脑肿瘤)以可变程度表达。GD2存在并集中在细胞表面上，其中神经酰胺部分的两个烃链嵌入质膜中，并且寡糖位于细胞外表面上，其中它们呈现细胞外分子或相邻细胞表面的识别点。由于相对肿瘤选择性表达与其在细胞表面上的存在相结合，GD2是肿瘤特异性抗体疗法的有吸引力的靶标。本公开的抗体的实施方案靶向细胞外结构域。
治疗性分子
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码一种或多种治疗性分子的一个或多个另外的核酸序列。如本文所用，“治疗性分子”是指增强本文所述的溶瘤病毒的治疗功效的分子。通常，本文描述的治疗性分子是蛋白质、核酸或其组合。示例性治疗性分子包括细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段、蛋白酶、RNA多核苷酸和DNA多核苷酸。
在一些实施方案中，治疗性分子能够通过刺激或活化细胞免疫应答来增加或增强本文所述的溶瘤病毒的治疗功效。在一些实施方案中，治疗性分子能够通过拮抗抑制性或调控性免疫应答来增加或增强本文所述的溶瘤病毒的治疗功效。在一些实施方案中，抑制性免疫应答的减少发生在肿瘤微环境中。在一些情况下，通过治疗性分子减少抑制性免疫应答增强了本文所述的假型化溶瘤病毒的溶瘤作用。在一些实施方案中，治疗性分子进一步降低用本文所述的假型化溶瘤病毒治疗的受试者中的免疫调控性T细胞活性。在一些实施方案中，治疗性分子在核酸水平或蛋白质水平上调节或损害蛋白质的产生水平，或者破坏蛋白质功能。
在一些实施方案中，编码衔接分子的核酸序列和编码一种或多种治疗性分子的核酸序列包含在同一载体内。在一些实施方案中，编码衔接分子的核酸序列和编码一种或多种治疗性分子的核酸序列包含在不同载体内。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些情况下，治疗性分子包含多肽或核酸聚合物。在一些实施方案中，将另外的核酸序列插入病毒载体中，其允许治疗性分子的更高表达水平和产生。
在一些实施方案中，治疗性分子是多肽。在一些情况下，多肽是免疫调节剂多肽。在一些情况下，免疫调节剂多肽是细胞因子、共刺激结构域、抑制T细胞活化的负调控分子的结构域(例如，免疫检查点抑制剂)或其组合。
在一些实施方案中，免疫调节剂多肽调节一种或多种细胞类型的活性，所述细胞类型如调控性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、树突细胞和/或T细胞。示例性Treg调节性多肽包括CCR4、Helios、TIGIT、GITR、神经纤毛蛋白、神经突蛋白、CD103、CTLA-4、ICOS和Swap70。示例性MDSC调节性多肽包括TGF-βR1、GM-CSF、INFγ、白细胞介素如IL-β、IL-1F2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-6、IL-6Rα、IL-6/IL-6R复合物、TGF-β1、M-CSF、前列腺素E2/PGE2、前列腺素E合酶2、S100A8和VEGF。示例性树突细胞定向调节多肽包括GM-CSF和/或IL-13。示例性T细胞定向调节多肽包括IL-12、OX-40、GITR、CD28或IL-28，或激动包含IL-12、OX-40、GITR、CD28或IL-28的途径的抗体。
在其他实施放那中，治疗性多肽调节纤维化间质。示例性纤维化间质多肽包括成纤维细胞活化蛋白-α(FAP)。在一些实施方案中，治疗性多肽是蛋白酶。在特定实施方案中，蛋白酶能够改变细胞外基质，特别是肿瘤微环境内的细胞外基质。示例性蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)如MMP9，胶原酶和弹性蛋白酶。
作为治疗性分子的细胞因子
在一些情况下，免疫调节剂多肽是细胞因子。细胞因子是参与细胞信号传导的约5-20kDa之间的一类小蛋白质，并且包括趋化因子、干扰素(INF)、白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等。趋化因子作为化学引诱物起到引导细胞迁移的作用，并切分为四个亚家族：CXC、CC、CX3C和XC。示例性趋化因子包括来自以下亚家族的趋化因子：CC亚家族，如CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28；CXC亚家族，如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；XC亚家族，如XCL1和XCL2；以及CX3C亚家族，如CX3CL1。
干扰素(IFN)包括I型IFN(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω)、II型IFN(例如IFN-γ)和III型IFN。在一些实施方案中，IFN-α进一步分为约13种亚型，包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。
白细胞介素是一类广泛的细胞因子，其可促进免疫细胞(包括T细胞和B细胞)以及其他造血细胞的发育和分化。示例性白细胞介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35和IL-36。
肿瘤坏死因子(TNF)是一组调节细胞凋亡的细胞因子。在一些情况下，TNF家族中存在约19个成员，包括但不限于TNFα、淋巴毒素-α(LT-α)、淋巴毒素-β(LT-β)、T细胞抗原gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码细胞因子的另一核酸序列，所述细胞因子选自趋化因子、干扰素、白细胞介素或肿瘤坏死因子。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码趋化因子、干扰素、白细胞介素和/或肿瘤坏死因子的另一核酸序列。
作为治疗性分子的共刺激结构域
在一些实施方案中，免疫调节剂多肽是共刺激结构域。在一些情况下，共刺激结构域增强抗原特异性细胞毒性。在一些情况下，共刺激结构域进一步增强细胞因子产生。在一些实施方案中，共刺激结构域包括CD27、CD28、CD70、CD80、CD83、CD86、CD134(OX-40)、CD134L(OK-40L)、CD137(41BB)、CD137L(41BBL)或CD224。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码共刺激结构域的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码共刺激结构域的另一核酸序列，所述共刺激结构域选自CD27、CD28、CD80、CD83、CD86、CD134、CD134L、CD137、CD137L或CD224。
作为治疗性分子的免疫检查点抑制剂
在一些实施方案中，免疫调节剂多肽是免疫检查点抑制剂多肽，其抑制T细胞活化的负调控分子。免疫检查点抑制剂与免疫检查点分子结合，所述免疫检查点分子是CD4和CD8 T细胞的细胞表面上的一组分子。在一些情况下，这些分子有效地充当“制动器”以下调或抑制抗肿瘤免疫应答。免疫检查点抑制剂是指调节或抑制免疫检查点分子的活性的任何分子。在一些情况下，免疫检查点抑制剂包括抗体、抗体衍生物(例如，Fab片段、scFv、微型抗体、双抗体)、反义寡核苷酸、siRNA、适体或肽。
示例性免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡配体1(PD-L1，也称为B7-H1、CD274)、程序性死亡-1(PD-1)、PD-L2(B7-DC、CD273)、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD16、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、可诱导的T细胞共刺激(ICOS)、KIR、LAIR1、LIGHT、具有胶质结构的巨噬细胞受体(MARCO)、OX-40、磷酯酰丝氨酸(PS)、SLAM、TIGHT、VISTA和VTCN1。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂抑制以下中的一种或多种：PDL1、PD-1、CTLA-4、PD-L2、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、ICOS、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO、OX-40、PS、SLAM、TIGIIT、VISTA和VTCN1。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码免疫检查点抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂降低一种或多种免疫检查点分子的表达或活性。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂减少免疫检查点分子与其配体之间的相互作用(例如，减少PD-1与PDL1之间的相互作用)。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码免疫检查点抑制剂的另一核酸序列，所述免疫检查点抑制剂抑制以下中的一种或多种：PDL1、PD-1、CTLA-4、PD-L2、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、ICOS、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO、OX-40、PS、SLAM、TIGHT、VISTA和VTCN1。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码包含衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和治疗性分子结构域，其中所述治疗性分子结构域是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码包含衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和治疗性分子结构域，其中所述治疗性分子结构域是免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂抑制以下中的一种或多种：PDL1、PD-1、CTLA-4、PD-L2、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、ICOS、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO、OX-40、PS、SLAM、TIGHT、VISTA和VTCN1。
a)PDL1抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PDL1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是针对PDL1的抗体(例如，单克隆抗体或其抗原结合片段，或人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，PDL1的抑制剂降低PDL1的表达或活性。在一些实施方案中，PDL1的抑制剂减少PD-1与PDL1之间的相互作用。PDL1的示例性抑制剂包括抗PDL1抗体、RNAi分子(例如，抗PDL1RNAi)、反义分子(例如，抗PDL1反义RNA)或显性负性蛋白质(例如，显性负性PDL1蛋白)。示例性抗PDL1抗体包括：克隆EH12；MPDL3280A(Genentech，RG7446)；抗小鼠PDL1抗体克隆10F.9G2(BioXcell，Cat#BE0101)；抗PDL1单克隆抗体MDX-1105(来自Bristol-Meyers Squibb的BMS-936559和BMS-935559；MSB0010718C；小鼠抗PDL1克隆29E.2A3；以及AstraZeneca的MEDI4736。
在一些实施方案中，抗PDL1抗体是国际PCT公布号WO 2013/079174；WO 2010/036959；WO 2013/056716；WO 2007/005874；WO 2010/089411；WO 2010/077634；WO 2004/004771；WO 2006/133396；WO 2013/09906；WO 2012/145493；WO 2013/181634；美国专利申请公布号20140294898；或中国专利申请公布号CN 101104640中公开的抗PDL1抗体。
在一些实施方案中，PDL1抑制剂是PDL1表达的核酸抑制剂。在一些实施方案中，PDL1抑制剂是国际PCT公布号WO 2011/127180或WO 2011/000841中公开的抑制剂。在一些实施方案中，PDL1抑制剂是雷帕霉素。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3 scFv)和结合至PDL1的治疗性分子结构域(例如，抗PDL1 scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至PDL1的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码PDL1抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码PDL1抑制剂的另一核酸序列，所述PDL1抑制剂选自EH12、Genentech的MPDL3280A(RG7446)；来自BioXcell的抗小鼠PDL1抗体克隆10F.9G2(Cat#BE0101)；来自Bristol-Meyer’s Squibb的抗PDL1单克隆抗体MDX-1105(BMS-936559)和BMS-935559；MSB0010718C；小鼠抗PDL1克隆29E.2A3；以及AstraZeneca的MEDI4736。
b)PD-L2抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L2的抑制剂。在一些实施方案中，PD-L2的抑制剂是针对PD-L2的抗体(例如，单克隆抗体或片段，或人源化或嵌合抗体或其片段)。在一些实施方案中，PD-L2的抑制剂降低PD-L2的表达或活性。在其他实施方案中，PD-L2的抑制剂降低PD-1与PD-L2之间的相互作用。PD-L2的示例性抑制剂包括抗体(例如，抗PD-L2抗体)、RNAi分子(例如，抗PD-L2 RNAi)、反义分子(例如，抗PD-L2反义RNA)、显性负性蛋白质(例如，显性负性PD-L2蛋白)。
在一些实施方案中，PD-L2抑制剂是GlaxoSmithKline的AMP-224(Amplimmune)。在一些实施方案中，PD-L2抑制剂是rHIgM12B7。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码PD-L2抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码PD-L2抑制剂的另一核酸序列，所述PD-L2抑制剂选自AMP-224(Amplimmune)或rHIgM12B7。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至PDL2的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3scFv)和结合至PD-L2的治疗性分子结构域(例如，抗PDL2 scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
c)PD-1抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD1的抑制剂。在一些实施方案中，PDL1的抑制剂是针对PD-1的抗体(例如，单克隆抗体或片段，或人源化或嵌合抗体或其片段)。针对PD-1的示例性抗体包括：来自BioXcell的抗小鼠PD-1抗体克隆43(Cat#BE0033-2)；来自BioXcell的抗小鼠PD-1抗体克隆RMP1-14(Cat#BE0146)；小鼠抗PD-1抗体克隆EH 12；Merck的MK-3475抗小鼠PD-1抗体(Keytruda、派姆单抗、拉姆布罗力珠单抗)；和AnaptysBio的抗PD-1抗体，称为ANB011；抗体MDX-1106(ONO-4538)；Bristol-Myers Squibb的人IgG4单克隆抗体纳武单抗(BMS-936558、MDX1106)；AstraZeneca的AMP-514和AMP-224；以及匹地利珠单抗(CT-011)，CureTech Ltd。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码PD1抑制剂的另一核酸序列，所述PD1抑制剂选自ANB011；抗体MDX-1 106(ONO-4538)；Bristol-Myers Squibb的人IgG4单克隆抗体纳武单抗(BMS-936558、MDX1106)；AstraZeneca的AMP-514和AMP-224；以及匹地利珠单抗(CT-011)。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码PD-1抑制剂的另一核酸序列，所述PD-1抑制剂选自ANB011；抗体MDX-1 106(ONO-4538)；Bristol-Myers Squibb的人IgG4单克隆抗体纳武单抗(BMS-936558、MDX1106)；AstraZeneca的AMP-514和AMP-224；以及匹地利珠单抗(CT-011)。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码PD-L2抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码PD-L2抑制剂的另一核酸序列，所述PD-L2抑制剂选自AMP-224(Amplimmune)或rHIgM12B7。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至PD1的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3scFv)和结合至PD1的治疗性分子结构域(例如，抗PD1 scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
d)CTLA-4抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，CTLA-4的抑制剂是针对CTLA-4的抗体(例如，单克隆抗体或片段，或人源化或嵌合抗体或其片段)。在一个实施方案中，抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4与在抗原呈递细胞上表达的CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)的结合。示例性针对CTLA-4的抗体包括伊匹单抗(还称为MDX-010、BMS-734016和MDX-101，Bristol Meyers Squibb)；来自Millipore的抗CTLA4抗体克隆9H10；曲美木单抗(CP-675、206、替西木单抗，Pfizer)；以及来自Abcam的抗CTLA4抗体克隆BNI3。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是在国际PCT公布号WO 2001/014424；WO 2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO 2006/09649；WO 2005/092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO 2006/12168；WO 1997/020574；美国专利申请公布号2005/0201994；或欧洲专利申请公布号EP1212422中任一者中公开的抗CTLA-4抗体。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097；5,855,887；5,977,318；6,051,227；6,682,736；6,984,720；7,109,003；7,132,281；国际PCT公布号WO 01/14424和WO 00/37504；以及美国专利申请公布号2002/0039581和2002/086014中。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是在国际PCT公布号WO 1998/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(17)：10067-10071(1998)；Camacho等人，J.Clin.Oncol.，22(145)：摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人，Cancer Res.，58：5301-5304(1998)中任一者中公开的抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是如在国际PCT公布号WO 1996/040915中公开的CTLA-4配体。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是CTLA-4表达的核酸抑制剂，如RNAi分子。在一些实施方案中，抗CTLA4 RNAi分子采取国际PCT公布号WO 1999/032619和WO 2001/029058；美国专利申请公布号2003/0051263、2003/0055020、2003/0056235、2004/265839、2005/0100913、2006/0024798、2008/0050342、2008/0081373、2008/0248576和2008/055443；和/或美国专利号6,506,559；7,282,564；7,538,095；和7,560,438中任一者中描述的那些的形式。在一些情况下，抗CTLA4 RNAi分子是双链RNAi分子，如在欧洲专利号EP 1309726中公开的那些。在一些情况下，抗CTLA4 RNAi分子是双链RNAi分子，如在美国专利号7,056,704和7,078,196中描述的那些。在一些实施方案中，CTLA4抑制剂是适体，如在国际PCT公布号WO2004/081021中描述的那些，如Del 60或M9-14 del 55。另外，在一些实施方案中，本发明的抗CTLA4 RNAi分子是RNA分子，如在美国专利号5,898,031、6,107,094、7,432,249和7,432,250以及欧洲申请号EP 0928290中描述的那些。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码CTLA-4抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码CTLA-4抑制剂的另一核酸序列，所述CTLA-4抑制剂选自伊匹单抗(也称为MDX-010、BMS-734016和MDX-101)；来自Millipore的抗CTLA4抗体克隆9H10；Pfizer的曲美木单抗(CP-675、206、替西木单抗)；以及来自Abcam的抗CTLA4抗体克隆BNI3。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至CTLA-4的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3 scFv)和结合至CTLA-4的治疗性分子结构域(例如，抗CTLA-4scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
e)LAG3抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是LAG-3(CD223)的抑制剂。在一些实施方案中，LAG3的抑制剂是针对LAG3的抗体(例如，单克隆抗体或片段，或人源化或嵌合抗体或其片段)。在另外的实施方案中，针对LAG3的抗体阻断LAG3与主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的相互作用。示例性针对LAG3的抗体包括：来自eBioscience的抗Lag-3抗体克隆eBioC9B7W(C9B7W)；来自LifeSpan Biosciences的抗Lag3抗体LS-B2237；来自Immutep的IMP321(ImmuFact)；抗Lag3抗体BMS-986016；以及LAG-3嵌合抗体A9H12。在一些实施方案中，抗LAG3抗体是国际PCT公布号WO 2010/019570；WO 2008/132601；或WO 2004/078928中公开的抗LAG3抗体。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码LAG3抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码LAG3抑制剂的另一核酸序列，所述LAG3抑制剂选自来自eBioscience的抗Lag-3抗体克隆eBioC9B7W(C9B7W)；来自LifeSpan Biosciences的抗Lag3抗体LS-B2237；来自Immutep的IMP321(ImmuFact)；抗Lag3抗体BMS-986016；以及LAG-3嵌合抗体A9H12。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至LAG3的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3scFv)和结合至LAG3的治疗性分子结构域(例如，抗LAG3 scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
f)TIM3抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是TIM3的抑制剂。在一些实施方案中，TIM3的抑制剂是针对TIM3(也称为HAVCR2)的抗体(例如，单克隆抗体或片段，或人源化或嵌合抗体或其片段)。在另外的实施方案中，针对TIM3的抗体阻断TIM3与半乳凝素-9(Gal9)的相互作用。在一些实施方案中，抗TIM3抗体是在国际PCT公布号WO 2013/006490；WO 2011/55607；WO 2011/159877；或WO 2001/17057中公开的抗TIM3抗体。在另一个实施方案中，TIM3抑制剂是在国际PCT公布号WO 2009/052623中公开的TIM3抑制剂。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码TIM3抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码TIM3抑制剂的另一核酸序列，所述TIM3抑制剂如阻断TIM3与半乳凝集素-9(Gal9)的相互作用的针对TIM3的抗体。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至TIM3的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3scFv)和结合至LAG3的治疗性分子结构域(例如，抗TIM3 scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
g)B7-H3抑制剂
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是B7-H3的抑制剂。在一些实施方案中，B7-H3的抑制剂是针对B7-H3的抗体(例如，单克隆抗体或片段，或人源化或嵌合抗体或其片段)。在一些实施方案中，B7-H3的抑制剂是MGA271(MacroGenics)。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和抗原识别结构域；以及编码B7-H3抑制剂的另一核酸序列。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列和编码B7-H3抑制剂如MGA271的另一核酸序列。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含活化结构域和结合至B7-H3的治疗性分子结构域。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒包含编码衔接分子的核酸序列，所述衔接分子包含结合至CD3的活化结构域(例如，抗CD3scFv)和结合至B7-H3的治疗性分子结构域(例如，抗B7-H3 scFv)。在此类实施方案中，所述假型化溶瘤病毒还可包含编码另一种治疗分子的另一核酸序列。
在某些其他实施方案中，所述衔接分子另外包含一个或多个其他结构域，例如，细胞因子、共刺激结构域、抑制T细胞活化的负调控分子的结构域或其组合中的一种或多种。在替代实施方案中，衔接分子是假型化溶瘤病毒内提供的第一多肽，所述假型化溶瘤病毒具有第二多肽，所述第二多肽具有一个或多个其他结构域，例如，细胞因子、共刺激结构域、抑制T细胞活化的负调控分子的结构域或其组合。在一些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽在同一载体(例如，病毒载体)中编码。在一些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽在不同的载体(例如，病毒载体)中编码。在具体实施方案中，细胞因子是IL-15、IL-2和/或IL-7。在其他具体实施方案中，共刺激结构域是CD27、CD80、CD83、CD86、CD134或CD137。在其他具体实施方案中，抑制T细胞活化的负调控分子的结构域是PD-1、PDL1、CTLA4或B7-H4。
作为治疗性分子的抗血管生成因子
在一些实施方案中，治疗性分子是多肽，如抗血管生成因子。血管生成或新血管形成是由已建立的血管网络形成新的微血管。在一些情况下，血管生成过程涉及来自多种细胞类型的通信，所述细胞类型如内皮细胞(EC)和循环内皮祖细胞、周皮细胞、血管平滑肌细胞、间质细胞，包括干细胞和实质细胞。这些通信或相互作用通过分泌因子发生，所述分泌因子如VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)或血管生成素。在一些情况下，抗血管生成因子是破坏以下细胞类型的一种或多种相互作用的多肽：内皮细胞(EC)和循环内皮祖细胞、周皮细胞、血管平滑肌细胞、间质细胞，包括干细胞和实质细胞。在一些情况下，抗血管生成因子是破坏分泌因子的一种或多种相互作用的多肽，所述分泌因子如VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)或血管生成素。
在其他实施方案中，提供了假型化溶瘤病毒，其包含编码治疗性多肽的核酸，所述治疗性多肽调节调控性T细胞。在一些情况下，调控性T细胞维持对自身抗原的耐受性，并且在一些情况下消除自身免疫。在一些情况下，Treg抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。示例性Treg调节性多肽包括CCR4、Helios、TIGIT、GITR、神经纤毛蛋白、神经突蛋白、CD103、CTLA-4、ICOS和Swap70。
在其他实施方案中，提供了假型化溶瘤病毒，其包含编码治疗性多肽的核酸，所述治疗性多肽调节骨髓源性抑制细胞(MDSC)。MDSC是来自骨髓谱系的异质免疫细胞群体(源自骨髓干细胞的一组不同细胞类型)，其中还包括树突细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。在一些情况下，骨髓细胞与T细胞相互作用以调控T细胞的功能。示例性MDSC调节性多肽包括TGF-βR1、GM-CSF、IFN-γ、白细胞介素(例如，IL-β、IL-1F2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-6、IL-6Rα、IL-6/IL-6R复合物、TGF-β1、M-CSF、前列腺素E2/PGE2、前列腺素E合酶2、S100A8和VEGF。
在其他实施方案中，提供了假型化溶瘤病毒，其包含编码治疗性多肽的核酸，所述治疗性多肽调节纤维化间质。在一些实施方案中，响应于炎症发生纤维化，慢性抑或复发性。随着时间推移，炎症的反复发作刺激并伤害组织，从而导致纤维组织的堆积。在一些情况下，如果发展足够的纤维物质，它变成间质纤维化。示例性纤维化间质多肽包括成纤维细胞活化蛋白-α(FAP)。
作为治疗性分子的核酸聚合物
在一些实施方案中，治疗性分子是核酸聚合物。在一些情况下，核酸聚合物是RNA聚合物。在一些情况下，RNA聚合物是序列与微小RNA(miRNA或miR)靶序列互补的反义聚合物。在一些情况下，RNA聚合物是微小RNA聚合物。在一些实施方案中，RNA聚合物包含DNA指导的RNAi(ddRNAi)序列，其能够在体内产生短发夹RNA(shRNA)。
在一些实施方案中，微小RNA聚合物是短的非编码RNA，其在不同的组织和细胞类型中表达并抑制靶基因的表达。例如，miRNA作为加帽和多腺苷酸化的初级转录物(pri-miRNA)的一部分由RNA聚合酶II转录。在一些情况下，初级转录物通过Drosha核糖核酸酶III裂解而产生大约70-nt的茎环前体miRNA(pre-miRNA)，所述前体miRNA通过细胞质Dicer核糖核酸酶进一步裂解而产生成熟miRNA和反义miRNA星形(miRNA*)产物。在一些情况下，成熟miRNA并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，所述RISC通过与miRNA不完美的碱基配对识别靶mRNA，并且在一些情况下导致靶mRNA的翻译抑制或去稳定化。
在一些情况下，失调的微小RNA表达与一种或多种类型的癌症相关。在一些实施方案中，微小RNA被称为oncomiR。在一些情况下，失调的微小RNA表达是升高的表达。在一些情况下，微小RNA的表达水平升高与一种或多种类型的癌症相关。例如，已经在诸如伯基特淋巴瘤或喉鳞状细胞癌(LSCC)的癌症中观察到微小RNA-155(miR-155)的过表达，并且已经在乳腺癌中观察到微小RNA-21(miR-21)的过表达。
在一些实施方案中，具有升高的表达水平的示例性微小RNA包括但不限于miR-10家族(例如，miR-10b)、miR-17、miR-21、miR-106家族(例如，miR-106a)、miR-125家族(例如，miR-125b)、miR-145、miR-146家族(例如，miR-146a、miR-146b)、miR-155、miR-96、miR-182、miR-183、miR-221、miR-222以及miR-1247-5p。
在一些情况下，核酸聚合物是序列与oncomiR互补的反义聚合物。在一些情况下，核酸聚合物是序列与以过表达为特征的oncomiR互补的反义聚合物。在一些情况下，核酸聚合物是序列与微小RNA靶序列互补的反义聚合物。在一些情况下，核酸聚合物是序列与以过表达为特征的微小RNA靶序列互补的反义聚合物。在一些情况下，治疗性分子是序列与微小RNA靶序列互补的反义聚合物。在一些情况下，治疗性分子是序列与以过表达为特征的微小RNA靶序列互补的反义聚合物。在一些情况下，过表达水平是相对于微小RNA的内源性表达水平。
在一些情况下，失调的微小RNA表达是降低的表达。在一些情况下，微小RNA的表达水平降低与一种或多种类型的癌症相关。例如，在人和小鼠转移性乳腺癌细胞系两者中均观察到消减的miR-31水平。
在一些实施方案中，具有降低的表达水平的示例性微小RNA包括但不限于miR-31、miR-34家族(例如，miR34a、miR-34b和miR-34c)、miR-101、miR-126、miR-145、miR-196a和miR-200家族。
在一些情况下，核酸聚合物是oncomiR。在一些情况下，oncomiR等效于内源性oncomiR，其中所述内源性oncomiR的特征在于降低的表达水平。在一些情况下，核酸聚合物是微小RNA聚合物。在一些情况下，治疗性分子是微小RNA聚合物。在一些情况下，微小RNA等效于内源性微小RNA聚合物，其中所述内源性微小RNA的特征在于降低的表达水平。
如上所述，在一些情况下，RNA聚合物包含DNA指导的RNAi(ddRNAi)序列。在一些情况下，将编码shRNA的ddRNAi构建体包装到病毒载体，如本文所述的假型化溶瘤病毒的病毒载体中。在一些情况下在进入靶细胞(例如，肿瘤细胞)后，对病毒基因组进行加工以产生编码的shRNA。所述shRNA然后通过内源性宿主系统加工并进入RNAi途径以调节或沉默所需的基因靶标。在一些情况下，基因靶标是在癌症类型中过表达的基因。在一些情况下，基因靶标是在实体瘤中过表达的基因。在一些情况下，基因靶标是在血液癌症中过表达的基因。在癌症中过表达的示例性基因包括但不限于TP53、人表皮生长因子受体2(HER2)、粘蛋白1-细胞表面相关(MUC1)、人垂体肿瘤转化基因1(hPPTG1)、前列腺癌和乳腺癌过表达的基因1蛋白(PBOV1)等。
在一些情况下，核酸聚合物包含ddRNAi序列。在一些情况下，核酸聚合物包含靶向在癌症中过表达的基因的ddRNAi序列。在一些情况下，治疗性分子包含ddRNAi序列。在一些情况下，治疗性分子包含靶向在癌症中过表达的基因的ddRNAi序列。
示例性衔接分子
在一些实施方案中，本文所述的衔接分子包含双特异性抗体构建体，所述抗体构建体包含活化结构域和抗原识别结构域，其中所述活化结构域与表1中所示的效应细胞表面受体相互作用或结合；并且所述抗原识别结构域与表2中所示的靶细胞抗原相互作用或结合。在一些实施方案中，本文所述的衔接分子包含双特异性抗体构建体，所述抗体构建体包含活化结构域和治疗性分子结构域，其中所述活化结构域与表1中所示的效应细胞表面受体相互作用或结合；并且所述治疗性分子结构域与表2中所示的细胞表面抗原相互作用或结合。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含活化结构域，其中所述活化结构域包含抗CD3 scFv。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段与SEQ ID NO：22的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成；以及重链可变片段，所述重链可变片段由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含活化结构域，其中所述活化结构域包含抗CD3 scFv，其中所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：19的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：21的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：19的核酸序列100％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：21的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：19；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列包含SEQ IDNO：21。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：19组成；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：21组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域包含抗CD19 scFv。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段与SEQ ID NO：18的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成；以及重链可变片段，所述重链可变片段由SEQID NO：18的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域包含抗CD19 scFv，其中所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：15的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：17的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：15的核酸序列100％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：17的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：15；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：17。在一些实施方案中，所述抗CD19 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：15组成；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：17组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含治疗性分子结构域，其中所述治疗性分子结构域包含抗PDL1 scFv。在一些实施方案中，所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段与SEQ ID NO：38的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含SEQ IDNO：38的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成；以及重链可变片段，所述重链可变片段由SEQID NO：38的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含治疗性分子结构域，其中所述治疗性分子结构域包含抗PDL1 scFv，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：35的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：37的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，所述抗PDL1scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：35的核酸序列100％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：37的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：35；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：37。在一些实施方案中，所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：35组成；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：37组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含治疗性分子结构域，其中所述治疗性分子结构域包含SIRP1α多肽片段。在一些实施方案中，所述SIRP1α多肽片段包含与SEQID NO：32的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述SIRP1α多肽片段包含与SEQID NO：32的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述SIRP1α多肽片段包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述SIRP1α多肽片段由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的衔接分子包含治疗性分子结构域，其中所述治疗性分子结构域包含SIRP1α多肽片段，其中所述SIRP1α多肽片段包含与SEQ ID NO：31的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述SIRP1α多肽片段包含与SEQ ID NO：31的核酸序列100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述SIRP 1α多肽片段包含SEQ ID NO：31的核酸序列。在一些实施方案中，所述SIRP1α多肽片段由SEQ ID NO：31的核酸序列组成。
在一些实施方案中，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含结合至CD3的scFv；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含结合至CD19的scFv；在本文中称为CD19-CD3 BiTE或CD19 BiTE。示例性CD19-CD3 BiTE的示意图在图1(SEQ ID NO：44)中示出。在此类实施方案中，所述抗CD3 scFv和抗CD19 scFv通过G4S接头(SEQ ID NO：6)连接在一起。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码CD19-CD3 BiTE，并且第二核酸序列编码治疗性分子如IL-15(图2，SEQID NO：53)、IL-12(图3，SEQ ID NO：54)或CXCL10(图4，SEQ ID NO：55)。在此类实施方案中，所述CD19-CD3 BiTE(例如，SEQ ID NO：44)通过T2A自裂解肽接头(SEQ ID NO：14)连接至治疗性分子，例如IL-15(SEQ ID NO：24)、IL-12 p35(SEQ ID NO：28)、IL-12 p40(SEQ ID NO：26)和/或CXCL10(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方案中，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含结合至CD3的scFv；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域包含结合至CD47的SIRP1α多肽片段(SEQ ID NO：32)；在本文中称为SIRP1α-CD3 BiTE或SIRP1α BiTE。示例性SIRP1α-CD3BiTE的示意图在图5(SIRP1α-CD3(SL)，SEQ ID NO：46)和图6(SIRP1α-CD3(LL)，SEQ ID NO：48)中示出。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv和SIRP1α肽片段通过单个氨基酸接头或“短接头”(SL)(例如，如图5中所示的SIRP1α-CD3(SL))连接在一起。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv和SIRP1α肽片段通过G4S接头或“长接头”(LL)(例如，如图6中所示的SIRP1α-CD3(LL))连接在一起。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码SIRP1α-CD3 BiTE，并且第二核酸序列编码治疗性分子如IL-15(图7，SEQ ID NO：56和图8，SEQ ID NO：57)、IL-12(图9，SEQ ID NO：58和图10，SEQ IDNO：59)或CXCL10(图11，SEQ ID NO：60和图12，SEQ ID NO：61)。在此类实施方案中，所述SIRP1α-CD3 BiTE(例如，SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：48)通过T2A自裂解肽接头(SEQ IDNO：14)连接至治疗性分子，例如IL-15(SEQ ID NO：24)、IL-12 p35(SEQ ID NO：28)、IL-12p40(SEQ ID NO：26)和/或CXCL10(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码SIRP1α-CD3 BiTE，并且第二核酸序列编码治疗性分子如MMP9(图18A，SEQ ID NO：65和图18B，SEQ ID NO：66)。在此类实施方案中，所述SIRP1α-CD3 BiTE(例如SEQ ID NO：65或66)通过T2A自裂解肽接头(SEQ ID NO：14)连接至MMP9多肽(SEQ ID NO：34)。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码SIRP1α-CD3 BiTE，并且第二核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含与IgG1 Fc结构域连接的抗PDL1 scFv(例如，包含IgG1 CH2-CH3-铰链，SEQ ID NO：40)，如图37中所示的SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(SL)构建体(SEQ ID NO：68)或如图38中所示的SIRP1α-CD3-PDL1-Fc(LL)构建体(SEQ ID NO：70)。
在一些实施方案中，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含结合至CD3的scFv；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域包含结合至PDL1的scFv；在本文中称为PDL1-CD3 BiTE或PDL1 BiTE。示例性PDL1-CD3 BiTE在图13(SEQ ID NO：50)中示出。在一些实施方案中，所述抗CD3 scFv和抗PDL1 scFv通过G4S接头(SEQ ID NO：6)连接在一起。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码PDL1-CD3 BiTE，并且第二核酸序列编码治疗性分子如IL-15(图14，SEQ IDNO：62)、IL-12(图15，SEQ ID NO：63)或CXCL10(图16，SEQ ID NO：64)。在此类实施方案中，所述SIRP1α-CD3 BiTE(例如，SEQ ID NO：50)通过T2A自裂解肽接头(SEQ ID NO：14)连接至治疗性分子，例如IL-15(SEQ ID NO：24)、IL-12 p35(SEQ ID NO：28)、IL-12 p40(SEQ IDNO：26)和/或CXCL10(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方案中，所述衔接分子是三联衔接分子并且包含活化结构域，所述活化结构域包含结合至CD3的scFv；治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域包含结合至PDL1的scFv；以及第三结构域，所述第三结构域包含IgG1 Fc结构域(例如，包含IgG1 CH2-CH3-铰链，SEQ ID NO：40)并且能够结合至一个或多个FcγR；在本文中称为PDL1-CD3-Fc三联T细胞衔接器、或TiTE、或PDL1 TiTE。示例性PDL1-CD3-Fc TiTE的示意图在图17(SEQ ID NO：52)中示出。
示例性衔接分子和治疗性分子的氨基酸序列在表3中示出。
表3：示例性衔接分子和治疗性分子的氨基酸序列
在一些实施方案中，本发明提供了编码衔接分子和/或治疗性分子的重组核酸序列。示例性重组核酸序列在表4中示出。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，其中所述治疗性分子是IL-15。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-15治疗性分子，所述治疗性分子包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码与SEQ ID NO：24的氨基酸序列100％相同的IL-15治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的IL-15治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的IL-15治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-15治疗性分子并且包含与SEQ ID NO：23的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-15治疗性分子并且包含SEQ ID NO：23的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-15治疗性分子并且由SEQ ID NO：23的核酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，其中所述治疗性分子是IL-12(即，IL-12 p35和/或IL-12 p40)。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子，所述治疗性分子包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码与SEQ ID NO：26的氨基酸序列100％相同的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且包含与SEQ ID NO：25的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且包含SEQ ID NO：25的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且由SEQ ID NO：25的核酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子，所述治疗性分子包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码与SEQ ID NO：28的氨基酸序列100％相同的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且包含与SEQ ID NO：27的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且包含SEQ ID NO：27的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且由SEQ ID NO：27的核酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含SEQ ID NO：26和28的氨基酸序列的IL-12治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码IL-12治疗性分子并且包含SEQ ID NO：25和27的核酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，其中所述治疗性分子是CXCL10。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码CXCL10治疗性分子，所述治疗性分子包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码与SEQ ID NO：30的氨基酸序列100％相同的CXCL10治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CXCL10治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的CXCL10治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码CXCL10治疗性分子并且包含与SEQ IDNO：29的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码CXCL10治疗性分子并且包含SEQ ID NO：29的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码CXCL10治疗性分子并且由SEQ ID NO：29的核酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，其中所述治疗性分子是MMP9。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码MMP9治疗性分子，所述治疗性分子包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码与SEQ ID NO：34的氨基酸序列100％相同的MMP9治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的MMP9治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成的MMP9治疗性分子。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码MMP9治疗性分子并且包含与SEQ ID NO：33的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码MMP9治疗性分子并且包含SEQID NO：33的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码MMP9治疗性分子并且由SEQ ID NO：33的核酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，其中所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1 scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段与SEQ ID NO：38的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1 scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列；以及重链可变片段，所述重链可变片段包含SEQ IDNO：38的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1 scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段，所述轻链可变片段由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成；以及重链可变片段，所述重链可变片段由SEQ ID NO：38的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1 scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQ IDNO：35的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：37的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1 scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列与SEQID NO：35的核酸序列100％相同；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列与SEQ ID NO：37的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1 scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：35；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列包含SEQ ID NO：37。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码包含抗PDL1scFv的治疗性分子，其中所述抗PDL1 scFv包含轻链可变片段核酸序列，所述轻链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：35组成；以及重链可变片段核酸序列，所述重链可变片段核酸序列由SEQ ID NO：37组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域包含与SEQID NO：40的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域与SEQ ID NO：40的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域由SEQ ID NO：40的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域核酸序列与SEQ IDNO：39的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1 scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域核酸序列包含SEQ ID NO：39。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码治疗性分子，所述治疗性分子包含抗PDL1scFv和IgG1 Fc结构域，其中所述IgG1 Fc结构域核酸序列包含SEQ ID NO：39。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列包含选自SEQ ID NO：43、45、47、49、51、67和69的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列与选自SEQ ID NO：43、45、47、49、51、67和69的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列与选自SEQ ID NO：43、45、47、49、51、67和69的核酸序列100％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列由选自SEQ ID NO：43、45、47、49、51、67和69的核酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码衔接分子和/或治疗性分子，所述衔接分子和/或治疗性分子与选自SEQ ID NO：44、46、48、50和52的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码衔接分子蛋白，所述衔接分子蛋白与选自SEQ ID NO：44、46、48、50和52的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码衔接分子蛋白，所述衔接分子蛋白包含选自SEQ ID NO：44、46、48、50和52的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的核酸序列编码衔接分子蛋白，所述衔接分子蛋白由选自SEQ IDNO：44、46、48、50和52的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文提供的重组核酸序列编码衔接分子和治疗性分子。在一些实施方案中，所述重组核酸序列编码包含衔接分子和治疗性分子的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：53-66、68和70的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，所述核酸序列编码包含衔接分子和治疗性分子的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：53-66、68和70的氨基酸序列100％相同。在一些实施方案中，所述核酸序列编码包含衔接分子和治疗性分子的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列由选自SEQ ID NO：53-66、68和70的氨基酸序列组成。
表4：示例性衔接分子的核酸序列
衔接分子的另外示例性实施方案包括衔接分子，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含抗CD3 scFv(例如，包含SEQ ID NO：20和22)；以及治疗性结构域，所述治疗性结构域包含结合至细胞表面蛋白的scFv，所述细胞表面蛋白如CTLA4、TIM3、LAG3、BTLA、KIR、TIGIT、OX40或GITR。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码衔接分子，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含抗CD3 scFv(例如，包含SEQ ID NO：20和22)；以及治疗性结构域，所述治疗性结构域包含结合至细胞表面蛋白的scFv，所述细胞表面蛋白如CTLA4、TIM3、LAG3、BTLA、KIR、TIGIT、OX40、CD47或GITR；并且第二核酸序列编码治疗性分子，如IL-15(SEQ ID NO：24)、IL-12(SEQ ID NO：26和28)、CXCL10(SEQ ID NO：30)或MMP9(SEQ ID NO：34)。在此类实施方案中，衔接分子通过T2A自裂解肽接头(SEQ ID NO：14)连接至治疗性分子多肽。
衔接分子的另外示例性实施方案包括衔接分子，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含抗CD3 scFv(例如，包含SEQ ID NO：20和22)；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含结合至SLAMF7(也称为CD319)或CD27(膜结合形式的CD27或可溶形式的CD27)的scFv。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒包含双顺反子或多顺反子核酸序列，其中第一核酸序列编码衔接分子，所述衔接分子包含活化结构域，所述活化结构域包含抗CD3 scFv(例如，包含SEQ ID NO：20和22)；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含结合至靶细胞抗原如SLAMF7或CD27的scFv；并且第二核酸序列编码治疗性分子，如IL-15(SEQ ID NO：24)、IL-12(SEQ ID NO：26和28)、CXCL10(SEQ ID NO：30)或MMP9(SEQ IDNO：34)。在此类实施方案中，衔接分子通过T2A自裂解肽接头(SEQ ID NO：14)连接至治疗性分子多肽。
适合于本文所述的衔接分子靶向的另外的细胞表面蛋白在以下表5中示出。适合用作治疗性分子的另外蛋白质在以下表6中示出。
表5：适于通过衔接分子靶向的细胞表面蛋白
表6：适合用作治疗性分子的蛋白质
分子 NCBI参考序列(RefSeq)标识符
人TNFα NP_000585.2
人CX3CL1 NP_002987.1
人CCR4 NP_005499.1
人CSF-1 NP_000748.3
人TGFβ NP_000651.3
人IL-7 NP_000871.1
人GM-CSF NP_000749.2
溶瘤病毒的治疗用途
在一些实施方案中，本发明提供了用于预防、治疗和/或改善癌性疾病的组合物和方法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向有需要的受试者施用有效量(例如，治疗有效量)的本文所述的溶瘤病毒，其中所述病毒表达衔接分子或衔接分子和治疗性分子。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于所有癌症分期和类型，包括用于最小残留病、早期实体瘤、晚期实体瘤和/或转移性实体瘤。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗与许多不同癌症相关的多种实体瘤。术语“实体瘤”是指除了在淋巴癌中观察到的转移以外的复发性或难治性肿瘤以及转移(无论位于何处)。
示例性实体瘤包括但不限于脑和其他中枢神经系统肿瘤(例如脑膜、脑、脊髓、脑神经和中枢神经系统的其他部位的肿瘤，例如成胶质细胞瘤或髓质母细胞瘤)；头和/或颈癌；乳腺肿瘤；循环系统肿瘤(例如心脏、纵隔膜和胸膜以及其他胸内器官、血管肿瘤和肿瘤相关血管组织)；排泄系统肿瘤(例如肾、肾盂、输尿管、膀胱、其他和未指明的泌尿器官)；胃肠道肿瘤(例如食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、直肠乙状结肠连接部、直肠、肛门和肛管)，涉及肝和肝内胆管、胆囊、胆道的其他和未指明部位、胰腺、其他和消化器官的肿瘤)；头颈部肿瘤；口腔(唇、舌、牙龈、口底、腭、和口腔的其他部位、腮腺、和唾液腺的其他部位、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窦、下咽以及唇、口腔和咽的其他部位)肿瘤；生殖系统肿瘤(例如外阴、阴道、子宫颈、子宫体、子宫、卵巢和与女性生殖器官相关的其他部位、胎盘、阴茎、前列腺、睾丸和与男性生殖器官相关的其他部位)；呼吸道肿瘤(例如鼻腔和中耳、副窦、喉、气管、支气管和肺，例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)；骨骼系统肿瘤(例如骨和四肢关节软骨、骨关节软骨和其他部位)；皮肤肿瘤(例如皮肤恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波济氏肉瘤)；以及涉及其他组织的肿瘤，包括周围神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼和附件、甲状腺、肾上腺以及其他内分泌腺和相关结构、淋巴结的继发性和未指明的恶性肿瘤、呼吸系统和消化系统的继发性恶性肿瘤以及其他部位的继发性恶性肿瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤或其他实体瘤。
在特定实施方案中，实体瘤是脑肿瘤。在一些情况下，脑肿瘤包括但不限于神经胶质瘤，特别是室管膜瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗血液癌症。术语“血液癌症”在本文中是指血液系统的癌症，并且包括复发性或难治性血液癌症以及转移性血液癌症(无论位于何处)。在一些情况下，血液癌症是T细胞恶性肿瘤或B细胞恶性肿瘤。示例性T细胞恶性肿瘤包括但不限于非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、母细胞性NK细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾(hematosplenic)γ-δ T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、鼻NK/T细胞淋巴瘤或治疗相关的T细胞淋巴瘤。
示例性B细胞恶性肿瘤包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、高风险CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋细胞性白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、非伯基特高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情况下，血液癌症是复发性或难治性血液癌症。在一些情况下，血液癌症是转移性血液癌症。
在一些实施方案中，将溶瘤病毒工程化以在病毒感染的细胞死亡之前，例如在感染1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时内或在感染后2、3、4、5或6天内产生高水平的衔接分子和/或治疗性多肽表达。可通过本领域已知的方法测定衔接分子和/或治疗性多肽的表达，所述方法包括蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀或电泳等。通常，关于治疗性分子的“高水平表达”是指表达水平高于未被溶瘤病毒感染的细胞中相应多肽的基础表达水平。
组合物和施用途径
在一些实施方案中，将治疗有效量的溶瘤病毒或其组合物施用至受试者。根据本公开，术语“药物组合物”涉及用于施用至个体的组合物。本文所述的组合物的施用可以是局部的或全身的，并且可通过不同的方式进行，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部或皮内施用。在一些实施方案中，本文公开的组合物通过本领域已知的任何方式施用。例如，本文所述的组合物可静脉内、肿瘤内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌肉内、鞘内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、经由导管、经由灌洗、以乳膏形式或以脂质组合物形式施用至受试者。在特定实施方案中，经由输注或注射将组合物施用至个体。在一些实施方案中，施用是肠胃外，例如，静脉内。在一些实施方案中，将溶瘤病毒或其组合物直接施用至靶部位，例如，通过生物射弹递送至内部或外部靶部位或通过导管递送至动脉中的部位。在特定实施方案中，皮下或静脉内施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，静脉内或动脉内施用本文所述的溶瘤病毒或其组合物。
在一个优选的实施方案中，本文所述的组合物被配制用于特定施用途径，用于肠胃外、透皮、腔内、动脉内、鞘内、静脉内施用或用于直接注射到癌症中。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。“药学上或药理学上可接受的”在本文是指视情况而定当向动物或人施用时不产生副作用、过敏或其他不利反应的分子实体和组合物。在一些实施方案中，本公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、缓冲剂、稳定制剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物通过熟知的常规方法配制。在一些实施方案中，补充活性成分也掺入组合物中。为了人施用，本文所述的制剂满足由FDA生物办公室标准所要求的无菌标准、热原性标准以及一般安全标准和纯度标准。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含载体，如含有例如以下各项的溶剂或分散介质：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。适当流动性例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持。对微生物作用的防止通过本领域中已知的各种抗细菌和抗真菌剂来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。在一些实施方案中，可注射组合物的延长吸收通过在组合物中使用延迟吸收剂来实现，所述延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒被配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，所述盐由例如像盐酸或磷酸的无机酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。由游离羧基形成的盐衍生自无机碱(例如像钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物)和有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包含芝蔴油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在一些情况下，所述形式是无菌的并且是流体。在一些情况下，它在制造条件和某些储存参数(例如冷藏和冷冻)下是稳定的并且防止微生物如细菌和真菌的污染作用。本文的一些实施方案的水性组合物包括溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中的有效量的病毒、核酸、治疗性蛋白质、肽、构建体、刺激物、抑制剂等。还考虑了表达任何前述物质的载体的水性组合物。
在某些实施方案中，对生物材料进行充分透析以除去不需要的小分子量分子和/或冻干，以便在适当时更容易配制成所需媒介物。在一些实施方案中，活性化合物或构建体被配制用于肠胃外施用，例如被配制用于经由静脉内、肌肉内、皮下、病灶内、鼻内或腹膜内途径注射。使用用于受试者的疫苗接种或增强的任何途径。根据本公开，含有活性组分或成分的水性组合物的制备是本领域技术人员已知的。通常，此类组合物被制备为注射剂，呈液体溶液或悬浮液形式；还制备了适用于在注射前添加液体时制备溶液或悬浮液的固体形式；并且还将制剂进行乳化。
在一些情况下，溶瘤病毒分散在药学上可接受的注射用制剂中。在一些情况下，无菌可注射溶液是通过将在适当溶剂中的所需量的活性化合物或构建体与以上列举的任何其他成分(根据需要)合并，随后进行过滤灭菌来制备。
在配制时，本文所述的组合物以与待治疗的疾病和剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效的量施用。所述制剂易于以多种剂型，如上述可注射溶液类型施用，但也可以是缓释胶囊或微粒和微球等。
关于以水溶液形式肠胃外施用，例如，所述溶液在需要时应适当缓冲并且液体稀释剂首先使得用充足生理盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肿瘤内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这种背景下，所使用的无菌水性介质将为本领域技术人员根据本公开内容所已知的。例如，将一个剂量溶解在1mL的等渗NaCl溶液中，并添加至1000mL的皮下灌注液或在建议的输注部位注射。
除了被配制用于肠胃外施用诸如静脉内或、肿瘤内、皮内或肌肉内注射的化合物之外，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其他固体；脂质体制剂；定时释放胶囊；生物可降解以及目前使用的任何其他形式。
在一些实施方案中，将病毒包封以抑制免疫识别并置于肿瘤部位。
在一些情况下，用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也存在于例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等中。此外，本公开的药物组合物可包含优选地人来源的蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白。设想本公开的药物组合物除蛋白质性双特异性单链抗体构建体或核酸分子或编码它们的载体(如本公开中所述)外，还可包含其他生物活性剂，这取决于所述药物组合物预期用途。
在一些实施方案中，连续释放载体的肿瘤浸润性病毒产生细胞被配制用于直接植入肿瘤中，以增加病毒溶瘤作用和治疗性基因的转移效率。
鼻内制剂是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号4,476,116；5,116,817；和6,391,452中。根据本领域熟知的这些和其他技术制备的制剂被制备为盐水溶液，采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。参见例如，Ansel，H.C.等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第六版(1995)。优选地，这些组合物和制剂与合适的无毒的药学上可接受的成分一起制备。这些成分是制备鼻用剂型的那些技术人员已知的，并且这些中的一些见于Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，2005(本领域的标准参考文献)中。合适载体的选择在很大程度上取决于所需鼻用剂型(例如溶液、悬浮液、软膏或凝胶)的确切性质。除活性成分外，鼻用剂型通常含有大量的水。还存在少量其他成分，如pH调节剂、乳化剂或分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂或缓冲剂以及其他稳定剂和增溶剂。鼻用剂型与鼻分泌物等渗。
对于通过吸入施用，本文描述了呈气雾剂、雾或粉末的形式。本文所述的药物组合物在使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)的情况下从加压包装或喷雾器以气雾剂喷雾给送的形式方便地递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位通过提供阀以递送计量的量来确定。配制含有本文所述的化合物与合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物的用于在吸入器或吹入器中使用的(如仅作为举例)明胶的胶囊和药筒。
治疗有效量和治疗方案
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒及其组合物以治疗有效量施用至受试者。治疗有效量将取决于待治疗的受试者、受试者的状态(例如，一般健康状况)、所需的保护、待治疗的疾病、施用途径和/或病毒的性质。在一些实施方案中，负责施用的人员(例如，主治医师)将确定个体的适当剂量。如在医学领域中众所周知，用于任一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体重、体表面积、年龄、性别和一般健康状况、待施用的特定化合物、待治疗的特定疾病、施用时间和途径以及目前正在施用的其他药物。因此，预期对于每个个体患者，即使所述病毒一般施用至群体，也监测每个患者的个体适当剂量，并且监测患者的此类实践是本领域的常规。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒的治疗有效量以单剂量施用。在本发明的一些实施方案中，假型化溶瘤病毒或其组合物以在约1x10+5pfu至约1x10+15pfu(噬斑形成单位)、约1x10+8pfu至约1x10+15pfu、约1x10+10pfu至约1x10+15pfu或约1x10+8pfu至约1x10+ 12pfu范围内的剂量施用于受试者。例如，在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒或其组合物以约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015pfu病毒的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，剂量取决于组合物所施用至的受试者的年龄。例如，如果受试者是青少年，则可能需要较低剂量，并且如果受试者是成年人受试者，则可能需要较高剂量。在某些实施方案中，例如，青少年受试者接受约1x10+8pfu和约1x10+10pfu，而成年人受试者接受约1x10+10pfu与约1x10+12pfu之间的剂量。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒的治疗有效量在两个或更多个剂量过程内施用。在一些实施方案中，两个或更多个剂量同时施用(例如，在同一天或在短时间段内)或以适当的间隔，例如每天两次、三次、四次或更多次亚剂量。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒或其组合物施用至受试者一次。在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒或其组合物施用至受试者多于一次。例如，本文公开的组合物可多次施用，包括1、2、3、4、5、6或更多次。在一些实施方案中，本文公开的组合物可每天一次或每周一次施用至受试者持续一段时间或每月一次、每年两次或每年一次施用至受试者，这取决于受试者中的病原生物体或疾患(例如癌症)的需要或暴露。在特定实施方案中，溶瘤病毒及其组合物以使得它们被受试者长时间保留的这样的方式配制并且以这样的量和/或频率施用。
在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒或其组合物被施用用于治疗性应用或作为维持疗法施用，例如像用于缓解的患者。在一些实施方案中，假型化溶瘤病毒或其组合物每月一次、每2个月一次、每6个月一次、每年一次、每年两次、每年三次、每两年一次、每三年一次或每五年一次施用。
在一些实施方案中，其中患者的状态确实改善，假型化溶瘤病毒或其组合物可根据医生的判断连续施用。在一些实施方案中，暂时减少剂量组合物和/或暂时中止组合物的施用一段时间(即“休药期”)。在一些实施方案中，休药期的长度在2天与1年之间变化，仅举例来说包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。休药期期间的剂量减少时10％-100％，仅举例来说包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施方案中，一旦发生患者疾患的改善，就可在需要时施用维持剂量。在一些实施方案中，随症状变化，组合物的施用剂量和/或频率降低至保留改善的疾病、病症或疾患的水平。在一些实施方案中，在症状的任何复发时，患者可能需要在长期基础上进行间歇治疗。
在一些实施方案中，在细胞培养物或实验动物中通过标准药物程序测定此类治疗方案的毒性和治疗功效，包括但不限于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数并且其被表示为LD50与ED50之间的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于配制用于人的一系列剂量。此类化合物的剂量优选地在包括具有最小毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和利用的施用途径，剂量在此范围内变化。
在一些情况下，评价肿瘤抗原表达水平以评估患者中的治疗进程，对患者进行分层和/或调节治疗方案。在一些情况下，抗原表达水平的评估包括使用免疫组织化学(IHC)(包括半定量或定量IHC)或其他基于抗体的测定(蛋白质印迹、荧光免疫测定(FIA)、荧光原位杂交(FISH)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀(RIP)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳)、或间接定量这些基因的转录物(例如通过原位杂交、核酸酶保护、RNA印迹、聚合酶链反应(PCR)，包括逆转录酶PCR(RT-PCR))。在一些情况下，使用抗体使用FAC技术或石蜡包埋的肿瘤切片对细胞，例如淋巴细胞进行分析。
在一些情况下，抗体用于通过诸如免疫组织化学、ELISA和蛋白质印迹的技术表征靶细胞的蛋白质含量。在一些情况下，这提供例如对于是否存在可能对溶瘤病毒疗法有利反应的受试者和/或需要与溶瘤病毒共同施用免疫刺激剂的筛选。
在一些实施方案中，对来自活组织检查的组织样品进行免疫组织化学。在一些情况下，对新鲜或冷冻样品检查。在一些情况下，将细胞中存在的针对抗原的抗体添加至载玻片上的样品，并且抗体结合存在抗原的任何地方。在一些实施方案中，然后洗去过量的抗体。在一些情况下，将保留与细胞的结合的抗体进一步通过第二抗体标记，以用于在显微镜下可视化。
在一些实施方案中，从受试者，例如像从组织(例如肿瘤活检)、脑脊液(CSF)、淋巴、血液、血浆、血清、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴液、淋巴细胞、滑液和尿液获得测试样品。在特定实施方案中，从CSF或肿瘤组织获得测试样品。在其他特定实施方案中，从肿瘤组织获得测试样品，并且例如测定所述样品中CD4+和/或CD8+细胞的相对数目和/或例如通过用针对Th1和/或Th2细胞因子的抗体对来自样品的固定和透化细胞进行免疫荧光染色来测量所述样品中一种或多种Th1和/或Th2细胞因子的水平。在其他特定实施方案中，从血液获得测试样品并且例如通过ELISA测量所述样品中一种或多种Th1和/或Th2细胞因子的水平。
组合疗法
在一些实施方案中，本文所述的病毒、表达构建体、核酸分子和/或载体与另一种治疗剂组合施用。在一些实施方案中，溶瘤病毒和另外的治疗剂被配制在相同的组合物中。在此类实施方案中，组合物还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，溶瘤病毒和另外的治疗剂被配制在单独的组合物(例如，适合施用至患者或受试者的两种或更多种组合物)中。本公开还涵盖与其他癌症疗法的共同施用方案，所述其他癌症疗法例如双特异性抗体构建体、靶向毒素或其他化合物，包括经由免疫细胞起作用的那些，包括T细胞疗法。用于共同施用本发明组合物的临床方案涵盖在施用其他组分同时、之前和/或之后共同施用。特定组合疗法包括化学疗法、放射、外科手术、激素疗法和/或其他类型的免疫疗法。在一些实施方案中，将治疗有效量的假型化溶瘤病毒与另外的治疗剂组合施用至有需要的受试者。在一些情况下，另外的治疗剂是化学治疗剂、类固醇、免疫治疗剂、靶向疗法或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物与辅助疗法结合施用。例如，在一次或多次施用(例如，肿瘤内注射假型化病毒)之前、同时或之后施用活化辅助治疗。例如，辅助疗法包括调节Toll样受体(TLR)配体，如通过包含CpG序列的DNA分子进行的TLR9活化，或TLR9活化(例如，通过RNA配体)。其他辅助治疗包括激动抗体或其他多肽(例如，分别通过CD40配体(CD40L)或GITR配体(GITRL)活化CD40或GITR)。此外，提供了调节STING的环状二核苷酸(例如，c-di-GMP)。另一种活化佐剂包括白细胞介素如IL-33。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括选自以下的剂：苯达莫司汀、硼替佐米、来那度胺、艾代拉里斯(GS-1101)、伏立诺他、依维莫司、帕比司他、坦罗莫司、罗米地辛、伏立诺他、氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌、喷司他丁、泼尼松、依托泊苷(etopside)、丙卡巴肼和沙利度胺。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是多剂治疗方案。在一些实施方案中，另外的治疗剂包括HyperCVAD方案(环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、与甲氨蝶呤和阿糖胞苷交替的地塞米松)。在一些实施方案中，HyperCVAD方案与利妥昔单抗组合施用。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包含R-CHOP方案(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括FCR方案(FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥昔单抗))。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括FCMR方案(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌、利妥昔单抗)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括FMR方案(氟达拉滨、米托蒽醌、利妥昔单抗)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括PCR方案(喷司他丁、环磷酰胺、利妥昔单抗)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括PEPC方案(泼尼松、依托泊苷、丙卡巴肼、环磷酰胺)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括使用90Y-替伊莫单抗或131I-托西莫单抗的放射免疫疗法。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是自体干细胞移植。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：氮芥类，例如像苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、氮芥(chlormethine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、泼尼莫司汀、曲磷胺；烷基磺酸酯类，如白消安、甘露舒凡、曲奥舒凡；乙烯亚胺类，如卡波醌、噻替派、三亚胺醌；亚硝基脲类，如卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、司莫司汀、链脲菌素；环氧化物，例如像依托格鲁；其他烷化剂，例如像达卡巴嗪、二溴甘露醇、哌泊溴烷、替莫唑胺；叶酸类似物，例如像甲氨蝶呤、培美曲塞、普拉曲沙、雷替曲塞；嘌呤类似物，例如像克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤、奈拉滨、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如像阿扎胞苷、卡培他滨、卡莫氟、阿糖胞苷、地西他滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟；长春花生物碱，例如像长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨；鬼臼毒素衍生物，例如像依托泊苷、替尼泊苷；秋水仙碱衍生物，例如像秋水仙胺；紫杉烷类，例如像多西他赛、紫杉醇、聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex)；其他植物生物碱和天然产物，例如像曲贝替定；放线菌素类，例如像更生霉素；蒽环类药物，例如像阿柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、吡柔比星、戊柔比星、佐柔比星；其他细胞毒性抗生素，例如像博来霉素、伊沙匹隆、丝裂霉素、普卡霉素；铂化合物，例如像卡铂、顺铂、奥沙利铂、沙铂；甲基肼，例如像丙卡巴肼；敏化剂，例如像氨基乙酰丙酸、乙丙昔罗、氨基酮戊酸甲酯、卟吩姆钠、替莫泊芬；蛋白激酶抑制剂，例如像达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、西罗莫司；其他抗肿瘤药，例如像阿利维甲酸、六甲蜜胺、胺苯吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、蓓萨罗丁、硼替佐米、塞来昔布、地尼白介素-毒素连接物、雌莫司汀、羟基尿素、伊立替康、氯尼达明、马索罗酚、米替福新、米托胍腙、米托坦、奥利默森、培门冬酶、喷司他丁、罗米地辛、腺病毒载体定位码基因注射剂(sitimagene ceradenovec)、噻唑呋林、托泊替康、维甲酸、伏立诺他；雌激素，例如像己烯雌酚(diethylstilbenol)、炔雌醇、磷雌酚、聚雌二醇磷酸酯；孕激素，例如像孕诺酮、甲羟孕酮、甲地孕酮；促性腺激素释放激素类似物，例如像布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、曲普瑞林；抗雌激素，例如像氟维司群、他莫昔芬、托瑞米芬；抗雄激素，例如像比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、酶抑制剂、氨鲁米特、阿那曲唑、依西美坦、福美司坦、来曲唑、伏罗唑等；其他激素拮抗剂，例如像阿巴瑞克、地加瑞克；免疫刺激剂，例如像组胺二盐酸盐、米伐木肽、匹多莫德、普乐沙福、罗喹美克、胸腺五肽；免疫抑制剂，例如像依维莫司、胍立莫司、来氟米特、霉酚酸、西罗莫司；钙调磷酸酶抑制剂，例如像环孢素、他克莫司；其他免疫抑制剂，例如像硫唑嘌呤、来那度胺、甲氨蝶呤、沙利度胺；以及放射性药物，例如像碘苄胍。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子等。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：安西司亭、非格司亭、来格司亭、莫拉司亭、培非格司亭、沙格司亭；干扰素，例如像天然IFNα、IFNα-2a、IFNα-2b、IFN alfacon-1、IFNα-n1、天然IFNβ、IFNβ-1a、IFNβ-1b、IFNγ、聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b；白细胞介素，例如像阿地白介素、奥普瑞白介素；其他免疫刺激剂，例如像BCG疫苗、醋酸格拉替雷、组胺二盐酸盐、免疫花青、香菇多糖、黑素瘤疫苗、米伐木肽、培加酶、匹多莫德、普乐沙福、聚I：C、聚ICLC、罗喹美克、他索纳明、胸腺五肽；免疫抑制剂，例如像阿巴西普、阿贝莫司、阿法西普、抗淋巴细胞免疫球蛋白(马)、抗胸腺细胞免疫球蛋白(兔)、依库珠单抗、依法珠单抗、依维莫司、胍立莫司、来氟米特、莫罗单抗-CD3、霉酚酸、那他珠单抗、西罗莫司；TNFα抑制剂，例如像阿达木单抗、阿非莫单抗、塞妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗；白细胞介素抑制剂，例如像阿那白滞素、巴利昔单抗、卡那单抗、达克珠单抗、美泊利单抗、利纳西普、托珠单抗、优特克单抗；钙调磷酸酶抑制剂，例如像环孢素、他克莫司；其他免疫抑制剂，例如像硫唑嘌呤、来那度胺、甲氨蝶呤、沙利度胺。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、塞妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗等或其组合。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：单克隆抗体，例如像阿仑单抗、贝伐单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、依决洛单抗、吉妥珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗；免疫抑制剂，依库珠单抗、依法珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗；TNFα抑制剂，例如像阿达木单抗、阿非莫单抗、塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗；白细胞介素抑制剂，巴利昔单抗、卡那单抗、达克珠单抗、美泊利单抗、托珠单抗、优特克单抗；放射性药物，替伊莫单抗、托西莫单抗；另外的单克隆抗体，例如像阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、抗CD30单克隆抗体Xmab2513、抗MET单克隆抗体MetMab、阿泊珠单抗、阿普单抗、阿西莫单抗、巴利昔单抗、双特异性抗体2B1、博纳吐单抗、本妥西单抗维多汀、卡罗单抗喷地肽、西妥木单抗、claudiximab、可那妥木单抗、达西珠单抗、地诺单抗、依库珠单抗、依帕珠单抗、依帕珠单抗、厄妥索单抗、伊瑞珠单抗、芬妥木单抗、夫苏木单抗、加利昔单抗、甘尼妥单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、格莱木单抗、替伊莫单抗、伊珠单抗奥佐米星、伊匹单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉珠单抗、单克隆抗体CC49、耐妥珠单抗、尼妥珠单抗、奥戈伏单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、西利珠单抗、索尼普单抗、他尼珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗、图考珠单抗西莫白介素、维妥珠单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗、扎妥木单抗。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：影响肿瘤微环境的剂，如细胞信号传导网络(例如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号传导途径、来自B细胞受体和IgE受体的信号传导)。在一些实施方案中，另外的治疗剂是PI3K信号传导抑制剂或syc激酶抑制剂。在一个实施方案中，syk抑制剂是R788。在另一个实施方案中，是PKCγ抑制剂，如仅作为实例，恩斯他瑞。
影响肿瘤微环境的剂的实例包括PI3K信号传导抑制剂、syc激酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂，例如像达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、替西罗莫司；其他血管生成抑制剂，例如像GT-111、JI-101、R1530；其他激酶抑制剂，例如像AC220、AC480、ACE-041、AMG900、AP24534、Arry-614、AT7519、AT9283、AV-951、阿西替尼、AZD1152、AZD7762、AZD8055、AZD8931、巴非替尼、BAY73-4506、BGJ398、BGT226、BI 811283、BI6727、BIBF 1120、BIBW 2992、BMS-690154、BMS-777607、BMS-863233、BSK-461364、CAL-101、CEP-11981、CYC116、DCC-2036、地尼西宝(dinaciclib)、多韦替尼乳酸盐、E7050、EMD 1214063、ENMD-2076、福他替尼二钠、GSK2256098、GSK690693、INCB18424、INNO-406、JNJ-26483327、JX-594、KX2-391、利尼伐尼、LY2603618、MGCD265、MK-0457、MK1496、MLN8054、MLN8237、MP470、NMS-1116354、NMS-1286937、ON 01919.Na、OSI-027、OSI-930、Btk抑制剂、PF-00562271、PF-02341066、PF-03814735、PF-04217903、PF-04554878、PF-04691502、PF-3758309、PHA-739358、PLC3397、祖细胞生成素(progenipoietin)、R547、R763、雷莫芦单抗、瑞戈非尼、RO5185426、SAR103168、SCH 727965、SGI-1176、SGX523、SNS-314、TAK-593、TAK-901、TKI258、TLN-232、TTP607、XL147、XL228、XL281RO5126766、XL418、XL765。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：有丝分裂原活化蛋白激酶信号传导的抑制剂，例如，U0126、PD98059、PD184352、PD0325901、ARRY-142886、SB239063、SP600125、BAY 43-9006、渥曼青霉素或LY294002；Syk抑制剂；mTOR抑制剂；以及抗体(例如，美罗华)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：20-表-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；艾美多；阿米福汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；雄茸交酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸蚜肠霉素；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；奥沙那宁；阿他美坦；阿莫司汀；阿新司坦汀1；阿新司坦汀2；阿新司坦汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；巴卡亭III衍生物；班兰诺；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿立辛；贝他霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双萘法德；双崔特(bistratene)A；比折来新；比锐来特(breflate)；溴匹立明；布多替钛；丁硫氨酸亚砜胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨来源抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里斯霉素A；克里斯霉素B；考布他丁A4；考布他汀类似物；考那格宁(conagenin)；卡那贝西汀(crambescidin)816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；卡拉新(curacin)A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；次帕霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；去氢膜海鞘素B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；亚丝醌；膜海鞘素B；地多西(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二噁霉素；二苯基螺莫司汀；二十二醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法屈唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄安；夫拉平度；氟卓斯汀；氟海星酮；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；钆德克萨卟啉；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；和普苏姆；和瑞古林；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素-例如像生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；4-甘薯醇；伊罗普拉；伊索拉定；异苯胍唑；异高软海绵素B；伊他司琼；杰斯普拉克立德(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；三乙酸片螺素-N；兰乐肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸香菇多糖；利特斯塔汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；立索克林酰胺(lissoclinamide)7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；德克萨斯卟啉镥；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美坦新；抑甘露糖苷酶素(mannostatin)A；马马司他(marimastat)；马索罗酚；马司非(maspin)；基质溶素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；美服培酮；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体、人类绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重抗药性基因抑制剂、基于多肿瘤抑制因子1的治疗剂；芥末抗癌剂；美卡普罗B；分枝杆菌细胞壁提取物；美瑞泡仁(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；纳格瑞替；纳洛酮+戊唑星；纳普维；萘特非；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；丽沙霉素；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；里挫林；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥克恩；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉新；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；奥克萨霉素；帕诺明；十六酰基根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；帕拉贝新；帕折普汀；培门冬酶；皮地新(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他汀；戍四硝唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；皮西板尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；普来司汀A；普来司汀B；血纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂、铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂、微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑并吖啶；吡哆醛化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲赛；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替立汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；鲁滨吉隆(rubiginone)B1；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈；圣特平(saintopin)；SarCNU；沙卡弗托A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐糖；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；索佛罗；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；斯皮卡霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；斯兰罗皮汀；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂；斯替匹酰胺(stipiamide)；基质溶素抑制剂；索非罗新；超活性血管活性肠肽拮抗剂；苏拉迪司塔(suradista)；苏拉明；苦马豆素；合成葡糖氨基葡聚糖；他莫司汀；甲碘化他莫昔芬；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶、碲哌喃鎓；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物；替唑明；噻立拉斯汀(thaliblastine)；噻考瑞林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；二氯化二茂钛；托普升替；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂、维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；凡瑞林B；载体系统、红细胞基因治疗剂；维拉雷琐；凡拉明；凡啶；维替泊芬；维萨汀；维他欣；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；以及净司他丁斯酯。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自：烷化剂、抗代谢药、天然产物或激素，例如，氮芥(例如，氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥等)、烷基磺酸盐(例如，白消安)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀等)或三氮烯(达卡巴嗪等)。抗代谢药的实例包括但不限于叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤)或嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷)、嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁)。
在一些实施方案中，药物组合物与辅助疗法结合施用。例如，在一次或多次施用(例如，肿瘤内注射假型化病毒)之前、同时或之后施用活化辅助治疗。例如，辅助疗法包括调节Toll样受体(TLR)配体，如通过包含CpG序列的DNA分子进行的TLR9活化，或TLR9活化(例如，通过RNA配体)。其他辅助治疗包括激动抗体或其他多肽(例如，分别通过CD40配体(CD40L)或GITR配体(GITRL)活化CD40或GITR)。此外，提供了调节STING的环状二核苷酸(例如，c-di-GMP)。另一种活化佐剂包括白细胞介素如IL-33。在一些情况下，本文所述的药物组合物与辅助疗法结合施用。
药盒
在一些实施方案中，本发明提供了药盒，其包括一种或多种如本文所述的溶瘤病毒、如本文所述的核酸序列、如本文所述的载体和/或如本文所述的宿主细胞。在一些实施方案中，所述药盒包含单独或与待施用于有需要的个体的其他治疗剂组合的如上文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了用于将根据本发明的载体和病毒产生细胞用作治疗方法中的药物的药盒。特别地，根据本发明的一些实施方案的载体和病毒产生细胞用于受试者的实体瘤的疗法或治疗。在一些实施方案中，治疗作用由重组载体和病毒的溶瘤特性以及治疗基因的使用引起。
在一些实施方案中，本发明提供了用于与方法和组合物一起使用的药盒。一些实施方案涉及具有用于减少患有一种或多种实体瘤的受试者的发作或治疗所述受试者的疫苗组合物的药盒。其他实施方案涉及用于制备和使用本文所述的分子构建体的药盒。在一些情况下，药盒还包括合适的容器，例如小瓶、管、微型或微量离心管、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器。在提供另外的组分或剂的情况下，药盒含有一个或多个另外的容器，这种剂或组分被置于所述容器中。本文的药盒还包括用于容纳严格限制用于商业销售的构建体、疫苗组合物和任何其他试剂容器的装置。此类容器包括注塑或吹塑的塑料容器，所需的小瓶保留在所述容器中。任选地，所描述的组合物(例如用作疫苗的组合物)需要一种或多种另外的剂，如其他抗病毒剂、抗真菌剂或抗细菌剂。
本说明书中所提及的所有出版物、专利以及专利申请以引用的方式并入本文，其引用的程度犹如每个独立的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入。
实施例
以下实施例进一步说明所描述的实施方案而不限制本发明的范围。
实施例1：假型化VSV-G的制备
通过将VSV-糖蛋白(VSV-GP)与HIV1-gag和rev蛋白组合，采用以下方案来制备示例性假型化VSV-G。
细胞培养和转染：将以下包装质粒的DNA混合并制备用于转染到293T细胞中：表达HIV-1 GAG/POL的pMDLg/pRRE；表达HIV-1 REV的pRSV/REV；和pMD2.G 5 60 5.8 VSV糖蛋白。将DNA混合物添加至500μL预热的Optimem II培养基中。在1xPBS(pH 4.5)中以1μg/μL制备聚乙烯亚胺转染试剂(PEI)的工作储备液，并将88μL工作储备液添加至混合物中，维持4∶1 v/w比例的PEI∶DNA。将混合物短暂涡旋并在室温下放置5-10分钟以形成PEI∶DNA转染复合物。将总计2.5x 106低传代(小于P20)293T细胞在15mL补充有10％血清和1％Pen/Strep的DMEM中每15cm培养皿接种。在转染前2小时，吸出细胞培养基并用15mL新鲜预热的生长培养基(GM)更换。然后将转染复合物逐滴添加至每个15cm板，短暂涡旋以混合并在10％CO2、35℃中孵育8小时。在8小时后，用10mL含有25mM HEPES和10％血清的新鲜生长培养基更换培养基。然后将混合物在转染后孵育48小时。
病毒收集：取出每个培养皿中的培养基、合并并通过0.22μm低蛋白质结合/快速流动过滤器单元过滤并在4℃下储存。向每个培养皿中添加5mL体积的新鲜生长培养基并在4℃下孵育过夜(转染后60-72小时)。收集来自每个培养皿的第二批培养基，如前一步骤中，并与之前的培养基收获合并。通过用DNASE-1(1mg/mL储备液)消化除去质粒遗留物。将补充有1μL的1M MgCl2的1μg/mL溶液(病毒上清液)在室温下孵育30分钟，然后在4℃下孵育2-4小时。过滤的上清液可直接在培养的细胞上施用，或等分并储存在-80℃。可任选地浓缩并纯化假型化VSV-G病毒上清液。
实施例2：表达CD28-CA125双特异性抗体衔接分子的假型化VSV-G的构建
如实施例1中所述来制备假型化VSV-G，并且进一步加工以表达编码衔接多肽的核酸，所述衔接多肽包含含有抗CD28分子的活化结构域和包含抗CA125分子的抗原识别结构域，以及编码抗PD1免疫调节肽的核酸。所得到的溶瘤病毒是假型化溶瘤性VSV-G病毒，其编码CD28-CA125衔接分子和抗PD1治疗性分子(CD28-CA125-PD1 VSV-G)。
实施例3：CD28-CA125-PD1 VSV-G活化人T细胞并表现出抗肿瘤活性
用假型化CD28-CA125-PD1 VSV-G病毒感染人T细胞。在病毒感染后24小时至48小时，收集T细胞培养基并检查促炎性细胞因子的存在。这些结果将显示T细胞被CD28-CA125-PD1 VSV-G活化，如通过CD28-CA125-PD1 VSV-G感染的人T细胞的细胞培养上清液中存在促炎性细胞因子如IFN-β和IL-2所证明。
将来自KATO3细胞系的过表达EphA2的胃癌细胞用假型化CD28-CA125-PD1 VSV-G或非假型化CD28-CA125-PD1 VSV病毒感染，并评估细胞增殖。这些结果将表明，与用非假型化CD28-CA125-PD1 VSV病毒感染的KATO3细胞相比，用假型化CD28-CA125-PD1 VSV-G感染的KATO3细胞中的细胞增殖显著降低。
实施例4：CD19-CD3、SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc衔接分子经由CD3特异性地结合至T细胞
评估了二分(CD19-CD3和SIRP1α-CD3)和三联(PDL1-CD3-Fc)衔接分子与T细胞的结合。简言之，用200U/mL IL-2刺激25,000个T细胞持续12天。在12天后，将T细胞与不同浓度的衔接分子(500、1000或2000ng/mL用于CD19-CD3和SIRP1α-CD3；纯净上清液用于PDL1-CD3-Fc)一起一式三份在室温下孵育20分钟。然后将细胞洗涤两次，随后用500ng/mL的抗6XHis APC抗体染色另外20分钟。再次洗涤细胞并用碘化丙啶(PI)处理以从进一步分析中排除死细胞。在BD LSR Fortesa细胞计数器上通过流式细胞术分析染色的细胞，并将对于染色呈阳性的细胞群体的百分比设定为仅第二对照的2％。
CD19-CD3(图19A)、SIRP1α-CD3(图19B)和PDL1-CD3-Fc(图19C)的结果表明这些功能分子中的每一个的CD3结合部分与表达CD3的293F T结合，如通过与单独第二抗体相比对衔接分子呈阳性的细胞百分比的增加所表明。特别地，对于CD19-CD3观察到阳性细胞％的剂量依赖性增加(图19A)，而SIRP1α-CD3构建体在所有浓度下都显示出最大结合。所使用的纯净PDL1-CD3-Fc上清液的量产生构建体与大多数T细胞的结合(图19C)。
这一实验的结果在图20中定量。特别地，与未添加衔接分子的样品相比，所有构建体都显示阳性T细胞％的显著增加。
另外的实验证明CD19-CD3、SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc的结合通过衔接分子的抗CD3结构域与由T细胞表达的CD3的相互作用介导。在将T细胞暴露于衔接分子之前，将T细胞与抗CD3单克隆抗体(OKT3)一起孵育。与OKT3一起预孵育抑制CD19-CD3衔接器的结合，并且显著降低PDL1-CD3-Fc衔接器的结合。通过与OKT3一起预孵育缺乏SIRP1α-CD3衔接器的结合的抑制(图21C)可能是由于这些样品中OKT3对CD3的不完全抑制。
实施例5：SIRP1α-CD3构建体特异性地结合至CD47
进行实验以确定SIRP1α-CD3衔接构建体的结合特异性。将Raji细胞与SIRP1α-CD3衔接器一起在室温下预孵育20分钟。然后洗涤细胞并与荧光标记的抗CD47单克隆抗体一起在室温下孵育20分钟，之后洗涤细胞并通过流式细胞术分析。未与SIRP1α-CD3衔接器一起预孵育的Raji细胞显示抗CD47单克隆抗体的显著结合(图22，IgG对照直方图对比抗CD47直方图)。Raji细胞与SIRP1α-CD3衔接器一起预孵育阻断抗CD47单克隆抗体的结合(图22，抗CD47直方图对比抗CD47+SIRP1α-CD3直方图)。
实施例6：SIRP1α-CD3和CD19-CD3衔接分子与靶细胞的结合
进行实验以确定SIRP1α-CD3和CD19-CD3 BiTE与Raji(CD19+CD47+，图23)、U2OS(CD19-CD47+，图24)、GBM30-luc(CD19-CD47+，图25)以及U251(CD19-CD47+，图26)靶细胞类型结合的能力。对于每种靶细胞类型，用500或1000ng/mL的(i)His-标记的可溶性SIRP1α；(ii)SIRP1α-CD3 BiTE；或(iii)或CD19-CD3 BiTE处理细胞。然后用荧光标记的抗His抗体染色细胞，并通过流式细胞术进行分析。
SIRP1α-CD3和CD19-CD3与CD19+CD47+Raji细胞的结合的结果在图23中示出。相对于阴性对照Ig(仅2°)，可溶性SIRP1α、SIRP1α-CD3 BiTE和CD19-CD3 BiTE能够与Raji细胞结合，如通过与IgG对照直方图相比朝向衔接器直方图右侧的移位所指示(图23A)。显示BiTE阳性细胞的百分比的结合数据的定量在图23B中示出。
SIRP1α-CD3和CD19-CD3与CD19+CD47+U2OS细胞的结合的结果在图24中示出。相对于阴性对照Ig(仅2°)，可溶性SIRP1α、SIRP1α-CD3 BiTE能够在所有使用的浓度下与U2OS细胞结合，如通过与IgG对照直方图相比朝向衔接器直方图右侧的移位所指示(图23A)。CD19-CD3 BiTE不能与U2OS细胞结合，这是基于U2OS细胞缺乏CD19表达而预期的。显示BiTE阳性细胞的百分比的这些结合数据的定量在图24B中示出。
SIRP1α-CD3和CD19-CD3与CD19-CD47+GBM30-luc细胞的结合的结果在图25中示出。相对于阴性对照Ig(仅2°)，SIRP1α-CD3 BiTE能够在所有使用的浓度下与GBM30-luc细胞结合，如通过与IgG对照直方图相比朝向衔接器直方图右侧的移位所指示(图25A)。相比之下，CD19-CD3 BiTE不能与GBM30-luc细胞结合，这是基于GBM30-luc细胞缺乏CD19表达而预期的。显示BiTE阳性细胞的百分比的这些结合数据的定量在图25B中示出。
SIRP1α-CD3和CD19-CD3与CD19-CD47+U251细胞的结合的结果在图26中示出。相对于阴性对照Ig(仅2°)，SIRP1α-CD3 BiTE能够在所有使用的浓度下与U251细胞结合，如通过与IgG对照直方图相比朝向衔接器直方图右侧的移位所指示(图26A)。相比之下，CD19-CD3BiTE不能与U251细胞结合，这是基于U251细胞缺乏CD19表达而预期的。显示BiTE阳性细胞的百分比的这些结合数据的定量在图26B中示出。
实施例7：PDL1-CD3-Fc TiTE与U251细胞的结合由CD47介导，而不是FcγR
由于PDL1-CD3-Fc TiTE构建体包含能够结合至靶细胞的2个结构域(抗PDL1和Fc结构域)，因此进行实验以评估这些构建体的结合特异性。将CD19-CD47+U251细胞用2μg/mL荧光标记的抗PDL1抗体、同种型对照或PDL1-CD3-Fc转染上清液处理。相对于阴性对照Ig，PDL1-CD3-Fc TiTE结合至U251细胞(图27B)。为了评估这种观察到的结合是否是由于与由U251细胞表达的CD47或FcγR的相互作用，测定了U251细胞上的FcγR表达。将细胞与2μg/mL荧光团缀合的抗CD16/32(识别FcγRIII/FcγRII)或抗CD64(识别FcγRI)mAb一起在室温下孵育20分钟。然后洗涤细胞并使用BD LSR Fortessa细胞计数器通过流式细胞术进行分析。如图27C中所示，U251细胞不表达FcγRI、FcγRII或FcγRIII，从而表明PDL1-CD3-Fc构建体的结合是通过与CD47而非FcγR的相互作用介导的。
实施例8：CD19-CD3、SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc构建体刺激CD8+T细胞介导的靶细胞杀伤
进行实验以确定CD19-CD3、SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc构建体介导靶细胞的杀伤的能力。简言之，将CD8+T细胞在200U/mL IL-2和Dynabcads存在下刺激8-12天。在与靶细胞一起共培养之前，通过磁体除去所有Dynabeads并洗涤细胞以除去IL-2。在接种之前，用荧光膜染料PKH67绿色标记Raji(图28)、THP1(图29)、U251(图30)和293F(图31)靶细胞。然后将CD8+效应T细胞与靶细胞以1∶1的效应物与靶标比例连同1000ng/mL CD19-CD3 BiTE、SIRP1α-CD3 BiTE或1∶3稀释的PDL1-CD3-Fc转染上清液共培养。将靶细胞和效应细胞的共培养物孵育18小时，之后将它们用7-AAD染色，并在BD LSR Fortesa细胞计数器上通过流式细胞术进行存活/死亡分析。
这些实验的结果表明CD19-CD3、SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc衔接构建体都能够诱导效应细胞介导的Raji靶细胞死亡(图28)，Raji细胞上CD19-CD3、SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc衔接分子中的每种的EC50在以下表7中示出。
表7：Raji细胞上衔接分子的EC50
衔接分子 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
CD19-CD3 0.6997
SIRP1α-CD3 0.0137
PDL1-CD3-Fc 0.8907
这些实验的结果进一步表明PDL1-CD3-Fc衔接构建体而非CD19-CD3构建体能够诱导效应细胞介导的THP1靶细胞死亡(图29)。这可能是由于THP1细胞缺乏/相对低的CD19表达。
此外，PDL1-CD3-Fc衔接构建体能够诱导效应细胞介导的U251靶细胞死亡(图30)，而CD19-CD3构建体由于U251细胞缺乏CD19表达而不诱导效应细胞介导的U251细胞死亡。U251细胞上CD19-CD3和PDL1-CD3-Fc构建体中的每种的EC50在以下表8中示出。
表8：U251细胞上衔接分子的EC50
衔接分子 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
CD19-CD3 2.247
PDL1-CD3-Fc 2.611
此外，与对照骨桥蛋白融合蛋白(OPN 1)相比，SIRP1α-CD3衔接构建体能够诱导效应细胞介导的293F靶细胞死亡(图31)，通过含有SIRP1α-CD3的培养物中细胞死亡的增加所指示。293F细胞上SIRP1α-CD3衔接分子的EC50在以下表9中示出。
表9：293F细胞上SIRP1α-CD3的EC50
衔接分子 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
SIRP1α-CD3 0.0184
实施例9：PDL1-CD3-Fc BiTE增强U251细胞的原代NK细胞杀伤
进行实验以评估PDL1-CD3-Fc构建体诱导NK细胞介导的靶细胞杀伤的能力。简言之，将U251细胞用细胞膜染料PKH67绿色标记，且然后接种并使其粘附至孔过夜(图32)。然后将原代NK细胞(StemCell Technologies，Inc.)以1∶1的效应物与靶标比例与不同量的病毒产生的PDL1-CD3-Fc蛋白一起添加至每个孔。在通过7-AAD染色进行存活/死亡分析之前，将效应物/靶细胞共培养物在37℃下孵育6小时。在BD LSR Fortesa细胞计数器上通过流式细胞术分析染色的细胞。
这些结果将证明病毒产生的PDL1-CD3-Fc化合物能够刺激NK细胞介导的靶细胞如U251的死亡。
实施例10：oHSV感染的Vero细胞表达SIRP-1α-CD3 BiTE
为了证明在此描述的溶瘤病毒能够或产生衔接分子，将Vero细胞用具有短接头(SL)(ONCR-085；2A5B SIRP1α-CD3(SL)BiTE)或长接头(LL)(ONCR-087；2A5B SIRP1α-CD3(LL)BiTE)的表达SIRP1α-CD3 BiTE的oHSV(图32)或表达PDL1-CD3-Fc TiTE的oHSV(ONCR-089，图33)感染。将细胞感染3天，然后将来自感染的细胞的上清液通过100K MWCO超滤膜以除去任何病毒颗粒。用10K MWCO超滤膜浓缩流过液。然后通过PAGE分析浓缩的病毒上清液和100ng、50ng、25ng或12.5ng纯化的SIRP1α-CD3或PDL1-CD3-Fc蛋白，随后用抗6xHis检测抗体进行蛋白质印迹以确定存在于病毒上清液中的衔接蛋白的量。
结果表明，用ONCR-085或ONCR-087感染的细胞分别产生SIRP1α-CD3(SL)和SIRP1α-CD3(LL)蛋白(图32)。此外，用ONCR-089感染的细胞产生PDL1-CD3-Fc蛋白(图33)。通过蛋白质印迹评估100K和10K Amicon过滤和浓缩步骤除去剩余病毒的能力。用于澄清病毒上清液的工作流程包括上清液的低速离心，然后通过0.8μm滤膜过滤。然后将上清液滤液通过Amicon 100kDa过滤器以夹带病毒，然后使滤液通过Amicon 10kDa过滤器以夹带剩余的蛋白质。在用Amicon过滤器处理之前和之后取出来自病毒感染的细胞的上清液的等分部分，并通过用抗HSV多克隆抗体印迹来确定HSV的存在。这些结果表明，用于纯化衔接构建体的超滤步骤有效地除去病毒(图35)。因此，在这些衔接构建体存在下观察到的任何靶细胞杀伤是由于衔接构建体本身，而不是靶细胞的病毒感染的结果。
实施例11：病毒产生的SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc衔接构建体诱导效应细胞介导的靶细胞杀伤
进行实验以评估病毒产生的衔接分子(SIRP1α-CD3和PDL1-CD3-Fc构建体)介导靶细胞杀伤的能力。简言之，从实施例10中描述的Vcro细胞制备了SIRP1α-CD3(SL)、SIRP1α-CD3(LL)和PDL1-CD3-Fc蛋白。将50μL的所得SIRP1α-CD3(SL)、SIRP1α-CD3(LL)和PDL1-CD3-Fc衔接蛋白蛋白质样品在含有20％FBS的组织培养基中1∶1稀释。然后将稀释的衔接蛋白与活化的CD8+效应T细胞一起孵育并与荧光标记的U251靶细胞以1∶1的靶标与效应物比例共培养18小时。在BD LSR Fortesa细胞计数器上通过流式细胞术评估U251细胞的细胞死亡。
这一实验的结果表明，病毒产生的衔接构建体指导T细胞介导的U251靶细胞的杀伤(图34A)。这些结果在图34B中定量。
实施例12：来自293T细胞的SIRP1α-CD3/PDL1-Fc化合物的表达
产生了编码SIRP1α-CD3衔接分子和PDL1-Fc治疗性分子的两种表达质粒。一种构建体包含编码HA标记的PDL1-Fc的第一基因，所述第一基因与编码His标记的SIRP1α-CD3BiTE的第二基因连接。通过单个氨基酸接头(即，短接头)(SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(SL)，图37)将SIRP1α氨基酸序列连接至抗CD3 scFv。另一构建体包含编码PDL1-Fc的第一基因，所述第一基因与编码SIRP1α-CD3 BiTE的第二基因连接。通过G4S接头(即，长接头)(SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(LL)，图38)将SIRP1α氨基酸序列连接至抗CD3 scFv。将构建体插入质粒中(图39)，并将得到的SIRP1α-CD3/PDL1-Fc表达质粒转染到293 Free Style T细胞中。在质粒转染后四天，收集培养物上清液。
使用HiTrap MabSelect SuRe蛋白A柱HiTrap柱(GE Healthcare)从培养上清液中纯化抗PDL1-Fc化合物。简言之，将用SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(LL)或SIRP1α-CD3/PDL1-Fc(LL)表达质粒转染的293T细胞的上清液负载到柱上以通过HA标签与柱的结合纯化抗PDL1-Fc化合物。收集流过液以用于使用抗His抗体通过蛋白质印迹检测SIRP1α-CD3 BiTE(图40B)。用洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4)洗涤柱。用IgG洗脱缓冲液(pH 2.8，Pierce)洗脱结合的抗PDL1-Fc蛋白，并立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)中和。
然后通过考马斯染色可视化不同洗脱级分的抗PDL1-Fc蛋白含量。简言之，将洗脱级分在MOPS缓冲液中的4％-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶上以180伏特运行1小时。在SimplyBlue SafeStain中将凝胶染色1小时，然后用水脱色。每种洗脱级分的抗PDL1-Fc蛋白含量示于图40A中。在考马斯分析后，合并洗脱级分并在4℃下用PBS透析。然后通过BCA测定确定总抗PDL1-Fc蛋白浓度。
实施例13：分离的PDL1-Fc蛋白刺激T细胞介导的靶细胞死亡
通过PD1/PDL1阻断测定评估抗PDL1-Fc蛋白诱导靶细胞的效应细胞介导的死亡的能力。所述测定的总体示意图在图41A-41B中示出。简言之，将CD8+T细胞与表达PDL1的靶细胞(CHO-K1细胞)一起共培养。然后将如实施例12中所描述分离的不同浓度的抗PDL1-Fc蛋白添加至培养物中。所使用的抗PDL1-Fc的最高浓度是50μg/mL。然后进行8、2.5倍连续稀释，以产生抗PDL1-Fc浓度的剩余部分。在抗PDL1-Fc存在(图41B)和不存在(图41A)下通过CytoTox-GloTM细胞毒性测定分析细胞死亡。结果在图41C中量化。抗PDL1-Fc的EC50在表10中示出。这些结果证明，由本文所述的表达构建体产生的抗PDL1-Fc治疗性分子能够介导效应细胞介导的靶细胞死亡。
表10.抗PDL1-Fc化合物的EC50
化合物 EC<sub>50</sub>
抗PDL1-Fc 0.45μg/mL
实施例13：oHSV感染的Vero细胞表达MMP9和抗PDL1-Fc治疗性分子
除了如实施例10中所述产生衔接分子外，还进行了实验以证明在此所述的溶瘤病毒能够产生MMP9和抗PDL1-Fc治疗性分子。用表达SIRP1α-CD3/PDL1-Fc构建体BiTE的oHSV(图37和图38)或用表达SIRP1α-CD3/MMP9构建体的oHSV(图18A和图18B)感染Vero细胞。将细胞感染3天，然后将来自感染的细胞的上清液通过100K MWCO超滤膜以除去任何病毒颗粒。用10K MWCO超滤膜浓缩流过液。根据实施例11中概述的方案，从过滤的浓缩上清液中纯化MMP9和抗PDL1-Fc。通过PAGE、随后考马斯染色分析蛋白A分离的MMP9和抗PDL1级分。将存在于蛋白A流过液中的SIRP1α-CD3 BiTE用抗6x His检测抗体通过蛋白质印迹进行分析。
结果将证明用编码SIRP1α-CD3/PDL1-Fc构建体或SIRP1α-CD3/MMP9构建体的oHSV载体感染的细胞产生SIRP1α-CD3(SL)和SIRP1α-CD3(LL)BiTE蛋白、MMP9和抗PDL1-Fc。
实施例14：病毒产生的SIRP1α-CD3/MMP9和SIRP1α-CD3/PDL1-Fc衔接构建体诱导效应细胞介导的靶细胞杀伤
进行实验以评估病毒产生的衔接分子(SIRP1α-CD3)和治疗性分子(MMP9和抗PDL1-Fc)介导靶细胞杀伤的能力。简言之，如实施例13中所述，从Vero细胞制备了SIRP1α-CD3(SL)、SIRP1α-CD3(LL)、MMP9和抗PDL1-Fc蛋白。将50μL所得蛋白质样品在含有20％FBS的组织培养基中稀释。然后将稀释的蛋白质与活化的CD8+效应T细胞或NK效应细胞一起孵育并且与荧光标记的靶细胞以1∶1的靶标与效应物比例共培养18小时。在BD LSR Fortesa细胞计数器上通过流式细胞术评估靶细胞的细胞死亡。
这一实验的结果将证明病毒产生的SIRP1α-CD3衔接构建体和治疗性分子MMP9和抗PDL1-Fc能够指导T细胞和/或NK细胞介导的靶细胞杀伤。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和取代而不偏离本发明。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。以下权利要求书意图限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物意图由其涵盖。

Claims (77)

1.一种包含重组核酸的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸包含：
i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含：活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域对靶细胞上表达的细胞表面抗原具有特异性。
2.如权利要求1所述的假型化溶瘤病毒，其中所述抗原识别结构域特异性地结合至肿瘤抗原。
3.如权利要求2所述的假型化溶瘤病毒，其中肿瘤抗原是选自表2。
4.一种包含重组核酸的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸包含：
i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含：活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域结合至细胞表面上表达的抑制性抗原。
5.如权利要求4所述的假型化溶瘤病毒，其中所述治疗性分子结构域特异性地结合至PD1、PDL1或CD47。
6.如前述权利要求中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸还包含编码治疗性多肽的第二核酸序列。
7.如权利要求6所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸是多顺反子序列。
8.如权利要求7所述的假型化溶瘤病毒，其中所述多顺反子序列是双顺反子序列或三顺反子序列。
9.如权利要求7所述的溶瘤病毒，其中所述多顺反子序列包含微小核糖核酸病毒-2a样序列，并且其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列由存在于所述重组核酸中的单一启动子序列表达。
10.如权利要求6所述的溶瘤病毒，其中所述治疗性多肽是免疫调节剂多肽。
11.如权利要求10所述的溶瘤病毒，其中所述免疫调节剂多肽是选自细胞因子、共刺激分子、免疫检查点多肽、抗血管生成因子、基质金属蛋白酶(MMP)或核酸。
12.如权利要求11所述的溶瘤病毒，其中所述免疫检查点多肽包含
i)PD-1、PDL-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、神经纤毛蛋白或CCR4的抑制剂；
ii)GITR、OX-40或CD28的激动剂；或
iii)i)和ii)的组合。
13.如权利要求11所述的溶瘤病毒，其中所述MMP是MMP9。
14.如权利要求11所述的溶瘤病毒，其中所述细胞因子是选自IL-15、IL-12和CXCL10。
15.如前述权利要求中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其中所述效应细胞是T细胞、NKT细胞、NK细胞或巨噬细胞。
16.如前述权利要求中任一项所述的假型化溶瘤病毒，所述活化结构域特异性地结合至CD3、CD4、CD5、CD8、CD16、CD28、CD40、CD134、CD137或NKG2D。
17.一种包含重组核酸序列的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸序列包含：
i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含：活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及抗原识别结构域，所述抗原识别结构域对靶细胞上表达的肿瘤细胞抗原具有特异性，其中在所述效应细胞上表达的所述抗原是CD3，并且其中所述肿瘤细胞抗原是CD19。
18.如权利要求17所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：44至少90％相同的多肽序列。
19.如权利要求17所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：43。
20.如权利要求17所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-12。
21.如权利要求20所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：54至少90％相同的多肽序列。
22.如权利要求17所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-15。
23.如权利要求22所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：53至少90％相同的多肽序列。
24.如权利要求17所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是CXCL10。
25.如权利要求24所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：55至少90％相同的多肽序列。
26.如权利要求17所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是MMP9。
27.一种包含重组核酸序列的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸序列包含：
i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含：活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域对抑制性抗原具有特异性，其中在所述效应细胞上表达的所述抗原是CD3，并且其中所述抑制性抗原是PDL1。
28.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO：50至少90％相同的多肽序列。
29.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：49。
30.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-12。
31.如权利要求30所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：63至少90％相同的多肽序列。
32.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-15。
33.如权利要求32所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：62至少90％相同的多肽序列。
34.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是CXCL10。
35.如权利要求34所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：64至少90％相同的多肽序列。
36.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是MMP9。
37.如权利要求27所述的假型化溶瘤病毒，其中所述衔接分子还包含第三结合结构域。
38.如权利要求37所述的假型化溶瘤病毒，其中所述第三结合结构域包含免疫球蛋白Fc结构域。
39.如权利要求38所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：52至少90％相同的多肽序列。
40.如权利要求39所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：51。
41.一种包含重组核酸序列的假型化溶瘤病毒，所述重组核酸序列包含：
i)编码衔接多肽的第一核酸序列，其中所述衔接多肽包含：活化结构域，所述活化结构域对效应细胞上表达的抗原具有特异性；以及治疗性分子结构域，所述治疗性分子结构域对抑制性抗原具有特异性，其中在所述效应细胞上表达的所述抗原是CD3，并且其中所述抑制性抗原是SIRP1α。
42.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO：46或48至少90％相同的多肽序列。
43.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：45或47。
44.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-12。
45.如权利要求44所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：58或59至少90％相同的多肽序列。
46.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是IL-15。
47.如权利要求46所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：56或57至少90％相同的多肽序列。
48.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是CXCL10。
49.如权利要求48所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：60或61至少90％相同的多肽序列。
50.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是MMP9。
51.如权利要求50所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：65或66至少90％相同的多肽序列。
52.如权利要求41所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列还包含
ii)编码治疗性分子的第二核酸序列，其中所述治疗性分子是与IgG1 Fc结构域连接的抗PDL1 scFv。
53.如权利要求52所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列编码与SEQ ID NO：68或70至少90％相同的多肽序列。
54.如权利要求52所述的假型化溶瘤病毒，其中所述重组核酸序列包含SEQ ID NO：67或69。
55.如前述权利要求中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其中所述假型化溶瘤病毒是选自腺病毒、单纯疱疹病毒1(HSV1)、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MV)、拉沙病毒(LASV)或新城疫病毒(NDV)。
56.如权利要求1-54中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其中与参考病毒相比，所述假型化溶瘤病毒在人受试者中包含降低的亲神经性活性和/或神经毒性活性。
57.如权利要求56所述的假型化溶瘤病毒，其中所述参考病毒是i)非假型化溶瘤病毒，或ii)痘苗病毒。
58.如权利要求1-54中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其中所述假型化溶瘤病毒是减毒溶瘤病毒。
59.如权利要求1-58中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其包含单一重组核酸。
60.如权利要求1-58中任一项所述的假型化溶瘤病毒，其包含多种重组核酸。
61.如前述权利要求中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒选择性地感染靶细胞。
62.如权利要求61所述的溶瘤病毒，其中所述靶细胞是肿瘤细胞，并且其中所述溶瘤病毒能够在所述肿瘤细胞内选择性地复制。
63.如前述权利要求中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述病毒不是痘苗病毒。
64.如前述权利要求中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述衔接多肽是二分多肽并且包含抗体、抗体结构域、人免疫球蛋白重链可变结构域、双可变结构域抗体(DVD-Ig)、Tandab、双抗体、柔性抗体、对接锁定抗体、Scorpion多肽、单链可变片段(scFv)、BiTE、DuoBody、Fc工程化IgG、Fcab、Mab2或DART多肽。
65.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-64中任一项所述的假型化溶瘤病毒。
66.如权利要求65所述的药物组合物，其中所述假型化溶瘤病毒诱导免疫应答。
67.如权利要求66所述的药物组合物，其中免疫应答对靶细胞具有选择性细胞毒性。
68.如权利要求67所述的药物组合物，其中所述靶细胞是实体瘤细胞或血液癌症细胞。
69.如权利要求68所述的药物组合物，其中所述靶细胞表达一种或多种肿瘤抗原。
70.如权利要求69所述的药物组合物，其中所述一种或多种肿瘤抗原是选自表2。
71.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求1-54中任一项所述的溶瘤病毒或如权利要求65-70中任一项所述的药物组合物。
72.如权利要求71所述的方法，其还包括向所述有需要的受试者施用一种或多种另外的疗法。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述一种或多种另外的疗法包括外科手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或它们的组合。
74.一种治疗有需要的受试者的一种或多种肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的如权利要求1-54中任一项所述的溶瘤病毒或如权利要求65-70中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或多种肿瘤表达肿瘤抗原。
75.一种针对治疗选择患者的方法，所述方法包括：
a)确定源自所述患者的一种或多种肿瘤细胞上肿瘤抗原的表达；以及
b)如果从所述患者获得的所述肿瘤细胞表达一种或多种肿瘤抗原，则施用如权利要求1-54中任一项所述的溶瘤病毒或如权利要求65-70中任一项所述的药物组合物。
76.如权利要求74或权利要求75所述的方法，其中所述一种或多种肿瘤抗原是选自表2。
77.一种将衔接多肽和治疗性多肽递送至肿瘤部位的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求1-54中任一项所述的溶瘤病毒或如权利要求65-70中任一项所述的药物组合物。
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