JP2023529892A - 可溶性ｅｎｐｐ１又はｅｎｐｐ３タンパク質及びその使用 - Google Patents

可溶性ｅｎｐｐ１又はｅｎｐｐ３タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

特定の態様では、本発明は、新規の可溶性ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチド、並びにそれらのバリアントを使用して、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３欠損に関連する適応症を治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書に提供される組成物及び方法は、病理学的石灰化又は病理学的骨化などのＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３欠損に関連する疾患の治療において有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月９日出願の米国仮特許出願第６３／０３６，８３３号に対する優先権の利益を主張する。上述の出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
ヒトエクトヌクレオチドピロホスファターゼ（ＥＮＰＰ）タンパク質ファミリーは、ホスホジエステル結合を加水分解する７つの細胞外グリコシル化タンパク質（すなわち、ＥＮＰＰ１－ＥＮＰＰ７）を含む。ＥＮＰＰは、細胞表面酵素であるが、ＥＮＰＰ２は例外で、原形質膜に運び出されるが、フーリンによって切断され、細胞外液中に放出される。ＥＮＰＰ酵素は、高度な配列及び構造相同性を有するが、ヌクレオチドから脂質までを包含する多様な基質特異性を呈する。
ＥＮＰＰ１（ＰＣ－１としても知られる）及びＥＮＰＰ３は、骨芽細胞及び軟骨細胞の鉱質沈着基質小胞上に位置する２型細胞外膜結合糖タンパク質であり、細胞外ヌクレオチド（主にＡＴＰ）をアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）に加水分解する。ＰＰｉは、新生ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶に結合することによって異所性組織石灰化の強力な阻害剤として機能し、それによって、これらの結晶の将来の成長を防止する。ＥＮＰＰ１が、ヌクレオチド三リン酸の加水分解（ＮＴＰ）を介してＰＰｉを生成し、進行性強直タンパク質（ＡＮＫ）が、細胞内ＰＰｉを細胞外空間に輸送し、組織非特異性アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）が、ＰｉへのＰＰｉの直接加水分解を介してＰＰｉを除去する。
異所性組織石灰化は、慢性関節疾患及び急性致死性新生児症候群を含む、多数のヒト疾患と関連している。望ましくない組織石灰化を防止するために、組織石灰化を促進及び阻害する因子は、緊密なバランスに保たれなければならない。細胞外無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びリン酸（Ｐｉ）のバランスは、異所性組織石灰化の重要な調節因子である。３つの細胞外酵素、ＴＮＡＰ、ＡＮＫ、及びＥＮＰＰ１の活性は、それぞれ、１～３ｍＭ及び２～３ｐＭの哺乳動物におけるＰｉ及びＰＰｉの濃度を厳密に制御する。ＰＰｉは、非結晶性リン酸カルシウムから塩基性リン酸カルシウムの形成を阻害する、生体石灰化の調節因子である。
発明の概要
本開示は、大部分の抗薬物抗体が、ＥＮＰＰ１のソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメインに結合した融合タンパク質を含有するＥＮＰＰ１に対して、哺乳動物によって生成されるという発見に少なくとも部分的に基づく。実施例に説明されるように、マウス及び非ヒト霊長類へのＥＮＰＰ１含有融合タンパク質の投与後、これらの動物から回収された抗薬物抗体は、ＥＮＰＰ１のＳＭＢドメイン領域を主に認識した。本開示はまた、任意のＳＭＢドメインを欠く、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのバリアント形態、及びそのようなポリペプチドを含有する融合タンパク質が酵素的に活性であり、対応するＳＭＢドメイン含有ポリペプチド及び／又は融合タンパク質に対する増強された安定性を示し、とりわけ、軟部組織における望ましくない石灰化を阻害するのに有用であるという発見に部分的に基づく。
ソマトメジンＢは、ビトロネクチンからのタンパク質分解によって遊離されるシステインリッチペプチドである。例えば、Ｌｅａｖｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ６５（１０）：８０７－８１８を参照されたい。ＳＭＢドメインは、４つのジスルフィド結合を形成する８つのシステイン残基を含有し、これらは、三次元構造に基づいて、共有結合したコアを形成するドメイン内に埋没される。Ｉｄ Ｋａｍｉｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：６５１９－６５３４を参照されたい。本開示は、任意の特定の理論又は作用機序に拘束されないが、ＳＭＢ構造内の不均質性及び／又は互換性若しくは相互変化するジスルフィド結合形成は、部分的に、免疫原性に対する増加した傾向、及びＥＮＰＰ１含有融合タンパク質に対して観察される低減された安定性の原因となり得る。
ＥＮＰＰ１及びビトロネクチンに加えて、ＳＭＢドメインはＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ３、及び胎盤タンパク質１１（ＰＰ１１）などのタンパク質にも見出され得る。したがって、本開示は、ＳＭＢドメインを含有しないＳＭＢドメイン含有ポリペプチドのバリアント形態を特徴とする。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、ビトロネクチンポリペプチドのバリアントではない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、ＥＮＰＰ１のバリアント（例えば、ＥＮＰＰ１の可溶性形態のバリアント）である。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、ＥＮＰＰ２のバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、ＥＮＰＰ３のバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、ＰＰ１１のバリアントである。また、バリアントポリペプチドと異種タンパク質とのうちの１つ以上を含む融合タンパク質、及び／又はバリアントポリペプチドと異種部分とのうちの１つ以上を含むコンジュゲートも特徴とする。
更に別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１のソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを特徴とする。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く。
いくつかの態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供し、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一である可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供し、ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠き、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのホモ二量体化を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、ホモ二量体化を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性を有する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供し、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠くポリペプチドを含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供し、ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を更に含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含むアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供し、ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一である可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供し、少なくとも、位置８１８におけるアルギニン（Ｒ）が、別のアミノ酸の代わりに置換されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を更に含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのより大きいタンパク質分解抵抗性が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％増加したタンパク質純度を有する均質な組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのより大きいタンパク質分解抵抗性が、タンパク質切断を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％減少させる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼが、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、置換が、配列番号１に対する位置８１８にある。いくつかの実施形態では、位置８１８のアルギニン（Ｒ）が、ヒスチジン（Ｈ）で置換される。いくつかの実施形態では、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）で置換される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８１６Ｈ、Ｒ８１７Ｈ、Ｒ８１７Ｋ、Ｒ８１８Ｈ、又はＲ８１８Ｋからなる群から選択される配列番号１のアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１のホスホジエステラーゼ触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１及び２のうちの一方又は両方を欠く。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメイン及び１つ以上の異種タンパク質部分を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、哺乳動物における可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、野生型ＩｇＧ定常ドメインよりも高いＦｃＲｎに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、Ｎ末端リーダー配列（例えば、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのＮ末端に１つ以上のアミノ酸のＮ末端伸長を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長が、Ｓ又はＫＳである。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、異種部分を更に含む。いくつかの実施形態では、異種部分が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、及び脂質部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号１に対するアミノ酸残基３３２が、Ｉ３３２Ｔ置換を含む。
いくつかの態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ３のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ３のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを提供し、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９０％同一である可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを提供し、ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、ＥＮＰＰ３ポリペプチドのホモ二量体化を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、ホモ二量体化を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して低減されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３のホスホジエステラーゼ触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１及び２のうちの一方又は両方を欠く。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドドメイン及び１つ以上の異種タンパク質部分を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、哺乳動物における可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、野生型ＩｇＧ定常ドメインよりも高いＦｃＲｎに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、異種部分を更に含む。いくつかの実施形態では、異種部分が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、及び脂質部分からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ３融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ａ）ＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分であって、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分と、（ｂ）異種タンパク質部分と、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ａ）ＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分と、（ｂ）異種タンパク質部分と、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ａ）配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分であって、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分と、（ｂ）異種タンパク質部分と、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５を含む。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、哺乳動物における可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、哺乳動物における可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１ポリペプチド、ＥＮＰＰ３ポリペプチド、又は融合タンパク質を含むコンジュゲートを提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ａ）本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、又は本明細書で使用されるＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３融合タンパク質と、（ｂ）異種部分と、を含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、異種部分が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、及び脂質部分からなる群から選択される。いくつかの態様では、本開示は、（ａ）本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、本明細書で使用されるＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３融合タンパク質、又は本明細書で使用されるコンジュゲートと、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む薬学的に許容される組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における異所性石灰化を低減及び／又は改善するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における異所性石灰化を低減及び／又は改善するための方法であって、治療有効量の、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、本明細書で使用される融合タンパク質、本明細書で使用されるコンジュゲート、又は本明細書で使用される薬学的組成物を対象に投与し、それによって、対象における異所性石灰化を低減及び／又は改善することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、異所性石灰化が、軟部組織石灰化、動脈石灰化、及び血管石灰化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象が、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、尿毒症性細小動脈石灰化（ＣＵＡ）、カルシフィラキシス、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）、変形性関節炎、加齢に伴う動脈の硬化、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、及びアテローム性動脈硬化プラークの石灰化からなる群から選択される疾患を有する。いくつかの実施形態では、軟部組織が、アテローム性動脈硬化プラーク、筋性動脈、関節、脊椎、関節軟骨、脊椎板軟骨、血管、及び結合組織からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象が、ＥＮＰＰ１欠損である。いくつかの実施形態では、対象が、ＥＮＰＰ３欠損である。いくつかの実施形態では、対象が、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）を有する。いくつかの実施形態では、対象が、ＡＢＣＣ６遺伝子に病原性変異を有する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１欠損障害を有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、本明細書で使用される融合タンパク質、本明細書で使用されるコンジュゲート、又は本明細書で使用される薬学的組成物を対象に投与し、それによって、対象を治療することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＥＮＰＰ３欠損障害を有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、本明細書で使用される融合タンパク質、本明細書で使用されるコンジュゲート、又は本明細書で使用される薬学的組成物を対象に投与し、それによって、対象を治療することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象が、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、尿毒症性細小動脈石灰化（ＣＵＡ）、カルシフィラキシス、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）、変形性関節炎、加齢に伴う動脈の硬化、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、及びアテローム性動脈硬化プラークの石灰化からなる群から選択される疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象が、異所性石灰化を有する。いくつかの実施形態では、異所性石灰化が、軟部組織石灰化、動脈石灰化、及び血管石灰化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象が、病理学的骨化を有する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドのコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドが、配列番号１４又は１５のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書で使用される可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドのコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、ポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞が、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞が、ＣＨＯ細胞又はヒト細胞である。いくつかの態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを作製する方法であって、ａ）可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの発現に好適な条件下で組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養することと、ｂ）そのように発現された可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを回収することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法が、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤とともに製剤化して、薬学的組成物を生成することを更に含む。いくつかの態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを作製する方法であって、ａ）可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの発現に好適な条件下で組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養することと、ｂ）そのように発現された可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを回収することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法が、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤とともに製剤化して、薬学的組成物を生成することを更に含む。
野生型ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質の全未処理アミノ酸配列（配列番号１）を示す。細胞質及び膜貫通領域は、下線が引かれている。潜在的なＮ－グリコシル化部位は、太字である。ＰＳＣＡＫＥ（残基９９～１０４、枠付き）は、ＳＭＢ１（残基１０４～１４４）及びＳＭＢ２（残基１４５～１８９）を含む可溶性ＥＮＰＰ１タンパク質部分の始まりである。 ヒトＥＮＰＰ１の特定のドメインを例示する。 可溶性野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 ＳＭＢ１及びＳＭＢ２の両方を欠く可溶性野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。 図５Ａ及び図５Ｂは、様々な脊椎動物可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及びヒト可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの多重整列（配列番号４～８）を示す。様々な可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、次の種に対応し、特定のＮＣＢＩアクセッション番号の領域を表す：マウス（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１２９５２５６．１、配列番号４）、ウシ（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１１９３１４１、配列番号５）、ウサギ（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１１６２４０４．１、配列番号６）、ヒト（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９．２、配列番号７）、及びヒヒ（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１０７６２１１．２、配列番号８）。 野生型ＥＮＰＰ３前駆体タンパク質の全未処理アミノ酸配列（配列番号１１６）を示す。細胞質及び膜貫通領域は、下線が引かれている。可溶性ＥＮＰＰ３タンパク質部分は、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を含む。 ヒトＥＮＰＰ３の特定のドメインを例示する。 ラット及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）試料上で実施された抗薬物抗体（ＡＤＡ）ＥＬＩＳＡ競合アッセイの結果を例示する棒グラフである。動物研究中に生成されたＡＤＡを含有する血清及び血漿試料を、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ－処理アッセイプレートに添加し、競合と処理した。ＥＬＩＳＡシグナルの変化が測定され、対照シグナルに対するパーセンテージとして示される。アッセイに使用される競合は、（ａ）構築物１：ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメイン全体を含有するＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と、（ｂ）構築物２：ＥＮＰＰ１のＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインを欠くヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と、（ｃ）構築物３：触媒ドメインがカニクイザルＥＮＰＰ１の対応するドメインからの触媒ドメインと置換された可溶性ヒトＥＮＰＰ１を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と、（ｄ）構築物４：ヌクレアーゼ様ドメインがカニクイザルＥＮＰＰ１の対応するドメインと置換された可溶性ヒトＥＮＰＰ１を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と、（ｅ）構築物５：構築物の可溶性ＥＮＰＰ１部分がアミノ酸リンカー配列：ＧＧＧＧＳ（配列番号６３）を介して構築物のＦｃ部分に結合されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と、（ｆ）ヒトＩｇＧ１のみを含む対照構築物１と、（ｇ）対照構築物２：ＰＮＧａｓｅ Ｆ（脱グリコシル化ＥＮＰＰ１－Ｆｃ）で処理された構築物１のＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と、（ｈ）対照構築物３：対照構築物２のモック処理バージョンと、を含む。対照試料に対するＥＬＩＳＡシグナルの５０％を表す破線が示されている。 図９Ａ及び図９Ｂは、インビボにおける様々なＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物の活性及び関連するＰＰｉレベルを例示する棒グラフである。図９Ａは、３６０日間のインビボにおける試験構築物５、試験構築物６、及び試験構築物７の活性レベルを示す。図９Ｂは、試験期間にわたる、試験構築物５、試験構築物６、又は試験構築物７で処理されたマウスにおけるＰＰｉレベルを示す。試験構築物５は、構築物の可溶性ＥＮＰＰ１部分が、アミノ酸リンカー配列：ＧＧＧＧＳ（配列番号６３）を介して構築物のＦｃ部分に結合されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を含む（配列番号１１９）。試験構築物６は、ＥＮＰＰ１部分の触媒ドメインがＩ３３２Ｔ置換を含み、Ｆｃドメインが三重変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む、ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を含む（配列番号１２０）。試験構築物７は、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインを欠き、ＥＮＰＰ１部分の触媒ドメインがＩ３３２Ｔ置換を含み、Ｆｃドメインが三重変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む、ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を含む（配列番号１２１）。 図１０Ａ～図１０Ｄは、ビヒクル又は様々なＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（試験構築物５、試験構築物６、又は試験構築物７）で処理されたマウスにおける、心臓、大動脈、腎臓、及び脾臓のＰＰｉレベル及び組織石灰化のグラフを示す。図１０Ａは、ビヒクル又は試験構築物５、試験構築物６、若しくは試験構築物７のいずれかで処理されたマウスにおけるＰＰｉレベルを示す。マウスを、ビヒクル又は試験構築物５、試験構築物６、若しくは試験構築物７のいずれかで処理し、心臓及び大動脈（図１０Ｂ）、腎臓（図１０Ｃ）、及び脾臓（図１０Ｄ）の組織石灰化を測定した。試験構築物５は、構築物の可溶性ＥＮＰＰ１部分が、アミノ酸リンカー配列：ＧＧＧＧＳ（配列番号６３）を介して構築物のＦｃ部分に結合されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を含む。（配列番号１１９）。試験構築物６は、ＥＮＰＰ１部分の触媒ドメインがＩ３３２Ｔ置換を含み、Ｆｃドメインが三重変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む、ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を含む。（配列番号１２０）。試験構築物７は、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインを欠き、ＥＮＰＰ１部分の触媒ドメインがＩ３３２Ｔ置換を含み、Ｆｃドメインが三重変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む、ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を含む。（配列番号１２１）。 ＳＭＢドメインを含む（試験構築物５）か、又はＳＭＢドメインを欠く（試験構築物２）を含む、ＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドの凝集を示す。各試料を、１５日間（試験構築物２）又は１３日間（試験構築物５）のいずれかの間、１００ｍＭのＤＴＴを伴って、又は伴わずに周囲室温でインキュベートした。ＳＭＢドメインを欠く試験構築物２の試料は、１５日間にわたって透明のままであった。
１．概要
本出願は、ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む組成物、並びにＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３に関連する疾患又は障害の治療におけるそれらの使用を提供する。特定の態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及びその使用（例えば、病理学的石灰化及び／若しくは骨化、又は病理学的石灰化及び／若しくは骨化の１つ以上の合併症の進行速度及び／又は重症度を治療、予防、及び／又は低減すること）に関する。特定の態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド及びその使用（例えば、病理学的石灰化及び／若しくは骨化、又は病理学的石灰化及び／若しくは骨化の１つ以上の合併症の進行速度及び／又は重症度を治療、予防、及び／又は低減すること）に関する。したがって、本開示は、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の機能的に活性な部分及びバリアントを識別する。ＥＮＰＰ１遺伝子の特定の変異は、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、インスリン抵抗性、低リン血症性くる病、及び脊椎の後縦靱帯骨化症に関連していることが当技術分野で知られている。
稀な常染色体劣性、かつほぼ常に致死的な障害であるＩＩＡＣは、筋性動脈の内弾性板の石灰化、及び筋内膜増殖に起因する狭窄によって特徴付けられる。疾患の症状は、最も多くの場合、乳児期に現れ、生後６か月までに致死的であり、これは、概して、虚血性心筋症、及び腎動脈狭窄を含む閉塞性動脈症の他の合併症のためである。ＩＩＡＣの１２件超の報告症例では、大関節の関節周囲石灰化もまた、幼児期に発症した。ＥＮＰＰ１の変異は、特定のＩＩＡＣ患者におけるヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ活性の低下と関連していることが示されている。例えば、Ｒｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：３７９－８１を参照されたい。
ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、異所性組織石灰化の特定の疾患の治療に効果的であることが示されている。ＥＮＰＰ１－Ｆｃは、幼児に発生し、かつ広範な動脈石灰化を伴う重篤な疾患であるＧＡＣＩ（幼児の全身性動脈石灰化）に対するマウスモデルにおいて、全身性動脈石灰化を低減することが示されている（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．１０００６）。ＥＮＰＰ１の融合タンパク質はまた、重度の組織石灰化の疾患を治療するように説明されており（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１４／１２６９６５号及び同第ＷＯ２０１６／１８７４０８号参照）、負に帯電した骨標的化ドメインを含むＥＮＰＰ１の融合タンパク質は、ＧＡＣＩを治療するように説明されている（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／１１３０２７号及び同第ＷＯ２０１２／１２５１８２号）。
特定の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの異常活性に関連する疾患又は状態の治療、改善、及び／又は予防における、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチド、及びそのバリアントの使用を企図する。ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３ポリペプチドは、多くの重要な生物学的プロセスの調節（例えば、心血管、神経学的、免疫学的、筋骨格、ホルモン、及び血液学的機能の調節）に関与する。これらのプロセスにおけるそれらの主要な機能に起因して、それらは、治療的介入の望ましい標的となり得る。例えば、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチド（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチド）は、ヒト又は動物の障害又は状態を治療、改善、及び／又は予防するために使用され得る。そのような障害又は状態の例としては、限定されるものではないが、異所性石灰化（例えば、軟部組織石灰化、動脈石灰化、及び血管石灰化）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、尿毒症性細小動脈石灰化（ＣＵＡ）、カルシフィラキシス、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）、変形性関節炎、加齢に伴う動脈の硬化、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、及びアテローム性動脈硬化プラークの石灰化が挙げられる。他の例としては、ＥＮＰＰ１欠損症（例えば、ＧＡＣＩ及びＡＲＨＲ２）、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、対象がＡＢＣＣ６遺伝子に病原性変異を有する障害、及び病理学的骨化が挙げられる。ＥＮＰＰ１ポリペプチド及びこれらの障害及び状態が、以下でより詳細に論じられる。
２．可溶性ＥＮＰＰポリペプチド
特定の態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドに関する。本明細書に開示されるＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３ファミリーの天然発生型ポリペプチド、並びに生物学的活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合体、及び／又はペプチド模倣形態を含む）を含む。「ＥＮＰＰ１」又は「ＥＮＰＰ１ポリペプチド」という用語は、任意の種に由来する、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１タンパク質（ＮＰＰ１／ＥＮＰＰ１／ＰＣ－１）及びＥＮＰＰ１関連タンパク質を指す。「ＥＮＰＰ３」又は「ＥＮＰＰ３ポリペプチド」という用語は、任意の種に由来する、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３タンパク質（ＮＰＰ３／ＥＮＰＰ３／ＰＤＮＰ３）及びＥＮＰＰ３関連タンパク質を指す。ＥＮＰＰ１タンパク質は、ホモ二量体を形成するＩＩ型膜貫通糖タンパク質を含む。ＥＮＰＰ１タンパク質の各単量体は、原形質膜への標的化に関与する短い細胞内Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、及び数個のドメインを含む大きい細胞外領域を含む。大きい細胞外領域は、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインを含み、これらは、ＥＮＰＰ１二量体化に関与することが報告されている（Ｒ．Ｇｉｊｓｂｅｒｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１；２００３：３２１－３３０）。具体的には、ＳＭＢドメインは、８つのシステイン残基を含有し、各々が４つのジスルフィド結合に配置され、共有結合シスチン間結合及び分子内結合を通じて、ＥＮＰＰ１ホモ二量体化を媒介することが示されている。タンパク質は、ヌクレオチド及びヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、並びにヌクレオチド及びヌクレオチド糖のピロリン酸結合を含む、様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ１タンパク質は、ヌクレオシド５’トリホスファターゼを、対応する一リン酸に加水分解し、またジアデノシンポリリン酸も加水分解するように機能する。ＥＮＰＰ１タンパク質は、心血管、神経学的、免疫学的、筋骨格、ホルモン、及び血液学的機能の調節に関与する、プリン作動性シグナル伝達における役割を果たす。ヒトＥＮＰＰ１前駆体タンパク質（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９）の例示的なアミノ酸配列が図１に示される（配列番号１）。ヒトＥＮＰＰ１前駆体タンパク質は、ＥＮＰＰ１ Ｎ末端に内在性ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列を含む。本明細書に説明される全てのＥＮＰＰ１関連ポリペプチドに対するアミノ酸のナンバリングは、別段の指定がない限り、図１に提供されるヒトＥＮＰＰ１前駆体タンパク質配列のナンバリングに基づく。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質は、内在性又は異種のシグナルペプチド配列を更に含む。タンパク質分解時に、シグナルペプチド配列は、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質から切断され、成熟ＥＮＰＰ１タンパク質を提供する。例えば、Ｊａｎｓｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００５；１１８（Ｐｔ １４）：３０８１－９を参照されたい。本明細書で開示されるポリペプチドとともに使用され得る例示的なシグナルペプチド配列としては、限定されるものではないが、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、及び／又はＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。処理された（成熟）細胞外ＥＮＰＰ１ポリペプチド配列が図３に示されている（配列番号２）。
一般に、ＥＮＰＰ１は、脊椎動物の間で良好に保存されており、細胞外ドメインの大部分は、実質的に保存されていることが当技術分野で知られている。例えば、図５Ａ及び図５Ｂは、様々なＥＮＰＰ１オルソログと比較した、ヒトＥＮＰＰ１細胞外ドメインの多重整列を図示する。様々なヌクレオチド三リン酸（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、及びＣＴＰ）、ｐＮＰ－ＴＭＰ、３’，５’－ｃＡＭＰ、及び２’－３’－ｃＧＡＭＰに結合するＥＮＰＰ１もまた、高度に保存されている（例えば、Ｋａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１２；１０９（４２）：１６８７６－８１、及びＭａｃｋｅｎｚｉｅ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ．２０１２；５１（５）：９６１－８参照）。したがって、これらの整列から、正常なＥＮＰＰ１活性に重要である細胞外ドメインとの重要なアミノ酸位置を予測すること、及び正常なＥＮＰＰ１活性を顕著に改変することなく、置換に耐性がある可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。それゆえに、本開示の方法による有用な活性ヒトＥＮＰＰ１ポリペプチドは、別の脊椎動物ＥＮＰＰ１の配列からの対応する位置に１つ以上のアミノ酸を含み得るか、又はヒト若しくは他の脊椎動物配列のものと同様の残基を含み得る。対応する位置における１つ以上のアミノ酸の置換は、ポリペプチド鎖の形状を改変するか、又は正常なＥＮＰＰ１活性を改変する可能性が低い保存的変形又は置換を含み得る。保存的変形、又は置換の例としては、別のものに対するイソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンなどの１つの疎水性残基の置換、又はリジンに対するアルギニンの置換、アスパラギン酸に対するグルタミンの置換、若しくはアスパラギンに対するグルタミンなどの、別のものに対する１つの極性残基の置換などが挙げられる。例えば、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性の配列を有する任意の既知のＥＮＰＰ１ポリペプチドの配列に由来するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメイン（例えば、ＳＭＢ１、ＳＭＢ２、触媒ドメイン、ヌクレアーゼ様ドメイン、リンカー配列）、又は別の種からの対応するドメイン若しくは部分配列で置換された（例えば、ヒトからカニクイザル）部分配列を含み得る。
ＥＮＰＰ１タンパク質は、構造的及び生物学的特徴の点で当技術分野で特徴付けられてきた。特定の実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１タンパク質は、ピロホスファターゼ及び／又はホスホジエステラーゼ活性を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１タンパク質は、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、及びＣＴＰ）、ｐＮＰ－ＴＭＰ、３’，５’－ｃＡＭＰ、及び２’－３’－ｃＧＡＭＰを結合し、ヌクレオチド三リン酸を無機ピロリン酸に変換する［Ｋａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１２；１０９（４２）：１６８７６－８１、Ｌｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１４；１０（１２）：１０４３－８、Ｊａｎｓｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１２；２０（１１）：１９４８－５９、及びＯｎｙｅｄｉｂｅ Ｋｌ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１９；２４（２２）参照］。本明細書で使用される場合、「酵素的に活性」又は「生物学的に活性」という用語は、ピロホスファターゼ及び／又はホスホジエステラーゼ活性を呈する（例えば、ＡＴＰをＡＭＰ及びＰＰｉに、並びに／又はＡＰ３ａをＡＴＰに結合及び／又は加水分解することができる）ＥＮＰＰ１ポリペプチドを指す。例えば、ＥＮＰＰ１タンパク質のピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼドメインは、細胞外ヌクレオチド三リン酸を加水分解して、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を生成し、概して、可溶性である。この活性は、上記に説明されたようにｐＮＰ－ＴＭＰアッセイを使用して測定され得る（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（１０）：３３５２－６２、Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．６：１０００６）。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、約３．４（±０．４）ｓ－１酵素－１以上の基質ＡＴＰに対するｋｃａｔ値を有し、ｋｃａｔは、ポリペプチドに対するＡＴＰの加水分解速度を測定することによって決定される。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、約２ｐＭ以下の基質ＡＴＰに対するＫＭ値を有し、ＫＭは、ポリペプチドに対するＡＴＰの加水分解速度を測定することによって決定される。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つ以上の生物学的活性を保持する可溶性ＥＮＰＰ１タンパク質を生成するやり方（例えば、無機ピロリン酸へのヌクレオチドの変換）のための十分なガイダンスを提供する。
一実施形態では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドに関する。本明細書に説明されるように、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドという用語は、生物学的活性（例えば、酵素的活性）を保持する、ＥＮＰＰ１タンパク質の任意の天然発生型細胞外ドメイン、及びその任意のバリアント（変異体、断片、及び／又はペプチド模倣形態を含む）を含む。例示的な可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１タンパク質の細胞外ドメイン（例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９の残基９６～９２５、又はＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９の残基１９０～９２５）を含み、本明細書に説明される。可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの例としては、例えば、図３に示されるＥＮＰＰ１細胞外ドメイン（配列番号２）、ＳＭＢ１又はＳＭＢ２ドメインのうちの少なくとも１つを欠くＥＮＰＰ１細胞外ドメイン、ＳＭＢ１ドメイン及びＳＭＢ２ドメインの両方を欠くＥＮＰＰ１細胞外ドメイン（例えば、配列番号３に示される）が挙げられる。配列番号３に示される切断されたＥＮＰＰ１細胞外ドメインは、配列番号１のナンバリングに基づいて、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）を示す。例示的な可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、触媒ドメイン及びヌクレアーゼ様ドメインを含む。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの細胞外ドメインに加えてシグナル配列を更に含む。例示的なシグナル配列は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの天然シグナル配列、又は限定されるものではないがｈＥＮＰＰ７シグナル配列などの別のタンパク質からのシグナル配列を含む。バリアント可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの例は、本開示全体を通して、並びに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１２５１８２号、同第ＷＯ２０１４／１２６９６５号、同第ＷＯ２０１６／１８７４０８号、同第ＷＯ２０１８／０２７０２４号、同第ＷＯ２０２０／２０６３０２号、及び同第ＷＯ２０２０／０４７５２０号に提供され、それらの全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの様々なドメインに対応する残基が変化し得ることを認識するであろう。具体的には、ポリペプチドドメインの識別は、タンパク質配列及び／又は構造に古典的に基づく。ポリペプチド配列及び／又は構造が、関連するポリペプチドドメインを識別するために使用され得る（すなわち、ポリペプチドは、他のタンパク質構造又はドメインと配列及び／又は構造類似性を有し得る）。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、又は１０８のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１のアミノ酸１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１０４の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で始まり、かつ配列番号１のアミノ酸残基１４３の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１００～１４２を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１０４～１４４を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ２ドメインは、配列番号１のアミノ酸１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１のアミノ酸１８６、１８７、１８８、１８９、又は１９０のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ２ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１４３の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で始まり、かつ配列番号１のアミノ酸残基１８８の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ２ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１４２～１８７を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ２ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１４５～１８９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のリンカードメイン（図２に示される「Ｌ１」）は、配列番号１のアミノ酸１８５、１８６、１８７、１８８、又は１８９のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１のアミノ酸２０６、２０７、２０８、２０９、又は２１０のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１の第１のリンカードメインは、配列番号１のアミノ酸残基１８７の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で始まり、かつ配列番号１のアミノ酸残基２０８の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１の第１のリンカードメインは、配列番号１のアミノ酸残基１８７～２０８を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１の触媒ドメイン（ホスホジエステラーゼドメイン）は、配列番号１のアミノ酸１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、又は２０９のうちのいずれか１つで始まり、配列番号１のアミノ酸５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、又は５９８のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１の触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１９９の上流又は下流のアミノ酸残基±１１残基で始まり、かつ配列番号１のアミノ酸残基５９４の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒ドメインは、配列番号１の残基２０８～５９７を含む。いくつかの実施形態では、触媒ドメインは、配列番号１の残基１９１～５９１を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のヌクレアーゼ様ドメインは、配列番号１のアミノ酸６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、又は６５５のうちのいずれか１つで始まり、配列番号１のアミノ酸９２３、９２４、又は９２５のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１のヌクレアーゼ様ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基６５１の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で始まり、かつ配列番号１のアミノ酸残基９２３の上流又は下流のアミノ酸残基±２残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ様ドメインは、配列番号１の残基６４８～９２５を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ様ドメインは、配列番号１の残基６５４～９２５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、限定されるものではないが、治療有効性又は安定性（例えば、インビボにおけるタンパク質分解に対する保存寿命及び抵抗性）を増強することなどの目的のために、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの構造を修飾することによって、機能的ＥＮＰＰ１バリアントを生成することを企図する。バリアントは、アミノ酸置換、欠失、付加、又はそれらの組み合わせによって生成され得る。例えば、イソロイシン又はバリンとのロイシン、グルタミン酸とのアスパラギン酸、セリンとのトレオニン、又は構造的に関連するアミノ酸とのアミノ酸の同様の置換（例えば、保存的変異）の単離された置換は、結果として生じる分子の生物学的活性に主要な効果を有しないことになると予想することは合理的である。保存的置換は、それらの側鎖で関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が結果として機能的相同体をもたらすか否かは、野生型ポリペプチドと比較したバリアントポリペプチドの酵素活性、野生型ポリペプチドと比較した、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を生成するバリアントポリペプチドの能力、又は野生型ポリペプチドと比較した、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ、ｐＮＰＴＭＰ、３’，５’－ｃＡＭＰ、及び２’－３’－ｃＧＡＭＰのうちの１つ以上に結合するバリアントポリペプチドの能力を評価することによって、容易に決定され得る。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、触媒及び／又はヌクレアーゼドメインにおける１つ以上の置換などの、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの１つ以上のドメインにおける置換を導入することを企図する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、例えば、製造及び／又は投与中にプロテアーゼによる切断に感受性である配列番号１の位置における置換などの、１つ以上のアミノ酸置換を含む。例示的な置換としては、例えば、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８を含む配列番号１の位置における置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す。任意選択的に、触媒及び／又はヌクレアーゼドメインにおける置換を有する可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、対応する野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと実質的に同様の生物学的活性を示す。例えば、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと同様に、ＡＴＰをＡＭＰ及びＰＰｉに、並びに／又はＡＰ３ａをＡＴＰに結合させ、加水分解し得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼである。
特定の実施形態では、そのような置換は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドのタンパク質分解抵抗性を、野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％増加させる。他の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドにおける置換は、野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％増加したタンパク質純度を有する均質な組成物を提供する。例えば、プロテアーゼによる可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの切断は、様々な長さのいくつかのポリペプチドを結果的にもたらし得る。プロテアーゼ抵抗性可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、結果として、単一種を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの生成、又は生成される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの均質性の増加をもたらし得る。加えて、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのより大きいタンパク質分解抵抗性が、結果として、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％のタンパク質切断の減少をもたらす。本明細書で使用される場合、「置換」という用語は、野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドに関する挿入、欠失、及び／又は修飾を含む。
本開示は、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を有するいくつかの可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供する。任意選択的に、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、対応する野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと実質的に同様の生物学的活性を有する。例えば、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、対応する野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと同様に、ＡＴＰをＡＭＰ及びＰＰｉに、並びに／又はＡＰ３ａをＡＴＰに結合させ、加水分解し得る。したがって、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得、ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ１を更に欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドのＳＭＢ１ドメインは、配列番号１の残基１００～１４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１４２～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ２を更に欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドのＳＭＢ２ドメインは、配列番号１の残基１４２～１８６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１０７～１４４及び配列番号１の残基１９０～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１００～１４２及び配列番号１の残基１８７～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ２及び第１のリンカードメインを更に欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を更に欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１８８～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１９０～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ１、ＳＭＢ２、及び第１のリンカードメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、Ｎ末端リーダー配列（例えば、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に対する少なくとも位置８１６に置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、位置８１６で少なくともリジン（Ｋ）の代わりのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、位置８１６のリジン（Ｋ）が、ヒスチジン（Ｈ）で置換される。いくつかの実施形態では、位置８１６のリジン（Ｋ）が、アルギニン（Ｒ）で置換される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、位置８１７で少なくともアルギニン（Ｒ）の代わりにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、位置８１７のアルギニン（Ｒ）は、ヒスチジン（Ｈ）で置換される。いくつかの実施形態では、位置８１７のアルギニン（Ｒ）が、リジン（Ｋ）で置換される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、位置８１７で少なくともアルギニン（Ｒ）の代わりにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に対する少なくとも位置８１８に置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、位置８１８で少なくともアルギニン（Ｒ）の代わりにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、位置８１８のアルギニン（Ｒ）が、リジン（Ｋ）で置換される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、位置８１８で少なくともアルギニン（Ｒ）の代わりにアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、減少した免疫原性を有するように、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの細胞外ドメインに欠失を導入することを企図する。いくつかの実施形態では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、減少したタンパク質凝集を有するように、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの細胞外ドメインに欠失を導入することを企図する。例えば、ソマトメジンＢドメイン１（ＳＭＢ１）及びＳＭＢ２ドメインは、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基の増加した数に起因して、凝集し易い場合がある。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１を欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢ２を欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２の両方を欠く。特定の場合、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを更に欠く。
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの前駆体の分泌を結果的にもたらすシグナルペプチドを含み、これは、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドをもたらすタンパク質分解プロセシングを経る。他の実施形態では、シグナルペプチドは、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ５、及びＥＮＰＰ７のシグナルペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の膜貫通ドメインを含むＥＮＰＰ１ポリペプチドと、非限定的な例として、ＥＮＰＰ２などの別のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ２膜貫通ドメインを含む前駆体ＥＮＰＰ１ポリペプチドの切断産物を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ２膜貫通ドメインが、アミノ酸配列ＩＩＳＬＦＴＦＡＶＧＶＮＩＣＬＧＦＴＡ（配列番号２０）を含む。
特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１と比較して、シグナルペプチド後、かつ膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間で、ペプチダーゼ切断部位を含むＥＮＰＰ１の細胞外領域のセグメントで修飾される。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１と比較して、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間で、フーリン切断部位を含むＥＮＰＰ１の細胞外領域のセグメントで修飾される。他の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１と比較して、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間で、フーリン切断部位を含むＥＮＰＰ１の細胞外領域のセグメントで修飾されない。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１と比較して、シグナルペプチド切断部位を含有するＥＮＰＰ２の細胞外領域のセグメントで修飾される。他の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１と比較して、シグナルペプチド切断部位を含有するＥＮＰＰ２の細胞外領域のセグメントで修飾されない。
いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、可溶性野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのホモ二量体化を低減する１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、ＳＭＢ１及び／又はＳＭＢ２の欠失）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、ホモ二量体化を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、可溶性野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有していない。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％をホモ二量体化する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、可溶性野生型ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ヒトＩＲに対するＥＮＰＰ１の親和性を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、ヒトＩＲに対するＥＮＰＰ１の親和性を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１のホスホジエステラーゼ触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢ１を欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１４５～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１４２～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ２を欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１０７～１４４及び配列番号１の残基１９０～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１００～１４２及び配列番号１の残基１８７～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ２及び第１のリンカードメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１８８～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１の残基１９０～９２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＳＭＢ１、ＳＭＢ２、及び第１のリンカードメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示すように、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの細胞外ドメインに１つ以上の変異を更に含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１及び２のうちの一方又は両方を欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ヌクレアーゼドメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ヌクレアーゼドメインを除去するように切断される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に対するおよそ残基５２４～およそ残基８８５のヌクレアーゼドメインを除去するように切断され、配列番号１に対するおよそ残基１８６～およそ残基５８６の触媒ドメインのみを残し、これは、タンパク質の触媒活性を保存するように機能する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、本明細書に説明される触媒及び／又はヌクレアーゼドメインにおける１つ以上の置換などの、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの１つ以上のドメインにおける置換を更に導入することを企図する。
ある特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１膜貫通ドメインを欠くＥＮＰＰ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを含み、ＥＮＰＰ１膜貫通ドメインが、除去され（及び／又は切断され）、非限定的な例として、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ５、又はＥＮＰＰ７などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインで置き換えられている。
いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメイン及び１つ以上の異種タンパク質部分（すなわち、ＥＮＰＰ１に対して異種のポリペプチドドメイン）を含む融合タンパク質である。アミノ酸配列が、配列番号１によって表されるＥＮＰＰ１の形態で一意に見出されない場合、ＥＮＰＰ１に対して異種であることが理解される。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、イムノグロブリンのＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンのＦｃドメインが、ＩｇＧ１イムノグロブリンのＦｃドメインである。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ヒトイムノグロブリン１（ＩｇＧ１）、ヒトイムノグロブリン２（ＩｇＧ２）、ヒトイムノグロブリン３（ＩｇＧ３）、及び／又はヒトイムノグロブリン４（ＩｇＧ４）のＦｃドメインにＣ末端融合される。他の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ヒトイムノグロブリン１（ＩｇＧ１）、ヒトイムノグロブリン２（ＩｇＧ２）、ヒトイムノグロブリン３（ＩｇＧ３）、及び／又はヒトイムノグロブリン４（ＩｇＧ４）のＦｃドメインにＮ末端融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの存在は、半減期、可溶性を改善し、免疫原性を低減し、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの活性を増加させる。特定の実施形態では、天然ヒトＩｇＧタンパク質（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）の部分が、Ｆｃ部分（例えば、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ）の代わりに使用され得る。例えば、本開示は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／又はＩｇＧ４に由来するＣＨＩ、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメインなどの、イムノグロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合されたＥＮＰＰ１を含む融合タンパク質を提供する。Ｆｃ断片は、ヒンジ領域（Ｒａｂａｔナンバリングシステムによる、ヒトＩｇＧ１の残基２１６～２３０）などの天然ＩｇＧの領域、第２の定常ドメインＣＨ２（残基２３１～３４０）全体、及び第３の定常ドメインＣＨ３（残基３４１～４４７）を含み得る。本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物」という用語は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに、組換え融合及び／又は化学的にコンジュゲートされた（共有結合及び非共有結合の両方を含む）ＥＮＰＰ１の可溶形態（例えば、ＥＮＰＰ１の細胞外ドメイン）を指す。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端が、ＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合又はコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＮ末端が、ＦｃＲ結合ドメインのＣ末端に融合又はコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、バリアントＦｃ定常領域を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、それが由来した天然定常領域に対して、３０個以下（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個以下）のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ定常領域が、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含む。いくつかの実施形態では、バリアントヒトＦｃ定常領域が、各々ＥＵナンバリングにおいて、位置４２８にメチオニン、及び位置４３４にアスパラギンを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ定常領域が、例えば、米国特許第８，０８８，３７６号に説明される４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換を含む。いくつかの実施形態では、機能的均等物又は機能的誘導体が、本明細書に開示されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と同一若しくは同様の、又はそれよりも高い生物学的活性を有するか否かを決定する方法が、ＷＯ２０１６／１８７４０８に説明されるＡＴＰ切断を伴う酵素学的アッセイを使用することによって決定され得る。
ヒトＩｇＧ１（Ｇ１Ｆｃ）のＦｃ部分に使用され得るアミノ酸配列の例は、配列番号１３である（表１）。部分的に、本開示は、配列番号１３と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなるポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１６と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなるポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、イムノグロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、又はヒト血清アルブミンからなる群から選択される１つ以上のドメインを含む。融合ドメインが、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的で、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッケル又はコバルトコンジュゲート樹脂などの、アフィニティクロマトグラフィーのための関連基質が使用される。そのような基質の多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システム及び（ＨＩＳ６）融合パートナーと有用なＱＩＡＥＸＰＲＥＳＳ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの、「キット」形態で利用可能である。別の例として、融合ドメインは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの検出を容易にするために選択され得る。そのような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、及び特異的抗体が利用可能である、通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特定のモノクローナル抗体が容易に入手可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、及びｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、例えば、因子Ｘａ又はトロンビンなどのプロテアーゼ切断部位を有し、これは、関連プロテアーゼが、融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を遊離させることを可能にする。次いで、遊離されたタンパク質が、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離され得る。他のタイプの融合ドメインが、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させるように選択され得る。例えば、選択され得る融合ドメインは、多量体形成（例えば、二量体形成、四量体形成）ドメイン及び機能性ドメイン（追加の生物学的機能を付与する）を含む。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの凝集を低減する。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの免疫原性を減少させる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの二量体化を増加させる。例えば、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインは、ＥＮＰＰ１二量体化に関与すると報告されている（Ｒ．Ｇｉｊｓｂｅｒｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１；２００３：３２１－３３０）。したがって、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインの欠失は、結果として、増加した単量体可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドをもたらし得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、単量体である。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、二量体である。いくつかの実施形態では、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、Ｆｃドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの二量体化を増加させるＦｃドメインを更に含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１融合タンパク質が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメインと１つ以上の異種タンパク質部分（例えば、Ｆｃイムノグロブリンドメイン）との間に位置付けられたリンカーを更に含む。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、Ｆｃドメインに直接的又は間接的に融合される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１融合タンパク質が、ＦｃドメインとＥＮＰＰ１ポリペプチドとの間のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーが、１～２００個のアミノ酸を含むアミノ酸スペーサーであってもよい。好適なペプチドスペーサーが、当技術分野で公知であり、例えば、グリシン、アラニン、及びセリンなどの柔軟なアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーが、ポリグリシンリンカー又はＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーが、ＧＡ（配列番号２１）、ＧＳ（配列番号２２）、ＧＧ（配列番号２３）、ＧＧＡ（配列番号２４）、ＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＧＧ（配列番号２６）、ＧＧＧＡ（配列番号２７）、ＧＧＧＳ（配列番号２８）、ＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＡＧ（配列番号３３）、ＧＧＳＧ（配列番号３４）、ＡＧＧＧ（配列番号３５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３６）、又はＳＧＧＧ（配列番号３７）のモチーフ、例えば、複数又は反復モチーフを含有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーが、ＧＡ又はＧＳ、例えば、ＧＡ、ＧＳ、ＧＡＧＡ（配列番号３８）、ＧＳＧＳ（配列番号３９）、ＧＡＧＡＧＡ（配列番号４０）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号４１）、ＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号４２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４３）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号４４）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４５）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号４６）、及びＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４７）のモチーフを含む２～１２個のアミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーが、ＧＧＡ又はＧＧＳ、例えば、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＡＧＧＡ（配列番号４８）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号４９）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号５０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号５１）、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号５２）、及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号５３）のモチーフを含む３～１２個のアミノ酸を含有し得る。更にいくつかの実施形態では、スペーサーが、ＧＧＡＧ（配列番号５４）、ＧＧＳＧ（配列番号５５）、例えば、ＧＧＡＧ（配列番号５６）、ＧＧＳＧ（配列番号５７）、ＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号５８）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号５９）、ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧ（配列番号６０）、及びＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号６１）のモチーフを含む、４～１２個のアミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーが、ＧＧＧＧＡ（配列番号６２）又はＧＧＧＧＳ（配列番号６３）、例えば、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号６４）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５）のモチーフを含有し得る。本発明のいくつかの実施形態では、異種タンパク質部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換を有するＦｃドメイン（例えば、二量体化を低減する１つ以上の置換）、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミン）と可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドとの間のアミノ酸スペーサーが、ＧＧＧ、ＧＧＧＡ（配列番号２７）、ＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＧＧＧＡＧ（配列番号６６）、ＧＧＧＡＧＧ（配列番号６７）、又はＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号６８）であり得る。
いくつかの実施形態では、スペーサーはまた、グリシン、アラニン、及びセリン以外のアミノ酸、例えば、ＬＩＮ（配列番号６９）、ＴＧＧＧＧ（配列番号７０）、ＡＡＡＬ（配列番号７１）、ＡＡＡＫ（配列番号７２）、ＡＡＡＲ（配列番号７３）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号７４）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号７５）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号７６）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号７７）、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号７８）、ＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号７９）、ＲＳＩＡＴ（配列番号８０）、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号８１）、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号８２）、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ（配列番号８３）、ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号８４）、ＮＳＳ（配列番号８７）、ＥＳＳ（配列番号８８）、ＲＱＱ（配列番号８９）、ＫＲ（配列番号９０）、ｍが０～１５である（Ｒ）ｍ（配列番号９１）、ＤＳＳＳＥＥＫＦＬＲＲＩＧＲＦＧ（配列番号９２）、ＥＥＥＥＥＥＥＰＲＧＤＴ（配列番号９３）、ＡＰＷＨＬＳＳＱＹＳＲＴ（配列番号９４）、ＳＴＬＰＩＰＨＥＦＳＲＥ（配列番号９５）、ＶＴＫＨＬＮＱＩＳＱＳＹ（配列番号９６）、ｍが１～１５である（Ｅ）ｍ（配列番号９７）、ＲＳＧＳＧＧＳ（配列番号９８）、ｍが１～１５である（Ｄ）ｍ（配列番号９９）、ＬＶＩＭＳＬＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１００）、ＶＩＭＳＬＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０１）、ＩＭＳＬＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０２）、ＭＳＬＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０３）、ＳＬＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０４）、ＬＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０５）、ＧＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０６）、ＬＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０７）、ＧＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０８）、ＬＧＬＧＬＲＫ（配列番号１０９）、ＧＬＧＬＲＫ（配列番号１１０）、ＬＧＬＲＫ（配列番号１１１）、ＧＬＲＫ（配列番号１１２）、ＬＲＫ（配列番号１１３）、ＲＫ（配列番号１１４）、又はｍが１～１５である（Ｋ）ｍ（配列番号１１５）を含有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＥＡＡＡＫ（配列番号８５）のモチーフ、例えば、複数又は反復モチーフを含有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、Ｘが任意のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｋ、又はＥ）であり得、かつｎが１～５である（ＸＰ）ｎ、及びＰＡＰＡＰ（配列番号８６）などの、プラリネリッチ配列のモチーフ、例えば、複数又は反復モチーフを含有し得る。
ペプチドスペーサーの長さ及び使用されるアミノ酸は、関与する２つのタンパク質、及び最終タンパク質融合ポリペプチドにおいて望ましい柔軟性の程度に応じて調整され得る。スペーサーの長さは、適切なタンパク質フォールディングを確保し、凝集体形成を回避するように調整され得る。
いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、ヒト血清アルブミンポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ポリペプチドにＣ末端で融合されている。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ヒト血清アルブミンにＮ末端で融合されている。ヒト血清アルブミンが、限定されるものではないが、天然発生型又は人工のジスルフィド結合を含む化学リンカーを通じて、又は可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、又はその断片及び／若しくはバリアントへの遺伝子融合によって、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドにコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、少なくとも１つのソマトメジンＢドメイン及び異種タンパク質部分を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、ＳＭＢ１を欠く。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、ＳＭＢ２を欠く。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を欠く。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が、負に帯電した骨標的化ドメインを更に欠く。
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１及び異種タンパク質部分に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、位置８１６でアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、位置８１７でアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、位置８１８でアミノ酸置換を含む。これらの位置のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換が、結果として、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性をもたらし得る。位置８１６、８１７、及び／又は８１８におけるアミノ酸置換を含むＥＮＰＰ１ポリペプチドが生成されており、これらの変異体の各々が、生物学的活性を示す。具体的には、（１）Ｒ８１８Ｈ変異、（２）Ｒ８１７Ｈ及びＲ８１８Ｈ変異、並びに（３）Ｋ８１６Ｈ、Ｒ８１７Ｈ、及びＲ８１８Ｈ変異の各々を含むＥＮＰＰ１ポリペプチドは、生物学的活性を示す。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質（例えば、イムノグロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なる要素が、所望の機能性と一致する任意の様式で配置され得る。例えば、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメインが、異種タンパク質部分に対してＣ末端に配置され得るか、又は代替的に、異種タンパク質部分が、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメインに対してＣ末端に配置され得る。可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメイン及び異種タンパク質部分が、融合タンパク質において直接的又は間接的に結合され得、追加のドメイン又はアミノ酸配列が、いずれかのドメイン又はドメイン間のＣ又はＮ末端に含まれ得る。例示的融合タンパク質が、配列番号９～１２、１２１、及び１２２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、１つ以上の異種部分を含有する。任意選択的に、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファメシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、及び有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つ以上の異種部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、更に修飾される。そのような修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及び／又はアシル化が挙げられる。結果として、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類又は単糖類、及びリン酸塩などの、非アミノ酸要素を含有し得る。可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの機能性に対するそのような非アミノ酸要素の効果は、他の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドに関して本明細書に説明されるように試験され得る。本開示のポリペプチドが、ポリペプチドの新生形態を切断することによって細胞内で生成されるとき、翻訳後処理もまた、タンパク質の正しいフォールディング及び／又は機能にとって重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３、又はＨＥＫ２９３）が、そのような翻訳後活性に対する特定の細胞機構及び特徴的な機構を有し、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの正しい修飾及び処理を確保するように選択され得る。
特定の態様では、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及びその融合タンパク質が、ポリペプチドを「安定化」することができる１つ以上の修飾を更に含み得る。「安定化」とは、減少した破壊、腎臓による減少したクリアランス、及び／又は修飾の他の薬物動態学的効果のためであるか否かにかかわらず、インビトロ半減期、血清半減期を増加させる修飾を意味する。例えば、そのような修飾は、ポリペプチドの保存寿命を増強する、ポリペプチドの循環半減期を増強する、及び／又はポリペプチドのタンパク質分解を低減する。そのような安定化修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の追加を含む）、及び炭水化物部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が挙げられる。
特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を改変するために、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの特定の変異を企図する。そのような変異は、Ｏ結合型又はＮ結合型グリコシル化部位などの、１つ以上のグリコシル化部位を導入又は排除するように選択され得る。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、概して、トリペプチド配列、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、又はアスパラギン－Ｘ－セリン（「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、これは、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識される。改変はまた、ポリペプチドの配列への１つ以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそれらによる置換（Ｏ結合型グリコシル化部位に対する）によって行われ得る。グリコシル化認識部位（及び／又は第２の位置におけるアミノ酸欠失）の第１又は第３のアミノ酸位置のうちの一方又は両方における様々なアミノ酸置換又は欠失は、結果として、修飾トリペプチド配列で非グリコシル化をもたらす。ある特定の態様では、本開示のＥＮＰＰ１ポリペプチドが、１つ以上のグリコシル化部位を導入又は排除する変異を含む。特定の実施形態では、変異が、１つ以上のＯ結合型又はＮ結合型グリコシル化部位を導入又は排除する。特定の実施形態では、変異が、１つ以上のＯ結合型グリコシル化部位を導入する。特定の実施形態では、変異が、１つ以上のＯ結合型グリコシル化部位を排除する。特定の実施形態では、変異が、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を導入する。特定の実施形態では、変異が、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を排除する。特定の実施形態では、変異が、置換及び／又は欠失変異を含む。特定の実施形態では、変異が、グリコシル化認識部位の第１又は第３のアミノ酸位置のうちの一方又は両方における置換及び／又は欠失を含む。特定の実施形態では、変異が、グリコシル化認識部位の第１のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換及び／又は欠失を含む。特定の実施形態では、変異が、グリコシル化認識部位の第３のアミノ酸位置における置換及び／又は欠失を含む。特定の実施形態では、変異が、グリコシル化認識部位の第２のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換及び／又は欠失を含む。特定の非限定的な実施形態では、変異が、グリコシル化認識部位の第２のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、グリコシル化認識部位の第２のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換が、配列番号１に対するアミノ酸残基３３２における置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸残基３３２が、Ｉ３３２Ｔ置換を含む。特定の実施形態では、Ｉ３３２Ｔ置換が、１つ以上のＯ結合型又はＮ結合型グリコシル化部位を導入する。特定の実施形態では、Ｉ３３２Ｔ置換が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのグリコシル化を増加させる。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号９又は１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に関連するようにＩ３３２Ｔ置換変異を含む。
ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドに対するグリコシドの化学的及び／又は酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリングモードに応じて、糖が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの基などの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、又はヒドロキシプロリンの基などの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンの基などの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付着され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上に存在する１つ以上の炭水化物部分の除去は、化学的及び／又は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は均等な化合物へのポリペプチドの曝露を伴い得る。いくつかの実施形態では、この治療は、結果として、アミノ酸配列を無傷のままで、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除く、大部分又は全ての糖の切断をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１３８：３５０］によって説明されるように、様々なエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物、酵母、昆虫、及び植物細胞が、全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るため、ポリペプチドの配列は、使用される発現系のタイプに応じて、適宜、調整され得る。一般に、ヒトで使用するための本開示のポリペプチドは、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞株などの、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株で発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることが期待される。
ある特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く。いくつかの実施形態では、ポリアスパラギン酸ドメイン（約２～約２０個以上の連続アスパラギン酸残基）は、負に帯電した骨標的化ドメインの非限定的な例である。いくつかの実施形態では、負に帯電した骨標的化ドメインが、８個の連続アスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインを含む。いくつかの実施形態では、負に帯電した骨標的化ドメインが、１０個の連続アスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインを含む。いくつかの実施形態では、負に帯電した骨標的化ドメインが、２個の連続アスパラギン酸残基、３個の連続アスパラギン酸残基、４個の連続アスパラギン酸残基、５個の連続アスパラギン酸残基、６個の連続アスパラギン酸残基、７個の連続アスパラギン酸残基、８個の連続アスパラギン酸残基、９個の連続アスパラギン酸残基、１０個の連続アスパラギン酸残基、１１個の連続アスパラギン酸残基、１２個の連続アスパラギン酸残基、１３個の連続アスパラギン酸残基、１４個の連続アスパラギン酸残基、１５個の連続アスパラギン酸残基、１６個の連続アスパラギン酸残基、１７個の連続アスパラギン酸残基、１８個の連続アスパラギン酸残基、１９個の連続アスパラギン酸残基、又は２０個の連続アスパラギン酸残基を含む、ポリアスパラギン酸ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、上記に説明されたように、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く（ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１１／１１３０２７号及び同第ＷＯ２０１２／１２５１８２号）。
特定の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１関連タンパク質に関する。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１関連ポリペプチドが、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ４、ＥＮＰＰ５、ＥＮＰＰ６、又はＥＮＰＰ７である。特定の非限定的な実施形態では、ＥＮＰＰ１関連ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３である。本明細書に開示されるＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３ファミリーの天然発生型ポリペプチド、及び生物学的活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合体、及び／又はペプチド模倣形態を含む）を含む。
当業者であれば、ＥＮＰＰ３ポリペプチドの様々なドメインに対応する残基が変化し得ることを認識するであろう。具体的には、ポリペプチドドメインの識別は、タンパク質配列及び／又は構造に古典的に基づく。ポリペプチド配列及び／又は構造が、関連するポリペプチドドメインを識別するために使用され得る（すなわち、ポリペプチドは、他のタンパク質構造又はドメインと配列及び／又は構造類似性を有し得る）。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のＳＭＢ１ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７ ４８、４９、５０、又は５１のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のＳＭＢ１ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基４６の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸残基９１の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のＳＭＢ１ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基４６～９１を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のＳＭＢ２ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、又は９７のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、又は１４０のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のＳＭＢ２ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基９２の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸残基１３５の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のＳＭＢ２ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基９２～１３５を含む。
いくつかの実施形態では、第１のリンカードメイン（図７に示される「Ｌ１」）が、配列番号１１６のアミノ酸１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、又は１３９のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、又は１６３のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３の第１のリンカードメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基１３６の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸残基１６０の上流又は下流のアミノ酸残基±３残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３の第１のリンカードメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基１３６～１６０を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３の触媒ドメイン（ホスホジエステラーゼドメイン）が、配列番号１１６のアミノ酸１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、又は１６３のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、又は５５０のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３の触媒ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基１６１の上流又は下流のアミノ酸残基±１０残基で始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸残基５４５の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒ドメインが、配列番号１１６の残基１６１～５４５を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のヌクレアーゼ様ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸５７５、５７６、５７７、５７８、５７９ ５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、又は５８５のうちのいずれか１つで始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、又は８７５のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３のヌクレアーゼ様ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸残基５８３の上流又は下流のアミノ酸残基±５残基で始まり、かつ配列番号１１６のアミノ酸残基８７５の上流又は下流のアミノ酸残基±２残基で終わるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ様ドメインが、配列番号１１６の残基５８３～８７５を含む。
特定の実施形態では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、減少した免疫原性を有するように、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの細胞外ドメインに欠失を導入することを企図する。いくつかの実施形態では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、減少したタンパク質凝集を有するように、ＥＮＰＰ３ポリペプチドの細胞外ドメインに欠失を導入することを企図する。例えば、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインは、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基の増加した数に起因して、凝集し易い場合がある。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ１を欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ２を欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２の両方を欠く。特定の場合、ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを更に欠く。
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３ポリペプチドの前駆体の分泌を結果的にもたらすシグナルペプチドを含み、これは、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをもたらすタンパク質分解プロセシングを経る。他の実施形態では、シグナルペプチドは、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ５、及びＥＮＰＰ７のシグナルペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の膜貫通ドメインを含むＥＮＰＰ３ポリペプチドと、非限定的な例として、ＥＮＰＰ２などの別のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ２膜貫通ドメインを含む前駆体ＥＮＰＰ３ポリペプチドの切断産物を含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ２膜貫通ドメインが、アミノ酸配列ＩＩＳＬＦＴＦＡＶＧＶＮＩＣＬＧＦＴＡ（配列番号２０）を含む。
いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３ポリペプチドのホモ二量体化を低減する１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、ＳＭＢ１及び／又はＳＭＢ２の欠失）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、ホモ二量体化を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、低減したホモ二量体化能力を有していない。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、野生型ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％をホモ二量体化する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して低減されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ヒトＩＲに対するＥＮＰＰ３の親和性を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、ヒトＩＲに対するＥＮＰＰ３の親和性を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減する。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３のホスホジエステラーゼ触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ１を欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドのＳＭＢ１ドメインは、配列番号１１６の残基４５～９０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号１１６の残基９１～８７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ２を欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドのＳＭＢ２ドメインは、配列番号１１６の残基９２～１３５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号１１６の残基４６～９１及び配列番号１１６の残基１３６～８７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ２及び第１のリンカードメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２を欠く。例えば、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドのＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインは、配列番号１１６の残基４６～１３５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号１１６の残基１３６～８７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢ１、ＳＭＢ２、及び第１のリンカードメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示すように、ＥＮＰＰ３ポリペプチドの細胞外ドメインに１つ以上の変異を更に含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１及び２のうちの一方又は両方を欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ヌクレアーゼドメインを欠く。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ヌクレアーゼドメインを除去するように切断される。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号１１６に対するおよそ残基５８３～およそ残基８７５のヌクレアーゼドメインを除去するように切断され、配列番号１１６に対するおよそ残基１６１～およそ残基５４５の触媒ドメインのみを残し、これは、タンパク質の触媒活性を保存するように機能する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、本明細書に説明される触媒及び／又はヌクレアーゼドメインにおける１つ以上の置換などの、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの１つ以上のドメインにおける置換を更に導入することを企図する。
ある特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３膜貫通ドメインを欠くＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを含み、ＥＮＰＰ３膜貫通ドメインが、除去され（及び／又は切断され）、非限定的な例として、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ５、及び／又はＥＮＰＰ７などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインで置き換えられている。
いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３ポリペプチドドメイン及び１つ以上の異種タンパク質部分（すなわち、ＥＮＰＰ３に対して異種のポリペプチドドメイン）を含む融合タンパク質である。アミノ酸配列が、配列番号１１６によって表されるＥＮＰＰ３の形態で一意に見出されない場合、ＥＮＰＰ３に対して異種であることが理解される。いくつかの実施形態では、異種タンパク質部分が、イムノグロブリンのＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、イムノグロブリンのＦｃドメインが、ＩｇＧ１イムノグロブリンのＦｃドメインである。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ヒトイムノグロブリン１（ＩｇＧ１）、ヒトイムノグロブリン２（ＩｇＧ２）、ヒトイムノグロブリン３（ＩｇＧ３）、及び／又はヒトイムノグロブリン４（ＩｇＧ４）のＦｃドメインにＣ末端融合される。他の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ヒトイムノグロブリン１（ＩｇＧ１）、ヒトイムノグロブリン２（ＩｇＧ２）、ヒトイムノグロブリン３（ＩｇＧ３）、及び／又はヒトイムノグロブリン４（ＩｇＧ４）のＦｃドメインにＮ末端融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの存在が、野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、半減期、可溶性を改善し、免疫原性を低減し、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの活性を増加させる。特定の実施形態では、天然ヒトＩｇＧタンパク質（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）の部分が、Ｆｃ部分（例えば、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ）の代わりに使用され得る。例えば、本開示は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／又はＩｇＧ４に由来するＣＨＩ、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメインなどの、イムノグロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合されたＥＮＰＰ３を含む融合タンパク質を提供する。Ｆｃ断片は、ヒンジ領域（Ｒａｂａｔナンバリングシステムによる、ヒトＩｇＧ１の残基２１６～２３０）などの天然ＩｇＧの領域、第２の定常ドメインＣＨ２（残基２３１～３４０）全体、及び第３の定常ドメインＣＨ３（残基３４１～４４７）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、バリアントＦｃ定常領域を含む。ＥＮＰＰ３融合Ｆｃドメイン及びＦｃ定常領域は、上記に説明されるように誘導された天然定常領域と比較して、アミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含み得る。ＥＮＰＰ３融合は、１つ以上のドメインを含む異種タンパク質部分、及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドドメインと上記に説明された群から選択される１つ以上の異種タンパク質部分（例えば、Ｆｃイムノグロブリンドメイン）との間に位置付けられたリンカー若しくはスペーサーを含み得る。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド配列と参照配列との間の「同一性」パーセントは、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じて配列を整列させてギャップを導入した後、参照配列中のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、又はＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術内である様々な方式で達成され得る。いくつかの実施形態では、整列は、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して実施される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。
本開示は、変異体、特に可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセット、並びに切断変異体を生成する方法を更に企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、無機ピロリン酸へのヌクレオチドの変換）ＥＮＰＰ１配列を識別するために特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする目的は、例えば、改変された薬物動態又は改変された安定性（例えば、より大きいタンパク質分解抵抗性）などの、改変された特性を有するポリペプチドバリアントを生成することであり得る。様々なスクリーニングアッセイが以下に提供され、そのようなアッセイは、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、増加したプロテアーゼ（例えば、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ）に対するタンパク質分解抵抗性、又は減少した抗薬物抗体の形成（例えば、減少した免疫原性）についてスクリーニングされ得る。本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰのうちの１つ以上に結合する能力、又は細胞外ヌクレオチド三リン酸を加水分解して、無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を産生する能力について更にスクリーニングされ得る。
いくつかの実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの活性はまた、細胞ベース又はインビボアッセイでも試験され得る。例えば、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の生成に対する可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの効果が測定され得る。具体的には、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３タンパク質のピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼドメインは、細胞外ヌクレオチド三リン酸を加水分解して、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を生成し、概して、可溶性である。この活性は、上記に説明されたように、ｐＮＰ－ＴＭＰアッセイ、及びＨＰＬＣベースＡＴＰ加水分解アッセイを使用して測定され得る（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（１０）：３３５２－６２、Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．６：１０００６）。ＡＲＨＲ２（例えば、骨芽細胞及び破骨細胞における線維芽細胞成長因子２３の転写）などのＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３関連疾患に関与する遺伝子の発現に対する可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの効果が評価され得る。これは、必要に応じて、１つ以上のヌクレオチド三リン酸、又は他のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３基質の存在下で実施され得、細胞は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを産生するようにトランスフェクトされ得る。同様に、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、マウス又は他の動物に投与され得、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３関連疾患に対する効果が、当技術分野で認識された方法を使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、増加したプロテアーゼ（例えば、トリプシン若しくはトリプシン様プロテアーゼ）に対するタンパク質分解抵抗性、又は参照ＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して減少した抗薬物抗体の形成（例えば、減少した免疫原性）を有する、コンビナトリアル由来バリアントが生成され得る。そのようなバリアントは、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子療法プロトコルに使用され得る。同様に、変異誘発が、対応する非修飾ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じさせ得る。例えば、改変されたタンパク質は、タンパク質分解又は未修飾ポリペプチドの破壊若しくは別様の不活性化を結果的にもたらす他の細胞プロセスに対して、より安定になるか、又はあまり安定ではなくなり得る。そのようなバリアント、及びそれらをコードする遺伝子は、ポリペプチドの半減期を調節することによってポリペプチド複合体レベルを改変するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的効果を生じさせ得、誘導性発現系の一部であるとき、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルのより緊密な制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異がリンカー（存在する場合）及び／又はＦｃ部分で作製されて、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの半減期を改変し得る。
いくつかの実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、各々が潜在的なＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド配列の少なくとも一部分を含むポリペプチドのライブラリをコードする遺伝子の縮重ライブラリによって生成され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、ヌクレオチド配列をコードする潜在的なＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、又は代替的に、より大きい融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ用）として発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的にライゲーションされ得る。
潜在的な相同体のライブラリが縮重オリゴヌクレオチド配列から生成され得る多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で実施され得、合成遺伝子は、次いで、発現のための適切なベクターにライゲーションされ得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である［Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３－２８９、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、及びＩｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７］。そのような技術は、他のタンパク質の指向性進化に用いられてきた［Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９－２４３３、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４－４０６、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８－６３８２、並びに米国特許第５，２２３，４０９号、同第 ５，１９８，３４６号、及び同第５，０９６，８１５号］。
あるいは、他の形態の変異誘発が、コンビナトリアルライブラリを生成するために利用され得る。例えば、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、例えば、アラニンスキャニング変異誘発［Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５－１５７２、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５－３０９９、Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９－１１８、Ｇｒｏｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７－６０１、Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８－２８９２、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２－１０８３８、及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５］、リンカースキャニング変異誘発［Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３－６６０、及びＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４－２６５２、ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６］、飽和変異誘発［Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３］、ＰＣＲ変異誘発［Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１－１９］、又は化学的変異誘発を含むランダム変異誘発［Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、及びＧｒｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２－３４］を使用してスクリーニングすることによってライブラリから生成及び単離され得る 特にコンビナトリアル設定におけるリンカースキャニング変異誘発は、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの変異又は切断（生物活性）形態を識別する別の潜在的な方法である。
点変異及び切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするために、また、この点に関して、特定の特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために、当技術分野で幅広い技術が知られている。そのような技術は、概して、ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリの迅速スクリーニングに適合可能である。大規模遺伝子ライブラリをスクリーニングするために最も広く使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、ベクターの結果的に得られたライブラリで適切な細胞を形質転換することと、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現することと、を含む。
当業者によって認識されるように、本明細書に説明される変異、バリアント、及び／又は修飾の大部分が、核酸レベルで、又はいくつかの場合、翻訳後修飾又は化学合成によって行われ得る。そのような技術は、当技術分野で周知であり、それらのうちのいくつかが本明細書に説明されている。部分的には、本開示は、本明細書に説明される開示の範囲内で、他の可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを生成及び使用するためのガイダンスとして使用され得る可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの機能的に活性な部分（断片）及びバリアントを識別する。
ある特定の実施形態では、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの機能的に活性な断片は、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えで産生されるポリペプチドをスクリーニングすることによって取得され得る。加えて、断片は、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相Ｆｍｏｃ又はｔ－Ｂｏｃ化学などの、当技術分野で公知の技術を使用して化学合成され得る。断片は、（組換えで又は化学合成によって）産生され、特にプロテアーゼ（例えば、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ）又は抗薬物抗体の形成（例えば、低減した免疫原性）に対するタンパク質分解抵抗性に関して、機能的特徴を有するそれらのペプチジル断片を識別するために試験され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明される方法に従って使用されるＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。本明細書で使用される場合、単離されたタンパク質又はポリペプチドは、その自然環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）分析によって決定される際に、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える純度に精製される。純度の評価のための方法は、当技術分野で周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７参照］。いくつかの実施形態では、本明細書に説明される方法に従って使用される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。
本開示のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、様々な当技術分野で公知の技術によって産生され得る。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）及びＧｒａｎｔ Ｇ．Ａ（ｅｄ．），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）に説明されるものなどの、標準タンパク質化学技術を使用して合成され得る。加えて、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。あるいは、断片及び／又はそのバリアントを含む、本開示のポリペプチドは、当技術分野で周知であるように、様々な発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス、Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ］を使用して組換えで産生され得る。タンパク質は、接着又は懸濁細胞のいずれかで産生され得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞で発現される。安定した細胞株を確立するために、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３構築物をコードする核酸配列は、大規模なタンパク質産生のための適切なベクターにクローニングされる。更なる実施形態では、本開示の修飾又は非修飾ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、又は対の塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することによる、組換えで産生された全長ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの消化によって産生され得る。コンピュータ分析（例えば、市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）が、タンパク質切断部位を識別するために使用され得る。あるいは、そのようなポリペプチドは、化学切断（例えば、シアノゲンブロミド、ヒドロキシルアミンなど）を使用して、組換えで生成された全長ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドから産生され得る。
多くの発現系が、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｎｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞、動物細胞、及び昆虫細胞を含む、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３融合タンパク質の産生に使用され得る。所望のタンパク質は、従来の方式で、例えば、宿主染色体又は遊離プラスミドに挿入されたコード配列から産生され得る。
酵母は、通常の方式（例えば、エレクトロポレーション）のいずれかで、所望のタンパク質のコード配列を用いて形質転換され得る。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｇｕａｒｅｎｔｅ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２に開示されている。正常に形質転換された細胞、すなわち、本開示のＤＮＡ構築物を含有する細胞は、周知の技術によって識別され得る。例えば、発現構築物の導入から結果的に得られる細胞が、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを産生するために成長され得る。細胞が採取され、溶解され得、それらのＤＮＡ含有量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，９８：５０３及び／又はＢｅｒｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：２０８に説明される方法などの方法を使用して、ＤＮＡの存在について調べた。あるいは、上清中のタンパク質の存在は、抗体を使用して検出され得る。
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３－４０６及びｐＲＳ４１３－４１６が挙げられ、一般にｆｒｏｎｔ Ｓｔｒａｔｉｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡで入手可能なプラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、及びｐＲＳ４０６は、Ｙｅａｓｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇプラスミド（Ｙｉｐｓ）で、酵母を選択可能なマーカーＩ－１１Ｓ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、及び１ＪＲＡ３を組み込むものである。プラスミドｐＲＳ４１３－４１６は、Ｙｅａｓｔ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
相補的凝集末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に結合する様々な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマー経路が、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに添加され得る。ベクター及びＤＮＡセグメントは、次いで、相補的なホモポリマーテール間の水素結合によって結合されて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
１つ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに結合する代替的な方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ又はＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩで処理され、これらの酵素は、３’－５’－核酸分解活性によって、突出する３’－一本鎖末端を除去し、それらの重合活性によって、陥凹３’－末端に埋め合わせをする酵素である。
したがって、これらの活性の組み合わせは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。次いで、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下で、大きいモル過剰のリンカー分子とインキュベートする。結果として、反応の産物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を担持するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、ＤＮＡセグメントのものと適合する末端を産生する酵素で切断された発現ベクターにライゲーションされ得る。
次いで、単一の安定的にトランスフェクトされた細胞のクローンが確立され、所望のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３融合タンパク質の高発現クローンについてスクリーニングされる。ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３タンパク質発現のための単一細胞クローンのスクリーニングは、上記に説明される合成酵素基質ｐＮＰ－ＴＭＰを使用して、９６ウェルプレートでハイスループット様式で達成され得る（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６）。スクリーニングを通じた高発現クローンの識別時、タンパク質産生が、Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６で上記に説明される振盪フラスコ又はバイオリアクターにおいて達成され得る。
ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３の精製は、当技術分野で既知の標準的な精製技術の組み合わせを使用して達成され得る。精製後、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ及び／又はＥＮＰＰ３－Ｆｃは、５～７ｍｇ／ｍｌに濃縮されたＺｎ２＋及びＭｇ２＋（ＰＢＳｐｌｕｓ）を補充したＰＢＳに透析し、－８０℃で２００～５００ｐｌのアリコート中で凍結され得る。アリコートは、使用直前に解凍され得、溶液の比活性は、ＰＢＳｐｌｕｓ中で希釈することによって３１．２５ａｕ／ｍｌ（又は調製物に応じて約０．７ｍｇ／ｍｌ）に調整され得る。
３．ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸
特定の実施形態では、本開示は、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド（断片、機能的バリアント、及び／又はその融合タンパク質を含む）をコードする単離及び／又は組換え核酸を提供する。対象の核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよい。そのような核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってもよい。これらの核酸は、例えば、本明細書に説明される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを生成するための方法で使用され得る。
本明細書で使用される場合、単離された核酸は、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常、核酸分子を含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
ある特定の実施形態では、本開示のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１４又は配列番号１５のバリアントである核酸を含むことが理解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントを含む１つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失によって異なる配列を含み、それゆえに、配列番号１４又は配列番号１５に指定されるヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むことになる。
特定の実施形態では、本開示のＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１４又は配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である単離された及び／又は組換え核酸配列によってコードされる。当業者であれば、配列番号１４又は配列番号１５、並びにそのバリアントに相補的な配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である核酸配列も、本開示の範囲内であることを理解するであろう。更なる実施形態では、本開示の核酸配列は、異種ヌクレオチド配列と単離、組換え、及び／又は融合されるか、又はＤＮＡライブラリに存在し得る。
他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号１４若しくは配列番号１５に指定されたヌクレオチド配列、配列番号１４若しくは配列番号１５の相補体配列、及び／又はその断片に対して、高度に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上記に論じられたように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性条件が変更され得ることを容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性条件が変更され得ることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを実施し、続いて５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄し得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低い厳密性から５０℃で約０．２×ＳＳＣの高い厳密性で選択され得る。加えて、洗浄工程の温度は、約２２℃の室温の低い厳密性条件から、約６５℃の高い厳密性条件まで増加し得る。温度及び塩の両方が変更されてもよく、又は温度若しくは塩濃度は、他方の変数が変化する間、一定に維持されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣ、その後の室温における２×ＳＳＣの洗浄の低い厳密性条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
配列番号１４又は配列番号１５に記載される核酸とは遺伝子コードにおける縮重が異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸は、１つよりも多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を又は同義語を指定するコドン（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣは、ヒスチジンの同義語である）は、結果としてタンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」変異をもたらし得る。しかしながら、対象のタンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型は、哺乳動物細胞の間に存在することになると予想される。当業者であれば、特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３～５％まで）におけるこれらの変形例が、天然の対立遺伝子変化に起因して、所与の種の個体の間に存在し得ることを理解するであろう。任意の及び全てのそのようなヌクレオチドの変形例及び結果として生じるアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に結合され得る。調節ヌクレオチド配列は、発現に使用される宿主細胞に一般的に適切になる。数多くのタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列が当技術分野で公知であり、様々な宿主細胞で使用され得る。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダー若しくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、並びに／又はエンハンサー若しくはアクチベーター配列を含み得る。当技術分野で既知の構成的又は誘導性プロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然発生型プロモーター、又は１つよりも多いプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであってもよい。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在してもよく、又は発現構築物は、染色体に挿入されてもよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変化し得る。
特定の態様では、本明細書に開示される対象の核酸は、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに提供され、少なくとも１つの調節配列に作動可能に結合される。調節配列は、当技術分野で認識され、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの発現を指示するように選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に説明される。例えば、ＤＮＡ配列に作動可能に結合されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様な発現制御配列のいずれかが、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現するために、これらのベクターで使用され得る。そのような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルス又はサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、又はＴＲＣ系、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって発現が指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α－交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、及び原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、並びにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び／又は発現されることが望まれるタンパク質のタイプとしてのそのような因子に依存し得ることが理解されるべきである。更に、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現もまた、検討されるべきである。
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子、又はその一部分を、原核細胞、真核細胞のいずれか（酵母、鳥類、昆虫、又は哺乳動物）、又は両方で発現に好適なベクターにライゲーションすることによって産生され得る。組換えＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの産生の発現ビヒクルは、プラスミド及び他のベクター（例えば、ウイルス）を含む。例えば、好適なベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミドのタイプのプラスミドが挙げられる。
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を容易にするための原核配列と、真核細胞で発現される１つ以上の真核転写ユニットとの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちのいくつかは、原核及び真核細胞の両方における複製及び薬物抵抗性の選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）、又はエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）などのウイルスの誘導体が、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子療法送達系の説明において以下に見出される。プラスミドの調製及び宿主生物体の形質転換に用いられる様々な方法が、当技術分野で周知である。原核及び真核細胞の両方に対する他の好適な発現系、並びに一般的な組換え手順、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）について。いくつかの事例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現することが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩを含有するβ－ｇａｌなど）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）、及びｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ）などの、ＣＨＯ細胞における対象のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの産生のために設計されることになる。明らかであろうように、対象の遺伝子構築物は、例えば、精製のために融合タンパク質又はバリアントタンパク質を含むタンパク質を産生するために、培養物中で増殖する細胞において対象のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの発現を指示及び／又は制御する少なくとも１つの核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、シグナルペプチドに融合された本明細書に開示されるＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを含むポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、細胞からの分泌時にタンパク質分解的に処理されて、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをもたらす。
遺伝子療法に利用され得る様々なウイルスベクターは、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド配列を含み得る。ある特定の修飾ウイルスは、哺乳動物への投与後、ウイルスが細胞に感染し、コードされたタンパク質を発現するため、コード配列を担持するためのベクターとしてしばしば使用される。本発明による有用な修飾ウイルスは、例えば、以下：パルボウイルス、ピコルナウイルス、仮性狂犬病ウイルス、Ａ型、Ｂ型、又はＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ポリオーマ及びＳＶ４０など）又はヘルペスウイルス（エプスタイン－バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹及び単純ヘルペスウイルス１型及び２型）、ＲＮＡウイルス、又はモロニーマウス白血病ウイルス若しくはレンチウイルスなどのレトロウイルス（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、若しくはウマ感染性貧血ウイルス）を含むウイルスに由来する。本発明による有用なＤＮＡウイルスには、以下がある：アデノ随伴ウイルスアデノウイルス、アルファウイルス、及びレンチウイルス。
ウイルスベクターは、一般的に注射により投与され、最も頻繁には、静脈内（ＩＶ）で体に直接、又は特定の組織に直接投与され、そこでは個々の細胞によって取り込まれる。あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボでウイルスベクターを患者の細胞の試料と接触させることによって投与されてもよく、それによってウイルスベクターが細胞を感染させることを可能にし、次いでベクターを含む細胞が患者に戻される。ウイルスベクターが送達されると、コード配列が発現され、機能性タンパク質がもたらされる。概して、ウイルスベクターによる細胞の感染及び形質導入は、ウイルスカプシドの標的細胞表面上の受容体との相互作用、エンドサイトーシスによる内在化、エンドサイトーシス／プロテアソーム区画を通した細胞内輸送、エンドソーム脱出、核輸入、ビリオン脱殻、並びに組換えコード配列対象の転写及び発現につながるウイルスＤＮＡ二重鎖変換という一連の連続的な事象によって生じる。（Ｃｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７ Ｄｅｃ １；８：８７－１０４．）。
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科のデパノウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは約４．７キロベースの長さであり、ポジティブ又はネガティブセンスのいずれかであり得る直鎖一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端反復（ＩＴＲ）、並びに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。ｒｅｐフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要な非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする４つの重複遺伝子からできている。ｃａｐフレームは、構造ＶＰカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含み、それらは一緒に相互作用して、正二十面体型カプシドを形成する。
末端１４５ヌクレオチドは、自己相補的であり、Ｔ字形状のヘアピンを形成する、エネルギー的に安定した分子内二本鎖が形成され得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起源として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役目を果たす。哺乳動物細胞における野生型ＡＡＶ感染に続いて、ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製において機能を有する。ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳動物細胞におけるＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする非スプライシングｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター産生に十分であることが示されている。また、昆虫細胞では、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター産生に十分である。
ＡＡＶベクターは、典型的にはｒｅｐ及びｃａｐフレームを欠いている。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在する場合、複製及び感染性ウイルス粒子中にパッケージングされてもよく、宿主細胞は、アデノウイルスオープンリーディングフレームＥ４ｏｒｆ６からタンパク質をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされている。
一実施形態では、本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする配列を含むＡＡＶ発現ベクターに関し、哺乳動物に投与すると、ベクターは、細胞内のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチド前駆体を発現し、前駆体は、そのカルボキシ末端で可溶性ＥＮＰＰ１のアミノ末端に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含む。可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド前駆体は、ＩｇＧ Ｆｃ領域又はヒトアルブミンなどの安定化ドメインを含み得る。細胞から前駆体が分泌されると、シグナルペプチドは、切断され、酵素的に活性な可溶性ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３は、細胞外に提供される。
ＡＡＶ発現ベクターは、アズロシジンシグナルペプチド配列及び可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする組換え核酸配列に作動可能に結合された転写調節領域を含むヌクレオチド配列に作動可能に結合された転写調節領域を含む発現カセットを含み得る。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、プロモーター及びエンハンサー、コザック配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、他の好適な調節エレメント、並びにポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるＡＡＶベクターのＡＡＶ組換えゲノムは、ｒｅｐオープンリーディングフレーム及び／又はｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。
本開示によるＡＡＶベクターは、任意の血清型に由来するカプシドを含む。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一の遺伝的機能のセットを提供し、実質的に同一の機序を介して複製及びアセンブリする。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａ及び３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、又はヒツジＡＡＶの血清型１に属し得る。
異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）、及びＡＸ７５３３６２．１（ＡＡＶ１０）。
いくつかの実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型に由来するカプシドを含む。別の実施形態では、ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ８である。ウイルスベクターがカプシドタンパク質をコードする配列を含む場合、これらは、ＡＡＶを１つ若しくは複数の特定の細胞型に配向するために、又は標的ベクターの細胞への送達の効率を増加させるために、又はＡＡＶの精製若しくは検出を促進するために、又は宿主応答を低減するために、外因性配列を含むように修飾され得る。
その内容が参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる公開された出願であるＳｍｉｔｈらのＵＳ２０１７／０２９０９２６は、ＡＡＶベクターが生成、送達、及び投与されるプロセスを詳細に説明している。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、本明細書に教示されるように遺伝子療法に利用され得る。アデノウイルスは、所望の遺伝子産物（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド）をコード及び発現するように操作され得、同時に、正常な溶解ウイルスライフサイクルで複製するその能力に関して不活性化される。加えて、アデノウイルスは、気道上皮に対して天然指向性を有する。ウイルスは、気道に見られるような静止細胞に感染することができ、レトロウイルスよりも大きい利点を提供する。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体へのウイルスＤＮＡの組み込みなしで達成され、それによって、挿入変異誘発に関する懸念を軽減する。更に、アデノウイルスは、長年にわたって、優れた安全性プロファイルを有する生腸菌ワクチンとして使用されてきた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３－２３８）。最後に、アデノウイルス介在性遺伝子導入は、アルファ－１－アンチトリプシン及びＣＦＴＲのコットンラットの肺への導入を含むいくつかの事例で実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ＭＡ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５）。更に、アデノウイルスをヒトの癌の原因物質として確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：６６０６）。
偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）－ＰＡＶは、アデノウイルス逆位末端反復と、ヘルパーウイルス依存性のベクターの複製及びパッケージングに必要な最小のアデノウイルス５’配列と、を含有する。これらのベクターは、潜在的に有害なウイルス遺伝子を含有せず、３６ｋｂ近い異物に対する理論的容量を有し、合理的に高い力価で産生され、分裂及び非分裂ヒト標的細胞型に対する親ウイルスの指向性を維持し得る。ＰＡＶベクターは、プラスミド媒介性構築物、又は感染性ウイルス粒子のいずれかとして維持され得る。プラスミド構築物として、ＰＡＶは、野生型又は欠損型ヘルパーウイルスのいずれかによる、これらの配列及び任意の所望の追加の外因性遺伝物質の効率的な複製及びパッケージングに必要な野生型アデノウイルスタイプ２からの最小限の配列から構成される。
その内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＧｒｅｇｏｒｙらの米国特許公開第７，３１８，９１９号は、アデノウイルスベクターが生成、送達されるプロセス、及び疾患治療のためのそれらの対応する使用について詳細に説明している。本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又は可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチドを必要としている対象にそれを送達するためのアデノウイルスベクターの使用、並びにそれを使用する治療方法を企図している。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスベクター（ＨＳＶベースのウイルスベクター）は、本明細書に教示されるように遺伝子療法に利用され得る。ＨＳＶベースのウイルスベクターは、核酸配列を多数の細胞型に導入するためのベクターとしての使用に好適である。成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである線形二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する、エンベロープされた二面体カプシドからなる。別の実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、少なくとも１つの必須ＨＳＶ遺伝子を欠損している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの必須ＨＳＶ遺伝子が欠損しているＨＳＶベースのウイルスベクターは、複製欠損である。大部分の複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために、１つ以上の最初期、初期、又は後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期ＤＮＡ発現を結果的にもたらし得る潜伏段階に入るその能力、及び最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡ挿入を収容し得るその大きいウイルスＤＮＡゲノムである。
ＨＳＶベースのベクターは、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎらの米国特許第５，８３７，５３２号、Ｗｉｃｋｈａｍらの同第５，８４６，７８２号、及びＤｅｌｕｃａらの同第５，８０４，４１３号、並びにＰｒｅｓｔｏｎらの国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、Ｐｒｅｓｔｏｎらの同第ＷＯ９６／０４３９４号、Ｄｅｌｕｃａらの同第ＷＯ９８／１５６３７号、及びＧｌｏｒｉｏｓｏらの同第ＷＯ９９／０６５８３号に説明され、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＨＳＶベクターは、ＨＳＶゲノムの早期領域のみ、ＨＳＶゲノムの最初期領域のみ、ＨＳＶゲノムの後期領域のみ、又はＨＳＶゲノムの早期及び後期領域の両方の複製必須遺伝子機能を欠損し得る。ＨＳＶベクターの産生は、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学的技術を使用することを伴う。
複製欠損ＨＳＶベクターは、典型的には、複製欠損ＨＳＶベクターには存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を、ウイルスベクターストックの高い力価を生成するために適切なレベルで提供する相補細胞株で産生される。タンパク質をコードする核酸配列の発現は、核酸配列に作動可能に結合された好適な発現制御配列によって制御される。「発現制御配列」は、別の核酸配列の発現（典型的には、かつ好ましくは転写）を促進、増強、又は制御する任意の核酸配列である。
好適な発現制御配列としては、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、及びエンハンサーが挙げられる。ベクター中のタンパク質をコードする核酸配列は、その内因性プロモーターによって、又は好ましくは、非天然プロモーター配列によって調節され得る。好適な非天然プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期プロモーター（ＨＣＭＶ ＩＥｐ）などのＨＣＭＶプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復プロモーターなどのＨＩＶ由来のプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復などのＲＳＶプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーター、又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，７８，１４４４－１４４５（１９８１））、ＳＶ４０又はエプスタインバーウイルス由来のプロモーターなどが挙げられる。別の実施形態では、プロモーターは、ＨＣＭＶ ＩＥｐである。
プロモーターはまた、誘導性プロモーター、すなわち、適切なシグナルに応答して上方及び／又は下方調節されるプロモーターであってもよい。例えば、薬学的剤によって上方調節される発現制御配列は、疼痛管理用途において特に有用である。例えば、プロモーターは、薬学的誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンに応答する）であり得る。プロモーターは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ゲノムの所与の領域における固有の制限部位の導入によって、ベクターのゲノム内に導入され得る。
その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｌｏｒｉｏｓｏらの米国特許公報ＵＳ７，５３１，１６７には、Ｈｅｒｐｅｓシンプレックスベクターが生成、送達されるプロセス、及び疾患治療のためのそれらの対応する使用について詳細に説明されている。本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチドを必要としている対象にそれを送達するための単純ヘルペスベクターの使用、並びにそれを使用する治療方法を企図している。
いくつかの実施形態では、アルファウイルス発現ベクターが、本明細書に教示されるように遺伝子療法に利用され得る。アルファウイルス発現ベクターは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、及びベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスを含む、異なるタイプのアルファウイルスから開発されてきた。アルファウイルスレプリコンは、その５’末端に、ウイルスＲＮＡが細胞内にトランスフェクトされたときに翻訳されるウイルス複製体（Ｒｅｐ）をコードするオープンリーディングフレームを含有する。Ｒｅｐは、ポリタンパク質として発現され、その後、４つのサブユニット（ｎｓｐｓ１～４）に処理される。未処理Ｒｅｐは、ＲＮＡベクターをマイナス鎖ＲＮＡにコピーし得、これは、トランスフェクション又は感染後最初の３～４時間の間のみ行われるプロセスである。処理されると、Ｒｅｐは、より多くのレプリコン分子を合成するためのテンプレートとして、マイナス鎖ＲＮＡを使用することになる。処理されたＲｅｐは、マイナス鎖ＲＮＡの内部配列、又はサブゲノムプロモーターを認識し、そこから、レプリコンの３’末端に対応するサブゲノムプラス鎖ＲＮＡを合成することになる。このサブゲノムＲＮＡは、翻訳されて、異種タンパク質を大量に産生することになる。
ｎｓｐ２（ｎｓｐ２中のＳＩＮ Ｐ７２６Ｌベクター）中の位置７２６の単一アミノ酸変化（Ｌに対するＰ）を含有するＳＩＮから単離された非細胞変性変異体は、Ｒｅｐハイパープロセシングを示した（Ｆｌｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｖｉｒａｌ．７３：３８５４－６５）。この変異体は、ＢＨＫ細胞において連続複製を効率的に確立することができた。この非細胞変性ＳＩＮベクターは、良好な安定性レベル、及び元のＳＩＮベクターで取得されたレベルの約４％であった発現レベルを有する長期間の導入遺伝子発現を提供することができるため、インビトロで広く使用されている（Ａｇａｐｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１２９８９－９４）。同様に、Ｓｍｅｒｄｏｕらの特許出願第ＷＯ２００８０６５２２５号は、非細胞変性ＳＦＶベクターが、複製ｎｓｐ２サブユニット中に変異Ｒ６４９Ｈ／Ｐ７１８Ｔを有すると説明している。上述のベクターは、その抵抗性遺伝子がアルファウイルスベクターに組み込まれる抗生物質の存在下で培養することによって、関心対象の遺伝子を構成的かつ安定的に発現することができる細胞株を取得することを可能にする（Ｃａｓａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３７６：２４２－５１）。
本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドなどの関心対象の遺伝子の配列が、部位特異的組換えの認識配列とともに組み込まれている、アルファウイルスレプリコンに相補的なＤＮＡ配列を含むベクターを設計することを企図する。そのベクターによって、関心対象の遺伝子の配列を含むアルファウイルスレプリコンが細胞ゲノム内に組み込まれた細胞を取得及び選択することができ、その結果、細胞は、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを安定的に発現する。本発明はまた、アルファウイルスレプリコンが誘導性プロモーターの制御下にある発現ベクターを生成することも企図する。所与のリガンドの存在下で、アルファウイルスレプリコン転写を調節するプロモーターの活性を正に調節することができる転写アクチベーターをコードする発現カセットを組み込むことによって更に修飾されている細胞に組み込まれたときのベクター。
その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｒａｎｄａらの米国特許公報ＵＳ１０，０１１，８４７には、アルファウイルスベクターが生成、送達されるプロセス、及び疾患治療のためのそれらの対応する使用が詳細に説明されている。本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードするヌクレオチドを必要としている対象にそれを送達するためのアルファウイルスベクターの使用、並びにそれを使用する治療方法を企図している。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが、本明細書に教示されるように遺伝子療法に利用され得る。レンチウイルスは、レトロウイルス科のウイルス属に属し、長いインキュベーション期間によって特徴付けられる。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡ内に相当量のウイルスＲＮＡを送達し、非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの中でも独自の能力を有し得る。レンチウイルスベクター、特にＨＩＶ－１由来のベクターは、広く研究されており、頻繁に使用されるベクターである。レンチウイルスベクターバックボーンの進化、及び組換えＤＮＡ分子（導入遺伝子）を標的細胞内に送達するウイルスの能力は、遺伝子療法及びインビトロの組換えタンパク質産生で機能的遺伝子の復元におけるそれらの使用につながっている。
本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドなどの関心対象のタンパク質を発現する好適なプロモーター及び導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを企図する。典型的には、ベクターのバックボーンは、ＳＩＶ１又はアフリカミドリザルＳＩＶ（ＳＩＶ－ＡＧＭ）などの、類人猿免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来である。一実施形態では、プロモーターは、好ましくは、ハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターである。本発明は、レンチウイルスベクターの製造方法、関心対象の遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを含む組成物、並びに石灰化又は骨化の疾患を治療するために可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを発現する遺伝子療法における使用を包含する。本発明によるレンチウイルスベクターは、治療用タンパク質の分泌を促進するための遺伝子療法の方法にも使用され得る。更なる例として、本発明は、気道又は循環系の内腔への治療用タンパク質の分泌を提供する。したがって、本発明によるベクターの投与、及び気道細胞によるその取り込みは、「工場」としての肺（又は鼻若しくは気道）の使用を可能にして、治療用タンパク質を生成し得、次いで、治療用タンパク質が分泌され、治療レベルで全身循環に入り、治療効果を引き出すために関心対象の細胞／組織に移動し得る。細胞内又は膜タンパク質とは対照的に、そのような分泌されたタンパク質の産生は、形質導入される特定の疾患標的細胞に依存せず、これは、顕著な利点であり、高レベルのタンパク質発現を達成する。したがって、心血管疾患及び血液障害などの、気道疾患ではない他の疾患もまた、レンチウイルスベクターによって治療され得る。本発明によるものなどのレンチウイルスベクターは、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれ、それらを幹細胞／前駆細胞の形質導入に好適にする長期間の発現につながり得る。
その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｌｔｏｎらの米国特許出願公開第２０１７／００９６６８４号には、レンチウイルスベクターが生成、送達されるプロセス、及び疾患治療のためのそれらの対応する使用が詳細に説明されている。本発明は、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチドを必要としている対象にそれを送達するためのレンチウイルスベクターの使用、並びにそれを使用する治療方法を企図している。
本開示はまた、対象のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドのうちの１つ以上に対するコード配列を含む、組換え遺伝子又はウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意の原核又は真核細胞であってもよい。ある特定の実施形態では、細胞が、非ヒト細胞である。他の実施形態では、細胞が、哺乳動物のものである。例えば、本開示のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母、又は哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］などの細菌細胞で発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されるＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドとシグナルペプチドとを含むポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞からの分泌時にタンパク質分解的に処理され、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをもたらす。
したがって、本開示は、対象のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを産生する方法に更に関する。例えば、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養されて、ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ３の発現が起こることを可能にし得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞及び培地の混合物から分泌及び単離され得る。あるいは、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドが細胞質又は膜画分に保持され、細胞が採取されて溶解され、タンパク質が単離されてもよい。細胞培養物としては、宿主細胞、培地、及び他の副産物が挙げられる。細胞培養に好適な培地は、当技術分野で周知である。対象のポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製、並びに／又はＥＮＰＰ１ポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤による親和性精製（例えば、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ及び／若しくはＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質を精製するためにカラムが使用され得る）を含む、タンパク質を精製するために当技術分野で公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、又は両方から単離され得る。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、精製は、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つ以上を任意の順番で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成される。精製は、ウイルス濾過及び緩衝液交換で完了し得る。ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される際、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、又は＞９９％の純度、並びにＳＤＳ ＰＡＧＥによって決定されるとき、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、又は＞９９％の純度で精製され得る。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に非ヒト霊長類、齧歯類（マウス）、及びヒトにおいて望ましい結果を達成するのに十分なものであるべきである。
別の実施形態では、組換えＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの所望される部分のＮ末端のポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによって発現融合タンパク質の精製を可能にし得る。次いで、精製リーダー配列は、その後、エンテロキナーゼを用いた処理によって除去されて、精製されたＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを提供し得る。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７、及びＪａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２を参照されたい。
ＥＮＰＰ１、又はＥＮＰＰ１ポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０３５９８５８Ａｌに記載されるように調製され得る。ＥＮＰＰ１は、別個の膜内ドメインを有する細胞表面に局在化された膜貫通タンパク質である。ＥＮＰＰ１を可溶性細胞外タンパク質として発現させるために、ＥＮＰＰ１の膜貫通ドメインを、ＥＮＰＰ２の膜貫通ドメインと交換してもよく、それはバキュロウイルス培養物の細胞外液中に可溶性の組換えＥＮＰＰ１の蓄積をもたらす。
イムノグロブリンカッパ及びラムダ軽鎖タンパク質のシグナル配列などであるがこれに限定されない、分泌のためにＥＮＰＰ１の細胞外ドメインを標的とするための任意の他の既知のタンパク質のシグナル配列が使用され得る。更に、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドに限定されると解釈されるべきではないが、ＥＮＰＰ１細胞外ドメインの任意の酵素的に活性な切断を含むポリペプチドも含む。
ＥＮＰＰ１は、膜貫通ドメインを省略することによって可溶性にされ得る。いくつかの実施形態では、ヒトＥＮＰＰ１（配列番号１）は、その膜貫通領域（例えば、残基７７～９８）を、ヒトＥＮＰＰ２（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１１２４３３ ５、例えば、残基１２～３０）の対応するサブドメインで置き換えることによって、可溶性の組換えタンパク質を発現するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、改変ＥＮＰＰ１配列は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位、続いて、Ｃ末端９－Ｆ１ＩＳタグを保有する修飾されたｐＦａｓｔｂａｃ ＦＩＴベクターにクローニングされ、昆虫細胞内でクローニング及び発現され得る。いくつかの実施形態では、両方のタンパク質は、上記に説明されたようにバキュロウイルス系で発現され得（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ １２０：４４３２－４４４０、Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８：９９４－１００４、Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７：３３５２－３３６２）、結果として、細胞外液中に可溶性組換えタンパク質の蓄積をもたらす。
融合遺伝子を生成するための技術は、周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の結合は、ライゲーションのための平滑末端又はスタガー末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な凝集末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、酵素的ライゲーションを採用する、従来の技術に従って実施される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを使用して実施され得、アンカープライマーは、２つの連続する遺伝子断片間の相補的なオーバーハングを生じさせ、その後、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい。
４．例示的な使用
ある特定の態様では、本開示は、病理学的石灰化の進行を低減、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象において、そのための特定の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド（例えば、及びその融合タンパク質）の使用に関し、方法は、治療有効量の本明細書に開示されるポリペプチド融合及び／又は可溶性ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、病理学的石灰化は、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）及びアテローム性動脈硬化プラークの石灰化からなる群から選択される。特定の実施形態では、病理学的骨化は、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、及び変形性関節炎からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、病理学的骨化の進行を低減、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、血管石灰化の低減、改善、又は予防を含む、軟部組織の異所性石灰化の進行を低減、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチドを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＮＰＰ１欠損（例えば、ＧＡＣＩ及びＡＲＨＲ２）によって引き起こされる疾患の進行を低減、逆転、及び／又は予防する方法を企図する。その方法を必要としている対象において、ＥＮＰＰ１欠損は、低減されたレベルのＥＮＰＰ１活性及び／又はＥＮＰＰ１レベルの欠損発現（健常な対象におけるＥＮＰＰ１活性レベル又はＥＮＰＰ１発現レベルのそれぞれと比較して）によって特徴付けられ、方法は、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合タンパク質（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１欠損が、ＧＡＣＩである。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１欠損が、ＡＲＨＲ２である。
いくつかの実施形態では、本開示は、より低いレベルの血漿ＰＰｉによって引き起こされる疾患の進行を低減、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図しており、方法は、治療有効量の本明細書に開示されるポリペプチドを対象に投与して、対象の血漿ＰＰｉを正常レベル（１～３ｐＭ）又は正常レベル超（３０～５０％高い）に増加させ、次いで、その後、血漿ＰＰｉを一定の正常レベル又は正常レベル超に維持することを含む。方法は、病理学的石灰化又は骨化の進行を低減、逆転、及び／又は予防するために、対象の血漿ＰＰｉを一定の正常レベル又は正常レベル超に維持するために、２日、３日、１週間、又は１か月の間隔で追加の治療有効量を投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチドは、正常レベル（約２ｐＭ）よりも低いピロリン酸（ＰＰｉ）レベルを有する対象においてＰＰｉレベルを上昇させるために使用され得る。他の実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチドは、正常レベルよりも低いＰＰｉレベルを有する対象において、病理学的石灰化又は骨化の進行を低減、逆転、及び／又は予防するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチドは、対象における細胞外ＰＰｉ濃度の低減によって現れるＥＮＰＰ１欠損（例えば、ＧＡＣＩ及びＡＲＨＲ２）を治療及び／又は改善するために使用され得る。ある特定の実施形態では、第１の用量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチドの投与後に達成される血漿ＰＰｉの定常状態レベルは、少なくとも２日、少なくとも４日、少なくとも１週間、又は少なくとも１か月の期間にわたって維持される。
いくつかの実施形態では、本開示は、正常レベルよりも低い血漿ＰＰｉによって引き起こされる疾患の進行を低減、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図しており、方法は、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与して、対象の血漿ＰＰｉを正常ＰＰｉレベル（約１～３ｐＭ）の約９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、又は１５０％であるレベルに増加させる及び／又は維持することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、血漿ＰＰｉレベルを正常なＰＰｉレベルの約９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、又は１５０％であるレベルに維持する、したがって、病理学的石灰化又は骨化を低減、逆転、及び／又は予防するために、２日、３日、１週間、又は１か月毎の本明細書に開示されるポリペプチドの更なる投与を更に含む。
ある特定の実施形態では、第２の用量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチドは、血漿ＰＰｉの定常状態レベルが一定又は定常状態レベルで維持され、かつ対象が第１の用量の本明細書に開示される構築物の投与前に有していたより低いレベルのＰＰｉに戻らないように、約２日後、約４日後、約１週間後、又は約１か月後の好適な時間間隔後に対象に投与される。
理論に縛られることを意図せず、正常なレベルで定常状態の血漿ＰＰｉ濃度を維持することは、対象の病理学的石灰化及び病理学的骨化の進行を低減、逆転、及び／又は予防すると考えられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、低リン血症性くる病の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、限定されるものではないが、異所性石灰化（例えば、軟部組織石灰化、動脈石灰化、及び血管石灰化）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、尿毒症性細小動脈石灰化（ＣＵＡ）、カルシフィラキシス、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、変形性関節炎、加齢に伴う動脈の硬化、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、アテローム性動脈硬化プラークの石灰化、ＥＮＰＰ１欠損症［例えば、常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）及び乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）］、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、ＡＢＣＣ６遺伝子における病原性変異に関連する障害、並びに病理学的骨化などの、ヒト又は動物の障害又は状態を治療、改善、及び／又は予防する。ＥＮＰＰ１ポリペプチドの例としては、ヒトＥＮＰＰ１前駆体ポリペプチド（例えば、配列番号１）、及び／又は可溶性ヒトＥＮＰＰ１ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）が挙げられる。
特定の実施形態では、軟部組織石灰化は、ＩＩＡＣ及び変形性関節炎からなる群から選択される。他の実施形態では、軟部組織は、アテローム性動脈硬化プラークを含む。いくつかの実施形態では、軟部組織は、筋性動脈を含む。いくつかの実施形態では、軟部組織は、関節及び脊椎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、関節は、手の関節及び足の関節からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、軟部組織は、関節軟骨及び脊椎板軟骨からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、軟部組織は、血管を含む。いくつかの実施形態では、軟部組織は、結合組織を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、加齢に伴う動脈の硬化の進行を低減、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、アテローム性動脈硬化プラークの石灰化の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、変形性関節炎の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、早老症に起因する動脈の硬化の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｘ連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、遺伝性低リン血症性くる病（ＨＨＲＨ）、低リン血症性骨疾患（ＨＢＤ）、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、及び／又は常染色体劣性低リン血症性くる病の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、加齢に伴う骨減少の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、強直性脊椎炎の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、小児鎌状赤血球症における脳卒中の進行を治療、逆転、及び／又は予防することを必要としている対象においてそれを行う方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、早老症と診断された対象における疾患の進行を治療、逆転、及び／又は予防する方法を企図し、方法が、治療有効量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド及び／又はＥＮＰＰ１融合ポリペプチド（例えば、配列番号２、３、９、１０、１１、及び１２）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は配列番号９に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は下線付きシグナル配列の有無にかかわらず、配列番号１０に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は配列番号１１に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は下線付きシグナル配列の有無にかかわらず、配列番号１２に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は配列番号１２１に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は配列番号１２２に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は下線付きシグナル配列の有無にかかわらず、配列番号１２７に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は下線付きシグナル配列の有無にかかわらず、配列番号１２８に図示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは融合タンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、哺乳動物細胞中に発現されるＥＮＰＰ１前駆体タンパク質の分泌された産物である。他の実施形態では、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質は、シグナルペプチド配列及びＥＮＰＰ１ポリペプチドを含み、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質は、本明細書に開示されるポリペプチドへのタンパク質分解処理を受ける。いくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質において、シグナルペプチド配列は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドＮ末端にコンジュゲートされる。タンパク質分解時に、シグナル配列は、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質から切断されて、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、シグナルペプチド配列は、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、及びＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、対象に急性又は慢性的に投与される。他の実施形態では、ポリペプチドは、局所的に、領域的に、非経口的に、又は全身的に対象に投与される。
特定の実施形態では、対象が、哺乳動物である。他の実施形態では、哺乳動物が、ヒトである。
当業者であれば、本明細書に詳述される方法を含む本開示によると、本開示は、一旦確立されると、疾患及び／又は障害の治療に限定されないことを理解するであろう。特に、疾患又は障害の症状は、対象に害を与えるほど現れている必要はなく、実際、疾患又は障害は、治療が行われる前に対象において検出される必要はない。すなわち、疾患又は障害からの有意な病理は、本発明のＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドが利益を提供し得る前に発生する必要はない。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチド、並びに／又はＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３融合ポリペプチドが、疾患又は障害の発症前に対象に投与され得、それによって、疾患又は障害が発症することを予防するという点で、対象における疾患及び障害を予防するための方法に関する。したがって、本開示は、対象における疾患又は障害の発症を予防若しくは遅延させるか、又はその進行若しくは成長を低減する方法に関し、方法は、疾患又は障害の検出前に、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、疾患又は障害の強い家族歴を有する対象に投与され、それによって、疾患又は障害の発症又は進行を予防又は遅延する。
本明細書の開示によると、当業者は、したがって、対象の疾患又は障害の予防が、疾患又は障害に対する予防策として、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを対象に投与することを包含することを理解するであろう。
５．薬学的組成物
本明細書に説明される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質は、薬学的組成物に製剤化され得る。本開示に従って使用するための薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体又は賦形剤を使用して、任意の従来の様式で製剤化され得る。そのような製剤は、大部分の規制要件を遵守して、実質的にパイロジェンフリーである。そのような薬学的組成物は、対象への投与に好適な形態であり得るか、又は薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、１つ以上の追加の成分、若しくはこれらのいくつかの組み合わせを更に含み得る。薬学的組成物の様々な構成要素は、当技術分野で周知であるように、生理学的に許容されるカチオン又はアニオンとの組み合わせなどの、生理学的に許容される塩の形態で存在し得る。
投与レジメンは、本開示の対象化合物（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド）の作用を修飾する様々な因子を考慮することによって、主治医によって決定され得ることが理解される。様々な因子としては、限定されるものではないが、患者の年齢、性別、及び食事、重症度、投与時間、及び他の臨床因子が挙げられる。任意選択的に、用量は、再構成に使用される基質のタイプ及び組成物中の化合物のタイプに応じて変化し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与され得る。他の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日～５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与され得る。
本明細書に開示される薬学的組成物中の活性成分（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質）、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び状態に応じて、かつ組成物が投与される経路に更に応じて変化することになる。一例として、組成物は、約０．１％～約１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質）を含む薬学的組成物の別個の量である。活性成分の量は、概して、対象に投与される活性成分の投与量、又は、例えば、そのような投与量の２分の１若しくは３分の１などの、そのような投与量の好都合な分数と等しい。単位剤形は、単回１日用量又は複数回１日用量（例えば、１日当たり約１～４回以上）のうちの１つのためのものであり得る。複数回１日用量が使用されるとき、単位剤形は、各用量に対して同一であってもよく、又は異なってもよい。
投与レジメンは、有効量を構成するものに影響を与え得る。例えば、いくつかの分割された投与量、及び時差投与量は、毎日又は逐次的に投与されてもよく、又は用量は、連続的に注入されてもよく、又はボーラス注射であってもよい。更に、治療製剤の投与量は、治療的又は予防的状況の緊急性によって示されるように、比例的に増加又は減少され得る。ある特定の実施形態では、対象への本明細書に開示される化合物の投与は、対象の血漿ＰＰｉを正常に近いレベルまで上昇し、哺乳動物における正常レベルは、１～３ｐＭである。「正常に近い」とは、０～１．２ｐＭ又は正常より０～４０％下回る若しくは上回る、３０ｎＭ～０．９ｐＭ又は正常より１～３０％下回る若しくは上回る、０～０．６ｐＭ又は正常より０～２０％下回る若しくは上回る、あるいは０～０．３ｐＭ又は正常より０～１０％下回る若しくは上回ることを意味する。
哺乳動物（すなわち、ヒト）などの患者への本開示の組成物（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質）の投与は、既知の手順を使用して、患者の疾患又は障害を治療するために有効な用量で、及び期間にわたって実施され得る。治療効果を達成するために必要な有効量の治療用化合物は、用いられる特定の化合物の活性、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び材料、治療されている患者の疾患又は障害の状態、年齢、性別、体重、状態、一般健康、及び既往歴、並びに医学分野で周知の同様の因子などに従って変化し得る。投与量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整されてもよい。投与量は、治療用化合物の生物学的活性に基づいて決定され、これは次に、治療用化合物曲線の半減期及び血漿時間下面積に依存する。本開示によるポリペプチドは、正常（１～３ｐＭ）レベルに近いか、又は正常レベルより上回る（３０～５０％より高い）のＰＰｉのいずれかである、連続的なレベルの血漿ＰＰｉを達成するために、２日毎、又は４日毎、又は毎週、又は毎月の適切な時間間隔で投与される。ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの治療投与量はまた、半減期又は治療用ポリペプチドが体外に排出される速度に基づいて決定されてもよい。本開示によるポリペプチドは、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の酵素活性の一定レベルを達成するために、２日毎、又は４日毎、毎週、又は毎月のいずれかの適切な時間間隔で投与される。
例えば、いくつかの分割された用量は、毎日投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低減されてもよい。本開示の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、約０．０１～５０ｍｇ／体重のｋｇ／日である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療用化合物の有効用量範囲は、約５０ｎｇ～５００ｎｇ／体重のｋｇ、好ましくは１００ｎｇ～３００ｎｇ／体重のｋｇである。当業者であれば、関連する因子を試験し、過度の実験なしで、治療用化合物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質は、１日数回の頻度で患者に投与され得るか、あるいは１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、又は数か月に１回若しくは１年に１回以下などの更に少ない頻度などの、低頻度で投与され得る。１日当たりに投与される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質の量は、非限定的な例では、毎日、隔日、２日毎、３日毎、４日毎、又は５日毎に投与され得ることが理解される。例えば、隔日投与では、１日当たり５ｍｇの用量を月曜日に開始し、水曜日に最初の後続の１日当たり５ｍｇの用量、金曜日に２つ目の後続の１日当たり５ｍｇの用量などとしてもよい。用量の頻度は、当業者にとって容易に明らかであり、これらに限定されないが、治療されている疾患の種類及び重症度、並びに患者の種類及び年齢などの任意の数の因子に依存する。
本開示の薬学的組成物中の活性成分（例えば、可溶性ＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチド並びに／又はその融合タンパク質）の実際の投与量レベルは、患者に毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について望ましい治療応答を達成するために有効である活性成分の量を取得するために変化させられてもよい。
当技術分野における通常の技術を有する医師、例えば、内科医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方してもよい。例えば、内科医又は獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、薬学的組成物に用いられる本開示の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、１日当たり１回～５回以上の範囲の投与量で患者に投与される。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回～週に１回、及び２週間毎に１回を含む投与量の範囲で患者に投与される。本明細書に開示される様々な併用組成物の投与頻度は、限定されるものではないが、年齢、治療される疾患又は障害、性別、全体的な健康、及び他の因子を含む多くの因子に応じて、対象毎に変化する。したがって、本開示は、任意の特定の投与量レジームに限定されると解釈されるべきではなく、任意の患者に投与される正確な投与量及び組成物は、患者に関する他の全ての因子を考慮して、主治医によって決定されることになる。
ある特定の実施形態では、本開示は、単独で、又は第２の薬学的剤と組み合わせて、本明細書に開示される化合物の治療有効量の化合物を保持する容器、並びに患者の疾患又は障害の１つ以上の症状を治療、予防、又は低減するために化合物を使用するための説明書を含む、パッケージングされた薬学的組成物を対象とする。
本明細書に開示される組成物のうちのいずれかの投与経路としては、吸入、経口、鼻腔、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣（例えば、経膣及び膣周囲）、鼻腔内、（経）直腸、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、髄腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入（例えば、エアロゾル）、眼、呼吸器、及び局所投与が挙げられる。他の実施形態では、ポリペプチド、又はその前駆体タンパク質は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を更に含む薬学的組成物として、対象に投与される。
ある特定の実施形態では、ポリペプチド、又はその前駆体タンパク質は、対象に急性又は慢性的に投与される。他の実施形態では、ポリペプチド、又はその前駆体タンパク質は、局所的、領域的、又は全身的に対象に投与される。更に別の実施形態では、ポリペプチド、又はその前駆体タンパク質は、コードされたベクター上で送達され、ベクターは、タンパク質をコードし、それは、対象へのベクターの投与時にベクターから転写及び翻訳される。
特定の実施形態では、本開示の治療方法は、組成物を全身的に、又は局所的に、インプラント又は装置として投与することを含む。本明細書に開示される方法に有用である薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻腔内、頬側、眼、髄腔内、静脈内、又は別の投与経路に対して好適に開発され得る。他の企図される製剤としては、投影されたナノ粒子、リポソーム調製物、及び免疫学的に基づく製剤が挙げられる。投与されるとき、本開示で使用するための治療用組成物は、実質的にパイロジェンフリー、又はパイロジェンフリーの生理学的に許容される形態である。
好適な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ゲルキャップ、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、粉末、ペレット、泥膏、ロゼンジ、クリーム、ペースト、膏薬、ローション、ディスク、坐剤、鼻又は経口投与のための液体スプレー、吸入のための乾燥粉末又はエアロゾル製剤、及び膀胱内投与のための製剤などが挙げられる。本開示で有用となる製剤及び組成物は、本明細書に説明される特定の製剤及び組成物に限定されない。
本明細書に使用される場合、薬学的組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的侵害によって特徴付けられる投与、及び組織における侵害を通した薬学的組成物の投与の任意の投与経路を含む。したがって、非経口投与は、これらに限定されないが、組成物の注射による、外科手術切開を通した組成物の適用による、組織膜透過型非外科的創傷を通した組成物の適用などによる、薬学的組成物の投与を含む。特に、非経口投与は、これらに限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎透析注入技術を含むことが企図される。
非経口投与に好適な薬学的組成物は、１つ以上のＥＮＰＰ１ポリペプチドと、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液若しくは乳濁液、又は使用直前に滅菌注射用溶液若しくは分散液に再構成され得る滅菌粉末とを組み合わせて含み得、抗酸化剤、緩衝液、静菌、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、又は懸濁若しくは濃縮剤を含有し得る。本開示の薬学的組成物に採用され得る好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。好適な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散体の場合に必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。
組成物及び製剤は、所望される場合、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得るパック又はディスペンサ装置に提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックホイルを含み得る。パック又はディスペンサ装置は、投与のための指示を伴い得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つの可溶性ＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチド、又はその塩若しくは溶媒和化合物と、本明細書に開示される方法内で可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを使用するための説明書とを含むキットを提供する。
更に、組成物は、標的組織部位への送達のために、形態で封入又は注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、１つ以上の治療化合物（例えば、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチド）を標的組織部位に送達し、発症組織のための構造を提供することができる、かつ身体中に最適に再吸収されることができる基質を含み得る。例えば、基質は、ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの緩効性を提供し得る。そのような基質は、他の移植された医療用途のために現在使用されている材料で形成され得る。
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、表面的外観、及び界面特性に基づく。対象組成物の特定の用途は、適切な製剤を定義することになる。組成物の潜在的な基質は、生分解性かつ化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、及びポリ無水物であり得る。他の潜在的な材料は、骨又は皮膚コラーゲンなどの、生分解性かつ生物学的に良好に定義されるものである。更なる基質は、純粋なタンパク質又は細胞外基質構成要素からなる。他の潜在的な基質は、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート、又は他のセラミックなどの、非生分解性かつ化学的に定義されるものである。基質は、ポリ乳酸及びヒドロキシアパタイト、又はコラーゲン及びリン酸三カルシウムなどの、上述のタイプの材料のうちのいずれかの組み合わせからなり得る。バイオセラミックスは、カルシウム－アルミネート－リン酸塩などの組成及び処理で変化して、細孔径、粒子径、粒子形状、及び生分解性を変化させ得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される治療薬は、例えば、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ（フレーバーベース、通常、スクロース及びアカシア若しくはトラガカントを使用する）、粉末、顆粒の形態で、又は水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型又は油中水型液体エマルジョンとして、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又はパステル剤（ゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアカシアなどの不活性基剤を使用する）、並びに／又は洗口剤などとして経口投与され得、各々、有効成分として所定量の薬剤を含有する。薬剤はまた、ボーラス、舐剤、又はペーストとして投与されてもよい。
経口投与のための固形剤形（カプセル、錠剤、丸剤、ドラジェ、粉末、顆粒など）では、本開示の１つ以上の治療化合物は、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウムなどの１つ以上の薬学的に許容される担体、かつ／又は（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／若しくはケイ酸などの充填剤若しくは伸長剤、（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び／若しくはアカシアなどの結合剤、（３）グリセロールなどの保湿剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ若しくはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（５）パラフィンなどの溶液遅延剤、（６）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（７）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、（８）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物などの滑剤、並びに（１０）着色剤のうちのいずれかと混合され得る。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトース又は乳糖などのそのような賦形剤、及び高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
ある特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１及び／若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチド又はその融合タンパク質は、液体製剤として製剤化される。経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤が挙げられる。有効成分に加えて、液体剤形は、水又は他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、及びごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコール及び脂肪酸エステルなどの可溶化剤及び乳化剤、並びにその混合物などの、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、及び懸濁剤などのアジュバント、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、及び防腐剤も含み得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、及びソルビタンエステルなどの懸濁剤、微結晶セルロース、メタヒドロキシドアルミニウム、ベントナイト、寒天、及びトラガカント、並びにそれらの混合物を含有し得る。
特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドは、凍結乾燥された産物として製剤化される。他の実施形態では、本開示は、治療量の本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１及び／又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む薬学的組成物の乾燥製品形態を提供し、それによって、乾燥製品は、液体形態の化合物の溶液に再構成可能である。
本開示の追加の剤形は、米国特許第６，３４０，４７５号、同第６，４８８，９６２号、同第６，４５１，８０８号、同第５，９７２，３８９号、同第５，５８２，８３７号、及び同第５，００７，７９０号に説明される剤形を含む。本開示の追加の剤形はまた、米国特許出願第２００３／０１４７９５２号、同第２００３／０１０４０６２号、同第２００３／０１０４０５３号、同第２００３／００４４４６６号、同第２００３／００３９６８８号、及び同第２００２／００５１８２０号に説明される剤形も含む。本開示の追加の剤形はまた、ＰＣＴ出願第ＷＯ０３／３５０４１号、同第ＷＯ０３／３５０４０号、同第ＷＯ０３／３５０２９号、同第ＷＯ０３／３５１７７号、同第ＷＯ０３／３５０３９号、同第ＷＯ０２／９６４０４号、同第ＷＯ０２／３２４１６号、同第ＷＯ０１／９７７８３号、同第ＷＯ０１／５６５４４号、同第ＷＯ０１／３２２１７号、同第ＷＯ９８／５５１０７号、同第ＷＯ９８／１１８７９号、同第ＷＯ９７／４７２８５号、同第ＷＯ９３／１８７５５号、及び同第ＷＯ９０／１１７５７号に説明される剤形も含む。
本明細書に開示される組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によって確保され得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。加えて、注射可能な薬学的形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらされ得る。
本明細書に開示される薬学的組成物の放出制御又は徐放性製剤は、従来の技術を使用して作製され得る。いくつかの場合、使用される剤形は、その中の１つ以上の活性成分の徐放又は放出制御として、例えば、ハイドロプロピルメチルセルロース、他のポリマー基質、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム、若しくはマイクロスフェア、又はそれらの組み合わせを使用して提供されて、様々な比率で所望の放出プロファイルを提供し得る。放出制御に適合される錠剤、カプセル、ゲルキャップ、及びカプレットなどの経口投与に好適な単回単位剤形は、本開示によって包含される。
ある特定の実施形態では、本開示の製剤は、限定されるものではないが、短期の急速オフセット、並びに制御された、例えば、徐放性、遅延放出性、及びパルス放出性の製剤であり得る。
徐放性という用語は、その従来の意味において、長期間にわたる薬物の段階的放出を提供し、必須ではないが、結果として、長期間にわたって実質的に一定の血液レベルの薬物をもたらし得る薬物製剤を指すために使用される。期間は、１か月以上であってもよく、ボーラス形態で投与される同じ量の薬剤よりも長い放出であるべきである。徐放性のために、化合物は、化合物に徐放特性を提供する好適なポリマー又は疎水性材料を用いて製剤化され得る。そのため、本明細書に説明される使用のための化合物は、例えば、注射によるマイクロ粒子の形態、又は移植によるウエハ若しくはディスクの形態で投与され得る。特定の実施形態では、化合物は、徐放性製剤を使用して、単独で、又は別の薬学的剤との組み合わせで患者に投与される。
遅延放出性という用語は、その従来の意味において、薬物投与後の幾分の遅延の後に薬物の初期放出を提供し、必須ではないが、マットが約１０分～最大約１２時間の遅延を含む、薬物製剤を指すために本明細書で使用される。パルス放出性という用語は、従来の意味において、薬物投与後に薬物のパルス化された血漿プロファイルを生成するような方式で薬物の放出を提供する薬物製剤を指すために、本明細書で使用される。即時放出性という用語は、その従来の意味において、薬物投与直後の薬物の放出を提供する薬物製剤を指すために使用される。
本明細書で使用される場合、短期とは、薬剤投与後の、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分、約２０分、又は約１０分、及び任意の又は全てのそれらの全体又は部分的増分までの、かつそれらを含む任意の期間を意味する。
本明細書で使用される場合、急速オフセットとは、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分、約２０分、又は約１０分、並びに任意の及び全てのそれらの全体又は部分的増分までの、かつそれらを含む任意の期間を意味する。
当業者は、通例の実験のみを使用して、本明細書に説明される特定の手順、実施形態、特許請求の範囲、及び実施例の多くの均等物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、本開示の範囲内であると考えられ、本明細書に添付される特許請求の範囲によって網羅されている。例えば、当技術分野で認識された代替物による、かつ通例の実験のみを使用する反応及び調製条件における変更は、本出願の範囲内である。
本明細書に値及び範囲が提供される場合、これらの値及び範囲によって包含される全ての値及び範囲は、本開示の範囲内で包含されることを意味することが理解されるべきである。更に、これらの範囲内に収まる全ての値、及び値の範囲の上限又は下限もまた、本出願によって企図される。
６．配列
Figure 2023529892000002
Figure 2023529892000003
Figure 2023529892000004
Figure 2023529892000005
Figure 2023529892000006
Figure 2023529892000007
Figure 2023529892000008
Figure 2023529892000009
Figure 2023529892000010
本明細書で使用される用語は、概して、本開示の文脈内、及び各用語が使用される特定の文脈内で、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。特定の用語は、本開示の組成物及び方法、並びにそれらを作製及び使用する方法を説明する際に、実践者に追加のガイダンスを提供するために、本明細書の以下又は別の場所で論じられる。用語の任意の使用の範囲又は意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかであろう。
「約」及び「およそ」は、一般的に、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量に対する許容可能な誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。
あるいは、特に生物学的系において、「約」及び「およそ」という用語は、所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書に与えられる数値は、別途記載がない限り、およそであり、これは、明示的に示されていないとき、「約」又は「およそ」という用語が推定され得ることを意味する。
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、用語が使用される文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照を含む。「ａ」（又は「ａｎ」）という用語、並びに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。更に、本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、他のものの有無にかかわらず、２つ以上の指定された特徴又は構成要素の各々についての特定の開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書の「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の態様の各々を包含することが意図される。Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、又はＣ、Ａ又はＣ、Ａ又はＢ、Ｂ又はＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、並びにＣ（単独）。
本明細書に開示される数値範囲は、範囲を定義する数を包含する。
本明細書に開示されるポリペプチドは、天然発生型ではないアミノ酸配列を含み得る。そのようなバリアントは、必ず、開始分子との１００％未満の配列同一性又は類似性を有する。ある特定の実施形態では、バリアントは、例えば、バリアント分子の長さにわたって、開始（例えば、天然発生型又は野生型）ポリペプチドのアミノ酸配列との約７５％～１００％未満、より好ましくは、約８０％～１００％未満、より好ましくは、約８５％～１００％未満、より好ましくは、約９０％～１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、最も好ましくは約９５％～１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性のアミノ酸配列を有することになる。
好ましい方法及び材料が本明細書に説明されているが、本明細書に開示されるものと同様又は均等の方法及び材料もまた、本開示の方法及び組成物の実施又は試験に使用され得る。本明細書に述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
例示
次に、本発明を一般的に説明するが、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されることになり、これらの実施例は、単に本発明の特定の実施形態及び実施形態の例示の目的で含まれており、本発明を限定することを意図していない。
実施例１．ＥＮＰＰ１融合タンパク質の生成
間にリンカー（ロイシン、イソロイシン、及びアスパラギンを含む）を有するヒトＦｃドメインに融合されたＥＮＰＰ１のＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインの両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１融合タンパク質を構築した。この構築物は、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）－ｈＦｃと称される。
ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）－ｈＦｃは、表１に、ＣＨＯ細胞株から精製された配列番号９（下線付きリンカーを含む）として示されている。
ＳＰ（２）リーダー配列を使用してＣＨＯ細胞株で発現されるＥＮＰＰ１（１９０～９２５）－ｈＦｃタンパク質は、配列番号１０（表１）に示される未処理アミノ酸配列を有する。
ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）－ｈＦｃ（配列番号１０）の未処理アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、表１に配列番号１４として示されている。
ＣＨＯ細胞産生物質のＮ末端配列決定は、ＳＲＡ－ＫＳ（配列番号１に関して、それぞれ、残基１８９及び１９０のセリン（Ｓ）及びトリプトファン（Ｗ）の間）における切断を示す－ＷＶＥＥＰＣの主要配列を明らかにした。
精製は、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つ以上を任意の順番で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る。精製は、ウイルス濾過及び緩衝液交換で完了し得る。
タンパク質の精製後、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）－ｈＦｃタンパク質の触媒活性を、ｐＮＰ－ＴＭＰを発色基質として使用して評価し、ＳＭＢ１及びＳＭＢ２の欠失がＥＮＰＰ１酵素活性に影響しなかったことを決定した。ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインの欠失は、ポリペプチドの凝集を減少させる、及び／又はＳＭＢドメインを含有するＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドと比較して、欠失変異体に対する抗薬物抗体が哺乳動物によって生成されることになる可能性を顕著に低減すると予想される。
実施例２．プロテアーゼ抵抗性ＥＮＰＰ１融合タンパク質の生成
上記に説明された精製工程に続いて、ポリペプチド分析は、小さいパーセンテージのポリペプチドが、プロテアーゼ（すなわち、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ）によってＥＮＰＰ１のヌクレアーゼドメイン内で切断され、結果として、ポリペプチドの切断をもたらしたことを示した。これらの所見に基づいて、ＥＮＰＰ１のヌクレアーゼドメインにおける一連の変異（配列変異）を生成し、これらのバリアントポリペプチドを、バリアントＥＮＰＰ１ヌクレアーゼドメインと、任意選択のリンカーによって結合されたＦｃドメインとを含む融合タンパク質として産生した。バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質の生成に使用されるバックグラウンドＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合は、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）－ｈＦｃであり、配列番号９として上記の実施例１に示されている。
様々な置換変異を、バックグラウンドＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質に導入した。プロテアーゼによって切断された残基に基づいて、変異の大部分を、配列番号１に対する残基８１６、８１７、又は８１８で作製した。変異を、ＰＣＲ変異誘発によってＥＮＰＰ１ヌクレアーゼドメイン内に生成した。ＰＣＲ変異誘発後、断片を、Ｑｉａｇｅｎカラムを通して精製し、消化し、ゲル精製した。これらの断片を発現ベクターにライゲーションし、その結果、ライゲーション時に、ヒトＩｇＧ１との融合キメラが生じた。形質転換後、コロニーを選抜し、ＤＮＡを単離した。全ての変異体を配列検証した。
したがって、間にリンカー（ロイシン、イソロイシン、及びアスパラギンを含む）を有するヒトＦｃドメインに融合された配列番号１に対するＲ８１８Ｈ置換によるＥＮＰＰ１のＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインの両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１融合タンパク質を構築した。この構築物は、ＥＮＰＰ１（１９０－９２５）Ｒ８１８Ｈ－ｈＦｃと称される。
ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）Ｒ８１８Ｈ－ｈＦｃは、表１に、ＣＨＯ細胞株から精製された配列番号１１（下線付きリンカーを含む）として示されている。
ＳＰ（２）リーダー配列を使用してＣＨＯ細胞株で発現されるＥＮＰＰ１（１９０～９２５）Ｒ８１８Ｈ－ｈＦｃタンパク質は、配列番号１２（表１）に示されるように未処理アミノ酸配列を有する。
ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）Ｒ８１８Ｈ－ｈＦｃ（配列番号１２）の未処理アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、表１に配列番号１５として示されている。
ＣＨＯ細胞産生物質のＮ末端配列決定は、ＳＲＡ－ＫＳ（配列番号１に関して、それぞれ、残基１８９及び１９０のセリン（Ｓ）及びトリプトファン（Ｗ）の間）における切断を示す－ＷＶＥＥＰＣの主要配列を明らかにした。
精製は、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つ以上を任意の順番で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る。精製は、ウイルス濾過及び緩衝液交換で完了し得る。
タンパク質の精製後、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）Ｒ８１８Ｈ－ｈＦｃタンパク質の触媒活性を、ｐＮＰ－ＴＭＰを発色基質として使用して評価し、配列番号１に対するＲ８１８Ｈ置換がＥＮＰＰ１酵素活性に影響しなかったことを決定した。加えて、ヌクレアーゼドメインにおけるタンパク質切断は、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）ｈＦｃと比較して、ＥＮＰＰ１（１９０～９２５）Ｒ８１８Ｈ－ｈＦｃタンパク質において有意に減少した。
実施例３．追加のＮ結合型グリコシル化部位を有するＥＮＰＰ１融合ポリペプチドの生成
特異的変異は、ヒトＥＮＰＰ１内の１つ以上のグリコシル化部位を導入又は排除するように選択され得る。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、概して、トリペプチド配列、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、又はアスパラギン－Ｘ－セリン（「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、これは、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識される。改変はまた、ポリペプチドの配列への１つ以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそれらによる置換（Ｏ結合型グリコシル化部位に対する）によって行われ得る。
配列番号１に対するＩ３３２Ｔ置換変異の導入は、ＥＮＰＰ１触媒ドメイン内の挿入ループ内にＮ－グリカンコンセンサス配列を導入する。ヒトＥＮＰＰ１挿入ループ内の残基３３２に存在するグリカンは、リン酸無水物基質への求核付加に関与する触媒トレオニンの近くに存在する。驚くべきことに、マウスに投与されたとき、Ｉ３３２Ｔ置換を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドは、インビボ曝露を７．７倍に増加させ、血清半減期を１６０％増加させた。ある特定の非限定的な実施形態では、位置３３２におけるグリカンの付加によって誘発される増加した生物学的曝露は、生物学的吸収及び／又は生物学的循環の増加に関連する。ある特定の非限定的な実施形態では、位置３３２におけるグリカンの付加によって誘発される増加した生物学的曝露は、酵素の機能獲得に起因しない。本明細書に開示される変異体の精製及び調製は、上記に概説された工程に従うことによって達成され得る。
実施例４．ＥＮＰＰ１抗薬物抗体（ＡＤＡ）競合試験
ＥＬＩＳＡ競合アッセイを使用して、可溶性ヒトＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質のどのドメインが、動物試験で生成された抗薬物抗体（ＡＤＡ）への結合に関与するかを識別した。動物試験で３０ｍｇ／ｋｇのＥＮＰＰ１－Ｆｃを投与されたラット又はＮＨＰからの血漿及び血清試料を、酢酸で処理して、ＡＤＡをＥＮＰＰ１－Ｆｃから分離した。酸処理された血漿試料を中和し、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ被覆プレートに添加した。３７℃で３時間のインキュベーション後、結合したＡＤＡを酸処理で溶出させ、中和し、第２のプレートに移して一晩被覆した。翌日、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＥＮＰＰ１－ＨＲＰ）にコンジュゲートされたＥＮＰＰ１を、様々な競合体の有無にかかわらず、第２のプレートに添加した。アッセイで使用した競合体は、以下を含んでいた：
●試験構築物１：ヒトＥＮＰＰ１の全細胞外ドメインを含有するＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物。
●試験構築物２：ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインを欠くヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（配列番号１２２）。
●試験構築物３：触媒ドメインがカニクイザルＥＮＰＰ１の対応するドメインからの触媒ドメインで置換された可溶性ヒトＥＮＰＰ１を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（配列番号１１７）。
●試験構築物４：ヌクレアーゼ様ドメインがカニクイザルＥＮＰＰ１の対応するドメインで置換された可溶性ヒトＥＮＰＰ１を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（配列番号１１８）。
●試験構築物５：構築物の可溶性ＥＮＰＰ１部分が、アミノ酸リンカー配列：ＧＧＧＧＳ（配列番号６３）を介して構築物のＦｃ部分に結合されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物。（配列番号１１９）。
●ヒトＩｇＧ１のみを含む対照構築物１
●対照構築物２：ＰＮＧａｓｅ Ｆで処理された構築物１のＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（脱グリコシル化ＥＮＰＰ１－Ｆｃ）
●対照構築物３：対照構築物２のモック処理バージョン
結合されたＥＮＰＰ１－ＨＲＰを、比色基質、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）で定量化した。ＥＬＩＳＡシグナルの減少は、ＡＤＡ結合ＥＮＰＰ１－ＨＲＰとの競合を示す。
陰性対照（競合体なし）と比較して、非標識のＥＮＰＰ１－Ｆｃ試験構築物１を、ＥＮＰＰ１－ＨＲＰと１：１の比率で添加すると、結果として、シグナルのおよそ５０％の低下をもたらした。ＮＨＰ試料では、対照構築物２は、ＡＤＡ結合がＥＮＰＰ１と同様に効果的に競合し、これは、ＡＤＡがグリコシル化ＥＮＰＰ１上に存在するグリカンに特異的に結合しないことを示す。試験構築物３、４、及び５についても有効な競合（シグナルの－５０％の低減）が観察され、これは、ＥＮＰＰ１触媒、ヌクレアーゼ様、及びリンカードメインがＡＤＡの主要な結合部位を含有しないことを示唆する。ラット及びＮＨＰ試料の両方で、ヒトＩｇＧ１（対照構築物１）は、ＡＤＡがＥＮＰＰ１－ＦｃのＦｃドメインに結合しないことを示すシグナルの減少を引き起こさなかった。驚くべきことに、競合アッセイへの試験構築物２の添加は、ＥＬＩＳＡシグナルの－２０％の減少につながり、これは、ＥＮＰＰ１のＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインの除去が、ＡＤＡ結合についてＥＮＰＰ１－ＨＲＰと競合する能力の顕著な減少を引き起こしたことを示す。これらのデータは、ＥＮＰＰ１ ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインが、動物試験におけるＡＤＡ反応に関与する、ＡＤＡの主要な結合部位を含有していることを示す。
実施例５．様々なＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物の単回投与ＰＫ／ＰＤ評価
インビボにおける様々なＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物の活性及び関連するＰＰｉレベルを、３つの試験構築物を使用して３６０時間にわたって評価した。正常な食事で約６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ－ＥＮＰＰ１ａｓｊ／ＧｒｓｒＪマウスを試験に使用した。マウスを９群、各試験物質に対して６匹のマウスの３群に無作為化し、表に示されるように収集時点をずらした。試験１日目に、様々な競合体の２ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与を動物に行った：
●試験構築物５：構築物の可溶性ＥＮＰＰ１部分が、アミノ酸リンカー配列：ＧＧＧＧＳ（配列番号６３）を介して構築物のＦｃ部分に結合されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（配列番号１１９）。
●試験構築物６：ＥＮＰＰ１部分の触媒ドメインがＩＩ３２Ｔ置換を含み、Ｆｃドメインが三重変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む、ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（配列番号１２０）。
●試験構築物７：ＳＭＢ１及びＳＭＢ２ドメインを欠き、ＥＮＰＰ１部分の触媒ドメインがＩ３３２Ｔ置換を含み、Ｆｃドメインが三重変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む、ヒトＥＮＰＰ１の細胞外ドメインのバリアント形態を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（配列番号１２１）。
全てのマウスは、試験１日目に４０μｇ／動物、試験６日目及び１２日目に２５μｇ／動物のＧＫ１．５（免疫抑制剤）を受容した。以下の表２に示されるように、血漿ＥＮＰＰ１活性及びＰＰｉレベルを測定するために、異なる時点で試料を取得した。
Figure 2023529892000011
ＥＮＰＰ１活性レベルは２４時間でピークに達し、その後の時点で全ての動物において低下した（図９Ａ）。試験構築物５を投与されたマウスは、２４時間で最低のＥＮＰＰ１活性レベルを示し、より速いクリアランス速度を示した。試験構築物５を投与された動物における活性レベルは、２１６時間の時点でベースラインに戻った。試験構築物５と比較して、試験構築物７の単回投与は、終点を除く全ての時点でより高いＥＮＰＰ１活性につながった。試験構築物６を投与されたマウスは、２４時間で最高のＥＮＰＰ１活性を示し、延長した半減期を示した。試験構築物６を投与された動物におけるＥＮＰＰ１活性レベルは、３６０時間で上昇したままであった。
全ての構築物の投与は、結果として、投与前のベースラインと比較してＰＰｉレベルの上昇をもたらした（図９Ｂ）。全ての群で、ＰＰｉの上昇は、少なくとも２１６時間の時点まで持続した。ＥＮＰＰ１活性データと一致して、試験構築物６又は試験構築物７を投与された動物のＰＰｉレベルは、２４時間後の時点で試験構築物５群のレベルよりも高かった。ＰＰｉレベルは、試験構築物６を投与された動物で３６０時間上昇したままであったが、他の２つの群は、ベースラインレベル近くまで低下した。
実施例６．ＥＮＰＰ１－Ｆｃ処理によるインビボＰＰｉ及び組織石灰化レベルの評価
心臓、大動脈、腎臓、及び脾臓のＰＰｉ及び組織石灰化を、ビヒクル又は様々なＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物（試験構築物５、試験構築物６、又は試験構築物７）で処理されたマウスで評価した。妊娠期間中に促進食を与えられた２～３週齢のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスを、５つの群に無作為に割り当てた。１ｍｇ／ｋｇのビヒクル又はＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアント（試験構築物５、試験構築物６、又は試験構築物７）を、週に１回、４週間にわたって皮下投与した。年齢が一致したＷＴ同腹仔に、対照としてビヒクルを投与した。試験終了時に、心臓／大動脈、腎臓、肝臓、肺、脾臓、及び感覚毛を含む複数の組織における血漿ＰＰｉ及びカルシウム含有量を測定した。
ビヒクルで処理された変異マウスは、ほぼ検出不可能なレベルのＰＰｉを示した（図１０Ａ）。試験構築物５を投与された動物では、ＰＰｉ濃度がおよそ２μＭであったが、試験構築物６又は試験構築物７を投与すると、それぞれ、ＰＰｉを８μＭ及び１０μＭまで上昇させた。試験構築物６又は試験構築物７を投与された動物は、ビヒクルを投与された動物と比較して、心臓及び大動脈、腎臓及び脾臓における組織石灰化の同様又は良好な予防を示した（図１０Ｂ、図１０Ｃ、及び図１０Ｄ）。
実施例７．ＳＭＢドメインを含む又は欠くＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドにおける凝集レベルの比較
ＳＭＢドメインを含む（試験構築物５）又は欠く（試験構築物２）ＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドの凝集を比較した。試験構築物２及び試験構築物５を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂で精製したＴｕｎａＣＨＯ（商標）細胞に一時的に発現させ、製剤緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭアルギニン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｈ ｐＨ６．０）中に透析した。タンパク質をほぼ同等の濃度（試験構築物２が２２ｍｇ／ｍＬ、試験構築物５が２２．６ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した。試料を、撮像前に１５日間（試験構築物２）又は１３日間（試験構築物５）のいずれかの間、１００ｍＭのＤＴＴを伴って、又は伴わずに周囲室温でインキュベートした。２日以内に、ＤＴＴ処理された試料は、おそらくＤＴＴ変性タンパク質の凝集に起因して、凝固した。ＤＴＴ処理なしの試料では、視認可能な沈殿物が１３日後に試験構築物５の試料中に形成されたが、一方、ＳＭＢドメインを欠く試験構築物２の試料は、１５日目まで透明のままであった（図１１）。
参照による組み込み
全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示唆されたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
主題の特定の実施形態が論じられているが、上記の明細書は、例示であり、限定ではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲について検討すると、当業者には多くの変形例が明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を、それらの均等物の全範囲とともに、かつ明細書を、そのような変形例とともに参照することによって決定されるべきである。

Claims (112)

  1. ＥＮＰＰ１のソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドであって、前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  2. 配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一である可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１のソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠き、前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有する、請求項１又は２に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドのホモ二量体化を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  5. 前記１つ以上のアミノ酸修飾が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％、ホモ二量体化を低減する、請求項４に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して低減されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  7. 配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドであって、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  8. ＥＮＰＰ１のソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠くポリペプチドを含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を更に含む、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  9. 配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含むアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を含む、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  10. 配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一である可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドであって、少なくとも、配列番号１に対する位置８１８におけるアルギニン（Ｒ）が、別のアミノ酸の代わりに置換されている、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチドが、配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８からなる群から選択される配列番号１の位置における１つ以上のアミノ酸置換を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  12. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す、請求項８～１１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  13. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドの前記より大きいタンパク質分解抵抗性が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％増加したタンパク質純度を有する均質な組成物を提供する、請求項７又は１２に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  14. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドの前記より大きいタンパク質分解抵抗性が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、又は３００％、タンパク質切断を減少させる、請求項７又は１２に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  15. 前記プロテアーゼが、トリプシン及びトリプシン様プロテアーゼからなる群から選択される、請求項７又は１２～１４のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  16. 前記置換が、配列番号１に対する位置８１８にある、請求項７～１５のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  17. 位置８１８のアルギニン（Ｒ）が、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている、請求項７～１６のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  18. 配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちのいずれか１つにおける前記アミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている、請求項７～１６のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  19. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、Ｋ８１６Ｒ、Ｋ８１６Ｈ、Ｒ８１７Ｈ、Ｒ８１７Ｋ、Ｒ８１８Ｈ、又はＲ８１８Ｋからなる群から選択される配列番号１のアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項７～１６のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  20. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１のホスホジエステラーゼ触媒ドメインを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  21. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１及び２のうちの一方又は両方を欠く、請求項７～２０のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  22. 前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  23. 前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９５％同一である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  24. 前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９９％同一である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  25. 前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  26. 前記ポリペプチドが、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメイン及び少なくとも１つの異種タンパク質部分を含む融合タンパク質である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  27. 前記少なくとも１つの異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、哺乳動物における前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項２６に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  28. 前記少なくとも１つの異種タンパク質部分が、Ｆｃドメインを含む、請求項２６又は２７に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  29. 前記Ｆｃドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  30. 前記Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている、請求項２８に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  31. 前記Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている、請求項２８に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  32. 前記Ｆｃドメインが、野生型ＩｇＧ定常ドメインよりも高いＦｃＲｎに対する親和性を有する、請求項２８に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  33. 前記ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  34. 前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  35. 前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  36. 前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  37. 前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  38. 前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１２２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  39. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、異種部分を更に含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  40. 前記異種部分が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、及び脂質部分からなる群から選択される、請求項３９に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  41. 配列番号１に対するアミノ酸残基３３２が、Ｉ３３２Ｔ置換を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド。
  42. ＥＮＰＰ３のソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  43. 配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９０％同一である可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３のＳＭＢドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  44. 前記ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して低減したホモ二量体化能力を有する、請求項４２又は４３に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  45. 前記ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドのホモ二量体化を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  46. 前記１つ以上のアミノ酸修飾が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％、ホモ二量体化を低減する、請求項４５に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  47. 前記ポリペプチドが、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して低減されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する親和性を有する、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  48. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３のホスホジエステラーゼ触媒ドメインを含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  49. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＳＭＢドメイン１及び２のうちの一方又は両方を欠く、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  50. 前記ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９０％同一である、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  51. 前記ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９５％同一である、請求項４２～５０のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  52. 前記ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９９％同一である、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  53. 前記ポリペプチドが、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５を含む、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  54. 前記ポリペプチドが、可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドドメイン及び少なくとも１つの異種タンパク質部分を含む融合タンパク質である、請求項４２～５３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  55. 前記少なくとも１つの異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、哺乳動物における前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項５４に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  56. 前記異種タンパク質部分が、Ｆｃドメインを含む、請求項５４又は５５に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  57. 前記Ｆｃドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  58. 前記Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている、請求項５７に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  59. 前記Ｆｃドメインが、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基が、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従って番号付けされている、請求項５７に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  60. 前記Ｆｃドメインが、野生型ＩｇＧ定常ドメインよりも高いＦｃＲｎに対する親和性を有する、請求項５７に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  61. 前記ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４２～６０のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  62. 前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、異種部分を更に含む、請求項４２～６１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  63. 前記異種部分が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、及び脂質部分からなる群から選択される、請求項６２に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド。
  64. （ａ）ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分であって、前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分と、（ｂ）異種タンパク質部分と、を含む融合タンパク質。
  65. （ａ）ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメイン１及びＳＭＢドメイン２の両方を欠く可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分と、（ｂ）異種タンパク質部分と、を含む融合タンパク質。
  66. （ａ）配列番号１に対する位置８１６、８１７、又は８１８のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を含む可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分であって、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、プロテアーゼに対して対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドよりも大きいタンパク質分解抵抗性を示す、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分と、（ｂ）異種タンパク質部分と、を含む融合タンパク質。
  67. 前記融合タンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の融合タンパク質。
  68. 前記融合タンパク質が、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６４又は６６に記載の融合タンパク質。
  69. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６４又は６６に記載の融合タンパク質。
  70. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６４及び６６～６９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  71. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６４及び６６～７０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  72. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸１９０～９２５を含む、請求項６４及び６６～７１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  73. 前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
  74. 前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
  75. 前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
  76. 前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド部分が、配列番号１１６のアミノ酸１３６～８７５を含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
  77. 前記異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドと比較して、哺乳動物における前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項６４及び６６～７２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  78. 前記異種タンパク質部分が、対応する野生型可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドと比較して、哺乳動物における前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項６５に記載の融合タンパク質。
  79. 前記異種タンパク質部分が、Ｆｃドメインを含む、請求項６４～７８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  80. 前記Ｆｃドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の融合タンパク質。
  81. （ａ）請求項１～３２のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、請求項３３～５１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、及び／又は請求項５２～６８のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、（ｂ）異種部分と、を含むコンジュゲート。
  82. 前記異種部分が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、及び脂質部分からなる群から選択される、請求項８１に記載のコンジュゲート。
  83. （ａ）請求項１～４１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、請求項６４～８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び／又は請求項８１若しくは８２に記載のコンジュゲートと、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物。
  84. 対象における異所性石灰化を低減、逆転、及び／又は防止するための方法であって、治療有効量の、請求項１～４１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、請求項６４～８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８１若しくは８２に記載のコンジュゲート、及び／又は請求項８３に記載の薬学的組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象における異所性石灰化を低減、逆転、及び／又は防止することを含む、方法。
  85. 前記異所性石灰化が、軟部組織石灰化、動脈石灰化、及び血管石灰化からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記対象が、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、尿毒症性細小動脈石灰化（ＣＵＡ）、カルシフィラキシス、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）、変形性関節炎、加齢に伴う動脈の硬化、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、及びアテローム性動脈硬化プラークの石灰化からなる群から選択される疾患を有する、請求項８４又は８５に記載の方法。
  87. 前記軟部組織が、アテローム性動脈硬化プラーク、筋性動脈、関節、脊椎、関節軟骨、脊椎板軟骨、血管、及び結合組織からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記対象が、ＥＮＰＰ１欠損である、請求項８４に記載の方法。
  89. 前記対象が、ＥＮＰＰ３欠損である、請求項８４に記載の方法。
  90. 前記対象が、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）を有する、請求項８４に記載の方法。
  91. 前記対象が、ＡＢＣＣ６遺伝子に病原性変異を有する、請求項８４に記載の方法。
  92. ＥＮＰＰ１欠損障害を有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の、請求項１～４１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、請求項６４～８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８１若しくは８２に記載のコンジュゲート、及び／又は請求項８３に記載の薬学的組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象を治療することを含む、方法。
  93. ＥＮＰＰ３欠損障害を有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の、請求項１～４１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、請求項６４～８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８１若しくは８２に記載のコンジュゲート、及び／又は請求項８３に記載の薬学的組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象を治療することを含む、方法。
  94. 前記対象が、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、尿毒症性細小動脈石灰化（ＣＵＡ）、カルシフィラキシス、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）、変形性関節炎、加齢に伴う動脈の硬化、特発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、及びアテローム性動脈硬化プラークの石灰化からなる群から選択される疾患を有する、請求項９２又は９３に記載の方法。
  95. 前記対象が、異所性石灰化を有する、請求項９２又９３に記載の方法。
  96. 前記異所性石灰化が、軟部組織石灰化、動脈石灰化、及び血管石灰化からなる群から選択される、請求項９２又は９３に記載の方法。
  97. 前記対象が、病理学的骨化を有する、請求項９２又９３に記載の方法。
  98. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドのコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  99. 前記単離されたポリヌクレオチドが、配列番号１４又は１５のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項９８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  100. 請求項４２～６３のいずれか一項に記載の可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドのコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  101. 請求項９８～１００のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  102. 請求項１０１に記載の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
  103. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１０２に記載の細胞。
  104. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞又はヒト細胞である、請求項１０３に記載の細胞。
  105. 可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの発現に好適な条件下で細胞を培養することであって、前記細胞が、請求項１０１に記載の組換えポリヌクレオチドで形質転換されている、培養することと、
    ｂ）そのように発現された前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを回収することと、を含む、方法。
  106. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドを、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤とともに製剤化して、薬学的組成物を生成することを更に含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドの発現に好適な条件下で細胞を培養することであって、前記細胞が、請求項１０１に記載の組換えポリヌクレオチドで形質転換されている、培養することと、
    ｂ）そのように発現された前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを回収することと、を含む、方法。
  108. 前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドを、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤とともに製剤化して、薬学的組成物を生成することを更に含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、及び／又は前記融合タンパク質が、前記可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド、前記可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド、及び／又は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターによって前記対象に送達される、請求項８４～９７のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２ベクターである、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、請求項１１０に記載の方法。
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