KR20230042263A - 가용성 enpp1 또는 enpp3 단백질 및 이의 사용 - Google Patents
가용성 enpp1 또는 enpp3 단백질 및 이의 사용 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230042263A KR20230042263A KR1020237000507A KR20237000507A KR20230042263A KR 20230042263 A KR20230042263 A KR 20230042263A KR 1020237000507 A KR1020237000507 A KR 1020237000507A KR 20237000507 A KR20237000507 A KR 20237000507A KR 20230042263 A KR20230042263 A KR 20230042263A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- polypeptide
- enpp1
- soluble
- seq
- enpp3
- Prior art date
Links
- 101000812677 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 646
- 102100039306 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 646
- 101000897042 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 303
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 302
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 819
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 812
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 811
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 134
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 71
- 230000002308 calcification Effects 0.000 claims abstract description 41
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 12
- 208000034970 Heterotopic Ossification Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 176
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 154
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 137
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 118
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 117
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 94
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 88
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 81
- 101800004225 Somatomedin-B Proteins 0.000 claims description 63
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 61
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 claims description 40
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 38
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 28
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 27
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 25
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 24
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 24
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 21
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 18
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 17
- 208000005475 Vascular calcification Diseases 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 208000004900 arterial calcification of infancy Diseases 0.000 claims description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 13
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 12
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 claims description 11
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 10
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 9
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 9
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 9
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- 208000033173 Generalized arterial calcification of infancy Diseases 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 230000002037 soft tissue calcification Effects 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- 206010051714 Calciphylaxis Diseases 0.000 claims description 6
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 claims description 6
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 claims description 6
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 claims description 6
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- 102000047882 human INSR Human genes 0.000 claims description 6
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 claims description 6
- 102100028187 ATP-binding cassette sub-family C member 6 Human genes 0.000 claims description 5
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 claims description 5
- 101000986621 Homo sapiens ATP-binding cassette sub-family C member 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims description 5
- 201000003672 autosomal recessive hypophosphatemic rickets Diseases 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 101150095012 ABCC6 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 claims description 4
- 206010048215 Xanthomatosis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003387 muscular Effects 0.000 claims description 3
- 208000007442 rickets Diseases 0.000 claims description 3
- 102400000099 Somatomedin-B Human genes 0.000 claims 22
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 claims 3
- 201000002044 ossification of the posterior longitudinal ligament of spine Diseases 0.000 claims 2
- 208000001040 ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine Diseases 0.000 claims 2
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 146
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 101
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 100
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 51
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 44
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 42
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 40
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 26
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 26
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 20
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 20
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 19
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 19
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 102100021977 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 Human genes 0.000 description 17
- 101000897035 Homo sapiens Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 Proteins 0.000 description 17
- 108010067341 ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 Proteins 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 13
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 11
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 11
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 10
- 208000011111 hypophosphatemic rickets Diseases 0.000 description 10
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 8
- 102100021962 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 5 Human genes 0.000 description 7
- 102100036093 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 7 Human genes 0.000 description 7
- 101000897063 Homo sapiens Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 5 Proteins 0.000 description 7
- 101000876377 Homo sapiens Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 7 Proteins 0.000 description 7
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 6
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- RWOAVOYBVRQNIZ-BFHYXJOUSA-N p-nitrophenyl thymidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)[C@@H](O)C1 RWOAVOYBVRQNIZ-BFHYXJOUSA-N 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 5
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 5
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 5
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 5
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 208000016216 Choristoma Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N (2r)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.OC(=O)[C@H](N)CCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCC(O)=O JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 3
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 101800000511 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 208000009469 Ossification of Posterior Longitudinal Ligament Diseases 0.000 description 3
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 3
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 102100037697 Uridylate-specific endoribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 3
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 3
- 108010044804 gamma-glutamyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 3
- 108010045797 placental protein 11 Proteins 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XRILCFTWUCUKJR-INFSMZHSSA-N 2'-3'-cGAMP Chemical compound C([C@H]([C@H]1O)O2)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](N4C5=NC=NC(N)=C5N=C4)O[C@@H]3COP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H]2N1C=NC2=C1NC(N)=NC2=O XRILCFTWUCUKJR-INFSMZHSSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 2
- 102100025683 Alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme Human genes 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010014611 Encephalitis venezuelan equine Diseases 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000000890 Somatomedin B domains Human genes 0.000 description 2
- 108050007913 Somatomedin B domains Proteins 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 201000009145 Venezuelan equine encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 201000003674 autosomal dominant hypophosphatemic rickets Diseases 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 208000000740 hypophosphatemic bone disease Diseases 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLTPSDHKZGWXTD-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(dicyanomethylidene)naphthalen-2-ylidene]propanedinitrile Chemical compound N#CC(C#N)=C1C=CC2=CC(=C(C#N)C#N)C=CC2=C1 JLTPSDHKZGWXTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 1
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710161969 Alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme Proteins 0.000 description 1
- 101100133992 Amycolatopsis sp Aaar gene Proteins 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 101100225890 Aplysia californica ENPP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100021961 Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase ENPP4 Human genes 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101000844746 Drosophila melanogaster Drosomycin Proteins 0.000 description 1
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150017770 ENPP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 208000005050 Familial Hypophosphatemic Rickets Diseases 0.000 description 1
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102000004042 Fibroblast Growth Factor-23 Human genes 0.000 description 1
- 108090000569 Fibroblast Growth Factor-23 Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001123946 Gaga Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010037370 Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036076 Glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase ENPP6 Human genes 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101150105462 HIS6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 101000574445 Homo sapiens Alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme Proteins 0.000 description 1
- 101000897056 Homo sapiens Bis(5'-adenosyl)-triphosphatase ENPP4 Proteins 0.000 description 1
- 101000876254 Homo sapiens Glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase ENPP6 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 101001042049 Human herpesvirus 1 (strain 17) Transcriptional regulator ICP22 Proteins 0.000 description 1
- 101000999690 Human herpesvirus 2 (strain HG52) E3 ubiquitin ligase ICP22 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 208000025500 Hutchinson-Gilford progeria syndrome Diseases 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010048858 Ischaemic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101150011046 NPP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710199133 Nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100080092 Phytophthora capsici NLP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010063493 Premature ageing Diseases 0.000 description 1
- 208000032038 Premature aging Diseases 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000007932 Progeria Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000004531 Renal Artery Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 206010038378 Renal artery stenosis Diseases 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101000995829 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 101150081494 TMPO gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 206010048214 Xanthoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 108010022198 alkylglycerophosphoethanolamine phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- RFCBNSCSPXMEBK-INFSMZHSSA-N c-GMP-AMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](N4C5=NC=NC(N)=C5N=C4)O[C@@H]3COP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 RFCBNSCSPXMEBK-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 101150047356 dec-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003108 foot joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002478 hand joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000014092 hereditary hypophosphatemic rickets Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000048180 human ENPP3 Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 101710130522 mRNA export factor Proteins 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000012223 nuclear import Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
- C12Y301/04001—Phosphodiesterase I (3.1.4.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
- C12Y306/01009—Nucleotide diphosphatase (3.6.1.9), i.e. nucleotide-pyrophosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
소정의 측면에서, 본 발명은 신규한 가용성 ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드, 뿐만 아니라 ENPP1 또는 ENPP3 결핍과 연관된 징후를 치료하기 위해 이들 변이체를 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 병적 석회화 또는 병적 골화와 같은 ENPP1 또는 ENPP3 결핍과 연관된 질환을 치료하는 데 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 6월 9일에 출원된 미국 가출원 제63/036,833호의 우선권의 이익을 주장한다. 전술한 출원의 개시는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
인간 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제(ENPP) 단백질 계열은 인산디에스테르 결합을 가수분해하는 7개의 세포외, 당화된 단백질(즉, ENPP1-ENPP7)을 포함한다. ENPP들은 세포 표면 효소이지만, ENPP2는 예외이며, 이것은 원형질막으로 유출되지만 푸린에 의해 절단되어 세포외 유체로 방출된다. ENPP 효소는 높은 서열 및 구조적 상동성 정도를 갖지만, 뉴클레오티드에서 지질을 아우르는 다양한 기질 특이성을 나타낸다.
ENPP1(PC-1로도 알려짐) 및 ENPP3은 골아세포 및 연골세포의 무기질 침착 매트릭스 소포 상에 위치한 2형 세포외 막 결합 당단백질이며, 세포외 뉴클레오티드(주로 ATP)를 아데노신 모노포스페이트(AMP) 및 무기 피로포스페이트(PPi)로 가수분해한다. PPi는 초기 수산화인회석(HA) 결정과 결합함으로써 이소성 조직 무기질화의 강력한 억제제로서 기능하여, 이들 결정의 미래 성장을 방지한다. ENPP1은 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP)의 가수분해를 통해 PPi를 생성하고, 진행성 강직증 단백질(ANK)은 세포내 PPi를 세포외 공간으로 수송하고, 조직 비특이적 알칼리성 인산분해효소(Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase, TNAP)는 PPi의 Pi로의 직접 가수분해를 통해 PPi를 제거한다.
이소성 조직 무기질화는 만성 관절 질환 및 급성으로 치명적인 신생아 증후군을 포함하는, 다수의 인간 질환과 관련이 있다. 원치 않는 조직 석회화를 방지하기 위해, 조직 무기질화를 촉진하고 억제하는 인자는 반드시 긴밀한 균형을 유지해야 한다. 세포외 무기 피로포스페이트(PPi)와 포스페이트(Pi)의 균형은 이소성 조직 무기질화의 중요한 조절자이다. 3가지 세포외 효소인 -TNAP, ANK 및 ENPP1-의 활성은 포유동물에서 Pi 및 PPi의 농도를 각각 1-3 mM 및 2-3 pM으로 엄격하게 조절한다. PPi는 비정질 인산칼슘으로부터 염기성 인산칼슘의 형성을 억제하는, 생체무기질화의 조절자이다.
본 개시는, 적어도 부분적으로, ENPP1의 소마토메딘 B(Somatomedin B, SMB) 도메인에 결합된 ENPP1 함유 융합 단백질에 대해 포유동물에 의해 큰 항-약물 항체 비율이 생성된다는 발견에 기초한다. 작업 예에서 설명되는 바와 같이, ENPP1-함유 융합 단백질을 마우스 및 비인간 영장류에 투여한 후, 이들 동물로부터 회수된 항-약물 항체는 주로 ENPP1의 SMB 도메인 영역을 인식하였다. 본 개시는 또한, 부분적으로, 임의의 SMB 도메인이 결여된, ENPP1 폴리펩티드의 변이체 형태 및 이러한 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질이 효소적으로 활성이고, 상응하는 SMB 도메인-함유 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질에 비해 향상된 안정성을 나타내고, 무엇보다도, 연조직에서 원치 않는 석회화를 억제하는 데 유용하다는 발견에 기초한다.
소마토메딘 B는 시스테인-풍부 펩티드로서, 비트로넥틴(Vitronectin)으로부터 단백질분해에 의해 유리된다. 예를 들어, Leavesley 등 (2013) IOBMB Life 65(10):807-818. SMB 도메인은 8개의 시스테인 잔기를 함유하며, 이 잔기는 3차원 구조에 기초하여, 도메인 내에 매립되어 공유 결합된 코어를 형성하는 4개의 이황화 결합을 형성한다. Kamikubo 등 (2004) Biochemistry 43:6519-6534 또한 참조. 본 개시는 임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘에 의해 구속되지 않지만, SMB 구조 내에서의 이질성 및/또는 상호 교환 가능한 또는 상호 교환하는 이황화 결합 형성은, 부분적으로, ENPP1-함유 융합 단백질에 대해 관찰된 안정성 감소 뿐만 아니라 면역원성에 대한 성향 증가를 담당할 수 있다.
ENPP1 및 비트로넥틴에 더하여, SMB 도메인은 ENPP2, ENPP3, 및 태반 단백질 11(PP11)과 같은 단백질에서도 발견된다. 따라서, 본 개시는 SMB 도메인(들)을 함유하지 않는 SMB 도메인-함유 폴리펩티드의 변이체 형태를 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 변이체 폴리펩티드는 비트로넥틴 폴리펩티드의 변이체가 아니다. 일부 실시예에서, 변이체 폴리펩티드는 ENPP1의 변이체(예를 들어, ENPP1의 가용성 형태의 변이체)이다. 일부 실시예에서, 변이체 폴리펩티드는 ENPP2의 변이체이다. 일부 실시예에서, 변이체는 ENPP3의 변이체이다. 일부 실시예에서, 변이체는 PP11의 변이체이다. 또한, 변이체 폴리펩티드 및 이종 단백질 중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질 및/또는 변이체 폴리펩티드 및 이종 모이어티 중 하나 이상을 포함하는 접합체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 ENPP1의 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있다.
일부 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP1의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP1의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공하며, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 본 개시는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 ENPP1의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여되어 있고, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 감소된 동종이량체화 능력을 갖는다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 ENPP1 폴리펩티드의 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 동종이량체화를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 일부 측면에서, 본 개시는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타낸다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP1의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 폴리펩티드를 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공하며, 적어도 위치 818에서의 아르기닌(R)은 또 다른 아미노산을 치환한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817, 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타낸다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드의 더 큰 단백질분해 내성은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 또는 300% 증가된 단백질 순도를 갖는 균질한 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드의 더 큰 단백질분해 내성은 단백질 절단을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 프로테아제는 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 치환은 서열번호 1에 대해 위치 818에 있다. 일부 실시예에서, 위치 818에서의 아르기닌(R)은 히스티딘(H)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 서열번호 1에 대해 816, 817, 또는 818 위치 중 어느 하나에서 아미노산은 히스티딘(H)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: K816R, K816H, R817H, R817K, R818H, 또는 R818K. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1의 포스포디에스테라제 촉매 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 SMB 도메인 1 및 2 중 하나 또는 모두 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 95% 동일하다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 99% 동일하다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 가용성 ENPP1 폴리펩티드 도메인 및 하나 이상의 이종 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시킨다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 M252Y, S254T, 및 T256E 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I, 및 V308F, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 야생형 IgG 불변 도메인보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 ENPP1-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 11과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 12과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 121과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 122과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 127과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 128과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 N-말단 리더 서열(예를 들어, MTRLTVALLAGLLASSRA)을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드의 N-말단에서 하나 이상의 아미노산의 N-말단 연장부를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, N-말단 연장부는 S 또는 KS이다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 이종 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이종 모이어티는 글리코실화된 아미노산, 페길화(PEGylated) 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 및 지질 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 서열번호 1에 대한 아미노산 잔기 332는 I332T 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP3의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP3의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제공하며, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 본 개시는 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 90% 동일한 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 ENPP3의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 감소된 동종이량체화 능력을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 ENPP3 폴리펩티드의 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 동종이량체화를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서, ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3의 포스포디에스테라제 촉매 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3 폴리펩티드는 SMB 도메인 1 및 2 중 하나 또는 모두 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136- 875와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875와 적어도 95% 동일하다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875와 적어도 99% 동일하다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875을 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 가용성 ENPP3 폴리펩티드 도메인 및 하나 이상의 이종 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시킨다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 M252Y, S254T, 및 T256E 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I, 및 V308F, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링된다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 야생형 IgG 불변 도메인보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 ENPP3-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 이종 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이종 모이어티는 글리코실화된 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 및 지질 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시는 ENPP1 융합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP3 융합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 (a) SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분으로서, 음으로 하전된 골-표적화 도메인이 결여된, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및 (b) 이종 단백질 부분을 포함하는, 융합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 (a) SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분 및 (b) 이종 단백질 부분을 포함하는, 융합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 (a) 서열번호 1에 대해 816, 817, 또는 818 위치 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분으로서, 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타내는, 상기 ENPP1 폴리펩티드 및 (b) 이종 단백질 부분을 포함하는, 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 서열번호 9과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 서열번호 11과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875을 포함한다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시킨다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시킨다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP1 폴리펩티드, ENPP3 폴리펩티드, 또는 융합 단백질을 포함하는 접합체를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 (a) 본원에서 사용되는 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 또는 본원에서 사용되는 ENPP1 또는 ENPP3 융합 단백질; 및 (b) 이종 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다. 일부 실시예에서, 이종 모이어티는 글리코실화된 아미노산, 페길화 아미노산, 파메실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 및 지질 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 본 개시는 (a) 본원에서 사용되는 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 ENPP1 또는 ENPP3 융합 단백질, 또는 본원에서 사용되는 접합체, 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시는 대상체에서 이소성 석회화를 감소 및/또는 개선하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 대상체에서 이소성 석회화를 감소 및/또는 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에서 사용되는 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 ENPP1 또는 ENPP3 융합 단백질, 본원에서 사용되는 접합체, 또는 본원에서 사용되는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여, 대상체에서 이소성 석회화를 감소 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이소성 석회화는 연조직 석회화, 동맥 석회화, 및 혈관 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 대상체는 만성 신장 질환(CKD),말기 신장 질환(ESRD), 석회화 요독 동맥병증(CUA), 칼시필락시스(calciphylaxis), 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 상염색체 열성 저인산혈성 구루병 2형(ARHR2), 골관절염, 노화 관련 동맥 경화, 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 영아기의 전신성 동맥 석회화(GACI), 및 죽상동맥경화성 플라크의 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 가지고 있다. 일부 실시예에서, 연조직은 죽상동맥경화성 플라크, 근육 동맥, 관절, 척추, 관절 연골, 척추 디스크 연골, 혈관 및 결합 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 대상체는 ENPP1 결핍이다. 일부 실시예에서, 대상체는 ENPP3 결핍이다. 일부 실시예에서, 대상체는 탄성섬유 가황색종(PXE)을 갖는다. 일부 실시예에서, 대상체는 ABCC6 유전자에서 병원성 돌연변이를 갖는다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP1 결핍 장애를 가진 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은: 본원에서 사용되는 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 융합 단백질, 본원에서 사용되는 접합체, 또는 본원에서 사용되는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 ENPP3 결핍 장애를 가진 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은: 본원에서 사용되는 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 본원에서 사용되는 융합 단백질, 본원에서 사용되는 접합체, 또는 본원에서 사용되는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 대상체는 만성 신장 질환(CKD), 말기 신장 질환(ESRD), 석회화 요독 동맥병증(CUA), 칼시필락시스(calciphylaxis), 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 상염색체 열성 저인산혈성 구루병 2형(ARHR2), 골관절염, 노화 관련 동맥 경화, 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 영아기의 전신성 동맥 석회화(GACI), 및 죽상동맥경화성 플라크의 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 가지고 있다. 일부 실시예에서, 대상체는 이소성 석회화를 갖는다. 일부 실시예에서, 이소성 석회화는 연조직 석회화, 동맥 석회화, 및 혈관 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 대상체는 병리학적 골화를 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시는 본원에 사용된 가용성 ENPP1 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 소정의 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 또는 15 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 본원에서 사용되는 가용성 ENPP3 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 제공한다. 일부 실시예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시예에서, 세포는 CHO 세포 또는 인간 세포이다. 일부 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 b) 이렇게 발현된 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제형화하여 약학적 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 b) 이렇게 발현된 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제형화하여 약학적 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 야생형 ENPP1 전구체 단백질의 전체, 미가공 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 1). 세포질 및 막관통 영역은 밑줄이 그어져 있다. 잠재적 N-글리코실화 부위는 굵은 글씨체로 표시되어 있다. PSCAKE(잔기 99-104; 박스처리됨)는 SMB1(잔기 104-144) 및 SMB2(잔기 145-189)를 포함하는 가용성 ENPP1 단백질 부분의 시작이다.
도 2는 인간 ENPP1의 특정 도메인을 도시한다.
도 3은 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 2).
도 4는 SMB1 및 SMB2 모두 결여된 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 3).
도 5a 및 도 5b는 다양한 척추동물 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및 인간 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 다중 서열 정렬을 도시한다(서열번호 4-8). 다양한 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 다음 종에 상응하며, 특이적 NCBI 수탁 번호의 영역을 나타낸다: 마우스(NCBI 수탁 NP_001295256.1; 서열번호 4), 소(NCBI 수탁 NP_001193141; 서열번호 5), 토끼(NCBI 수탁 NP_001162404.1; 서열번호 6), 인간(NCBI 수탁 NP_006199.2; 서열번호 7), 및 개코원숭이(NCBI 수탁 NP_001076211.2; 서열번호 8).
도 6은 야생형 ENPP3 전구체 단백질의 전체, 미가공 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 116). 세포질 및 막관통 영역은 밑줄이 그어져 있다. 가용성 ENPP3 단백질 부분은 SMB1 및 SMB2를 포함한다.
도 7은 인간 ENPP3의 특정 도메인을 도시한다.
도 8은 랫트 및 비인간 영장류(NHP) 샘플에 대해 수행된 항-약물 항체(ADA) ELISA 경쟁 검정의 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 동물 연구 중에 생성된 ADA를 함유하는 혈청 및 혈장 샘플을 ENPP1-Fc-처리된 검정 플레이트에 첨가하고 경쟁자로 처리하였다. ELISA 신호 변화를 측정하였으며, 이를 대조군 신호에 대한 비율로서 나타낸다. 검정에 사용된 경쟁자는 다음을 포함한다: (a) 작제물 1: 인간 ENPP1의 전체 세포외 도메인을 함유하는 ENPP1-Fc 작제물, (b) 작제물 2: ENPP1의 SMB1 및 SMB2 도메인이 결여된 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물, (c) 작제물 3: 촉매 도메인을 시노몰구스 원숭이 ENPP1의 상응하는 도메인으로부터의 촉매 도메인으로 치환시킨 가용성 인간 ENPP1을 포함하는 ENPP1-Fc 작제물, (d) 작제물 4: 뉴클레아제-유사 도메인을 시노몰구스 원숭이 ENPP1의 상응하는 도메인으로 치환시킨 가용성 인간 ENPP1을 포함하는 ENPP1-Fc 작제물, (e) 작제물 5: 작제물의 가용성 ENPP1 부분이 다음의 아미노산 링커 서열을 통해 작제물의 Fc 부분에 연결되는 ENPP1-Fc 작제물: GGGGS (서열번호 63), (f) 인간 IgG1만을 포함하는 대조군 작제물 1, (g) 대조군 작제물 2: PNGase F(탈당화 ENPP1-Fc)로 처리한 작제물 1의 ENPP1-Fc 작제물, 및 (h) 대조군 작제물 3: 대조군 작제물 2의 모의 치료 버전. 파선은 대조군 샘플에 대해 ELISA 신호의 50%를 나타내는 것으로 도시되어 있다.
도 9a 및 도 9b는 다양한 ENPP1-Fc 작제물들의 활성 및 연관된 생체 내 PPi 수준을 도시하는 막대 그래프이다. 도 9a는 360일에 걸쳐 생체 내 시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 및 시험 작제물 7의 활성 수준을 보여준다. 도 9b는 시험 기간 동안 시험 작제물 5, 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7로 치료한 마우스에서의 PPi 수준을 보여준다. 시험 작제물 5는 작제물의 가용성 ENPP1 부분이 다음의 아미노산 링커 서열을 통해 작제물의 Fc 부분에 연결되는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다: GGGGS (서열번호 63) (서열번호 119). 시험 작제물 6은 ENPP1 부분의 촉매 도메인이 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인이 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다 (서열번호 120). 시험 작제물 7은 SMB1 및 SMB2 도메인이 결여되고, ENPP1 부분의 촉매 도메인은 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인은 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다 (서열번호 121).
도 10a-d는 비히클 또는 다양한 ENPP1-Fc 작제물(시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 또는 시험 작제물 7)로 치료한 마우스에서의 심장, 대동맥, 신장 및 비장의 PPi 수준 및 조직 석회화의 그래프를 도시한다. 도 10a는 비히클 또는 시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 또는 시험 작제물 7로 치료한 마우스에서의 PPi 수준을 보여준다. 마우스를 비히클 또는 시험 작제물 5, 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7로 치료하고, 심장 및 대동맥의 조직 석회화(도 10b), 신장(도 10c), 및 비장(도 10d)을 측정하였다. 시험 작제물 5는 작제물의 가용성 ENPP1 부분이 다음의 아미노산 링커 서열을 통해 작제물의 Fc 부분에 연결되는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다: GGGGS (서열번호 63). (서열번호 119). 시험 작제물 6은 ENPP1 부분의 촉매 도메인이 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인이 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다. (서열번호 120). 시험 작제물 7은 SMB1 및 SMB2 도메인이 결여되고, ENPP1 부분의 촉매 도메인은 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인은 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다 (M252Y, S254T, T256E). (서열번호 121).
도 11은 SMB 도메인을 포함하거나(시험 작제물 5) 또는 SMB 도메인이 결여된(시험 작제물 2) ENPP1-Fc 폴리펩티드의 응집을 보여준다. 각각의 샘플을 15일 동안(시험 작제물 2) 또는 13일 동안(시험 작제물 5) 100mM DTT가 있거나 없이 실온에서 인큐베이션하였다. SMB 도메인이 결여된, 시험 작제물 2 샘플은 15일 동안 깨끗한 상태를 유지했다.
도 2는 인간 ENPP1의 특정 도메인을 도시한다.
도 3은 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 2).
도 4는 SMB1 및 SMB2 모두 결여된 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 3).
도 5a 및 도 5b는 다양한 척추동물 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및 인간 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 다중 서열 정렬을 도시한다(서열번호 4-8). 다양한 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 다음 종에 상응하며, 특이적 NCBI 수탁 번호의 영역을 나타낸다: 마우스(NCBI 수탁 NP_001295256.1; 서열번호 4), 소(NCBI 수탁 NP_001193141; 서열번호 5), 토끼(NCBI 수탁 NP_001162404.1; 서열번호 6), 인간(NCBI 수탁 NP_006199.2; 서열번호 7), 및 개코원숭이(NCBI 수탁 NP_001076211.2; 서열번호 8).
도 6은 야생형 ENPP3 전구체 단백질의 전체, 미가공 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 116). 세포질 및 막관통 영역은 밑줄이 그어져 있다. 가용성 ENPP3 단백질 부분은 SMB1 및 SMB2를 포함한다.
도 7은 인간 ENPP3의 특정 도메인을 도시한다.
도 8은 랫트 및 비인간 영장류(NHP) 샘플에 대해 수행된 항-약물 항체(ADA) ELISA 경쟁 검정의 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 동물 연구 중에 생성된 ADA를 함유하는 혈청 및 혈장 샘플을 ENPP1-Fc-처리된 검정 플레이트에 첨가하고 경쟁자로 처리하였다. ELISA 신호 변화를 측정하였으며, 이를 대조군 신호에 대한 비율로서 나타낸다. 검정에 사용된 경쟁자는 다음을 포함한다: (a) 작제물 1: 인간 ENPP1의 전체 세포외 도메인을 함유하는 ENPP1-Fc 작제물, (b) 작제물 2: ENPP1의 SMB1 및 SMB2 도메인이 결여된 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물, (c) 작제물 3: 촉매 도메인을 시노몰구스 원숭이 ENPP1의 상응하는 도메인으로부터의 촉매 도메인으로 치환시킨 가용성 인간 ENPP1을 포함하는 ENPP1-Fc 작제물, (d) 작제물 4: 뉴클레아제-유사 도메인을 시노몰구스 원숭이 ENPP1의 상응하는 도메인으로 치환시킨 가용성 인간 ENPP1을 포함하는 ENPP1-Fc 작제물, (e) 작제물 5: 작제물의 가용성 ENPP1 부분이 다음의 아미노산 링커 서열을 통해 작제물의 Fc 부분에 연결되는 ENPP1-Fc 작제물: GGGGS (서열번호 63), (f) 인간 IgG1만을 포함하는 대조군 작제물 1, (g) 대조군 작제물 2: PNGase F(탈당화 ENPP1-Fc)로 처리한 작제물 1의 ENPP1-Fc 작제물, 및 (h) 대조군 작제물 3: 대조군 작제물 2의 모의 치료 버전. 파선은 대조군 샘플에 대해 ELISA 신호의 50%를 나타내는 것으로 도시되어 있다.
도 9a 및 도 9b는 다양한 ENPP1-Fc 작제물들의 활성 및 연관된 생체 내 PPi 수준을 도시하는 막대 그래프이다. 도 9a는 360일에 걸쳐 생체 내 시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 및 시험 작제물 7의 활성 수준을 보여준다. 도 9b는 시험 기간 동안 시험 작제물 5, 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7로 치료한 마우스에서의 PPi 수준을 보여준다. 시험 작제물 5는 작제물의 가용성 ENPP1 부분이 다음의 아미노산 링커 서열을 통해 작제물의 Fc 부분에 연결되는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다: GGGGS (서열번호 63) (서열번호 119). 시험 작제물 6은 ENPP1 부분의 촉매 도메인이 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인이 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다 (서열번호 120). 시험 작제물 7은 SMB1 및 SMB2 도메인이 결여되고, ENPP1 부분의 촉매 도메인은 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인은 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다 (서열번호 121).
도 10a-d는 비히클 또는 다양한 ENPP1-Fc 작제물(시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 또는 시험 작제물 7)로 치료한 마우스에서의 심장, 대동맥, 신장 및 비장의 PPi 수준 및 조직 석회화의 그래프를 도시한다. 도 10a는 비히클 또는 시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 또는 시험 작제물 7로 치료한 마우스에서의 PPi 수준을 보여준다. 마우스를 비히클 또는 시험 작제물 5, 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7로 치료하고, 심장 및 대동맥의 조직 석회화(도 10b), 신장(도 10c), 및 비장(도 10d)을 측정하였다. 시험 작제물 5는 작제물의 가용성 ENPP1 부분이 다음의 아미노산 링커 서열을 통해 작제물의 Fc 부분에 연결되는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다: GGGGS (서열번호 63). (서열번호 119). 시험 작제물 6은 ENPP1 부분의 촉매 도메인이 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인이 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다. (서열번호 120). 시험 작제물 7은 SMB1 및 SMB2 도메인이 결여되고, ENPP1 부분의 촉매 도메인은 I332T 치환을 포함하고 Fc 도메인은 삼중 돌연변이(M252Y, S254T, T256E)를 포함하는 인간 ENPP1의 세포외 도메인의 변이체 형태를 포함하는 ENPP1-Fc 작제물을 포함한다 (M252Y, S254T, T256E). (서열번호 121).
도 11은 SMB 도메인을 포함하거나(시험 작제물 5) 또는 SMB 도메인이 결여된(시험 작제물 2) ENPP1-Fc 폴리펩티드의 응집을 보여준다. 각각의 샘플을 15일 동안(시험 작제물 2) 또는 13일 동안(시험 작제물 5) 100mM DTT가 있거나 없이 실온에서 인큐베이션하였다. SMB 도메인이 결여된, 시험 작제물 2 샘플은 15일 동안 깨끗한 상태를 유지했다.
1.
개요
본 출원은 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP3 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 ENPP1 또는 ENPP3과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 데 이들의 용도를 제공한다. 소정의 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및 이의 용도(예를 들어, 병리학적 석회화 및/또는 골화의 진행 속도 및/또는 중증도 또는 병리학적 석회화 및/또는 골화의 하나 이상의 합병증을 치료, 예방 및/또는 감소시키는 것)에 관한 것이다. 소정의 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 용도(예를 들어, 병리학적 석회화 및/또는 골화의 진행 속도 및/또는 중증도 또는 병리학적 석회화 및/또는 골화의 하나 이상의 합병증을 치료, 예방 및/또는 감소시키는 것)에 관한 것이다. 따라서, 본 개시는 ENPP1 또는 ENPP3의 기능적으로 활성인 부분 및 변이체를 식별한다. ENPP1 유전자의 특정 돌연변이는 영아의 전신성 동맥 석회화(GACI), 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 인슐린 내성, 저인산혈성 구루병, 및 척추의 후종 인대 골화와 관련이 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다.
희귀 상염색체 열성 질환으로 거의 항상 치명적인 장애인, IIAC는 근육 동맥의 내부 탄성판의 석회화 및 근내막 증식으로 인한 협착을 특징으로 한다. 질환의 증상은 초기 영아기에 가장 흔히 나타나며, 질환은 6개월령에 치명적이며, 이는 일반적으로 허혈성 심근병증 및 신장 동맥 협착을 포함하는 폐쇄성 동맥병증의 다른 합병증 때문이다. 십여 건 넘게 보고된 IIAC 사례에서, 큰 관절의 관절주위 석회화도 영아기에 발생했다. ENPP1에서의 돌연변이는 특정 IIAC 환자에서 뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라제 활성의 저하와 관련이 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, Rutsch 등 (2003), Nature Genetics 34:379-81 참조.
ENPP1 폴리펩티드는 이소성 조직 석회화의 특정 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 나타났다. ENPP1-Fc는 GACI(영아의 전신성 동맥 석회화)에 대한 마우스 모델에서 전신성 동맥 석회화를 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 영아에서 발생하고 광범위한 동맥 석회화를 수반하는 중증 질환이다(Albright, 등, 2015, Nature Comm. 10006). ENPP1의 융합 단백질 또한 중증 조직 석회화 질환을 치료하는 것으로 기술되었으며(예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO 2014/126965 및 WO 2016/187408), 및 음으로 하전된 골-표적 도메인을 포함하는 ENPP1의 융합 단백질은 GACI를 치료하는 것으로 기술되었다(PCT 출원 공개 번호 WO 2011/113027 및 WO 2012/125182).
소정의 측면에서, 본 개시는 ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드의 비정상적인 활성과 관련된 질환 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 있어서, ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 변이체를 사용하는 것을 고려한다. ENPP1 및 ENPP3 폴리펩티드는 많은 중요한 생물학적 과정의 조절(예를 들어, 심혈관, 신경, 면역, 근골격, 호르몬 및 혈액학적 기능의 조절)에 관여한다. 이들 공정에서 이들의 주요 기능으로 인해, 이들은 치료적 개입을 위한 바람직한 표적일 수 있다. 예를 들어, ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드)는 인간 또는 동물 장애 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 장애 또는 병태의 예는 다음을 포함하지만, 이들에만 한정되지 않는다: 이소성 석회화(예를 들어, 연조직 석회화, 동맥 석회화, 및 혈관 석회화), 만성 신장 질환(CKD), 말기 신장 질환(ESRD), 석회화 요독 동맥병증(CUA), 칼시필락시스, 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 상염색체 열성 저인산혈성 구루병 2형(ARHR2), 골관절염, 노화 관련 동맥 경화, 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 영아기의 전신성 동맥 석회화(GACI), 및 죽상동맥경화성 플라크의 석회화. 다른 예는 ENPP1 결핍(예를 들어, GACI 및 ARHR2), 탄성섬유 가황색종(PXE), 대상체가 ABCC6 유전자에 병원성 돌연변이를 갖는 장애, 및 병리학적 골화를 포함한다. ENPP1 폴리펩티드 및 이들 장애 및 병태는 아래에서 보다 상세히 논의된다.
2.
가용성 ENPP 폴리펩티드
소정의 측면에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에 개시된 ENPP1 및 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP1 및 ENPP3 계열의 자연 발생 폴리펩티드 뿐만 아니라 생물학적 활성을 보유하는 이의 임의의 변이체(돌연변이체, 단편, 융합체 및/또는 펩티드모방 형태 포함)를 포함한다. 용어 "ENPP1" 또는 "ENPP1 폴리펩티드"는 임의의 종으로부터 유래된, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라제 1 단백질(NPP1/ENPP1/PC-1) 및 ENPP1-관련 단백질을 지칭한다. 용어 "ENPP3" 또는 "ENPP3 폴리펩티드"는 임의의 종으로부터 유래된, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라제 3 단백질(NPP3/ENPP3/PDNP3) 및 ENPP3-관련 단백질을 지칭한다. ENPP1 단백질은 동종이량체를 형성하는 II형 막관통 당단백질을 포함한다. ENPP1 단백질의 각각의 단량체는 원형질막에 대한 표적화에 관여하는 짧은 세포내 N-말단 도메인, 막관통 도메인, 및 여러 도메인을 포함하는 큰 세포외 영역을 포함한다. 큰 세포외 영역은 ENPP1 이량체화에 참여하는 것으로 보고된, SMB1 및 SMB2 도메인을 포함한다(R. Gijsbers, H. 등, Biochem. J. 371; 2003: 321-330). 구체적으로, SMB 도메인은 각각 4개의 이황화 결합으로 배열된, 8개의 시스테인 잔기를 함유하며, 공유 시스틴 분자간 및 분자내 결합을 통해 ENPP1 동종이량체화를 매개하는 것으로 나타났다. 단백질은 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 당의 인산디에스테르 결합 및 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 당의 피로포스페이트 결합을 포함하는, 다양한 기질을 절단한다. ENPP1 단백질은 뉴클레오시드 5' 트리포스파타아제를 상응하는 모노포스페이트로 가수분해하고 또한 다이아데노신 폴리포스페이트를 가수분해하는 기능을 한다. ENPP1 단백질은 심혈관, 신경, 면역, 근골격, 호르몬 및 혈액학적 기능의 조절에 관여하는 퓨린 신호전달에 역할을 한다. 인간 ENPP1 전구체 단백질(NCBI 수탁 NP_006199)의 예시적인 아미노산 서열은 도 1(서열번호 1)에 도시되어 있다. 인간 ENPP1 전구체 단백질은 ENPP1 N-말단에 내인성 ENPP1 신호 펩티드 서열을 포함한다. 본원에 설명되는 모든 ENPP1-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 번호는 달리 명시되지 않는 한 도 1에 제공된 인간 ENPP1 전구체 단백질 서열의 번호에 기초한다. 소정의 실시예에서, ENPP1 전구체 단백질은 내인성 또는 이종 신호 펩티드 서열을 추가로 포함한다. 단백질분해 시, 신호 서열을 ENPP1로부터 절단하여 성숙 ENPP1 단백질을 제공한다. 예를 들어, Jansen S 등 J Cell Sci. 2005;118(Pt 14):3081-9 참조. 본원에서 개시된 폴리펩티드로 사용될 수 있는 예시적인 신호 펩티드 서열은 ENPP1 신호 펩티드 서열, ENPP2 신호 펩티드 서열, ENPP7 신호 펩티드 서열, 및/또는 ENPP5 신호 펩티드 서열을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 가공된 (성숙) 세포외 ENPP1 폴리펩티드 서열은 도 3(서열번호 2)에 도시되어 있다.
일반적으로, ENPP1이 척추동물 사이에서 잘 보존되고, 세포외 도메인의 큰 구간이 실질적으로 보존된다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 도 5a 및 도 5b는 다양한 ENPP1 오소로그와 비교하여 인간 ENPP1 세포외 도메인의 다중 서열 정렬을 도시한다. 다양한 뉴클레오티드 트리포스페이트(예를 들어, ATP, UTP, GTP, TTP, 및 CTP), pNP-TMP, 3',5'-cAMP, 및 2'-3'-cGAMP에 대한 ENPP1 결합은 또한 고도로 보존된다(예를 들어, Kato K. 등, Proc Natl Acad Sci USA 2012;109(42):16876-81 및 Mackenzie NC, 등, Bone. 2012;51(5):961-8). 따라서, 이들 정렬로부터, 정상적인 ENPP1 활성을 상당히 변경시키지 않고 치환에 내성이 있을 가능성이 있는 아미노산 위치를 예측하는 것뿐만 아니라 정상적인 ENPP1 활성에 중요한 세포외 도메인으로 주요 아미노산 위치를 예측하는 것이 가능하다. 따라서, 현재 개시된 방법에 따라 유용한 활성 인간 ENPP1 폴리펩티드는 다른 척추동물 ENPP1의 서열로부터 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 인간 또는 다른 척추동물 서열에서의 것과 유사한 잔기를 포함할 수 있다. 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환은 폴리펩티드 사슬의 형상을 변화시키거나 정상적인 ENPP1 활성을 변경시킬 가능성이 없는 보존적 변이 또는 치환을 포함할 수 있다. 보존적 변이 또는 치환의 예는, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 다른 것에 대해 대체하는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 것에 대해 치환하는 것, 예컨대 리신에 대한 아르기닌, 아스파르트산에 대한 글루탐산, 또는 아스파라긴에 대한 글루타민을 치환하는 것, 등등을 포함한다. 예를 들어, ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드의 서열과 적어도 약 80% 동일한 서열, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일성을 갖는 임의의 공지된 ENPP1 폴리펩티드의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 다른 종(예를 들어, 인간 내지 시노몰구스) 유래의 상응하는 도메인 또는 하위 서열로 치환된 ENPP1 폴리펩티드 도메인(예를 들어, SMB1, SMB2, 촉매 도메인, 뉴클레아제-유사 도메인, 링커 서열) 또는 하위서열을 포함할 수 있다.
ENPP1 단백질은 구조적 및 생물학적 특징 측면에서 당업계에서 특징지어졌다. 소정의 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 단백질은 피로포스파타아제 및/또는 포스포디에스테라제 활성을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, ENPP1 단백질은 뉴클레오티드 트리포스페이트(예를 들어, ATP, UTP, GTP, TTP, 및 CTP), pNP-TMP, 3',5'-cAMP, 및 2'-3'-cGAMP에 결합하고; 뉴클레오티드 트리포스페이트를 무기 피로포스페이트로 전환시킨다[예를 들어, Kato K 등 Proc Natl Acad Sci USA 2012;109(42):16876-81; Li L, 등 Nat Chem Biol. 2014;10(12):1043-8; Jansen S, 등 Structure. 2012;20(11):1948-59; 및 Onyedibe Kl, 등 Molecules. 2019;24(22) 참조]. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효소 활성" 또는 "생물학적 활성"은 피로포스파타아제 및/또는 포스포디에스테라제 활성을 나타내는 ENPP1 폴리펩티드를 지칭한다 (예를 들어, ATP를 AMP로 결합 및/또는 가수분해하고, PPi 및/또는 AP3a를 ATP로 가수분해할 수 있음). 예를 들어, ENPP1 단백질의 피로포스파타아제/포스포디에스테라제 도메인은 세포외 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가수분해하여 무기 피로포스페이트(PPi)를 생산하고 일반적으로 가용성이다. 이러한 활성은 전술한 바와 같은 pNP-TMP 검정을 사용하여 측정될 수 있다(Saunders 등, 2008, Mol. Cancer Ther. 7(10):3352-62; Albright, 등, 2015, Nat Comm. 6:10006). 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 약 3.4(±0.4) s-1 효소-1 이상의 기질 ATP에 대한 k cat 값을 가지며, 여기서 k cat 은 폴리펩티드에 대한 ATP의 가수분해 속도를 측정함으로써 결정된다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 약 2 pM 이하의 기질 ATP에 대한 K M 값을 가지며, 여기서 K M 은 폴리펩티드에 대한 ATP의 가수분해 속도를 측정함으로써 결정된다. 본원의 교시에 더하여, 이들 참조 문헌은 하나 이상의 생물학적 활성을(예를 들어, 뉴클레오티드를 무기 피로포스페이트로 변환) 보유하는 가용성 ENPP1 단백질을 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.
일 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에 설명되는 바와 같이, 가용성 ENPP1 폴리펩티드라는 용어는 생물학적 활성(예를 들어, 효소적 활성)을 보유하는 ENPP1 단백질의 임의의 자연 발생 세포외 도메인 뿐만 아니라 임의의 변이체(돌연변이체, 단편 및/또는 펩티드모방 형태 포함)를 포함한다. 예시적인 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 단백질의 세포외 도메인(예를 들어, NCBI 수탁 NP_006199의 잔기 96 내지 925 또는 NCBI 수탁 NP_006199의 잔기 190 내지 925)을 포함하고 본원에 기술된다. 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 예는, 예를 들어, 도 3에 도시된 바와 같은 ENPP1 세포외 도메인(서열번호 2); SMB1 또는 SMB2 도메인 중 적어도 하나가 결여된 ENPP1 세포외 도메인; SMB1 및 SMB2 도메인 모두 결여된 ENPP1 세포외 도메인(예를 들어, 서열번호 3에 도시됨)을 포함한다. 서열번호 3에 도시된 절단된(truncated) ENPP1 세포외 도메인은 서열번호 1의 번호에 기초하여 ENPP1(190-925)을 표시한다. 예시적인 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 촉매 도메인 및 뉴클레아제 유사 도메인을 포함한다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드의 세포외 도메인에 더하여 신호 서열을 추가로 포함한다. 예시적인 신호 서열은 ENPP1 폴리펩티드의 고유 신호 서열, 또는 hENPP7 신호 서열과 같은 다른 단백질로부터의 신호 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 변이체 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 예는 본 개시의 전체 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/125182, WO 2014/126965, WO 2016/187408, WO 2018/027024, WO 2020/206302, 및 WO 2020/047520에 걸쳐 제공되고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
당 분야의 숙련자라면 ENPP1 폴리펩티드의 다양한 도메인에 대응하는 잔기가 다양할 수 있음을 인식할 것이다. 구체적으로, 폴리펩티드 도메인의 식별은 전통적으로 단백질 서열 및/또는 구조에 기초한다. 폴리펩티드 서열 및/또는 구조는 관련 폴리펩티드 도메인을 식별하는데 사용될 수 있다(즉, 폴리펩티드는 다른 단백질 구조 또는 도메인과 서열 및/또는 구조적 유사성을 가질 수 있다). 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 99, 100, 101, 102, 103, 104, 104, 105, 106, 107, 또는 108 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 140, 141, 142, 143, 144, 또는 145 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 104의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 잔기 143의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 100-142를 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 104-144를 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP1의 SMB2 도메인은 서열번호 1의 아미노산 141, 142, 143, 144 또는 145 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 186, 187, 188, 189 또는 190 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB2 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 143의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 잔기 188의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB2 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 142-187을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 SMB2 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 145-189를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 링커 도메인(도 2에 도시된 바와 같은 "LI")은 서열번호 1의 아미노산 185, 185, 185, 187, 185, 또는 189 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 206, 207, 208, 209 또는 210 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 제1 링커 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 187의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 잔기 208의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 제1 링커 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 187-208을 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP1의 촉매 도메인(포스포디에스테라제 도메인)은 서열번호 1의 아미노산 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 204, 205, 206, 206, 206, 207, 208, 또는 209 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 또는 598 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 촉매 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 199의 상류 또는 하류의 ±11 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 잔기 594의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 촉매 도메인은 서열번호 1의 잔기 208-597을 포함한다. 일부 실시예에서, 촉매 도메인은 서열번호 1의 잔기 191-591을 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP1의 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 1의 아미노산 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 또는 655 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 923, 924, 또는 925 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1의 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 651의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 1의 아미노산 잔기 923의 상류 또는 하류의 ±2 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 1의 잔기 648-925를 포함한다. 일부 실시예에서, 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 1의 잔기 654-925를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 치료 효능 또는 안정성(예를 들어, 저장 수명 및 생체내 단백질분해에 대한 저항성)을 향상시키지만, 이에 한정되지 않는 목적으로 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 구조를 변형시킴으로써 기능적 ENPP1 변이체를 생성하는 것을 고려한다. 변이체는 아미노산 치환, 결실, 첨가, 또는 이들의 조합에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 단리된 치환, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 대체(예를 들어, 보존적 돌연변이)는 생성된 분자의 생물학적 활성에 주요한 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 보존적 대체는 측쇄에서 관련된 아미노산의 계열 내에서 발생하는 것이다. 본 개시의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화가 기능적 상동체를 초래하는지 여부는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 변이체 폴리펩티드의 효소 활성, 야생형 폴리펩티드와 비교하여 무기 피로포스페이트(PPi)를 생산하는 변이체 폴리펩티드의 능력, 또는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 변이체 폴리펩티드가 ATP, UTP, GTP, TTP, CTP, pNP- TMP, 3',5'-cAMP 및 2'-3'-cGAMP 중 하나 이상에 결합하는 능력을 평가함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
소정의 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에서의 치환, 예를 들어, 촉매 및/또는 뉴클레아제 도메인에서의 하나 이상의 치환을 도입하는 것을 고려한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 제조 및/또는 투여 중에 프로테아제에 의한 절단에 민감한 서열번호 1의 위치에서의 치환을 포함한다. 예시적인 치환은, 예를 들어, 서열번호 1에 대해 위치 816, 817, 또는 818을 포함하는 서열번호 1의 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타낸다. 임의로, 촉매 및/또는 뉴클레아제 도메인에서 치환을 갖는 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 유사하게 ATP을 AMP 및 PPi로 및/또는 AP3a를 ATP로 결합하고 가수분해할 수 있다. 일부 실시예에서, 프로테아제는 트립신이다. 일부 실시예에서, 프로테아제는 트립신-유사 프로테아제이다.
소정의 실시예에서, 이러한 치환은 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 단백질분해 내성을 야생형 ENPP1 폴리펩티드보다 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 또는 300% 이상 증가시킨다. 다른 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드에서의 치환은 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 또는 300% 만큼 증가된 단백질 순도를 갖는 균질한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 프로테아제에 의한 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 절단은 다양한 길이의 여러 폴리펩티드를 초래할 수 있다. 프로테아제 저항성 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 단일 종을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 생산 또는 생산되는 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 균질성 증가를 초래할 수 있다. 또한, ENPP1 폴리펩티드의 더 큰 단백질분해 내성은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 또는 300% 만큼 단백질 절단 감소를 초래할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환"은 야생형 ENPP1 폴리펩티드를 참조하여 삽입, 결실 및/또는 변형을 포함한다.
본 개시는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 갖는 다수의 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제공한다. 임의로, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 예를 들어, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 유사하게 ATP을 AMP 및 PPi로 및/또는 AP3a를 ATP로 결합하고 가수분해할 수 있다. 따라서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있으며, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1이 추가로 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1SMB11 도메인은 서열번호 1의 잔기 100 내지 141과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 142 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB2가 추가로 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 SMB2 도메인은 서열번호 1의 잔기 142 내지 186과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 107 내지 144 및 서열번호 1의 잔기 190 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 100 내지 142 및 서열번호 1의 잔기 187 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB2 및 제1 링커 도메인이 추가로 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1 및 SMB2가 추가로 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 188 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 190 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1, SMB2, 및 제1 링커 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 11과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 12과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 121과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 122과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 N-말단 리더 서열(예를 들어, MTRLTVALLAGLLASSRA)을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 127과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 128과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817, 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817, 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 적어도 위치 816에서 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 위치 816에서 적어도 리신(K)에 대한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 위치 816에서의 리신(K)은 히스티딘(H)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 위치 816에서의 리신(K)은 아르기닌(R)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 위치 817에서 적어도 아르기닌(R)에 대한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 위치 817에서의 아르기닌(R)은 히스티딘(H)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 위치 817에서의 아르기닌(R)은 리신(K)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 위치 817에서 적어도 아르기닌(R)에 대한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 적어도 위치 818에서 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 위치 818에서 적어도 아르기닌(R)에 대한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 위치 818에서의 아르기닌(R)은 리신(K)으로 치환된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 위치 818에서 적어도 아르기닌(R)에 대한 아미노산 치환을 포함한다.
소정의 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드가 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 면역원성을 감소시키도록 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결실을 도입하는 것을 고려한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드가 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 단백질 응집을 감소시키도록 ENPP1 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결실을 도입하는 것을 고려한다. 예를 들어, 소마토메딘 B 도메인 1(SMB1) 및 SMB2 도메인은 이황화 결합 형성에 관여하는 시스테인 잔기의 수의 증가로 인해 응집 경향이 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB 도메인 1이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB2가 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1 및 SMB2 모두 결여되어 있다. 소정의 경우에, ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 추가로 결여되어 있다.
소정의 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드의 전구체의 분비를 초래하는 신호 펩티드를 포함하며, 이는 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 수득하기 위한 단백질분해 공정을 거친다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 ENPP2, ENPP5 및 ENPP7의 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1의 막관통 도메인을 포함하는 ENPP1 폴리펩티드및 다른 폴리펩티드, 예컨대 비제한적인 예로서 ENPP2를 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 ENPP2 막관통 도메인을 포함하는 전구체 ENPP1 폴리펩티드의 절단 산물을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP2 막관통 도메인은 아미노산 서열 IISLFTFAVGVNICLGFTA(서열번호 20)를 포함한다.
소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1과 비교하여, 신호 펩티드 다음에, 그리고 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 펩티다아제 절단 부위를 포함하는 ENPP1의 세포외 영역의 분절로 변형된다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1과 비교하여, 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 퓨린 절단 부위를 포함하는 ENPP1의 세포외 영역의 분절로 변형된다. 다른 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1과 비교하여, 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 퓨린 절단 부위를 포함하는 ENPP1의 세포외 영역의 분절로 변형되지 않는다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1과 비교하여, 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 퓨린 절단 부위를 포함하는 ENPP1의 세포외 영역의 분절로 변형된다. 다른 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1과 비교하여, 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 퓨린 절단 부위를 포함하는 ENPP1의 세포외 영역의 분절로 변형되지 않는다.
일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 동종이량체화 능력이 감소된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드의 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, SMB1 및/또는 SMB2의 결실)을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 동종이량체화를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 동종이량체화 능력이 감소되지 않는다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 동종이량체를 형성한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 가용성 야생형 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 인간 IR에 대한 ENPP1의 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 인간 IR에 대한 ENPP1의 친화도를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1의 포스포디에스테라제 촉매 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1이 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 145 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 142 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB2가 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 107 내지 144 및 서열번호 1의 잔기 190 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 100 내지 142 및 서열번호 1의 잔기 187 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB2 및 제1 링커 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1 및 SMB2가 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 188 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 190 내지 925와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB1, SMB2, 및 제1 링커 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 9과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 121과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 122과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 127과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 128과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드가 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타내도록, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드의 세포외 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 SMB 도메인 1 및 2 중 하나 또는 모두 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인을 제거하기 위해 절단된다(truncated). 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 약 잔기 524에서 약 잔기 885까지 뉴클레아제 도메인을 제거하기 위해 절단되어, 서열번호 1에 대해 약 잔기 186 내지 약 잔기 586만을 남기며, 이는 단백질의 촉매 활성을 보존하는 역할을 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에서의 치환, 예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은 촉매 및/또는 뉴클레아제 도메인에서의 하나 이상의 치환을 추가로 도입하는 것을 고려한다.
소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 막관통 도메인이 없는 ENPP1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 ENPP1 막관통 도메인은 제거되고, (그리고/또는 절단되고) 비한정적인 예로서, ENPP2, ENPP5 또는 ENPP7과 같은, 다른 폴리펩티드의 막관통 도메인으로 대체되었다.
일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드 도메인 및 하나 이상의 이종 단백질 부분(즉, ENPP1에 이종인 폴리펩티드 도메인)을 포함하는 융합 단백질이다. 아미노산 서열은 ENPP1이 서열번호 1로 표시되는 ENPP1의 형태로 고유하게 발견되지 않는 경우, ENPP1에 대해 이종인 것으로 이해된다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인이다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 I(IgG1), 인간 면역글로불린 2(IgG2), 인간 면역글로불린 3(IgG3), 및/또는 인간 면역글로불린 4(IgG4)의 Fc 도메인에 C-말단으로 융합된다. 다른 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 I(IgG1), 인간 면역글로불린 2(IgG2), 인간 면역글로불린 3(IgG3), 및/또는 인간 면역글로불린 4(IgG4)의 Fc 도메인에 N-말단으로 융합된다. 일부 실시예에서, Fc 도메인의 존재는 반감기, 용해도를 개선하고, 면역원성을 감소시키고, ENPP1 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 소정의 실시예에서, 천연 인간 IgG 단백질(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)의 일부가 Fc 부분(예를 들어, ENPP1-Fc)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4로부터 유래된 CHI, CH2, 또는 CH3 도메인과 같은, 면역글로불린의 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합된 ENPP1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Fc 단편은 천연 IgG의 영역, 예컨대 힌지 영역(Rabat 넘버링 시스템에 따라, 인간 IgG1의 잔기 216-230)을 포함할 수 있으며, 전체 제2 불변 도메인 CH2(잔기 231-340) 및 제3 불변 도메인 CH3(잔기 341-447). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ENPP1-Fc 작제물"은 IgG 분자(바람직하게는 인간 IgG)의 FcR 결합 도메인에 재조합적으로 융합 및/또는 화학적으로 접합된(공유 및 비공유 접합 둘 다 포함함) ENPP1의 가용성 형태(예, ENPP1 폴리펩티드의 세포외 도메인)를 지칭한다. 소정의 실시예에서, ENPP1의 C-말단은 FcR 결합 도메인의 N-말단에 융합되거나 접합된다. 소정의 실시예에서, ENPP1의 N-말단은 FcR 결합 도메인의 C-말단에 융합되거나 접합된다.
일부 실시예에서, Fc 도메인은 변이체 Fc 불변 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 변이체 Fc 불변 영역은, 유래된 천연 불변 영역에 비해 30개 이하(예를 들어, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개)의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시예에서, 변이체 Fc 불변 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I, 및 V308F. 일부 실시예에서, 변이체 Fc 불변 영역은 아미노산 치환 M252Y, S254T, 및 T256E를 포함한다. 일부 실시예에서, 변이체 인간 Fc 불변 영역은 각각 EU 넘버링에서, 위치 428에서 메티오닌 및 위치 434에서 아스파라긴을 포함한다. 일부 실시예에서, 변이체 Fc 불변 영역은 예를 들어, 미국 특허 제8,088,376호에 기술된 428L/434S 이중 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 기능적 등가물 또는 기능적 유도체가 본원에 개시된 ENPP1-Fc 작제물과 동일하거나 유사하거나 더 높은 생물학적 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위한 방법은 WO 2016/187408에 설명되는 ATP 절단을 포함하는 효소 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
인간 IgG1의 Fc 부분(GlFc)에 사용될 수 있는 아미노산 서열의 예는 서열번호 13일 수 있다 (표 1). 부분적으로, 본 개시는 서열번호 13과 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 서열번호 16과 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 폴리히스티딘, FLAG 태그, Glu-Glu, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP),또는 인간 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인을 포함한다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화도 정제의 목적으로, 글루타티온-, 아밀라아제-, 및 니켈- 또는 코발트- 접합 수지와 같은 친화도 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스가 사용된다. 많은 이러한 매트릭스는 (HIS6) 융합 파트너에서 유용한 Pharmacia GST 정제 시스템 및 QIAEXPRESS™ 시스템(Qiagen)과 같은, "키트" 형태로 이용 가능하다. 다른 예로서, 융합 도메인은 ENPP1 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 이러한 검출 도메인의 예는 다양한 형광 단백질(예를 들어, GFP)뿐만 아니라 특이적 항체가 이용 가능한 일반적으로 짧은 펩티드 서열인, "에피토프 태그"를 포함한다. 특이적 단클론 항체가 쉽게 이용 가능한 주지된 에피토프 태그로는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은, 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 소화시켜 그로부터 재조합 단백질을 유리시킬 수 있게 하는, 팩터 Xa 또는 트롬빈과 같은, 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 그런 다음, 유리된 단백질을 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리할 수 있다. 융합 도메인의 다른 유형은 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 선택될 수 있는 융합 도메인은 다량체화(예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (추가적인 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 응집을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 ENPP1 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분(예를 들어, Fc 도메인)은 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 이량체화를 증가시킨다. 예를 들어, SMB1 및 SMB2 도메인이 ENPP1 이량체화에 참여하는 것으로 보고되었다(R. Gijsbers, H. 등, Biochem. J. 371; 2003: 321-330). 따라서, SMB1 및 SMB2 도메인의 결실은 증가된 단량체 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 단량체다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 이량체다. 일부 실시예에서, SMB1 및 SMB2가 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, SMB1 및 SMB2가 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 이량체화를 증가시키는 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP1 융합 단백질은 ENPP1 폴리펩티드 도메인과 하나 이상의 이종 단백질 부분(예를 들어, Fc 면역글로불린 도메인) 사이에 위치한 링커를 추가로 포함한다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 Fc 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 융합 단백질은 Fc 도메인과 ENPP1 폴리펩티드 사이에 링커를 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 1-200개 아미노산을 포함하는 아미노산 스페이서일 수 있다. 적절한 펩티드 스페이서는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 가요성 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 폴리글리신 링커 또는 Gly-Ser 링커를 포함한다. 일부 실시예에서, 스페이서는 모티프, 예를 들어, GA (서열번호 21), GS (서열번호 22), GG (서열번호 23), GGA (서열번호 24), GGS (서열번호 25), GGG (서열번호 26), GGGA (서열번호 27), GGGS (서열번호 28), GGGG (서열번호 29), GGGGA (서열번호 30), GGGGS (서열번호 31), GGGGG (서열번호 32), GGAG (서열번호 33), GGSG (서열번호 34), AGGG (서열번호 35), SGGGG (서열번호 36), 또는 SGGG (서열번호 37)의 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 스페이서는 GA 또는 GS의 모티프, 예를 들어, GA, GS, GAGA (서열번호 38), GSGS (서열번호 39), GAGAGA (서열번호 40), GSGSGS (서열번호 41), GAGAGAGA (서열번호 42), GSGSGSGS (서열번호 43), GAGAGAGAGA (서열번호 44), GSGSGSGSGS (서열번호 45), GAGAGAGAGAGA (서열번호 46), 및 GSGSGSGSGSGS (서열번호 47)를 포함하는 2 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 스페이서는 GGA 또는 GGS의 모티프, 예를 들어, GGA, GGS, GGAGGA (서열번호 48), GGSGGS (서열번호 49), GGAGGAGGA (서열번호 50), GGSGGSGGS (서열번호 51), GGAGGAGGAGGA (서열번호 52), 및 GGSGGSGGSGGS (서열번호 53)를 포함하는 3 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 또 다른 일부 실시예에서, 스페이서는 GGAG (서열번호 54), GGSG (서열번호 55), 예를 들어, GGAG (서열번호 56), GGSG (서열번호 57), GGAGGGAG (서열번호 58), GGSGGGSG (서열번호 59), GGAGGGAGGGAG (서열번호 60), 및 GGSGGGSGGGSG (서열번호 61)의 모티프를 포함하는 4 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 스페이서는 GGGGA (서열번호 62) 또는 GGGGS (서열번호 63), 예를 들어, GGGGAGGGGAGGGGA (서열번호 64) 및 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 65)의 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분(예를 들어, Fc 도메인 단량체, 야생형 Fc 도메인, 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인(예를 들어, 이량체화를 감소시키는 하나 이상의 치환), 알부민-결합 펩티드, 피브로넥틴 도메인, 또는 인간 혈청 알부민) 및 가용성 ENPP1 폴리펩티드 사이의 아미노산 스페이서는 GGG, GGGA (서열번호 27), GGGG (서열번호 29), GGGAG (서열번호 66), GGGAGG (서열번호 67), 또는 GGGAGGG (서열번호 68)일 수 있다.
일부 실시예에서, 스페이서는 또한 글리신, 알라닌, 세린 이외의 아미노산을 함유할 수 있다, 예: LIN (서열번호 69), TGGGG (서열번호 70), AAAL (서열번호 71), AAAK (서열번호 72), AAAR (서열번호 73), EGKSSGSGSESKST (서열번호 74), GSAGSAAGSGEF (서열번호 75), AEAAAKEAAAKA (서열번호 76), KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 77), GENLYFQSGG (서열번호 78), SACYCELS (서열번호 79), RSIAT (서열번호 80), RPACKIPNDLKQKVMNH (서열번호 81), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (서열번호 82), AAANSSIDLISVPVDSR (서열번호 83), GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (서열번호 84), NSS (서열번호 87), ESS (서열번호 88), RQQ (서열번호 89), KR (서열번호 90), (R)m 여기서 m은 0-15임 (서열번호 91), DSSSEEKFLRRIGRFG (서열번호 92), EEEEEEEPRGDT (서열번호 93), APWHLSSQYSRT (서열번호 94), STLPIPHEFSRE (서열번호 95), VTKHLNQISQSY (서열번호 96), (E)m 여기서 m은 1-15임 (서열번호 97), RSGSGGS (서열번호 98), (D)m 여기서 m은 1-15임 (서열번호 99), LVIMSLGLGLGLGLRK (서열번호 100), VIMSLGLGLGLGLRK (서열번호 101), IMSLGLGLGLGLRK (서열번호 102), MSLGLGLGLGLRK (서열번호 103), SLGLGLGLGLRK (서열번호 104), LGLGLGLGLRK (서열번호 105), GLGLGLGLRK (서열번호 106), LGLGLGLRK (서열번호 107), GLGLGLRK (서열번호 108), LGLGLRK (서열번호 109), GLGLRK (서열번호 110), LGLRK (서열번호 111), GLRK (서열번호 112), LRK (서열번호 113), RK (서열번호 114), or (K)m 여기서 m은 1-15임 (서열번호 115). 일부 실시예에서, 스페이서는 모티프, 예를 들어, EAAAK(서열번호 85)의 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 스페이서는 모티프, 예를 들어, 프랄린-풍부 서열, 예컨대 (XP)n, 여기서 X는 임의의 아미노산(예를 들어, A, K, 또는 E)일 수 있고 n은 1-5이고, PAPAP(서열번호 86)의 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다.
펩티드 스페이서 및 사용된 아미노산의 길이는 관련된 2개의 단백질 및 최종 단백질 융합 폴리펩티드에서 원하는 유연성의 정도에 따라 조정될 수 있다. 스페이서의 길이는 적절한 단백질 접힘을 보장하고 응집체 형성을 피하기 위해 조정될 수 있다.
일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 인간 혈청 알부민 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 인간 혈청 알부민 폴리펩티드는 ENPP1 폴리펩티드에 C-말단으로 융합된다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민에 N-말단으로 융합된다. 인간 혈청 알부민은 자연 발생 또는 조작된 이황화 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 화학적 링커를 통해 가용성 ENPP1 폴리펩티드에 접합되거나, 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 또는 이의 단편 및/또는 변이체에 대한 유전적 융합에 의해 접합될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 적어도 하나의 소마토메딘 B 도메인이 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분 및 이종 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드 부분은 SMB1이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드 부분은 SMB2가 결여되어 있다. 일부 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드 부분은 SMB1 및 SMB2가 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 음으로 하전된 골-표적 도메인이 추가로 결여되어 있다.
일부 실시예에서, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분 및 이종 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 위치 816에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 위치 817에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 위치 818에서 아미노산 치환을 포함한다. 이들 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 초래할 수 있다. 위치 816, 817 및/또는 818에서의 아미노산 치환을 포함하는 ENPP1 폴리펩티드가 생산되었으며, 이들 돌연변이체의 각각은 생물학적 활성을 나타낸다. 구체적으로, (1) R818H 돌연변이; (2) R817H 및 R818H 돌연변이; 및 (3) K816H, R817H 및 R818H 돌연변이를 포함하는 ENPP1 폴리펩티드는 각각 생물학적 활성을 나타낸다.
일부 실시예에서, 융합 단백질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 융합 단백질)의 상이한 요소들이 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 폴리펩티드 도메인은 이종 단백질 부분에 C-말단에 놓일 수 있거나, 대안적으로, 이종 단백질 부분은 가용성 ENPP1 폴리펩티드 도메인에 C-말단에 놓일 수 있다. 가용성 ENPP1 폴리펩티드 도메인 및 이종 단백질 부분은 융합 단백질에서 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있고, 추가 도메인 또는 아미노산 서열은 각각의 도메인에 또는 도메인들 사이에 C-말단 또는 N-말단에 포함될 수 있다. 예시적인 융합 단백질은 서열번호 9-12, 121 및 122 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 하나 이상의 이종 모이어티를 함유한다. 임의로, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는, 글리코실화된 아미노산, 페길화 아미노산, 파메실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 및 유기 유도체화제에 접합된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 이종 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 추가로 변형된다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및/또는 아실화를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 결과적으로, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류, 및 인산염과 같은, 비-아미노산 요소를 함유할 수 있다. 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 기능성에 대한 이러한 비-아미노산 요소의 효과는 다른 가용성 ENPP1 폴리펩티드에 대해 본원에 설명되는 바와 같이 시험될 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드가 폴리펩티드의 초기 형태를 절단함으로써 세포에서 생산되는 경우, 번역 후 가공은 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능에도 중요할 수 있다. 상이한 세포(예를 들어, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이러한 번역 후 활성을 위한 특이적 세포 기계 및 특징적 메커니즘을 가지며, 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다.
소정의 측면에서, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질은 폴리펩티드를 "안정화"할 수 있는 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다. "안정화"는 이것이 파괴 감소, 신장에 의한 제거율 감소, 및/또는 변형의 다른 약동학적 효과 때문인지 여부와 상관없이, 시험관 내 반감기, 혈청 반감기를 증가시키는 변형을 의미한다. 예를 들어, 이러한 변형은 폴리펩티드의 저장 수명을 향상시키고, 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상시키고/하거나 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킨다. 이러한 안정화 변형은 글리코실화 부위의 변형(예를 들어, 본 개시의 폴리펩티드에 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 포함함), 및 탄수화물 모이어티의 변형(예를 들어, 본 개시의 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티를 제거하는 것을 포함함)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
소정의 실시예에서, 본 개시는 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키도록 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 특이적 돌연변이를 고려한다. 이러한 돌연변이는 하나 이상의 글리코실화 부위, 예컨대 O-연결 또는 N-연결된 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하기 위해 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적정 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린을 포함한다("X"는 임의의 아미노산임). 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나, 치환함으로써 이루어질 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 제2 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-글리코실화를 초래한다. 소정의 측면에서, 본 개시의 ENPP1 폴리펩티드는 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 하나 이상의 O-결합된 또는 N-결합된 글리코실화 부위를 도입하거나 제거한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 하나 이상의 O-결합된 글리코실화 부위를 도입한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 하나 이상의 O-결합된 글리코실화 부위를 제거한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 하나 이상의 N-결합된 글리코실화 부위를 도입한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 하나 이상의 N-결합된 글리코실화 부위를 제거한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 치환 및/또는 결실 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 글리코실화 인식 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 치환 및/또는 결실을 포함한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 글리코실화 인식 부위의 제1 아미노산 위치에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 글리코실화 인식 부위의 제3 아미노산 위치에서의 치환 및/또는 결실을 포함한다. 소정의 실시예에서, 돌연변이는 글리코실화 인식 부위의 제2 아미노산 위치에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 소정의 비제한적인 실시예에서, 돌연변이는 글리코실화 인식 부위의 제2 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 소정의 실시예에서, 글리코실화 인식 부위의 제2 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 서열번호 1에 대한 아미노산 잔기 332에서의 치환을 포함한다. 소정의 실시예에서, 아미노산 잔기 332는 I332T 치환을 포함한다. 소정의 실시예에서, I332T 치환은 하나 이상의 O-연결 또는 N-연결 글리코실화 부위를 도입한다. 소정의 실시예에서, I332T 치환은 ENPP1 폴리펩티드의 글리코실화를 증가시킨다. 소정의 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 9 또는 12와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시예에서, ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 1과 관련된 I332T 치환 돌연변이를 포함한다.
폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적 및/또는 효소적으로 결합하는 것이다. 사용된 결합 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실기; (c) 시스테인과 같은 유리 설프히드릴기; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 히드록실기; (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드 상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는, 예를 들어, 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 균등한 화합물에 폴리펩티드를 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 처리는 아미노산 서열을 온전하게 유지하면서, 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 초래할 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소 절단은 Thotakura 등 [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]에 의해 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다. 일부 실시예에서, 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴을 도입할 수 있으므로, 폴리펩티드의 서열은 사용된 발현 시스템의 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있다. 일반적으로, 인간에서 사용하기 위한 본 개시의 폴리펩티드는 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은, 적절한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주에서 발현될 수 있지만, 다른 포유동물 발현 세포주도 유용할 것으로 예상된다.
소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 폴리아스파르트산 도메인(약 2 내지 약 20개 이상의 순차적 아스파르트산 잔기)은 음으로 하전된 골-표적 도메인의 비제한적인 예이다. 일부 실시예에서, 음으로 하전된 골-표적 도메인은 8개의 순차적 아스파르트산 잔기를 포함하는 폴리아스파르트산 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 음으로 하전된 골-표적 도메인은 10개의 순차적 아스파르트산 잔기를 포함하는 폴리아스파르트산 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 음으로 하전된 골-표적 도메인은 2개의 순차적 아스파르트산 잔기, 3개의 순차적 아스파르트산 잔기, 4개의 순차적 아스파르트산 잔기, 5개의 순차적 아스파르트산 잔기, 6개의 순차적 아스파르트산 잔기, 7개의 순차적 아스파르트산 잔기, 8개의 순차적 아스파르트산 잔기, 9개의 순차적 아스파르트산 잔기, 10개의 순차적 아스파르트산 잔기, 11개의 순차적 아스파르트산 잔기, 12개의 순차적 아스파르트산 잔기, 13개의 순차적 아스파르트산 잔기, 14개의 순차적 아스파르트산 잔기, 15개의 순차적 아스파르트산 잔기, 16개의 순차적 아스파르트산 잔기, 17개의 순차적 아스파르트산 잔기, 18개의 순차적 아스파르트산 잔기, 19개의 순차적 아스파르트산 잔기, 또는 20개의 순차적 아스파르트산 잔기를 포함하는 폴리아스파르트산 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 전술한 바와 같이 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있다(PCT 출원 공개 번호 WO 2011/113027 및 WO 2012/125182).
소정의 측면에서, 본 개시는 ENPP1-관련 단백질에 관한 것이다. 소정의 실시예에서, ENPP1-관련 폴리펩티드는 ENPP2, ENPP3, ENPP4, ENPP5, ENPP6, 또는 ENPP7이다. 소정의 비제한적인 실시예에서, ENPP1-관련 폴리펩티드는 ENPP3이다. 본원에 개시된 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3 계열의 자연 발생 폴리펩티드뿐만 아니라 생물학적 활성을 보유하는 이의 임의의 변이체(돌연변이체, 단편, 융합체, 및 펩티드모방 형태 포함)를 포함한다.
당 분야의 숙련자라면 ENPP3 폴리펩티드의 다양한 도메인에 대응하는 잔기가 다양할 수 있음을 인식할 것이다. 구체적으로, 폴리펩티드 도메인의 식별은 전통적으로 단백질 서열 및/또는 구조에 기초한다. 폴리펩티드 서열 및/또는 구조는 관련 폴리펩티드 도메인을 식별하는데 사용될 수 있다(즉, 폴리펩티드는 다른 단백질 구조 또는 도메인과 서열 및/또는 구조적 유사성을 가질 수 있다). 일부 실시예에서, ENPP3의 SMB1 도메인은 서열번호 116의 아미노산 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 86, 87, 88, 88, 89, 90, 91, 93, 93, 94, 95, 또는 96 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 SMB1 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 46의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 잔기 91의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 SMB1 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 46-91을 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP3의 SMB2 도메인은 서열번호 116의 아미노산 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 또는 97 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 116의 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 또는 140 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 SMB2 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 92의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 잔기 135의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 SMB2 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 92-135를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 링커 도메인(도 7에 도시된 바와 같은 "LI")은 서열번호 116의 아미노산 132, 134, 135, 136, 137, 138 또는 139 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 서열번호 116의 157, 158, 159, 160, 161, 162, 또는 163 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 제1 링커 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 136의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 잔기 160의 상류 또는 하류의 ±3 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 제1 링커 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 136-160을 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP3의 촉매 도메인(포스포디에스테라제 도메인)은 서열번호 116의 아미노산 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 또는 163 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 또는 550 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 촉매 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 161의 상류 또는 하류의 ±10 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 잔기 545의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 촉매 도메인은 서열번호 116의 잔기 161-545를 포함한다.
일부 실시예에서, ENPP3의 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 116의 아미노산 575, 576, 577, 578, 579 580, 581, 582, 583, 584 또는 585 중 어느 하나에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 870, 871, 872, 874, 또는 875 중 어느 하나에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3의 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 116의 아미노산 잔기 583의 상류 또는 하류의 ±5 잔기인 아미노산 잔기에서 시작하여 서열번호 116의 아미노산 잔기 875의 상류 또는 하류의 ±2 잔기인 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 뉴클레아제-유사 도메인은 서열번호 116의 잔기 583-875를 포함한다.
소정의 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP3 폴리펩티드가 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 면역원성을 감소시키도록 가용성 ENPP3ENPP3 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결실을 도입하는 것을 고려한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP3 폴리펩티드가 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 단백질 응집을 감소시키도록 ENPP3 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결실을 도입하는 것을 고려한다. 예를 들어, SMB1 및 SMB2 도메인은 이황화 결합 형성에 관여하는 시스테인 잔기의 수의 증가로 인해 응집 경향이 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB1이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB2가 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB1 및 SMB2 모두 결여되어 있다. 소정의 경우에, ENPP3 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 추가로 결여되어 있다.
소정의 실시예에서, ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3 폴리펩티드의 전구체의 분비를 초래하는 신호 펩티드를 포함하며, 이는 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 수득하기 위한 단백질분해 공정을 거친다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 ENPP2, ENPP5 및 ENPP7의 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3의 막관통 도메인을 포함하는 ENPP3 폴리펩티드및 다른 폴리펩티드, 예컨대 비제한적인 예로서 ENPP2를 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP3 폴리펩티드는 ENPP2 막관통 도메인을 포함하는 전구체 ENPP3 폴리펩티드의 절단 산물을 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP2 막관통 도메인은 아미노산 서열 IISLFTFAVGVNICLGFTA(서열번호 20)를 포함한다.
일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 동종이량체화 능력이 감소된다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3 폴리펩티드의 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, SMB1 및/또는 SMB2의 결실)을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 동종이량체화를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 동종이량체화 능력이 감소되지 않는다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 야생형 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 동종이량체를 형성한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 인간 IR에 대한 ENPP3의 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 인간 IR에 대한 ENPP3의 친화도를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3의 포스포디에스테라제 촉매 도메인을 포함한다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB1이 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 SMB1 도메인은 서열번호 116의 잔기 45-90과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 서열번호 116의 잔기 91-875와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB2가 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 SMB2 도메인은 서열번호 116의 잔기 92-135와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 서열번호 116의 잔기 46-91 및 서열번호 116의 잔기 136 내지 875와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB2 및 제1 링커 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB1 및 SMB2가 결여되어 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 SMB1 및 SMB2 도메인은 서열번호 116의 잔기 46 내지 135와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 서열번호 116의 잔기 136 내지 875와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB1, SMB2, 및 제1 링커 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드가 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타내도록, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3 폴리펩티드의 세포외 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 SMB 도메인 1 및 2 중 하나 또는 모두 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인을 제거하기 위해 절단된다(truncated). 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 절단되어 서열번호 116에 대해 약 잔기 583에서 약 잔기 875까지 뉴클레아제 도메인을 제거하기 위해 절단되어, 서열번호 116에 대해 약 잔기 161 내지 약 잔기 545의 촉매 도메인만을 남기며, 이는 단백질의 촉매 활성을 보존하는 역할을 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에서의 치환, 예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은 촉매 및/또는 뉴클레아제 도메인에서의 하나 이상의 치환을 추가로 도입하는 것을 고려한다.
소정의 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3 막관통 도메인이 없는 ENPP3 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 ENPP3 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 ENPP3 막관통 도메인은 제거되고, (그리고/또는 절단되고) 비한정적인 예로서, ENPP2, ENPP5 또는 ENPP7과 같은, 다른 폴리펩티드의 막관통 도메인으로 대체되었다.
일부 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3 폴리펩티드 도메인 및 하나 이상의 이종 단백질 부분(즉, ENPP3에 이종인 폴리펩티드 도메인)을 포함하는 융합 단백질이다. 아미노산 서열은 ENPP3이 서열번호 116로 표시되는 ENPP3의 형태로 고유하게 발견되지 않는 경우, ENPP3에 대해 이종인 것으로 이해된다. 일부 실시예에서, 이종 단백질 부분은 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인이다. 소정의 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 I(IgG1), 인간 면역글로불린 2(IgG2), 인간 면역글로불린 3(IgG3), 및/또는 인간 면역글로불린 4(IgG4)의 Fc 도메인에 C-말단으로 융합된다. 다른 실시예에서, 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 I(IgG1), 인간 면역글로불린 2(IgG2), 인간 면역글로불린 3(IgG3), 및/또는 인간 면역글로불린 4(IgG4)의 Fc 도메인에 N-말단으로 융합된다. 일부 실시예에서, Fc 도메인의 존재는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 반감기, 용해도를 개선하고, 면역원성을 감소시키고/시키거나 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 소정의 실시예에서, 천연 인간 IgG 단백질(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)의 일부가 Fc 부분(예를 들어, ENPP3-Fc)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4로부터 유래된 CHI, CH2, 또는 CH3 도메인과 같은, 면역글로불린의 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합된 ENPP3을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Fc 단편은 천연 IgG의 영역, 예컨대 힌지 영역(Rabat 넘버링 시스템에 따라, 인간 IgG1의 잔기 216-230)을 포함할 수 있으며, 전체 제2 불변 도메인 CH2(잔기 231-340) 및 제3 불변 도메인 CH3(잔기 341-447). 일부 실시예에서, Fc 도메인은 변이체 Fc 불변 영역을 포함한다. ENPP3 융합 Fc 도메인 및 Fc 불변 영역은 전술한 바와 같이 유래된 천연 불변 영역에 대해 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다. ENPP3 융합은 하나 이상의 도메인을 포함하는 이종 단백질 부분, 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 도메인과 전술한 군으로부터 선택된 하나 이상의 이종 단백질 부분(예를 들어, Fc 면역글로불린 도메인) 사이에 위치된 링커 또는 스페이서를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 서열과 기준 서열 간의 백분율 "동일성"은, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해, 기준 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당 분야의 기술 내의 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, 또는 CLUSTAL OMEGA 소프트웨어와 같은, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, 정렬은 CLUSTAL OMEGA 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 당 분야의 숙련자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 개시는 또한 돌연변이체, 특히 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 조합 돌연변이체 및 절단 돌연변이체의 세트를 생성하는 방법을 고려한다. 조합 돌연변이체의 풀은 기능적으로 활성인 (예를 들어, 뉴클레오티드를 무기 피로포스페이트로 변환) ENPP1 서열을 식별하는 데 특히 유용하다. 이러한 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은, 예를 들어, 변경된 약동학적 또는 변경된 안정성(예를 들어, 더 큰 단백질분해 내성)과 같은, 변경된 특성을 갖는 폴리펩티드 변이체를 생성하는 것일 수 있다. 다양한 스크리닝 검정이 아래에 제공되며, 이러한 검정은 변이체를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 프로테아제(예를 들어, 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제)에 대한 단백질분해 내성의 증가 또는 항-약물 항체 형성의 감소(예를 들어, 면역원성 감소)에 대해 스크리닝될 수 있다. 본원에 개시된 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 ATP, UTP, GTP, TTP, CTP 중 하나 이상에 결합하거나, 비유기성 피로프페이트(PPi)를 생산하기 위해 세포외 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가수분해하는 능력에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다.
일부 실시예에서, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 활성은 세포 기반 또는 생체 내 검정으로 시험될 수도 있다. 예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드가 무기 피로포스페이트(PPi)의 생산에 미치는 효과를 측정할 수 있다. 구체적으로, ENPP1 및/또는 ENPP3 단백질의 피로포스파타아제/포스포디에스테라제 도메인은 세포외 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가수분해하여 무기 피로포스페이트(PPi)를 생성하고 일반적으로 가용성이다. 이 활성은, 전술한 바와 같이, pNP-TMP 검정뿐만 아니라 HPLC-기반 ATP 가수분해 검정을 사용하여 측정될 수 있다(Saunders 등 2008, Mol. Cancer Ther. 7(10):3352-62; Albright 등 2015, Nat Comm. 6:10006). 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드가 ARHR2와 같은 ENPP1 및/또는 ENPP3 관련 질환에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 효과(예를 들어, 골아세포 및 파골세포에서 섬유아세포 성장 인자 23의 전사)를 평가할 수 있다. 이는, 필요에 따라, 하나 이상의 뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 다른 ENPP1 및/또는 ENPP3 기질의 존재 하에 수행될 수 있고, 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 생산하도록 세포를 형질감염시킬 수 있다. 마찬가지로, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 마우스 또는 다른 동물에게 투여될 수 있고, ENPP1 및/또는 ENPP3 관련 질환에 대한 효과를 당업계에서 인정된 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 기준 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드에 비해 프로테아제(예를 들어, 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제)에 대한 단백질분해 내성이 증가하거나 항-약물 항체의 형성이 감소하는(예를 들어, 면역원성 감소) 조합-유래 변이체가 생성될 수 있다. 이러한 변이체는, 재조합 DNA 작제물로부터 발현될 때, 유전자 요법 프로토콜에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이 유발은 상응하는 미변형 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포 내 반감기를 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질분해 또는 변형되지 않은 폴리펩티드의 파괴, 또는 그렇지 않으면 불활성화를 초래하는 다른 세포 과정에 대해 보다 안정하거나 덜 안정하게 될 수 있다. 이러한 변이체 및 이를 암호화하는 유전자는 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 폴리펩티드 복합체 수준을 변경하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 보다 일시적인 생물학적 효과를 초래할 수 있고, 유도성 발현 시스템의 일부인 경우, 세포 내에서 재조합 폴리펩티드 복합체 수준을 보다 엄격하게 제어할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 반감기를 변경시키기 위해 돌연변이는 링커(존재하는 경우) 및/또는 Fc 부분에서 만들어질 수 있다.
일부 실시예에서, 조합 라이브러리는 각각 잠재적 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 암호화하는 유전자의 축퇴 라이브러리를 통해 생산될 수 있다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 유전자 서열에 효소적으로 연결됨으로써, 잠재적 ENPP1 및/또는 ENPP3의 암호화 뉴클레오타이드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서 발현될 수 있도록 하거나, 대안적으로 더 큰 융합 단백질의 세트로서 발현될 수 있도록 유전자 서열에 효소적으로 결찰될 수 있다 (예를 들어, 파지 디스플레이용).
잠재적 상동체의 라이브러리가 축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성될 수 있는 많은 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있고, 그런 다음 합성 유전자는 발현을 위한 적절한 벡터에 연결된다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 잘 알려져 있다 [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura 등 (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura 등 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura 등 (1984) Science 198:1056; 및 Ike 등 (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. 이러한 기술은 다른 단백질의 유도 진화에 사용되어 왔다 [[Scott 등 (1990) Science 249:386-390; Roberts Roberts 등 (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin 등 (1990) Science 249: 404-406; Cwirla 등, (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 뿐만 아니라 미국 특허 제5,223,409호, 제5,198,346호, 및 제5,096,815호].
대안적으로, 다른 형태의 돌연변이 유발을 이용하여 조합 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 생성되고 라이브러리로부터 단리될 수 있는데, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 사용한 스크리닝에 의해 [Ruf 등 (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint 등 (1993) Gene 137:109-118; Grodberg 등 (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima 등 (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman 등 (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham 등 (1989) Science 244:1081- 1085], 링커 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 [Gustin 등 (1993) Virology 193:653-660; 및 Brown 등 (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight 등 (1982) Science 232:316], 포화 돌연변이 유발에 의해 [Meyers 등(1986) Science 232:613]; PCR 돌연변이 유발에 의해 [Leung 등 (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; 또는 화학적 돌연변이 유발을 포함하는 무작위 돌연변이 유발에 의해 [Miller 등 (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 및 Greener 등 (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. 특히 조합 환경에서, 링커 스캐닝 돌연변이 유발은 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 돌연변이된 형태 또는 절단된(생물활성) 형태를 식별하기 위한 또 다른 잠재적 방법이다.
점 돌연변이 및 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하기 위한, 그리고, 이의 경우, 특정 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 광범위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 조합 돌연변이 유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합할 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 일반적으로 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터로 클로닝하고, 생성된 벡터의 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환하고, 및 원하는 활성의 검출이 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 비교적 용이한 단리를 용이하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현하는 단계를 포함한다.
당 분야의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본원에 설명되는 대부분의 설명되는 돌연변이, 변이체 및/또는 변형은 핵산 수준에서, 또는 일부 경우에는 번역 후 변형 또는 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 그 중 일부는 본원에 기술된다. 부분적으로, 본 개시는 본원에 설명되는 개시의 범위 내에서 다른 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 생성하고 사용하기 위한 지침으로서 사용될 수 있는 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 기능적 활성 부분(단편) 및 변이체를 식별한다.
소정의 실시예에서, 본 개시의 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 기능적 활성 단편은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 또한, 단편은 종래의 Merrifield 고상 Fmoc 또는 t-Boc 화학과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 단편은 생산될 수 있고(재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해), 특히 프로테아제 (예를 들어, 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제)에 대한 단백질분해 내성 또는 항-약물 항체의 형성(예를 들어, 면역원성 감소)과 관련하여 기능적 특성을 갖는 펩티딜 단편을 식별하기 위해 시험될 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 설명되는 방법에 따라 사용될 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시예에서, 본 개시의 폴리펩티드는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 분석에 의해 결정했을 때 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 초과하는 순도로 정제된다. 순도를 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[예를 들어, Flatman 등 (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]. 일부 실시예에서, 본원에 설명되는 방법에 따라 사용될 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다.
본 개시의 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 다양한 당업계에 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 폴리펩티드는 Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 및 Grant G. A (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에 기술된 것과 같은 표준 단백질 화학 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 자동화된 펩티드 합성기가 상업적으로 이용 가능하다 (예를 들어, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안적으로, 본 개시의 폴리펩티드는, 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하여, 다양한 발현 시스템 [예를 들어, 대장균, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, COS 세포, 바큘로바이러스, 효모 피키아]을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 단백질은 부착 세포 또는 현탁 세포에서 생산될 수 있다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 CHO 세포에서 발현된다. 안정한 세포주를 확립하기 위해, ENPP1 및/또는 ENPP3 작제물을 암호화하는 핵산 서열을 대규모 단백질 생산을 위한 적절한 벡터 내로 클로닝한다. 추가의 실시예에서, 본 개시의 변형되거나 변형되지 않은 폴리펩티드는, 예를 들어, 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 써모리신, 키모트립신, 펩신, 또는 쌍을 이룬 염기성 아미노산 변환 효소(PACE)를 사용하여 재조합적으로 생산된 전장 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 소화에 의해 생산될 수 있다. 컴퓨터 분석(시판 가능한 소프트웨어, 예를 들어, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.를 사용함)을 사용해 단백질분해 절단 부위를 식별할 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리펩티드는 화학적 절단(예를 들어, 시아노겐 브롬화물, 히드록실아민 등)을 사용하여 재조합적으로 생성된 전장 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드로부터 생산될 수 있다.
박테리아(예를 들어, 대장균 및 바실루스 서브틸리스), 효모(예를 들어, 사카로미세스 세레비시애, 클루이베론미세스 락티스 및 피키아 파스토리스), 사상균류(예를 들어, 아스페르길루스), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충을 포함하는 많은 발현 시스템이 ENPP1및/또는 ENPP3 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 원하는 단백질은 종래의 방식으로, 예를 들어 숙주 염색체에 삽입된 코딩 서열로부터 또는 유리 플라스미드 상에서 생산될 수 있다.
효모는 임의의 통상적인 방식(예를 들어, 전기천공)으로 원하는 단백질에 대한 코딩 서열로 형질전환될 수 있다. 전기천공에 의한 효모의 형질전환 방법은 Becker & Guarente, 1990, Methods Enzymol. 194: 182에 개시되어 있다. 성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 개시의 DNA 작제물을 함유하는 세포는 잘 알려진 기술에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 발현 작제물의 도입으로부터 생성된 세포는 성장하여 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 세포는 수거되고 용해될 수 있으며, DNA의 존재에 대해 Southern, 1975, J. Mol. Biol, 98:503 및/또는 Berent 등 1985, Biotech 3:208에 의해 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 그들의 DNA 함량을 조사할 수 있다. 대안적으로, 상청액 내 단백질의 존재는 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406 및 pRS413-416을 포함하며, 일반적으로 이용 가능한 프론트 Stratigene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA Plasmids pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효모 통합 플라스미드(Yeast Integrating plasmids, Yips)이며 효모 선택성 마커 I-l1S3, TRPl, LEU2 및 1JRA3를 포함한다. 플라스미드 pRS413- 416은 효모 센트로머 플라스미드(Yeast Centromere plasmids, YCps)이다.
상보적인 응집 말단을 통해 벡터에 DNA를 작동 가능하게 연결시키기 위한 다양한 방법이 개발되었다. 예를 들어, 상보적 동종중합체 관이 벡터 DNA에 삽입될 DNA 분절에 첨가될 수 있다. 벡터 및 DNA 분절은 이어서 상보적 동종중합체 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 결합되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 이상의 제한 부위를 함유하는 합성 링커는 DNA 분절을 벡터에 접합시키는 대안적인 방법을 제공한다. 엔도뉴클레아제 제한 소화에 의해 생성된 DNA 분절을, 박테리오파지 T4 DNA 중합효소 또는 대장균 DNA 중합효소 I로 처리하는데, 이 효소는 3'-5'-핵분해 활성으로 돌출된 3'-단일-가닥 말단을 제거하고, 이들의 중합화 활성으로 오목한 3'-말단을 채우는 효소다.
따라서, 이들 활성의 조합은 끝이 무딘 DNA 분절을 생성한다. 그런 다음, 끝이 무딘 분절을, 박테리오파지 T4 DNA 리가아제와 같은 끝이 무딘 DNA 분자의 결찰을 촉매할 수 있는 효소의 존재 하에, 큰 몰의 과량의 링커 분자와 함께 인큐베이션한다. 그 결과, 반응의 생성물은 그들의 말단에서 중합체 링커 서열을 지닌 DNA 분절이다. 이들 DNA 분절은 적절한 제한 효소로 절단될 수 있고, DNA 분절의 것과 양립 가능한 말단을 생성하는 효소로 절단된 발현 벡터에 연결된다.
그런 다음, 안정적으로 형질감염된 단일 세포의 클론을 확립하고, 원하는 ENPP1 및/또는 ENPP3 융합 단백질의 고발현 클론에 대해 스크리닝한다. ENPP1 또는 ENPP3 폴리펩티드 발현을 위한 단일 세포 클론의 스크리닝은, 전술한 바와 같은 합성 효소 기질 pNP-TMP를 사용하여 96 웰 플레이트에서 고 처리량 방식으로 달성될 수 있다(Albright, 등, 2015, Nat. Commun. 6:10006). 스크리닝을 통해 고 발현 클론을 식별하면, Albright, 등 2015, Nat. Commun. 6:10006에서 이전에 기술한 진탕 플라스크 또는 생물반응기에서 단백질 생산이 달성될 수 있다.
ENPP1 및/또는 ENPP3의 정제는 당업계에 공지된 표준 정제 기술의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 정제 후에, ENPP1-Fc 또는 ENPP3-Fc를 Zn2+ 및 Mg2+가 보충된 PBS에 투석하고 (PBSplus), 5 내지 7 mg/ml로 농축시키고, 200-500 μl의 분취량으로 -80℃에서 냉동시켰다. 분취량은 사용 직전에 해동될 수 있고, 용액의 비활성은 PBSplus에서 희석에 의해 31.25 au/ml(또는 제조에 따라 약 0.7 mg/ml)로 조정될 수 있다.
3.
ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 핵산
소정의 실시예에서, 본 개시는 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드(단편, 기능적 변이체, 및/또는 이의 융합 단백질 포함)를 암호화하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 대상체 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은, 예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 생성하는 방법에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단리된 핵산(들)은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 보통 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
소정의 실시예에서, 본 개시의 ENPP1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 14 또는 서열번호 15의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립유전자 변이체를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실이 상이한 서열을 포함하며, 따라서 서열번호 14 또는 서열번호 15에 지정된 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.
소정의 실시예에서, 본 개시의 ENPP1 폴리펩티드는 서열번호 14 또는 서열번호 15와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 암호화된다. 당 분야의 숙련자는 서열번호 14 또는 서열번호 15에 상보적인 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열 및 이의 변이체가 또한 본 개시의 범위 내에 있다는 것을 이해할 것이다. 추가의 실시예에서, 본 개시의 핵산 서열은 분리, 재조합 및/또는 이종 뉴클레오티드 서열과 융합될 수 있거나, DNA 라이브러리에서 융합될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 개시의 핵산은 또한 매우 엄격한 조건 하에서 서열번호 14 또는 서열번호 15, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 상보적 서열, 및/또는 이의 단편에 지정된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 당 분야의 숙련자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄중도 조건이 가변될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 당 분야의 숙련자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄중도 조건이 가변될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 약 45℃에서 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 혼성화를 수행한 다음, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄중도 내지 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄중도로 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 약 22℃의, 실온의 낮은 엄중도 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄중도 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 둘 모두가 변할 수 있거나, 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있는 반면, 다른 변수는 변화된다. 일 실시예에서, 본 개시는 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄중도 조건 하에서 혼성화한 다음 실온에서 2 x SSC로 세척하는 핵산을 제공한다.
유전자 코드에서의 퇴축에 대해 서열번호 14 또는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 핵산과 상이한 단리된 핵산도 본 개시의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 다수의 아미노산은 하나 이상의 삼중항으로 지정된다. 동일한 아미노산 또는 동의어를 지정하는 코돈(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어임)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 초래할 수 있다. 그러나, 대상 단백질의 아미노산 서열의 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 포유동물 세포 사이에 존재할 것으로 예상된다. 당 분야의 숙련자는 특정 단백질을 암호화하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 약 3-5%까지)에서의 이러한 변이가 자연 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체 사이에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 그리고 모든 이러한 뉴클레오티드 변이 및 생성된 아미노산 다형성이 본 개시의 범위 내에 있다.
소정의 실시예에서, 본 개시의 재조합 핵산은 발현 작제물의 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현에 사용된 숙주 세포에 적절할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터 및 적절한 조절 서열이 당업계에 공지되어 있고, 다양한 숙주 세포에서 사용될 수 있다. 통상적으로, 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및/또는 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 당업계에 공지된 바와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 개시에 의해 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 둘 이상의 프로모터의 요소를 조합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 작제물은 플라스미드와 같은 에피솜 상의 세포에 존재할 수 있거나, 발현 작제물은 염색체에 삽입될 수 있다. 일부 실시예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 선택성 마커 유전자를 함유한다. 선택성 마커 유전자는 당업계에 잘 알려져 있고 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다.
소정의 측면에서, 본원에 개시된 대상 핵산은 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하고 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 제공된다. 조절 서열은 당업계에서 인식되고, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기재되어 있다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 경우 DNA 서열의 발현을 제어하는 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 하나가 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은, 예를 들어, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 거대세포바이러스의 즉각적인 초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 RNA 중합효소에 의해 발현이 유도되는 T7 프로모터, 파지 람다의 주요 작동자 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질에 대한 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타아제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모 a-결합 인자의 프로모터, 바큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현하고자 하는 단백질의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 벡터의 복제수, 그 복제수를 제어하는 능력 및 항생제 마커와 같은 벡터에 의해 암호화된 임의의 다른 단백질의 발현도 고려되어야 한다.
본 개시의 재조합 핵산은 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유동물) 또는 둘 다에서 발현에 적합한 벡터 내에 클로닝된 유전자 또는 이의 일부분을 연결시킴으로써 생산될 수 있다. 재조합 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터(예를 들어, 바이러스)를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 다음 유형의 플라스미드를 포함한다: E. coli와 같은, 원핵 세포에서의 발현을 위한 pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 pUC-유래 플라스미드.
일부 포유동물 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 전파를 용이하게 하기 위한 원핵 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위를 모두 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에서 복제 및 약물 내성 선택을 용이하게 하기 위해, pBR322와 같은 박테리아 플라스미드 유래의 서열로 변형된다. 대안적으로, 우두 유두종 바이러스(BPV-1) 또는 Epstein- Barr 바이러스(pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스의 유도체가 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현에 사용될 수 있다. 다른 바이러스(레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 유전자 요법 전달 시스템의 설명에서 아래에서 확인할 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용된 다양한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두를 위한 다른 적절한 발현 시스템, 뿐만 아니라 일반적인 재조합 절차에 대해, 예를 들어, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). 일부 경우에, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용함으로써 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 바큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유래 벡터(예컨대 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래 벡터(예컨대 pAcUWl), 및 pBlueBac-유래 벡터(예컨대 pBlueBac III을 함유하는 β-갤런)를 포함한다.
일부 실시예에서, 벡터, 예컨대 Pcmv-Script 벡터(Stratagene, La Jolla, Calif), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, Calif) 및 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wisc.)는 CHO 세포에서 대상 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 생산을 위해 설계될 것이다. 명백한 바와 같이, 대상 유전자 작제물은, 예를 들어, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 포함하는 단백질을 정제하기 위해 배양물 내에서 증식된 세포에서 대상 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 발현을 유발하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터는 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 발현을 지시 및/또는 조절하는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산은 신호 펩티드에 융합된 본원에 개시된 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하되, 폴리펩티드는 세포로부터 분비 시 단백질분해 처리되어 본원에 개시된 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 수득한다.
유전자 요법에 사용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 소정의 변형된 바이러스가 종종 코딩 서열을 운반하기 위한 벡터로서 사용되는데, 이는 포유동물에게 투여된 후, 바이러스가 세포를 감염시키고 암호화된 단백질을 발현하기 때문이다. 본 발명에 따라 유용한 변형된 바이러스는, 예를 들어, 파보바이러스, 피코나바이러스, 가성광견병 바이러스, 간염 바이러스 A, B 또는 C, 유두종바이러스, 파포바바이러스(예를 들어, 폴리오마 및 SV40) 또는 포진 바이러스(예를 들어, 엡스타인-바 바이러스, 수두 대상포진 바이러스(Varicella Zoster Virus), 거대세포바이러스, 대상포진(Herpes Zoster) 및 단순 포진 바이러스 1형 및 2형), RNA 바이러스 또는 레트로바이러스, 예컨대 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스 또는 렌티바이러스 (즉, 인간 면역결핍 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스 등 유래)를 포함하는 바이러스에서 유래한다. 본 발명에 따라 유용한 DNA 바이러스는 다음과 같다: 아데나-연관 바이러스 아데노바이러스, 알파바이러스 및 렌티바이러스.
바이러스 벡터는 일반적으로 주사에 의해, 가장 흔히는 정맥내(IV)로 신체에 직접 투여되거나, 특정 조직에 직접 투여되며, 여기서 개별 세포에 의해 흡수된다. 대안적으로, 바이러스 벡터는 환자의 세포의 샘플과 생체 외에서 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 투여될 수 있고, 이에 의해 바이러스 벡터가 세포를 감염시키고, 벡터를 함유하는 세포가 이어서 환자에게 반환되도록 한다. 일단 바이러스 벡터가 전달되면, 코딩 서열이 발현되어 기능적 단백질을 생성한다. 일반적으로, 바이러스 벡터에 의한 세포의 감염 및 형질도입은 다음과 같은 일련의 순차적 사건에 의해 발생한다: 표적 세포의 표면 상의 수용체와 바이러스 캡시드의 상호작용, 세포내이입에 의한 내재화, 세포내/프로테아좀 구획을 통한 세포내 수송, 엔도좀 탈출, 핵 유입, 비리온 코팅박리, 및 관심있는 재조합 코딩 서열의 전사 및 발현을 유도하는 바이러스 DNA 이중 가닥 변환. (Colella 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 1;8:87-104.).
아데나-연관 바이러스 벡터(AAV)는 파보바이러스 과의 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 바이러스를 지칭한다. AAV 게놈은 대략 4.7 킬로염기 길이이고, 양- 또는 음-센스일 수 있는 선형 단일-가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 구성된다. 게놈은 DNA 가닥의 양 말단에 역위 말단 반복(ITR), 및 2개의 개방 해독 프레임(ORF): rep 및 cap을 포함한다. rep 프레임은 AAV 수명 주기에 필요한 비구조적 복제 (Rep) 단백질을 암호화하는 4개의 중첩 유전자로 만들어진다. cap 프레임은 다음의 구조적 VP 캡시드 단백질의 중첩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다: VP1, VP2 및 VP3, 이들은 함께 상호작용하여 20면체 대칭 캡시드를 형성한다.
말단 145개 뉴클레오티드는 자가-상보성이며, T-형상 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 이중체가 형성될 수 있도록 조직된다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제의 원점으로서 기능하며, 이것이 세포 DNA 중합효소 복합체의 프라이머로서의 역할을 한다. 포유동물 세포에서의 야생형 AAV 감염 후, rep 유전자(즉, Rep78 및 Rep52)가 P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 각각 발현되고, 두 Rep 단백질 모두 바이러스 게놈의 복제에 있어서 기능을 갖는다. rep ORF 내에서의 스플라이싱 이벤트로 인해 실제로 4개의 Rep 단백질(즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 발현시킨다. 그러나, 포유동물 세포에서, Rep78 및 Rep52 단백질을 암호화하는, 스플라이싱되지 않은 mRNA가 AAV 벡터 생산에 충분한 것으로 나타났다. 또한, 곤충 세포에서는, Rep78 및 Rep52 단백질이 AAV 벡터 생산에 충분하다.
AAV 벡터는 일반적으로 rep 및 cap 프레임이 결여되어 있다. 이러한 AAV 벡터는, rep 및 cap 유전자 산물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 인코딩 및 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있으며, 여기서 숙주 세포는 아데노바이러스 개방 해독 프레임 E4orf6으로부터 단백질을 암호화하고 발현하는 벡터로 형질감염되었다.
일 실시예에서, 본 발명은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3을 암호화하는 서열을 포함하는 AAV 발현 벡터에 관한 것으로, 포유동물에게 투여될 때 벡터는 세포에서 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 전구체를 발현하되, 상기 전구체는 그의 카르복시 말단에서 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 아미노 말단에 융합된 아주로시딘 신호 펩티드를 포함한다. 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 전구체는 IgG Fc 영역 또는 인간 알부민과 같은, 안정화 도메인을 포함할 수 있다. 세포로부터 전구체의 분비 시, 신호 펩티드가 절단되어 나가고 효소적으로 활성인 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드가 세포외에서 제공된다.
AAV 발현 벡터는, 아주로시딘 신호 펩티드 서열 및 가용성 ENPP1 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 영역을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 발현 카세트는 프로모터 및 인핸서, 코작(Kozak) 서열 GCCACCATGG, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 기타 적절한 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 AAV 벡터의 AAV 재조합 게놈은 rep 개방 해독 프레임 및/또는 cap 개방 해독 프레임이 결여되어 있다.
본 발명에 따른 AAV 벡터는 임의의 혈청형으로부터의 캡시드를 포함한다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 유의한 상동성의 게놈 서열을 가지며, 동일한 유전적 기능 세트를 제공하고, 실질적으로 동일한 메커니즘을 통해 복제하고 조립한다. 특히, 본 발명의 AAV는 AAV의 혈청형 1(AAVl), AAV2, AAV3(유형 3A 및 3B 포함), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVl0, AAVrhl0, AAVl1, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 또는 양 AAV에 속할 수 있다.
상이한 AAV 혈청형의 게놈의 서열의 예는 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, GenBank 등록 번호 NC_001401.2 (AAV2), NC_001829.l (AAV4), NC_006152.l (AAV5), AF028704.l (AAV6), NC_006260.l (AAV7), NC_006261.l (AAV8), AX753250.l (AAV9) 및 AX753362.l (AAVl0)
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 아데노-연관 바이러스 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10 혈청형으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형으로부터 유래된 캡시드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, AAV의 혈청형은 AAV8이다. 바이러스 벡터가 캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 경우, 이들은 AAV를 특정 세포 유형 또는 유형들로 유도하거나, 표적화된 벡터를 세포로 전달하는 효율을 증가시키거나, AAV의 정제 또는 검출을 용이하게 하거나, 숙주 반응을 감소시키기 위해 외인성 서열을 포함하도록 변형될 수 있다.
Smith 등 공개된 출원인 US 2017/0290926은 그 내용이 그 전체가 참조로서 본원에 통합되며, AAV 벡터가 생성, 전달 및 투여되는 공정을 상세히 기술한다.
일부 실시예에서, 아데노바이러스는 본원에서 교시된 바와 같은 유전자 요법에 사용될 수 있다. 아데노바이러스는 원하는 유전자 산물(예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드)을 암호화하고 발현하도록 조작될 수 있고, 동시에 정상적인 용해성 바이러스 수명 주기에서 복제하는 능력의 측면에서 불활성화된다. 또한, 아데노바이러스는 기도 상피에 대한 자연 향성을 갖는다. 바이러스는 기도에서 발견되는 바와 같이 정지 세포를 감염시킬 수 있어서, 레트로바이러스에 대한 주요 이점을 제공한다. 바이러스 DNA를 숙주 세포 염색체에 통합하지 않고 아데노바이러스 발현을 달성함으로써, 삽입 돌연변이 유발에 대한 우려를 완화시킨다. 또한, 아데노바이러스는 수년 동안 우수한 안전성 프로파일로 살아있는 장용 백신으로서 사용되어 왔다(Schwartz, A. R. 등 (1974) Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238). 마지막으로, 아데노바이러스 매개 유전자 전달은, 코튼 랫트의 폐에 대한 알파-1- 항트립신 및 CFTR의 전달을 포함하는 다수의 사례에서 입증되었다(Rosenfeld, MA. 등 (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld 등 (1992) Cell 68:143-155). 또한, 아데노바이러스를 인간 암에서 원인 물질로 확립하기 위한 광범위한 연구는 균일하게 부정적이었다(Green, M. 등 (1979) Proc. Natl. Acad Sci. USA 76:6606).
거짓-아데노바이러스 벡터(PAV)―PAV는 아데노바이러스 역위 말단 반복 및 벡터의 헬퍼 바이러스 의존적 복제 및 포장에 필요한 최소 아데노바이러스 5' 서열을 함유한다. 이 벡터는 잠재적으로 유해한 바이러스 유전자를 함유하지 않으며, 약 36 kb의 이물질에 대한 이론적 용량을 가지며, 합리적으로 높은 역가로 생산될 수 있고, 분열 및 비분열 인간 표적 세포 유형에 대한 모 바이러스의 향성을 유지할 수 있다. PAV 벡터는 플라스미드-매개 작제물로서 또는 감염성 바이러스 입자로서 유지될 수 있다. 플라스미드 작제물로서, PAV는 야생형 또는 결함 있는 헬퍼 바이러스에 의해, 이들 서열 및 임의의 원하는 추가 외인성 유전 물질의 효율적인 복제 및 포장에 필요한 야생형 아데노바이러스 2형으로부터의 최소 서열로 구성된다.
Gregory 등 미국 특허 공개 제7,318,919호는 그 내용이 그 전체가 참조로서 본원에 통합되며, 아데노바이러스 벡터가 생성되고, 전달되는 프로세스, 이들의 질병 치료를 위한 상응하는 용도를 상세히 기술한다. 본 발명은 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터의 용도 및 이를 사용하는 치료 방법을 고려한다.
일부 실시예에서, 단순 포진 벡터(HSV 기반 바이러스 벡터)는 본원에서 교시된 바와 같은 유전자 요법에 사용될 수 있다. HSV 기반 바이러스 벡터는 핵산 서열을 다수의 세포 유형 내로 도입하기 위한 벡터로서 사용하기에 적합하다. 성숙한 HSV 비리온은 152 kb인 선형 이중 가닥 가닥 DNA 분자로 이루어진 바이러스 게놈을 갖는 외피형 이십면체 캡시드로 구성된다. 또 다른 실시예에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 적어도 하나의 필수 HSV 유전자가 결핍되어 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 필수 HSV 유전자가 결핍된 HSV 기반 바이러스 벡터는 복제 결핍된다. 대부분의 복제 결핍 HSV 벡터는 복제를 방지하기 위해 하나 이상의 중간-초기, 초기, 또는 후기 HPS 유전자를 제거하기 위한 결실을 함유한다. 예를 들어, HSV 벡터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 즉시 초기 유전자가 결핍될 수 있다: ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 및 이들의 조합. HSV 벡터의 장점은 장기 DNA 발현을 초래할 수 있는 잠복 단계에 진입하는 능력 및 최대 25 kb의 외인성 DNA 삽입체를 수용할 수 있는 이의 큰 바이러스 DNA 게놈이다.
HSV-기반 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 Preston 등 제5,837,532호, Wickham 등 제5,846,782호, 및 Deluca 등 제5,804,413호, 및 국제특허출원 Preston 등 WO 91/02788, Preston 등 WO 96/04394, Deluca 등 WO 98/15637, 및 Glorioso 등 WO 99/06583에 기재되어 있으며, 이들 전부는 그 내용이 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. HSV 벡터는 HSV 게놈의 초기 영역, HSV 게놈의 즉시 초기 영역, HSV 게놈의 후기 영역, 또는 HSV 게놈의 초기 및 후기 영역 모두의 복제 필수 유전자 기능이 결핍될 수 있다. HSV 벡터의 생산은 당업계에 잘 알려진 표준 분자 생물학적 기술을 사용하는 것을 포함한다.
복제 결핍 HSV 벡터는 일반적으로 복제 결핍 HSV 벡터에는 존재하지 않지만, 바이러스 벡터 스톡의 높은 역가를 생성하기 위해 적절한 수준에서 바이러스 전파에 필요한 유전자 기능을 제공하는 보체 세포주에서 생산된다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현은 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적절한 발현 조절 서열에 의해 조절된다. "발현 조절 서열"은 또 다른 핵산 서열의 발현(전형적으로 및 바람직하게는 전사)을 촉진, 강화 또는 조절하는 임의의 핵산 서열이다.
적절한 발현 조절 서열은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 억제성 프로모터, 및 인핸서를 포함한다. 벡터에서 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 그의 내인성 프로모터에 의해 조절되거나, 바람직하게는 비-천연 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 적절한 비-천연 프로모터의 예는 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 예컨대 HCMV 즉시-초기 프로모터(HCMV IEp), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 유래 프로모터, 예컨대 HIV 긴 말단 반복 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 예컨대 RSV 긴 말단 반복, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, Lap2 프로모터 또는 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner 등, Proc. Natl. Acad Sci., 78, 1444-1445 (1981)), SV40 또는 앱스타인 바 바이러스 유래 프로모터 등을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 프로모터는 HCMV IEp이다.
프로모터는 유도성 프로모터, 즉 적절한 신호에 반응하여 상향 및/또는 하향 조절되는 프로모터일 수도 있다. 예를 들어, 약제학적 제제에 의해 상향 조절되는 발현 조절 서열은 통증 관리 응용예에서 특히 유용하다. 예를 들어, 프로모터는 약학적으로 유도 가능한 프로모터(예를 들어, 테트라사이클린에 반응성이 있음)일 수 있다. 프로모터는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 게놈의 주어진 영역에 고유한 제한 부위를 도입함으로써 벡터의 게놈 내로 도입될 수 있다.
Glorioso 등 미국 특허 공개 제7,531,167호는 그 내용이 그 전체가 참조로서 본원에 통합되며, 단순 포진 벡터가 생성되고, 전달되고, 이들의 질병 치료를 위한 상응하는 용도를 상세히 기술한다. 본 발명은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 단순 포진 벡터의 용도 및 이를 사용하는 치료 방법을 고려한다.
일부 실시예에서, 알파바이러스 발현 벡터는 본원에서 교시된 바와 같은 유전자 요법에 사용될 수 있다. 알파바이러스 발현 벡터는 Sindbis 바이러스(SIN), Semliki Forest 바이러스(SFV) 및 베네수엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스를 포함하는 다양한 유형의 알파바이러스로부터 개발되었다. 알파바이러스 복제물은 바이러스 RNA가 세포 내로 형질감염될 때 번역되는 바이러스 복제물(Rep)을 암호화하는 개방 해독 프레임을 그 5' 말단에 함유한다. Rep는 폴리단백질로서 발현되며, 이는 후속하여 4개의 하위 단위(nsps 1 내지 4)으로 가공된다. 미가공 Rep는 RNA 벡터를 음성-가닥 RNA로 복제할 수 있는데, 이는 형질감염 또는 감염 후 첫 3-4시간 동안에만 일어나는 과정이다. 일단 가공되면, Rep는 더 많은 복제물 분자를 합성하기 위한 템플릿으로서 음성-가닥 RNA를 사용할 것이다. 또한, 가공된 Rep는 음성-가닥 RNA, 또는 하위 게놈 프로모터에서 내부 서열을 인식할 수 있으며, 이로부터 복제물의 3' 말단에 상응하는 하위 게놈 양성-가닥 RNA를 합성할 것이다. 이러한 하위게놈 RNA는 번역되어 이종 단백질을 다량 생산할 것이다.
nsp2에서 위치 726의 단일 아미노산 변화(L에 대한 P)를 함유하는 SIN으로부터 단리된 비-세포변성 돌연변이체(nsp2에서의 SIN P726L 벡터)는 Rep 과 처리를 나타냈다(Frolov 등, 1999, J Viral. 73: 3854-65). 이 돌연변이체는 BHK 세포에서 연속 복제를 효율적으로 확립할 수 있었다. 이러한 비-세포병성 SIN 벡터는 원래의 SIN 벡터로 수득된 것들의 약 4%인 양호한 안정성 수준 및 발현 수준으로 오래 지속되는 이식유전자 발현을 제공할 수 있기 때문에 시험관 내에서 널리 사용되어 왔다(Agapov 등, 1998, Proc. Natl. Acad Sci. USA. 95: 12989-94). 마찬가지로, 특허 출원 WO2008065225 -Smerdou 등은 복제효소 nsp2 서브유닛에서 돌연변이 R649H/P718T를 갖는 비-세포변성 SFV 벡터를 기술한다. 전술한 벡터는 알파바이러스 벡터에 그 내성 유전자가 통합된 항생제의 존재 하에 배양함으로써 관심 유전자를 구성적으로 및 안정적으로 발현할 수 있는 세포주를 수득할 수 있게 한다(Casales 등 2008. Virology. 376:242-51).
본 발명은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드와 같은 관심 유전자의 서열이 부위 특이적 재조합을 위한 인식 서열과 함께 통합된 알파바이러스 복제물에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 벡터를 설계하는 것을 고려한다. 상기 벡터에 의해, 관심 유전자의 서열을 포함하는 알파바이러스 복제물이 세포 게놈에 통합되어, 세포가 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 안정적으로 발현하도록 하는 세포를 수득하고 선택할 수 있다. 본 발명은 또한 알파바이러스 복제물이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 발현 벡터를 생성하는 것을 고려한다. 상기 벡터는, 주어진 리간드의 존재 하에, 알파바이러스 복제물 전사를 조절하는 프로모터의 활성을 긍정적으로 조절할 수 있는 전사 활성화제를 암호화하는 발현 카세트를 통합하는 것에 의해 추가로 변형된 세포에 혼입될 때.
Aranda 등 미국 특허 공개 US 10,011,847는 그 내용 전체가 참조로서 본원에 통합되며, 알파바이러스 벡터가 생성되고, 전달되고, 이들의 질병 치료를 위한 상응하는 용도를 상세히 기술한다. 본 발명은 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 알파바이러스 벡터의 용도 및 이를 사용하는 치료 방법을 고려한다.
일부 실시예에서, 렌티바이러스 벡터는 본원에서 교시된 바와 같은 유전자 요법에 사용될 수 있다. 렌티바이러스는 레트로바이러스과 바이러스의 속에 속하며, 긴 인큐베이션 기간을 특징으로 한다. 렌티바이러스는 상당한 양의 바이러스 RNA를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있고, 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 중에서 고유한 능력을 가질 수 있다. 렌티바이러스 벡터, 특히 HIV-1로부터 유래된 벡터는 광범위하게 연구되고 빈번하게 사용된다. 렌티바이러스 벡터 골격의 진화 및 재조합 DNA 분자(이식유전자)를 표적 세포 내로 전달하는 바이러스의 능력으로 인해 유전자 요법 및 시험관 내 재조합 단백질 생산에서 기능적 유전자의 복원에 이들의 사용으로 이어졌다.
본 발명은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드와 같은 관심 단백질을 발현하기 위한 적절한 프로모터 및 이식 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 고려한다. 일반적으로, 벡터의 골격은 SIV1 또는 아프리카 녹색 원숭이 SIV(SIV-AGM)와 같은, 시미안 면역 결핍 바이러스(SIV)로부터 유래한다. 일 실시예에서, 프로모터는 바람직하게는 하이브리드 인간 CMV 인핸서/EF1a(hCEF) 프로모터이다. 본 발명은 렌티바이러스 벡터를 제조하는 방법, 관심 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물, 및 석회화 또는 골화 질환을 치료하기 위해 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 발현하기 위한 유전자 요법에서의 용도를 포함한다. 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터는 치료 단백질의 분비를 촉진하기 위한 유전자 치료 방법에 사용될 수도 있다. 또 다른 예로서, 본 발명은 호흡기관 또는 순환계의 내강 내로 치료 단백질의 분비를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터의 투여 및 기도 세포에 의한 흡수는 폐(또는 코 또는 기도)를 "공장"으로서 사용하여 치료 단백질을 생산할 수 있게 할 수 있고, 그 다음 분비되고 치료 수준으로 전신 순환으로 진입하며, 여기서 관심 세포/조직으로 이동하여 치료 효과를 유도할 수 있다. 세포내 또는 막 단백질과 대조적으로, 이러한 분비된 단백질의 생산은 형질도입되는 특정 질환 표적 세포에 의존하지 않으며, 이는 상당한 이점이며 높은 수준의 단백질 발현을 달성한다. 따라서, 심혈관 질환 및 혈액 장애와 같은 호흡기 질환이 아닌 다른 질환도 렌티바이러스 벡터에 의해 치료될 수 있다. 본 발명에 따른 것과 같은, 렌티바이러스 벡터는 형질도입된 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 오래 지속되는 발현을 유도하여 줄기/전구 세포의 형질도입에 적합할 수 있다.
Alton 등 미국 특허 출원 공개 US 2017/0096684는 그 내용 전체가 본원에 참조로서 통합되며, 렌티바이러스 벡터가 생성되고, 전달되고, 이들의 질병 치료를 위한 상응하는 용도를 상세히 기술한다. 본 발명은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 렌티바이러스 벡터의 용도 및 이를 사용하는 치료 방법을 고려한다.
본 개시는 또한 대상 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 중 하나 이상에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 유전자 또는 바이러스 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 소정의 실시예에서, 세포는 비인간 세포이다. 다른 실시예에서, 세포는 포유동물이다. 예를 들어, 본 개시의 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 E. coli과 같은 박테리아 세포, (예를 들어, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하는) 곤충 세포, 효모, 또는 포유동물 세포[예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주]에서 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 일부 실시예에서, 벡터는 본원에 개시된 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 및 신호 펩티드를 암호화하는 재조합 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리펩티드는 세포로부터 분비될 때 단백질분해 처리되어 본원에 개시된 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 수득한다.
따라서, 본 개시는 또한 대상 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 적절한 조건 하에서 배양되어 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP3의 발현이 일어나도록 할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드를 함유하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안적으로, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 세포질에 보유되거나 막 분획에 보유될 수 있고, 세포는 수확되고 용해되고, 단백질은 단리될 수 있다. 세포 배양은 숙주 세포, 배지 및 기타 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당업계에 잘 알려져 있다. 대상 폴리펩티드는 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 다로부터 단리될 수 있으며, 다음과 같은 단백질을 정제하기 위해 당업계에 공지된 기술을 사용한다: 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화도 정제, 및/또는 ENPP1 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 제제를 이용한 친화도 정제 (예를 들어, ENPP1-Fc 및/또는 ENPP3-Fc 융합 단백질을 정제하는 데 컬럼을 사용할 수 있음). 일부 실시예에서, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 이의 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다.
일부 실시예에서, 정제는, 예를 들어, 다음 중 3개 이상을 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 임의의 순서로 달성된다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 정제를 완료할 수 있다. ENPP1 및/또는 ENPP3 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도 및 SDS PAGE에 의해 결정된 바와 같이 >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도로 정제될 수 있다. 목표 순도 수준은 포유동물 시스템, 특히 비인간 영장류, 설치류(마우스), 및 인간에서 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 수준이어야 한다.
또 다른 실시예에서, 재조합 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에서 폴리-(His)/엔테로키나아제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 암호화하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 수지를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 발현된 융합 단백질을 정제할 수 있게 한다. 그런 다음, 정제 리더 서열을 엔테로키나아제 처리로 제거하여 정제된 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 예를 들어, Hochuli 등 (1987) J Chromatography 411:177; 및 Janknecht 등 (1991) PNAS USA 88:8972 참조.
ENPP1, 또는 ENPP1 폴리펩티드는 US 2015/0359858 Al에 설명되는 바와 같이 제조되며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. ENPP1은 구별되는 막내 도메인을 가지고 세포 표면에 국소화된 막관통 단백질이다. ENPP1을 가용성 세포외 단백질로서 발현시키기 위해, ENPP1의 막관통 도메인을 ENPP2의 막관통 도메인으로 교체하며, 바큘로바이러스 배양물의 세포외 유체에 가용성 재조합 ENPP1이 축적되게 한다.
이에 제한되지는 않지만 면역글로불린 카파 및 람다 경쇄 단백질의 신호 서열 같은, 임의의 다른 공지된 단백질의 신호 서열을 사용해서 분비를 위한 ENPP1의 세포외 도메인을 표적화할 수도 있다. 또한, 본 개시는 본원에서 설명되는 폴리펩티드에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, ENPP1 세포외 도메인의 임의의 효소 활성 절단(truncation)을 포함하는 폴리펩티드를 또한 포함한다.
ENPP1은 막관통 도메인을 생략함으로써 가용성으로 만들 수 있다. 일부 실시예에서, 인간 ENPP1(서열번호 1)은 그의 막관통 영역(예를 들어, 잔기 77 내지 98)을 인간 ENPP2(NCBI 수탁 NP 00112433 5, 예를 들어, 잔기 12 내지 30)의 상응하는 하위 도메인으로 대체함으로써 가용성 재조합 단백질을 발현하도록 변형되었다. 일부 실시예에서, 변형된 ENPP1 서열은 TEV 프로테아제 절단 부위를 가진 변형된 pFastbac FIT 벡터에 이어서 C-말단 9- FlIS 태그로 클로닝되고, 곤충 세포에서 클로닝되고 발현될 수 있다. 일부 실시예에서, 두 단백질은 전술한 바와 같이 바큘로바이러스 시스템에서 발현될 수 있으며(Albright, 등, 2012, Blood 120:4432-4440; Saunders, 등 2011, J. Biol. Chem. 18:994-1004; Saunders, 등 2008, Mol. Cancer Ther. 7:3352-3362), 그 결과 가용성 재조합 단백질을 세포외액에 축적시켰다.
융합 유전자를 생성하기 위한 기술은 잘 알려져 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은, 결찰을 위해 끝이 무딘 또는 끝이 엇갈린 말단을 사용하고, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화를 사용하고, 적절한 경우 응집성 말단을 충진하고, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타아제 처리, 및 효소 연결에 의한, 통상적인 기술에 따라 수행된다. 또 다른 실시예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 종래의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 키메라 유전자 서열을 생성하기 위해 후속하여 어닐링될 수 있는 2개의 연속 유전자 단편 사이의 상보적 오버행을 유발하는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 등 John Wiley & Sons: 1992 참조.
4.
예시적인 용도
소정의 측면에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 병리학적 석회화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하기 위한 특정 가용성 ENPP1 폴리펩티드(예를 들어, 이의 융합 단백질)의 용도에 관한 것이며, 상기 방법은 본원에 개시된 폴리펩티드 융합 및/또는 가용성 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11, 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시예에서, 병리학적 석회화는 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC) 및 죽상동맥경화성 플라크의 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시예에서, 병리학적 골화는 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 병리학적 골화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11, 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 혈관 석회화의 감소, 개선, 또는 예방을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 연조직의 이소성 석회화의 진행을 감소, 역전, 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 ENPP1 결핍증(예를 들어, GACI 및 ARHR2)에 의해 야기되는 질환의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려한다. ENPP1 결핍증은, 이를 필요로 하는 대상체에서 (정상 건강한 대상체에서 ENPP1 활성 또는 ENPP1 발현 수준과 각각 비교하여) ENPP1 활성 수준 및/또는 ENPP1 수준의 결함 발현의 수준이 감소하는 것을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 단백질 (예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11, 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, ENPP1 결핍증은 GACI이다. 일부 실시예에서, ENPP1 결핍증은 ARHR2이다.
일부 실시예에서, 상기 개시는, 이를 필요로 하는 대상체에서 더 낮은 혈장 PPi 수준에 의해 야기되는 질환의 진행을 감소, 역전, 및/또는 예방하며, 상기 방법은 본원에 개시된 폴리펩티드의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체의 혈장 PPi를 정상 수준(1-3 pM) 또는 정상 수준 위(30-50% 더 높게)로 증가시킨 다음 혈장 PPi를 정상 또는 정상 수준 이상으로 유지하는 단계를 포함한다. 상기 방법은, 대상체의 혈장 PPi를 일정한 정상 또는 정상 수준 이상으로 유지하여 병적 석회화 또는 골화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하기 위해 2일, 3일, 1주 또는 1개월의 간격으로 추가 치료 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP1 융합 폴리펩티드는 PPi 수준이 정상 수준(약 2pM)보다 낮은 대상체에서 피로포스페이트(PPi) 수준을 상승시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP1 융합 폴리펩티드는 PPi 수준이 정상 수준보다 낮은 대상체에서 병리학적 석회화 또는 골화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP1 융합 폴리펩티드는 대상체에서 세포외 PPi 농도의 감소에 의해 발현되는 ENPP1 결핍증(예를 들어, GACI 및 ARHR2)을 치료 및/또는 개선하는 데 사용될 수 있다. 소정의 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP1 융합 폴리펩티드의 제1 용량의 투여 후 달성된 혈장 PPi의 항정 상태 수준은 적어도 2일, 적어도 4일, 적어도 1주 또는 적어도 1개월의 기간 동안 유지된다.
일부 실시예에서, 상기 개시는, 이를 필요로 하는 대상체에서 정상 수치보다 더 낮은 혈장 PPi 수준에 의해 야기되는 질환의 진행을 감소, 역전, 및/또는 예방하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11, 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체의 혈장 PPi를 정상 PPi 수준(1-3 pM)의 약 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 120%, 130%, 140%, 또는 150% 수준까지 증가시키고/또는 유지시키는 단계를 포함한다. 소정의 실시예에서, 상기 방법은 정상 PPi 수준의 약 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 120%, 130%, 140%, 또는 150% 수준으로 혈장 PPi 수준을 유지하여, 병리학적 석회화 또는 골화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하기 위해 2일, 3일, 1주 또는 1개월마다 본원에 개시된 폴리펩티드를 추가로 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
소정의 실시예에서, 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP1 융합 폴리펩티드의 제2 용량이 약 2일 후, 4일 후, 1주일 후, 또는 1개월 후의 적절한 시간 간격 후에 대상체에게 투여되어서, 혈장 PPi의 항정 상태 수준이 일정하거나 항정 상태 수준으로 유지되고 대상체가 본원에 개시된 작제물의 제1 용량을 투여받기 전에 가졌던 더 낮은 수준으로 회복되지 않도록 된다.
이론에 구속되고자 하는 의도 없이, 정상 수준으로 혈장 PPi의 항정 상태 농도를 유지하는 것은 대상체의 병리학적 석회화 및 병리학적 골화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하는 것으로 여겨진다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 후종 인대 골화증(OPLL)의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 저인산혈성 구루병의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 이에 한정되지는 않지만 다음과 같은 인간 또는 동물 장애 또는 병태를 치료, 개선, 및/또는 예방한다: 이소성 석회화(예를 들어, 연조직 석회화, 동맥 석회화, 및 혈관 석회화), 만성 신장 질환(CKD), 말기 신장 질환(ESRD), 석회화 요독 동맥병증(CUA), 칼시필락시스, 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 골관절염, 노화 관련 동맥 경화, 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 죽상동맥경화성 플라크의 석회화, ENPP1 결함 [예: 상염색체 열성 저인산혈성 구루병 2형(ARHR2) 및 영아기의 전신성 동맥 석회화(GACI)], 탄성섬유 가황색종(PXE), ABCC6 유전자의 병원성 돌연변이와 연관된 장애, 및 병리학적 골화. ENPP1 폴리펩티드의 예는 인간 ENPP1 전구체 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 1), 및/또는 가용성 인간 ENPP1 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)를 포함한다.
소정의 실시예에서, 연조직 석회화는 IIAC 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 연조직은 죽상동맥경화성 플라크를 포함한다. 일부 실시예에서, 연조직은 근육 동맥을 포함한다. 일부 실시예에서, 연조직은 관절 및 척추로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 관절은 손의 관절 및 발의 관절로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 연조직은 관절 연골 및 척추 디스크 연골로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 연조직은 혈관을 포함한다. 일부 실시예에서, 연조직은 결합 조직을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 탄성섬유 가황색종(PXE)의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하고, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 노화 관련 동맥 경화의 진행을 감소, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈관 동맥 내 죽상동맥경화성 플라크의 석회화의 진행의 치료, 역전 및/또는 예방 방법을 고려하고, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 골관절염의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 조로증으로 인한 동맥 경화를 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 X-염색체 연관 저인산혈상 구루병(XLH), 유전성 저인산혈성 구루병(HHRH), 저인산형성 골 질환(HBD), 상염색체 우성 저인산혈성 구루병(ADHR), 및/또는 상염색체 열성 저인산혈성 구루병을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11, 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 노화 관련 골감소증의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 강직성 척추염의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 소아 겸상 적혈구 빈혈증의 뇌졸중의 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 실시예에서, 본 개시는 조로증으로 진단된 대상체에서 질환 진행을 치료, 역전 및/또는 예방하는 방법을 고려하며, 상기 방법은 본원에 개시된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및/또는 ENPP1 융합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2, 3, 9, 10, 11 및 12)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 서열번호 9에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는, 밑줄 친 신호 서열이 있거나 없는, 서열번호 10에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 서열번호 11에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 밑줄 친 신호 서열이 있거나 없는, 서열번호 12에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 서열번호 121에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 서열번호 122에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 밑줄 친 신호 서열이 있거나 없는, 서열번호 127에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 밑줄 친 신호 서열이 있거나 없는, 서열번호 128에 예시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다.
소정의 실시예에서, 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 발현된 ENPP1 전구체 단백질의 분비된 산물이다. 다른 실시예에서, ENPP1 전구체 단백질은 신호 펩티드 서열 및 ENPP1 폴리펩티드를 포함하고, ENPP1 전구체 단백질은 본원에 개시된 폴리펩티드에 대한 단백질분해 공정을 겪는다. 일부 실시예에서, ENPP1 전구체 단백질에서 신호 펩티드 서열은 ENPP1 폴리펩티드 N-말단에 접합된다. 단백질분해 시, 신호 서열을 ENPP1 전구체 단백질로부터 절단하여 ENPP1 폴리펩티드를 제공한다. 소정의 실시예에서, 신호 펩티드 서열은 ENPP1 신호 펩티드 서열, ENPP2 신호 펩티드 서열, ENPP7 신호 펩티드 서열, 및 ENPP5 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 실시예에서, 폴리펩티드는 대상체에게 급성 또는 만성으로 투여된다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 대상체에게 국소적으로, 부위로, 비경구적으로 또는 전신적으로 투여된다.
소정의 실시예에서, 대상체는 포유동물이다. 다른 실시예에서, 포유동물은 인간이다.
본 발명에서 상세히 설명된 방법을 포함하여 본 개시로 무장될 때, 일단 확립되면 본 개시가 질환 및/또는 장애의 치료에 한정되지 않음을 당 분야의 숙련자라면 이해할 것이다. 특히, 질환 또는 장애의 증상은 대상체에게 해를 끼치는 시점까지 나타날 필요는 없으며; 실제로, 질환 또는 장애는 치료제가 투여되기 전에 대상체에서 검출될 필요가 없다. 즉, 질환 또는 장애로부터의 유의한 병리는 본 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드가 이점을 제공할 수 있기 전에 발생할 필요가 없다.
소정의 측면에서, 본 개시는, 본원에 개시된, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드, 및/또는 ENPP1 및/또는 ENPP3 융합 폴리펩티드가 질환 또는 장애의 발병 전에 대상체에게 투여됨으로써, 질환 또는 장애의 발생을 방지할 수 있다는 점에서, 대상체에서 질환 및 장애를 예방하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 개시는 대상체에서 질환 또는 장애의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 진행 또는 성장을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 질환 또는 장애를 검출하기 전에 대상체에게 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시예에서, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 질환 또는 장애의 강한 가족력이 있는 대상체에게 투여됨으로써, 질환 또는 장애의 발병 또는 진행을 예방하거나 지연시킨다.
따라서, 본원의 개시로 무장하여, 당 분야의 숙련자는 대상체에서 질환 또는 장애의 예방이 질환 또는 장애에 대한 예방 조치로서 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
5.
약학적 조성물
본원에 설명되는 바와 같은 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질은 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 본 개시에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 임의의 종래의 방식으로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 대부분의 규제 요건을 준수하여, 실질적으로 발열원이 없다. 이러한 약학적 조성물은 대상체에게 투여하기에 적합한 형태일 수 있거나, 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 하나 이상의 추가 성분, 또는 이들의 일부 조합을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 다양한 성분은 당업계에 주지된 바와 같이 생리학적으로 허용 가능한 염의 형태로, 예컨대 생리학적으로 허용 가능한 양이온 또는 음이온과 조합하여 존재할 수 있다.
복용량 처방은 본 개시의 대상 화합물(예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드)의 작용을 변형하는 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 다양한 인자는 환자의 연령, 성별 및 식단, 중증도 질환, 투여 시간, 및 기타 임상 인자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 임의로, 용량은 재구성에 사용된 매트릭스의 유형 및 조성물 중의 화합물의 유형에 따라 달라질 수 있다.
소정의 실시예에서, 본원에 개시된 약학적 조성물은 1 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 투여량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 약학적 조성물은 1 ng/kg/일 내지 500 mg/kg/일의 투여량을 전달하기 위해 투여될 수 있다.
본원에 개시된 약학적 조성물 중의 활성 성분(예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질), 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체, 크기, 및 병태에 따라 달라질 것이고, 추가로 조성물이 투여될 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 약 0.1% 내지 약 100%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단위 투여량"은 미리 결정된 양의 활성 성분(예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질)을 포함하는 약학적 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량과 동일하거나, 예를 들어, 이러한 용량의 1/2반 또는 1/3과 같은, 이러한 용량의 적절한 분획과 동일하다. 단위 용량 형태는 1일 1회 투여 또는 1일 1회 다회 투여 중 하나일 수 있다(예를 들어, 약 1일 1회 내지 4회 이상). 다수의 일일 투여량이 사용될 때, 단위 투여 형태는 각 투여량에 대해 동일하거나 상이할 수 있다.
투여 체계는 유효량을 구성하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 여러 개의 분할된 투여뿐만 아니라, 시차를 둔 투여가 매일 또는 순차적으로 투여될 수 있거나, 투여량이 연속적으로 주입될 수 있거나, 볼루스 주사일 수도 있다. 또한, 치료 제형의 투여는 치료적 또는 예방적 상황의 긴급성에 의해 표시된 바와 비례해서 증가되거나 감소될 수 있다. 소정의 실시예에서, 대상체에게 본원에 개시된 화합물을 투여하면 대상체의 혈장 PPi가 정상에 가까운 수준까지 상승하며, 포유동물에서 PPi의 정상 수준은 1-3 pM이다. "정상에 가까운"은 0-1.2 pM 또는 정상의 0-40% 미만 또는 초과, 30 nM-0.9 pM 또는 정상의 1-30% 미만 또는 초과, 0-0.6 pM 또는 정상의 0-20% 미만 또는 초과, 또는 0-0.3 pM 또는 정상의 0-10% 미만 또는 초과를 지칭한다.
포유동물(즉, 인간)과 같은, 환자에게 본 개시의 조성물(예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질)을 투여하는 것은, 환자의 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 기간 동안 투여량으로, 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 치료 효과를 달성하는 데 필요한 치료 화합물의 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성; 투여 시간; 화합물의 배출 속도; 치료 지속기간; 다른 약물, 화합물 또는 화합물과 조합하여 사용된 물질; 치료 중인 환자의 질환 또는 장애의 상태, 연령, 성별, 체중, 병태, 전반적 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 기타 인자 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 최적 치료 반응을 제공하기 위해 투여 체계를 조정할 수 있다. 투여는 치료 화합물의 생물학적 활성에 기초하여 결정되며, 이는 결국 치료 화합물 곡선의 반감기 및 혈장 시간 아래 면적에 따라 달라진다. 본 개시에 따른 폴리펩티드는 정상(1-3 pM) 수준에 가깝거나 정상 PPi 수준보다 높은 (30-50% 더 높음) 혈장 PPi의 연속적인 수준을 달성하도록 2일마다, 또는 4일마다, 또는 매주 또는 매월 적절한 시간 간격으로 투여된다. ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 치료적 용량은 또한 반감기 또는 치료용 폴리펩티드가 신체로부터 제거되는 속도에 기초하여 결정될 수 있다. 본 개시에 따른 폴리펩티드는 ENPP1 및/또는 ENPP3의 효소 활성의 일정한 수준을 달성하도록 2일마다, 또는 4일마다, 매주 또는 매월의 적절한 시간 간격으로 투여된다.
예를 들어, 여러 번의 분할된 투여량이 매일 투여될 수 있거나, 투여량은 치료 상황의 긴급성에 의해 표시된 바와 비례해서 감소될 수 있다. 본원에 개시된 치료 화합물에 대한 유효 투여량 범위의 비한정적인 예는 약 0.01 및 50 mg/kg의 체중/일이다. 소정의 실시예에서, 본원에 개시된 치료 화합물의 유효 투여량 범위는 체중의 약 50 ng/kg 내지 500 ng/kg, 바람직하게는 100 ng 내지 300 ng/kg이다. 당해 분야 숙련자라면 관련 인자를 연구하고 과도한 실험 없이 치료 화합물의 유효량에 관한 결정을 내릴 수 있을 것이다.
가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질은 매일 수회만큼 빈번하게 환자에게 투여될 수 있거나, 덜 빈번하게, 예컨대 1일 1회, 주 1회, 2주마다 1회, 월 1회, 또는 심지어 덜 빈번하게, 예컨대 수개월에 1회, 또는 심지어 1년에 1회 또는 그 이하로 투여될 수 있다. 일일 투여되는 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및 이의 융합 단백질의 양은, 비한정적인 예에서, 매일, 이틀에 1회, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 또는 5일마다 투여될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2일마다 투여 시, 5 mg/일 투여량이 월요일에 개시될 수 있고, 첫번째 후속 5 mg/일 투여량이 수요일에 투여되고, 두번째 후속 5 mg/일 투여량은 금요일에 투여되는 것 등이다. 투여량의 빈도는 당해 분야 숙련자에게 쉽게 명백하며, 치료 중인 질환의 유형 및 중증도, 및 환자의 유형 및 연령과 같은 임의의 수의 인자에 의존하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 약학적 조성물 중의 활성 성분(예를 들어, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 및/또는 이의 융합 단백질)의 실제 투여 수준은, 환자에게 독성이 되지 않으면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다.
의사, 예를 들어, 당해 분야 숙련자인 의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는, 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 수준보다 낮은 수준으로 약학적 조성물에 사용된 본원에 개시된 화합물의 투약을 시작할 수 있고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
소정의 실시예에서, 본원에 개시된 조성물은 1일 1 내지 5회 또는 그 이상의 투여량으로 환자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 조성물은 1일, 2일마다, 3일마다 1회 내지 주 1회, 및 2주마다 1회를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 투여 범위로 환자에게 투여된다. 본원에 개시된 다양한 조합 조성물의 투여 빈도는 대상체에서 대상체까지 다양하며, 이는 연령, 치료 대상 질환 또는 장애, 성별, 전반적인 건강 및 기타 인자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 따라 달라진다. 따라서, 본 개시는 임의의 특정 투여 체제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 임의의 환자에게 투여될 정확한 투여량 및 조성물은 환자에 대한 모든 다른 인자를 고려한 참여중인 신체에 의해 결정될 것이다.
소정의 실시예에서, 본 개시는 본원에 개시된 화합물의 치료적 유효량을 단독으로 또는 제2 약학적 제제와 조합하여 보유하는 용기; 및 환자에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키기 위해 화합물을 사용하기 위한 지침을 포함하는 포장된 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 투여 경로는 흡입, 경구, 비강, 직장, 비경구, 설하, 경피, 경점막 (예를 들어, 설하, 설측, (경)협측, (경)요도, 질 (예를 들어, 경- 및 질주위), 비강내 및 (경)직장, 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 척수강내, 피하, 근육내, 피내, 동맥내, 정맥내, 기관지내, 흡입(예를 들어, 에어로졸), 안과, 폐, 및 국소 투여를 포함한다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드, 또는 이의 전구체 단백질은, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물로서 대상체에게 투여된다.
소정의 실시예에서, 폴리펩티드, 또는 이의 전구체 단백질은, 대상체에게 급성 또는 만성으로 투여된다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드, 또는 이의 전구체 단백질은, 대상체에게 국소적으로, 부위로 또는 전신적으로 투여된다. 또 다른 실시예에서, 폴리펩티드, 또는 이의 전구체 단백질은, 암호화된 벡터 상에 전달되며, 여기서 벡터는 단백질을 암호화하고, 벡터가 대상체에게 투여될 때 벡터로부터 전사되고 번역된다.
소정의 실시예에서, 본 개시의 치료 방법은 전신적으로, 또는 국소적으로 이식재 또는 기구로서 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 약학적 조성물은 흡입, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 경피, 폐, 비강 내, 협측, 안과, 경막 내, 정맥 내 또는 다른 투여 경로를 위해 적절히 개발될 수 있다. 다른 고려되는 제형은 투사된 나노입자, 리포좀 제제, 및 면역 기반 제형을 포함한다. 투여될 때, 본 개시에서 사용하기 위한 치료 조성물은 실질적으로 발열원이 없거나, 발열원이 없는, 생리학적으로 허용 가능한 형태이다.
적절한 조성물 및 투여 형태는, 예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플릿, 알약, 겔 캡, 트로슈, 분산액, 현탁액, 용액, 시럽, 과립, 비드, 경피 패치, 겔, 분말, 펠릿, 매그마, 캔디, 크림, 페이스트, 회반죽, 로션, 디스크, 좌제, 비강 또는 경구 투여용 액체 스프레이, 흡입용 건조 분말 또는 에어로졸 제형, 방광내 투여용 조성물 및 제형 등을 포함한다. 본 개시에 유용할 제형 및 조성물은 본원에서 설명되는 특정 제형 및 조성물에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는, 약학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직을 물리적으로 뚫는 것 및 조직 내 틈을 통한 약학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서 비경구 투여는, 조성물의 주사에 의한 약학적 조성물의 투여, 수술적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 침투성 비-수술 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학적 조성물의 투여를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 줄기 내 주사, 및 신장 투석 주입 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있으며, 항산화제, 완충제, 정균제, 의도된 수용자의 혈액과 제형을 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있는, 멸균 분말과 조합된 하나 이상의 ENPP1 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
조성물 및 제형은, 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치에 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어 블리스터 팩과 같은, 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 지침을 수반할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 개시는 본원에 개시된 적어도 하나의 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드, 또는 이의 염 또는 용매화물, 및 본원에 개시된 방법 내에서 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드를 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 조성물은 표적 조직 부위에 전달하기 위한 형태로 캡슐화되거나 주사될 수 있다. 소정의 실시예에서, 본 개시의 조성물은 하나 이상의 치료 화합물(예를 들어, ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드)을 표적 조직 부위에 전달할 수 있고, 발달 조직을 위한 구조를 제공하고, 신체 내로 재흡수될 수 있는 최적의 구조를 제공할 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 다른 이식된 의료 응용예에 현재 사용 중인 재료로 형성될 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용 외관 및 계면 특성에 기초한다. 본 발명의 조성물의 특정한 적용은 적절한 제형을 정의할 것이다. 조성물에 대한 잠재적 매트릭스는 생분해성이고 화학적으로 정의된 황산칼슘, 인산삼칼슘, 수산화인회석, 폴리락트산 및 다가수화물일 수 있다. 다른 잠재적 재료는, 뼈 또는 진피 콜라겐과 같은, 생분해성이고 생물학적으로 잘 정의된 것이다. 추가의 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 비-생분해성이고 화학적으로 정의된 것으로, 예컨대 소결형 수산화인회석, 바이오글래스, 알루미네이트, 또는 기타 세라믹이다. 매트릭스는 폴리락트산 및 수산화인회석 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘과 같은, 전술한 유형의 재료 중 임의의 것의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 조성물에서, 예컨대 칼슘-알루미네이트-포스페이트에서 변경될 수 있고, 기공 크기, 입자 크기, 입자 형상, 및 생분해성을 변경시키도록 가공될 수 있다.
소정의 실시예에서, 본원에 개시된 치료제는 경구 투여될 수 있고, 예: 캡슐, 카셰이, 알약, 정제, 캔디(가향 베이스, 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸스 사용), 분말, 과립의 형태, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 유화액으로서, 또는 엘릭서 또는 시럽으로서, 또는 파스틸(비활성 베이스, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아 사용)로서 및/또는 구강 세척제 등으로서 투여될 수 있으며, 각각은 활성 성분으로서 미리 결정된 양의 제제를 함유하고 있다. 제제는 볼루스, 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수도 있다.
경구 투여용 고형 투여 형태(캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말, 과립, 등)에서, 본 개시의 하나 이상의 치료 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 구연산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 다음 중 하나 이상과 혼합될 수 있다: (1) 충진제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스, 및/또는 아카시아; (3) 습윤제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 아가-아가, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 및 탄산나트륨; (5) 용액 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대, 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물, 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약학적 조성물은 완충제를 포함할 수도 있다. 유사한 유형의 고형 조성물은 또한 락토오스 또는 우유당과 같은 부형제뿐만 아니라, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하는 연질 및 경질 충진 젤라틴 캡슐의 충진제로서 사용될 수 있다.
소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질은 액체 제형으로서 제형화된다. 경구 투여용 액체 투여 형태는 약학적으로 허용 가능한 유화액, 마이크로유화액, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭서를 포함한다. 활성 성분 이외에, 액체 투여 형태는 당업계에서 흔히 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 아세트산에틸, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 캐스터, 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구용 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 착향제, 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
현탁액은, 활성 화합물 이외에, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸스, 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
소정의 실시예에서, 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드는 동결 건조된 생성물로서 제형화된다. 다른 실시예에서, 본 개시는 본원에 개시된 가용성 ENPP1 및/또는 ENPP3 폴리펩티드의 치료적 양을 포함하는 약학적 조성물의 건조 생성물 형태를 제공하며, 이에 의해 건조 생성물은 액체 형태의 화합물의 용액으로 재구성 가능하다.
본 개시의 추가 투여 형태는 미국 특허 제6,340,475호, 제6,488,962호, 제6,451,808호, 제5,972,389호, 제5,582,837호, 및 제5,007,790호에 설명되는 바와 같은 투여 형태를 포함한다. 본 개시의 추가 투여 형태는 또한 미국 특허 출원 제20030147952호, 제20030104062호, 제20030104053, 제20030044466호, 제20030039688호, 및 제20020051820호에 설명되는 바와 같은 투여 형태를 포함한다. 본 개시의 추가 투여 형태는 또한 PCT 출원 번호 WO 03/35041, WO 03/35040, WO 03/35029, WO 03/35177, WO 03/35039, WO 02/96404, WO 02/32416, WO 01/97783, WO 01/56544, WO 01/32217, WO 98/55107, WO 98/11879, WO 97/47285, WO 93/18755, 및 WO 90/11757에 설명되는 투여 형태를 포함한다.
본원에 개시된 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사형 약학적 형태의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 일어날 수 있다.
본원에 개시된 약학적 조성물의 제어-방출식 또는 서방성 제형은 종래의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 경우에, 사용될 투여 형태는, 예를 들어, 하이드로프로필메틸 셀룰로오스, 기타 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 미세입자, 리포좀, 또는 미세구체 또는 이들의 조합을 사용하여 그 안의 하나 이상의 활성 성분의 서방성 또는 제어-방출로 제공되어 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공할 수 있다. 제어-방출에 적합한 정제, 캡슐, 겔캡 및 캐플릿과 같은, 경구 투여에 적합한 단일 단위 투여 형태가 본 개시에 포함된다.
소정의 실시예에서, 본 개시의 제형은 단기, 급속한 오프셋 뿐만 아니라, 제어된, 예를 들어, 서방성, 지연 방출 및 박동성 방출 제형일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
서방성이라는 용어는 통상적인 의미에서 장기간에 걸쳐 약물의 점진적 방출을 제공하는 약물 제형을 지칭하도록 사용되고, 이는 반드시 그러한 것은 아니지만, 장기간에 걸쳐 약물의 실질적으로 일정한 혈중 수준을 초래할 수 있다. 기간은 1개월 이상일 수 있고, 볼루스 형태로 투여되는 제제의 동일한 양보다 더 긴 방출이어야 한다. 서방성(sustained release)을 위해, 화합물은 화합물에 서방출 특성을 제공하는 적절한 중합체 또는 소수성 물질로 제형화될 수 있다. 이와 같이, 본원에 설명되는 바와 같은 용도의 화합물은 미세입자의 형태로, 예를 들어, 주사에 의해 또는 이식에 의해 웨이퍼 또는 디스크의 형태로 투여될 수 있다. 소정의 실시예에서, 화합물은 서방성 제형을 사용하여, 단독으로 또는 다른 약학적 제제와 조합하여 환자에게 투여된다.
지연 방출이라는 용어는, 통상적인 의미에서 약물 투여 후 약간의 지연 후에 약물의 초기 방출을 제공하는 약물 제형을 지칭하도록 본원에서 사용되고, 이는 반드시 그러한 것은 아니지만, 약 10분 내지 약 12시간까지의 지연을 포함한다. 용어 박동성 방출은 통상적인 의미에서 약물 투여 후 약물의 펄스화된 혈장 프로파일을 생성하도록 하는 방식으로 약물의 방출을 제공하는 약물 제형을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 속방출(immediate release)이라는 용어는 통상적인 의미에서 약물 투여 직후에 약물의 방출을 제공하는 약물 제형을 지칭하도록 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단기는 약물 투여 후 약물 투여 후 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 약 40분, 약 20분, 또는 약 10분을 포함하며 최대 이 시간까지의 임의의 기간 및 이의 어느 하나 또는 모든 전체 또는 부분적 증분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 급속-오프셋은 약물 투여 후 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 약 40분, 약 20분, 또는 약 10분을 포함하며 최대 이 시간까지의 임의의 기간 및 이의 어느 하나 또는 모든 전체 또는 부분적 증분을 지칭한다.
당해 분야 숙련자라면 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에서 설명되는 특정 절차, 실시예, 청구범위 및 예시의 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주되었고, 본원에 첨부된 청구범위에 의해 커버되었다. 예를 들어, 당업계에서 인정된 대안을 가지고 통상적인 실험을 초과하지 않는 방식으로 반응 및 제조 조건의 변형이 본 출원의 범위 내에 있다는 것을 이해해야 한다.
값과 범위가 본원에서 제공될 때마다, 이들 값 및 범위에 포함되는 모든 값 및 범위는 본 개시의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 이들 범위 내에 속하는 모든 값뿐만 아니라 값의 범위의 상한 또는 하한도 본 출원에 의해 고려된다.
6.
서열
| 서열번호 | 서열 | 설명 |
| 9 |
  |
성숙한 ENPP1(190-925)-hFc가 도시되어 있다(링커에 밑줄이 쳐짐) |
| 10 |
 |
미가공된 ENPP1(190-925)-hFc 단백질, 신호 서열에 밑줄이 쳐짐 |
| 11 |
 |
링커에 밑줄이 쳐진 성숙한 ENPP1(190-925) R818H-hFc |
| 12 |
  |
미가공된 ENPP1(190-925)R818H-hFc, 신호 서열에 밑줄 쳐짐 |
| 13 |
 |
인간 IgG1 (GlFc) |
| 14 |
   |
ENPP1-Fc 뉴클레오티드 서열 I |
| 15 |
  |
ENPP1-Fc 뉴클레오티드 서열 2 |
| 16 |
 |
hlgG Fc 도메인, Fc |
| 17 |  여기서 Xaa23은 부재하거나 L이고, 여기서 Xaa23이 부재하는 경우 Xaa24는 부재하고, Xaa23이 L인 경우 Xaa24는 부재하거나 또는 Q임 |
hENPP5 단백질 유출 신호 서열 |
| 18 |
 |
hENPP7 단백질 유출 신호 서열 |
| 19 |
 |
hENPP7 단백질 유출 신호 서열 |
| 117 |
  |
시험 작제물 3 |
| 118 |
 |
시험 작제물 4 |
| 119 |
  |
시험 작제물 5 |
| 120 |
 |
시험 작제물 6 |
| 121 |
 |
시험 작제물 7 |
| 122 |
  |
시험 작제물 2 |
| 123 |
 |
신호 서열에 밑줄이 쳐진 시험 작제물 3 |
| 124 |
 |
신호 서열에 밑줄이 쳐진 시험 작제물 4 |
| 125 |
  |
신호 서열에 밑줄이 쳐진 시험 작제물 5 |
| 126 |
 |
신호 서열에 밑줄이 쳐진 시험 작제물 6 |
| 127 |
 |
신호 서열에 밑줄이 쳐진 시험 작제물 7 |
| 128 |
  |
신호 서열에 밑줄이 쳐진 시험 작제물 2 |
본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 당업계에서, 본 개시의 문맥 내에서, 및 각각의 용어가 사용되는 특정 맥락에서 이들의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물 및 방법, 및 이들의 제조 및 사용 방법을 기술함에 있어서 실무자에게 추가 지침을 제공하기 위해 하기 또는 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 용어의 임의의 사용의 범위 또는 의미는 해당 용어가 사용되는 특정 문맥으로부터 명백해질 것이다.
"약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정밀도를 고려하여 측정된 양에 대한 허용 가능한 오차 정도를 의미한다. 전형적으로, 예시적인 오차의 정도는 주어진 값 또는 값들의 범위의 20% 이내(%), 바람직하게는 10% 이내, 및 더 바람직하게는 5% 이내이다.
대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 크기, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내인 값을 의미할 수 있다. 본원에서 주어진 수치 양은 달리 언급되지 않는 한 대략적인 양이며, 용어 "약" 또는 "대략"은 명시적으로 언급되지 않은 경우에 추론될 수 있음을 의미한다.
용어 "a" 및 "an"은 용어가 사용되는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 용어 "a" (또는 "a") 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것의 유무와 상관없이 둘 이상의 특정된 특징부 또는 구성요소 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원의 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 "및/또는"이라는 용어는 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구절에 사용된 용어 "및/또는"은 다음의 측면 각각을 포함하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에 개시된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 자연 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 반드시 출발 분자와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 소정의 실시예에서, 변이체는 출발 (예를 들어, 자연 발생 또는 야생형) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80% 내지 100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85% 내지 100% 미만, 보다 바람직하게는 약 90% 내지 100% 미만(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 및 가장 바람직하게는 약 95% 내지 100% 미만을, 예를 들어, 상기 변이체 분자의 길이에 걸쳐 가질 것이다.
바람직한 방법 및 재료가 기술되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본원에 개시된 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다.
예시
이제 본 발명이 일반적으로 설명되고 있으며, 이는 다음의 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이며, 이들은 단지 본 발명의 특정 실시예 및 실시예의 예시 목적으로만 포함되며 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
예 1. ENPP1 융합 단백질의 생성
(류신, 이소류신 및 아스파라긴을 포함하는) 링커를 그 사이에 가지고 인간 Fc 도메인에 융합된 ENPP1의 SMB1 및 SMB2 도메인 모두 결여된 가용성 ENPP1 융합 단백질을 구성하였다. 이 작제물을 ENPP1(190-925)-hFc로 지칭한다.
ENPP1(190-925)-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 바와 같이 서열번호 9(링커에 밑줄이 쳐짐)로서 표 1에 나타나 있다.
SP(2) 리더 서열을 사용하여 CHO 세포주에서 발현된 ENPP1(190-925)-hFc 단백질은 서열번호 10 (표 1)에 나타낸 미가공된 아미노산 서열을 갖는다.
ENPP1(190-925)-hFc(서열번호 10)에 대한 미가공된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에서 서열번호 14로서 제시되어 있다.
CHO-세포 생산 물질의 N-말단 시퀀싱은 SRA-KS에서 절단을 나타내는 WVEEPC의 주요 서열을 밝혀냈다(서열번호 1과 관련하여, 잔기 189 및 190에서 각각 세린(S)과 트립토판(W) 사이임).
정제는, 예를 들어, 다음 중 3개 이상을 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해, 임의의 순서로 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 정제를 완료할 수 있다.
단백질의 정제 후, pNP-TMP를 발색 기질로서 사용하여 ENPP1(190-925)-hFc 단백질의 촉매 활성을 평가하였고, SMB1 및 SMB2의 결실은 ENPP1 효소 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 결정하였다. SMB1 및 SMB2 도메인의 결실은, SMB 도메인을 함유하는 ENPP1-Fc 폴리펩티드에 비해, 폴리펩티드의 응집을 감소시키고/감소시키거나 결실 돌연변이체에 대항하여 항-약물 항체가 포유동물에 의해 생성될 가능성을 상당히 감소시킬 것으로 예상된다.
예 2. 프로테아제 내성 ENPP1 융합 단백질의 생성
전술한 정제 단계 후, 폴리펩티드 분석은 적은 비율의 폴리펩티드가 프로테아제(즉, 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제)에 의해 ENPP1의 뉴클레아제 도메인에서 클립핑되어 폴리펩티드가 절단되었음을 보여주었다. 이들 소견에 기초하여, ENPP1의 뉴클레아제 도메인에서 일련의 돌연변이(서열 변이)를 생성하고, 이들 변이체 폴리펩티드를 선택적 링커에 의해 결합된 변이체 ENPP1 뉴클레아제 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질로서 생산하였다. 변이체 ENPP1-Fc 단백질의 생성에 사용된 배경 ENPP1-Fc 융합은 ENPP1(190-925)-hFc였으며, 상기 예 1에서 서열번호 9로서 나타나 있다.
다양한 치환 돌연변이를 배경 ENPP1-Fc 융합 단백질에 도입하였다. 프로테아제에 의해 절단된 잔기에 기초하여, 대부분의 돌연변이는 서열번호 1에 대해 잔기 816, 817, 또는 818에서 만들어졌다. PCR 돌연변이 유발에 의해 ENPP1 뉴클레아제 도메인에서 돌연변이를 생성하였다. PCR 돌연변이 유발 후, Qiagen 컬럼을 통해 단편을 정제하고, 분해하고, 겔 정제하였다. 이들 단편을 발현 벡터에 연결시켜, 연결 시 인간 IgG1과의 융합 키메라를 생성하였다. 형질전환 후, 콜로니를 선별하고 DNA를 단리하였다. 모든 돌연변이체를 서열 검증하였다.
따라서, (류신, 이소류신 및 아스파라긴을 포함하는) 링커를 그 사이에 가지고 인간 Fc 도메인에 융합된 서열번호 1에 대해 R818H 치환을 갖는 ENPP1의 SMB1 및 SMB2 도메인 모두 결여된 가용성 ENPP1 ENPP1 융합 단백질을 구성하였다. 이 작제물을 ENPP1(190-925) R818H-hFc로 지칭한다.
ENPP1(190-925) R818H-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 바와 같이 서열번호 11(링커에 밑줄이 쳐짐)로서 표 1에 나타나 있다.
SP(2) 리더 서열을 사용하여 CHO 세포주에서 발현된 ENPP1(190-925) R818H-hFc 단백질은 서열번호 12(표 1)에 나타낸 미가공된 아미노산 서열을 갖는다.
ENPP1(190-925) R818H-hFc(서열번호 12)에 대한 미가공된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에서 서열번호 15로서 제시되어 있다.
CHO-세포 생산 물질의 N-말단 시퀀싱은 SRA-KS에서 절단을 나타내는 WVEEPC의 주요 서열을 밝혀냈다(서열번호 1과 관련하여, 잔기 189 및 190에서 각각 세린(S)과 트립토판(W) 사이임).
정제는, 예를 들어, 다음 중 3개 이상을 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해, 임의의 순서로 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 정제를 완료할 수 있다.
단백질의 정제 후, pNP-TMP를 발색 기질로서 사용하여 ENPP1(190-925) R818H-hFc 단백질의 촉매 활성을 평가하였고, 서열번호 1에 대해 R818H 치환은 ENPP1 효소 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 결정하였다. 또한, 뉴클레아제 도메인에서의 단백질분해 절단은 ENPP1(190-925)-hFc와 비교하여 ENPP1(190-925) R818H-hFc 단백질에서 유의하게 감소하였다.
예 3. 추가 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 ENPP1 융합 폴리펩티드의 생성
인간 ENPP1 내에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하기 위해 특이적 돌연변이가 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적정 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린을 포함한다("X"는 임의의 아미노산임). 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나, 치환함으로써 이루어질 수 있다.
서열번호 1에 대해 I332T 치환 돌연변이를 도입하면 N-글리칸 컨센서스 서열이 ENPP1 촉매 도메인 내의 삽입 루프 내로 도입된다. 인간 ENPP1 삽입 루프에서 잔기 332에 존재하는 글리칸은 촉매 트레오닌 근처에 존재하며, 이는 무수 포스포산 기질에 친핵성 첨가를 담당한다. 놀랍게도, 마우스에 투여될 때, I332T 치환을 포함하는 ENPP1-Fc 융합 폴리펩티드는 생체 내 노출을 7.7배 증가시켰고, 혈청 반감기를 160% 증가시켰다. 소정의 비제한적인 실시예에서, 위치 332에서 글리칸의 첨가에 의해 유도된 증가된 생물학적 노출은 생물학적 흡수 및/또는 생물학적 순환을 증가시키는 것과 관련이 있다. 소정의 비제한적인 실시예에서, 위치 332에서 글리칸의 첨가에 의해 유도된 증가된 생물학적 노출은 효소의 기능 획득으로 인한 것이 아니다. 본원에 개시된 돌연변이체의 정제 및 제조는 전술한 단계를 따름으로써 달성될 수 있다.
예 4. ENPP1 항약물 항체(ADA) 경쟁 연구
ELISA 경쟁 검정을 사용하여 가용성 인간 ENPP1-Fc 융합 단백질의 어느 도메인이 동물 연구에서 생성된 항-약물 항체(ADA)에 결합하는지를 확인하였다. 동물 연구에서 30 mg/kg의 ENPP1-Fc를 투여한 랫트 또는 NHP로부터의 혈장 및 혈청 샘플을 아세트산으로 처리하여 ENPP1-Fc로부터 ADA를 분리하였다. 산-처리된 혈장 샘플을 중화시키고 ENPP1-Fc 코팅 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 결합된 ADA를 산 처리로 용출하고, 중화시키고, 제2 플레이트로 옮겨 밤새 코팅하였다. 다음 날, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제에 접합된 ENPP1(ENPP1-HRP)을 다양한 경쟁자와 함께 또는 없이 제2 플레이트에 첨가하였다. 분석에 사용된 경쟁자는 다음을 포함하였다:
결합된 ENPP1-HRP를 비색 기질인 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)로 정량화하였다. ELISA 신호의 감소는 ADA-결합 ENPP1-HRP와 경쟁함을 나타낸다.
음성 대조군(경쟁자 없음)과 비교하여, ENPP1-HRP와 1:1의 비율로 표지되지 않은 ENPP1-Fc 시험 작제물 1을 첨가하는 것은 대략 50%의 신호 강하를 초래한다. NHP 샘플에서, 대조군 작제물 2는 ENPP1만큼 효과적으로 ADA 결합에 대해 경쟁하였는데, 이는 ADA가 글리코실화된 ENPP1에 존재하는 글리칸에 특이적으로 결합하지 않음을 나타낸다. 시험 작제물 3, 4 및 5에 대해서도 효과적인 경쟁(신호의 -50% 감소)이 관찰되었는데, 이는 ENPP1 촉매, 뉴클레아제 유사, 및 링커 도메인이 ADA에 대한 주요 결합 부위를 함유하지 않음을 시사한다. 랫트 및 NHP 샘플 모두에서, 인간 IgG1(대조군 작제물 1)은 ADA가 ENPP1-Fc의 Fc 도메인에 결합하지 않음을 나타내는 신호 감소를 야기하지 않았다. 놀랍게도, 시험 작제물 2를 경쟁 분석에 첨가하면 ELISA 신호가 -20% 감소하였는데, 이는 ENPP1의 SMB1 및 SMB2 도메인의 제거가 ADA 결합을 위해 ENPP1-HRP와 경쟁하는 능력을 현저하게 감소시켰음을 나타낸다. 이 데이터는 ENPP1 SMB1 및 SMB2 도메인이 동물 연구에서 ADA 반응을 담당하는 ADA에 대한 주요 결합 부위를 포함하고 있음을 나타낸다.
예
5.
다양한 ENPP1-Fc 작제물의 단일 투여량 PK/PD 평가
다양한 ENPP1-Fc 작제물의 활성 및 연관된 생체 내 PPi 수준을 3개의 시험 작제물을 사용하여 360시간에 걸쳐 평가하였다. 생후 약 6주령의 정상 식이요법 중인, C57B1/6J-ENPP1asj/GrsrJ 마우스를 연구에 사용하였다. 표에 나타낸 바와 같이 채취 시점에 시차를 두도록, 마우스를 9개 군, 각 시험 항목에 대해 6마리 마우스로 이루어진 3개 군으로 무작위 배정하였다. 다양한 경쟁자의 연구 1일차에 동물에게 2 mg/kg을 1회 피하 투여하였다:
모든 마우스에게 연구 1일차에 40 μg/동물의 GK 1.5(면역억제제)를 투여하고 연구 6일차와 12일차에 25 μg/동물을 투여하였다. 아래 표 2에 나타낸 바와 같이 혈장 ENPP1 활성 및 PPi 수준을 측정하기 위해 상이한 시점에 샘플을 수득하였다.
| 시험 작제물 | 군 | n | 투여 전 | 24시간 | 72시간 | 144시간 | 216시간 | 360시간 |
| 시험 작제물 5 | 1 | 6 | X | X | ||||
| 2 | 6 | X | X | |||||
| 3 | 6 | X | X | |||||
| 시험 작제물 6 | 4 | 6 | X | X | ||||
| 5 | 6 | X | X | |||||
| 6 | 6 | X | X | |||||
| 시험 작제물 7 | 7 | 6 | X | X | ||||
| 8 | 6 | X | X | |||||
| 9 | 6 | X | X |
ENPP1 활성 수준은 24시간에서 최고에 달했으며 모든 동물에서 이후 시점에 감소하였다(도 9a). 시험 작제물 5를 투여한 마우스는 24시간 시점에 최저 ENPP1 활성 수준 및 더 빠른 제거율을 나타냈다. 시험 작제물 5가 투여된 동물에서의 활성 수준은 216시간 시점 즈음 베이스라인으로 되돌아갔다. 시험 작제물 5와 비교하여, 시험 작제물 7의 단일 투여량은 말단 1을 제외한 모든 시점에서 더 높은 ENPP1 활성을 초래하였다. 시험 작제물 6이 투여된 마우스는 24시간 시점에 최고 ENPP1 활성을 나타냈고 반감기를 연장시켰다. 시험 작제물 6이 투여된 동물의 ENPP1 활성 수준은 360시간에 상승된 상태로 유지되었다.
모든 작제물을 투여한 결과, 투여 전 베이스라인 대비 PPi 수준이 상승하였다(도 9b). 모든 군에서 PPi 상승은 적어도 216시간 시점까지 지속되었다. ENPP1 활성 데이터와 일관되게, 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7을 투여한 동물에서의 PPi 수준은 24시간 후 시점들에서 시험 작제물 5 군의 수준보다 높았다. 시험 작제물 6을 투여한 동물에서는 PPi수준이 360시간에 상승한 반면, 다른 2개 군은 거의 베이스라인 수준까지 감소하였다.
예 6. ENPP1-Fc 처리에 의한 생체 내 PPi 및 조직 석회화 수준 평가
심장, 대동맥, 신장 및 비장의 PPi 및 조직 석회화를 비히클 또는 다양한 ENPP1-Fc 작제물(시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 또는 시험 작제물 7)로 처리한 마우스에서 평가하였다. 임신 전반에 걸쳐 가속 식이를 먹인 2-3주령 Enpp1asj/asj 마우스를 5개 군으로 무작위 배정하였다. 1 mg/kg의 비히클 또는 ENPP1-Fc 변이체(시험 작제물 5, 시험 작제물 6, 또는 시험 작제물 7)를 4주 동안 주 1회 피하 투여하였다. 연령이 일치하는 WT 한배 새끼에게 대조군으로서 비히클을 투여하였다. 연구 종료 시 심장/대동맥, 신장, 간, 폐, 비장, 및 비모(vibrissae)를 포함하는 다수의 조직에서의 혈장 PPi 및 칼슘 함량을 측정하였다.
비히클로 처리한 돌연변이 마우스는 거의 검출 불가능한 수준의 PPi를 나타냈다(도 l0a). 시험 작제물 5를 투여한 동물에서 PPi 농도는 대략 2 μM인 반면, 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7을 투여한 경우, PPi는 각각 8 μM 및 10 μM로 상승하였다. 시험 작제물 6 또는 시험 작제물 7을 투여한 동물은 비히클을 투여한 동물과 비교하여 심장 및 대동맥, 신장 및 비장에서 조직 석회화의 예방이 유사하거나 더 양호하였다(도 l0b, 도 l0c, 및 도 l0d).
예 7. SMB 도메인을 포함하거나 결여된 ENPP1-Fc 폴리펩티드에서의 응집 수준 비교
SMB 도메인을 포함하는 (시험 작제물 5) 또는 결여된 (시험 작제물 2) ENPP1-Fc 폴리펩티드의 응집을 비교하였다. 시험 작제물 2 및 시험 작제물 5를 MabSelect SuRe 수지로 정제한 TunaCHOTM 세포에서 일시적으로 발현시키고, 제형 완충액(20 mM 히스티딘, l00mM 아르기닌, 50mM NaCl, lmM ZnCh pH 6.0)으로 투석하였다. 단백질을 대략 동등한 농도로 농축시켰다(시험 작제물 2- 22 mg/mL 및 시험 작제물 5-22.6 mg/mL). 샘플을 이미징 전에 15일 동안(시험 작제물 2) 또는 13일 동안(시험 작제물 5) 100mM DTT와 함께 또는 없이 상온에서 인큐베이션하였다. 2일 이내에, DTT-처리된 샘플은 고형화되었고, 이는 아마도 DTT-변성된 단백질의 응집 때문일 것이다. DTT 처리가 없는 샘플에서, 가시적인 침전물이 시험 작제물 5 샘플에서 13일 후에 형성되었지만, SMB 도메인이 결여된 시험 작제물 2 샘플은 15일 동안 깨끗한 상태를 유지했다 (도 11).
참조에 의한 통합
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시된 것처럼 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
주제의 특정 실시예가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적인 것이며 제한적이지 않다. 본 명세서 및 하기 청구범위를 검토하면 많은 변형이 당 분야의 숙련자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는, 균등물의 전체 범위와 함께 청구범위 및 이러한 변형과 함께 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> INOZYME PHARMA, INC.
<120> SOLUBLE ENPP1 PROTEINS AND USES THEREOF
<130> 1886569-001-WO1
<140> PCT/US2021/036494
<141> 2021-06-08
<150> 63/036,833
<151> 2020-06-09
<160> 134
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 925
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
20 25 30
Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser
35 40 45
Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala
50 55 60
Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu
65 70 75 80
Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly
85 90 95
Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys
100 105 110
Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu
115 120 125
Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu
130 135 140
His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr
145 150 155 160
Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys
165 170 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180 185 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195 200 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210 215 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225 230 235 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245 250 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260 265 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275 280 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290 295 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305 310 315 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325 330 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340 345 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355 360 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370 375 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385 390 395 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405 410 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420 425 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435 440 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450 455 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465 470 475 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485 490 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500 505 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515 520 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530 535 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545 550 555 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565 570 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580 585 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595 600 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610 615 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625 630 635 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645 650 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660 665 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675 680 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690 695 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705 710 715 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725 730 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740 745 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755 760 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770 775 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785 790 795 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805 810 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820 825 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835 840 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850 855 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865 870 875 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885 890 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900 905 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
915 920 925
<210> 2
<211> 827
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20 25 30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35 40 45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50 55 60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85 90 95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100 105 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115 120 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130 135 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195 200 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210 215 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245 250 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260 265 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275 280 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290 295 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305 310 315 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325 330 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340 345 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355 360 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370 375 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385 390 395 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405 410 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420 425 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435 440 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450 455 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485 490 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500 505 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530 535 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565 570 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580 585 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595 600 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610 615 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625 630 635 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645 650 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660 665 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675 680 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690 695 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705 710 715 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725 730 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740 745 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755 760 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770 775 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785 790 795 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805 810 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
820 825
<210> 3
<211> 736
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
<210> 4
<211> 735
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Trp Val Glu Glu Thr Cys Glu Ser Ile Asp Thr Pro Glu Cys Pro Ala
1 5 10 15
Glu Phe Glu Ser Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Asn Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Met Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Leu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Ile Trp Val Thr Ala Asn His Gln Glu Val Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Tyr Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asp Gly Ile Leu
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Val Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Pro Ser His Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
His Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Lys Val Asp
195 200 205
Arg Leu Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Asp Leu Gly Leu Asp
210 215 220
Lys Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Asn
245 250 255
Asn Val Lys Val Val Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Thr Asp
260 265 270
Val Pro Glu Thr Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Ala Leu Ala Lys Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Arg Pro Tyr Leu Lys Pro
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Leu Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Ile Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Lys His
355 360 365
Gly Ala Glu Val Asp Ser Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Gly Leu Ile Pro Ala Pro Asn Asn Gly Ser His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Lys Pro Ile Tyr Asn Pro Ser His Pro
405 410 415
Lys Glu Glu Gly Phe Leu Ser Gln Cys Pro Ile Lys Ser Thr Ser Asn
420 425 430
Asp Leu Gly Cys Thr Cys Asp Pro Trp Ile Val Pro Ile Lys Asp Phe
435 440 445
Glu Lys Gln Leu Asn Leu Thr Thr Glu Asp Val Asp Asp Ile Tyr His
450 455 460
Met Thr Val Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Ile Leu Leu Lys Gln His Arg
465 470 475 480
Val Cys Leu Leu Gln Gln Gln Gln Phe Leu Thr Gly Tyr Ser Leu Asp
485 490 495
Leu Leu Met Pro Leu Trp Ala Ser Tyr Thr Phe Leu Ser Asn Asp Gln
500 505 510
Phe Ser Arg Asp Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Leu Arg Ile
515 520 525
Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Tyr Tyr Lys Ser Asn Ser Lys
530 535 540
Leu Ser Tyr Gly Phe Leu Thr Pro Pro Arg Leu Asn Arg Val Ser Asn
545 550 555 560
His Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Val Pro Met Tyr
565 570 575
Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp His Tyr Leu His Asp Thr Leu Leu Gln
580 585 590
Arg Tyr Ala His Glu Arg Asn Gly Ile Asn Val Val Ser Gly Pro Val
595 600 605
Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu Ile Leu Lys
610 615 620
Gln Asn Ser Arg Val Ile Arg Ser Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His
625 630 635 640
Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Gln Leu Ser Glu Thr Pro Leu
645 650 655
Glu Cys Ser Ala Leu Glu Ser Ser Ala Tyr Ile Leu Pro His Arg Pro
660 665 670
Asp Asn Ile Glu Ser Cys Thr His Gly Lys Arg Glu Ser Ser Trp Val
675 680 685
Glu Glu Leu Leu Thr Leu His Arg Ala Arg Val Thr Asp Val Glu Leu
690 695 700
Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Asp Arg Gln Glu Ser Val Ser Glu
705 710 715 720
Leu Leu Arg Leu Lys Thr His Leu Pro Ile Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
<210> 5
<211> 735
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 5
Trp Ala Glu Glu Glu Cys Asp Ser Ile Asp Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Thr Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Asn Ile Tyr Asp Pro Gln Met Asn
85 90 95
Ala Asn Phe Ala Leu Lys Asn Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Leu Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Thr
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Lys Ile Asn Gly Ile Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Ile Tyr Asn Val Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Ile Leu Lys Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Arg Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Asn Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Thr Lys
245 250 255
Asp Tyr Lys Val Val Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asp Tyr Glu Gly Ile Ala Lys Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Gln Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Asn Asp Arg Ile Glu Arg
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Phe
340 345 350
Leu Asn Met Gln Ala Leu Phe Ile Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Ser Thr Glu Val Asp Ser Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Ser Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val Arg Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Ala Pro Arg
420 425 430
Glu Ser Leu Asp Cys Ser Cys Asp Pro Ser Ile Leu Pro Ile Val Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Leu Asn Leu Thr Met Ala Glu Glu Lys Thr Ile Lys
450 455 460
Arg Gly Ala Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Asn Ser Thr
465 470 475 480
Val Cys Leu Leu Tyr Gln His Gln Phe Val Ser Gly Tyr Ser Arg Asp
485 490 495
Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Ile Gly Arg Asn Asp Ser
500 505 510
Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Leu Arg Ile
515 520 525
Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Ala Lys
530 535 540
Leu Ser Tyr Gly Leu Leu Ser Pro Pro Gln Leu His Lys Gly Ser Ser
545 550 555 560
Gln Val Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr
565 570 575
Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp His Tyr Leu His Gly Thr Leu Leu Gln
580 585 590
Arg Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Leu Asn Val Val Ser Gly Pro Val
595 600 605
Phe Asp Ser Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu Thr Leu Lys
610 615 620
Gln Asn Ser Lys Ile Ile Arg Asn Leu Glu Val Leu Ile Pro Thr His
625 630 635 640
Phe Phe Leu Val Leu Thr Ser Cys Lys Asn Thr Ser Gln Thr Pro Leu
645 650 655
Gln Cys Glu Asn Leu Asp Ala Met Ala Phe Ile Leu Pro His Lys Thr
660 665 670
Asp Asn Ser Glu Ser Cys Ala His Gly Lys His Glu Ser Leu Trp Val
675 680 685
Glu Glu Leu Leu Lys Leu His Thr Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His
690 695 700
Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Glu Arg Lys Glu Pro Ile Ser Asp
705 710 715 720
Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Asn Gln Glu Asp
725 730 735
<210> 6
<211> 736
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 6
Trp Val Glu Glu Thr Cys Glu Asn Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Glu
1 5 10 15
Gly Phe Glu Met Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Ala Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Leu Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Arg Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Lys Ile Asn Gly Ile Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Ile Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Ile Leu Lys Trp Leu Arg Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Asn Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Gln Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Thr Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Glu Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Asn Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Ser Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Gln His
355 360 365
Gly Ile Glu Val Asp Ser Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Ile Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val Gln Pro Ser Val Gln Cys Pro Leu Ala Gly Ser Pro Arg
420 425 430
Asp Ser Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Val Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Thr Ala Glu Glu Lys Asn Ile Asn
450 455 460
Arg Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Leu Leu Gln Lys Lys Ser
465 470 475 480
Ser Val Cys Leu Leu Tyr Gln His Gln Phe Val Ser Gly Tyr Ser His
485 490 495
Asp Val Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asn Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Leu Arg
515 520 525
Ile Ser Phe Ser Pro Ile His Asn Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Ala
530 535 540
Lys Leu Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Ser Lys Asp Ser
545 550 555 560
Ser Gln Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Gln Arg Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Ser Ile Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Ser Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Ser Glu Ala Leu
610 615 620
Lys Arg Asn Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Ile Thr Ser Cys Lys Asn Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu Gln Cys Asp Asn Leu Asp Pro Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Ser Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Glu Lys Arg Glu Ser Ser Trp
675 680 685
Ile Glu Glu Leu Leu Met Met His Arg Ala Arg Ile Met Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Glu Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Val Ser Gln Glu Asp
725 730 735
<210> 7
<211> 736
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
<210> 8
<211> 736
<212> PRT
<213> Papio anubis
<400> 8
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Asn Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Val Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Ile Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Ile Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Asn Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Lys Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Ser Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Arg Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu Ile Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Ala Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Leu His Gly Lys His Glu Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
<210> 9
<211> 966
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 9
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Thr Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
740 745 750
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
755 760 765
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
770 775 780
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
785 790 795 800
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
805 810 815
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
820 825 830
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
835 840 845
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
850 855 860
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
865 870 875 880
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
885 890 895
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
900 905 910
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
915 920 925
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
930 935 940
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
945 950 955 960
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
965
<210> 10
<211> 987
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
Unprocessed ENPP1(190-925)-hFc protein sequence"
<400> 10
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu
20 25 30
Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser
35 40 45
Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met
65 70 75 80
Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val
85 90 95
Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr
100 105 110
Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe
115 120 125
Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr
130 135 140
Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu
145 150 155 160
Ile Asn Gly Thr Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val
165 170 175
Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro
180 185 190
Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp
195 200 205
Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala
210 215 220
Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys
225 230 235 240
Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His
245 250 255
Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr
260 265 270
Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg
275 280 285
Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu
290 295 300
Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys
305 310 315 320
Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu
340 345 350
Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly
355 360 365
Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly
370 375 380
Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu
385 390 395 400
Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn
405 410 415
Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr
420 425 430
Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe
435 440 445
Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile
450 455 460
Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu
465 470 475 480
Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val
485 490 495
Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met
500 505 510
Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr
515 520 525
Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu
530 535 540
Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln
565 570 575
Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr
580 585 590
Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe
595 600 605
His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn
610 615 620
Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp
625 630 635 640
Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu
645 650 655
Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp
660 665 670
Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe
675 680 685
Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys
690 695 700
His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg
705 710 715 720
Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg
725 730 735
Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr
740 745 750
Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
755 760 765
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
770 775 780
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr
785 790 795 800
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
805 810 815
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
820 825 830
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
835 840 845
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
850 855 860
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
865 870 875 880
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
885 890 895
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
900 905 910
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
915 920 925
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
930 935 940
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
945 950 955 960
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
965 970 975
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 11
<211> 966
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 11
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Thr Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg His Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
740 745 750
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
755 760 765
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
770 775 780
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
785 790 795 800
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
805 810 815
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
820 825 830
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
835 840 845
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
850 855 860
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
865 870 875 880
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
885 890 895
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
900 905 910
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
915 920 925
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
930 935 940
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
945 950 955 960
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
965
<210> 12
<211> 987
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 12
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu
20 25 30
Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser
35 40 45
Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met
65 70 75 80
Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val
85 90 95
Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr
100 105 110
Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe
115 120 125
Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr
130 135 140
Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu
145 150 155 160
Ile Asn Gly Thr Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val
165 170 175
Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro
180 185 190
Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp
195 200 205
Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala
210 215 220
Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys
225 230 235 240
Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His
245 250 255
Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr
260 265 270
Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg
275 280 285
Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu
290 295 300
Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys
305 310 315 320
Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu
340 345 350
Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly
355 360 365
Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly
370 375 380
Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu
385 390 395 400
Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn
405 410 415
Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr
420 425 430
Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe
435 440 445
Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile
450 455 460
Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu
465 470 475 480
Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val
485 490 495
Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met
500 505 510
Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr
515 520 525
Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu
530 535 540
Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln
565 570 575
Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr
580 585 590
Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe
595 600 605
His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn
610 615 620
Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp
625 630 635 640
Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg His Val Ile Arg Asn Gln Glu
645 650 655
Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp
660 665 670
Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe
675 680 685
Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys
690 695 700
His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg
705 710 715 720
Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg
725 730 735
Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr
740 745 750
Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
755 760 765
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
770 775 780
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr
785 790 795 800
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
805 810 815
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
820 825 830
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
835 840 845
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
850 855 860
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
865 870 875 880
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
885 890 895
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
900 905 910
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
915 920 925
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
930 935 940
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
945 950 955 960
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
965 970 975
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 13
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 14
<211> 2985
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
ENPP1-Fc nucleotide sequence"
<400> 14
ggtaccgcca ccatgacaag actgacagtg ctggctctgc tggccggact gttggcctct 60
tctagagcta agtcctgggt tgaagaaccc tgcgagtcca tcaacgagcc tcagtgtcct 120
gccggcttcg agacacctcc tactctgctg ttctccctgg atggcttcag agccgagtac 180
ctgcatactt ggggaggcct gctgccagtg atctccaagc tgaagaagtg cggcacctac 240
accaagaaca tgaggcctgt gtaccctacc aagacattcc ccaaccacta ctccatcgtg 300
accggcctgt atcctgagag ccacggcatc atcgacaaca agatgtacga ccccaagatg 360
aacgcctcct tcagcctgaa gtccaaagag aagttcaacc ccgagtggta taagggcgag 420
cctatctggg tcaccgctaa gtaccaggga ctgaagtctg gcaccttctt ttggcctggc 480
tccgacgtgg aaatcaacgg caccttcccc gacatctata agatgtacaa cggctccgtg 540
cctttcgagg aacgcattct ggctgttctg cagtggctgc agctgcctaa ggatgagagg 600
cctcacttct acaccctgta cctggaagaa cctgactcct ccggccactc ttatggccct 660
gtgtcctctg aagtgatcaa ggccctgcag cgagtggacg gaatggtcgg aatgctgatg 720
gacggcctga aagagctgaa cctgcacaga tgcctgaacc tgatcctgat ctccgaccac 780
ggcatggaac aggggagctg caagaagtac atctacctga acaagtacct gggcgacgtg 840
aagaacatca aagtgatcta cggcccagcc gccagactga ggccttctga tgtgcctgac 900
aagtactact ccttcaacta cgagggaatc gcccggaacc tgtcctgcag agagcctaac 960
cagcacttca agccctacct gaagcacttt ctgcctaagc ggctgcactt cgccaagtct 1020
gacagaatcg agcccctgac cttctatctg gaccctcagt ggcagctggc cctgaatcct 1080
agcgagagaa agtactgtgg ctccggcttc cacggctccg acaacgtgtt ctctaatatg 1140
caggccctgt tcgtcggcta cggccctggc tttaaacacg gcatcgaggc cgacaccttc 1200
gagaacatcg aggtgtacaa tctgatgtgt gacctgctga atctgacccc tgctcctaac 1260
aacggcaccc acggatctct gaaccatctg ctgaagaatc ccgtgtacac ccctaagcac 1320
cccaaagagg ttcaccctct ggtccagtgt cctttcacca gaaatcctcg ggacaacctg 1380
ggctgctctt gcaacccttc tatcctgcct atcgaggact ttcagaccca gttcaacctg 1440
accgtggccg aggaaaagat catcaagcac gagacactgc cctacggcag acctagagtg 1500
ctgcagaaag agaacaccat ctgcctgctg tcccagcacc agttcatgtc cggctactcc 1560
caggacatcc tgatgcctct gtggacctcc tacaccgtgg accggaacga tagcttctcc 1620
accgaggact tcagcaactg cctgtaccag gatttcagaa tccctctgag ccccgtgcac 1680
aagtgcagct tctacaagaa caacaccaag gtgtcctacg gcttcctgtc tcctccacag 1740
ctgaacaaga actccagcgg catctactct gaggccctgc tgaccaccaa catcgtgccc 1800
atgtaccagt ccttccaagt gatctggcgg tacttccacg acaccctgct gaggaagtac 1860
gccgaagaaa gaaacggcgt gaacgtggtg tctggccccg tgttcgactt cgactacgac 1920
ggcagatgcg actctctgga aaacctgcgg cagaaaagac gagtgatccg gaatcaagag 1980
atcctgattc ctacacactt ctttatcgtg ctgaccagct gcaaggatac ctctcagacc 2040
cctctgcact gcgagaatct ggacaccctg gccttcattc tgcctcacag aaccgacaac 2100
tccgagtcct gtgtgcacgg caagcacgac tcctcttggg tcgaagaact gctgatgctg 2160
caccgggcca gaatcaccga tgtggaacac atcaccggcc tgagcttcta ccagcagcgg 2220
aaagaacctg tgtccgatat cctgaagctg aaaacccatc tgccaacctt cagccaagag 2280
gacctgatca acgacaagac ccacacctgt cctccatgtc ctgctccaga actgctcgga 2340
ggcccctctg tgttcctgtt tccacctaag ccaaaggaca cactgtacat cactcgggag 2400
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tctcacgaag atcccgaagt caagttcaat 2460
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 2520
aactccacct acagagtggt gtccgtgctg actgtgctgc accaggattg gctgaacggc 2580
aaagagtaca agtgcaaagt gtccaacaag gctctgcccg ctcctatcga aaagaccatc 2640
tccaaggcta agggccagcc tcgggaacct caggtttaca ccctgcctcc atctcgggaa 2700
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtca agggcttcta cccttccgat 2760
atcgccgtgg aatgggagtc caatggccag cctgagaaca actacaagac aacccctcct 2820
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactctaagc tgacagtgga caagtcccgg 2880
tggcagcaag gcaatgtgtt ttcctgctct gtgatgcacg aggccctcca caatcactac 2940
acccagaagt ccctgtctct gtcccctggc aaatgatagc tcgag 2985
<210> 15
<211> 2985
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
ENPP1-Fc nucleotide sequence"
<400> 15
ggtaccgcca ccatgacaag actgacagtg ctggctctgc tggccggact gttggcctct 60
tctagagcta agtcctgggt tgaagaaccc tgcgagtcca tcaacgagcc tcagtgtcct 120
gccggcttcg agacacctcc tactctgctg ttctccctgg atggcttcag agccgagtac 180
ctgcatactt ggggaggcct gctgccagtg atctccaagc tgaagaagtg cggcacctac 240
accaagaaca tgaggcctgt gtaccctacc aagacattcc ccaaccacta ctccatcgtg 300
accggcctgt atcctgagag ccacggcatc atcgacaaca agatgtacga ccccaagatg 360
aacgcctcct tcagcctgaa gtccaaagag aagttcaacc ccgagtggta taagggcgag 420
cctatctggg tcaccgctaa gtaccaggga ctgaagtctg gcaccttctt ttggcctggc 480
tccgacgtgg aaatcaacgg caccttcccc gacatctata agatgtacaa cggctccgtg 540
cctttcgagg aacgcattct ggctgttctg cagtggctgc agctgcctaa ggatgagagg 600
cctcacttct acaccctgta cctggaagaa cctgactcct ccggccactc ttatggccct 660
gtgtcctctg aagtgatcaa ggccctgcag cgagtggacg gaatggtcgg aatgctgatg 720
gacggcctga aagagctgaa cctgcacaga tgcctgaacc tgatcctgat ctccgaccac 780
ggcatggaac aggggagctg caagaagtac atctacctga acaagtacct gggcgacgtg 840
aagaacatca aagtgatcta cggcccagcc gccagactga ggccttctga tgtgcctgac 900
aagtactact ccttcaacta cgagggaatc gcccggaacc tgtcctgcag agagcctaac 960
cagcacttca agccctacct gaagcacttt ctgcctaagc ggctgcactt cgccaagtct 1020
gacagaatcg agcccctgac cttctatctg gaccctcagt ggcagctggc cctgaatcct 1080
agcgagagaa agtactgtgg ctccggcttc cacggctccg acaacgtgtt ctctaatatg 1140
caggccctgt tcgtcggcta cggccctggc tttaaacacg gcatcgaggc cgacaccttc 1200
gagaacatcg aggtgtacaa tctgatgtgt gacctgctga atctgacccc tgctcctaac 1260
aacggcaccc acggatctct gaaccatctg ctgaagaatc ccgtgtacac ccctaagcac 1320
cccaaagagg ttcaccctct ggtccagtgt cctttcacca gaaatcctcg ggacaacctg 1380
ggctgctctt gcaacccttc tatcctgcct atcgaggact ttcagaccca gttcaacctg 1440
accgtggccg aggaaaagat catcaagcac gagacactgc cctacggcag acctagagtg 1500
ctgcagaaag agaacaccat ctgcctgctg tcccagcacc agttcatgtc cggctactcc 1560
caggacatcc tgatgcctct gtggacctcc tacaccgtgg accggaacga tagcttctcc 1620
accgaggact tcagcaactg cctgtaccag gatttcagaa tccctctgag ccccgtgcac 1680
aagtgcagct tctacaagaa caacaccaag gtgtcctacg gcttcctgtc tcctccacag 1740
ctgaacaaga actccagcgg catctactct gaggccctgc tgaccaccaa catcgtgccc 1800
atgtaccagt ccttccaagt gatctggcgg tacttccacg acaccctgct gaggaagtac 1860
gccgaagaaa gaaacggcgt gaacgtggtg tctggccccg tgttcgactt cgactacgac 1920
ggcagatgcg actctctgga aaacctgcgg cagaaaagac acgtgatccg gaatcaagag 1980
atcctgattc ctacacactt ctttatcgtg ctgaccagct gcaaggatac ctctcagacc 2040
cctctgcact gcgagaatct ggacaccctg gccttcattc tgcctcacag aaccgacaac 2100
tccgagtcct gtgtgcacgg caagcacgac tcctcttggg tcgaagaact gctgatgctg 2160
caccgggcca gaatcaccga tgtggaacac atcaccggcc tgagcttcta ccagcagcgg 2220
aaagaacctg tgtccgatat cctgaagctg aaaacccatc tgccaacctt cagccaagag 2280
gacctgatca acgacaagac ccacacctgt cctccatgtc ctgctccaga actgctcgga 2340
ggcccctctg tgttcctgtt tccacctaag ccaaaggaca cactgtacat cactcgggag 2400
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tctcacgaag atcccgaagt caagttcaat 2460
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 2520
aactccacct acagagtggt gtccgtgctg actgtgctgc accaggattg gctgaacggc 2580
aaagagtaca agtgcaaagt gtccaacaag gctctgcccg ctcctatcga aaagaccatc 2640
tccaaggcta agggccagcc tcgggaacct caggtttaca ccctgcctcc atctcgggaa 2700
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtca agggcttcta cccttccgat 2760
atcgccgtgg aatgggagtc caatggccag cctgagaaca actacaagac aacccctcct 2820
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactctaagc tgacagtgga caagtcccgg 2880
tggcagcaag gcaatgtgtt ttcctgctct gtgatgcacg aggccctcca caatcactac 2940
acccagaagt ccctgtctct gtcccctggc aaatgatagc tcgag 2985
<210> 16
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (23)..(23)
<223> /replace=" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> /replace=" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(24)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 17
Met Thr Ser Lys Phe Leu Leu Val Ser Phe Ile Leu Ala Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln
20
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ala Pro Gly Ala Gly Ala
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Met Arg Gly Pro Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ala Pro Gly Ala
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Ile Ile Ser Leu Phe Thr Phe Ala Val Gly Val Asn Ile Cys Leu Gly
1 5 10 15
Phe Thr Ala
<210> 21
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 21
Gly Ala
1
<210> 22
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 22
Gly Ser
1
<210> 23
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 23
Gly Gly
1
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 24
Gly Gly Ala
1
<210> 25
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 25
Gly Gly Ser
1
<210> 26
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 26
Gly Gly Gly
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 27
Gly Gly Gly Ala
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 28
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 29
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 33
Gly Gly Ala Gly
1
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 34
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 35
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 35
Ala Gly Gly Gly
1
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 36
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 37
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 38
Gly Ala Gly Ala
1
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 39
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 40
Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 41
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 42
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 43
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 44
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 45
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 46
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 47
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 48
Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 49
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 50
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 51
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 52
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 53
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 54
Gly Gly Ala Gly
1
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 55
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 56
Gly Gly Ala Gly
1
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 57
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 58
Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 59
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 60
Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 61
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 66
Gly Gly Gly Ala Gly
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 67
Gly Gly Gly Ala Gly Gly
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 68
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
1 5
<210> 69
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 69
Leu Ile Asn
1
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 70
Thr Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 71
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 71
Ala Ala Ala Leu
1
<210> 72
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 72
Ala Ala Ala Lys
1
<210> 73
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 73
Ala Ala Ala Arg
1
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 74
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 75
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 76
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 77
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 77
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 78
Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 79
Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser
1 5
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 80
Arg Ser Ile Ala Thr
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 81
Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
1 5 10 15
His
<210> 82
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 82
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Thr Gly Ser Gly
35
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 83
Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ile Asp Leu Ile Ser Val Pro Val Asp Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 84
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 84
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 85
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 86
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 87
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 87
Asn Ser Ser
1
<210> 88
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 88
Glu Ser Ser
1
<210> 89
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 89
Arg Gln Gln
1
<210> 90
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 90
Lys Arg
1
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> /note="This sequence may encompass 0-15 residues"
<400> 91
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 92
Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Phe Leu Arg Arg Ile Gly Arg Phe Gly
1 5 10 15
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 93
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Arg Gly Asp Thr
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 94
Ala Pro Trp His Leu Ser Ser Gln Tyr Ser Arg Thr
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 95
Ser Thr Leu Pro Ile Pro His Glu Phe Ser Arg Glu
1 5 10
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 96
Val Thr Lys His Leu Asn Gln Ile Ser Gln Ser Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> /note="This sequence may encompass 1-15 residues"
<400> 97
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 98
Arg Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> /note="This sequence may encompass 1-15 residues"
<400> 99
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 100
Leu Val Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 101
Val Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10 15
<210> 102
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 102
Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 103
Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 104
Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 105
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 106
Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 107
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 108
Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 109
Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5
<210> 110
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 110
Gly Leu Gly Leu Arg Lys
1 5
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 111
Leu Gly Leu Arg Lys
1 5
<210> 112
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 112
Gly Leu Arg Lys
1
<210> 113
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 113
Leu Arg Lys
1
<210> 114
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 114
Arg Lys
1
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> /note="This sequence may encompass 1-15 residues"
<400> 115
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 116
<211> 875
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Met Glu Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Glu Gln Pro Val Lys Lys Asn
1 5 10 15
Thr Leu Lys Lys Tyr Lys Ile Ala Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Val Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu
35 40 45
Glu Lys Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Asn Cys Arg Cys Asp Val Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp
65 70 75 80
Cys Cys Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Val Glu Ser Thr Arg Ile Trp
85 90 95
Met Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Arg Lys Asp Cys Cys Ala Asp
115 120 125
Tyr Lys Ser Val Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys
130 135 140
Asp Thr Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro
145 150 155 160
Val Ile Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr
165 170 175
Trp Asp Thr Leu Met Pro Asn Ile Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly Ile
180 185 190
His Ser Lys Tyr Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn
195 200 205
His Tyr Thr Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile
210 215 220
Asp Asn Asn Met Tyr Asp Val Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser
225 230 235 240
Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp
245 250 255
Leu Thr Ala Met Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro
260 265 270
Gly Ser Glu Val Ala Ile Asn Gly Ser Phe Pro Ser Ile Tyr Met Pro
275 280 285
Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Ser Thr Leu Leu Lys
290 295 300
Trp Leu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr
305 310 315 320
Phe Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Val Ser Ala
325 330 335
Arg Val Ile Lys Ala Leu Gln Val Val Asp His Ala Phe Gly Met Leu
340 345 350
Met Glu Gly Leu Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Val Asn Ile Ile
355 360 365
Leu Leu Ala Asp His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu
370 375 380
Tyr Met Thr Asp Tyr Phe Pro Arg Ile Asn Phe Phe Tyr Met Tyr Glu
385 390 395 400
Gly Pro Ala Pro Arg Ile Arg Ala His Asn Ile Pro His Asp Phe Phe
405 410 415
Ser Phe Asn Ser Glu Glu Ile Val Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys Pro
420 425 430
Asp Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Thr Pro Asp Leu Pro Lys Arg Leu
435 440 445
His Tyr Ala Lys Asn Val Arg Ile Asp Lys Val His Leu Phe Val Asp
450 455 460
Gln Gln Trp Leu Ala Val Arg Ser Lys Ser Asn Thr Asn Cys Gly Gly
465 470 475 480
Gly Asn His Gly Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala Ile Phe
485 490 495
Leu Ala His Gly Pro Ser Phe Lys Glu Lys Thr Glu Val Glu Pro Phe
500 505 510
Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Arg Ile Gln
515 520 525
Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys
530 535 540
Val Pro Phe Tyr Glu Pro Ser His Ala Glu Glu Val Ser Lys Phe Ser
545 550 555 560
Val Cys Gly Phe Ala Asn Pro Leu Pro Thr Glu Ser Leu Asp Cys Phe
565 570 575
Cys Pro His Leu Gln Asn Ser Thr Gln Leu Glu Gln Val Asn Gln Met
580 585 590
Leu Asn Leu Thr Gln Glu Glu Ile Thr Ala Thr Val Lys Val Asn Leu
595 600 605
Pro Phe Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Asn Val Asp His Cys Leu
610 615 620
Leu Tyr His Arg Glu Tyr Val Ser Gly Phe Gly Lys Ala Met Arg Met
625 630 635 640
Pro Met Trp Ser Ser Tyr Thr Val Pro Gln Leu Gly Asp Thr Ser Pro
645 650 655
Leu Pro Pro Thr Val Pro Asp Cys Leu Arg Ala Asp Val Arg Val Pro
660 665 670
Pro Ser Glu Ser Gln Lys Cys Ser Phe Tyr Leu Ala Asp Lys Asn Ile
675 680 685
Thr His Gly Phe Leu Tyr Pro Pro Ala Ser Asn Arg Thr Ser Asp Ser
690 695 700
Gln Tyr Asp Ala Leu Ile Thr Ser Asn Leu Val Pro Met Tyr Glu Glu
705 710 715 720
Phe Arg Lys Met Trp Asp Tyr Phe His Ser Val Leu Leu Ile Lys His
725 730 735
Ala Thr Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Ile Phe Asp
740 745 750
Tyr Asn Tyr Asp Gly His Phe Asp Ala Pro Asp Glu Ile Thr Lys His
755 760 765
Leu Ala Asn Thr Asp Val Pro Ile Pro Thr His Tyr Phe Val Val Leu
770 775 780
Thr Ser Cys Lys Asn Lys Ser His Thr Pro Glu Asn Cys Pro Gly Trp
785 790 795 800
Leu Asp Val Leu Pro Phe Ile Ile Pro His Arg Pro Thr Asn Val Glu
805 810 815
Ser Cys Pro Glu Gly Lys Pro Glu Ala Leu Trp Val Glu Glu Arg Phe
820 825 830
Thr Ala His Ile Ala Arg Val Arg Asp Val Glu Leu Leu Thr Gly Leu
835 840 845
Asp Phe Tyr Gln Asp Lys Val Gln Pro Val Ser Glu Ile Leu Gln Leu
850 855 860
Lys Thr Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Thr Thr Ile
865 870 875
<210> 117
<211> 1057
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 117
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20 25 30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35 40 45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50 55 60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85 90 95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100 105 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115 120 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130 135 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195 200 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210 215 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245 250 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260 265 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275 280 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Asn Met Val Gly Met
290 295 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305 310 315 320
Ile Leu Val Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325 330 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340 345 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355 360 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370 375 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385 390 395 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405 410 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420 425 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Ile Phe Ser Asn Met Gln Ala
435 440 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Val Asp
450 455 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485 490 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500 505 510
Leu Ile Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530 535 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Asn Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565 570 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580 585 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595 600 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610 615 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625 630 635 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645 650 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660 665 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675 680 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690 695 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705 710 715 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725 730 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740 745 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755 760 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770 775 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785 790 795 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805 810 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn Asp Lys
820 825 830
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
835 840 845
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
850 855 860
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
865 870 875 880
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
885 890 895
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
900 905 910
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
915 920 925
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
930 935 940
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
945 950 955 960
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
965 970 975
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
980 985 990
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
995 1000 1005
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
1010 1015 1020
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
1025 1030 1035
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1040 1045 1050
Ser Pro Gly Lys
1055
<210> 118
<211> 1057
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 118
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20 25 30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35 40 45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50 55 60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85 90 95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100 105 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115 120 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130 135 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195 200 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210 215 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245 250 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260 265 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275 280 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290 295 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305 310 315 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325 330 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340 345 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355 360 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370 375 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385 390 395 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405 410 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420 425 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435 440 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450 455 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485 490 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500 505 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530 535 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Lys Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565 570 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580 585 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595 600 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Ser Leu Ser Pro
610 615 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625 630 635 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645 650 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660 665 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675 680 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690 695 700
Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu Ile Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705 710 715 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725 730 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Ala Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740 745 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755 760 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Glu Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770 775 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785 790 795 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805 810 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn Asp Lys
820 825 830
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
835 840 845
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
850 855 860
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
865 870 875 880
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
885 890 895
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
900 905 910
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
915 920 925
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
930 935 940
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
945 950 955 960
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
965 970 975
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
980 985 990
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
995 1000 1005
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
1010 1015 1020
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
1025 1030 1035
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1040 1045 1050
Ser Pro Gly Lys
1055
<210> 119
<211> 1059
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 119
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20 25 30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35 40 45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50 55 60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85 90 95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100 105 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115 120 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130 135 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195 200 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210 215 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245 250 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260 265 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275 280 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290 295 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305 310 315 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325 330 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340 345 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355 360 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370 375 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385 390 395 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405 410 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420 425 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435 440 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450 455 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485 490 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500 505 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530 535 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565 570 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580 585 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595 600 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610 615 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625 630 635 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645 650 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660 665 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675 680 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690 695 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705 710 715 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725 730 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740 745 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755 760 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770 775 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785 790 795 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805 810 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser
820 825 830
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
835 840 845
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
850 855 860
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
865 870 875 880
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
885 890 895
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
900 905 910
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
915 920 925
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
930 935 940
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
945 950 955 960
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
965 970 975
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
980 985 990
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
995 1000 1005
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
1010 1015 1020
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1025 1030 1035
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
1040 1045 1050
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1055
<210> 120
<211> 1059
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 120
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20 25 30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35 40 45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50 55 60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85 90 95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100 105 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115 120 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130 135 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180 185 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195 200 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210 215 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Thr Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225 230 235 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245 250 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260 265 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275 280 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290 295 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305 310 315 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325 330 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340 345 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355 360 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370 375 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385 390 395 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405 410 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420 425 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435 440 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450 455 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465 470 475 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485 490 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500 505 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530 535 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565 570 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580 585 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595 600 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610 615 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625 630 635 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645 650 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660 665 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675 680 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690 695 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705 710 715 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725 730 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740 745 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755 760 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770 775 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785 790 795 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805 810 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser
820 825 830
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
835 840 845
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
850 855 860
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
865 870 875 880
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
885 890 895
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
900 905 910
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
915 920 925
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
930 935 940
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
945 950 955 960
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
965 970 975
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
980 985 990
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
995 1000 1005
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
1010 1015 1020
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1025 1030 1035
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
1040 1045 1050
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1055
<210> 121
<211> 968
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 121
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Thr Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
740 745 750
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
755 760 765
Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val
770 775 780
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
785 790 795 800
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
805 810 815
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
820 825 830
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
835 840 845
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
850 855 860
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
865 870 875 880
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
885 890 895
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
900 905 910
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
915 920 925
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
930 935 940
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
945 950 955 960
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
965
<210> 122
<211> 966
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 122
Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala
1 5 10 15
Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg
20 25 30
Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys
35 40 45
Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro
50 55 60
Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn
85 90 95
Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe
130 135 140
Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro
165 170 175
His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser
180 185 190
Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp
195 200 205
Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His
210 215 220
Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly
225 230 235 240
Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys
245 250 255
Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp
260 265 270
Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His
290 295 300
Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser
325 330 335
Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe
340 345 350
Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His
355 360 365
Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met
370 375 380
Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly
385 390 395 400
Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro
405 410 415
Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg
420 425 430
Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp
435 440 445
Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys
450 455 460
His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn
465 470 475 480
Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln
485 490 495
Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp
500 505 510
Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg
515 520 525
Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr
530 535 540
Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser
545 550 555 560
Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met
565 570 575
Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu
580 585 590
Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro
595 600 605
Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu
610 615 620
Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr
625 630 635 640
His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro
645 650 655
Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg
660 665 670
Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp
675 680 685
Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu
690 695 700
His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser
705 710 715 720
Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
725 730 735
Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
740 745 750
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
755 760 765
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
770 775 780
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
785 790 795 800
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
805 810 815
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
820 825 830
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
835 840 845
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
850 855 860
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
865 870 875 880
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
885 890 895
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
900 905 910
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
915 920 925
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
930 935 940
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
945 950 955 960
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
965
<210> 123
<211> 1076
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 123
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg
20 25 30
Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val
35 40 45
Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro
50 55 60
Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu
65 70 75 80
Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp
85 90 95
Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val
100 105 110
Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe
115 120 125
Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu
130 135 140
Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys
145 150 155 160
Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys
165 170 175
Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser
180 185 190
His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser
195 200 205
Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly
210 215 220
Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr
225 230 235 240
Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp
245 250 255
Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu
260 265 270
Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe
275 280 285
Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly
290 295 300
Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Asn Met
305 310 315 320
Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys
325 330 335
Leu Asn Leu Ile Leu Val Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys
340 345 350
Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile
355 360 365
Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro
370 375 380
Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser
385 390 395 400
Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu
405 410 415
Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr
420 425 430
Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg
435 440 445
Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Ile Phe Ser Asn
450 455 460
Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile
465 470 475 480
Glu Val Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp
485 490 495
Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu
500 505 510
Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu
515 520 525
Val His Pro Leu Ile Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn
530 535 540
Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln
545 550 555 560
Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Asn Ile Lys His Glu
565 570 575
Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile
580 585 590
Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile
595 600 605
Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe
610 615 620
Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro
625 630 635 640
Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val
645 650 655
Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly
660 665 670
Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln
675 680 685
Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys
690 695 700
Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe
705 710 715 720
Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln
725 730 735
Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe
740 745 750
Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His
755 760 765
Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp
770 775 780
Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu
785 790 795 800
Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile
805 810 815
Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile
820 825 830
Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile
835 840 845
Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
850 855 860
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
865 870 875 880
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
885 890 895
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
900 905 910
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
915 920 925
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
930 935 940
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
945 950 955 960
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
965 970 975
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
980 985 990
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
995 1000 1005
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
1010 1015 1020
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
1025 1030 1035
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
1040 1045 1050
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
1055 1060 1065
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1070 1075
<210> 124
<211> 1076
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 124
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg
20 25 30
Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val
35 40 45
Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro
50 55 60
Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu
65 70 75 80
Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp
85 90 95
Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val
100 105 110
Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe
115 120 125
Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu
130 135 140
Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys
145 150 155 160
Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys
165 170 175
Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser
180 185 190
His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser
195 200 205
Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly
210 215 220
Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr
225 230 235 240
Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp
245 250 255
Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu
260 265 270
Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe
275 280 285
Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly
290 295 300
Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met
305 310 315 320
Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys
325 330 335
Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys
340 345 350
Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile
355 360 365
Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro
370 375 380
Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser
385 390 395 400
Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu
405 410 415
Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr
420 425 430
Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg
435 440 445
Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn
450 455 460
Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile
465 470 475 480
Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp
485 490 495
Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu
500 505 510
Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu
515 520 525
Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn
530 535 540
Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln
545 550 555 560
Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu
565 570 575
Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Lys Asn Thr Ile
580 585 590
Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile
595 600 605
Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe
610 615 620
Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Ser
625 630 635 640
Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val
645 650 655
Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly
660 665 670
Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln
675 680 685
Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys
690 695 700
Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe
705 710 715 720
Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu Ile Leu Arg Gln
725 730 735
Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe
740 745 750
Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Ala Ser Gln Thr Pro Leu His
755 760 765
Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp
770 775 780
Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Glu Ser Ser Trp Val Glu
785 790 795 800
Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile
805 810 815
Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile
820 825 830
Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile
835 840 845
Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
850 855 860
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
865 870 875 880
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
885 890 895
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
900 905 910
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
915 920 925
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
930 935 940
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
945 950 955 960
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
965 970 975
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
980 985 990
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
995 1000 1005
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
1010 1015 1020
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
1025 1030 1035
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
1040 1045 1050
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
1055 1060 1065
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1070 1075
<210> 125
<211> 1078
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 125
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg
20 25 30
Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val
35 40 45
Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro
50 55 60
Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu
65 70 75 80
Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp
85 90 95
Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val
100 105 110
Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe
115 120 125
Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu
130 135 140
Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys
145 150 155 160
Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys
165 170 175
Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser
180 185 190
His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser
195 200 205
Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly
210 215 220
Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr
225 230 235 240
Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp
245 250 255
Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu
260 265 270
Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe
275 280 285
Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly
290 295 300
Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met
305 310 315 320
Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys
325 330 335
Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys
340 345 350
Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile
355 360 365
Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro
370 375 380
Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser
385 390 395 400
Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu
405 410 415
Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr
420 425 430
Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg
435 440 445
Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn
450 455 460
Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile
465 470 475 480
Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp
485 490 495
Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu
500 505 510
Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu
515 520 525
Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn
530 535 540
Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln
545 550 555 560
Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu
565 570 575
Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile
580 585 590
Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile
595 600 605
Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe
610 615 620
Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro
625 630 635 640
Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val
645 650 655
Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly
660 665 670
Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln
675 680 685
Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys
690 695 700
Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe
705 710 715 720
Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln
725 730 735
Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe
740 745 750
Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His
755 760 765
Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp
770 775 780
Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu
785 790 795 800
Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile
805 810 815
Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile
820 825 830
Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Gly Gly
835 840 845
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
850 855 860
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
865 870 875 880
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
885 890 895
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
900 905 910
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
915 920 925
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
930 935 940
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
945 950 955 960
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
965 970 975
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
980 985 990
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
995 1000 1005
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
1010 1015 1020
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
1025 1030 1035
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
1040 1045 1050
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
1055 1060 1065
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1070 1075
<210> 126
<211> 1078
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 126
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg
20 25 30
Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val
35 40 45
Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro
50 55 60
Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu
65 70 75 80
Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp
85 90 95
Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val
100 105 110
Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe
115 120 125
Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu
130 135 140
Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys
145 150 155 160
Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys
165 170 175
Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser
180 185 190
His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser
195 200 205
Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly
210 215 220
Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr
225 230 235 240
Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Thr Phe Pro Asp
245 250 255
Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu
260 265 270
Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe
275 280 285
Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly
290 295 300
Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met
305 310 315 320
Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys
325 330 335
Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys
340 345 350
Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile
355 360 365
Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro
370 375 380
Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser
385 390 395 400
Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu
405 410 415
Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr
420 425 430
Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg
435 440 445
Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn
450 455 460
Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile
465 470 475 480
Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp
485 490 495
Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu
500 505 510
Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu
515 520 525
Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn
530 535 540
Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln
545 550 555 560
Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu
565 570 575
Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile
580 585 590
Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile
595 600 605
Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe
610 615 620
Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro
625 630 635 640
Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val
645 650 655
Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly
660 665 670
Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln
675 680 685
Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys
690 695 700
Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe
705 710 715 720
Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln
725 730 735
Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe
740 745 750
Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His
755 760 765
Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp
770 775 780
Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu
785 790 795 800
Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile
805 810 815
Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile
820 825 830
Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Gly Gly
835 840 845
Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
850 855 860
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
865 870 875 880
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
885 890 895
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
900 905 910
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
915 920 925
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
930 935 940
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
945 950 955 960
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
965 970 975
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
980 985 990
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
995 1000 1005
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
1010 1015 1020
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
1025 1030 1035
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
1040 1045 1050
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
1055 1060 1065
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1070 1075
<210> 127
<211> 989
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 127
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu
20 25 30
Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser
35 40 45
Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met
65 70 75 80
Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val
85 90 95
Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr
100 105 110
Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe
115 120 125
Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr
130 135 140
Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu
145 150 155 160
Ile Asn Gly Thr Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val
165 170 175
Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro
180 185 190
Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp
195 200 205
Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala
210 215 220
Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys
225 230 235 240
Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His
245 250 255
Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr
260 265 270
Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg
275 280 285
Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu
290 295 300
Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys
305 310 315 320
Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu
340 345 350
Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly
355 360 365
Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly
370 375 380
Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu
385 390 395 400
Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn
405 410 415
Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr
420 425 430
Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe
435 440 445
Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile
450 455 460
Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu
465 470 475 480
Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val
485 490 495
Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met
500 505 510
Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr
515 520 525
Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu
530 535 540
Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln
565 570 575
Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr
580 585 590
Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe
595 600 605
His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn
610 615 620
Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp
625 630 635 640
Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu
645 650 655
Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp
660 665 670
Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe
675 680 685
Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys
690 695 700
His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg
705 710 715 720
Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg
725 730 735
Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr
740 745 750
Phe Ser Gln Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
755 760 765
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
770 775 780
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu
785 790 795 800
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
805 810 815
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
820 825 830
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
835 840 845
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
850 855 860
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
865 870 875 880
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
885 890 895
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
900 905 910
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
915 920 925
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
930 935 940
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
945 950 955 960
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
965 970 975
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 128
<211> 987
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 128
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu
20 25 30
Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser
35 40 45
Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met
65 70 75 80
Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val
85 90 95
Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr
100 105 110
Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe
115 120 125
Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr
130 135 140
Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu
145 150 155 160
Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val
165 170 175
Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro
180 185 190
Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp
195 200 205
Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala
210 215 220
Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys
225 230 235 240
Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His
245 250 255
Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr
260 265 270
Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg
275 280 285
Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu
290 295 300
Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys
305 310 315 320
Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu
340 345 350
Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly
355 360 365
Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly
370 375 380
Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu
385 390 395 400
Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn
405 410 415
Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr
420 425 430
Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe
435 440 445
Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile
450 455 460
Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu
465 470 475 480
Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val
485 490 495
Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met
500 505 510
Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr
515 520 525
Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu
530 535 540
Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln
565 570 575
Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr
580 585 590
Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe
595 600 605
His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn
610 615 620
Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp
625 630 635 640
Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu
645 650 655
Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp
660 665 670
Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe
675 680 685
Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys
690 695 700
His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg
705 710 715 720
Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg
725 730 735
Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr
740 745 750
Phe Ser Gln Glu Asp Leu Ile Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
755 760 765
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
770 775 780
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
785 790 795 800
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
805 810 815
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
820 825 830
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
835 840 845
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
850 855 860
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
865 870 875 880
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
885 890 895
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
900 905 910
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
915 920 925
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
930 935 940
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
945 950 955 960
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
965 970 975
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 129
<211> 19
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
N-terminal leader sequence"
<400> 129
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 130
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag"
<400> 130
His His His His His His
1 5
<210> 131
<211> 10
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
Kozak sequence"
<400> 131
gccaccatgg 10
<210> 132
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Trp Val Glu Glu Pro Cys
1 5
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 133
Ser Arg Ala Lys Ser
1 5
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /note="This sequence may encompass 1-5 'Xaa Pro'
repeating units"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 134
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5 10
Claims (112)
- ENPP1의 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드로서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여된, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한 가용성 ENPP1 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 ENPP1의 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여되어 있고, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 음으로 하전된 골-표적 도메인이 결여되어 있는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 감소된 동종이량체화 능력을 갖는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 상기 ENPP1 폴리펩티드의 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 동종이량체화를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소시키는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 감소된 친화도를 갖는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드로서, 상기 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질 분해 내성을 나타내는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- ENPP1의 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 폴리펩티드를 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한 가용성 ENPP1 폴리펩티드로서, 적어도 서열번호 1에 대해 위치 818에서의 아르기닌(R)은 또 다른 아미노산을 치환하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ENPP1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타내는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 또는 제12항에 있어서, 상기 ENPP1 폴리펩티드의 더 큰 단백질분해 내성은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 또는 300% 증가된 단백질 순도를 갖는 균질한 조성물을 제공하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 또는 제12항에 있어서, 상기 ENPP1 폴리펩티드의 더 큰 단백질분해 내성은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 단백질 절단을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 또는 300%만큼 감소시키는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 트립신 및 트립신-유사 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 치환은 서열번호 1에 대해 위치 818에 있는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 818에서의 아르기닌(R)은 히스티딘(H)으로 치환되는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 어느 하나에서 아미노산은 히스티딘(H)으로 치환되는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드: K816R, K816H, R817H, R817K, R818H, 또는 R818K.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ENPP1 폴리펩티드는 ENPP1의 포스포디에스테라제 촉매 도메인을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ENPP1 폴리펩티드는 SMB 도메인 1 및 2 중 하나 또는 모두 결여되어 있는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 95% 동일한, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 99% 동일한, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 가용성 ENPP1 폴리펩티드 도메인 및 적어도 하나의 이종 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질인, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 단백질 부분은 Fc 도메인을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제28항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제28항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 M252Y, S254T, 및 T256E 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제28항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고: M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I, 및 V308F, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제28항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 야생형 IgG 불변 도메인보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 ENPP1-Fc 융합 단백질인, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제33항에 있어서, 상기 ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제33항에 있어서, 상기 ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 11과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제33항에 있어서, 상기 ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 12과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제33항에 있어서, 상기 ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 121과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제33항에 있어서, 상기 ENPP1-Fc 융합 단백질은 서열번호 122과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드는 이종 모이어티를 더 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제39항에 있어서, 상기 이종 모이어티는 글리코실화된 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 및 지질 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에 대한 아미노산 잔기 332는 I332T 치환을 포함하는, 가용성 ENPP1 폴리펩티드.
- ENPP3의 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 90% 동일한 가용성 ENPP3 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 ENPP3의 SMB 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 감소된 동종이량체화 능력을 갖는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 상기 ENPP3 폴리펩티드의 동종이량체화를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 동종이량체화를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소시키는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 감소된 친화도를 갖는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ENPP3 폴리펩티드는 ENPP3의 포스포디에스테라제 촉매 도메인을 포함하는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ENPP3 폴리펩티드는 SMB 도메인 1 및 2 중 하나 또는 모두 결여되어 있는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875와 적어도 90% 동일한, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875와 적어도 95% 동일한, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875와 적어도 99% 동일한, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 116의 아미노산 136-875를 포함하는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 가용성 ENPP3 폴리펩티드 도메인 및 적어도 하나의 이종 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질인, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제54항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 이종 단백질 부분은 Fc 도메인을 포함하는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제56항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제57항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 M252Y, S254T, 및 T256E 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제57항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고: M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I, 및 V308F, 여기서 아미노산 잔기는 Kabat에서와 같이 EU 지수에 따라 넘버링되는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제57항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 야생형 IgG 불변 도메인보다 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 ENPP3-Fc 융합 단백질인, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드는 이종 모이어티를 추가로 포함하는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 제62항에 있어서, 상기 이종 모이어티는 글리코실화된 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 및 지질 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 가용성 ENPP3 폴리펩티드.
- 융합 단백질로서, (a) 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2 모두 결여된 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분으로서, 음으로 하전된 골-표적화 도메인이 결여된, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드 및 (b) 이종 단백질 부분을 포함하는, 융합 단백질.
- 융합 단백질로서, (a) 소마토메딘 B(SMB) 도메인 1 및 SMB 도메인 2가 모두 결여된 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분 및 (b) 이종 단백질 부분을 포함하는, 융합 단백질.
- 융합 단백질로서, (a) 서열번호 1에 대해 위치 816, 817 또는 818 중 적어도 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분으로서, 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드보다 프로테아제에 대한 더 큰 단백질분해 내성을 나타내는, 상기 ENPP1 폴리펩티드 및 (b) 이종 단백질 부분을 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 9과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항 또는 제66항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 11과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항 또는 제66항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항 및 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항 및 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항 및 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드 부분은 서열번호 1의 아미노산 190 내지 925를 포함하는, 융합 단백질.
- 제65항에 있어서, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제65항에 있어서, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제65항에 있어서, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제65항에 있어서, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드 부분은 서열번호 116의 아미노산 136 내지 875를 포함하는, 융합 단백질.
- 제64항 및 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP1 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키는, 융합 단백질.
- 제65항에 있어서, 상기 이종 단백질 부분은 상응하는 야생형 가용성 ENPP3 폴리펩티드와 비교하여 포유동물에서 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키는, 융합 단백질.
- 제64항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질 부분은 Fc 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
- 제79항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- (a) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 및/또는 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질; 및 (b) 이종 모이어티를 포함하는, 접합체.
- 제81항에 있어서, 상기 이종 모이어티는 글리코실화된 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 및 지질 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
- (a) 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 및/또는 제81항 또는 제82항에 따른 접합체, 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
- 대상체에서 이소성 석회화를 감소, 역전, 및/또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제81항 또는 제82항에 따른 접합체, 및/또는 제83항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하여, 대상체에서 이소성 석회화를 감소, 역전, 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제84항에 있어서, 상기 이소성 석회화는 연조직 석회화, 동맥 석회화, 및 혈관 석회화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제84항 또는 제85항에 있어서, 대상체는 만성 신장 질환(CKD), 말기 신장 질환(ESRD), 석회화 요독 동맥병증(CUA), 칼시필락시스(calciphylaxis), 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 상염색체 열성 저인산혈성 구루병 2형(ARHR2), 골관절염, 노화 관련 동맥 경화, 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 영아기의 전신성 동맥 석회화(GACI), 및 죽상동맥경화성 플라크의 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 가지고 있는, 방법.
- 제85항에 있어서, 상기 연조직은 죽상동맥경화성 플라크, 근육 동맥, 관절, 척추, 관절 연골, 척추 디스크 연골, 혈관 및 결합 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제84항에 있어서, 대상체는 ENPP1 결핍인, 방법.
- 제84항에 있어서, 대상체는 ENPP3 결핍인, 방법.
- 제84항에 있어서, 대상체는 탄성섬유 가황색종(PXE)을 갖는, 방법.
- 제84항에 있어서, 대상체는 ABCC6 유전자에서 병원성 돌연변이를 갖는, 방법.
- ENPP1 결핍 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은: 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제81항 또는 제82항에 따른 접합체, 및/또는 제83항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
- ENPP3 결핍 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은: 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제81항 또는 제82항에 따른 접합체, 및/또는 제83항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 대상체는 만성 신장 질환(CKD), 말기 신장 질환(ESRD), 석회화 요독 동맥병증(CUA), 칼시필락시스(calciphylaxis), 후종 인대 골화증(OPLL), 저인산혈성 구루병, 상염색체 열성 저인산혈성 구루병 2형(ARHR2), 골관절염, 노화 관련 동맥 경화, 특발성 영아 동맥 석회화(IIAC), 영아기의 전신성 동맥 석회화(GACI), 및 죽상동맥경화성 플라크의 석회화로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 가지고 있는, 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 대상체는 이소성 석회화를 갖는, 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 이소성 석회화는 연조직 석회화, 동맥 석회화, 및 혈관 석회화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 대상체는 병리학적 골화를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 가용성 ENPP1 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제98항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 또는 15 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항의 가용성 ENPP3 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
- 제101항의 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
- 제102항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, 세포.
- 제103항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포 또는 인간 세포인, 세포.
- 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
a) 가용성 ENPP1 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 제101항의 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환되는, 단계; 및
b) 이렇게 발현된 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 방법. - 제105항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제로 제형화하여 약학적 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
a) 가용성 ENPP3 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 제101항의 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환되는, 단계; 및
b) 이렇게 발현된 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 방법. - 제107항에 있어서, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제로 제형화하여 약학적 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제84항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 및/또는 상기 융합 단백질은 상기 가용성 ENPP1 폴리펩티드, 상기 가용성 ENPP3 폴리펩티드, 및/또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 의해 상기 대상체에게 전달되는, 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
- 제110항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 벡터인, 방법.
- 제110항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV8 벡터인, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063036833P | 2020-06-09 | 2020-06-09 | |
| US63/036,833 | 2020-06-09 | ||
| PCT/US2021/036494 WO2021252549A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-06-08 | Soluble enpp1 or enpp3 proteins and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230042263A true KR20230042263A (ko) | 2023-03-28 |
Family
ID=76731053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237000507A KR20230042263A (ko) | 2020-06-09 | 2021-06-08 | 가용성 enpp1 또는 enpp3 단백질 및 이의 사용 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230313158A1 (ko) |
| EP (1) | EP4162036A1 (ko) |
| JP (1) | JP2023529892A (ko) |
| KR (1) | KR20230042263A (ko) |
| CN (1) | CN116157145A (ko) |
| AR (1) | AR122578A1 (ko) |
| AU (1) | AU2021286502A1 (ko) |
| BR (1) | BR112022024958A2 (ko) |
| CA (1) | CA3181983A1 (ko) |
| CO (1) | CO2023000016A2 (ko) |
| IL (1) | IL298853A (ko) |
| MX (1) | MX2022015772A (ko) |
| TW (1) | TW202214849A (ko) |
| WO (1) | WO2021252549A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023191898A1 (en) * | 2022-03-30 | 2023-10-05 | Yale University | Method and compositions for treatment, amelioration, and/or prevention of diffuse idiopathic skeletal hyperostosis (dish) |
Family Cites Families (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| US5198346A (en) | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
| US5096815A (en) | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
| US5007790A (en) | 1989-04-11 | 1991-04-16 | Depomed Systems, Inc. | Sustained-release oral drug dosage form |
| GB8918616D0 (en) | 1989-08-15 | 1989-09-27 | Univ Glasgow | Herpes simplex virus type 1 mutant |
| US20020164782A1 (en) | 1999-02-10 | 2002-11-07 | Gregory Richard J. | Adenovirus vectors for gene therapy |
| AU668386B2 (en) | 1992-03-25 | 1996-05-02 | Depomed Systems, Incorporated | Alkyl-substituted cellulose-based sustained-release oral drug dosage forms |
| US5582837A (en) | 1992-03-25 | 1996-12-10 | Depomed, Inc. | Alkyl-substituted cellulose-based sustained-release oral drug dosage forms |
| US5804413A (en) | 1992-07-31 | 1998-09-08 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Herpes simplex virus strains for gene transfer |
| GB9415319D0 (en) | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Medical Res Council | HSV viral vector |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| WO1997047285A1 (en) | 1996-06-10 | 1997-12-18 | Depomed, Inc. | Gastric-retentive oral controlled drug delivery system with enhanced retention properties |
| US5972389A (en) | 1996-09-19 | 1999-10-26 | Depomed, Inc. | Gastric-retentive, oral drug dosage forms for the controlled-release of sparingly soluble drugs and insoluble matter |
| PT998271E (pt) | 1997-06-06 | 2005-10-31 | Depomed Inc | Formas de dosagem oral de farmacos com retencao gastrica para a libertacao controlada de farmacos altamente soluveis |
| US6635280B2 (en) | 1997-06-06 | 2003-10-21 | Depomed, Inc. | Extending the duration of drug release within the stomach during the fed mode |
| AU8605598A (en) | 1997-07-31 | 1999-02-22 | University Of Pittsburgh | Targeted hsv vectors |
| IL149421A0 (en) | 1999-11-02 | 2002-11-10 | Depomed Inc | Pharmaceutical compositions containing fed mode inducing agents |
| AU767812B2 (en) | 2000-02-04 | 2003-11-27 | Depomed, Inc. | Shell-and-core dosage form approaching zero-order drug release |
| US6488962B1 (en) | 2000-06-20 | 2002-12-03 | Depomed, Inc. | Tablet shapes to enhance gastric retention of swellable controlled-release oral dosage forms |
| US6451808B1 (en) | 2000-10-17 | 2002-09-17 | Depomed, Inc. | Inhibition of emetic effect of metformin with 5-HT3 receptor antagonists |
| KR20040020056A (ko) | 2001-05-29 | 2004-03-06 | 디포메드 디벨롭먼트 리미티드 | 위식도 역류 질환 및 야간 위산분비의 치료 방법 |
| TWI312285B (en) | 2001-10-25 | 2009-07-21 | Depomed Inc | Methods of treatment using a gastric retained gabapentin dosage |
| US6723340B2 (en) | 2001-10-25 | 2004-04-20 | Depomed, Inc. | Optimal polymer mixtures for gastric retentive tablets |
| EP1438027A1 (en) | 2001-10-25 | 2004-07-21 | DepoMed, Inc. | Methods of treatment using a gastric retained losartan dosage |
| CA2409552A1 (en) | 2001-10-25 | 2003-04-25 | Depomed, Inc. | Gastric retentive oral dosage form with restricted drug release in the lower gastrointestinal tract |
| US20030091630A1 (en) | 2001-10-25 | 2003-05-15 | Jenny Louie-Helm | Formulation of an erodible, gastric retentive oral dosage form using in vitro disintegration test data |
| US6682759B2 (en) | 2002-02-01 | 2004-01-27 | Depomed, Inc. | Manufacture of oral dosage forms delivering both immediate-release and sustained-release drugs |
| US20070207124A1 (en) | 2004-10-28 | 2007-09-06 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Peripherally delivered glutamic acid decarboxylase gene therapy for spinal cord injury pain |
| US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
| PL2097533T3 (pl) | 2006-11-28 | 2011-02-28 | Proyecto De Biomedicina Cima | Wektor wirusowy oraz jego zastosowania |
| ES2628841T3 (es) | 2010-03-12 | 2017-08-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Proteínas de fusión npp1 |
| AU2011362576B2 (en) | 2011-03-11 | 2017-06-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | NPP1 fusion proteins |
| JP6894664B2 (ja) | 2013-02-13 | 2021-06-30 | イエール ユニバーシティ | 病的な石灰化および骨化を治療するための組成物および方法 |
| ES2523016B1 (es) | 2013-05-20 | 2015-09-09 | 3P Biopharmaceuticals | Vectores alfavirales y líneas celulares para la producción de proteínas recombinantes |
| GB2526339A (en) | 2014-05-21 | 2015-11-25 | Imp Innovations Ltd | Lentiviral vectors |
| CA2960912A1 (en) | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Universitat Autonoma De Barcelona | Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases |
| EP3967755B1 (en) * | 2014-12-19 | 2024-03-27 | Inozyme Pharma, Inc. | Soluble npp1 for use in a method for treating pseudoxanthoma elasticum |
| JP6995627B2 (ja) | 2015-05-19 | 2022-02-04 | イエール ユニバーシティ | 病的石灰化状態を治療するための組成物およびそれを使用する方法 |
| EP3827835A1 (en) * | 2016-06-16 | 2021-06-02 | Inozyme Pharma, Inc. | Methods of treating myointimal proliferation |
| EP3493829B1 (en) | 2016-08-05 | 2024-04-17 | Yale University | Compositions and methods for stroke prevention in pediatric sickle cell anemia patients |
| JP2020535161A (ja) * | 2017-09-27 | 2020-12-03 | アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 組換えエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ｎｐｐ１）を使用して心血管機能を改善し、心血管疾患を処置するための方法。 |
| CA3099266A1 (en) * | 2018-05-08 | 2019-11-14 | Yale University | Compositions and methods for reducing progression of nephrolithiasis |
| US20220119782A1 (en) | 2018-08-31 | 2022-04-21 | Yale University | ENPP1 Polypeptides and Methods of Using Same |
| JP2022527557A (ja) | 2019-04-05 | 2022-06-02 | イエール ユニバーシティ | Ｅｎｐｐ１ポリペプチドおよびその使用方法 |
-
2021
- 2021-06-08 EP EP21736850.5A patent/EP4162036A1/en active Pending
- 2021-06-08 CA CA3181983A patent/CA3181983A1/en active Pending
- 2021-06-08 KR KR1020237000507A patent/KR20230042263A/ko active Search and Examination
- 2021-06-08 AU AU2021286502A patent/AU2021286502A1/en active Pending
- 2021-06-08 IL IL298853A patent/IL298853A/en unknown
- 2021-06-08 BR BR112022024958A patent/BR112022024958A2/pt unknown
- 2021-06-08 WO PCT/US2021/036494 patent/WO2021252549A1/en unknown
- 2021-06-08 MX MX2022015772A patent/MX2022015772A/es unknown
- 2021-06-08 CN CN202180059006.4A patent/CN116157145A/zh active Pending
- 2021-06-08 JP JP2022575745A patent/JP2023529892A/ja active Pending
- 2021-06-09 TW TW110120998A patent/TW202214849A/zh unknown
- 2021-06-09 AR ARP210101571A patent/AR122578A1/es unknown
-
2022
- 2022-12-08 US US18/063,263 patent/US20230313158A1/en active Pending
-
2023
- 2023-01-03 CO CONC2023/0000016A patent/CO2023000016A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112022024958A2 (pt) | 2022-12-27 |
| CO2023000016A2 (es) | 2023-02-16 |
| JP2023529892A (ja) | 2023-07-12 |
| IL298853A (en) | 2023-02-01 |
| AU2021286502A1 (en) | 2023-01-19 |
| MX2022015772A (es) | 2023-05-19 |
| AR122578A1 (es) | 2022-09-21 |
| WO2021252549A1 (en) | 2021-12-16 |
| CN116157145A (zh) | 2023-05-23 |
| TW202214849A (zh) | 2022-04-16 |
| EP4162036A1 (en) | 2023-04-12 |
| US20230313158A1 (en) | 2023-10-05 |
| CA3181983A1 (en) | 2021-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2018204100A1 (en) | Methods for dosing an activin-ActRIIa antagonist and monitoring of treated patients | |
| US11807673B2 (en) | Methods and compositions for increasing red blood cells | |
| EP3212663B1 (en) | C1 esterase inhibitor fusion proteins and uses thereof | |
| US9045564B2 (en) | HSA-related compositions and methods of use | |
| JP2019010124A (ja) | Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用 | |
| WO2012112188A1 (en) | Hsa-related compositions and methods of use | |
| SG186875A1 (en) | Chimeric clotting factors | |
| US20230313158A1 (en) | Soluble enpp1 proteins and uses thereof | |
| CN112930397A (zh) | Enpp1多肽及其使用方法 | |
| KR20210149146A (ko) | Enpp1 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 | |
| EP4387647A2 (en) | Compositions and methods for treating renal diseases or conditions | |
| US20240181007A1 (en) | Compositions and methods for treating pulmonary hypertension | |
| JP2012511309A (ja) | Ｅｃ−ｓｏｄのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合蛋白質 | |
| KR20240049857A (ko) | Actrii 단백질 및 이의 용도 | |
| CA3208936A1 (en) | Retroviral vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |