CN101203530A

CN101203530A - 关于脊髓损伤疼痛的外周递送的谷氨酸脱羧酶基因治疗

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Publication number: CN101203530A
Application number: CNA2005800447832A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫·C·格格廖索; 戴维·J·芬克; 达瑞恩·沃尔夫; 戴维·克里斯基
Original assignee: US OF ANERICA REPRESENTED BY T; University of Pittsburgh
Current assignee: US OF ANERICA REPRESENTED BY T; University of Pittsburgh
Priority date: 2004-10-28
Filing date: 2005-10-28
Publication date: 2008-06-18
Also published as: KR20070100241A; US7531167B2; US20070178069A1; WO2006050211A3; EP1805213A2; EP2377882A1; AU2005302408A1; US20140256801A1; US8309349B2; US20070207124A1; US20090238807A1; WO2006050211A2; JP2008518599A; EP1805213B1; AU2005302408B2

Abstract

本发明提供一种载体，优选单纯疱疹病毒(HSV)载体，其包括编码谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列。本发明还提供这样的载体的储液以及包括这样的载体的药物组合物。本发明还提供治疗哺乳动物中的疼痛诸如脊髓损伤疼痛的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效治疗脊髓损伤疼痛的量的包括编码谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白的核苷酸序列的载体。

Description

关于脊髓损伤疼痛的外周递送的谷氨酸脱羧酶基因治疗

关于联邦政府资助的研究与开发的陈述

本发明部分是在由United States National Institute of NeurologicalDisorders and Stroke和来自Department of Veterans Affairs的研究资助授予的授权号NS044507，NS38850和NS43247的政府支持下进行的。美国政府可以拥有本发明中的某些(certain)权利。

发明领域

本发明涉及用于治疗疼痛的方法和组合物。

发明背景

脊髓损伤后的疼痛是不利地影响生活质量并且阻碍有效的康复的重要问题。几乎患有脊髓损伤(SCI)的每一名患者都患有SCI疼痛。SCI疼痛可以在损伤平面(level)或在损伤平面以下。对于每个人，疼痛在强度、频率、发作持续时间和经历的疼痛类型上不同。经历的疼痛类型已经被患者描述为麻刺感、麻木、疼痛、悸痛、灼痛或压痛。它通常描述在具体的机体区域并且发生在机体的一侧或两侧。它可以是持续的或断续的，并且与机体姿势或活动无关。

慢性SCI疼痛可以在脊髓损伤时发生，或者在SCI后缓慢地发展几个月或几年的时间。慢性SCI疼痛持续长期的时间，并且通常对常规疼痛治疗反应不好。根据一些报道，多达90％的患有SCI的人还经历了慢性SCI疼痛。对于患者，SCI疼痛的水平可以从只是小烦恼到难以忍受的范围。已经描述了SCI后的两类慢性疼痛。平面(at-level)神经性SCI疼痛是指在脊髓损伤位点附近的皮区。平面以下(below-level)神经性SCI疼痛是指在脊髓损伤位点平面以下的皮区。前者通常在脊髓损伤的早期阶段存在，并且随着时间过去而减轻，而后者逐渐发展，并且通常是药物治疗难以控制的。脊髓损伤后的慢性SCI疼痛是不利地影响生活质量并且阻碍有效的康复的重要问题。

SCI疼痛可以分类为肌肉骨骼或神经性疼痛。肌肉骨骼SCI疼痛由于机体组织诸如骨骼、关节和肌肉的过度使用引起。它通常随着运动而加重，并且随着休息而减轻。

神经性SCI疼痛可能是由于神经系统对于疼痛的正常感觉的异常处理引起。例如，脊髓和大脑可以另外将正常感觉认为是疼痛。损伤平面的神经性SCI疼痛可能是由于对真实神经根的损伤或者对脊髓本身的损伤引起。医生和其它保健专家可以将这叫作“部分传入神经阻滞(segmentaldeafferentiation)”或“带区疼痛(girdle zone pain)”。这种类型的神经性SCI疼痛通常是两侧的，并且按照圆周模式，例如，从你的胃部环绕到你的背部。如其它类型的慢性疼痛，这可以在初始脊髓损伤后的刚开始的几周内发展，或者可以随着时间更加缓慢地发展。损伤平面以下的发散性神经性SCI疼痛可能是由于已经发生在中枢神经系统的实际损伤引起。这种SCI神经性疼痛通常与异常性疼痛(来自通常不是疼痛的事物的疼痛，例如，光接触)或痛觉过敏(由通常引起轻微疼痛的事物引起的极度疼痛，例如，大头针刺痛)有关。

再现这种临床病症的主要特征的动物模型的建立已经允许鉴定损伤的脊髓中的神经化学变化。在一种模型SCI模型中，实验室大鼠经受在T13的脊髓的侧半切断。实验室大鼠在T13脊髓的侧半切断在双后肢半切面以下产生两侧疼痛-相关的行为。SCI模型提供了检测SCI疼痛新型治疗的独特的动物模型。

在SCI后报道了脊髓中γ-氨基丁酸(GABA)-ergic抑制机制的机能减退和降钙素基因相关肽(CGRP)的增加。在突触前和突触后都作用的GABA-介导的抑制作用，发挥对初级传入神经和次级脊髓丘脑束状神经元(second-order spinothalamic tract neurons)之间疼痛神经传递的增强调控作用。脊髓GABA-ergic神经传递的药理拮抗作用导致与在神经性SCI疼痛中发现的相似的机械性超敏反应。GABA激动药物(例如，巴氯芬)核准用于选择性神经性疼痛综合征的治疗，但是中枢神经系统中GABA受体的普遍分布导致副作用，其加强了对施用巴氯芬的严重限制，即使当鞘内施用时，也是如此。

先前已经证明，通过皮下接种递送的基于重组单纯疱疹病毒(HSV)的载体可以用来表达所选的背根神经节(DRG)的神经元中的神经递质。构建表达脑啡肽原的HSV载体在炎症疼痛、神经性疼痛和由骨骼癌症引起的疼痛的啮齿动物模型中产生局部疼痛-减轻作用。通常观察到SCI疼痛抗阿片样物质治疗，但是它可以应答鞘内巴氯芬。

其它的研究已经证明，加工包含编码GAD基因的腺伴随病毒或疱疹扩增子载体可以用来在转导细胞中表达GABA。然而，这些研究中的载体是直接注射到大脑神经核中，但是不是用于疼痛模型或实验。

目前，对于SCI疼痛没有始终成功的药物或手术治疗。目前的SCI疼痛治疗包括阿片样物质和神经药物治疗。对于这些治疗的反应率通常受到副作用的限制。不幸地，神经性SCI疼痛通常不对阿片样物质(例如，吗啡)反应。在一些情形中，SCI疼痛也不与神经性药物治疗(例如，某些抗惊厥药物或抗抑郁药物)反应。一些医生推荐可以使得疼痛区域麻木的神经根阻断剂。这种麻木作用只持续短时间。有时推荐另一种方法，进行手术途径，诸如DREZ(背根进入区(dorsal root entry zone))、脊神经根切断术或脊髓前侧柱切断术。这些方法最终使得SCI疼痛水平升高，并且长期可能加重神经性SCI疼痛。

外周神经性疼痛是另一种常见的并且难以治疗的多神经病或结构神经损伤的并发症。阿片样物质相对无效，并且它们的应用受到副作用的限制。已经证明，抗抑郁药物和抗惊厥药物在随机控制的试验中有效，但是在不到一半的治疗患者中只提供50％的减轻作用。在神经性疼痛中潜在的复杂机制中，局部神经损伤导致脊髓中GABAergic抑制性突触电流的选择性丢失，这引起异常疼痛敏感性和神经性疼痛综合征的表型特征。由于这些试剂的治疗机会不多，并且剂量受到副作用的限制，所以GABAergic试剂还没有广泛用于治疗神经性疼痛。

因此，存在对于治疗SCI和神经性疼痛的治疗方法的需求。

发明简述

本发明提供一种载体，优选地单纯疱疹病毒(HSV)载体，其包括编码谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列。本发明还提供这样的载体的储液和包括这样的载体的药物组合物。本发明还提供治疗哺乳动物中的疼痛诸如脊髓损伤疼痛或外周神经性疼痛的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效治疗脊髓损伤疼痛的量的包括编码谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白的核酸序列的载体。这些优点，以及其它的创造性特征将从本发明的下述描述和附图中显而易见。

附图简述

图1是可以用于本发明的示例性载体构建体的图示。

图2是QHGAD67转导的图示，其通过爪垫接种增加腰部背根神经节(DRG)中的GAD67mRNA。在皮下接种30μl1×10⁹pfu/ml QHGAD67或Q0ZHG到一个后爪后一周，从收集的L4-L6DRG中提取总RNA(500ng)，通过实时PCR扩增，并且使用GAPDH作为标准物进行定量。描述了相对于Q0ZHG-转导的神经节的量。平均值±标准误差平均值(SEM)，N＝6。

图3表示来自腰部脊髓的背象限区的蛋白，其通过使用β-肌动蛋白作为内部标准物的蛋白质印迹而确定，并且通过相对光学密度进行定量。平均值±SEM，N＝6，^*P＜0.05。在转导QHGAD67后增加了GAD67-样免疫反应性。

图4A图示与对照或Q0ZHG-感染的细胞相比较，在QHGAD67-感染的细胞中基本上增加的γ氨基丁酸(GABA)的量，γ氨基丁酸释放于以感染复数(m.o.i.)1体外转导的初级DRG神经元。如在材料和方法中所述那样，通过HPLC确定5min释放的GABA。GABA浓度/孔的检测进行3次，并且对于每种情况使用一式三份样品。平均值±SEM，^*P＜0.01对Q0HG或赋形剂(vehicle)。图4B图示在体内从脊髓神经末梢释放的GABA的量，其通过HPLC在背角质的微量透析液中确定。在皮下接种30μl1×10⁹pfu/ml QHGAD67到一个后爪后一周，与对照动物相比，在QHGAD67-接种的动物中，GABA的量(pmol/10μl微量透析液的级分)基本上增加了。平均值±SEM，N＝6，^*P＜0.05。

图5A-D图示机械性异常性疼痛和热痛觉过敏通过QHGAD67接种显著减少。图5A和5B显示，在半切断后一周，在爪退缩阈值(机械性异常性疼痛)中存在减小，在赋形剂-处理的动物(x)中，其持续了15周。用QHGAD67接种产生由增加的阈值所(空心圆圈)反映的抗异常性疼痛作用。初始接种后7周，QHGAD67的抗异常性疼痛作用减小，但是将QHGAD67重新接种到同一动物中重新建立了抗异常性疼痛作用(^*P＜0.05，^**P＜0.01对Q0ZHG-接种的，N＝6)。相对于半切断，(A)在身体同侧和(B)在身体对侧。图5C和5D显示，在半切断后一周，在爪退缩潜伏期(热痛觉过敏)中存在显著减少，并且注射载体导致爪退缩潜伏期的显著增加(空心圆圈)。初始接种后7周，QHGAD67的抗痛觉过敏作用减小，但是重新接种QHGAD67重新建立了抗痛觉过敏作用(^*P＜0.05，^**P＜0.01对Q0ZHG-接种的，N＝6)。相对于半切断，(C)在身体同侧和(D)在身体对侧。在所有情形中(A-D)，Q0ZHG-接种的动物(空心三角形)与载体-处理的对照动物没有区别。

图6A和6B显示在半切断后3周和爪垫接种后2周鞘内施用比枯枯灵碱(0.5μg)或phaclofen(0.8μg)部分地逆转了载体接种的(A)抗异常性疼痛和(B)抗痛觉过敏作用。点线表示用对照载体或赋形剂接种的SCI后动物中的平均阈值(A)和潜伏期(B)。平均值±SEM，N＝6，^*P＜0.05，^**P＜0.01对赋形剂-处理的。

图7是背角质中CGRP-样免疫反应性的相对光学密度测定的柱状图。相对光学密度测定取自每只动物L5部分中的一系列6个连续切片。点线表示，在用赋形剂或Q0ZHG接种的动物中相对于T13半切断，在身体同侧和身体对侧，正常脊髓中的CGRP-IR密度都基本上增加了，并且用QHGAD67接种显著地消弱了这种增加。与赋形剂或Q0ZHG相比，平均值±SEM，N＝6，^*P＜0.051。

图8描述本文讨论的SEQ ID NO：1。

图9描述本文讨论的SEQ ID NO：2。

图10描述本文讨论的SEQ ID Nos：3-8。

图11(a)和11(b)描述证明QOGAD67在神经性疼痛中的防感受伤害作用的数据。(A)L5脊神经连接(SNL)引起对触觉刺激阈值的显著减小，其持续了4个多月。QHGAD67的皮下接种(箭头)产生了以机械性阈值的增加为反映的抗异常性疼痛作用。在初始接种后7周重新接种QHGAD67(箭头)重新建立了抗异常性疼痛作用。结果表示为平均值±平均值的标准误差。(空心圆圈)QHGAD67；(实心圆圈)QOZHG；^*p＜0.05；^**p＜0.01；n＝8只动物每组。(B)L5SNL还引起显著的热痛觉过敏，其持续6周。用QHGAD67接种(箭头)，而不是QOZHG，逆转了由脊神经损伤诱导的热痛觉过敏。^*p＜0.05；^**p＜0.01相对QOZHG-接种的；n＝8只动物每组。差异的统计学显著性通过变量分析(StatView 5.2；SAS Institute，Cary，NC)确定，使用Scheffe′sF检验校正尤其是(hoc)比较后的数目。

图12是描述关于QHGAD67对背角质中Fos-LI的作用的数据的柱状图。脊神经连接(SNL)后1周并且在2周后(SNL后3周)检测，通过10分钟温和的触觉刺激诱导的背角质中的Fos-LI在用QOZHG接种的大鼠中显著地增加。(SNL)后1周并且在2周后(SNL后3周)检测，在用QHGAD67接种的具有SNL的大鼠中，这种增加被阻滞，并且它在背角质的I-VI层中发现。结果表示为平均值±平均值的标准误差。^**p＜0.01；n＝5只动物每组。假-手术和用QOZHG接种的SNL动物之间的差异也是统计学显著的(p＜0.01)。

图13图示关于QHGAD67对磷酸化胞外信号-调控激酶1和2(p-ERK1/2)在背角质中表达的作用的数据。结果表示为平均值±平均值的标准误差。^**p＜0.01；^***p＜0.001；n＝5只动物每组。

图14描述具有ICP4和ICP27基因座的延长缺失和UL55缺失的HSV载体的构建。

发明详述

本发明提供包括编码谷氨酸脱羧酶蛋白的多聚核苷酸序列的载体。所述载体可以是任何适宜的基因转移载体。适宜的载体的实例包括质粒、脂质体、分子缀合物(例如，运铁蛋白)、以及病毒。优选地，所述载体是病毒载体。适宜的病毒载体包括，例如，反转录病毒载体、基于疱疹病毒的载体和基于细小病毒的载体(例如，基于腺伴随病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体)。本领域的普通技术人员具有必需的理解以确定用于具体情形的适当载体。

在一个优选的实施方案中，所述载体是基于疱疹病毒的载体，诸如基于HSV的载体。基于HSV的病毒载体适于用作将核酸序列引入众多细胞类型的载体。成熟的HSV病毒体由包膜的二十面体衣壳组成，所述衣壳具有由152kb的线性双链DNA分子组成的病毒基因组。在一个优选的实施方案中，基于HSV的病毒载体缺失至少一种必需HSV基因。当然，所述载体可以备选地或者另外删除非必需基因。优选地，缺失至少一种必需HSV基因的基于HSV的病毒载体是复制缺陷型的。大部分复制缺陷型HSV载体含有去除一种或多种中间-早期(intermediate-early)、早期或晚期HSV基因的删除以防止复制。例如，HSV载体可以缺失选自由下列各项组成的组的早早期基因(immediate early gene)：ICP4，ICP22，ICP27，ICP47以及它们的组合。HSV载体的优点是它们进入可以导致长期DNA表达的潜伏期的能力，以及它们可以容纳高达25kb的外源DNA插入片段的大的病毒DNA基因组。例如，基于HSV的载体在美国专利5,837,532，5,846,782，5,849,572和5,804,413，以及国际专利申请WO 9I/02788，.WO96/04394，WO 98/15637和WO 99/06583中描述，它们通过参考结合于此。优选地，HSV载体是“多缺陷型的”，意指所述HSV载体缺失多于一种的病毒复制所需要的基因功能。HSV的序列可从互联网www.ncbi.nlm.nih.gov：80/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝nucleotide&list_uids＝9629378&dopt＝GenBank&term＝hsv-1&qty＝1上获得，其可以辅助在设计的载体中产生需要的突变。

HSV载体可以只缺失HSV基因组早期区域的复制-必需的基因功能，只缺失HSV基因组早早期区域的复制-必需的基因功能，只缺失HSV基因组晚期区域的复制-必需的基因功能，或者缺失HSV基因组早期和末期区域的复制-必需的基因功能。HSV载体还可以使得基本上整个HSV基因组被移除，在这种情形中，优选地至少病毒反向末端重复(ITRs)和一种或多种启动子，或者病毒ITRs和包装信号保持完好(即，HSV扩增子)。移除的HSV基因组区域越大，可以插入到所述基因组的外源核酸序列片段就越大。然而，优选本发明的载体应该是非扩增子HSV载体。

应该理解，HSV载体的不同区域的缺失可以改变哺乳动物的免疫应答。特别地，不同区域的缺失可以减少由HSV载体产生的炎性反应。此外，可以修饰HSV载体的蛋白外壳，以减少HSV载体被针对野生型蛋白外壳的中和抗体识别的能力或无能。

当多种复制缺失时，HSV载体优选地包括间隔元件，以在类似于通过单一复制缺陷型HSV载体获得的细胞系的互补细胞系中提供病毒生长。所述间隔元件可以包含理想长度的任何一种或多种核酸序列。关于HSV基因组，所述间隔元件序列可以是编码的或不编码的以及天然的或非天然的，但是没有恢复缺失区域的复制必需功能。另外，在任何或全部缺失HSV区域包含间隔元件将减小HSV载体容纳大插入片段的能力。HSV载体的产生包括应用本领域公知的标准分子生物学技术。

复制缺陷型HSV载体典型地在互补细胞系中产生，所述互补细胞系以适当的水平提供复制缺陷型HSV载体中不存在但是病毒增殖需要的基因功能，以产生高滴度的病毒载体储液。优选的细胞系与复制缺陷型HSV载体中不存在的至少一种复制必需基因功能互补，并且优选地与所有复制必需基因功能互补。所述细胞系还可以互补非必需基因，当所述非必需基因丢失时，其可以减少生长或复制效率(例如，UL55)。互补细胞系可以互补于由早期区域、早早期区域、晚期区域、病毒包装区域、病毒-相关区域、或它们的组合所编码的至少一种复制必需基因功能的缺陷，其包括所有的HSV功能(例如，使得包括最少的HSV序列诸如只有反向末端重复和包装信号或者只有ITRs和HSV启动子的HSV扩增子能够增殖)。所述细胞系优选地还是特征在于，它以不与HSV载体重叠的方式包含互补基因，这最小化并且部分地消除了HSV载体基因组与细胞DNA重组的可能性。因此，如果在载体储液中不能避免的话，能够复制的HSV的存在减到最小，因而它适用于某些治疗目的，特别是基因治疗目的。互补细胞系的构建包括本领域公知的标准分子生物学和细胞培养技术。

当所述载体是复制缺陷型HSV时，编码蛋白(例如，GAD蛋白)的核酸序列优选地位于必需HSV基因的基因座上，更优选地位于HSV基因组的ICP4或ICP27的基因座上。将核酸序列插入到HSV基因组(例如，HSV基因组的ICP4或ICP27基因座)可以由已知方法促成，例如，通过在给定的HSV基因组位置引入独特的限制性位点。

用于本发明情形的优选的HSV载体包含延伸的ICP4，或ICP27缺失体，并且优选地包含两者。在这种情形中“延伸的”缺失体，意指所述优选的载体相对于用于它们生产的互补细胞系在这些基因座中的任一个或两者都没有同源序列。理想地，所述病毒没有剩余的ICP4或ICP27(或两者)编码或启动子序列。优选地，ICP27中的缺失还延伸到UL55基因座，并且理想地，两种基因都被删除。因此，用于本发明的最优选的病毒包含在ICP4、ICP27和UL55中的延伸的缺失，以致与用于互补细胞系的这些基因没有病毒同源性。理想地，所述载体还不包括与互补细胞系中所用的序列同源的任何DNA序列(例如，甚至使用不同的调控序列和多聚腺苷化序列)。

如上文所述，与从HSV载体中删除的基因的功能特别是必需基因的基因功能互补的细胞系对于复制载体是理想的(并且在必需HSV基因的情形中，是必需的)。因此，为了应用缺少ICP4和ICP2两者的优选的载体，应该应用加工成与两种必需基因互补的细胞系。此外，由于UL55^-HSV毒株生长不好，所以，当它从载体骨架中删除时，理想地应用与其互补的细胞系。产生互补细胞系的方法是本领域的普通技术人员已知的。

如上文所述，所述本发明的载体还包括编码GAD蛋白的核酸序列(即，一种或多种编码一种或多种GAD蛋白的核酸序列)。编码GAD蛋白的核酸序列可以从任何来源获得，例如，从天然的分离，合成产生，从遗传加工的生物体分离等。普通技术人员应该理解，可以插入到载体中的任何类型的核酸序列(例如，DNA，RNA和cDNA)可以与本发明联系应用。

所述本发明载体的核酸序列可以编码分泌蛋白，例如，由感染的细胞天然分泌的蛋白。备选地，所述核酸序列可以编码蛋白，诸如GAD，其通过在细胞内的酶促催化作用而产生分泌产物(例如，GABA)或肽。备选地，所述核酸序列可以编码不是由细胞天然分泌的蛋白(即，非分泌蛋白)，但是其包括促使蛋白分泌的信号肽。以这种方式，例如，所述核酸序列编码内质网(ER)定位信号肽和非分泌蛋白。ER定位信号肽作用是将DNA、RNA和/或蛋白导向内质网膜上，其中蛋白被表达并且靶向进行分泌。ER定位信号肽理想地作用是增加细胞分泌(即，分泌潜力)下列各项：(i)通常不是由细胞分泌的(即，分泌型)蛋白，和/或(ii)通常由细胞分泌但是以低量(即，低于需要的量)分泌的蛋白。由所述多聚核苷酸编码的ER定位信号肽可以是任何适宜的ER定位信号肽或多肽(即，蛋白)。例如，由核酸序列编码的ER定位信号肽可以是选自由下列各项组成的组的肽或多肽(即，蛋白)：神经生长因子(NGF)、免疫球蛋白(Ig)(例如，Igκ链前导序列)、和中期因子(MK)、或其片段。适宜的ER定位信号肽还包括Ladunga，Current Opinions in Biotechnology，11，13-18(2000)中所描述的那些。

尽管所述核酸序列可以编码任何蛋白，但是所述蛋白优选地是GAD蛋白或脑啡肽。存在一些由一些不同的基因编码的哺乳动物GAD的同种型，具体地为GAD25、GAD65和GAD67。GAD65，主要靶向膜和神经末梢，受到吡哆醛-5-磷酸和其它辅因子的调控。认为GAD65在制备突触释放中负责将GABA包装成小泡。另一种哺乳动物GAD的同种型GAD67主要是在细胞质中，并且其酶促活性似乎受蛋白水平的调控。GAD25是GAD67的备选剪接的变体。所述载体优选地包括编码GAD67的核酸序列。人GAD67基因的编码序列和所编码的基因产物(即，所编码的蛋白)的氨基酸序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网址上分别作为GenBank登记号NM 000817(SEQ ID NO：1)和NP 000808(SEQ ID NO：2)而可以公共获得。类似地，人脑啡肽基因的编码序列和所编码的基因产物(即，所编码的蛋白)的氨基酸序列作为GenBank登记号NM 006211可以公共获得。

所述核酸序列可以编码前面提及的蛋白的任何变体、同系物或功能片段。所述蛋白的变体可以包括来自相应的天然存在的蛋白的一个或多个突变(例如，点突变、缺失、插入等)。“天然存在”意指所述蛋白可以在自然界中找到，并且没有进行合成修饰。因此，在将突变引入到编码所述蛋白的核酸序列中的情形中，这样的突变理想地将影响所编码的蛋白中的取代，其中编码正电荷残基(H、K和R)的密码子用编码正电荷残基的密码子取代，编码负电荷残基(D和E)的密码子用编码负电荷残基的密码子取代，编码中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)的密码子用编码中性极性残基的密码子取代，以及编码中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)的密码子用编码中性非极性残基的密码子取代。另外，蛋白的同系物可以是任何肽、多肽或其片段，其与所述蛋白在氨基酸水平上有大于约70％的相同性(优选地大于约80％的相同性，更优选地大于约90％的相同性，并且更优选地大于约95％的相同性)。氨基酸相同性的程度可以使用本领域已知的任何方法确定，诸如BLAST序列数据库。“功能片段”是在检测水平上保留天然存在的、全长GAD蛋白的生物活性的GAD蛋白的任何部分。通过表达所述载体的核酸序列而产生的GAD蛋白的功能片段可以使用标准分子生物学和细胞培养技术进行鉴定，诸如在瞬时转染编码GAD蛋白片段的核酸序列的人细胞中检测所述GAD蛋白片段的生物活性而进行鉴定。

编码所述蛋白的核酸序列的表达受到可操作性地连接到所述核酸序列上的适当的表达控制序列的控制。“表达控制序列”是促进、增强或控制另一种核酸序列表达(典型地和优选地是转录)的任何核酸序列。适宜的表达控制序列包括组成型启动子、可诱导的启动子、抑制性启动子和增强子。在载体中编码所述蛋白的核酸序列可以受到其内源启动子的调控，或者优选地受到非内在的启动子序列的调控。适宜的非内在的启动子的实例包括人巨细胞病毒(HCMV)启动子，诸如HCMV早早期启动子(HCMVIEp)、来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子诸如HIV长末端重复启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子诸如RSV长末端重复、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、Lap2启动子、或疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等.，Proc.Natl.Acad.Sci，78，144-145(1981))、来源于SV40或埃巴病毒的启动子等。在一个优选的实施方案中，所述启动子是HCMVIEp。HCMV IEp启动子可以插入到重组HSV的ICP4基因座。备选地，编码所述蛋白的核酸序列的表达可以受嵌合启动子序列的控制。如果它包括获自、源于、或者基于至少两种不同来源(例如，一种生物体基因座的两个不同区域、两种不同的生物体或与合成序列组合的生物体)的至少两种核酸序列片段，那么启动子序列是“嵌合的”。可操作性地将序列连接到一起的技术在本领域是公知的。

所述启动子可以是可诱导的启动子，即，应答适当的信号进行上调和/或下调的启动子。例如，由药剂上调的表达控制序列特别用于疼痛处理应用。例如，所述启动子可以是药物-诱导的启动子(例如，应答四环素)。这样的启动子的实例在市场上由Ariad销售。所述启动子可以通过本领域已知的方法引入到载体的基因组中，例如，通过在基因组的给定区域引入独特的限制性位点进行。备选地，可以插入所述启动子，作为包括编码蛋白诸如GAD的核酸序列的表达盒的部分。在一个优选的实施方案中，所述可诱导的启动子可操作性地连接到编码GAD蛋白的多聚核苷酸序列上。

优选地，编码蛋白的核酸序列还包括转录-终止区域，诸如位于编码所述蛋白的区域的3′的多聚腺苷化序列。可以使用任何适宜的多聚腺苷化序列，包括合成的最优化序列，以及下列各项的多聚腺苷化序列：BGH(牛生长素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(埃巴病毒)、和乳头瘤病毒包括人乳头瘤病毒和BPV(牛乳头瘤病毒)。

除了编码蛋白的核酸(包括启动子和转录-终止区)，所述载体可以包括编码至少一种其它基因产物的至少一种其它的核酸序列，例如其本身行使预防或治疗功能，或者增加或增强所述蛋白的预防或治疗潜力。由其它核酸序列编码的基因产物可以是具有需要的活性的RNA、肽或多肽。如果所述其它核酸序列赋予预防或治疗益处，那么所述核酸序列可以在RNA或蛋白水平上行使其功能。备选地，所述其它核酸序列可以编码反义分子、核酶、影响剪接或3′加工(例如，多聚腺苷化)的蛋白、或影响细胞内另一种基因的表达水平(即，其中广泛认为基因表达包括从转录起始到产生加工蛋白的所有步骤)的蛋白，诸如通过调控mRNA累积或转运的变化速率或者转录后调控的改变而进行。其它的核酸序列可以编码赋予预防或治疗益处的许多基因产物中的任何一种，这取决于组合物的想要的最终用途。与由载体的核酸序列编码的蛋白相比，所述其它的核酸序列还可以编码作用于不同靶点的因子，因而提供多因子的治疗。所述其它核酸序列可以编码嵌合蛋白用于组合治疗。其它基因产物可以是被分泌的，或者保留在细胞内，在细胞内，除非或者直到细胞裂解它才产生。许多基因产物可以增强所述载体的治疗潜力。

所述其它核酸序列可以编码一种基因产物或多种基因产物。备选地，每种编码一种或多种基因产物的多种其它核酸序列，可以插入到载体中。在每种情形中，基因产物的表达可以独立地受各自的表达控制序列的调控，或者同时受一种共有表达控制序列的调控。备选地，其它核酸的表达可以由同一表达控制序列调控，所述同一表达控制序列调控由载体的核酸序列编码的蛋白的表达；然而，可以消除在编码所述蛋白的核酸中存在的任何转录终止区，以允许所述其它核酸序列的连读转录。所述其它核酸序列可以包括本文所讨论的任何适宜的表达控制序列和任何适宜的转录-终止区，其与所述载体的核酸序列表达而产生的蛋白的表达相联系。

在产生所述载体后，将所述载体纯化。载体纯化增加所述载体在组合物中的浓度，这可以通过任何适当的方法实现，诸如通过密度梯度纯化，通过层析技术，或者有限稀释纯化而进行。将所述载体，优选地复制缺陷型HSV载体，理想地从感染复制缺陷型HSV载体的细胞中纯化，纯化使用包括将感染HSV载体的细胞裂解并且收集含有HSV载体的级分的方法进行。

可以使用任何适当的方法裂解细胞，诸如暴露于去污剂、冷冻-解冻以及细胞膜破裂(例如，通过弗氏压碎器或微观流体化作用)。然后，任选地使用任何适当的方法诸如温和的离心、过滤或切向流过滤(TFF)，将细胞裂解物澄清化，以去除大块的细胞碎片。然后，任选地将澄清的细胞裂解物用能够消化DNA和RNA的酶(″DNase/RNase″)处理，以去除澄清的细胞裂解物中不包含在载体颗粒中的任何DNA或RNA。

一般地，当可以将足够的病毒递送到细胞群以保证所述细胞面临预先确定数量的病毒时，本发明的重组HSV是最有用的。因此，本发明提供一种储液，优选地一种均匀的储液，其包括本发明的HSV载体。HSV储液的制备和分析在本领域内是公知的。例如，病毒储液可以在包含用HSV载体转导的细胞的摇瓶中制备。然后，可以在连续的尼可登梯度上纯化所述病毒储液，并且等分和保存直到需要时。病毒储液在滴度上变化很大，这主要取决于病毒的基因型和用于制备它们的流程和细胞系。优选地，这样的储液具有至少约10⁵个蚀斑形成单位(pfu)，诸如至少约10⁶pfu，或者甚至更优选地至少约10⁷pfu的病毒滴度。在更优选的实施方案中，滴度可以至少约10⁸pfu，或者至少约10⁹pfu，并且最优选至少约10¹⁰pfu或者至少约10¹¹pfu的高滴度储液。

本发明另外提供一种组合物，所述组合物包括HSV载体(vector)和媒介物(carrier)，优选地生理学可接收的媒介物。所述组合物的媒介物可以是用于载体的任何适宜的媒介物。所述媒介物典型地将是液体，而且可以是固体、或液体和固体成分的组合。所述媒介物理想地是药用(例如，生理学上或药物学上可接受的)媒介物(例如，赋形剂或稀释剂)。药用媒介物是公知的，并且容易获得。媒介物的选择将至少部分地由具体的载体和用于施用所述组合物的具体的方法所确定。所述组合物还包括任何其它适宜的成分，特别用于增强所述组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，存在本发明组合物的广泛种类的适宜的制剂。下述制剂和方法只是示例性的，并且决不是限制性的。

适于肠胃外施用的制剂包括水性的和非水性的、等渗的无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使得所述制剂与目的受体的血液等渗的溶质，以及水性的和非水性的无菌混悬液，其可以包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所述制剂可以以单位剂型或多剂型密封容器诸如安瓿和小瓶存在，并且可以以冷冻-干燥(冻干)状态保存，在使用之前，只需要立即加入无菌液体赋形剂如水就可用于注射。临时注射溶液和混悬液可以从先前所述的类型的无菌粉剂、粒剂和片剂制备。

另外，所述组合物可以包括其它治疗的或生物活性剂。例如，可以存在用于具体指征治疗的治疗因子。控制炎症的因子，诸如布洛芬或类固醇，可以是组合物的成分，以减少与体内施用所述载体以及生理窘迫有关的肿胀和炎症。免疫系统抑制剂可以与所述组合物方法一起施用，以减少针对所述载体本身的或者与疾病相关的任何免疫反应。备选地，所述组合物可以包含免疫增强剂，以上调机体针对疾病的自然防御。

可以存在抗生素，即，杀微生物剂和杀真菌剂，以减少与基因转移步骤相关的感染以及其它疾病的危险。

本发明还提供在哺乳动物中治疗脊髓损伤疼痛或外周神经性疼痛的方法，所述方法包括给哺乳动物施用本发明的载体或组合物，所述载体或组合物包括有效治疗脊髓损伤疼痛或外周神经性疼痛的量的编码谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，所施用的载体是病毒载体。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。

治疗脊髓损伤疼痛或外周神经性疼痛的方法还可以包括其它治疗和/或药剂的施用(即，施用前、同时施用和/或施用后)以改进(例如，增强)所述方法的效用。本发明的方法还可以包括施用局部或全身性地改变(即，消除或增强)所述组合物对宿主的作用的其它物质。例如，消除通过在宿主中表达所述载体的核酸序列而产生的蛋白的任何全身性作用的物质可以用来控制在宿主内的全身性毒性水平。类似地，增强通过在宿主中表达所述载体的核酸序列而产生的蛋白的局部作用的物质可以用来减少在宿主中产生预防性或治疗性作用所需要的蛋白的水平。这样的物质包括拮抗剂，例如，可溶受体或针对通过表达所述载体的核酸序列而产生的蛋白的抗体，以及所述蛋白的激动剂。

本领域的技术人员应该理解，给动物(特别是人)施用本发明的创造性载体和组合物用于治疗或预防目的如基因治疗、接种等(参见，例如，Rosenfeld等，Science，252，431-434(1991)，Jaffe等，Clin.Res.，39(2)，302A(1991)，Rosenfeld等.，Clin.Res.，39(2)，311A(1991)，Berkner，BioTechniques，6，616-629(1988))的适当方法是可用的，并且，尽管不止一种途径可以用来施用所述组合物，但是，一种特别的途径可以提供比另一种途径更直接的和更有效的反应。优选的施用途径包括通过外周接种转导DRG神经元，以在背角质中释放GABA。在许多实施方案中，这可以通过皮下接种递送GAD载体而实现，这是所述治疗SCI疼痛或外周神经性疼痛的创造性方法的吸引人的特征。

在本发明的情形中，施用给动物特别是人的剂量将随着具体的载体、含有所述载体和其媒介物(如上文所述)的组合物、施用的方法、以及具体的位点和要治疗的生物体而不同。所述剂量应该足以在理想的时限内引发理想的反应，例如，治疗性或预防性反应。因此，所述本发明组合物的载体的剂量典型地为大约1×10⁵或更多颗粒单位(例如，大约1×10⁶或更多颗粒单位、大约1×10⁷或更多颗粒单位，1×10⁸或更多颗粒单位、1×10⁹或更多颗粒单位、1×10¹⁰或更多颗粒单位、1×10¹¹或更多颗粒单位、或者大约1×10¹²或更多颗粒单位)。载体的剂量典型地将不是1×10¹³或更少的颗粒单位(例如，4×10¹²或更少的颗粒单位、1×10¹²或更少的颗粒单位、1×10¹¹或更少的颗粒单位、或者甚至1×10¹⁰或更少的颗粒单位)。

下述实例进一步举例说明本发明，但是，当然，不应该以任何方式解释成限制本发明的范围。在这些实例中，记录并且统计学分析了一些检测。使用变量的多变量分析和用于无参量检测的Kruskal-Wallis检验，确定在载体处理的动物和对照动物之间的差异的统计学显著性。用斯氏t检验(Student’s ttest)进行单一比较，使用＜0.05的P值作为显著性。所有的数据都表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。

实施例1

本实例说明GAD载体的构建。

非复制型HSV载体QHGAD67在HSV早早期(IE)基因ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的表达上是缺陷型的，并且包含人GAD67基因，其受控于在U_L41基因座的人巨细胞病毒早早期启动子(HCMV IEp)(图1)。对照载体Q0ZHG(按照在Chen等.J Virol，74(21)，10132-41(2000)中所述的方法构建)缺失相同的基因，但是在相同的位置含有大肠杆菌(Escherichiacoli)lacZ报告基因(图1)。

将GAD67cDNA(按照Bu，D.F.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89，2115-2119(1992)所述的方法构建)作为人巨细胞病毒早早期启动子下游的ClaI/XbaI片段单独地亚克隆到穿梭质粒p41H中，其包含启动子和充分的HSV两侧DNA序列，以使得能够在所述载体的U_L41基因座进行有效的同源重组。通过用PmeI-消化的病毒和靶点质粒DNA同时转染互补的7b细胞，而将表达/靶点盒重组到载体Q0ZHG的U_L41基因座，以用GAD表达构建体取代LacZ标记基因。重组QHGAD67通过3轮限制稀释纯化法进行纯化，并且遗传结构通过DNA印迹进行确定。载体储液在摇瓶中在7b细胞中生产，在连续的尼可登梯度上纯化，并且等分并保存在-80℃，直到使用时解冻。最终载体产物的滴度按照Krisky，D.，等.，InMethods in Molecular Medicine，Human Press，Totowa，NJ(1996)中所述的方法进行确定。

实施例2

本实例说明具有ICP4和ICP27基因座的延长缺失以及UL55的缺失的HSV载体的构建。

构建这一载体的图示在图14中列出。具体地，将质粒d106(Hadjipanayis和DeLuca，Can Res 65(12)：5310-6(2005))与质粒TOZ.1(Arafat等.，Clin Can Res 6：4442-8(2000))病毒性杂交，产生QOZHG.1。载体QOZHG.1的详情在实施例1中所述，并且它的构建在Chen等.，J Virol74(21)，10132-41(2000)中所述。

将质粒pPXE(Niranjan等.，Mol Ther 8(4)：530-42(2003))重组到QOZHG.1的ICP27基因座中，以挽救先前的ICP27缺失，并且去除HCMV-eGFP基因。然后，分离单一的重组子，纯化，并且通过选择在荧光显微镜下不表现出绿色荧光的蚀斑而进行验证。重组子叫作E1。E1对于GFP基因是阴性的，对于LacZ基因是阳性的。

通过将含有UL41编码序列的Hind III到Not I片段(HSV-1基因座核苷酸90145到93858)克隆到pBSSK(Stratagene)的Hind III和Not I位点，而产生质粒41HN。然后将质粒41HN重组到E1的UL41基因座，以挽救野生型UL41基因，并且去除LacZ。将得到的命名为E1-1的载体通过标准方法分离，纯化，并且验证。这一载体对于gfp和lacZ基因都是阴性的。

质粒pSASB3的构建，是通过将HSV-1KOS毒株基因组的Sph I到Afl III(Sal I连接的)片段(1928bp)(核苷酸124485-126413)克隆到Sph I/SalI消化的pSP72中，然后将695bp的Bgl II到BamH I片段(核苷酸131931到132626)插入到所述载体质粒的Bgl II到BamH I位点而实现的，其中所述695bp的Bgl II到BamH I片段含有ICP4启动子上游区域，所述ICP4启动子包括在短反向重复区域所含有的病毒起点。

通过将HCMV-eGFP片段克隆到pSASB3的BamH I位点而构建质粒pSASB3gfp。然后，将质粒pSASB3gfp重组到E1-1的ICP4基因座，以扩展ICP4缺失。然后，将得到的命名为E1G6/d106-4HG的载体通过标准方法分离，纯化，并且验证。

质粒pSASB3-HPPE通过将来自Dr.Steven Wilson，University of SouthCarolina(Liu F，Housley PR，Wilson SP.[J Neurochem.1996Oct；67(4)：1457-62]的质粒pCMV-hPPE的EcoR I到Sal I片段在独特的Sal I位点克隆到质粒pSASB3中而产生，其中所述质粒pCMV-hPPE含有HCMV早早期启动子、来自SV40的16s/19s RNA的SV40内含子(180bpXhoI-PstI)、完整的hPPE编码序列和SV40多聚腺苷化信号(SV40碱基2533-2729)。通过先前的EcoR I消化，然后通过克列诺片段补平EcoR I位点，并且用Sal I接头连接，而使得hPPE表达构建体的Sal I释放成为可能。然后，将这一连接的产物用Sal I消化，以纯化Sal I两侧的表达构建体。pCMV-hPPE从来自Dr.Barbara Spruce的cDNA克隆pUR292亚克隆而来，其作为来自pUR292的946bp的BamH I-Hind III片段，所述片段末端被补平，加上Not I接头，并且克隆到表达质粒pCMVβ的独特NotI位点。

最终的脑啡肽表达/ICP4靶点构建体(pSASB3-HPPE)含有下述元件：1)HSV基因组的碱基131931-132626，以提供靶向ICP4基因座的5′重组侧翼序列，2)人巨细胞病毒(HCMV)早早期启动子(IEp)，3)SV4016s/19s内含子剪接供体和受体位点，4)前脑啡肽原cDNA，5)SV40晚期多聚腺苷化信号，6)HSV基因组的碱基124485-126413，以提供靶向ICP4基因座的3′重组侧翼。

然后将质粒pSASB3-hppe重组到E1G6/d106-4HG的ICP4基因座，以产生NurelPl(NPl)载体，其通常叫作6221。

质粒PS-UB6R-6通过将两侧为BgI II-BamH I的泛蛋白启动子驱动的Red2(Invitrogen)克隆到PSP4的BamH I位点而产生。PSP.4的BamH I位点位于5′ICP27侧翼片段和UL56编码序列之间。

将质粒PS-UB6R-6重组到NPl的ICP27基因座，以扩展ICP27缺失使其包括所有的ICP27和UL55，并且插入UB6-Red基因。将命名为HPPE6221R的得到的载体分离，纯化，并且通过选择红色蚀斑进行验证。

质粒PSP4通过将ICP27编码序列5′的EcoR I到BamH I(HSV-1基因组110095到113322)序列克隆到质粒PS.2中而产生。PS.2含有连接到pBSSK(Stratagene)的Not I位点的Dde I到Sma I(HSV-1基因组片段116156到117119)平端。

将质粒PSP4重组到HPPE6221R载体的ICP27基因座中，以去除UB6-Red并且保留ICP27/UL55缺失。将得到的命名为NurelP2(NP2)的载体通过标准方法分离，纯化，并且验证。

将质粒pSASB3GFP重组到NP2的ICP4基因座中，以用HCMV-eGFP取代HCMV-hppe。将得到的命名为SAS2的质粒通过标准方法分离，纯化并且验证。

将质粒pRC2(Invitrogen)顺序地通过改变下列各项进行修饰：1)将HinDIII位点变成ClaI位点，2)将BbvII位点变成HinDIII位点，3)将得到的HinDIII位点变成BglII位点，以制备质粒pRC2HB2。将大约1200个碱基对的pRC2HB2的BglII片段克隆到质粒pSASB3的BamHI位点，产生质粒pSHB3。独立地，通过将HinDIII位点转变成BamHI位点而修饰GAD67克隆，产生pGADHB2。将得到的来自pGADHB2的2.8kb BamHI片段克隆到pSHB3的BamHI位点，以产生pGADL1。

将质粒pGAD-L1重组到SAS2的ICP4基因座，以产生载体NurelG2(NG2)。

载体NP2，SAS2和NG2是与所述细胞系没有同源性的载体，以致在所述细胞系和载体之间不会发生同源重组。因此，这些载体理想地与细胞ICP4、ICP27、IL55互补株系组合用于载体产生。

实施例3

本实例说明通过GAD载体转导的细胞表达GAD蛋白。

在将QHGAD67皮下接种到实验室大鼠后爪的足底表面后一周，在收集的L4-L6DRG中通过实时RT-PCR检测的GAD67mRNA的量比用Q0ZHG转导的对侧DRG高出5倍(图2)。此外，与对侧(注射赋形剂的)DRG相比，在转导的DRG中的GAD67免疫反应性以所有大小的广谱DRG神经元存在于神经元中。与假接种的对照(0.025±0.006OD单位，P＜0.01＝相比，通过蛋白质印迹确定的GAD67蛋白在两者腰部DRG中显著增加(0.048±0.009OD单位)。

在皮下接种30μl的11×10⁹pfu/mlQHGAD67后一周，与对侧(注射赋形剂的)背角质相比，在层II和III显著地观察到增加的免疫反应性。在对照大鼠的浅表背角质中，GAD67免疫反应性显著地位于层III的小圆细胞中，具有似乎是浅表背角质中的内源GABA-ergic中间神经元的极少的神经炎性延伸，以及似乎是静脉曲张或小轴突末梢的一些更小的、加点的、浓密染色的、不规则的轮廓。在含有来自用QHGAD67转导的DRG的轴突中枢末梢的背角质中，免疫染色的密度基本上增加，并且增加的免疫反应性似乎位于代表轴突末梢的不规则的轮廓中。通过蛋白质印迹，与假接种对照(0.027±0.004OD单位)相比，在含有这些轴突的中枢末梢的腰节背部脊髓中的GAD的量(0.041±0.008OD单位)显著地增加(P＜0.01，图3)。

通过实时RT-PCR分析GAD RNA进行如下：将L4-6DRGs快速移出，并且使用TriReagent(Sigma)从收集的L4-6中提取总RNA。在DNase I消化后，使用Omniscript反转录酶(Qiagen，Valencia，CA，USA)产生第一链cDNA。使用Primer Express(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)设计针对GAD67和GAPDH的引物和探针(Synthegen，Houston，TX，USA)。GAD67正向引物SEQ ID NO：3；反向引物SEQ ID NO：4；探针，SEQ IDNO：5(Synthegen)；和CAPDH正向引物SEQ ID NO：6；反向引物SEQ IDNO：7；探针SEQ ID NO：8(Invitrogen)。PCRs以50μl的总体积在ABIPrism 7700序列检测系统(Applied Biosystems)中进行。RNA的量使用GAPDH作为内部参照进行确定，并且相对于用Q0ZHG转导的DRG进行计算。每一PCR扩增在3个孔中进行，使用下述条件：50℃2分钟和90℃10分钟，然后在95℃15s和在60℃1分钟进行40个循环。

GAD67蛋白的量通过蛋白质印迹法确定，其按照下述流程：将L4-L6DRG或脊髓的腰部放大(lumbar enlargement)(L4到L6片段)的背部象限区在匀浆缓冲液(100mg组织/ml)中超声，所述匀浆缓冲液由60mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，1mM苯甲基磺酰氟和0.5％TritonX-100组成。使用TL100超高速离心机(Beckman)将匀浆物在100,000g离心15分钟，并且通过Bradford检测法(BioRad，Hercules，CA，USA)测定上层清液中的总蛋白。将蛋白在4-15％SDS梯度聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝基纤维素膜(Immobilon-P.Millipore，Billerica，Ma，USA)上，用兔抗-GAD67(1∶4000，Chemicon，Temecula，CA，USA)温育，然后用辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗-小鼠(1∶10,000，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA)温育，并且通过增强的化学发光(NEN，Boston，MA，USA)进行检测。将膜去除条带，并且用兔抗β-肌动蛋白作为上样对照再次检测。每一条带的密度通过使用基于PC的成像分析系统(MCID，Imaging Research，Brock，Ontario，Canada)进行定量密度计量而确定。

实施例4

本实例说明GABA在GAD载体转导的细胞中的增加的释放。

在体外以感染复数(m.o.i.)1转导QHGAD67的初级DGR神经元向培养基中以基本大于从对照释放的那些(2.34±0.22pmmol/10μl，P＜0.01)或从Q0ZHG-转导的DRG神经元释放的那些(2.56±0.54pmol/10μl，P＜0.01)的量释放GABA(9.53±2.15pmol/10μl)(图4A)。从通过提早1周皮下接种到足部而转导的DRG中枢末梢释放到背部脊髓中的GABA的体内的量，通过从移植到身体同侧腰部背角质的导管的微量透析而确定。与来自用QHGAD67接种的动物的透析物(其含有1.46±0.25pmol/10μl)相比，包含在从接种Q0ZHG的动物收集的透析物中的GABA含有0.74±0.24pmol/10μl(P＜0.05)(图4B)。

将从17天大的大鼠胚胎分离的DRG神经元以10⁵个细胞/孔的密度接种到24孔平板的聚-D-赖氨酸-处理的盖玻片上。每个孔含有500μlNeurobasal培养基，其包含B27、Glutamax I、Albumax II、和青霉素/链霉素(Gibco-BRL，Carlsbad，CA)，补充了100ng/ml的7.0S NGF(Sigma，St.Louis，MO)。在培养的第14天，将所述细胞用m.o.i.为1的QHGAD67或Q0ZHG感染1小时，之后将病毒去除。48小时后，将培养基换成100μl人造脑脊液，并且在5分钟的收集时间后，将水浴溶液在10,000g离心5分钟，并且提取上层清液用于通过HPLC确定GABA。DRG细胞通过免疫细胞化学检验GAD67蛋白的表达。

在体内从背角质神经末梢释放的GABA的量通过微量透析物的HPLC而确定，其使用下述流程：将大鼠用水合氯醛(400mg/kg)麻醉，将位于脊髓腰节之上的T11和T12椎骨层去除，使硬膜保持完好，并且将动物固定在立体定位装置上。使用加热灯防止热量损失，并且使用反馈传感器将体温保持在37.5℃。使用尖针做出从侧面到中线的小的硬膜切口，并且将微量透析探针(CMA/11，铜纺透析膜，长度1mm，直径0.24mm，分子截留6kDa，CMA/Microdialysis，Stockholm，Sweden)通过硬膜切口插入到背角质中，并且以1μl/min的速度灌注人造脑脊液(CMA/Microdialysis)。允许与细胞外流体平衡1h后，收集样品1h。在实验后期，检验探针气泡的存在，并且通过显微镜检灌注-固定的切片而检验在脊髓背角质中的位置。

接着，使用具有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯衍生作用(AccQ.Fluor Reagent Kit；Waters，USA)的HPLC，确定从转导的细胞体外释放的GABA的量，或者从微量透析物体内收集的GABA的量。将20微升培养物溶液与20μl衍生剂在60μl硼酸盐缓冲液中混合；将10μl样品允许在55℃反应10分钟，并且通过梯度HPLC (Waters 2695Separations Module)在AccQ.Taq column(3.9x 150mm；Waters)柱上分离，移动相由洗脱液A(Waters)和乙腈组成，流速为1ml/min。使用250nm的激发波长和395nm的发射波长，通过在37℃的荧光(Waters 2475Detector)而检测峰值。

按照下述流程，将鞘内导管手术移植到实验室大鼠内：使用Storkson方法的改良方法，在T13左脊髓半切断后1周，放置鞘内导管。简要地，将动物用水合氯醛(400mg/kg)重新麻醉，从中线左侧几毫米的L2到L6做出纵向切口，并且将聚乙烯导管(PE-10，Clay Adams，Parsippany，NJ，USA)从L4-L5的椎骨间隙引入到腰部蛛网膜下空间，以便导管末端位于脊髓的腰部放大附近。导管的远端皮下穿行，出现在颈部，留下7μl的死空间(dead space)。在移植鞘内导管后，将大鼠笼养在单个的笼中，并且将表现出运动功能障碍的那些动物处死。导管末端的位置通过灌注15μl的利多卡因(20mg/ml)，然后灌注8μl的盐水产生持续20-30分钟的运动麻痹而检验。通过使用与清醒的暂时受约束的大鼠中鞘内导管连接的微量注射器(Hamilton Co.，Reno，NV，USA)进行鞘内药物施用。

实施例5

本实例说明在实验室大鼠中皮下接种GAD载体减少SCI后的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。

在T13左侧脊髓半切断后1天，所有动物都表现出同侧后肢麻痹，在与脊髓半切断的对侧的后肢中没有运动功能障碍。脊髓半切断后2周，有相当多的运动功能恢复(BBB得分12-13，数据未显示)。BBB得分12，其与频繁-到-始终一致的重量-支持幻觉(frequent-to-consistentweight-supporting phantom)步骤和临时的前腿-后腿协调相对应，足以允许体觉-诱导的爪收缩的完全行为测试。脊髓半切断后1周，在两只后爪中观察到机械性异常性疼痛，当与手术前的阈值(11.2±1.68g身体同侧，11.6±1.71g身体对侧)相比时，其表现为后爪退缩阈值显著减少到等级系列的von Frey纤丝刺激(1.71±0.35g身体同侧，1.9±0.52g身体对侧)。脊髓半切断后l周在两侧后爪的足底表面皮下接种QHGAD67(1x 10⁹pfu/ml，30μl/爪)，在接种后1周(损伤后2周)检测，显著增加了后爪退缩阈值(4.4±1.12g身体同侧，4.1±0.75g身体对侧)。接种Q0ZHG的对照动物在它们的机械性阈值中没有表现出变化(与QHGAD67比较，1.8±0.28g身体同侧，1.6±0.34g身体对侧，P＜0.01)。最大抗异常性疼痛作用(即，爪退缩阈值的增加)发生在QHGAD67接种(5.19±0.82g身体同侧和5.8±1.14g身体对侧)后两周，并且抗异常性疼痛作用持续5周，在接种后六周减少到2.86±0.63g身体同侧和3.2±0.47g身体对侧(图5A和5B)。在初始接种后六周用相同剂量的QHGAD67重新接种到两侧足垫重新建立了抗异常性疼痛作用。通过重新接种获得的作用的数量级至少同通过初始注射所述载体而产生的作用的数量级一样大，并且通过重新接种产生的作用的持续时间比由初始接种引起的作用的持续时间略微长一些(6-7周)。在所有时刻，在Q0ZHG-接种的和赋形剂-处理的大鼠之间的爪退缩阈值中不存在显著差异(图5A和5B)。

在脊髓半切断后，动物还表现出热痛觉过敏，与手术前的值(12.6±1.23s身体同侧，12.1±1.25s身体对侧)相比，其表现出应答有害热刺激的退缩潜伏期的减少(6.7±0.51s身体同侧，6.9±0.6s身体对侧)。QHGAD67接种后1周(脊髓半切断后2周)，与Q0ZHG-接种的对照(6.5±0.43s身体同侧，7.1±0.42sec身体对侧)相比，在热潜伏期中存在统计学显著的增加(8.8±0.48s身体同侧，8.7±0.71s身体对侧)。除了峰值作用发生在接种后4周(9.7±0.71s身体同侧，9.62±0.78s身体对侧)以外，抗痛觉过敏作用的时间过程与所述载体的抗异常性疼痛作用的时间过程相似(图5C和5D)。在第6周重新接种QHGAD67载体也重新建立了抗痛觉过敏作用。第二次接种后的抗痛觉过敏作用的持续时间和数量级比在初始接种后的那些更久和更大。在任何时间阶段，在赋形剂-处理的和Q0ZHG-接种的动物之间的两只后爪退缩潜伏期中没有显著差异(图5C和5D)。

对于这些测试，使用雄性Sprague-Dawley大鼠，体重175-200g。笼养条件和实验方法受到University of Pittsburgh，Institutional Animal Careand Use Committee的核准。将大鼠在水合氯醛麻醉(400mg/kg)下，通过触摸最末的肋骨(与T13附着)而定位T11-T12脊椎层。做出纵向切口，暴露一些片段，并且在两个椎节(T11-T12)进行椎板切除术。通过伴随的背部血管而确定腰部放大，并且使用11号解剖刀在T13进行脊髓半切断，小心不要损伤主要的背部血管和血管分支。将具有28-线规针头的结核菌素注射器背腹地置于脊索中线，并且侧面推进，以保证完成脊髓半切断。将肌肉和筋膜缝合关闭，并且将皮肤用自动小夹封闭。手术后，将动物保持在相同的手术前条件下。在手术后3小时内所有的动物都进食和饮水。使用BBB运动等级量表(Locomotor Rating Scale)观察并记录运动功能，以保证与脊髓半切断同侧的肢体的运动恢复足以允许体觉行为测试。在那时将在两只后肢都表现出运动损失的动物(这表明两侧皮层脊髓束反式作用)排除在研究外。然后，将符合标准的动物用载体接种。每组6只动物用载体接种，并且通过重现接种进行检验。

机械性异常性疼痛和热痛觉过敏的行为测试在生理周期的白天部分(8:00AM到5:00PM)进行。通过使用一系列yon Frey纤丝(0.4，0.7，1.2，1.5，2.0，3.6，5.5，8.5，11.8和15.1g)检测应答等级性机械刺激的爪退缩阈值，而评估机械性异常性疼痛。将大鼠置于底部有网孔的透明的塑料室中，持续至少30分钟，以使之适应环境，之后将von Frey纤丝以强度上升的顺序连续应用到足的足底表面，力量足以引起爪轻微弯曲并且保持6s。将针对von Frey纤丝应用的敏锐的足退缩视为阳性反应，并且引起进行下一次更弱的刺激。热痛觉过敏通过检测针对辐射热源的爪退缩的潜伏期而进行评估。在这种测试中，将大鼠置于灯箱上的玻璃盘上。10分钟的适应期后，将爪的足底表面暴露于一束通过玻璃板应用的辐射热。当大鼠举起四肢时，通过光电池自动关闭光束，允许检测光束开始和爪退缩之间的时间。这一时间定义为爪退缩时间。测试总是在5分钟的时间间隔进行3次，并且将20秒用作截断时间。

实施例6

本实例说明GAD载体接种的行为作用被比枯枯灵碱和phaclofen逆转。

使用GABA_A受体-选择性拮抗剂比枯枯灵碱和GABA_B受体-选择性拮抗剂phaclofen，检验QHGAD67-介导的抗疼痛作用的药理学基础。给手术后两周的假手术动物鞘内施用比枯枯灵碱(0.5μg；Sigma)或phaclofen(0.8μg；Sigma)没有改变机械阈值或热潜伏期。给接种QHGAD67的具有脊髓半切断的大鼠施用相同剂量的比枯枯灵碱，在药物施用后10-15分钟检测，将与脊髓半切断同侧的机械阈值从4.87±1.13g减小到3.5±0.7g(P＜0.05)，将与脊髓半切断对侧的机械阈值从5.75±1.41g减小到3.38±0.9g(P＜0.01)(图6A)。鞘内phaclofen将与脊髓半切断同侧的机械阈值减小到3.6±0.78g(P＜0.05)，将与脊髓半切断对侧的机械阈值减小到4.05±0.75g(P＜0.05)(图6A)。热退缩潜伏期，通过施用比枯枯灵碱，在身体同侧从9.28±1.39s减小到7.23±1.21s(P＜0.05)，在身体对侧从9.56±1.5s减小到7.41±1.29s(P＜0.05)，并且通过施用phaclofen，在身体同侧减小到7.54±1.16s(P＜0.05)，在身体对侧减小到7.66±1.24s(P＜0.05)(图6B)。在每种情形中，药物的作用通过在药物施用后30分钟的峰值作用进行检测。接种后1小时，不再存在任何可检测到的药物作用。在用Q0ZHG接种并且用相同剂量的比枯枯灵碱或phaclofen处理的大鼠脊髓半切断中，在机械阈值或热潜伏期中没有显著变化。

实施例7

本实例说明用GAD载体进行细胞转导减小了背角质中的CGRP免疫反应性。

在假手术的动物中，在L5部分的CGRP免疫反应性是微弱的，主要限制在身体两侧脊髓的浅表背角质内的层I和II。左侧T13半切断后1周，CGRP免疫反应性增加，并且可以延伸到两侧背脊髓的层III和IV而检测到染色。在两只后爪接种QHGAD67后1周，在脊髓半切断的大鼠中，与用Q0ZHG接种的脊髓半切断的大鼠(107.3±22.4OD单位身体同侧，86±23.5单位身体对侧，P＜0.05)或赋形剂-处理的动物(96.7±21.8OD单位身体同侧，104.6±22.6OD单位身体对侧，P＜0.05)相比较，CGRP-样免疫反应性减小(76.5±13.3OD单位身体同侧，63.6±12.4OD单位身体对侧)。在Q0ZHG-接种的和赋形剂-处理的动物之间在染色上不存在显著差异(图7)。

通过免疫组织化学确定GAD蛋白在未损伤的转导动物中的分布以及CGRP肽在损伤的转导动物中的分布。将大鼠心内(intracardially)灌注4％低聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液，将脊髓L5片段和附着的根部去除，而后在相同的溶液中固定2小时，并且用30％蔗糖的PBS溶液冷冻保护2天。将20微升冷冻液解冻，包埋在冷的Superfrost显微镜载玻片(Fisher，Pittsburgh，PA，USA)上，并且在4℃与兔抗-GAD67(1∶2000，Chemicon)或兔抗-CGRP(1∶500，PLI，San Carlos，CA，USA)温育过夜，然后在室温下与荧光抗-兔IgG(Alexa Fluor 594，1∶500，Molecular Probes，Eugene，OR，USA)温育2小时。通过共聚焦显微镜(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MIUSA)捕获荧光成像。

实施例8

本实例说明，使用单纯疱疹病毒载体将编码GAD的基因转移到背根神经节减轻了外周神经性疼痛。

重225-250gm的雄性Sprague-Dawley大鼠进行选择性L5SNL(按照Hao等.，Pain；102：135-42(2003)所述)。SNL后一周，将30μl载体(QHGAD67或QOZHG，每毫升4×10⁸个蚀斑形成单位)皮下注射到与连接在身体同侧的左后爪的足底表面。通过评估针对等级抗张强度的vonFrey毛发的爪退缩反应(参见Hao等.，supra，和Chaplan等.，J NeurosciMethods，53：55-63(1994))，而确定由SNL诱导的机械性异常性疼痛，触觉刺激产生使用上-下方法(up-down method)(参见Dixon等.，Annu RevPharmacol Toxicol；20：441-62(1980))确定的50％的退缩可能性。热痛觉过敏使用Hargreaves装置(如Hargreaves等.，Pain；32：77-88(1988)中所述)进行确定，所述装置记录从直接放置在后爪下的辐射热刺激的退缩时间。

在L5SNL后，大鼠表现出激发针对yon Prey毛发刺激的敏锐的退缩反应所必需的机械刺激的量级的显著减小(图11A)，以及在从热刺激随后的对退缩的潜伏期中的显著减小(热痛觉过敏；参见图11B)。接种QH-GAD67的大鼠从接种后1周开始在机械阈值上表现出统计学显著的增加。QHGAD67-介导的GABA表达的抗异常性疼痛作用保持并且继续，持续5-6周，并且在接种后2周达到峰值(参见图11A)。机械阈值的峰值，8.6gm，接近手术前的值。到接种后7周，载体转导的抗异常性疼痛作用消失，并且QHGAD67-注射大鼠的机械性阈值与对照大鼠的相同。用相同剂量的QHGAD67重新接种到同一爪重建了抗异常性疼痛作用(参见图11A)。SNL诱导热潜伏期从10.7减小到6.5秒，其在逐渐恢复之前持续3周。接种QHGAD67的大鼠从接种后1周开始在身体同侧爪的热潜伏期中表现出统计学显著的增加(参见图11B)，所述作用保持并且继续，持续3-4周(参见图11B)。假手术的动物在机械性阈值或热潜伏期中没有变化。

由温柔触摸诱导的c-Fos和磷酸化胞外信号-调控激酶1和2(p-ERK1/2)的表达是疼痛过程的一种间接生物标记(Catheline等.，Pain；92：389-98(2001))。SNL后3周，进行温柔触摸，每4秒钟1次，持续10分钟，用实验者拇指的平面触摸大鼠的爪，并且免疫反应细胞(抗-c-Fos或抗-p-ERK1/2抗体；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的数目检测抗生物素蛋白-生物素辣根过氧化物酶，然后是镍-增强的二氨基联苯胺(Vector Laboratories，Bur-lingame，CA)。与假手术的对照大鼠相比，在与SNL的身体同侧，Fos-LI-阳性神经元的数目基本上增加了，并且接种载体QHGAD67显著地减少了层I-VI中Fos-LI-阳性神经元的数目(参见图12)。在温柔触摸刺激后，在具有SNL的大鼠中p-ERK1/2在层I和II中的表达也增加了，并且所述增加在接种QHGAD67的动物中得到阻滞。在假手术动物中，p-ERK没有受到10分钟的温柔触摸刺激的诱导，但是在接种QOZHG的动物中在脊神经连接(SNL)后，p-ERK基本上得到诱导。在接种QHGAD67的动物中，触摸诱导的p-ERK1/2的表达受到抑制，这通过计数在背角质中的p-ERK1/2-阳性神经元而证实(图13)。

这些结果表明，在外周神经性疼痛模型中，皮下接种表达GAD的HSV载体以便在体内转导DRG减弱了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏的行为表现；对行为的作用由表明在身体同侧脊背角质中诱导c-Fos和p-ERK1/2表达的组织学检测而证实。

讨论

实验室大鼠脊髓在T13的侧面半切断在两只后肢中损伤以下产生两侧的SCI疼痛相关的行为(“SCI模型”)。SCI疼痛相关的行为表现为机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。这一现象伴随两侧的脊髓重组。在上文提及的实验中，这种SCI模型用来检验由于GAD载体介导的基因转移到腰部DRG引起的GABA的局部生产和释放在减轻一些SCI疼痛表现中的作用。

用编码GAD的HSV载体(“GAD载体”)转导DRG神经元。这些转导的DRG神经元在体外和体内表达GAD。GAD在这些细胞中的表达导致GABA的释放。在进行T13脊髓侧面半切断然后皮下接种GAD载体的实验室大鼠中，来自转导的DRG神经元的局部GABA释放减轻了后肢的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。这一作用可以被GABA_A或GABA_B受体拮抗剂逆转，所述拮抗剂被给予的剂量不改变正常动物的痛觉或进行T13脊髓侧面半切断而没有皮下接种GAD载体的实验室动物的痛觉。此外，GAD载体介导的GABA释放还减弱在腰部背角质中SCI后发生的CGRP免疫反应性的增加。因此，包括GAD载体介导的基因转移到DRG的所述本发明的方法可以有效地用于治疗平面以下神经性SCI疼痛。

在含有60mM K⁺的培养基中，GABA从体外转导GAD载体的初级DRG神经元的释放没有增加，并且不被从培养基中移除Ca²⁺而受影响，这表明GABA释放不是囊泡式的，而是组成型发生的，可能通过GABA转运体的翻转而发生。尽管在体内从神经末梢释放的GABA的量足以显著升高背角质微量透析物中的GABA水平，但是在这些动物中没有运动缺点的证据，这表明转基因介导GABA释放局限于背角质。这与下述观察一致，即，通过皮下接种表达脑啡肽原的HSV载体转导的动物获得局限于与所述接种在身体同侧的肢体的止痛作用。

在具有未损伤的脊髓的实验室大鼠中，低阈值传入输入的增强的GABA-ergic抑制作用调节感觉处理，并且GABA受体功能的比枯枯灵碱阻断产生疼痛相关的行为。电生理学研究表明，GABA_A和GABA_B受体都引起脊髓水平的疼痛神经传递的增强的调控。外周神经损伤导致背角质中GABA水平的减少，和部分神经损伤后在背角质中初级传入激发的抑制性后突触电流的减少。然而，这些现象是否是由GABA-ergic中间神经元的丢失或如在中枢致敏作用中发现的GABA受体的脱敏作用所引起，没有完全确定。已经报道了在脊髓缺血的光化诱导后腰部脊髓中的GABA免疫反应性的瞬时减少，但是先前的研究没有检验半切断平面以下的GABA免疫反应性。但是，由于GAD载体转导DRG神经元引起GABA向半切断平面以下的背角质的组成型递送减弱了SCI后机械性异常性疼痛和热痛觉过敏的行为检测。这表明，SCI疼痛对GABA的调控敏感。

已经在一些试验中评估了baclofen对中枢神经性疼痛的作用，通常在简短(brief)试验中有阳性结果，但是只有较少显著的长期减轻。在SCI缺血性模型中，鞘内施用baclofen部分减轻了慢性机械性和冷异常性疼痛。在神经性疼痛的慢性收缩性损伤模型中，鞘内移植GABA-释放细胞逆转了神经性疼痛的一些表现。已经发现，GAD载体介导的GABA释放的疼痛减轻作用持续几个星期的过程。

没有检测GABA随时间释放的量。然而，观察到，在止痛作用后重新接种GAD载体减弱了重新建立机械性异常性疼痛和热痛觉过敏的减轻。这一观察证明治疗作用的丢失不是由于耐受性的发展，而是由于基因表达的减少。这与先前的研究的发现一致，所述先前的研究检验其中转基因表达受到瞬时活化的人巨细胞病毒早早期启动子(HCMV IEp)推动的载体。

没有疼痛和疼痛减轻的“客观(objective)”检测。然而，在实验室中，已经用在SCI模型中损伤水平以下脊髓片段中CGRP免疫反应性的量的增加的检测来检测疼痛和疼痛减轻。不幸地，关于SCI模型中增加的脊髓CGRP的现象所知甚少。还没有确定负责水平以下CGRP增加的机制。免疫反应性的增加是否与在CGRP翻转上增加的释放相关是未知的。CGRP是否在SCI疼痛现象中起任何作用或者是否作为SCI的副现象而发生也是未知的。但是，在这些研究中发生在SCI后的CGRP的增加作为与疼痛行为检测的组织学相关性，类似于在外周神经性疼痛的脊髓神经连接模型中由无害性触摸诱导的c-fos免疫反应性的增加。因此，CGRP检测可以用来确定GAD载体在治疗SCI疼痛中的作用。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，但是由于CGRP位于主要投射到背角质的层I、II和V的无髓鞘的和稀疏有髓鞘的传入神经处，所以据信CGRP的增加由初级传入神经的萌发导致。GABA从GAD转导的细胞释放防止CGRP表达增加的机制是未知的。

从前文，按照本发明，成功构建了设计成表达人谷氨酸脱羧酶(GAD)的非复制性HSV载体，并且将这一载体用于治疗SCI疼痛以及外周神经性疼痛。这些实例说明包括包括应用基因转移方法的本发明方法可以用来转导DRG神经元，通过外周接种在背角质中释放GABA。这些实例还说明包括使用GAD载体的基因转移的本发明方法减轻SCI后的平面以下的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。通过皮下接种递送GAD载体的能力是治疗SCI疼痛以及外周神经性疼痛的本发明方法的吸引人的特征。

除非另外指明，本发明的实践应用本领域技术内的病毒学、微生物学、分子生物学的方法和重组DNA技术的常规方法。这样的技术在文献中有充分地解释。(参见，例如，Sambrook，等.Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Current Edition)；DNA Cloning：A Practical Approach，Vol.I&II(D.Glover，ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，Current Edition)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames和S.Higgins，eds.，Current Edition)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins，eds.，Current Edition)；CRC Handbook of Parvoviruses，Vol.I&II(P.Tijessen，ed.)；FundamentalVirology，第二版，Vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.))。

本文引用的所有的参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都通过参考结合于此，它们以好像每一参考文献单独地并且具体地指明通过参考结合并且在本文中完全提出一样的程度结合。

术语″a″(一个)和″an″(一个)和″the″(这个)以及类似的指示词在描述本发明的情形中(特别是在下述权利要求的情形中)的应用应该解释为涵盖单数和复数，除非在本文中另外指明或者与上下文明显地相互抵触。除非另外指明，术语″comprising″(包括)，″having″(具有)，″including″(包括)以及″containing″(含有)应该解释成开放的术语(即，意指“包括，但不限于”)。除非本文另外指明，本文值的数值范围的引用仅仅意欲作为独立地参考落入所述范围内的每一独立值的速记方法，并且每一独立值如其在本文中独立地引用那样结合在说明书中。本文所述的所有方法可以以任何适宜的顺序进行，除非本文另外指明或者另外与上下文明显地相互抵触。任何以及所有实例的应用，或者本文所提供的示例性语言(例如，“诸如”)的应用，仅仅是意欲更好地举例说明本发明，并且不构成本发明的范围的限制，除非另外要求。说明书中没有语言应该被解释成是指实施本发明重要的任何非要求的元素。

本文描述了本发明的优选实施方案，其包括本发明人已知的实施本发明的最佳方式。当考虑到前面的描述时，这些优选实施方案的改变对于本领域的普通技术人员是显而易见的。本发明人希望熟练的技术人员适当地应用这些改变，并且本发明人意欲按照与本文详细描述所不同的方式实施本发明。因此，本发明包括按照适用的法律允许的在附上的权利要求中引用的主题的所有改进和等价物。此外，在所有可能的改变中的上述元素的任何组合都包含在本发明内，除非本文另外指明或者另外与上下文明显地相互抵触。

序列表

<110>匹兹堡大学高等教育联邦体系

约瑟夫.C.格格廖索

戴维.J.芬克

达瑞恩.沃尔夫

戴维.克里斯基

<120>关于脊髓损伤疼痛的外周递送的谷氨酸脱羧酶基因治疗

<130>241746

<150>60/622，889

<151>2004-10-28

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3610

<212>DNA

<213>人

<400>1

gaattcttcg taggaattat cttttccctc ctctcacccg acagcctgcc tatttccaaa 60

ggaaaaaaaa aaagcgtgtt gagtacgttc tggattactc ataagacctt ttttttttcc 120

ttccgggcgc aaaaccgtga gctggattta taatcgccct ataaagctcc agaggcggtc 180

aggcacctgc agaggagccc cgccgctccg ccgactagct gcccccgcga gcaacggcct 240

cgtgatttcc ccgccgatcc ggtccccgcc tccccactct gcccccgcct accccggagc 300

cgtgcagccg cctctccgaa tctctctctt ctcctggcgc tcgcgtgcga gagggaacta 360

gcgagaacga ggaagcagct ggaggtgacg ccgggcagat tacgcctgtc agggccgagc 420

cgagcggatc gctgggcgct gtgcagagga aaggcgggag tgcccggctc gctgtcgcag 480

agccgagcct gtttctgcgc cggaccagtc gaggactctg gacagtagag gccccgggac 540

gaccgagctg atggcgtctt cgaccccatc ttcgtccgca acctcctcga acgcgggagc 600

ggaccccaat accactaacc tgcgccccac aacgtacgat acctggtgcg gcgtggccca 660

tggatgcacc agaaaactgg ggctcaagat ctgcggcttc ttgcaaagga ccaacagcct 720

ggaagagaag agtcgccttg tgagtgcctt cagggagagg caatcctcca agaacctgct 780

ttcctgtgaa aacagcgacc gggatgcccg cttccggcgc acagagactg acttctctaa 840

tctgtttgct agagatctgc ttccggctaa gaacggtgag gagcaaaccg tgcaattcct 900

cctggaagtg gtggacatac tcctcaacta tgtccgcaag acatttgatc gctccaccaa 960

ggtgctggac tttcatcacc cacaccagtt gctggaaggc atggagggct tcaacttgga 1020

gctctctgac caccccgagt ccctggagca gatcctggtt gactgcagag acaccttgaa 1080

gtatggggtt cgcacaggtc atcctcgatt tttcaaccag ctctccactg gattggatat 1140

tattggccta gctggagaat ggctgacatc aacggccaat accaacatgt ttacatatga 1200

aattgcacca gtgtttgtcc tcatggaaca aataacactt aagaagatga gagagatagt 1260

tggatggtca agtaaagatg gtgatgggat attttctcct gggggcgcca tatccaacat 1320

gtacagcatc atggctgctc gctacaagta cttcccggaa gttaagacaa agggcatggc 1380

ggctgtgcct aaactggtcc tcttcacctc agaacagagt cactattcca taaagaaagc 1440

tggggctgca cttggctttg gaactgacaa tgtgattttg ataaagtgca atgaaagggg 1500

gaaaataatt ccagctgatt ttgaggcaaa aattcttgaa gccaaacaga agggatatgt 1560

tcccttttat gtcaatgcaa ctgctggcac gactgtttat ggagcttttg atccgataca 1620

agagattgca gatatatgtg agaaatataa cctttggttg catgtcgatg ctgcctgggg 1680

aggtgggctg ctcatgtcca ggaagcaccg ccataaactc aacggcatag aaagggccaa 1740

ctcagtcacc tggaaccctc acaagatgat gggcgtgctg ttgcagtgct ctgccattct 1800

cgtcaaggaa aagggtatac tccaaggatg caaccagatg tgtgcaggat atctcttcca. 1860

gccagacaag cagtatgatg tctcctacga caccggggac aaggcaattc agtgtggccg 1920

ccacgtggat atcttcaagt tctggctgat gtggaaagca aagggcacag tgggatttga 1980

aaaccagatc aacaaatgcc tggaactggc tgaatacctc tatgccaaga ttaaaaacag 2040

agaagaattt gagatggttt tcaatggcga gcctgagcac acaaacgtct gtttttggta 2100

tattccacaa agcctcaggg gtgtgccaga cagccctcaa cgacgggaaa agctacacaa 2160

ggtggctcca aaaatcaaag ccctgatgat ggagtcaggt acgaccatgg ttggctacca 2220

gccccaaggg gacaaggcca acttcttccg gatggtcatc tccaacccag ccgctaccca 2280

gtctgacatt gacttcctca ttgaggagat agaaagactg ggccaggatc tgtaatcatc 2340

cttcgcagaa catgagttta tgggaatgcc ttttccctct ggcactccag aacaaacctc 2400

tatatgttgc tgaaacacac aggccatttc attgagggaa aacataatat cttgaagaat 2460

attgttaaaa ccttacttaa agcttgtttg ttctagttag caggaaatag tgttcttttt 2520

aaaaagttgc acattaggaa cagagtatat atgtacagtt atacatacct ctctctatat 2580

atacatgtat agtgagtgtg gcttagtaat agatcacggc atgtttcccg ctccaagaga 2640

attcacttta ccttcagcag ttaccgagga gctaaacatg ctgccaacca gcttgtccaa 2700

caactccagg aaaactgttt ttcaaaacgc catgtcctag gggccaaggg aaatgctgtt 2760

ggtgagaatc gacctcactg tcagcgtttc tccacctgaa gtgatgatgg atgagaaaaa 2820

acaccaccaa atgacaagtc acaccctccc cattagtatc ctgttagggg aaaatagtag 2880

cagagtcatt gttacaggtg tactatggct gtattttaga gattaatttg tgtagattgt 2940

gtaaattcct gttgtctgac cttggtggtg ggaggggaga ctatgtgtca tgatttcaat 3000

gattgtttaa ttgtaggtca atgaaatatt tgcttattta tattcagaga tgtaccatgt 3060

taaagaggcg tcttgtattt tcttcccatt tgtaatgtat cttatttata tatgaagtaa 3120

gttctgaaaa ctgtttatgg tattttcgtg catttgtgag ccaaagagaa aagattaaaa 3180

ttagtgagat ttgtatttat attagagtgc ccttaaaata atgatttaag cattttactg 3240

tctgtaagag aattctaaga ttgtacatga cataagttat agtaatcatg gcaaatcctg 3300

ttacttaaat agcatctgct cttctcttac gctctctgtc tggctgtacg tctggtgttc 3360

tcaatgcttt tctagcaact gttggataat aactagatct cctgtaattt tgtagtagtt 3420

gatgaccaat ctctgtgact cgcttagctg aaacctaagg caacatttcc gaagaccttc 3480

tgaagatctc agataaagtg accaggctca caactgtttt tgaagaaggg aaattcacac 3540

tgtgcgtttt gagtatgcaa gaagaatata aataaataaa atatctcatg gagattgaca 3600

aaaaaaaaaa 3610

<210>2

<211>594

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Ser Ser Thr Pro Ser Ser Ser Ala Thr Ser Ser Asn Ala Gly

1 5 10 15

Ala Asp Pro Asn Thr Thr Asn Leu Arg Pro Thr Thr Tyr Asp Thr Trp

20 25 30

Cys Gly Val Ala His Gly Cys Thr Arg Lys Leu Gly Leu Lys Ile Cys

35 40 45

Gly Phe Leu Gln Arg Thr Asn Ser Leu Glu Glu Lys Ser Arg Leu Val

50 55 60

Ser Ala Phe Arg Glu Arg Gln Ser Ser Lys Asn Leu Leu Ser Cys Glu

65 70 75 80

A5n Ser Asp Arg Asp Ala Arg Phe Arg Arg Thr Glu Thr Asp Phe Ser

85 90 95

Asn Leu Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Ala Lys Asn Gly Glu Glu Gln

100 105 110

Thr Val Gln Phe Leu Leu Glu Val Val Asp Ile Leu Leu Asn Tyr Val

115 120 125

Arg Lys Thr Phe Asp Arg Ser Thr Lys Val Leu Asp Phe His His Pro

130 135 140

His Gln Leu Leu Glu Gly Met Glu Gly Phe Asn Leu Glu Leu Ser Asp

145 150 155 160

His Pro Glu Ser Leu Glu Gln Ile Leu Val Asp Cys Arg Asp Thr Leu

165 170 175

Lys Tyr Gly Val Arg Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Ser

180 185 190

Thr Gly Leu Asp Ile Ile Gly Leu Ala Gly Glu Trp Leu Thr Ser Thr

195 200 205

Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu

210 215 220

Met Glu Gln Tle Thr Leu Lys.Lys Met Arg Glu Ile Val Gly Trp Ser

225 230 235 240

Ser Lys Asp Gly Asp Gly Ile Phe Ser Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn

245 250 255

Met Tyr Ser Ile Met Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Phe Pro Glu Val Lys

260 265 270

Thr Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Lys Leu Val Leu Phe Thr Ser Glu

275 280 285

Gln Ser His Tyr Ser Ile Lys Lys Ala Gly Ala Ala Leu Gly Phe Gly

290 295 300

Thr Asp Asn Val Ile Leu Ile Lys Cys Asn Glu Arg Gly Lys Ile Tle

305 310 315 320

Pro Ala Asp Phe Glu Ala Lys Ile Leu Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr

325 330 335

Val Pro Phe Tyr Val A5n Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala

340 345 350

Phe Asp Pro Ile Gln Glu Ile Ala Asp Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Leu

355 360 365

Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg

370 375 380

Lys His Arg His Lys Leu Asn Gly Ile Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr

385 390 395 400

Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val Leu Leu Gln Cys Ser Ala Ile

405 410 415

Leu Val Lys Glu Lys Gly Ile Leu Gln Gly Cys Asn Gln Met Cys Ala

420 425 430

Gly Tyr Leu Phe Gln Pro Asp Lys Gln Tyr Asp Val Ser Tyr Asp Thr

435 440 445

Gly Asp Lys Ala Ile Gln Cys Gly Arg His Val Asp Ile Phe Lys Phe

450 455 460

Trp Leu Met Trp Lys Ala Lys Gly Thr ValGly Phe Glu A5n Gln Ile

465 470 475 480

A5n Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Tyr Ala Lys Ile Lys Asn

485 490 495

Arg Glu Glu Phe Glu Met Val Phe Asn Gly Glu Pro Glu His Thr Asn

500 505 510

Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Gln Ser Leu Arg Gly Val Pro Asp Ser

515 520 525

Pro Gln Arg Arg Glu Lys Leu His Lys Val Ala Pro Lys Ile Lys Ala

530 535 540

Leu Met Met Glu Ser Gly Thr Thr Met Val Gly Tyr Gln Pro Gln Gly

545 550 555 560

Asp Lys Ala Asn Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr

565 570 575

Gln Ser Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln

580 585 590

Asp Leu

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>3

gcgggagcgg atcctaata 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>4

tggtgcatcc atgggctac 19

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>5

cgtcctacaa catatgatac ttggtgtg 28

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>6

ccgagggccc actaaagg 18

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>7

tgctgttgaa gtcacaggag a 21

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>8

catcctgggc tacactgagg acca

<210>9

<211>1239

<212>DNA

<213>人

<400>9

cggcgagggt cctgccgagg gacccgttct gcgcccaggc aggctcgaag cacgcgtccc 60

tctctcctcg cagtccatgg cgcggttcct gacactttgc acttggctgc tgttgctcgg 120

ccccgggctc ctggcgaccg tgcgggccga atgcagccag gattgcgcga cgtgcagcta 180

ccgcctagtg cgcccggccg acatcaactt cctggcttgc gtaatggaat gtgaaggtaa 240

actgccttct ctgaaaattt gggaaacctg caaggagctc ctgcagctgt ccaaaccaga 300

gcttcctcaa gatggcacca gcaccctcag agaaaatagc aaaccggaag aaagccattt 360

gctagccaaa aggtatgggg gcttcatgaa aaggtatgga ggcttcatga agaaaatgga 420

tgagctttat cccatggagc cagaagaaga ggccaatgga agtgagatcc tcgccaagcg 480

gtatgggggc ttcatgaaga aggatgcaga ggaggacgac tcgctggcca attcctcaga 540

cctgctaaaa gagcttctgg aaacagggga caaccgagag cgtagccacc accaggatgg 600

cagtgataat gaggaagaag tgagcaagag atatgggggc ttcatgagag gcttaaagag 660

aagcccccaa ctggaagatg aagccaaaga gctgcagaag cgatatgggg gcttcatgag 720

aagagtaggt cgcccagagt ggtggatgga ctaccagaaa cggtatggag gtttcctgaa 780

gcgctttgcc gaggctctgc cctccgacga agaaggcgaa agttactcca aagaagttcc 840

tgaaatggaa aaaagatacg gaggatttat gagattttaa tatttttccc actagtggcc 900

ccaggcccca gcaagcctcc ctccatcctc cagtgggaaa ctgttgatgg tgttttattg 960

tcatgtgttg cttgccttgt atagttgact tcattgtctg gataactata caacctgaaa 1020

actgtcattt caggttctgt gctctttttg gagtctttaa gctcagtatt agtctattgc 1080

agctatctcg ttttcatgct aaaatagttt ttgttatctt gtctcttatt tttgacaaac 1140

atcaataaat gcttacttgt atatagagat aataaaccta ttaccccaag tgcaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1239

Claims

1.一种包括非扩增子重组单纯疱疹病毒(HSV)的载体，所述单纯疱疹病毒包括编码谷氨酸脱羧酶(GAD)蛋白的多聚核苷酸序列，所述载体包括ICP4、ICP27的延长的缺失以及UL55的缺失。

2.权利要求1的载体，其中所述GAD蛋白是GAD67。

3.权利要求1的载体，其还包括与编码GAD蛋白的多聚核苷酸序列可操作地连接的可诱导的启动子。

4.权利要求1的载体，其还包括与编码GAD蛋白的多聚核苷酸序列可操作地连接的人巨细胞病毒早早期启动子(HCMV IEp)。

5.权利要求1的载体，其中所述编码GAD蛋白的序列插入到重组HSV的UL41、ICP4或ICP27基因座。

6.权利要求1的载体，其还缺失至少一种必需HSV基因。

7.权利要求6的载体，其中所述必需HSV基因是早早期、早期或晚期HSV基因。

8.权利要求1的载体，其还缺失选自由下列各项组成的组的早早期基因：ICP22和ICP47，以及它们的组合。

9.权利要求1的载体，其中所述重组HSV是复制缺陷型的。

10.一种病毒储液，其包括权利要求1或9的载体。

11.一种组合物，其包括权利要求1或9的载体和生理学可接受的媒介物。

12.权利要求1-11中任一项的载体在用于制备治疗哺乳动物内的脊髓损伤疼痛或外周神经性疼痛的药物中的应用。

13.权利要求12的方法，其中所述哺乳动物是人。

14.一种HSV载体，其包括ICP4、ICP27的延长的缺失以及UL55的缺失。

15.权利要求14的HSV载体，其还包括缺失至少一种其它必需HSV基因。

16.权利要求15的载体，其中所述必需HSV基因是早早期、早期或晚期HSV基因。

17.权利要求16的载体，其中所述早早期基因选自由下列各项组成的组：ICP22、ICP47以及它们的组合。

18.权利要求14的载体，其中所述重组HSV是复制缺陷型的。

19.权利要求14的载体，其还包括转基因。

20.权利要求19的载体，其中所述转基因编码GAD。

21.权利要求19的载体，其中所述转基因编码脑啡肽。

22.权利要求14-21中任一项的载体在制备药物中的应用。

23.与HSV ICP4、ICP27和UL55基因互补的细胞系。