NO314666B1

NO314666B1 - DNA molekyl som koder for et rekombinant polypeptidenzym samt en vektor ogsammensetning inneholdende denne

Info

Publication number: NO314666B1
Application number: NO19943323A
Authority: NO
Inventors: James C Paulson; Xiaohong Wen; Brian Livingston; William Gillespie; Sorge Kelm; Alma L Burlingame; Katalin Medzihradszky
Original assignee: Cytel Corp
Priority date: 1992-03-09
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 2003-04-28
Also published as: DK0632831T3; FI944136A; SK108894A3; FI944136A0; EP0632831B1; CA2131703C; AU3791993A; DE69332520T2; HU219260B; WO1993018157A1; BG99100A; DE69332520D1; BG62492B1; HUT69933A; HU9402586D0; JPH07505771A; CA2131703A1; KR100300467B1; AU668714B2; ES2191011T3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår DNA molekyl som koder for et rekombinant polypeptidenzym som har sialyltransferase enzymaktivitet. Sialyltransferase-genfamilien er en gruppe glykosyltransferaser som er ansvarlig for den terminale sialyleringen av karbohydratgrupper av glykoproteiner, glykopeptider og oligosakkarider som inneholder en konservert homologiregion i det katalytiske området. Medlemmer av sialyltransferase-genfamilien omfatter Gall,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase. Oppfinnelsen angår videre nye former og sammensetninger derav.

Sialyltransferase er en familie enzymer som katalyserer overføringen av sialinsyre (SA) til terminale deler på karbohydratgruppene av glykolipider og oligosakkarider i den generelle reaksjon:

Cytidin-5-monofosfat-sialinsyre (CMP-SA) +

HO-akseptor -> CMP + SA-O-akseptor

(Beyer, T.S. et. Adv. Enzynol. 52,23-175 [1981]).

Sialyltransferaser blir primært funnet i Golgi-apparat i celler hvor de deltar i post-translasjonell glykosylering. (Fleischer, B.J., CellBiol. 89,246-255 [1981]). De blir også funnet i kroppsvæskene, slik som brystmelk, kolostrum og blod. Minst 10 til 12 forskjellige sialyltransferaser er nødvendige for å syntetisere alle sialyloligosakkarid-sekvensene som er kjent. Hver av disse kan skilles enzymatisk ved deres spesifisitet for sekvensen på akseptor oligosakkaridet og den anomere bindingen dannet mellom sialinsyren og sukkeret til hvilket det er bundet. Fire sialyltransferaser har blitt renset.

(Beyer et al, Ibid; Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem. 257,13835-13844 [1982]; Miagi, T. og Tsuiki, S. Eur. J. Biochem. 125, 253-261 [1982]; og Joziasse, D.H. et al., J. Biol. Chem. 260, 4941-4951 [1985]). Mer spesifikt har en Gal61,4GlcNAc-a2,6-sialyltransferase og en Gall3l,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase blitt renset fra rottelevermembraner (Weinstein et al. ibid).

Andre glykosyltransferaser har blitt isolert som oppløselige enzymer i serum, melk eller kolostrum inkludert sialyl-, fukosyl-, galaktosyl-, N-acetylglukosaminyl- og N-acetyl-galaktosaminyltransferaser. (Beyer et al., ibid). Bovin og human 13-N-acetylglukosamid-fil,4-galaktosyltransferase har blitt isolert (Narimatsu, H. et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 83,4720-4724 [1986]; Shaper, N.L. et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 83,1573-1577 [1986]; Appert, H.E. et al., Biochem. Biophys. Res. Common, 139, 163-168

[1986]; og Humphreys-Beyer, M.G. et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 83, 8918-8922

[1986]. Disse rensede glykosyltransferasene har forskjellige størrelse noe som kan skyldes fjerningen av deler av proteinet som ikke er nødvendig for aktiviteten, slik som områder som spenner over membranen.

Sammenligning av avledede aminosyresekvenser av cDNA-klonene som koder for glykosyltransferaser omfatter galaktosyltransferaser, sialyltransferase, fukosyltransferase og N-acetylgalaktosaminyltransferase, viser at disse enzymene tilsynelatende ikke har noen sekvenshomologi. Noe innsikt i hvordan denne familien glykolsyltransferaser kan være strukturelt beslektet har kommet fra nylige analyser av primærstrukturen av klonene sialyltransferaser (Weinstein, J. et al., ibid). Imidlertid har de alle en kort NH2-terminal cytoplasmatisk hale, et 16-20 aminosyrer langt signal-ankerområde og en forlenget stammeregion som er fulgt av det stirre COOH-terminale katalytiske området, Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 262,17735-17743 [1987], Paulson, J.C. et al., J. Biol. Chem., 264,17615-17618 [1989]. Signal-ankerområdet virker både som ikke-spaltede signalpeptider og som membran-overspennende regioner og orienterer katalytiske områder av disse glykolsyltransferasene i lumen av Golgi-apparatet. Vanlige aminosyresekvenser forventes innen familier av glykosyltransferaser som deler tilsvarende akseptorer eller donorsubstrater; imidlertid er overraskende få regioner med homologi blitt funnet mellom de katalytiske områdene av glykosyltransferaser og ingen signifikant sekvenshomologi er funnet med noen andre proteiner i GenBank (Shaper, N.L. et al., J. Biol. Chem., 216,10420-10428 [1988], D'Agostaso, G. et al., Eur. J. Biochem., 183,211-217 [1987] og Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 262,17735-17743 [1987]). Dette er spesielt overraskende for Gal-al,3-GT of GlcNAc-J31,4-GT, to galaktosyltransferaser. Imidlertid har ikke disse galaktosyltransferasene noen total homologi, men det er et felles heksapeptid KDKKND for Gal-_1,3-GT (bovin, 304-309) og RDKKNE for GlcNAc-61,4-GT (bovin, human, murine aminosyrer 346-351). (Joziasse et al., J. Biol. Chem., 264,14290-14297 [1989]).

Sialinsyrer er terminalsukkere på karbohydratgrupper som er til stede på glykoproteiner og glykolipider og er vidt distribuert i animalske vev (Momol, T. et al, J. Biol. Chem., 261.16270-16273 [1986]). Sialinsyre spiller viktige roller i biologiske funksjoner av karbohydratstrukturer på grunn av deres terminale posisjon. For eksempel, fungerer sialinsyrer som ligand for binding av influensavirus til en vertscelle (Paulson, J.C, The Receptors, vol. 2, Conn, P.M., redaktør, sidene 131-219, Academic Press [1985]). Selv en forandring i sialinsyrebindinger er tilstrekkelige for å forandre vertsspesifisitet (Roger, G.N. et al., Nature, 304, 76-78 [1983]). Nøytralcelleadhesjonsmolekylet (NCAM) er utsatt for utviklingsmessig regulert polysialylering som er antatt å modulere en NCAm mediert celleaddisjon under utviklingen av nervesystemet (Rutishauser, U. et al., Science, 240, 53-37 [1988] og Rutishauser, U., Avd. Exp. Med. Biol., 265,179-18

[1990]). Nylig har en karbohydratstruktur, sialyl-lewis-X (SLe<x>) blitt vist å virke som en ligand for det endoteliale leucocyttadhesjonsmolekylet ("E-Selectin") som medierer bindingen av neutrofiler til aktiverte endoteliale celler (Lowe et al., 1990; Phillips et al., 1990; Goelz et al., 1990; Walz et al., 1990; Brandley et al., 1990). P-selektin (blodplateaktiveringsavhengig partikkel til ekstern membranprotein; CD62), et annet medlem av selektinfamilien (Stoolman, L.M., Cell, 56, 907-910 [1989]) har også blitt vist å gjenkjenne SLe<x> som er til stede på monocytter og PMN (Larsen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87,6674-6678 [1990]; Momol et al., J. Biol. Chem., 261,16270-16273 [1986]; Polley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88,6224-6228 [1991]; Chan, K.F.J., J. Biol. Chem., 263, 568-574 [1988]; Beyer, T.A. et al., Adv. Enzymol., 52,23-175 [1981]). I begge tilfeller, er sialinsyre en nøkkelkomponent for at karbohydratstrukturen fungerer som en ligand. I tillegg til å spille en rolle i celleaddisjonen, har sialinsyreinnholdende karbohydratstrukturer blitt funnet å spille en direkte rolle i differensieringen. Den hematopoetiske cellelinjen HL-60 kan bli indusert til å differensiere behandling med glykolipid G\ij3. Gangliosider er også antatt å spille en rolle i moduleringen av vekstfaktor-proteinkinase-aktiviteter og i kontroll av cellecyklus.

En slik sialyltransferase har blitt renset, som beskrevet i US-PS 5 047 335. Mens noen mengder "rensede" sialyltransferase har vært tilgjengelige, er de tilgjengelige i meget lave mengder, delvis på grunn av at de er membranbundne proteiner i det endeoplasmatiske retikulum og i Golgi-apparatet. Betydelig kostnad, både økonomisk og innsatsmessig, ved rensing av disse sialyltransferasene gjør det til et lite tilgjengelig materiale. Det er et mål ved foreliggende oppfinnelse å isolere DNA-kodende sialyltransferaser og å produsere nyttige mengder av mammalsk, spesielt humane, sialyltransferaser ved bruk av rekombinante DNA-teknikker. Det er videre et mål å fremskaffe et middel for fremskaffelse av DNA som koder for andre medlemmer av sialyltransferase-genfamilien fra forskjellige vev så vel som fra forskjellige arter. Det er også ønskelig å fremstille nye former av sialyltransferaser. Det er enda et mål her å fremskaffe et forbedret middel for katalysering av overføringen av sialinsyre til terminale posisjoner på visse karbohydratgrupper. Disse og andre mål ifølge foreliggende oppfinnelse vil tydelig fremgå fra beskrivelsen som et hele.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Målene med foreliggende oppfinnelse har blitt oppnådd ved en fremgangsmåte omfattende: identifisering og kloning av gener som koder for mammalske sialyltransferaser (definert nedenfor), inkludert, men ikke begrenset til svin-Gal61,3GalNAc-a2,3-sialyltransferase ogrotte-Gall31,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase (forskjellig fra GalBl,4GlcNAc-cc2,6-sialyltransferase); innlemming av dette genet i en rekombinant DNA-vektor; transformering av en passende vertscelle med vektoren inkludert genet; uttrykking av det mammalske sialyltransferasegenet i en slik vertscelle; og gjenvinning av den produserte mammalske sialyltransferasen. Alternativt, kan forskjellige andre rekombinante teknikker bli benyttet for å oppnå ekspresjon av sialyltransferase. Tilsvarende, gjør foreliggende oppfinnelse det mulig å produsere mammalsk sialyltransferase og/eller derivater derav ved rekombinante teknikker, så vel som å fremskaffe midler for produksjon av slike sialyltransferaser. Sialyltransferasene er proteiner som er lite rikholdige og vanskelige å rense. Isoleringen og identifiseringen av sialyltransferasegenene var ekstremt vanskelig. mRNA mengden var liten og cellelinjer eller andre kilder av store mengder mRNA var utilgjengelige. Foreliggende oppfinnelse etablerte for første gang en sialyltransferase-genfamilie definert ved en konservert homologiregion i det katalytiske området av enzymet.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot DNA molekyl som koder for et rekombinant polypeptidenzym som har sialyltransferase enzymaktivitet, kjennetegnet ved at nevnte peptidenzym innbefatter et katalytisk domene hvori nevnte katalytiske domene innbefatter et konservert homologiområde som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: Cys-Arg-Arg-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Asn-Leu-Lys-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Gln-Ile-Asp-Ser-His-Asp-Phe-Val-Leu-Arg-Met-Asn-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu-Gly-Phe-Glu-Ala-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-His-His-Phe-Val-Tyr-Pro-Glu; Cys-Arg-Arg-Cys-Ile-Ile-Val-Gly-Asn-Gly-Gly-Val-Leu-Ala-Asn-Lys-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-IIe-Asp-Tyr-Asp-Ile-Val-Leu-Arg-Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys-Gly-Phe-Glu-Lys-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-Leu-Arg-Ile-Thr-Tyr-Pro-Glu;

og

Phe-Gln-Thr-Cys-Ala-Ile-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Asn-Ser-Gly-Cys-Gly-Gln-Glu-IIe-Asp-Thr-His-Ser-Phe-Val-Ile-Arg-Cys-Asn-Leu-Ala-Pro-Val-Gln-GIu-Tyr-Ala-Arg-Asp-Val-Gly-Leu-Lys-Thr-Asp-Leu-Val-Thr-Met-Asn-Pro-Ser(SEQ. ID. NO. 14)

og varianter derav, hvori nevnte varianter har minst 70% sekvenslikhet med nevnte rekombinante polypeptidenzym.

Videre omfatter oppfinnelsen en rekombinant ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den innbefatter et DNA-molekyl som nevnt over, og en sammensetning som er kjennetegnet ved at den innbefatter en celle transformert med den rekombinante ekspresjonsvektoren ifølge krav 6.

Den mammalske sialyitransferasen og derivater derav ifølge oppfinnelsen er nyttige i tilsetningen av sialinsyrer på karbohydratgrupper som er til stede på glykoproteiner og glykolipider. I tillegg, er sialyltransferase og derivater derav enzymatisk nyttige ved tilsetning av sialinsyre på sukkerkjeder for å produsere karbohydrater som virker som determinanter ved biologisk gjenkjenning. Slike sialyltransferase-enzymer kan bli benyttet i multi-enzymsystemer for syntese av oligosakkarider og derivater (Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc, H3, 4698 [1991] og Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc, 113, 6300 [1991]). Endelig, er DNA'et spesielt den konserverte homologiregionen i det katalytiske området, som koder for sialyltransferase-genfamilien ifølge oppfinnelsen, nyttig i fremskaffelsen av et middel for kloning av genet som koder for andre medlemmer av sialyltransferase-genfamilien. Andre anvendelser av sialyltransferase og DNA som koder for sialyltransferase vil være tydelig for fagmannen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur INukleotid og aminosyresekvens av svin-Gal61,3GalNAc-a2,3-sialyltransferase ("a2,3-0"). Nukleotidsekvensen av svin-a2,3-0 mRNA ble bestemt fra DNA-sekvensanalyse av to overlappende kloner, X.ST1 og A.ST2. Avledet aminosyresekvens av ct2,3-0-polypeptid er vist ovenfor DNA-sekvensen og er nummerert fra den første residien av N-terminalen av det analoge, rensede proteinet. Den foreslåtte signal-ankersekvensen er indikert (lys boks). Potensielle glykosyleirngsseter med sekvensen Asn-X-Thr er markert med en stjerne (<*>). Sekvensen tilsvarer den lange formen av ot2,3-sialyltransferasen, kodet ved de overlappende klonene A.ST1 og A,ST2. Se SEQ. ID.NO.: 1 og 2. Figur 2Nukleotid og aminosyresekvens av rotte-GalB 1,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase ("a2,3-N"). Nukleotidsekvensen av rotte-a2,3-N mRNA ble bestemt fra DNA-sekvensanalysen. Avledede aminosyrer av sialyltransferase-polypeptidet er vist ovenfor DNA-sekvensen og er nummerert fra den første residien av modne proteinet som bestemt ved N-terminal-proteinsekvensering. Se SEQ.ID.NO: 3 og 4. Figur 3 Rensing av a2,3-0-sialyltransferase på CDP-heksanolaminagarose (KC1-eluering). Homogenatet fra 2 kg svinelever ble satt på en CDP-heksanolaminagarosekolonne og eluert med en lineær gradient av KC1 (se Eksperimentelle prosedyrer). Proteinkonsentrasjon og sialyltransferase-aktivitet ved anvendelse av laktose som akseptorsubstrat, ble bestemt for individuelle fraksjoner. De to toppene av enzymaktivitet ble separert i oppsamling A og B, som indikert. Figur 4Rensing av a2,3-0-sialyltransferase på CDP-heksanolaminagarose (kolonne III,

CDP-eluering). Enzymaktiviteter ble bestemt ved det spesifikke akseptorsubstrat-antifrys-glykoproteinet (AFGP). I kolonnene A og B korrelerte eluering av enzymaktivitet hovedsakelig med 48 kDa og en 45 kDa-proteinform (se SDS-PAGE). Disse to fonnene, form A og form B av a2,3-sialyltransferase, hadde spesifikke aktiviteter på 8-10 enheter/mg protein. 48 kDa- og 45 kDa-formene ble blottet på en PVDF-membran og analysert ved NH2-terminal sekvensering. Figur 5NH2-terminale aminosyresekvenser av 48 kDa- og 45 kDa-a2,3-0-sialyltransferase-peptidene. De 16 hydrofobe aminosyrene nær NH2-terminalen av 48 kDA peptidet omfattende det gjentagende signal-ankerområdet, er understreket. Se SEQ.ID.NO. 6 og 10. Figur 6Restriksjonskart og sekvenseringsstrategi for to cc2,3-0-sialyltransferase cDNA-kloner. Figur 7 Sammenligning av målstrukturer og homologe regioner av to sialyltransferaser.

A, sammenligning av de primære sekvensene av a2,6-sialyltransferase og a2,3-0-sialyltransferase avslører en 45 aminosyre-region med 64% sekvensidentitet og 84% sekvenslikhet. B, det homologe området spenner over sammenhengen mellom ekson 2 og 3 i a2,6-sialyltransferasen og ligger innen det katalytiske området av begge enzymer.

Figur 8 Ekspresjon av en oppløselig, katalytisk aktiv a2,3-0-sialyltransferase. A: en cDNA som er rettet mot ekspresjon av en oppløselig form av a2,3-0-sialyltransferasen, sp-ST, ble konstruert ved å erstatte vill-type sialyltransferase-cytoplasmatisk området og signal-ankerområdet med insulin-signalpeptidet; sp-ST ble anslått å kode for et 38 kDA, utsktilt protein når det ble transfektert i vertsceller. B: sp-ST ble satt inn ekspresjonsvektor pSVL og transfektert inn i COS-1-celler; 48 post-transfeksjon ble cellene pulsmerket i 2 timer i media inneholdende Tran35S-merke, fulgt av en 5 timers etterfølgelsesperiode i et media uten innmerking. Dette media ble høstet, konsentrert 15 ganger og analysert ved SDS-PAGE/fluorografi. Doble prøver av sp-ST og mock-transfektert cellemedia ble analysert. C: COS-1-celler ble transfektert med lipofektin (+sp-ST) eller lipofektin alene (mock) på identisk måte som 7B; 48 timer etter transfeksjon ble mediet oppsamlet, konsentrert 15 ganger og

analysert for sialyltransferase-aktivitet med det spesifikke akseptor-substratet AFGP (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254,4434-4443

[1979]). Figur 9CID-spektrum av det lengste sekvenserte tryptiske peptidet fra Gal-a2,3-N-sialyltransferase-enzymet. Peptidsekvensen er Leu-Thr-Pro-AIa-Leu-Asp-Ser-Leu-His-Cys<*->Arg, MH<+>=1283,6. Cys<*> står for karboksy-metylcystein. Ioner med ladningsretensjon ved N-terminalen er merket som a-, b-, c-ioner, og C-terminal-ioner er angitt som x-, y- og z-fragmenter (Biemann, K. (1990), Meth. Enzymol., 193: 886-887). De første ionene (a, x) er produkter av en spalting mellom oc-karbon og karbonylgruppen. Ioner y og b er dannet når peptidbindingen er spaltet. Ioner c og z er til stede på grunn av spaltingen mellom aminogruppen og ct-karbonet. Nummereringen av disse fragmentet er alltid initiert ved den respektive terminal. Sidekjedefragmentering skjer mellom 6- og oc-karboner av aminosyrene, for å gi såkalt d- (N-terminal) og w-(C-terminal) ioner. Observerte fragmentioner er inkludert i tabellen. Ioner som hører til samme ioneserie er listet i rekker. Figur 10 CID-spektrum av karbamylert tryptisk peptid fra Gal-cc2,3-N-sialyltransferase-enzym. Peptidsekvensen er Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys, MH<*>=771,4. Fragmentering indikerer klart modifikasjon ved N-terminalen og ikke ved e-aminogruppen av lysinresidien. Et tilstedeværende ion ved m/z 669 (w7) bekrefter nærværet av en N-terminal Ieucin i dette peptidet. Ioner merket med stjerne er matriks-relaterte bakgrunnsioner (Falick et al. (1990), Rapid Commun. Mass Spectrom., 4, 318). Observerte fragmentioner er inkludert i tabellen. Ioner som hører til samme ioneserie er listet i rekker. Figur 11 Oppsett av peptider 1 og 11 avledet fra GalBl ,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase (ST3N) med forhåndsvis klonede sialyltransferaser. GalBl,4GlcNAc-a2,6sialyltransferase (ST6N) og GalBl,3GalNAc-a2,3-sialyltransferase (ST30) er vist som åpne søyler. Faste bokser indikerer signal-ankersekvens. Stripede bokser indikerer homologiregioner identifisert mellom to sialyltransferaser. Figur 12 Den konserverte regionen delt av de tre klonede sialyltransferaser. De tre klonede sialyltransferasene er rotte-Gallfl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase (ST3N), (SEQ.ID.NO. 11), svin-GalBl,3GalNAc-a2,3-sialyltransferase (ST30) (SEQ.ID.NO. 12) og rotte-GalBl,4GlcNAc-a2,6-sialyltransferase (ST6N) (SEQ.ID.NO. 13). Regionen består av 55 aminosyrer fra residie 156 til residie 210 av GalBl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase (ST3N). Aminosyre-identitetene er indikert ved boksoppdeling. Figur 13 Avledet aminosyresekvens av det forsterkede fragment, SMI, og sammenligning med den tidligere karakteriserte konserverte homologiregionen. Den konsensus konserverte homologiregionen ble generert for sammenligning av den konserverte homologiregionen av de klonede og karakteriserte sialyltransferasene og det forsterkede fragment SMI (SEQ.ID. NO. 14). De konstante aminosyrene er indikert med store bokstaver, mens aminosyrene som er til stede i mer enn 50% av den konserverte homologiregionen er med små bokstaver. Posisjonene r eller q er funnet angitt med b; posisjoner hvor enten i eller v er funnet, er angitt med x. De understrekede aminosyrene står for regioner som ble benyttet i utformingen av de avledede primere. Forandringer i de tidligere konstante aminosyrene funnet i forsterkede fragmenter er merket med stjerner. Figur 14 Nukleotid og avledet aminosyresekvenser av STX1. Den avledede aminosyresekvensen med den lengste åpne leserammen koder for den konserverte homologiregionen SMI (aminosyrer 154-208), identifisert ved en skyggelagt boks. Den foreslåtte signal-anker (aminosyrer 8-23)-sekvensen er satt i rammer og de potensielle N-bundne glykosyleringssetene er understreket.

DETALJERT BESKRIVELSE

Som benyttet her refererer sialyltransferase eller sialyltransferase-derivater til sialyltransferase-enzymer forskjellig fra rotte-GalBl,4GlcNAc-a2,6-sialyltransferase som inneholder en konservert homologiregion i det katalytiske området og er enzymatisk aktive i overføring av sialinsyre til en terminal posisjon på sukkerkjeder på glykoproteiner, glykolipider, oligosakkarider og lignende. Eksempler på enzymatisk, funksjonelle sialyltransferaser er de som er i stand til å overføre sialinsyre fra CMP-sialinsyre til et akseptor-oligosakkarid, hvor oligosakkaridakseptoren varierer avhengig av den bestemte sialyltransferasen.

"Konservert homologiregion" refererer til en serie aminosyre i en sialyltransferase som hovedsakelig er identisk med den samme serien aminosyrer i et annet sialyltransferase-enzym når sekvensen i de to enzymene blir sammenlignet. I sialyltransferase-genfamilien ifølge oppfinnelsen er den konserverte homologiregionen i det katalytiske området og strekker seg over minst 7 sammenhengende aminosyrer, fortrinnsvis minst 20 aminosyrer og mest foretrukket over minst omkring 55 aminosyrer som har

aminosyresekvensen i residiene 156-210 ifølge figur 2 eller residiene 142-196 i figur 1. Når den konserverte homologiregionen er identifisert, kan aminosyresekvensvarianter av konserverte regioner bli gjort og faller innen en eller flere av disse klassene: substitusjon, insertsjon eller delesjon varianter. Disse variantene blir vanligvis fremstilt ved sete-spesifikk mutagenese-nukleotider i DNA som koder for sialyltransferase for derved å produsere DNA som koder for sialyltransferase som omfatter en konservert homologiregion-variant.

Også inkludert i rammen av sialyltransferase er eksempelvis rotte-GalJ31,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase (her referert til som "a2,3-N") (SEQ.ID.NO.4) som danner NeuNAc-a2,3GalBl,3GlcNAca og NeuAca2,3GalBl,4GlcNAc-sekvenser som ofte terminerer komplekse N-bundne oligosakkarider. Andre eksempler på et enzym som er omfattet innen rammen av sialyltransferaser er svin-GalBl,3GalNAc-a2,3-sialyltransferase (her referert til som "a2,3-0") (SEQ.ID.NO. 2) som danner NeuAca2,3GalBl ,3GalNAc funnet på sukkerkjeder som er O-bundet til treonin eller serin så vel som terminal sekvenser på visse gangliosider.

Inkludert innen rammen av sialyltransferaser som uttrykket blir benyttet her, er sialyltransferaser som har nativ glykosylering og aminosekvenser av rotte- og svin-sialyltransferaser som angitt i figur 1 eller 2, analoge sialyltransferaser fra andre dyrearter som storfe, menneske og lignende, så vel som andre vev, deglykosylerte eller ikke-glykosylerte derivater av slike sialyltransferaser, aminosyresekvensvarianter av forskjellige sialyltransferaser og in vitro-genererte, kovalente derivater av sialyltransferaser. Alle disse formene av sialyltransferase inneholder en konservert homologiregion og er enzymatisk aktive eller, hvis ikke, bærer minst en immunepitop felles med enzymatisk aktive sialyltransferaser.

Aminosyresekvensvarianter av sialyltransferaser faller i en eller flere av tre klasser: substitusjon, insertsjon eller delesjon varianter. Disse variantene blir vanligvis fremstilt ved sete-spesifikk mutagenese av nukleotider i DNA som koder for sialyltransferase for derved å produsere DNA som koder for varianter og deretter uttrykke DNAet er rekombinante cellekulturer. Imidlertid, kan forskjellige sialyltransferasefragmenter med opptil 100-150 residier av fremstilt ved anvendelse av in vitro-syntese. Aminosyresekvensvarianter blir kjennetegnet ved deres forhåndsbestemte egenskap av variasjon, en egenskap som skiller dem fra naturlig forekommende alleliske eller variasjoner mellom arter av sialyltransferase-aminosyresekvensen. Variantene i den konserverte homologiregionen viser de samme kvalitative biologiske aktiviteter som naturlig forekommende analoger.

Mens sete for innføring av en aminosyresekvensvariasjon er forhåndsbestemt, trenger mutasjonen per se ikke å være forhåndsbestemt. For eksempel, for å optimalisere utførelsen ved mutasjon ved et gitt sete, kan tilfeldig mutagenese bli utført ved målkodonet eller regionen og de uttrykte sialyltransferase-variantene screenet for optimal kombinasjon av ønsket aktivitet. Teknikker for fremstilling av substi-tusjonsmutasjoner ved forhåndsbestemte seter i DNA'et som har en kjent frekvens er velkjent, f.eks. Ml 3 primer-mutagenese eller PCR-mutagenese.

Aminosyresubstitusjonen er typisk enkle residier; insertsjoner vil vanligvis være i størrelse på omkring 1 til 10 aminosyreresider og delesjoner vil være i området fra 1 til 30 resider. Delesjoner eller insersjoner blir fortrinnsvis gjort ved to hosliggende par, dvs. en delesjon av 2 residier eller insertsjon av 2 residier. Substitusjoner, delesjoner og insertsjoner eller en hvilken som helst kombinasjon av disse kan bli kombinert for å komme til et endelig konstrukt. Naturligvis må mutasjoner som vil bli gjort i DNA som koder for variant sialyltransferase ikke plassere sekvensen ut av leserammen og fortrinnsvis vil ikke skape komplementære regioner som vil produsere sekundære mRNA-strukturer (EP 75.444A).

Substitusjonsvarianter er de hvor minst en residie i figur 1 eller 2 sekvenser har blitt fjernet og forskjellige residier satt i dette sted. Slike substitusjoner blir generelt utført ifølge tabell 1 når det er ønskelig å endelig modulere karakteristikkene til sialyltransferase.

Betydelige forandringer i funksjon eller immunologisk identitet blir gjort ved å selektere substitusjoner som er mindre konservative enn de i tabell 1, dvs. utvelger residier som er mer betydelig forskjellige i deres effekt på å holde

(a) strukturen av polypeptidskjelettet i substitusjonsområdet, f.eks. så som et plan

eller helisk konformasjon,

(b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet på målsetet eller (c) størrelsen av sidekjeden. Substitusjonen som generelt er antatt å produsere de største forandringene i sialyltransferase-egenskaper vil være (a) hydrofile residier, f.eks. seryl eller treonyl, blir byttet med (eller for) en hydrofob residie, f.eks. leucyl, isoleucyl, fenylalanyl, valyl eller alanyl; (b) en cystein eller prolin er utbyttet med (eller for) en hvilken som helst annen residie; (c) en residie som har en elektropositiv sidekjede, f.eks. lysyl, arginyl eller histidyl, er utbyttet for (eller med) en elektronegativ residie, f.eks. glutamyl eller aspartyl;

eller

(d) en residie som har en stor sidekjede, f.eks. fenylalanin, er utbyttet med (eller for)

en som ikke har noen sidekjede, f.eks. glycin.

En hovedklasse av substitusjon eller delesjon varianter er de som omfatter transmembran og/eller cytoplasmatiske regioner av sialyltransferase. Det cytoplasmatiske området av sialyltransferase er sekvensen av aminosyreresidier som starter ved startkodonet vist i figur 1 og 2 og fortsetter omkring 11 ytterligere residier. I rotte- og svineresidier 10-28 og 12 til 27 henholdsvis, antatt å tjene som stopp-transfersekvens. De konformasjonelle bøyninger innført ved Phe-Val-Arg-Asn-(SEQ.ID.NO. 15) og Pro-Met-Arg-Lys-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys-(SEQ.ID.NO. 16) residiene i henholdsvis rotte og svin, og elektropositiv karakter til disse residiene, virker sammen med den nedenfor beskrevne transmembrane regionen for å stanse overføring av sialyltransferase gjennom cellemembranen.

Den transmembrane regionen av sialyltransferase er lokalisert i svinesekvensen ved omkring residiene 12-27 (hvor Ala er +1 er vist i figur 2), og rottesekvensen ved analog lokalisering. Denne regionen er et sterkt hydrofobt område som er den riktige størrelsen for å spenne over lipidbilaget av den cellulære membranen. Det er antatt å virke sammen med det cytoplasmatiske området for å forankre sialyltransferasen i Golgi-apparatet eller endoplasmatisk retikulum.

Delesjon eller substitusjon av en eller begge av cytoplasmatiske og transmembrane områder vil lette gjenvinningen av rekombinant sialyltransferase ved å redusere dets cellulære eller membrane lipiders affinitet og forbedre dets vannløselighet slik at detergenter ikke vil være påkrevet for å holde sialyltransferase i vandig oppløsning. (Se f.eks. US-PS 5 032 519 som beskriver produksjon av oppløselige B-galaktosid-cc2, G-sialyltransferase som er spesifikt innlemmet her som referanse). Delesjon av det cytoplasmatiske området alene, mens den transmembrane sekvensen blir opprettholdt, vil produsere sialyltransferase som ville bli oppløst med detergent. Sialyltransferasen med deletert cytoplasmatisk område vil med større sannsynlighet sette seg inn membranen for derved å muliggjøre å finne dets enzymatiske aktivitet. Fortrinnsvis blir det cytoplasmatiske eller transmembranområdet deletert heller enn substituert (f.eks. aminosyrer 1-33 i rotte ct2,3-N-sialyltransferase for stopp-transfer-sekvensen for å gi oppløselig sialyltransferase).

Den cytoplasmatiske og/eller transmembran (C-T) deleterte eller substituerte sialyltransferasen kan bli syntetisert direkte i rekombinante cellekulturer eller som

funksjon med en signalsekvens, fortrinnsvis et verts-homologt signal. For eksempel, ved å konstruere en prokaryot ekspresjonsvektor blir C-T-området deletert til fordel for den bakterielle alkaliske fosfatasen, lpp eller varmestabil enterotoksin-II-ledere, og for gjær blir områdene substituert med gjær invertase ct-faktor eller sur fosfataseledere. I mammalske celler blir ekspresjon av C-T-områder substituert med en mammalsk celle viral sekretorisk leder, f.eks. herpes simplex gD-signalet. Når den sekretoriske lederen blir "gjenkjent" av verten, er vertens signalpeptidase i stand til å spalte en fusjon av lederpolypeptidet som er forbundet ved dens C-terminus til C-T-deletert sialyltransferase. Fordelen ved C-T-deletert sialyltransferase er at den er i stand til å bli utskilt i kulturmediet. Denne varianten er vannoppløselig og har ikke en observerbar affinitet for cellemembranlipider, for således betydelig å forenkle dets gjenvinning fra den rekombinante cellekulturen.

Tilsetning av detergent, slik som en ikke-ionisk detergent, kan bli benyttet for å oppløse, stabilisere og/eller øke den biologiske aktiviteten til proteiner som inneholder en membran-ankringssekvens. For eksempel, er deoksycholinsyren en foretrukket detergent og Tween, NP-50 og Triton X-100, så vel som andre detergenter kan bli benyttet. Valg av detergent blir bestemt av legen basert på de bestemte omgivelsesbetingelser og egenskapen til det involverte polypeptidet/polypeptidene.

Substitusjon eller delesjon mutagenese blir benyttet for å eliminere N- eller O-bundne glykosyleringsseter. Alternativt blir ikke-glykosylerte sialyltransferaser produsert i rekombinante prokaryote cellekulturer. Delesjoner av cystein eller andre labile residier kan også være ønskelig, f.eks. i økning av den oksydative stabiliteten til sialyltransferasen. Delesjoner eller substitusjoner av potensielle proteolyseseter, dvs. dibasiske residier slik som Arg Arg, blir utført ved deletering av en av de basiske residiene eller substituering med en med glutaminyl- eller histidylresidier.

Insertsjon aminosyresekvensvarianter av sialyltransferase er de, hvor en eller flere aminosyreresidier blir innført i et forhåndbestemt sete i mål sialyltransferasen. Vanligvis er insertsjon varianter fusjoner av heterologe proteiner eller polypeptider til amino- eller karboksylterminalen av sialyltransferasen.

DNA som koder for sialyltransferase, blir fremskaffet fra andre kilder enn rotte eller svin ved a) å skaffe til veie et cDNA-bibliotek for forskjellige vev, slik som lever eller submaksillar kjertler fra det bestemte dyret, b) utføring av en hybridiseringsanalyse med merket DNA som koder for den konserverte homologiregionen av sialyltransferase eller fragmenter derav

(vanligvis større enn 30 bp) for å detektere kloner i cDNA-biblioteket inneholdende homologe sekvenser, og

c) analysere klonene med restriksjonsenzymanalyse og nukleinsyresekvensering for å identifisere full-lengde kloner. Dersom full-lengde kloner ikke er til stede i

biblioteket, så kan de riktige fragmentene bli gjenvunnet fra forskjellige kloner og ligert ved restriksjonsseter som er vanlige i klonene for å sette sammen en full-lengde klone.

"Hovedsakelig fri fra" eller "hovedsakelig ren" blir benyttet for å beskrive tilstanden til sialyltransferasen produsert ved oppfinnelsen, og betyr fri for proteiner eller andre materialer som normalt er forbundet med sialyltransferase i dets naturlig forefinnende in vivo fysiologiske miljø, som f.eks. når sialyltransferasen blir fremskaffet fra blod og/eller vev ved ekstrahering og rensing. Sialyltransferase produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen var større enn eller lik 95 vekt-% sialyltransferase av totalt protein; utgjorde et enkelt mettet bånd (ved Coomasie-blå-farging) ved polyakrylamid-gelelektroforese; og hadde en spesifikk aktivitet på minst omkring 500 nmol/mg protein/min.

Uttrykkene "vesentlig lik" eller "vesentlig identitet" som benyttet her, angir en karakteristikk av polypeptidsekvensen eller nukleinsyresekvensen, hvor polypeptidsekvensen har minst 70% sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens og nukleinsyresekvensen har minst 80% sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens. Prosentandelen av sekvensidentitet er beregnet ved å ekskludere mindre delesjoner eller addisjoner som utgjør mindre enn 35% av referansesekvensen. Referansesekvensen kan være en delmengde av en større sekvens, slik som de vist i figurene 1 og 2; imidlertid, er referansesekvensen minst 18 nukleotider lang for polynukleotider, og minst 6 aminoresidier lang for et polypeptid.

Generelt, blir prokaryoter benyttet ved kloning av DNA-sekvenser ved konstruksjon av vektorene som er nyttige i oppfinnelsen. F.eks., er E. coli Kl 2 stamme 294 (ATCC nr. 31446) spesielt nyttig. Andre mikrobielle stammer som kan bli benyttet omfatter E. coli B og E. coli XI776 (ATCC nr. 31537). Disse eksemplene er illustrative ikke begrensende.

Prokaryoter blir også benyttet for ekspresjon. De ovenfor nevnte stammer, så vel som E. coli W3110 (F- X; prototropisk, ATCC nr. 27325), bacilli slik som Bacillus subtilus, og andre enterobakteriacea slik som Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskjellige pseudomonas-arter kan bli benyttet.

Generelt, blir plasmidvektorer inneholdende promoter og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er forenelige med vertscellen, benyttet med disse vertene. Vektoren bærer vanligvis et replikasjonssete så vel som markørsekvens, som er i stand til å fremskaffe fenotypisk seleksjon i transformerte celler. F.eks., blir E. coli transformert ved bruk av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, 2, 95 [1977]). pBR322 inneholder gener for ampicillin og tetracyklinresistans og gir således enkle midler for identifisering av transformerte celler. pBR322-plasmidet eller andre mikrobielle plasmider kan også inneholde eller bli modifisert for å inneholde promotere og andre kontrollelementer som vanligvis blir benyttet i rekombinant DNA-konstruksjon.

Promotere som passer for anvendelse med prokaryote verter omfatter illustrativt B-laktamase og laktosepromotersystemene (Chang et al., Nature, 275,615 [1976]; og Goeddel et al., Nature, 28_L 544 [1979]), alkalisk fosfatase, tryptofan (trp) promotersystem (Goeddel, D., Nucleic Acids Res., 8, 4057 [1980])og hybridpromotere slik som tac-promoteren (de Boer, R, PNAS (USA) 80,21-25 [1983]). Imidlertid er andre funksjonelle, bakterielle promotere passende. Deres nukleotidsekvenser er generelt kjent, noe som muliggjør at en fagperson operativt kan ligere dem til DNA som koder for sialyltransferase (Siebenlist et al., Cell, 2 [1980]) ved anvendelse av linkere eller adapterer for å tilføre et hvilket som helst nødvendig restriksjonssete. Promotere for anvendelse i bakterielle systemer vil også inneholde en Shine-Dalgamo-(S.D.)-sekvens operativt bundet til DNAet som koder for sialyltransferase.

I tillegg til prokaryoter, kan eukaryote mikrober slik som gjærkulturer også<l>bli benyttet. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig bakegjær er den vanligste brukte eukaryote mikroorganismen, selv om et antall andre stammer er vanlig tilgjengelige. For ekspresjon i Saccharomyces, blir f.eks. plasmid YTp7 (Stinchomb et al., Nature, 282. 39

[1979]; Kingsman et al.} Gene, 7, 141 {1979]; Tschemper et al., Gene, 10,157 [1980]) vanlig benyttet. Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som gir en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85, 12 [1977]). Nærværet av trpl-lesjonen som et karakteristika til gjærvertscellegenomet gir således et effektivt miljø for detektering av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan.

Passende promotersekvenser for anvendelse med gjærverter omfatter promotere for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255.2073 [1980]) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7,149, [1968]; og Holland, Biochemistry, 17,4900 [1978]), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosforglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase.

Andre gjærpromotere som er induserbare promotere med den ytterligere fordelen ved transkripsjon kontrollert ved vekstbetingelser, er promoterregionen for alkohol dehydro-genase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degradative enzymer forbundet med nitrogenmetabolismen, metallotionein, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase og enzymer som er ansvarlig for maltose- og galaktose-anvendelse. Passende vektorer og promotere for anvendelse i gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i R. Hitzeman et al., EP-PS 73.657A. Gjær-enhancere er også med fordel benyttet med gjærpromotere.

"Kontrollert region" refererer til spesifikke sekvenser ved 5'- og 3-endene av eukaryote gener som kan være involvert i kontrollen av enten transkripsjonen eller translasjonen. Hovedsakelig alle eukaryote gener har en TA-rik region lokalisert omkring 25 til 30 baser oppstrøms fra setet hvor transkripsjonen blir initiert. En annen sekvens funnet 70 til 80 baser oppstrøms fra starten av transkripsjonen av mange gener er CXCAAT-regionen hvor X kan være et hvilket som helst nukleotid. Ved 3'-enden av de fleste eukaryote gener er en AATAAA-sekvens som kan være signal for påsetting av poly-A-halen til 3'-enden av det transkriberte mRNA.

Foretrukne promotere som kontrollerer transkripsjon fra vektorer i mammalske vertsceller, kan bli fremskaffet fra forskjellige kilder, f.eks. genomene av vira slik som: polyoma, Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, retrovira, heptitt-B-vira og mest foretrukket cytomegalovirus, eller fra heterologe mammalske promotere, f.eks. B-aktinpromoter. De tidlige og sene promotere fra SV40-virus er passende fremskaffet fra SV40-restriksjonsfragment som også inneholder SV40 virale origo for replikasjon (Fiers et al., Nature, 273, 113 [1978]). Den umiddelbare tidlige promoteren fra det human cytomegalovirus er passende fremskaffet som et HindIII-E-restriksjonsfragment (Greenaway, P.J. et al., Gene, 18,355-360 [1982]). Naturligvis er også promotere fra vertscellen eller beslektede arter også anvendelige.

Transkripsjon av et DNA som koder for enkefalinase ved høyere eukaryoter blir øket ved innsetting av en forsterkersekvens i vektoren. Forsterkere er cis-virkende elementer av DNA, vanligvis fra omkring 10-300 bp, som virker på en promoter for å øke dens transkripsjon. Enhancere er relativt orienterings- og posisjonsuavhenige og kan bli funnet 5' (Laimins, L. et al., PNAS, 78, 993 [1981]) og 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell. Bio., 3j 1108 [1983]) for transkripsjonsenheten, inne i et intron (Banerji, J.L. et al., Cell, 33, 729 [1983]) så vel som i selve den kodende sekvensen (Osbome, T.F. et al.k Mol. Cell. Bio., 4j 1293 [1984]). Mange enhancersekvenser har blitt funnet fra mammalske gener (globin, elastase, albumin, cc-fetoprotein og insulin). Typisk vil man imidlertid benytte en enhancer fra en eukaryot cellevirus. Eksempler omfatter SV40-enhancer etter replikasjonsorigo (bp 100-270), cytomegalovirus tidlig promoterenhancer, polyoma-enhanceren på baksiden av replikasjonsorigo og adenovirus-enhancere.

Ekpresjonsvektorer benyttet i eukaryote vertsceller (gjær, fungi, insekt, plante, dyr, menneske eller celler med kjeme fra andre multicellulære organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendige for termineringen av transkripsjonen som kan påvirke mRNA-ekspresjonen. Disse regionene blir transkribert som polyadenylerte segmenter i den ikke-translaterte delen av mRNA som koder for sialyltransferase. 3'-ikke-translaterte regioner omfatter også transkripsjonstermineringsseter.

Ekspresjonsvektorer kan inneholde et seleksjonsgen, også kalt en selekterbar markør. Eksempler på passende selekterbare markører for mammalske celler er dihydrofolat-reduktase (DHFR), ornitindekarboksylase, multiple medikamentresistans biokjemisk markør, adenosindeaminase, asparaginsyntetase, glutaminsyntetase, thymidinkinase eller neomycin. Når slike selekterbare markører er transfektert suksessrikt i en mammalsk vertscelle, kan den transformerte vertscellen overleve hvis den blir plassert under selektivt trykk. Det er to vidt benyttede distinkte kategorier av selektive regimer. Den første kategorien er basert på en celles metabolisme og anvendelsen av en mutant cellelinje som mangler evnen til å vokse uavhengig av et tilført medium. To eksempler er CHO DHFR-celler og mus LTK-celler. Disse cellene mangler evnen til å vokse uten tilsetning av slike næringsmidler som thymidin eller hypoxantin. På grunn av at disse cellene mangler visse gener som er nødvendig for en fullstendig nukleotid syntese, kan de ikke overleve hvis ikke den manglende nukleotidsyntesen blir fremskaffet ved hjelp av et supplementert medium. Et alternativ til supplering til mediet er å introdusere et intakt DHFR- eller TK-gen i celler som mangler de respektive gener, for derved å forandre deres vekstkrav. De individuelle celler som ikke blir transformert med DHFR-eller TK-genet vil ikke være i stand til å overleve i ikke-supplementert medium.

Den andre kategorien er dominant seleksjon som refererer til et seleksjonsskjema benyttet i en hvilken som helst celletype og som ikke krever anvendelsen av en mutant cellelinje. Disse skjemaene benytter typisk et medikament for å stanse vekst til en vertscelle. De cellen som har et nytt gen vil uttrykke et protein som gir medikamentresistans og vil overleve seleksjon. Eksempler på slik dominant seleksjon anvender medikamentet neomycin (Southern, P. og Berg, P., J. Molec. Appl. Genet, i, 327 [1982]), mycofenolsyre (Mulligan, R.C. og Berg, P., Science, 209,1422 [1980]) eller hygromycin (Sugden, B. et al., Mol. Vell. Biol., 5, 410-413 [10985]). De tre eksemplene gitt ovenfor benytter bakteriegener under eukaryot kontroll for å gi resistans til det passende medikamentet G418 eller neomycin (genticin), xgpt (mycofenolsyre) eller hygromycin.

"Amplifikasjon" refererer til økningen eller replikasjonen av en isolert region innen en celles kromosomale DNA. Amplifikasjon blir oppnådd ved anvendelse av et seleksjonsmiddel, f.eks. metrotrexat (MTX) som inaktiverer DHFR. Amplifikasjon eller akkumuleringen av multiple kopier av DHFR-genet resulterer i at større mengder DHFR blir produsert overfor større mengder av MTX. Amplifikasjonstrykk blir påsatt trass nærværet av endogent DHFR, ved tilsetning av enda større mengder MTX til mediet. Amplifikasjon av et ønsket gen kan bli oppnådd ved kotransfektering av en mammalsk vertscelle med et plasmid med et DNA som koder for et ønsket protein og DHFR eller amplifikasjonsgenet ved kointegrasjon blir referert til koamplifikasjon. Man sikrer at cellen krever mer DHFR, som blir møtt ved replikasjon av seleksjonsgenet, ved seleksjon selekteres kun for celler som kan vokse i nærvær av stadig økende MTX-konsentrasjon. Så lenge som genet som koder for et ønsket heterologt protein er kointegrert med seleksjonsgenet, gir ofte replikasjon av dette gen opphav til replikasjon av genet som koder for det ønskede protein. Resultatet er at økede kopier av genet, dvs. et amplifisert gen, som koder for det heterologe proteinet uttrykker mer det ønskede heterologe proteinet.

Foretrukne passende vertsceller for ekspresjonen av vektorer ifølge oppfinnelsen som koder for sialyltransferase i høyere eukaryoter omfatter: apenyre CV1 linjetransformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryon nyrelinje (293) (Graham, F.L. et al., J. Gen. Virol., 36, 59 [1977]); babyhamster-nyreceller (BHK, ATCC CCL 10); kinesisk hamster-ovarieceller-DHFR (CHO, Urlaub og Chasin, PNAS (USA), 77,4216

[1098]); mus-sertoliceller (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod., 23,243-251 [1980]); ape-nyreceller (CV1, ATCC CCL 70); afrikansk grønnape-nyreceller (VERO-76, ATCC CRL 1587); humane cervikale karsinomaceller (HELA, ATCC CCL 2); kanin-nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); buffalorotte-leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); mus-mammarytumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); og TRI-celler (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383,44-46 [1982]); baculovirusceller.

"Transformasjon" betyr innføring av DNA inn i en organisme slik at DNA er replikerbar enten som et ekstrakromosomalt element eller ved kromosomal integrasjon. Hvis ikke annet er indikert, er fremgangsmåtene benyttet her for transformering av vertscellen i fremgangsmåten ifølge Graham, F. og Van der Eb, A., Virology, 52, 456-457 [1973]. Imidlertid kan andre fremgangsmåter for innføring av DNA inn i celler slik som ved nukleær injeksjon eller ved protoplastfusjon også bli benyttet. Dersom prokaryote celler eller celler som inneholder betydelige celleveggkonstruksjoner blir benyttet, er en foretrukket fremgangsmåte for transfeksjon kaliumbehandling ved anvendelse av kalsiumklorid som beskrevet av Cohen, F.N. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 [1972].

For analyse for å bekrefte korrekte sekvenser i plasmidkonstruksjoner, blir ligeringsblandinger benyttet for å transformere E. coli Kl2 stamme 294 (ATCC 31446) og suksessfulle transformanter valgt for ampicillin- eller tetracyklinresistens. Plasmider fra transformantene blir fremstilt, analysert ved restriksjon og/eller sekvensert ved fremgangsmåten ifølge Messing et al., Nucleic Acids Res., 9, 309 [1981] eller ved metoden ifølge Maxam et al., Methods in Enzymology, 65,449 [1980].

Vertsceller kan bli transformert med ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen og dyrket i konvensjonelle næringsmedia modifisert slik det passer for indusering av promotere, selektering av transformanter eller amplifiseringsgener. Kulturbetingelsene, slik som temperatur, pH og lignende, er de tidligere benyttet med den valgte vertscellen for ekspresjon og vil være kjent for fagmannen.

"Transfeksjon" refererer til opptaket av en ekspresjonsvektor av en vertscelle enten en

kodesekvens faktisk blir uttrykt eller ikke. Tallrike fremgangsmåter for transfeksjon er kjent for fagmannen, f.eks. CaPC>4 og elektroporering. Vellykket transfektering blir vanligvis fastslått ved at vektoren er aktiv i vertscellen.

For å lette forståelsen i de følgende eksemplene, vil visse fremgangsmåter og/eller utrykk som opptrer ofte bli beskrevet.

"Plasmider" er angitt ved en liten p etterfulgt og/eller fulgt av store bokstaver og/eller tall. Startplasmidene er enten kommersielt tilgjengelige, anvendt tilgjengelige på en ubegrenset basis, eller kan bli konstruert fra tilgjengelige plasmider ifølge publiserte prosedyrer. I tillegg, er ekvivalente plasmider til de beskrevet kjent i teknikken og vil være opplagte for fagmannen.

"Kutting" av DNA refererer til katalytisk spalting av DNA med et restriksjonsenzym som kun virker ved visse sekvenser i DNAet. De forskjellige restriksjonsenzymene benyttet her er kommersielt tilgjengelige og deres reaksjonsbetingelser, kofaktorer og andre krav blir benyttet slik de ville bli gjort av en fagmann. For analytiske formål, typisk 1 \ ig plasmid eller DNA-fragment benyttet med omkring 2 enheter enzym i omkring 20 ul bufferoppløsning. For det formål å isolere DNA-fragmenter for plasmidkonstruksjon, blir typisk 5 til 50 ug DNA digestert med 20 til 250 enheter enzym i et større volum. Passende buffere og substratmengder for bestemte restriksjonsenzymer spesifisert av fabrikanten. Inkubasjonstider på omkring 1 time ved 37°C blir vanligvis benyttet, men kan variere ifølge leverandørens instruksjoner. Etter digestion blir reaksjonsblandingen elektroforest direkte på en polyakrylamidgel for å isolere det ønskede fragmentet.

Størrelseseparering av det spaltede fragmentene blir utført vanligvis ved 8% polyakrylamidgel beskrevet i Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 [1980].

"Defosforylering" refererer til fjerning av den terminale 5'-fosfat ved behandling med bakteriell alkalisk fosfatase (BAP). Denne prosedyren forhindrer to restriksjonsspaltede ender av et DNA-fragment fra "sirkularisering" eller dannelse av en lukket sløyfe som vil hindre insersjon av et annet DNA-fragment ved restriksjonssetet. Prosedyrer og reagenser for defosforylering er konvensjonelle (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, s. 133-134 [1982]). Reaksjoner ved anvendelse av BAP blir utført i 50 mM Tris ved 68°C for å undertrykke aktiviteten av en eventuell eksonuklease som kan være til stede i enzympreparatene. Reaksjoner blir kjørt i 1 time. Etter reaksjonen ble DNA-fragmentet

gelrenset.

"Oligonukleotider" refererer enten til et enkeltstrenget polydeoksynukleotid eller to komplementære polydeoksynukleotidstrenger som kan være kjemisk syntetisert. Slike syntetiske oligonukleotider har ingen 5'-fosfat og vil således ikke ligere til et annet oligonukleotid uten å tilsette et fosfat med en ATP i nærvær av en kinase. Et syntetisk oligonukleotid vil ligere til et fragment som ikke har blitt defosforylert.

"Ligering" refererer til prosedyren ved dannelse av fosfodiesterbindinger mellom to dobbeltstrengede nukleinsyrefragmenter (Maniatis, T. et al., Id., p. 146). Hvis ikke annet er angitt, kan ligeringen bli utført ved anvendelse av kjente buffer og betingelser med 10 enheter T4 DNA-ligase ("ligase") pr. 0,5 ug av passende ekvimolare mengder av DNA-fragmenter som skal bli ligert. Konstruksjon av passende vektorer inneholdende den ønskede kodende og kontrollerende sekvensene anvender standard ligeringsteknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter blir spaltet, påsatt hale og religert i den form som er ønsket for å danne de ønskede plasmider.

"Innfylling" eller "blunt end" (blunt ending) refererer til prosedyrer ved hvilke den enkeltstrengede enden i den kohesive enden av et restriksjonsenzym-spaltet nukleinsyre blir omdannet til en dobbeltstreng. Dette eliminerer den kohesive terminalen og danner en stump ende. Denne prosessen er et anvendelige verktøy for omdannelse av en restriksjonskuttet ende som kan være kohesiv med endene dannet ved kun eller få andre restriksjonsenzymer til en ende som er forenelig med en hvilken som helst stump-kuttende restriksjonsendonuklease eller andre fyllede, kohesive ender. Typisk, blir ende-stumping utført ved inkubering av 2-15 |ig av mål-DNA i 10 mM MgC^, 1 mM ditiotreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tri-(pH 7,5)-buffer ved omkring 37°C i nærvær av 8 enheter av Klenow-fragment av DNA-polymerase I og 250 uM av hver av de fire deoksynukleosidtrifosfatene. Inkuberingen blir generelt terminert etter 30 minutter ved fenol og kloroformekstraksjon og etanolfelling.

Polynukleotider som tilsvarer eller er komplementære til deler av de beskrevne sekvensene kan bli benyttet som hybridiseringsprober for å identifisere og/eller isolere de respektive kjønnslinje genene. Slike polynukleotider kan også bli benyttet som hybridiseringsprober for å screene cDNA og genomiske biblioteker for å isolere cDNA og gener som koder for polypeptider som er strukturelt og/eller evolusjonært beslektet til sialyltransferasesekvensen ifølge oppfinnelsen. Alternativt, kan slike polynukleotider tjene som primere for amplifisering av kjønnslinje-genesekvenser eller beslektede

sekvenser ved polymerasekjedereaksjon (PCR).

Hybridiseirngsprober benyttet for identifisering og isolering av ytterligere sialyltransferase-cDNA-typer er utformet på basis av nukleotid og avledet aminosyresekvenser vist i figurene 1 og 2. Hybridiseirngsprober som er typisk merket ved innlemming av en radioisotop, kan omfatte en eller flere pooler av degenererte oligonukleotider som koder for hele eller en del av den konserverte regionen tilsvarende til det 55 restsegmentet som spenner fra aminosyreresidie 134 til aminosyreresidie 189 i svine-a2,3-0-sialyltransferase (figur 1). Spesielt, er heptapeptidmotivet -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr- (SEQ.ID.NO. 17) høyt konservert og hybridiseirngsprober inneholdende degenererte oligonukleotider som koder for dette temaet, eller varianter av dette motivet hvor en eller to aminosyrer modifisert slik at minst omkring 4 eller 5 aminosyrer i heptapeptidet blir igjen. Degenerert oligonukleotidprober som koder for enkle eller doble aminosyresubstitusjonsvarianter av heptapeptidtemaet er også anvendelig for screening etter beslektede sialyltransferase-cDNA-typer. I tillegg til degenererte oligonukleotider, kan fragmenter av klonede polynukleotider, slik som de angitt i figurene 1 og 2, bli benyttet som prober; det er foretrukket at slike prober spenner over heptapeptidmotivet og, hvor ønskelig, den konserverte 55 aminosyreresidiesegmentet beskrevet ovenfor.

Genomisk eller cDNA-kloner som koder for sialyltransferaser kan bli isolert fra klonebiblioteket ved anvendelse av hybridiseringsprober utformet på basis av sialyltransferase-nukleotidsekvenser slik som de vist i figurene 1 og 2. Hvor en cDNA-klon er ønsket, inneholder biblioteket cDNA avledet fra celler som uttrykker sialyltransferase(r), foretrukket.

Alternativt, kan syntetiske polynukleotidsekvenser korresponderende til hele eller deler av sekvensene vist i figurene 1 og 2 bli konstruert ved kjemisk syntese av oligonukleotider. I tillegg, kan polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av primer basert på sekvensdata beskrevet i figurene 1 og 2 bli benyttet for forsterket DNA-fragmenter fra genomisk DNA, mRNA-pooler eller fra cDNA-klonebiblioteker. US-PS 4 683 195 og 4 683 202 beskriver PCR-metoden. I tillegg, benytter PCR-metoden en primer som er basert på sekvensdata beskrevet i figurene 1 og 2 og en andre primer som ikke er basert på disse sekvensdata kan bli benyttet. For eksempel, kan en andre primer som er homolog til eller komplementær til et polyadenylasjonssegment bli benyttet.

Det er opplagt for fagmannen at nukleotidsubstitusjoner, delesjoner og addisjoner kan bli inkorporert i polynukleotidene ifølge oppfinnelsen. Imidlertid, må slike nukleotidsubstitusjoner, delesjoner og addisjoner ikke betydelig forstyrre evnen til polynukleotidet til å hybridisere til en av polynukleotidsekvensene vist i figurene 1 og 2 under hybridiseringsbetingelser som er tilstrekkelig stringente for å resultere i spesifikk hybridisering.

Nukleotid og aminosyresekvensene vist i figurene 1 og 2 tillater fagmannen å produsere polypeptider som tilsvarer hele eller deler av de kodede polypeptidsekvensene. Slike polypeptider kan bli produsert i prokaryote eller eukaryote vertsceller ved ekspresjon av polynukleotider som koder for full-lengde sialyltransferase(r) eller fragmenter og analoger derav. Alternativt kan slike polypeptider bli syntetisert ved kjemiske metoder eller produsert ved in vitro translasjonssystemer ved anvendelse av polynukleotidtemplat for direkte translasjon. Metoder for ekspresjon av heterologe proteiner i rekombinante verter, kjemisk syntese av polypeptider og in vitro translasjon er vel kjent i teknikken og beskrevet videre i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2. utg., Cold Spring Harbor, N.Y. og Berger og Kimmel, Methods in Enzymology, vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Fragmenter av sialyltransferase kan bli preparert av fagmannen. Foretrukne amino- og karboksyterminaler av fragmenter eller analoger opptrer nær grensene av strukturelle og/eller funksjonelle områder, f.eks. nær et enzyms aktive sete. Fragmenter omfattende hovedsakelig et eller flere funksjonelle områder kan bli smeltet sammen til heterologe polypeptidsekvenser, hvor det resulterende fusjonsproteinet viser de funksjonelle egenskapene, slik som en enzymatisk aktivitet, gitt av fragmentet. Alternativt, delesjonspolypeptider hvor en eller flere funksjonelle områder har blitt deletert viser tap av egenskapen som normalt blir gitt ved det manglende fragment.

Baculovirus eukaryot genekspresjon er en av de mest effektive måtene å generere store mengder av funksjonelt aktive proteiner fra klonede gener (Summers, M. og Luckow, V. (1988) Bio/Technology, 6: 47, som er innlemmet som referanse). Sialyltransferase polypeptider ifølge oppfinnelsen kan bli produsert fra klonede polynukleotider ved ekspresjon i et baculovirus ekpresjonssystem (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

En typisk sialyltransferase og dets rekombinante ekspresjonsprodukt blir fremskaffet ifølge den følgende protokoll:

1. Svinelever-sialyltransferase ble renset til tilsynelatende homogenitet.

2. Den N-terminale aminosyresekvensen av svine-sialyltransferase ble bestemt.

3. Oligonukleotidprober tilsvarende til 18 aminosyrer nær NH2-terminalsekvensen ble kjemisk syntetisert.

4. cDNA-biblioteker ble konstruert i Xgt\0, ved bruk av

a) tilfeldig primet polyA+-anriket mRNA fra svine-submaksillariekjertler,

b) oligo-dT-primet polyA+-anriket mRNA fra rottelever og

c) oligo-dT-primet polyA+-anriket mRNA fra rottehjerne.

5. En pool av radiomerket syntetisk deoksyoligonukleotider som er komplementære til kodoner for aminosyresekvenser av sialyltransferase ble benyttet som beskrevet nedenfor, slik som: 6. Det vilkårlig primede svine-submaksillare biblioteket ble screenet ved anvendelse av kjemisk syntetisert oligonukleotid lange og korte prober merket ved anvendelse av polynukleotidkinase og <32p_>ATP. Dobbelt positive plakk ble renset

og inserter sekvensert.

7. Et <32p_>merket insert ble benyttet for igjen å screene oligo-dT-primet svinesubmaksillare biblioteker. 8. Den fullstendige leserammen for svin-sialyltransferase ble fremskaffet fra to overlappende kloner. cDNA'et fra rottelever og -hjerne inneholdt den konserverte homologiregionen som bestemt ved DNA-sekvensanalyse av det fremskaffede

klonede materialet.

9. Full-lengde cDNA som koder for svine-sialyltransferase ble konstruert fra to overlappende kloner i et plasmid og sekvensert. Det må noteres at beskrivelse av DNA-sekvensen i figurene 1 og 2 muliggjør at en kan fremstille prober fra den konserverte homologiregionen av sialyltransferase cDNA, for derved betydelig å forenkle og øke effektiviteten av probing av cDNA eller genomiske biblioteker fra disse eller andre typer så vel som andre vev fra disse eller andre arter, og gjør det mulig å komme utenom sialyltransferase-rensing, sekvensering og fremstilling av

probepooler.

10. Full-lengde cDNA som koder for svin- og rotte-sialyltransferase, ble så satt inn i ekspresjonsbærer som ble benyttet for å transformere en passende vertscelle som

så ble dyrket i en kultur for å produsere den ønskede sialyltransferase.

11. Biologisk aktivt moden sialyltransferase produsert ifølge den foregående prosedyren kan ha alternative former som vist i figurene 4 og 5, noe som resulterer i to varianter av 45 kDa- og 48 kDa- molekylvekt.

Polynukleotider ifølge oppfinnelsen og rekombinant produserte sialyltransferase-polypeptider og fragmenter eller aminosyre-substituerte varianter av disse kan bli fremstilt på basis av sekvensdata vist i figurene 1, 2, 3, 5, 7 og 8, eller på basis av sekvensdata oppnådd fra nye sialyltransferase-cDNA isolert ved fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen. Produksjonen av polynukleotider og rekombinant produserte sialyltransferase-polypeptider ble utført ifølge fremgangsmåter som er kjent i teknikken og beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. og Berger og Kimmel, Methods in Enzymology, vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, som er innlemmet her som referanse. Polynukleotidsekvenser kan bli uttrykt i verter etter at sekvensen har blitt "operativt bundet" til (dvs. posisjonert for å sikre funksjoner) en ekspresjonskontrollerende sekvens slik at transkripsjonen av polynukleotidsekvensen skjer under passende betingelser for transkripsjon.

"Spesifikk hybridisering" er her definert som dannelsen av hybrider mellom et probe-nukleotid (f.eks. et polynukleotid ifølge oppfinnelsen som kan omfatte substitusjoner, delesjoner og/eller addisjoner) og et spesifikt mål polynukleotid (f.eks. et polynukleotid med en komplementær sekvens), hvor proben fortrinnsvis hybridiserer til det spesifikke målet slik at, f.eks. et enkelt bånd kan bli identifisert på et Northern-blott av RNA

fremstilt fra eukaryote celler som inneholder mål-RNA'et og/eller et enkelt hoved-PCR-produkt ble fremstilt når probe-polynukleotidet ble benyttet som en PCR-primer. I noen tilfeller kan målsekvensen være til stede i mer en mål-polynukleotidtype (f.eks. en bestemt målsekvens kan opptre i flere medlemmer av en sialyltransferase-genfamilie eller i alternativt spleisede RNA transkripter fra det samme genet). Det er tydelig at optimale hybridiseringsbetingelser vil være avhengig av sekvenssammensetningen og lengden av proben(e) og mål(ene), og eksperimentelle metoder som velges. Forskjellige retningslinjer kan bli benyttet for å velge passende hybridiseringsbetingelser (se Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), 2. utg., Cold Spring Harbor, N.Y. og Berger og Kimmel, Methods in Enzymology, vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, som er innlemmet her som referanse.

"Antisens polynukleotider" er polynukleotider som:

(1) er komplementære til hele eller deler av sekvensene vist i figurene 1 og 2, og/eller sekvenser oppnådd fra nye sialyltransferase cDNA'er isolert ved fremgangsmåter

ifølge oppfinnelsen, og

(2) som spesifikt hybridiserer til en komplementær målsekvens.

Slike komplementære antisens-polynukleotider kan omfatte

polynukleotidsubstitusjoner, addisjoner, delesjoner eller transposisjoner, så lenge spesifikk hybridisering til den relevante målsekvensen (f.eks. tilsvarende til figurene 1 eller 2) blir opprettholdt som en funksjonell egenskap til polynukleotidet. Komplementære antisenspolynukleotider omfatter oppløselige antisens RNA og DNA-oligonukleotider som kan hybridisere spesifikt til individuelle sialyltransferase mRNA-typer eller til multiple medlemmer av en sialyltransferase-mRNA-familie, og forhindre transkripsjon av mRNA-typer og/eller translasjon av det kodede polypeptid (Ching et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86: 10006-10010 (1989); Broder et al., Ann. Int. Med., 113: 604-618 (1990); Loreau et al., FEBS Letters, 274: 53-56 (1990); Holchenbert et al., W091/11535; USSSN 07/530.165 ("New human CRIPTO gene"); WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; og EP 386563, som alle er innlemmet her som referanse). Antisens-polynukleotidene hemmer derfor produksjonen av det kodede polypeptid(ene). Hva dette angår, kan antisens-polynukleotider som hemmer transkripsjon og/eller translasjon av en eller flere sialyltransferaser, endre kapasiteten og/eller spesifisiteten til en celle for glykosylat-polypeptider.

Antisens-polynukleotider kan bli fremstilt fra en heterolog ekspresjonskassett i en transfektert celle eller transgen celle, slik som transgen pluripotent hematopoietisk stamcelle benyttet for å rekonstituere hele eller deler av den hematopoietiske stamcelle-populasjonen i et individ. Alternativt kan antisens-polynukleotidene som omfatter oppløselige oligonukleotider som kan administreres til det eksterne miljø, enten i kulturmedium in vitro eller i sirkulasjonssystemet eller interstitielle væsken in vivo. Oppløselige antisens-polynukleotider som er til stede i det eksterne miljø, har blitt vist og fått tilgang til cytoplasma og hemmer translateringen av spesifikke mRNA-typer. I noen utførelsesformer omfatter antisens-polynukleotidene metylfosfonatdeler, alternativt kan fosforotiolater eller O-metylribonukleotider bli benyttet, og chimere oligonukleotider kan også bli benyttet (Dagle et al. (1990) Nucleic Acids Res., 18: 4751). For noen anvendelser kan antisens-oligonukleotider omfatte polyamidnukleinsyrer (Nielsen et al., (1991), Science, 254: 1497). For generelle fremgangsmåter angår en antisens-polynukleotid, se Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Antisens-polynukleotider som er komplementære til en eller flere sekvenser, blir benyttet for å hemme translateringen av det gjenkjente mRNA-typen og derved gi en reduksjon i mengden av det respektivt kodede polypeptid. Slike antisens-polynukleotider kan gi en terapeutisk funksjon ved å hemme dannelsen av en eller flere sialyltransferaser in vivo.

Transgene dyr som huser en eller flere integrerte kopier av et sialyltransferase-transgen kan bli konstruert. Sialyltransferase-transgener er polynukleotider omfattende et polynukleotidsekvens som koder for et sialyltransferase-protein eller -fragment som er operativt bundet til en funksjonelle promoter og bundet til en selekterbar markør-sekvens, slik som et G-418-resistensgen.

Det er mulig, ved bruk av genetisk manipulasjon, å utvikle transgene modellsystemer og/eller hele cellesystemer inneholdende et sialyltransferase-transgen for anvendelse, f.eks. som modellsystem for screening av medikamenter og evaluering av medikamenteffektivitet. I tillegg gir slike modellsystemer et verktøy for definering av den underliggende biokjemien til sialyltransferase-metabolismen, som derved gir en basis for rasjonell medikamentutforming og eksperimentell testing.

En tilnærming for å skape transgene dyr er å målrette en mutasjon til det ønskede gen ved homolog rekombinasjon i en embryonal stam-(ES)-cellelinje in vitro fulgt av mikroinjeksjon av den modifiserte ES-cellelinjen inn i vertsblastocyst og påfølgende inkubasjon i en fostermor (se Frohman og Martin (1989), Cell, 56, 145). Alternativt, kan teknikken ved mikroinjeksjon av det muterte gen eller en del av dette, inn i et en-cellet embryo fulgt av inkubasjon i en fostermor, bli benyttet. Forskjellige anvendelser av transgene dyr, spesielt transgene dyr som uttrykker naturlig forekommende sialyltransferase-protein eller -fragmenter derav, kan bli benyttet. Alternativt, kan transgene dyr som huser transgener som koder for mutert, endret (f.eks. mutagenisert) sialyltransferase-protein(er) som kan eller ikke kan ha enzymatisk aktivitet, bli konstruert som ønsket. Ytterligere metoder for fremstilling av transgene dyr er kjent i teknikken.

Alternativt kan sete-rettet mutagenese og/eller genomdanning bli benyttet for å mutere in vivo et sialyltransferase-genallel, enten endogent eller transfektert, slik at det muterte allel koder for en variant sialyltransferase.

Alternativt kan homolog rekombinasjon bli benyttet for å sette inn en sialyltransferase-sekvens inn i et vertsgenom ved et spesifikt sete, f.eks. i en korresponderende vertssialyltransferase-lokus. I en type homolog rekombinasjon, blir en eller flere vertssekvenser erstattet, f.eks. en verts-sialyltransferase-allel (eller deler derav) blir erstattet med en mutert sialyltransferase-sekvens (eller deler derav). I tillegg til slike generstatningsmetoder kan homolog rekombinasjon bli benyttet for å målrette et polynukleotid som koder for en sialyltransferase (eller fragmenter derav) til et spesifikt sete forskjellig fra en verts-sialyltransferase-lokus. Homolog rekombinasjon kan bli benyttet for å produsere transgen ikke-humane dyr og/eller celler som innlemmer muterte sialyltransferase-alleler. Gen-målsøking kan bli benyttet for å ødelegge eller inaktivere en eller flere endogene sialyltransferasegener; disse såkalte "knock-out" transgener har blitt beskrevet i teknikken for andre gener (WO91/10741; Kuhn et al.

(1991), Science, 708, 707).

De følgende eksemplene illustrerer kun den beste utførelses formen som nå er kjent for utførelse av oppfinnelsen, men må ikke bli sett på som begrensning av oppfinnelsen. Alle litteraturhenvisninger her er uttrykkelig innlemmet som referanse.

EKSEMPEL 1

Rensing av svine- sialvltransferase

Rensing av to former av 2. 3- O- sialvltransferasen

En a-2,3-0-sialyltransferase ble renset ved anvendelse av en kombinasjon av to prosedyrer beskrevet tidligere (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254,4434-4443 [1979] og Conradt, H.S. et al., i Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Schauer og Yamakawa, redaktører) sidene 104-105, Verlag Wissenschaft og Bildung, Kiel [1988]). Enzymet ble renset fra et svinelever-Triton X-100-ekstrakt med affinitetskromatografi på tre suksessive kolonner av CDP-heksanolaminagarose. Elueringsprofilen fra det første og tredje rensingstrinnet er vist i henholdsvis figur 3 og 4. Figur 3 viser at to topper av sialyltransferase-aktivitet blir observert i elueringsprofilen fra den første affinitetskolonnen. Disse to toppene ble separert ved kombinasjon av de angitte fraksjoner i pool A og B og de to poolene ble deretter funnet å være anriket av to former med forskjellig molekylvekt av oc2,3-0-sialyltransferase.

Den andre runden av affinitetsrensing på hver pool resulterte i fjerning av det meste av den kontaminerende a2,6-sialyltransferasen som også er til stede i svinelever (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254,4434-4443 [1979]). Etter den tredje runden av affinitetskromatografi, ble kolonnerfaksjoner analysert og individuelle fraksjoner ble funnet å være anriket med 48 kDa (figur 4A, fraksjonene 4-6) eller 45 kDa (figur 4B, fraksjonene 2-6) molekylvektformene av oc2,3-sialyltransferasen. Disse to proteintypene ble angitt i form A og form B. Den spesifikke aktiviteten for toppfraksjonene fra begge kolonnene var 8-10 enheter/mg protein. Det sterke båndet (-44 kDa) som var synlig i fraksjon 6 i figur 4, kolonne A, er ikke a2,3-sia]yltransferase, da den representerer en av hovedkontaminantene i både pool A og pool B etter foregående kolonne da enzymatisk aktivitet var fraværende i det endelige affinitetskromatografitrinnet.

Sialyltransferase-aktivitet ble målt med laktose og/eller lav molekyl-antifrys-glykoprotein som substrater (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254,4434^443 [1979]). Enzymet ble renset fra svinelever ved å følge beskrevne fremgangsmåter (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254, 4434-4443 [1979] og Conradt, H.S. et al., i Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Schauer og Yamakawa, redaktører) sidene 104-105, Verlag Wissenschaft og Bildung, Kiel [1988]) med noen modifikasjoner. Kort sagt ble 2 kg lever homogenisert i en buffer og membraner ble preparert som beskrevet (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254,4434-4443 [1979]). Membranene ble ekstrahert tre ganger med buffer (Conradt, H.S. et al., i Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Schauer og Yamakawa, redaktører) sidene 104-105, Verlag Wissenschaft og Bildung, Kiel [1988]) og ekstraktet ble ledet over en 1,5 1 CDP-heksanolaminagarose-kolonne (kolonne 1) (16 umol/ml). Etter vasking av kolonnen med 3 1 buffer B, ble kolonnen eluert med en lineær gradient av 0,05 til 1,0M KC1 (2,5 1 x 2,5 1) i buffer B. Fraksjoner inneholdende ot2,3-sialyltransferasen ble slått sammen i to pooler A og B som representerte henholdsvis hoveddelen og etterfølgende enden av toppen (figur 3). Poolene ble dialysert mot buffer B og utsatt for en ny runde affinitetskromatografi på CDP-heksanolaminagarose (kolonner IIA og IIB). En 150 ml kolonne ble benyttet for pool A og en 30 ml kolonne ble benyttet for pool B; to preparater av kolonne I (fra totalt 4 kg lever) ble lastet på den samme kolonnen i trinn II. oc2,3-sialyltransferasen ble eluert med en gradient på 0-2,0 mM CTP (750 ml, pool A; 150 ml, pool B) i buffer B. Fraksjoner med a2,3-sialyltransferase-aktivitet ble avsaltet på G50 Sephadex, ekvilibrert med buffer og aktive fraksjoner ble satt på 1,0 ml CDP-heksanolaminagarosekolonner (del III), som ble eluert med trinngradienter på 0,1 til 1,0 mM CTP (20 trinn, 1,0 ml hver) i buffer B (se figur 2). Aktive fraksjoner ble oppsamlet og det kombinerte utbyttet fra begge kolonner var 2,5 enheter ved en spesifikk aktivitet på 8-10 enheter/mg protein.

48 kDa- og 45 kDa-sialyltransferase-peptidene (se figur 4) ble igjen oppløst på SDS-polyakrylamidgeler (Leammli, U.K., Nature, 227. 680-685 [1970]), elektroeluert på en PVDF-membran (Immobilon Transfer, Millipore) og farget med Coomasie Brilliant Blue (Sigma). Sialyltransferasebåndet ble skåret ut og de bundne peptidene ble utsatt for NH2-terminal aminosyresekvensanalyse ved Edman-degradering ved bruk av Applied Biosystems 475A-proteinsekvensator.

Fraksjoner anriket med 48 kDa (form A) og 45 kDa (form B) former av sialyltransferasen ble utsatt for polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), blottet på en PVDF-membran og analysert ved NH2-terminalsekvensering. 22 aminosyreresidier av sekvensen ble oppnådd fra hver av peptidene (figur 5). NH2-terminalsekvensen av form A inneholdt en hydrofob strekning av aminosyrer i samsvar med anslagene ifølge Sadler et al. (J. Biol. Chem., 254,4434-4443 [1979] og Wescott et al. (J. Biol. Chem., 260, 13109-131221) at den mindre form var avledet fra den større ved proteolytisk spalting av et hydrofosispeptid. Denne regionen var antatt å være ansvarlig for detergent og membranbindingsegenskapene som er unik for form A.

EKSEMPEL 2

Svin- sialyltransferase cDNA

Poly A+ RNA ble anvendt som et templat for konstruksjon av enkelt-strenget cDNA ved anvendelse av et sett levert av Invitrogen. cDNA'et tjente som templat i polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av reagenser og protokoller levert av Perkin Eimer Cetus. De anvendte spesifikke betingelsene var 92° i 1 minutt; 50° i 2 minutter; og 72° i 2 minutter for denaturering, annelering og polymeriseirngsopphold. PCR-reaksjonene ble primet med 30 bp oligonukleotider tilsvarende til sekvenser som flankerer den 120 bp-delesjonen ved 3-enden av STI. Produktene fra forsterkningsreaksjonen ble separert på en 2% agarosegel; to spesifikke bånd med forskjell på 120 bp, tilsvarende til STI - og ST2-kloner, ble identifisert ved etidiumbromid-farging. Disse båndene ble eluert fra gelen (Qiaex kit, Qiagen), subklonet inn i TA-vektoren (Invitrogen) og sekvensert som ovenfor for sikker identifikasjon.

RNA- isolerine og cDNA- bibliotekkonstraksjon

Ferske svin-submaksillare kjertler (<30 min. post-mortem) ble frosset og transportert i tems-EtOH. Totalt RNA ble isolert ifølge prosedyren ifølge Chomczynksi og Sacchi (Anal. Biochem., 162,156-159 -[1987]). Poly A+ RNA ble renset ved oligo-dT-cellulosekromatografi (Pharmacia). Dobbelt-strenget cDNA ble syntetisert ved reverstranskripsjon av poly A+ RNA'et ved anvendelse av randome heksamerer som primere med et Pharmacia cDNA syntesesett og prosedyrer anbefalt av leverandøren. EcoRI-adaptere ble ligert til EcoRI digestert IgtlO og pakket in vitro (ProMega). cDNA-biblioteket ble avsatt på plater for screening ved infeksjon av E. coli C600 med blandingen i pakken.

Isolering og sekvensering av cDNA- kloner

Alle prosedyrer ble utført ifølge Maniatis et al. (i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. [1982]) hvis ikke annet er spesifisert. En 53bp oligonukleotidprobe (5'ACCCTGAAGCTGC-

18), tilsvarende 18 aminosyrer nær NH2-terminalsekvensen av det rensede 48 kDa-sialyltransferasepeptidet (se figur 5), ble endemerket med <32>p til en spesifikk aktivitet på IO<7> cpm/pmol. 500,00 plakk ble screenet ved nukleotidhybridisering i den følgende prehybridiserings/hybridiserings-oppløsningen; 5xSS, 50 mM NaH2P04, pH 6,7, 20% formamid, 5xDenhardts oppløsning, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml laksesperm DNA ved 37°

(Wood, W., i Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, sidene 443) Nitrocellulosefiltere (Schleicher og Schuell 0,45 m pore) ble vasket i 0,2 x SSC, 0,1% SDS ved 420 i 40 minutter. En sterkt hybridiserende klone, X.ST1, som inneholdt en åpen leseramme som kodet aminosyresekvensen tilsvarende til 48 kDa og 45 kDa renset sialyltransferasepeptidene, ble oppnådd. En andre klone, XST2, ble isolert ved nukleotid hybridisering ved anvendelse av restriksjonsfragmentprobe fra 3'-enden fra A.ST1. Denne proben, en 0,5 kb PvuII-EcoRI-restirksjonsfragment, ble merket ved bruk at randomisert primingsett og [_-<32p>]dCTP (Amersham).

EcoRI-restriksjonsfragmenter tilsvarende de cDNA-innskuddene av fag DNA ble subklonet inn i pUC-vektorer (Pharmacia). Subkloner ble sekvensert ved bruk av T7-sett fra Pharmacia. Sekvensdata ble analysert med computer ved bruk av DNASTAR

(DNASTAR Inc., WI, USA).

Flere kloningstrategier ble forsøkt for å klone cDNA for cc2,3-sialyltransferasen, basert på aminosyresekvensinformasjon representert i figur 5.1 en første tilnærming, ble det preparert polymerasekjedereaksjonsprimere i et forsøk på å generere en probe som spenner over NH2-terminalsekvensene til 48 og 45 kDa-proteintypene under den antagelsen at de var kontinuerlig i det intakte enzymet. I ettertid kan en se at denne tilnærmingen feilet på grunn av unøyaktigheter i aminosyresekvensen oppnådd ved 45 kDa-typen (se figurene 5 og 6). Et annet forfeilet forsøk på å oppnå en positiv klon benyttet korte (16-20 bp) degenerert oligonukleotider som prober for å screene et svin-submaksillar kjertel cDNA. Den tilnærmingen som til sist viste seg suksessfull var å anvende ikke-degenerert 53 bp oligonukleotidprober designet fra en 17-aminosyrers region av NH2"termma'en av A-formen. Den 53 bp-proben ble benyttet for å screene 500 000 plakk av IgtlO-svin-submaksillar spyttkjertel cDNA-bibliotek. En enkelt 1,6 kb klone ble fremskaffet, IST1, som hadde et ATG-startkodon (Kozak, M., Cell, 49,283-292 [1986] og Kozak, M., Nuc. Acids Res., 12, 857-872 [1984]), en åpen leseramme kodende NH2-terminale aminosyresekvenser av både A- og B-formene av a2,3-sialyltransferase, og ingen stoppkodon i rammen. Det faktum at NH2-terminale aminosyresekvenser fra begge former av ot2,3-sialyltransferasen var til stede i den translaterte åpne leserammen av A.ST1, noe som indikerte at XST1-klonen kodet for en del av a2,3-sialyltransferasen.

Et 3,-restriksjonsfragment av X.ST1 ble benyttet som en probe for å fremskaffe en andre, overlappende kloen, XST2, fra det samme bibliotek (figur 6). X.ST2 fullfører den åpne leserammen som starter i XST1. Sammen, koder disse to cDNA en enkel, åpen leseramme (909-1029, se under), en 600 bp 5' ikke-translatert region og en 1000 bp 3' ikke-translatert region. Nukleotidsekvensen så vel som den translaterte aminosyresekvensen for den 1029 bp åpne leserammen er vist i figur 7. Det er godt samsvar mellom den avledede aminosyresekvens i den translaterte åpne leserammen av X.ST1 og aminosyresekvensen oppnådd ved direkte analyse av de rensede proteiner.

Sekvensene av de overlappende regionene av XST1 og ?*,ST2 er identiske gjennom hele deres lengder bortsett fra et enkelt 120 bp gap i XST\. Den unike, åpne leserammen fortsetter på begge sider av dette avbruddet i AJSTl (figur 6). For å bestemme om en eller begge av de to cDNA-formene representerte et sant mRNA, ble PCR-analyse ved anvendelse av primere som flanket dette gapet utført på en cDNA-templat avledet ved reverstranskriptase av poly A+ RNA fra svine-spyttkjertler. Forsterkede PCR-fragmenter tilsvarende til X.ST1 og XST2 ble detektert ved denne tilnærmingen (data ikke vist). PCR-produkter ble subklonet og sekvensert for å bekrefte deres identitet og begge ble funnet å være identiske til de tilsvarende regionene i XSTl og X.ST2. Resultater fra både cDNA-kloning og PCR-forsterking foreslår således at to mRNA som spesifiserer for a2,3-sialyltransferasen i svin-submaksillar kjertel, som forskjellig ved nærvær eller fravær av en 120 bp insersjon i den åpne leserammen.

Den anslåtte størrelsen av sialyltransferase (1029 bp åpen leseramme) proteinet er 39 kDa, med fire potensielle N-bundne glykosyleringsseter (se figur 7). (Bouse, E., Biochem. J., 209. 331-336 [1983]). Ved anvendelse av tre av disse setene vil gi et protein med en anslått størrelse på omkring 48 kDA observert fra form A av den rensede sialyltransferasen. Selv om den amino-terminale sekvensen inneholder to ATG-kodoner nær hverandre, ligger kun det første innenfor et strengt konsensus translasjonsinitieringssete (Kozak, M., Cell, 49, 283-292 [1986] og Kozak, M, Nuc. Acids Res., 12, 857-872 [1984]). En Kyte-Doolittle-hydropatianalyse (J. Mol. Biol., 157,105-132 [1982]) avslører en potensiell membran-spennende region bestående av 16 hydrofobe residier, lokalisert 11 residier fra aminoterminalen (figur 7). Denne strukturelle egenskapene foreslår at cc2,3-sialyltransferasen lik andre glykoltransferaser som har blitt studert, har en type II-membranorientering og at denne enkle, hydrofobe regionen kan tjene som et ikke-spaltbart, aminoterminalt signal/ankerområde (Paulson, J.C. ogColley, K.J, J. Biol. Chem.. 264.17615-17618 [1989]).

Den åpne leserammen kodet av X.ST1 og X.ST2 inneholder hele NH2-terminal aminosyresekvensene fremskaffet fra både form A og form B av oc2,3-sialyltransferasen. Som vist i figur 6, er det i den NH2_termma^e sekvensen av form A funnet 8 aminosyrer fra det antatte startsettet for translasjonen av den åpne leserammen, og den tilsvarende NH2-terminale sekvensen av form B er funnet 27 aminosyreresidier videre mot COOH-terminalen av proteinet. Da form B av a2,3-sialyltransferasen er fullt katalytisk aktiv (Rearick, J.I. et al, J. Biol. Chem., 254, 4444-4451 [1979]), er proteinsekvensen mellom den antatt initiator-metioninet av full-lengde enzym og aminoterminalen av form B, antagelig ikke nødvendig for den enzymatiske aktiviteten. Den proteolytiske sensitive regionen av oc2,3-0-sialyltransferasen som ligger mellom signal-ankerområdet og det katalytiske området synes å være en stammeregion, som definert for tidligere studerte glykosyltransferaser (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 262.17735-17743 [1987] og Paulson, J.C. og Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264,17615-17618 [1989]. 20 mg totalt RNA fra svin- og rottevev ble elektroforert på en 1,0% agarosegel inneholdende 2,2M formaldehyd (26) og overført til nitrocellulosefiltere (Schleicher og Schuell) som beskrevet. Nitrocellulosefiltrene ble hybridisert med <32>P-merket cDNA-prober og vasket som tidligere beskrevet.

EKSEMPEL 3

Ekspresjon av oppløselig svin- sialvltransferase

Et sekreterbart chimerisk protein ble fremstilt mellom den antatte katalytiske området av a2,3-0-sialyltransferasen og insulin-signalsekvensen ved sammensmelting av de C-terminale 890 bp av klone XST2 til den N-terminale delen av vektoren pGIR-199

(Hsueh et al., J. Biol. Chem., 261,4940-4947 [1986]) ved Sacl-settet inneholdt i leserammen i begge vektorene. Dette chimere produkt, sp-ST, ble spaltet med restriksjonsenzymene Nhel og Smal, 1,0 kb-fragmentet ble isolert og subklonet inn i pSVL (Pharmacia) spaltet med Xbal og Smal som spalter seter inneholdt i polylinkeren. Det resulterende konstruktet ble kalt pSVL-spST og ble benyttet som vektor for den transiente ekspresjonen av en oppløselig form av a2,3-0-sialyltransferasen i COS-1-celler. Det supercoilde DNA, pSVL sp-ST, ble transfektert inn i COS-1-celler ved anvendelse av lipofektin ifølge prosedyren anbefalt av leverandøren. (60 mm kulturskål inneholdende 50% sammenvokste celler ble transfektert med 5 ug DNA, 20 ml lipofektinreagens). 48 timer etter transfeksjon ble COS-l-cellemediet oppsamlet og konsentrert 15 ganger på Centricon 30 filteret (Amicon) for analyse av a2,3-0-sialyltransferase-aktivitet. a2,3-0-sialyltransferase-aktivitet ble bestemt ved bruk av antifrys-glykoproteinakseptor som beskrevet ovenfor (Sadler et al., J. Biol. Chem., 254. 4434-4443 [1979]). 48 timer etter transfeksjon med pSVL-spST ble COS-cellene (60 mm kulturskåler) vasket med met-fritt medium (DMEM, 5% føtalt kalveserum) (Gibco) og kulturert i det samme mediet i 1 time. Cellene ble puls-merket med 150 mCi/150 pmol av ^^S-met Express-merke (NEN) i 1,5 ml met-fritt medium i 2 timer. Disse cellene ble vasket med PBS og chaset i 5 timer i medium uten <35->S-met merke. Mediet, inneholdende utskilte proteiner, ble så høstet, konsentrert 15 ganger og utsatt for SDS-PAGE og analysert med fluorgrafi.

Som tidligere angitt, er form B av ct2,3-0-sialyltransferasen et enzymatisk aktivt, proteolytisk spalteprodukt av det full-lengde, membran-bundne enzymet. Det er derfor antatt at et oppløselig, chimert protein ville ha a2,3-0-sialyltransferase-aktivitet, dersom det omfattet hele sekvensen av B-formen. For å lage et slikt oppløselig protein, ble et restriksjonssete oppstrøms for NH2-terminalen av B-peptidsekvensen valgt som et sete for fusjon med X.ST2 cDNA med en vektor kodende insulin-signalsekvensen pGIR-199. Som illustrert i figur 9a, koder dette konstruktet for et fusjonsprotein som blir kalt signalpeptid -ST (sp-ST), som omfatter insulin-signalsekvensen fulgt av 9 aminosyrer kodet ved pGIR-Iinkeren og hele det antatte katalytiske området av a2,3-0-sialyltransferasen. sp-ST-konstruktet ble uttrykt for å rette syntesen av 38 kDa, utskillbart protein når det ble transfektert inn i mammalske vertsceller. En tilsvarende strategi for produksjon av oppløselige former av glykosyltransferase har blitt benyttet med suksess (Paulson, J.C. og Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264, 17615-17618 [1989]; Colley, KJ., J. Biol. Chem., 264,17619-17622 [1989]; Larsen, R.D. et al., Proe. Nati.

Acad. Sei. USA, 87,6674-6678 [1990].

sp-ST-konstniktet ble plassert i pSVL-ekspresjonsvektoren og transient transfektert inn i COS-1 -celler. Etter 48 timer ble transfekterte celler inkubert i 2 timer i media inneholdende Trans^S-merke fulgt av en 5 timers chase-periode i media uten merke; dette media ble oppsamlet, konsentrert 1S ganger og analysert med SDS-PAGE/fluorgrafi. Figur 9b viser at mediet inneholdt et prominerende protein ved 38 kDa, den antatte størrelsen av sp-ST-proteinet. I parallell transfekterte kulturer ble mediet høstet 48 timer etter transfeksjon, konsentrert og analysert for a2,3-0-sialyltransferase-aktivitet. Som illustrert i figur 9c, inneholdt media fra celler transfektert med sp-ST millienheter/ml av sialyltransferasen, mens media fra mock-transfekterte celler ikke hadde noen signifikant aktivitet.

EKSEMPEL 4

Rensing og sekvensering av rottelever- sialvltransferase

Lik andre glykolsyltransferaser som er stasjonære membranproteiner i det endoplasmatiske retikulum og i Golgi-apparatet, er sialyltransferaser lite biproteiner og er vanskelig å rense noe som er grunnen til at kun to medlemmer av denne familien har blitt klonet. GalJ31,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferasen ("ct2,3-N") ble først renset 800 000 ganger fra rottelever i 1982 av Weinstein et al. for å gi omkring 10 ug/ng vev (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 257, 13835-13844 [1982], og Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 13845-13853 [1982]). Selv om alvorlige forsøk har blitt gjort for å fremskaffe aminosyresekvensinformasjon og fremskaffe et antistoff mot enzymet ved anvendelse av konvensjonelle metoder, har dette feilet på grunn av de små mengdene av fortynnet protein som ville bli oppnådd. En alternativ massespektrometri har spilt en økende rolle i strukturavledningen av biologisk viktige makromolekyler. Utviklingen av nye ioniserende metoder og instrumentering har ekspandert det tilgjengelige masseområdet og deteksjonssensivitet. Høy-ydelse-tandem-massespektrometri er nå etablert som en kraftig teknikk for proteinsekvensering (Mathews, W.R. et al., J. Biol. Chem., 262, 7537-7545 [1987]), så vel som for bestemmelse av post-translasjonelle og kjemiske modifikasjoner (Dever, T.E. et al., J. Biol. Chem., 264,20518-20525 [1989]; Settineri, CA. et al., Biomed. Environ. Mass Spectrom., 19, 665-676 [1990]; og DeWolf Jr., W.E. et al., Biochem., 27,90993-9202 [1988]. Massespektrometri ble derfor anvendt for å fremskaffe aminosyresekvensen av sialyltransferase.

Reduksjon og karboksvmetvlering - Omkring 13 ug GalBl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyltransferase (cc2,3N) ble lagret i 350 ml 30 mM natriumkakodylat (pH=6,5), 100 mM NaCl 0,1% Triton CF-54 og 50% glycerol. Tris-HCl (pH=8,0), guanidin-HCl og ditiotreitol ble tilsatt til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 0,2M, 6M og 7 mM. Reduksjonen ble utført ved 60°C under argon i 1,5 timer. Natriumjodacetat (1,32 mg) ble tilsatt i 2,5 ml 0,2M Tris-HCl-buffer til blandingen. Alkyleringen ble utført ved romtemperatur, under argon, i mørke i 1,5 timer.

Dialyse - Den reduserte og karboksymetylert a2,3N ble dialysert med 4 liter 50 mM N-etyl-morfolinacetat-buffer (pH=8,l) ved bruk av Bethesda Research Labs ("BRL") Microdialysis System ved BRL Prepared Dialysis Membran med en molekylvektsgrense ved 12-14 kDa. Når dialysen var fullstendig, ble 10% SDS tilsatt til dialysebrønnene for å gi en endelig SDS-konsentrasjon på omkring 0,1%. Innholdet i brønnene ble oppsamlet og tørket ved bruk av SpeedVac Concentrator (Savant). For å fjerne SDS, ble Konigsberg-utfelling utført (Konigsberg, W.H., Henderson, L., Methods in Enzymology, £1,254,259 [1993]).

Trvptisk kutting - Det utfelte _2,3N ble oppløst i kuttebuffer (100 mM Tris-HCl, 2M urea, 1 mM CaCl2, pH=8,0), for å gi en proteinkonsentrasjon på omkring 2 mg/ml. a2,3N ble kuttet med 10% trypsin (w/w) (Boehringer-Mannheim, sekvenseringsgrad, oppløst i 1 mM HC1) ved 37°C. Etter 7 timers spalting ble enda en mengde trypsin tilsatt til blandingen for å resultere i en endelig trypsinkonsentrasjon på omkring 13%. Spaltingen ble stoppet etter 18 timer. Det resulterende tryptiske spalteproduktet ble separert ved reversfase-HPLC (ABI C18-kolonne, 1,0 x 100 mm) ved bruk av et ABI 140A-oppløsningsmiddel-leveringssystem. Oppløsningsmiddel A var 0,1% TFA i vann. Oppløsningsmiddel B var 0,08% TFA i 70% acetonitril/30% vann. Systemet ble drevet ved en gjennomstrømningshastighet på 50 ml/min. 10 etter injeksjon ble prosentdelen av oppløsningsmiddel B øket fra 0% til 50% i løpet av 90 minutter, så opp til 100% i løpet av 30 minutter. Peptider ble detektert ved bruk ABI 783A absorbansdetektor, drevet ved 215 nm. Noen av fraksjonene ble esterifisert ved bruk av HCl/n-heksanolblanding.

Massespektrometri - Væske-sekundær-ion-massespektrometri (LSIMS)-eksperimenter ble utført ved bruk av Kratos MS50S dobbeltfokuserende massespektrometer utstyrt med LSIMS-kilde og en høy-feltsmagnet. Omkring 1/5 av hver oppsamlede fraksjon ble lastet for LSIMS-analyse. 1 ul av glycerol-tioglyserol l:l-blandingble surgjort med 1% TFA, ble benyttet som væskematriksen. Prøvene ble igjen oppsamlet fra probespissen. De mest hyppige molekylionene ble valgt for kollisjonsindusert dissosiering (CID)-analyse. Disse eksperimentene ble utført på et Kratos-konsept IEHH fire sektors massespektrometer, utstyrt med en elektro-optisk multikanals stråledetektor, som kan registrere sekvensielt 4% segmenter av masseområdet samtidig. Kollisjonsenergien var satt ved 4 keV, kollisjonsgassen var helium og dets trykk ble justert for å dempe hyppigheten av det valgte precursor-ion til 30% av dets initielle verdi. Residien av hver prøve ble lastet og 1 ml av den ovenfor nevnte matriks ble tilsatt. Høy energi CID-dataene ble tolket ved hjelp av computeranalyse.

Tandem-massespektrometri er en kraftfull fremgangsmåte for proteinsekvensering som viser fordeler over konvensjonelle Edman-teknikker. Sekvensering selv av like-molare blandinger muliggjør denne fremgangsmåten. For massespektrometri-analyse ble de første få peptidfraksjonene fra HPLC esterifisert for å øke deres hydrofobisitet, for således å forbedre deres forstøvningseffektivitet (Falick, A.M. og Maltby, D.A., Anal. Biochem., 182,165-169 -[1989]). LSJMS-analyse av hver fraksjon avslørte multiple molekylærioner, noe som indikerte nærværet av mer enn et peptid i hver. De mest 30 molekylære ionene ble valgt for CID-analyse. I disse eksperimentene, ble den 12C-isotope toppen av det aktuelle ionet valgt i det første massespektrometeret. Kun fragmenter av dette som var resultatet av dissosieringen indusert ved kollisjon med helium i kollisjonscellen, plassert mellom de to massespektrometrene, ble detektert ved enden av det andre massespektrometeret. I høy-energikollisjonsindusert dissosiering (CID)-analyse skjer fragmentering hovedsakelig langs peptidskjelettet. Multiple spalter, dvs. fragmentering i aminosyresidekjeder er også observert. Fragmenteringen langs peptidkjeden som resulterer i ioneserier som skiller seg ved aminosyreresidievekter, og således kan den tilsvarende aminosyresekvensen bli avledet. Høy-energimodene av fragmentering gir ytterligere informasjon om aminosyrens identitet for således å bekrefte de fremskaffede sekvenser og tillate differensiering mellom isobare Leu/Ile-aminosyrepar (Johnson, R.S. et al., Anal. Chem., 59,2621-2625 [1987]). Sidekjedefragmentering kan bli observert hovedsakelig når det er en basisk aminosyre, dvs. Arg, Lys eller His, i sekvensen (Johnson, R.S. et al., Int. J. Mass. Spectrom. Ion Proe, 86, 137-154 [1988]). Vanligvis resulterer foretrukket protonisering av basiske aminosyreresidier ved eller nær N-terminalene, i foretrukket ladningsretensjon på denne enden av molekylet. Peptider inneholdende basiske aminosyrer ved eller nær C-terminalen vil vise flest C-terminale fragmenter. Trypsin er således foretrukket for initiell spalting. Tolking av høy energi CID-data ga til sist 14 sekvenser (se tabell 2 og figur 9).

Analysen av CID-spekteret avslått at noen sidereaksjoner opptrådte under den tryptiske spaltingen. To trypsin-autolyseprodukter ble identifisert ved m/z 659,3 og 1153,6 (figur 9). På grunn av lang inkuberingstid og mangel på en skikkelig fanger, ble noen tryptiske peptider karbamylert ved deres N-termini. Slike sidereaksjoner ikke bli unngått ved Edman-degradering, den N-terminale modifisering kan også være nyttig i massespektrometrisk sekvensering. Faktisk, var CID-analysene av disse modifiserte peptidene nyttige i bekreftelsen av noen av de ovenfor nevnte sekvensene, i et tilfelle midler for differensiering mellom N-terminal leucin eller isoleucin (figur 10).

EKSEMPEL 5

Rottelever- sialyltransferase

PCR- amplifisering av en spesifikk cDNA- probe - Basert på aminosyresekvensen av 11 av de 14 peptidene avledet fra a2,3N, ble 22 degenererte oligonukleotidpooler fra både sens-og antisens-strenger syntetisert (Genosys). Initielle PCR-eksperimenter ble utformet, basert på observasjonen at peptid 11 og peptid 1 er homologe til en region lokalisert nær senteret av den tidligere klonede sialyltransferasen, Gall31,4GlcNAc-a2,6-sialyltransferase (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 257,13835-13844 [1982]) og a2,3-0 beskrevet ovenfor (figur 11). To grupper av PCR-eksperimenter ble utført ved bruk av enten en sensprimer til peptid 11 eller en antisensprimer til peptid 1 parret med oligonukleotidprimere til de andre peptidene og først streng cDNA syntetisert fra rottelever totalt RNA som en templat. Start med et templatesmeltetrinn (5 minutter ved 94°C), ble forsterkning utført ved bruk av GeneAmpTM DNA-forsterkningsreagenssett med AmpliTaqTM DNA-polymerase (Perkin Eimer Cetus), ved cyklisering 35 ganger, 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 37°C, og 2 minutter ved 72°C, og avsluttet med et endelig forlengelsestrinn (15 minutter ved 72°C). Flere cDNA-fragmenter ble generert fra disse PCR-reaksjonene. Ut fra antagelsen at peptid 11 og 1 representerte en kontinuerlig strekning av aminosyrer, ble ytterligere sett av PCR-eksperimenter utført ved anvendelse av en nestet primerstrategi (Mullis, K.B. og Faloona, F., Methods Enzymol., 155, 335-350 [1987]) for å identifisere spesifikke cDNA-fragmenter. Ved anvendelse av denne tilnærmingen ble et spesifikt cDNA-fragment, 1 lsens-14antisens (1 ls-14as), identifisert. 1 ls-14as cDNA-fragmentet ble subklonet inn i Bluescript-plasmid (Stratagene) og sekvensert ved bruk av universielle primere (Stratagene) og Sequenase Version 2,0-sett (USB).

Kloning av sialyltransferasen - Et cDNA-bibliotek ble konstruert fra rottelever poly

(A)+ RNA ved bruk av cDNA-syntesesett fra Pharmacia (Gubler, U. og Hoffman, B.J., Gene, 25, 263-269 [1983]). 01igo-(dT)-primet cDNA ble syntetisert og ligert til EcoRI-Notl-linkere. cDNA ble så ligert inn i EcoRI-spaltet IgtlO DNA (Promega). Etter in vitro pakking med et DNA pakkingsekstrakt (Stratagene), ble fag sådd på en

vertsstamme E. coli C600 hfl- (Promega). Omkring 1 000 000 plakk ble screenet med 1 ls-14as cDNA-proben (Gubler, U. og Hoffman, B.J., Gene, 25,263-269 [1983]). To positive fag (18-1 og 9-1) ble plakkrenset og subklonet inn i Bluescript-plasmidvektor (Stratagene) for sekvensering.

Isolering av cDNA- kloner - Dayhoff-protein-databasen ble benyttet for å screene peptidsekvensene for homologi med kjente proteiner. Disse søkene ga de første bevisene for homologi mellom a2,3-N og andre klonede sialyltransferaser. Fra denne analysen, ble peptid 11 (tabell 2) funnet å være homolog med sekvenser til stede både i rotte og human-6-galaktosid a-2,6-sialyltransferaser (disse to enzymene er 88% konserverte, Gu, T.J. et al., FEBS, 275,83-86 [1990] og Lance, P. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, 225-232 [1989]). Når denne analysen blir utvidet til å omfatte sekvensene av svin-ct2,3-0, et ytterligere peptid, ble peptid 1 (tabell 2) funnet å være homolog til sekvenser i begge de klonede sialyltransferasene. Sammenligning av disse peptidene med sekvensene til stede i de tidligere klonede sialyltransferasene foreslo at disse to peptidene representerte en kontinuerlig strekning av aminosyrer som hadde blitt spaltet ved argininresidien under trypsinkutting (figur 11). Observasjon av peptid 11 og peptid 1 viste homologi med en sekvens tidligere identifisert som den konserverte homologiregionen i senteret av de to klonede sialyltransferasene gir basis for foreliggende kloningsstrategi (figur 11). Det er antatt at peptidet 11 og peptid 11 kan være nær senteret i proteinet, PCR-eksperimenter ble således utformet for å gi lang cDNA-probe, basert på aminosyresekvensen av de 14 sialyltransferasepeptidene, ble degenererte oligonukleotidprimere for både sens og antisens syntetisert for anvendelse i PCR-ekspeirmenter. I disse eksperimentene, ble primer 11 sens og 1 antisens pardannet med andre primere i forsøk på å forsterke lange cDNA-fragmenter av a2,3-N. Flere cDNA-fragmenter ble forsterket i disse eksperimentene. Ut fra antagelsen at peptid 11 og peptid 1 representerte en kontinuerlig strekning av aminosyrer, ble primer 11 og primer 1 benyttet i en nestet primerstrategi

(Mullis, K.B. og Faloona, F., Methods Enzymol., 155, 335-350 [1987]) for å identifisere spesifikke cDNA-fragmenter. Fragmentet forsterket ved bruk av primerne 11 sens og 14 antisens var nær den samme størrelsen som fragmentet forsterket ved bruk av 1 sens- og 14 antisens-primere, noe som antyder de produserte fragmentene var resultat av

spesifikk annelering med primere og ikke et artifakt.

Kloning og karakterisering av ll-sens-14-antisens-fragmentet viste at peptid 11 og 1 faktisk er kontinuerlige. Sammenligning av sekvensen av cDNA-fragmentet med de to klonede sialyltransferasene (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 262,17735-17743

[1987]) viste at homologien fortsetter for peptid 1 og kontinuerlig i 18 aminosyrer. På grunn av homologien er det antatt at 1 ls-14as cDNA-fragmentet ble forsterket fra en sialyltransferase mRNA. Sekvensen indikerer også at cDNA-fragmentet ikke var et fragment av Galbl,4-GlcNAc-a2,6-sialyltransferasen som er rikelig til stede i rottelever (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 257,13835-13844 [1982]). 11-sens-14-antisens-fragmentet ble benyttet for å screene et oligo-dT-primet rottelever cDNA-bibliotek fra hvilke to positive kloner ble oppnådd fra 1 million screenede plakk. Karakterisering av de positive klonene avslørte at klon ST3N-1 inneholdt et 2,1 Kb insert mens klon ST3N-2 var betydelig kortere, kun en 1,5 Kb lengde. Northern-analysen indikerte at Gal-a2,3-ST mRNA var 2,5 Kb (se nedenfor), noe som antyder at klon ST3N-1 kan inneholde den fullstendige kodesekvensen av Gal-ot2,3-ST.

Primærstruktur av a2. 3- N- sialyltransferase - Sekvensanalyse avslørte at klon ST3N-1 inneholdt den fullstendige åpne leserammen av sialyltransferasen (figur 2). Den består av en 82 bp 5-ikke-translatert region, en åpen leseramme med 1122 bp lengde, en 3-ikke-translatert region på omkring 1 Kb og en poly-(A)-hale. Den åpne leserammen av klon ST3N-1 koder for en 374 aminosyrers protein med en anslått molekylvekt på 42 033. Med unntak av en enkel aminosyresekvens, koder den åpne leserammen for alle de 14 peptidsekvensene fremskaffet fra massespektrometrisk analyse av den rensede sialyltransferasen. Dette bekrefter at cDNA av klon ST3N-1 faktisk er den av sialyltransferasen. Som observert fra andre klonede glykosyltransferaser (Paulson, J.C. og Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264, 17615-17618 [1989]), er a2,3-N antatt å ha en kort N-terminal cytoplasmatisk hele, en signal-ankersekvens på omkring 20 aminosyrer og en stor C-terminal region som omfatter det katalytiske området av enzymet.

EKSEMPEL 6

Ekspresjon av oppløselig rotte- sialvltransferase

For å produsere en oppløselig form av sialyltransferasen for enzymatisk karakterisering, ble et fusjonsprotein inneholdende det katalytiske området av enzymet og insulin-spaltesignalsekvensen konstruert i den mammalske ekspresjonsvektoren pSVL (Pharmacia). Spesifikt, blir det katalytiske området av sialyltransferasen forsterket ved PCR ved bruk av en 5-primer ved posisjon +182 (figur 11), nedstrøms for det transmembrane området og en 3'-primer lokalisert i 3'UTR oppstrøms for polyadenyleringssetet. PCR-reaksjoner ble utført som beskrevet ovenfor med anneleringstemperatur ved 55°C. PCR-produktet ble subklonet inn i BamHI-EcoRI-seter av pGIR-199 (en gave fra K. Drickamer) for å resultere i en fusjon av sialyltransferase i rammen til insulin-signalsekvensen til stede i pGIR-vektoren (Huseh, E.C. et al., J. Biol. CHem., 261, 4940-4947 [1986]). Det resulterende fusjonsproteinet ble satt inn i Xbal-Smal-setene i ekspresjonsvektoren pSVL for å gi ekspresjonsplasmidet pBD122.

For transient ekspresjon av COS-l-celler, ble ekspresjonsplasmid pBD122 (20 mg) transfektert inn i COS-l-celler på 100 mm plater ved bruk av lipofektin som foreslått av fabrikant (BRL). Etter 48 timer ble cellekulturmediet oppsamlet og konsentrert ved bruk av en sentrikon 10 mikrokonsentrater. Det konsentrert mediet ble analysert for sialyltransferase-aktivitet ved bruk av oligosakkarider som akseptorsubstrater. Overføring av sialinsyre til oligosakkaridet ble registrert ved bruk av ionebyttekromatografi (Sadler, J.E. et al., J. Biol. Chem., 254, 5934-5941 [1979] og Paulson, J.C. et al., J. Biol. Chem., 264, 10931-10934 [1989]).

For å demonstrere at klon ST3N-1 koder for _2,3-N-sialyltransferase, ble det fortsatt for å uttrykke klonen i COS-l-celler. Aminosyresekvens av klon ST3N-1 viste at proteinet inneholdt en NH2-terminal signal-ankersekvens som er antatt å feste enzymet til Golgi-apparatet i cellen (Paulson, J.C. og Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264,17615-17618

[1989]). For å lette funksjonelle analyse av enzymet, var det ønsket å produsere en oppløselig form av enzymet som når det blir uttrykt ville bli utskilt fra cellen. Et fusjonsprotein ble konstruert ved bruk av den spaltbare insulin-signalsekvensen for å erstatte signal-ankersekvensen ved NH2"termma'en 1 sialyltransferasen. Når ekspresjonsplasmidet pBD122 ble uttrykt i COS-l-celler, ble enzymet utskilt fra cellene og viste sialyltransferase-aktivitet.

De enzymatiske egenskapene til a2,3-N-sialyltransferase ble først karakterisert med renset protein (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 257,13845-13853 [1982]). Sialyltransferasen ble funnet å anvende fl-galaktosidakseptorer inneholdende enten GalBl ,3GlcNAc- eller Galfil,4GlcNAc-sekvensene for å danne NeuAca2,3Gallfl,3GlcNAc- og NeuAcoc2,3Gal61GlcNAc-sekvensene ofte funnet å terminere kompleks-type N-bundne oligosakkarider. Enzymet utskilt fra cellene som var transfektert med ekspresjonsplasmid pBD122 var i stand til å anvende fl-galaktosidakseptorer inneholdende enten Galfll,4GlcNAc- eller Gal61,4GlcNAc-sekvensene (tabell 2); celler transfektert med den parentale vektoren utskilte ingen slik sialyltransferase-aktivitet. Det utskilte enzym er også i stand til sialylering av asialo-al-syre glykoprotein. Disse data er i samsvar med de enzymatiske egenskapene til renset ct2,3-N.

EKSEMPEL 7

Ekspresjon av 2. 3- N- sialvltransferase i Baculovirus

Det terminale tetrasakkarid-sialyl-Lewis<x> (Sle<*>: SA_2,3GalBl,4GlcNAc[_l,3Fuc]) har blitt identifisert som liganden for P-selektin og E-selektin og et syntetisk oligosakkarid inneholdende SLe<x->strukturen er en kandidat for blokkering av selektin-ligand-interaksjonene. Fullstendig kjemisk syntese av SLe<x> er teknisk og økonomisk vanskelig, men anvendelse av spesifikk glykosyltransferaser for å feste den terminale sialinsyren og fukoseresidier til kjemisk syntetiserte kjerne-sakkarider, vil gjøre syntesen av fri SLe<x> oppnåelig. Genet kodende a2,3-N-sialyltransferase ble klonet fra rottelever-cDNA-bibliotek og ble vist å ha spesifikk ct2,3-(GalBl,4/4GlcNAc)-sialyltransferase-aktivitet når den blir uttrykt i transfekterte COS-l-celler (Wen et al., manuskript under bearbeidelse). En del av cDNA-klonen som koder for den enzymatiske deler av polypeptidet, men mangler det hydrofobe signal/membran-ankerområdet, ble fusert til pre-insulin-signalsekvensen for å anne et cDNA kodende et oppløselig, sekretert a2,3-NST-protein. Dette cDNA ble klonet inn i Baculovirus-transfervektor og benyttet for å transfektet Sf-9-insektcelIer i nærvær av vill-type baculovirus DNA.

Rekombinante virus inneholdende a2,3-N-sia!yltransferase cDNA ble isolert og renset og benyttet for å infisere Sf-9-celler. Infiserte celler utskilte oc2,3-NST i store mengder i mediet og dette proteinet ble renset ved ionebyttekromatografi.

Sf-9-celler ble anskaffet fra ATCC. DNA-vektorer pGIR199 og pBlueBac ble anskaffet fra henholdsvis J.C. Paulson og Invitrogen (San Diego, CA). Sf-9-celler ble dyrket i en spinnkultur ved celledensitet mellom 0,3 og 1,5 millioner celler pr. ml i Graces Insect Media (tilsatt 0,33% laktalbuminhydrolysat og 0,33% gjærolat), anskaffet fra Gibco (Grand Island, NY) pluss 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Dette mediet ble kalt GCMS+10%FCS.

En oppløselig form av a2,3-N-sialyltransferase ble fremstilt på følgende måte. cDNA som representerer hele a2,3-N-sialyltransferase mRNA ble benyttet som templat for PCR ved bruk av som forsterkere to oligonukleotider som hybridiserte (5') ved en posisjon akkurat C-terminalt for kombinasjonssignalet/anker-regionen i enzymet og (3') oppstrøms for poly(A)-addisjonssetet ved den 3'-ikke-translaterte regionen. Begge oligonukleotidene koder BamHI-seter ved deres 5'-ender, noe som muliggjør at PCR-produktene ble klonet ved HamHI-setet av pGIR199, fusert i rammen med pre-insulin-signalsekvensen. Flankerende Nhel-seter ble benyttet for å frigi genfusjonen og dette cDNA-fragmentet ble klonet i baculovirus-transfervektoren pBluebac, under kontroll av baculovirus polyhydrin-promoteren. Alle rekombinante DNA-manipuleringer ble utført under betingelser anbefalt i enzymfremstillerens instruksjoner. pBluebac-vektoren inneholder E. coli fi-galaktosidasegenet under kontroll av en annen baculovirus-promoter og viruset som har gjennomgått rekombinasjon og tatt opp DNA-vektoren, kan omdanne kromoforen X-gal til et blått produkt.

Dannelsen av rekombinant baculovirus ble gjort ved bruk av MaxBac-ekspresjonssystem (Invitrogen) ved eksakt å følge protokollene anbefalt av fabrikanten. Kort sagt ble plasmid og vill-type virus DNA blandet og benyttet for å transfektet Sf-9-celler ved kalsiumfosfatmetoden. Virus ble produsert av transfekterte celler og utskilt i kulturmediet. Rekombinant virus ble identifisert i plakkanalyser ved blåfargen produsert ved virkningen av 6-galaktosidase på X-gal-indusert i plakkmediet ved en konsentrasjon på 150 ug/ml, og renset fra vill-typevirus ved repetitive fortynning/plakk-dannelser. Renset virus ble ekspandert til 500 ml ved infeksjon av friske Sf-9-celler. Flere kloner ble analysert for evnen til å forårsake sekresjon av a2,3-N-sialyltransferase inn i infektert cellemedium ved testing av en prøve av mediet direkte i den radioaktive

sialyltransferase-analysen beskrevet nedenfor.

For å dyrke store mengder virus, ble 3 x 10<6> Sf-9-celler i 25 cm<2> vevkulturflasker i 5 ml GCMS+10% FCS infektert med en enkel blå plakkfri vill-type virus og tillatt å vokse i 5-7 dager ved 27°C. Den resulterende 5 ml virusstamløsningen ble klaret ved sentrifugering og ytterligere ekspandert. Sf-9-celler i den logaritmiske vekstfasen (0,5-1,5 x IO** celler/ml) ble infektert ved en konsentrasjon på 1 x 10<?> celler pr. ml ved en infeksjonsmultiplisitet (moi) på 1, under antagelsen av et virustiter i 5 ml stamoppløsning på 1 x 10<**> plakkdannende enheter (pfu) pr. ml. Celler ble fortynnet tilbake 10 ganger i GCMS+10% FCS og dyrket i 5-7 dager ved 27°C. De resulterende virus ble klaret og virustiter ble bestemt ved plakkanalyse og var generelt større enn 10^ pfu/ml. For å uttrykke ct2,3-N-sialyltransferase ble 2,5 x 10^ Sf-9-celler i logaritmisk vekstfase utsådd på hvert lag av en Ten Tray Cell Factor (Nunc, Naperville, IL) under betegnelsen CF-10. Hver CF-10 hadde et totalt dyrkingsareal på 6000 cm<z> og cellene ble infektert med rekombinante baculovirus ved moi=5 i et volum på 300 ml. Etter inkubasjon for 1 time ble 1 liter Excell-400 (JRH Biosciences), et serumfritt medium, tilsatt og cellene ble inkubert ved 27°C i 72 timer. Mediet ble høstet, klargjort og filtrert gjennom en 0,2 um filterenhet. Ferskt medium (Excell 400 supplementert med 2% føtalt kalveserum) ble tilsatt og cellene ble inkubert ved 27°C i ytterligere 48 timer, hvoretter mediet ble høstet, klaret og filtrert.

a2,3-N-sialyltransferase-aktiviteten ble analysert ved bruk av en modifikasjon av den publiserte analyse (Sadler et al., 1979). I et 30 ul volum, ble 14 ul av prøve blandet med 3,5 ul lakto-N-tetraose (Gal61,3GlcNAcifl,3Gal61,4Glc) og 12,5 ul av en analyseblanding beskrevet nedenfor. Prøvene ble blandet hurtig, spunnet til bunnen av reaksjonsrcret og inkubert ved 37°C i 10 minutter. Reaksjonene ble så umiddelbart fortynnet i 1 ml 5 mM fosfatbuffer, pH 6, og satt på en 0,5 ml ionebyttekolonne. Kolonnegjennomkjøringen og 1 ml vask ble oppsamlet i scintillasjonsrør og talt. En enhet er definert som mengden enzym nødvendig for å overføre 1 mikromol sialinsyre til akseptor pr. minutt.

Prøven bestod av enten ren supernatant eller supernatant fortynnet, slik at kinetikken til reaksjonen ble holdt i det lineære området, omkring 10 000 cpm utløp fra kolonnen. Analyseblandingen ble fremstilt ved tørking av en 0,65 ml (50 uCi) [<14>C]-CMP-sialinsyre (NEN, Boston, MA) og resuspendering i 0,65 ml vann inneholdende 2,3 mg CMP-sialinsyre. Til dette ble det tilsatt 0,95 ml av en IM oppløsning av natrium-kakodylatbuffer, pH 6; 0,48 ml 20% Triton CF-54; 0,29 ml av en 50 mg pr. ml oppløsning av bovint serumalbumin (alt skaffet fra Sigma, St. Louis, MO); og vann til et totalvolum på 8 ml. Den spesifikke aktiviteten til analyseblandingen ble bestemt og den ble porsjonert og lagret ved -20°C. Den benyttede ionebytteharpiksen var AG1-X8, 200-400 mesh, fosfatform (Biorad, Richmond, CA).

Konsentrasjon og rensing av a2,3-N-sialyltransferase. Media (1-3 liter) inneholdende cc2,3-NST ble filtrert og konsentrert til omkring 250 ml i et Amicon CH2PRS-spiralkassettsystem utstyrt med en SlYlO-kassett. Enheten ble så kjørt i diafiltreringsmodus for å avsalte den konsentrerte supematanten med tre volumer 10 mM kakodylinsyre, 25 mM NaCl, 25% glycerol, pH 5,3 (buffer A). Prøver ble så satt på en kolonne (2,5 x 17 cm) S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrert med buffer A ved en gjennomstrømningshastighet på 2 ml/min. Etter at alle prøvene hadde blitt satt på, ble kolonnen vasket med buffer A inntil OD28O av kolonneutløpet hadde returnert til basislinjen (1,6 kolonnevolumer). a2,3-NST ble så eluert fra kolonnen med 50 mM kakodylinsyre, IM NaCl, 25% glycerol, pH 6,5. Fraksjoner inneholdende a2,3-NST ble oppsamlet og dialysen over natten mot 1 liter 50 mM kakodylinsyre, 0,5M NaCl, 50% glycerol, pH 6,0 og så lagret ved -80°C.

EKSEMPEL 8

Vevsdistribusion av rotte- 2. 3- N- sialvltransferase

For å karakteriseres vevsdistribusjon av den klonede rotte-a2,3-N-sialyltransferasen, ble totalt RNA isolert fra forskjellige rottevev og testet med <32p_>merket cDNA av sialyltransferasen. Hybridisering til en mRNA på ~2,5 Kb ble observert i alle testede vev. Som observert for to klonede sialyltransferaser, viste oc2,3-N-sialyltransferasen differensiell ekspresjon i vev fra rotte. De høyeste nivåene av a2,3-N-sialyltransferasen mRNA ble oppdaget i hjernen. Lever, nyre, colon, hjerte, ovarie og lunge uttrykte mellomliggende nivåer av message, mens lave nivåer mRNA ble funnet i submaksillar kjertel, milt og tynntarm. Derimot ble de høyeste nivåene av GalBl,4GlcNAc-cc2,6-sialyltransferase mRNA (4,7 og 4,3 Kb, 41,46) detektert i rottelever og submaksillar kjertel, mens lave nivåer av mRNA ble funnet i hjerte, ovarie og hjerne.

EKSEMPEL 9

Konservert homologiregion i katalytisk område

Den konserverte regionen av sialyltransferase-familien - Sammenligning av den primære strukturen av de tre klonede sialyltransferasene avslørte en region av utstrakt homologi (figur 12). Denne regionen består av 55 aminosyrer fra residie 156 til residie 210 fra a2,3-N-sialyltransferase med 42% av aminosyrene identiske og 58% av aminosyrene konservert mellom alle tre enzymer. Sekvenser fra alle tre sialyltransferasene har ingen signifikant homologi utenfor denne regionen. Da denne homologiregionen er lokalisert nær senteret av det katalytiske området i enzymet, kan denne regionen representere en konservert struktur som er nødvendig for den enzymatiske aktiviteten av disse sialyltransferasene.

Tre medlemmer av sialyltransferase-familien av glykosyltransferaser har blitt klonet. Selv om 85% av sekvensene i alle tre klonede sialyltransferaser ikke har noen signifikant homologi, er en region på 55 aminosyrer i senteret av hvert molekyl meget konservert, noe som foreslår et proteinmotiv i sialyltransferase-familien. Et proteinmotiv er en vel-konservert gruppe av aminosyrer i en spesifikk region. Andre aminosyreresidier utenfor denne regionen er vanligvis dårlig konservert, slik at det er lav total homologi i proteinene inneholdende det samme motiv. Ved denne definisjonen, er den konserverte region definert ved de primære strukturene av de tre klonede sialyltransferasene et motiv i sialyltransferase-familien.

Proteinmotiver er ofte involvert i katalyse og ligand-binding (Hodgman, T.C., Comput. Applic. Biosci., 5,1-13 [1989]; Bairoch, A., Prosite: A Dictionary of Protein Sites and Patterns, 5. utg., University of Geneva [1990]; og Steinberg, M.J.E., Nature, 349. 111

[1991]). Alle tre klonede sialyltransferasene katalyserer overføringen sialinsyre fra CMP-NeuAc i ct2,3- eller a2,6-bindinger av terminal galaktose for å danne de følgende sekvenser: NeuAcot2,3-GalB 1,3(4)GlcNAc- (ST3N) NeuAca2,3-GalBl,3)GlcNAc- (ST30) NeuAca2,3-GalBl,4GlcNAc- (ST6N)

Alle tre enzymene deler en felles funksjon. Mer enn 50% av residiene i den konserverte regionen er enten ladede eller polare aminosyrer i samsvar med å være på overflaten av enzymene. Seks av de ladede residiene i denne regionen er identiske i alle tre sialyltransferasene. Det er meget slående at det er syv aminosyreresidier i en strekning i den konserverte regionen som er identisk mellom alle tre klonede sialyltransferasene-Asp.Val.Gly.Ser.Lys.Thr.Thr (figur 12) (SEQ. ID. NO. 17).

EKSEMPEL 10

Kloning av en ny sialyltransferase ved bruk av

den konserverte homologiregionen

Den konserverte homologiregionen ble benyttet for å klone et annet medlem av sialyltransferase-gen fami lien.

PCR- kloning med degenerert oligonukleotider - To degenererte oligonukleotider tilsvarende til 5'- og 3'-endene av den konserverte homologiregionen (figur 13) ble syntetisert (Genosys). Sekvensen av 5'- og 3'-primerne var henholdsvis

5'GGAAGCTTTGSCRNMGSTGYRYCRTCGT (SEQ. ID. NO. 19) og 5'CCGGATCCGGTRGTYTTNSNSCCACRTC (SEQ. ID. NO. 20) (N=A+G+T+C,

S=G+C, R=A+G, M=A+C, Y=C+T). PCR-eksperimenter ble utført ved bruk av 100 pmol av hver primer og hver streng cDNA syntetisert fra nyfødt rottehjerne som en templat. Forsterking ble utført ved 30 cykler på 94<0>C i 1 minutt, 37°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter. PCR-produktene ble kuttet med BamHI og Hindlll og subklonet inn i disse setene av Bluescript KS (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). Subkloner ble karakterisert ved sekvensering med en T3-primer. Det forsterkede fragmentet fra disse tre subklonene, SMI, ble benyttet nedenfor for å screene for et SMI-inneholdende gen som koder for sialyltransferase.

Kloning av det SMI- inneholdende genet - Vilkårlig primet nyfødt rottehjerne cDNA ble ligert med EcoRI-Notl-linkere som så deretter ble ligert til EcoRI-kuttet XgtlO. Det resulterende biblioteket ble pakket ved bruk av et Stratagene Gigapack II-pakkingsekstrakt og utsådd på E. coli C600 hfl. Omkring 10^ plakk ble screenet med det klonede SMI PCR-fragmentet. Fire kloner, STX1-4, ble renset og subklonet inn i Notl-setet av Bluescript (Stratagene) for videre analyse.

Northern analyse - Totalt RNA fra rottevev ble preparert ved bruk av en syrefenolprosedyre som beskrevet tidligere (Chomoznsyi, P. et al., Anal. Biochem., 162.136-159 [1987]). Nyfødte RNA-prøver ble isolert fra rotteunger innen fire dager etter fødsel. RNA ble elektroforesert i en 1% agarosegel inneholdende formaldehyd, overført til nitrocellulose og hybridisert ifølge standard prosedyrer (Kriegler, M., Gene transfer and expression, Stockton Press, N.Y., N.Y. [1990]). Northern blott ble testet med et gelrenset, radiomerket, 900 bp EcoRI-fragment isolert fra STX1.

Konstruksjon av en oppløselig form av STX - En forkortet form av STX manglende de første 31 aminosyrene av pen-leserammen ble preparert ved PCR-amplifisering med en 5'-primer inneholdende et i-ramme BanHI-sete og en 3'-primer lokalisert 50 bp nedstrøms for stp-kodonet. Forsterking ble utført ved 30 cykler ved 94°C i 1 minutt, 45°C i 1 minutt og 72°C i 2 minutter. Fusjonsvektoren pGIR201 protA ble konstruert ved insertsjon av et BcII/BamHI-fragment isolert fra pRIT5 (Pharmacia LKB Biotech, Inc., 1025 Atlantic Avenue, Suite 101, Alameda, CA 94501), og kodet for protein A IgG bindende området i BamHI-setet av pGIR201 (en gave fra Dr. K. Drickamer, Columbia University). Det forsterkede fragment ble subklonet inn i BamHI-setet av pGIR201protA for å resultere i fusjon av STX til insulin-signalsekvensen og protein A til stede i vektoren. Et Nhe-fragment inneholdende fusjonsproteinet ble subklonet inn i plasmid pSVL for å resultere i ekspresjonsplasmid AX78.

Ekspresjon av den oppløselig form av STX - Ekspresjonsplasmidet AX78 (10 ug) ble transfektert inn i COS-l-celler i 10 cm plater. To dager etter transfeksjon ble kulturmediet oppsamlet og inkubert med IgG sepharose (Pharmacia) i 1 time ved romtemperatur. Kulene ble analysert for sialyltransferase-aktivitet ved bruk av oligosakkarider, antifrys-glykoprotein, blandede gangliosider og neuraminidase-behandlede nyfødte rottehjernemembraner som akseptorsubstrater. Overføring av sialinsyre til disse akseptorene ble målt ved hjelp av ionebytter (Weinstein, J., et al., J. Biol. Chem.. 257.13835-13844 [1982]), størrelseseksklusjon (Id.), og synkende papirkromatografi (McCoy, R.D., et al., J. Biol. Chem., 260,12695-12699 [1985]).

Identiske transfeksjoner ble utført for puls-chase-merkingsekspeirmenter. Etter en 36 timers ekspresjonsperiode ble platene inkubert ved 37°C med 2,5 ml DMEM-metionin. Etter 1 time ble 250 uCI 3^S-transmerke (Amersham, 2636 S. Clairebrook, Arlington Heights, IL 60005) tilsatt til mediet og platene ble inkubert i ytterligere 3 timer. Ved slutten av denne tiden ble platene vasket og inkubert over natten med fullstendig DMEM. Merkede fusjonsproteiner ble isolert ved inkubering med IgG sepharose (Pharmacia). Etter binding ble kulene vasket, kokt i Laemalli-prøvebuffer og de frigitte proteinene ble analysert ved SDS-PAGE/fluorgrafi.

PCR- amplifisering av en konservert homologiregion relatert til de funnet i karakteriserte sialyltransferaser

Mens omkring 70% av aminosyrene i den konserverte homologiregionen i de karakteriserte sialyltransferasene er konserverte, er de største konserveringsregionene funnet i aminosyresekvensene ved endene av den konserverte homologiregionen (figur 13). Aminosyresekvensen nær den C-terminal enden av den konserverte homologiregionen har blitt funnet å inneholde en kontinuerlig strekning på syv invariante residier. Den sterke konverseringen av denne aminosyresekvensen tillater utforming av et oligonukleotid med relativt lav kompleksitet med en 256 ganger degenerasjon som omfatter alle de observerte variasjonene i kodonanvendelse. Utformingen av et oligonukleotid tilsvarende til den N-terminale enden av den konserverte homologiregionen var vanskeligere. Aminosyrene til stede i denne regionen viser større variabilitet enn de funnet i den motsatte enden av den konserverte homologiregionen. Oligonukleotidutforming var ytterligere komplisert ved den høye kodonredundansen i aminosyrene. For å kompensere for disse faktorene ble oligonukleotidet fra 5'-enden av den konserverte homologiregionen syntetisert med en 1026 gangers degenerasjon. Mens denne graden av kompleksitet er nær terskelen for degenerasjonen som er tillatelig i PCRE-eksperimenter, den resulterende primeren svarer for alle nukleotidsekvensene funnet å kode for denne regionen av den konserverte homologiregionen.

Neural utvikling er en kompleks prosess under hvilken glykosyltransferaser blir utsatt for dynamisk regulering slik det er tydelig fra de dramatiske forandringer funnet i celleoverflatens karbohydratekspresjon. Av denne grunn ble nyfødt rottehjerne valgt som kilde for forsøk for å isolere nye sialyltransferaser. Ved bruk av nyfødt rottehjerne cDNA som templat for PCR-eksperimenter med de degenerate primere resulterte i amplifisering av et 150 bp bånd, bestående av den kjente størrelsen av den konserverte homologiregionen. Subkloning og sekvensering avslørte at båndet var en blanding av to DNA-fragmenter. Av 30 karakteriserte isolater kodet 56% for den ct-konserverte homologiregionen; de gjenværende klonene kodet for en unik konservert homologiregion, SMI. Noe overraskende inneholder SMI fem forandringer i aminosyrene som ble funnet å være invariante i de tre foregående klonede sialyltransferasene. Mens disse forandringene reduserer det totale antall invariante residier, hever de nye sekvensinformasjonene gitt ved karakteirseringen av SMI totalkonserveringen av konsensussekvensen.

Den antatte aminosyresekvensen av SMI viser ingen spesiell tilbøyelighet mot noen individuell konservert homologiregion. Ved noen posisjoner (aminosyrer 1, 2, 53, 54) er SMI tilsvarende til den a2,6-konserverte homologiregionen; i andre posisjoner (aminosyrer 8,9, 54, 55) reflekterer SMI sekvensene funnet i den a2,3-konserverte homologiregionen. Mens den konserverte homologiregionen er 85% konservert, resulterer denne balansen av likheter i SMI i omkring 45% homolog til andre medlemmer av sialyltransferase-genfamilien.

Primær struktur av det SMI - inneholdende gen - Sekvensanalyse av den 1,5 kb klon STX1 viste en kontinuerlig 375 aminosyrers åpen leseramme som kodet den SMI konserverte homologiregionen karakterisert i tidligere PCR-eksperimenter (figur 14) SEQ JD. NO. 7 og 8. Den avledede aminosyresekvensen til STX1 foreslår at dette proteinet er type II-transmembranprotein som har blitt observert for hver av disse andre klonede glykosyltransferasene. Den avledede aminosyresekvensen av STX1 indikerte nærværet av en hydrofob region åtte residier fra aminoterminalen til proteinet som kunne tjene som et signal-ankerområde. Den konserverte homologiregionen er lokalisert nær senteret av proteinet. Totalstørrelsen av STX-proteinet og de relative andelene av både den hydrofobe regionen og den konserverte homologiregionen samsvarer strengt de primære sekvenskarakteristikkene til klonede sialyltransferaser. Selv om STX ikke viser noen homologi med de klonede sialyltransferasene bortsett fra den konserverte homologiregionen, gjør de uttrykte strukturelle likhetene til disse genene det klart at STX står for det nyeste medlem av denne genfamilien.

Enz<y>matisk karakterisering av STX - Naturlig forekommende oppløselige former av sialyltransferaser kan bli funnet i forskjellige sekreter og kroppsfluider (Paulson, J.C. et al, J. Biol. Chem., 252,2356-2367 [1977] og Hudgin, R.L. et al., Can. J. Biochem., 49, 829-837 [1971]). Disse oppløselige formene er resultat av proteolytisk spalting av stammeregionen av sialyltransferasen for å frigi det katalytiske området fra det transmembrane ankeret. Oppløselige sialyltransferaser kan bli rekombinant konstruert ved erstatning av det endogene signal-ankerområdet med en spaltbar signalsekvens (Colley, K.J. et al., J. Biol. Chem., 264,17619-17622 [1989]). For å muliggjøre funksjonell analyse av STX ble en oppløselig form av proteinet generert ved å erstatte de første 31 aminosyrene med den spaltbare insulin-signalsekvensen og protein A IgG-bindende området. Det IgG-bindende området ble inkludert i konstruksjon for å hjelpe detekteringen av det oppløselige STX-proteinet. Tilsvarende fusjoner med ST3N ble aktivt utskilt fra uttrykkende celler, bundet ved IgG sepharose og er enzymatisk aktivt. Når et ekspresjonsplasmid inneholdende protein A/STX-fusjon (AX78) ble uttrykt i COS-l-celler, ble et 85 kd protein isolert. Størrelsen av fusjonsproteinet er omkring 15 kd større enn den anslåtte molekylvekten til polypeptidet, noe som antyder at et antall av STX potensielle N-bundne glykosyleringsseter blir benyttet.

Det bundne fusjonsproteinet ble analysert for sialyltransferase-aktivitet ved bruk av forskjellige akseptorsubstrater. Aktivitet ble ikke detektert ved bruk av fi-galaktosidakseptorer inneholdende GalJ31,3(4)GlcNAc-sekvenser; tilsvarende ble ingen overføring av sialinsyre til de O-bundne oligosakkaridene på antifrys-glykoproteinet detektert. Ekspresjonen av STX i hjernevevet antyder at genet kan være involvert i glykolipid-biosyntesen; imidlertid feilet gangliosider isolert fra voksne bovine hjerner i å tjene som akseptorsubstrat. Neuroamidase-behandlede, nyfødte hjernemembraner var det eneste substratet som viste selv en marginal evne til å tjene som en akseptor. Inkubering av behandlede membraner med STX-fusjonsprotein resulterte i en 50% økning av aktivitet over bakgrunnen.

Utvikling og vevsspesifikkk ekspresjon av STX - For å bestemme mønsteret av ekspresjon og messagestørrelse til STX-genet ble Northern blott testet med et 900 bp EcoRI-fragment isolert fra STX1. De forskjellige undersøkte vevene ble hybridisering av en 5,5 kB messanger kun observert i nyfødt rottehjerne RNA. Ingen krysshybridisering til relatert konserverte homologiregioner ble observert. Den begrensede ekspresjonen av STX er et avvik fra den differensielle vevsspesifikke ekspresjonen funnet med karakteriserte sialyltransferaser. Mens hver av disse genene blir uavhengig regulert for å resultere i forskjellige mønstere av vevsspesifikk ekspresjon, ble generelt hver sialyltransferase variabelt uttrykt i et antall forskjellige vev (Paulson, J.C. et al., J. Biol. Chem., 264,10831-10934 [1989]). Derimot, blir STX kun uttrykt i nyfødt hjerne; ekspresjonen synes ikke å være et generalisert embryonisk fenomen ettersom messangeren ikke ble detektert i nyfødt nyre.

Claims

1. DNA molekyl som koder for et rekombinant polypeptidenzym som har sialyltransferase enzymaktivitet, karakterisert ved at nevnte peptidenzym innbefatter et katalytisk domene hvori nevnte katalytiske domene innbefatter et konservert homologiområde som innbefatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: Cys-Arg-Arg-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Asn-Leu-Lys-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Gln-Ue-Asp-Ser-His-Asp-Phe-Val-Leu-Arg-Met-Asn-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu-Gly-Phe-Glu-Ala-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-His-His-Phe-Val-Tyr-Pro-Glu; Cys-Arg-Arg-Cys-Ile-Ile-Val-Gly-Asn-Gly-Gly-Val-Leu-Ala-Asn-Lys-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Ile-Asp-Tyr-Asp-Ile-Val-Leu-Arg-Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys-Gly-Phe-Glu-Lys-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-Leu-Arg-Ile-Thr-Tyr-Pro-Glu; og Phe-Gln-Thr-Cys-Ala-Ile-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Asn-Ser-Gly-Cys-Gly-Gln-Glu-Ile-Asp-Thr-His-Ser-Phe-Val-Ile-Arg-Cys-Asn-Leu-Ala-Pro-Val-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Asp-Val-Gly-Leu-Lys-Thr-Asp-Leu-Val-Thr-Met-Asn-Pro-Ser (SEQ. ID. NO. 14) og varianter derav, hvori nevnte varianter har minst 70% sekvenslikhet med nevnte rekombinante polypeptidenzym.

2. DNA-molekylet ifølge krav 1, karakterisert ved at de koder for en sialyltransferase med aminosyresekvensen vist i SEQ. ID. NO. 8.

3. DNA-molekylet ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte rekombinante polypeptidenzym ytterligere innbefatter et transmembrandomene.

4. DNA-molekylet ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte rekombinante polypeptidenzym innbefatter et cytoplasmadomene.

5. DNA-molekylet ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte rekombinante polypeptidenzym er i det alt vesentlige fri for substanser som finnes i et in vivo fysiologisk miljø, og som innbefatter aminosyresekvensene vist i SEQ. ID. NO. 8.

6. En rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den innbefatter et DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1-5.

7. En sammensetning, karakterisert ved at den innbefatter en celle transformert med den rekombinante ekspresjonsvektoren ifølge krav 6.