CZ220494A3 - Composition and methods of identification and synthesis of siallyltransferases - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká sialyltransferásových genů, skupiny glykosyltransferás odpovědné ze terminální sialylaci karbohydrátové skupiny glykoproteinů, glykolipidů a oligosacharidu, které obsahují konzervovaný region homologie v katalytické doméně. Členy rodiny sialyltransferáscvých genů jsou GalBl, 3GalNAc / 2,3 sialyltransferása a Gall,3(4)GlcNAc d2,3 sialyltransferása. Vynález se dále týká nových forem a přípravků, které je obsahují a způsobu identifikace a produkce členů rodiny sialyltransferásových genů , které jsou homogenní ve významných použitelných množstvích. Tento vynález se také týká přípravy izolované deoxyribonukleotidové kyseliny (DNA), kódující produkci sialyltransferás, způsobů přípravy DNA molem kul, které kódují sialyltransferásy, exprese lidských a savčích sialyltransferás za použití takových DNA, jakož i nových sloučenin, zahrnujících nové nukleové kyseliny, kódující sialyltransferásy nebo jejich fragmenty. Tento vynález je také veden na sialyltransferásové deriváty, zejména deriváty, postrádající cytoplasmické a/nebo transmembránové podíly proteinu a jejich produkce rekombinantními DNA technikami.

Dosavadní stav techniky

Sialyltransferásy jsou rodinou enzymu, které kataly zují přenos sialové kyseliny (SA) k terminálním podílům karbohydrátových skupin glykolipidů a oligosacharidu v obecné reakci:

cytididin 5 monofosfát-sialová kyselina (C’1P) + KO-akceptor CI1P + SA-O-akceptor (Beyer T.A. et. Adv.Enzymol. 52, 23_175/1931/).

-2Sialyltransferásy se nacházejí primárně v Golgiho aparátu buněk, kde se podílejí na posttranslačních glykosylačních drahách.(Fleischer B.J. Cell Biol. 89, 246255/1981/).Nacházejí se také v tělesných tekutinách jako je prsní mléko, kolostrum a krev. Alespoň 10-12 různých sialyltransferás je požadováno pro syntézu všech známých sialyloligosacharidových sekvencí. Každá z nich by měla být enzymaticky rozlišitelná pro svoji specifitu sekvence oligosacharidu a anomerního spojení vytvořeného mezi sialovou kyselinou a cukrem, ke kterému je tato připojena. Byyly vyčištěny čtyři sialyltransferásy (Beyer et al., ibid, Weinstein J.at al., J.Biol.Chem. 257, 13835-13844/1982/,_{Miagi T> a Tsuiki s>} Eur.J.Biochem. 125, 253-261/1982/ a Joziasse D.H. et al., J.Biol.Chem., 260, 4941-4951/1985/). Specifičtěji byly GalBl,4GlcNAc 2-6 sialyltransferása a GalBl,3(4)GlcNAc p( 2-3 sialyltransferása čištěny z membrán krysích jater (Weinstein et al. ibid).

Jiné glykosyltransferásy byly izolovány jako rozpustné enzymy v séru, mléku nebo kolostru, zahrnující sialyl-, fukosyl-, galaktosyl-, N-acetylglukosaminyl- a N-acetylgalaktisaminyltransferásy.(Beyer et al., ibid)).Hovězí a lidská B-N-acetylglukosamid B1,4-galaktosyltransferása byla izolována (Narimatsu H. et al. Proc.Nat.Acad.Sci.

USA 83, 4720-4724/1986/, Shaper N.L: et al., Proč.Nat.Acad Sci. USA 83, 1573-1577/1986/, Appert H.E. et al., Biochem. Biophys.Res.Common 139, 163-168 /1986/ a Humpreys-Beyer M.G. et al., Proč.Nat.Acad.Sci. USA 83, 8918-8922/1986/. Tyto čištěné glykosyltransferásy se liší ve velikosti, což muže být způsobeno odstraněním .-_{stí protsinu nepod}.

-3statných pro aktivitu jako jsou membránové spanning domény.

Porovnání odvozených aminokyselinových sekvencí cDNA klonů, kodujíccích glykosyltransferásy, zahrnující galaktosyltransferásy, sialyltransferásy, fukosyltransferásu a N-acetylgalaktosaminyltransferásu, potvrzuje, že tyto pravděpodobně nemají žádnou sekveni homologní.

Totéž je možno prohlásit o glykosyltransferásáhch strukturn ně podobných z analyýzy primárních struktur klonovaných sialyltransferás (Weinstein J.et al., ibid.). Nicméně všechny mají krátký Nl^-terminální cytoplasmický ocas 16-20 aminokyselinovou signální základní doménu a přesahující kmenovou oblast,která je následována velkou COOH-terminální katalytickou doménou. Weinstein J.et al., J.Biol.Chem.264, 17615-17618/1989/. Signální základní domény působí jak jako -neodštěpitelné signální peptidy tak jako membránové-spanning regiony a orientují kataly tické domény těchto glykosyltransferás do lumenu Golgiho aparátu. Obvyklé aminokyselinové sekvence by mohly být očekávány v rodinách glykosyltransferás, ketré se podobně vážou na akceptory nebo donory substrátů, avšak bylo spřekvapením nalezeno málo regionů homologie v katalytických doménách glykosyltransferás a žádná významná sekvenční homologie nebyla nalezena se žádným proteinem v GenBank (Shaper N.L. et al., J.Biol Chem 216, 10420-10428/1988/, D'Agostaso G. et al., Eur J.Biochem 183, 211-217/1989/ a Weinstein J. et al., J.Biol.Chem 263, 17735-17743/1987/). Toto je zejména překvapující pro Gal ^1,3-GT a GlcNAC 81,4-GT,dvě galaktosyltransf erásy Nicméně pokud tyto galaktosyltransferásy nevykazují celkovou homologii, je zde obvyklý ^hexa9^eP^tiú KDKKND ^prOGal Λ 1,3-GT (hovězí, 304-309) a RDKKNE pro GlcNAc fll,4-GT (hovězí, lidské, myší aminokyseliny 346-351). (Joziasse et al., J.Biol Chem 264, 14290-14297/1989/.).

Sialová kyseliny jsou terminální cukry na karbohydrátových skupinách přítomných v glykoproteinech a glykolipidch a jsou široce distribuovány v živočišných tkáních (Momol T. a kol., J.Biol. Chem. 261, 16270-16273/1986/). Sialové kyseliny hrají důležitou roli v biologických funkcích karbohydrátových struktur díky jejich terminální poloze. Například sialová kyselina působí jako ligand pro vazbu influenza vízu k hostitelské buňce (Paulson J.C., The Receptors, vol.2, Conn P.M., ed., str. 131-219, Academie Pres /1985/). I změna ve spojení sialová kyseliny je dostačující pro změnu hostitelovy specifity (Roger G.N., a kol., Nátuře 304, 76-78 /1983/). Neurální buněčná adheze molekuly (NCAI1) je podrobena vývojově regulované polysialylaci, o které se předpokládá, že moduluje NCAm zprostředkovanou buněčnou adhezi během vývoje nervového systému (Rutishauser U. a kol., Science 240, 53-37/1988/ a Rutishauser U., Adv.Exp.íled.Biol. 265, 179-18/1990/). V poslední v

době karbohydrátová struktura, sialyl lewis X (SLe ) byla zjištěna jako funkční jako ligand pro endotheliální leukocytovou adhezi molekuly (E-Selectin), která zprostředkuje vazbu neutrofilů k aktivovaným endotheliálním buňkám (Lowe a kol., 1990, Phillips a kol., 1990, Goelz a kol. Walz a kol., 1990, Brandley a kol.,1990). P-selectin (plotnová aktivace závislé granule k proteinu vnější membrány, CD62), další člen selectinové rodiny (Stolman,L.M., CE11 56, 90-910/1989/), byl také doložen k rozpoznání SLE^X přítomné na monocytech a PMN (Larsen a kol., Proč.Nati. Acad.Sci. USA 87, 6674-6678/1990/, Momol a kol., J.Biol. Chem. 261, 16270-16273/1986/, Polley a kol., Proč.Nati. Acad.Sci. USA 88, 6224-6228/1991/, Chán K.F.J., J.Biol.

Chem. 263, 568-574/1988/, Beyer T.A. a kol., Adv.Enzymol., 52, 23-175/1981/). V obou případech je kyselina sialová klíčovou složkou pro karbohydrátovou strukturu ve funkci jako ligand. Navíc k tomu, že hraje roli v buněčné adhezi, byly karbohydrátové struktury, obsahující kyselinu sia-tlovou zjištěny jako přímo působící v diferenciaci. Homatopoetická buněčná linie HL-60 může být indukována k diferenciaci ošetřením s glykolipidem G.,^. Gangliosidy jsou také považována za hrající úlohu v modulaci aktivit růstový faktor-protein kinása a v kontrole buněčného cyklu

Jedna z takových sialyltranferás byla čištěna, jak je popsáno v US patentu 5047335. I když určitá množství čištěné sialyltransferásy byla dostupná, jsou dostupná jen velmi malá množství, zejména proto, že jsou membránově navázanými proteiny endoplasmického retikula a golgiho aparátu. Značné náklady jak ekonomické tak na dostupnost, při čištění takových sialyltransferás činí tyto vzácným materiálem. Objektem předloženého vynálezu je izolovat DUA, kódující sialyltranferásu a produkovat použitelná množství savčích, zejména lidských, sialyltransferás za použití rekombinantních DUA technik. Dalším objektem je poskytnutí způsobu pro získání DNA kódující jiné členy rodiny sialyltransferásových genů z různých tkání jakož i od různých druhů. Je dalším objektem vynálezu připravit nové formy sialyltransferás. Je ještě dalším objektem poskytnout zlepšené způsoby pro katalýzu transferu sialové kyseliny k terminálním polohám některých karbohydrátových skupin. Tyto a dal,ší objekty předloženého vynálezu budou zřejmé z popisu jako celku.

Podstata vynálezu

Objjů©ty tohoto vynálezu byly provedeny metodou, zahrnující: identifikaci a klonování genů, které kódují savčí sialyltransferásy /definované zde dále/, zahrnující, aniž by tak byly omezeny, vepřovou Galfll,3GalNAc

-6·

Λ 2,3 sialyltransferásu a krysí Gall,3(4)GlcNAc ,<2,3 sialyltransfsrásu (jinou než krysí GallBl, 4GlcNAc ,^2,6 sialyltransferásu), inkorporací genu do rekombinantního DNA vektoru, transformaci vhodného hostitele vektorem, obsahujícím tento gen, expresi genů savčí sialyltransferásy v takovém hostiteli a získání takto produkované savčí sialyltransferásy. Alternativně může být použito mnoho jiných rekombinantních technik pro dosažení exprese sialyltransf erásy . Podobně předložený vynález umožňuje produkovat savčí sialyltransferásu a/nebo její deriváty rekombinantními technikami, jakož i poskytnutí způsobů pro produkci takových sialyltransferás. Sialyltransferásy jsoukírně hojné proteiny a jsou obtížné pro čištění.

Izolace a identifikace sialyltransferásových genů byla extrémně obtížná. mRNA byla vzácná a buněčné linie nebo jiné zdroje velkých množství mRNA byly nedostupné.

Tento vynález poprvé uvádí rodinu sialyltransferásových genů definovanou konzervovaným regionem homologie v katalytické doméně enzymu.

Předložený vynález je řízen na přípravky a metody produkce savčí sialyltransferásy via rekombinantní DNA technologie, zahrnující: 1/ objev a identitu celé DNA sekvence enzymu a jeho 5'-lemující region, 2/ konstrukci klonujících a expresních vehikul, obsahujících uvedené DNA sekvence, umožňujících expresi savčího sialyltransferá sového proteinu jakož i fuzní nebo signální jejich N-koncové konjugáty, a 3/ životaschopné buněčné kultury a jiné expresní systémy a jiné expresní systémy, geneticky pozměněné na základě toho, že obsahují taková vehikula a jsou schopny produkce savší sialyltransferásy. TEnto vynález je dále řízen na přípravky a metody produkce DNA, která kóduje celulární produkci savčí sialyltransferásy. Ještě dal ším aspektem tohoto vynálezu jsou nové sloučeniny, zahrnující deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy, které jsou využitelné pro získání klonů, které jsou schopny exprese sia~ lyltransferásy. Ještě dalším aspektem předloženého vynálezu je sialyltransferás& v podstatě prostá všech přirozeně se vyskytujících substancí, které je typicky nacházena v krvi a/nebo tkámích,tj. sialyltransferása produkovaná rekombinantními způsoby bude prostá takových kontaminantů, které se typicky nacházejí v jejích in vivo fyziologickém prostředí. Dále v závislosti na způsobu produkce může získaná sialyltranferása obsahovat připojenou glykosylaci pro vetší nebo menší rozsah ve srovnání s materiálem získaným z jejího in vovo fyziologického prostředí,tj. krvi a/nebo tkáních. Tento vynález je dále řízen na nové sialyltransferásové deriváty, zejména deriváty, postrádají! sialyltransferásové aminoterminální zbytky, např. deriváty, postrádající krátkou NI^ cytoplasmickou doménu nebo hydrofobni N-terminální signální-kotevní sekvenci, která je tvořena sialyltransferásovou transmembránovou doménou a kmenovým regionem.

Savčí sialyltransferása a její deriváty podle předloženého vynálezu jsou použitelné mimo sialových kyselin na karbohydrátových skupinách přítomných na glykoproteinech a glykolipidech. Navíc sialyltransferása a její deriváty jsou enzymaticky použitelné při přidání sialové kyseliny k cukrovým řetězcům za vzniku karbohydrátů, s funkcí determinantů v biologickém rozpoznávání. Takové sialyltransferásové enzymy mohou být použity v multi-enzymových systémech pro syntézu oligosacharidů a derivátů (Ichikawa a kol., J.Am.Chem.Soc. 113, 4698/1591/ a Ichikawa a kol., J.Am.Chem.Soc. 113, 6300/1991/). Konečně DNA, zejména konzervovaný region homologie katalytické domény, kódující rodinu sialyltransferásových genů podle předloženého vynález je vhodný pro poskytnutí prostředků pro klono vání genu, kódujícího jiné členy rodiny sialyltransfera— sových genů. Jiná použití pro sialyltransferásu a DNA kódující sialyltransferásu budou zřejmá odborníkům v oboru.

-aPopis obrázků na připojených výkresech

GalBl, 3GalNAc #(2,3 sialyltransferásy ( 2,3-0).

Nukleotidová sekvence vepřové *(2,3-0 mRNA byla sta novena z DMA sekvenční analýzy dvou přesahujících klonů

ST2. Předpověděné aminokyseliny

0(.2,3-0 polypeptidu jsou označeny nad DMA sekvencí a jsou číslovány od prvního zbytku N-terminálu analogického čištěného proteinu. Označena je navržená signální-kotevní sekvence /prázdný rámeček/. Potenciální glykosylační místa se sekvencí Asn-X-Thr jsou označena hvezdickou/Ύ. SEkvence odpovídá dlouhé formě X 2,3 sialyltransferásy, kódované přesahujícími klony STl a AST2.

Obr.2.Nukleotidová a aminokyselinová sekvence krysí

GallBl,3(4)GlcNAc X. 2,3-sialyltransferásy ( 2,3-N)

Nukleotidová sekvence krysí X, 2,3-N mRNA byla stanovena z DNA sekvenční analýzy. Předpověděné aminokyseliny sialyltransferásového polypeptidu jsou označe ny nad DNA sekvencí a jsou číslovány od prvního zbyt ku zralého proteinu jak byl stanoven N-terminálním proteinovým sekvenováním

Obr.3 Čištění X 2,3-0 sialyltransferásy na CDP-hexanolamin agarosa /KCL eluce/. Homogenáty ze 2 kg vepřových jater byly vloženy na CDP-hexanolamin agarosovou kolonu a eluovány lineárním gradientem KCL /viz příklady/:. Koncentrace proteinu a aktivita sialyltransferásy za použití laktosy jako akceptorového substrátu byly stanoveny pro jednotlivé frakce. V pólech A a B se oddělily dva píky enzymové aktivity.

OBr.4 Čištění X 2,3-sialyltransferásy na CDP-hexanolamin agarose /kolona III, CDP eluce/. Enzymové aktivity _0_ byly stanovaný za použití specifického akceptor substrátu nemrznoucího glykoproteinu /AFGP/. VE sloupcích A a E eluce enzymové aktivity především koreluje se 48 kDa a 45 kDa druhy proteinů /viz SDS-PAGE/. Tyto dva druhy, forma A a forma B «<2,3 sialyltransferásy měly specifické aktivity 8-10 jednotek/mg proteinu.

kDA a 45 kDA druhy byly blotovány k PVDF membráně a analyzovány NF^-terminálním sekvenováním.

Obr.5 NH₂“terminální aminokyselinové sekvence 48 kDa a kDA </ 2,3-0 sialyltransferásovych peptidů. Podtrženo je 16 hydrofobních aminokyselin blízko Nl^-konce 48 kDa peptidu, obsahující domnělou signál-kotevní doménu.

Obr.6 Restrikční mapa a sekvenční strategie dvou o< 2,ΙΟ sialyltransferásovych cDNA klonů.

Obr.7 Porovnání doménových struktur a homologních regionů dvou sialyltransferás. A, seskupení primárních sekvencí <2,6 sialyltransf erásy a X 2,3-0 sialyltransf erásy zahrnuje 45 aminokyselinový region o 64% sekvenční identitě a 84% sekvenční podobnosti. Iíomologní doména zahrnuje spojení mezi exony 2 a 3 <X. 2,6 sialyltransferásy a leží v katalytických doménách obou enzymů.

Obr.8 Exprese rozpustné, katalyticky aktivní #>/2,3-0 sialyltransferásy. A: cDNA řídící expresi rozpustné formy <2,3-0 sialyltransferásy, sp-ST, byla konstruo vána nahrazením cytoplasmické doména a signální kotevní domény divokého typu sialyltransferásy inzulínovým signálním peptidem; sp-ST byl povazován za kódující 38 kDa, sekretovaných proteinových druhů, jestliže je transfektován do hostitelské buŇky. Bí sp-ST byl inzertován do expresního vektoru pSVL a transfek-10tován do COS-1 buněk? 43 oost-transfekci byly buňky pulzně značeny po 2 hodiny, v mediu, obsahujícím Tran35S značení a potom následovala 5b perioda bez značení.

Tato media byla sklizena, zahuštěna patnáctinásobně a analyzována SDS-PAGF/fluorografií. Byly analyzován duplikáty vzorků sp-ST a falešně transfektovaných buněk. C: COS-1 buňky byly transfektovány lipofeotinem (+ sp-SI) nebo lipofectinem samotnými falešně) stejným způsobem jako 7B. 43 po transfekci byla media oddělena, zahuštěna patnáctinásobně a zkoušena na aktivitu sialyltransferásy se specifickým akceptor substrátem AFG? /Sadler J.E a kol., J.EIol.Chem.

254,4434-4443/1979/).

Obr.

) CID spektrum nejdelšího cekvenovanóho tryptického peptidu z Gal \X2,3-T sialyltransferásového enzymu. Peptidová sekvence je Leu-Thr-Pro-Ala-Leu-Asp-SerLeu-His-Cys -Arg, 1233,5.

představuje karbixymethvl cystein. Ionty se zadrženým nábojem na N-konci jsou označeny jako a, b, o ionty a C-tárminální ionty jsou označeny jako x,v, z fragmenty /Biemnnn K. (1990) Mth.Bnzymol.193: 885-837/. První ionty (a,x) jsou produkty štěpení mezi uhlíkem a karbonylovou skupinou. Ionty y a b jsou vytvořeny, jestliže je štěpena peptidová vazba. Ionty c a z jsou přítomny díky štěpení mezi aminoskupinou a uhlíkem. Číslování těchto fragmentů vždy začíná na odpovídajícím konci. Fragmentace vedlejšího řetězce se objevuje mezi Ba uhlíky aminokyselin, což poskytuje tak zvané d /M-koncové/ a w /C-koncové ionty. Pozorované iontové fragmenty jsou zahrnuty v tabulce. Ionty patřící do těchže iontových sérií jsou uvedeny v řadách.

-11Obr.lO CID spektrum karbamylovaného tryptického peptidu z Gal^2,3-i; sialyltransferásového enzymu. Peptidová sekvence je Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val^Lys, ΐΐπ⁺= 771,4. Fragmentace jasně indikuje modifikaci na il-konci a ne na £ -aminoskupině lysinového zbytku. Velký iont při m/z 569 (w7) potvrzuje přítomnost N-terminálního leucinu v peptidu. lonty označené hvězdičkami jsou matricí příslušných základní.c'n iontů /Falick a kol.,/1990/ Rapid Commun.Mass Spectrom.4:

318/. Pozorované iontové fragmenty jsou uvedeny v tabulce. Ionty, patřící do téže iontové serie jsou uvedeny v řádcích.

Obr.11 Sestava peptidu 1 a 11 odvozených od Galfll,3(4)GlcNAc Λ 2,3-sialyltransferásy /ST3iI/ s dříve klonovanými sialyltransferásami. Gallfll,4GlcNAc ^2,6-sialyltrasferása /ST61I/ a Gallfll, 3GalNAc ^2,3-sialyltransferása /ST3O/ jsou uvedena jako otevřené sloupe.e. Pevný sloupec označuje signál-kotevní sekvenci. Šrafovaný sloupec označuje homologní region identifi·’kovaný mezi dvěma sialyltransferásami.

Obr.12 Konzervovaný region společný třem klonovaným sialyltransf erására. Tři klonované sialyltransferásy jsou krysá Galfll, 3 (4 )GlcNAc o(, 2,3-sialyltransferása (ST3N), vepřová Galfi,3GalNAc 2,3-sialyltransf erása (ST3O) a krysí Galfll,4GlcNAc 2,6-sialyltransferása (ST6N). RBgion tvoří 55 aminokyselin od zbytku 156 ke zbytku 210 Galfll,3(4)GlcMAc 2,3-sialyltransferásy (ST3N). Aminokyselinové identity jsou označeny rámečky.

-12Cbr.13

Předpověděná aminokyselinová sekvence amplifikovaného fragmentu, SMI, a porovnání s předem charakterizovaným konzervovaným regionem homologie. 3’noda koa zervovaného regionu homologie byla získána ze srovnání konzervovaného regionu homologie klonovaných a charakterizovaných sialyltransferás a amplifikovanéo fragmentu Slil. Invariantní aminokyseliny jsou označenyvelkými - písmeny, zatímco aminokyseliny přítomné ve více než 50 % konzervovaného regionu homologie jsou označena rwlýni písmeny.

Polohy, kde r nebo o jsou nalezeny, jsou označeny b, polohy kde jsou nalezeny buč i nebo v jsou označeny Podtržené aminokyseliny představují regiony, které byly použity při tvarování degenerovaných příměrů. Změny v předchozích invariantních aminokyselinách nalezené v amplifikovaném fragmentu jsou označeny hvězdičkami.

Obr.14 Nukleotid a předpověděná aminokyselinová sekvence STXl. Předpovčí/éná aminokyselinová sekvence nejdelšího otevřeného čtecího rámečku kóduje konzervovanou oblast homologie SMI (aminokyseliny 154-208), označené rámečkem. Navržená signál-kotevní (aminokyseliny 8-23) je v rámečku a potenciální N-připojená glykosylační místa jsou podtržena.

Jak je zde použito, sialyltransfarása nebo sialyltransferásové deriváty označují sialyltransferásové enzymy jiné než krysí Galfil,4GlcNAc <2( 2,5 sialyltransferása, které obsahují konzervovaný region homologie v katalytické doméně a jsou enzymaticky aktivní v přenosu sialové kyseliny na terminální polohu cukrových řetězců glykoproteinů, glykolipidů, oligcsacharidů a podobně. Příklady enzymaticky funkčních sialyltransferás jsou ty, které jsou schopny pře nosu sialové kyseliny z CMP-sialové kyseliny na oligosacha,-13ridový akceotor, kde sa tento oligosacharidovv akceptor není v závislosti na jednotlivé sialyltransferáse.

Xonzarvovaná oblast(region) homologie označujs serie aminokyselin v jedné sialyltransferáse, která ja v postata identická se stejnými seriemi aminokyselin v jiném sialyltransferásovém enzymu, když byly sekvence dvou enzymu seřazeny. 7 rodině sialyltransferásových genů podle přdloženého vynálezu ja konzervovaná oblast homologie v katalytické doméně a přesahuje přes alespoň asi 7 přiléhajících aminokyselin a nejvýhodněji alespoň asi 55 aminokyselin, majících aminokyselinovou sekvenci zbytků 156-210 na obr.

nebo zbytků 142 až 19S na obr.l. Jakmile se identifikována konzervovaná oblast homologie, mohou být připraveny varianty aminokyselinové sekvence konzervované oblasti a tyto spadají do jedné nebo více ze tří tříd:

varianty substituční, inzerční nebo deleční. Tyto varianty byly obočně připraveny místně specifickou mutagenesí nukleotidů v DNA kódující sialyltransferásu, čímž se získá DMA kódující sialyltransferásu, obsahující konzervovaný region homologové varianty.

V rozsahu sialyltransferásy je například krysí Galfil, 3(4)GlcNAc 'X. 2,3-sialyltransf erása (zde označena jako vC2,3-K), kteroutvoříLIeuDAc^2,3 ,GalBl,<K3GlcuAc a NeuAcoC2,3Galfil,4GlcNAc sekvence, které často zakončují komplex 11-připojených oligosacharidu. jjný oříklad enzymu zahrnutého v rozsahu sialyltransferásy je vepřová GalBl,3GalMAc¢¢2,3 sialyltransferása (zde označovaná jako 0(2,3-0), kterou tvoří NeuAc¢¢2,3GalBl,3GalHAc nalezená na cukrových řetězcích O-napojených k threoninu nebo šeřinu jakož i terminální sekvenci určitých gangliosidů.

-14j rozsahu sialyltransferásy jak je zde tento výraz použit jsou sialyltransferásy, mající nativní glykosylaci a aminokyselinové sekvence krysí a veorové sialyltransferásy, jak jsou uvedeny na obr. 1 nebo 2, analogická sialyltransferása z jiných živočišných druhů jako je hovězí, lidská a podobně jakož i z jiných tkání, deglýkosylovanc nebo neglykosylovaná deriváty takových sialy1transferás, varianty aminokyselinové sekvence sialvltransferásy a in vitro generované kovalentní deriváty sialyltransferás. Všech ny tyto formy sialyltransferásy obsahují konzervovanou oblast homologie a jsou enzymaticky aktivní nebo, pokud ne,, nesou alespoň jeden imunitní epitop běžný pro enzymaticky aktivní sialyltransferásu.

Varianty aminokyselinové sekvence sialyltransferásy * spadají do jedné nebo více ze tří tříd: substituční, inzerční nebo deleční varianty. Tyto varianty se obvykle připravují místně specifickou mutagenesí nukleotidů v DNA kódující sialyltransferásu, čímž se získá DNA kódující variantu a potom expresí DNA v rekombinantní buněčné kultuře. Nicméně fragmenty variant sialyltransferásy, mající až asi 100-150 zbytků, mohou být běžně připraveny za použití in vitro syntézy.Varianty aminokyselinové sekvence jsou charakterizovány předem stanoveným charakterem variace, jehož rysy jsou zjevné z přirozeně se vyskytující allelicé nebo interdruhové variace sialyltransferásové aminokyselinové sekvence. Varianty v konzervované oblasti homologie typicky vykazují stejnou kvalitativní biologickou aktivitu jako přirozeně se vyskytující analogy.

Jestliže je místo pro zavedení variace aminokyselinové sekvence předem stanoveno, nemusí být mutace perse předem stanovena. Například za účelem optimalizace účinnosi mutace na daném místě, může být provedena náhodná mutagenese u cílového kodonu nebo regionu a exprimované sialyltransferásové varianty být prohledány na optimální kombinaci

-13požadované aktivity. Tgchniky pro provedení substitučních mutací na předemstanovenýeh místech v DNA, mající známou sak věnci jsou dobře známé, například N13 primer mutagenese nebo mutagenese založená na PCR.

Aminokyselinové substituce jsou typicky jediné zbytky: inzerce obvykle bude řádově asi 1 až 10 aminokyselinových zbytků a delece budou v rozmezí asi 1 až 30 zbytků. DElece nebo inzerce se výhodné provednou v připojených párech,tj. delece 2 zbytků nebo inzerce 2 zbytků. Substituce, delece, inzerce nebo jakékoliv jejich kombinace mohou být kombinovány pro dosažení konečného konstruktu. Obvykle mutace, které se provedou v DNA kódující veriahíý sialyltransferásy nesmí být umístěny v sekvenci mimo čtecí rámec a výhodné nebudou tvořit komplementární regiony, které by mohly produkovat sekundární i-iRMA strukturu (EP 75444A).

Susbstituční varianty jsou ty, ve kterých alespoň jeden zbytek na obr.l nebo 2 sekvencí byl odstraněn a na jeho místo inzertován odlišný zbytek. Takové substituce jsou obecně provedeny v souladu s následující tabulkou 1, jestliže je žádoucí jemně modulovat charakteristiky sialyltransferásy.

Tabulka 1

Původní zbytek příklady substituce

Ala

Arg

Asn

Asp

Cys ser lys gin, his glu ser

-15Tabulka 1 (pokračování)

Gin	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn, gin
Ile	leu, val
Leu	ile, val
Lys	arg,gln,gl
Met	leu, ile
Phe	met, leu,
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp, phe
Val	ile, leu

Podstatné změny ve'funkci nebo imunologické identitě jsou provedeny selekčními substitucemi, které jsou méně konzervativní než ty v tabulce l,tj. výběrem zbytků, které se liší významněji ve svých účincích na zachování a/struktury polypeptidového řetězce v oblasti substituce, například jako listová nebo helikální konformace, b/ náboj nebo hydrofobiěnost molekuly v cílovém místě, nebo c/ velikosti postranního řetězce. Substituce, které jsou obecně pokládány za produkující neejvětší změny ve vlastnostech sialyltransferás budou ty, ve kterých a/hydrofilní zbytek např.seryl nebo threonyl, jenahrazen /nebo u/ hydrofobním zbytkem, např. leucylem, isoleucylem, fenylalanylem, valylem nebo alanylem, b/ cystein nebo prolin je nahrazen /nebo u/ jakýmkoliv jiným zbytkem, c/ zbytek, mající elektropozitivní vedlejší řetězec, např. lysí, arginyl, nebo histidyl, je nahrazen /nebo u/ elektronegativ ním zbytkem, např. glutamylem nebo aspartylem, nebo d/ zbtyek, mající velký postranní řetězec, např. fenylala-17nin, jo nahrazen /nebo u/ zbytkem nemajícím postranní řetězec, např. glycinem.

Hlavní třídu substitučních nebo delečních variant tvoří ty, kteréjzahrnu jí transmembránově a/nebo cytoplasmickě regiony sialyltransferás. Cytoolasmická doména sialyltransferásy je sekvence aminokyselinových zbytků, které začínají u startových kodonů uvedených na obr. 1 a 2 a pokračujících po přibližně dalších 11 zbytků. V krysích a vepřových zbytcích 10-28 a 12 až 27, se předpokládá, že slouží jako stop transfer sekvence.Konformační ohyby zavedené u Pha-Val-Arg-Asn a Pro-· let-Arg-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys v krysí, a vepřové aelektropozitivní charakter těchto zbytků působí, spolu s dále popsaným transmembránovým regionem, brání transferu sialyltransferásy buněčnou membránou.

Transmembránový region sialyltransferásy je umístěn ve vepřové sekvenci při asi 12-27 (kde Ala je +1 jak je uvedeno na obr.2) a v krysí sekvenci při analogické lokaci. TEnto region je vysoce hydrofobní doména, která má vhodnou velikost pro k překlenutí lipidové dvojvrstvy celulární membrány. Předpokládá se pro funkci v souladu s cytoplasmickými doménami zakotvení sialyltransferásy v golgiho nebo endoplasmatickém ratikulu.

Delece nebo substituce buč některé nebo obou cytoplasmatických domén budou usnadňovat získání rekombinantní sialyltransfásy redukcí její celulární nebo embránové lipidové afinity a zlepšení její rozpustnosti ve vodě takže nebude nutné vyžadovat detergenty pro udržení sialyltransferásy ve vodném roztoku./Viz např. US petent č.5032519, po pisující produkci rozpustné B-galaktosid</ 2, G-sialyltransferásy, který je zde specificky zahrnut jako odkaz/. De-18lece cytoplasmatické domény samotné, při zachování transmembránové sekvence, bude produkovat sialyltransferásu, která by mohla být solubilizována s detergentam. Cytoplasmatická doména deletovaná v sialyltransferáse bude pravdapo-* bobnaji inzartována do membrán, čímž usnadní cílení své enzymatické aktivity. Výhodně cytoplasmatické nebo transmambrá nové domény jsou deletovány, spíše než substituovány /například aminokyseliny 1-33 v krysí o< 2,3-1’ sialyltransferáse pro stop transfer sekvenci k produkci rozpustné sialyltransf erásy/ .

Cytoplasmaticky a/nebo transmembránově /C-T/ deletovaná nebo substituovaná sialyltransferása může být syntetizována přímo v rekombinantní buněčné kultuře nebo jako fúze se signální sekvencí, výhodně host-homologním signálem. například v konstrukci prokarvotického expresního vektoru C-T domény jsou-deletovány ve prospěch bakteriální alkalické fosfatásy, lpp nebo teplotně stabilních enterotcxin II lídrů a u kvasinek jsou domény nahrazeny kvasinkovou invertásou, alfa faktorem nebo lídry kyselé fosfatássy V savčí buněčné expresi C-T domény jsou nahrazeny savčím buněčným virovým sekrečním lídrem, například herpes simplex gD signálem. Jestliže je sekreční lídr rozpoznán hostitelem, je hostitelova signální pepticása schopna štěpit fúzi lídr polypeptidu fúzovaného na jeho C-konec k C-T deletované sialyltransferáse. Výhodou C-T deletované sialyltransf erásy je, že je schopna být sekretována do kultivačního media. Tato varianta je ve vodě rozpustná a nemá patrnou aktivitu pro buněčné membránové lipidy, což významně zjednodušuje její získání z rekombinantní buněčné kultury.

Přídavek detergentu, jako je může být použit pro solubilizaci, šení biologické aktivity proteinů, novou kotvící sekvenci. Například preferovaným detergentem a Tween, jakož i jiné detergenty mohou bvt neionogenní detergent, stabilizaci a/nebo zvýkteré obsahují membráje kyselina deoxycholová NP-40 a Triton X-100, použity. Vuběr detergentu ja prováděn odborníkem podle jednotlivých podmínek okolí a charakteru peptidu/u/.

—,τ

Substituční nabo dalační mutatenesc sa použije pro eliminování N- nebo O-připojenýoh míst. Alternativně je neglykosylovaná sialyltransferása produkována v rekombinantní prokaryotické buněčné kultura. Dalece cystainu nabo jiných labilních zbytků může být také žádoucí, například při zvýšení oxidační stability sialyltransferásy. Dalece nebo substituce potenciálních míst proteolýzy, např. dibázických zbytků jako je ArgArg, se provede dalecí jednoho z bazických zbytků nebo náhradou jednoho glutaminyl nebo histidyl zbytky.

Inzerční aminokyselinové sekvenční varianty sialyltransf arásy jsou ty, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků zavedeno do předem stanoveného místa v cílové sialyltransferáse. Nejobvykleji jsou inzerční varianty fúze heterologních proteinů nebo polypeptidů I: amano nebo karboxyl konci sialyltransferása.

DNA kódující sialyltransferásu sa získá z jiných zdrojů než krysích nebo vepřových a/ získáním cDNA knihovny z různých tkání jako jsou játra hebo submaxilární žlázy jednotlivého živočicha, b/ provedením hybridizační analýzy se značenou DNA, kódující konzervovanou oblast homologie sia¹· lyltransferásy nebo jejích fragmentů /obvykle větších než 30 bp/ za účelem detekce klonů v cDNA knihovně, obsahujících homologní sekvence a c/ analýzou klonů restrikční enzymovou analýzou a sekvenováním nukleové kyseliny pro identifikaci úplné délky klonů. Jestliže úplná délka klonu není v knihovně přítomna, potom mohou být vhodné fragmenty získány z různých klonů a ligovány na restrikční místa,jak je obvyklé u klonů pro sestavení úplné délky klonu.

V podstatě prostý nebo v podstatě čistý, je-li takovy výraz použit k popisu stavu sialyltransferásy produkované podle vynálezu znamená prostý proteinu nebo jiných materiálů normálně spojených se sialyltransferásou v jejím přirozeně sc vyskytujícím in vivo fyziologickém prostředí jako například je-li sialyltransferása získána z krve a/nebo tkání extrakcí nebo čištěním. Sialyltransferása produkovaná metodou podle předloženého vynálezu byla větší než nebo rovna 95% sialyltransferáse podle hmotnosti celkového proteinu; tvořená jediným nasyceným pruhem/u vybar vení Coomasie blue/ při polyakrylamidové gelové elektrofcréze a měla specifickou aktivitu alespoň asi 500 nmol/mg proteinu/min.

Výrazy podstatná podobnost nebo podstatná identita jak jsou zda použity označují charakteristiku polypeptidové sekvence nebo nukleokyselinová sekvence, kde polypeptidová sekvence má alespoň 70% sekvenční identitu ve srovnání s referenční sekvencí a nukleokyselinová sekvence má alespoň 80% sekvenční identitu ve srovnání s referenční sekvencí. Procenta sekvenční identity jsou vypočtena vyloučením malých delecí nebo adicí, které celkem činí méně než 35 procent referenční sekvence. REferenční sekvence může být část větší sekvence, jako jsou ty, které jsou uvedeny na obr.l a 2; nicméně je referenční sekvence alespoň 18 nukleotidů dlouhá v případě polynukleotidů a alespoň 6 aminokyselinových zbytků dlouhá v případě polypeptidu.

Obecně se používají prokaryoty pro klonování DUA sekvencí v konstrukci vektorů vhodných pro použití ve vynálezu.Například E.coli K12 kmen /ATCC č. 31446/ je zvláště vhodný. Jiné mikrobiální kmeny, které mohou být použity zahrnují E.coli Q a E.coli X1776 /ATCC č. 31537/. Tyto příklady jsou spíše ilustrativní než omezující.

cans a různé druhy pseudomonas mohou být použity.

Obecně se s těmito hostiteli používají plasmidové vektory, obsahující promotory a kontrolní sekvence, ktreré jsou odvozeny od druhů, kompatibilních s hostitelskou

rové sekvence, které jsou schopny poskytnou fenotypovou

typicky transformován za použití pBR322, olasmidu odvozené ho od E.coli druhů (Bolivar a kol., Gene 2, 95/1977/). pBR322 obsahuje geny pro ampicilinovou a tstracyklinovou rezistenci a tak poskytuje snadné prostředky pro identi-

obvykle používané v konstrukci rekombinantní DNA.

Promotory vhodné pro použití s prokaryotickými hostiteli ilustrativně zahrnují β-laktamásu a laktosové promotorové systémy /Chang a kol., Nátuře 275, 615/1975/ a Goeddel a kol., Kature 281, 544/1979//, alkalickou fosfatásu, tryptofan /tro/ oromotový systém /Goeddel D., Nucleic Acids Res.8, 4057/1980// a hybridové promotory jako je tac promotér /de Boer H., PNAS/USA/ 80, 21-25/1983//. Nicméně jsu také vhodné jiné funkční bakteriální promotory. Jejich nukleotidové sekvence jsou obecně známé, čímž je usnadněno po odborníky v oboru tyto ligovat k DNA kódující sialyltransferásu /Siebenlist a kol., Cell 2/1980// za použití linkerů nebo adaptorů k doplnění jakýchkoliv z požadovaných restrikčních míst. Promotory pro použití v bakteriálních systémech také budou obsahovat Shine-Dalgarnovu (S.D.) sekvenci operabilně připojenou k DNA kódující sialyltransf erásu.

používanými eukaryotními mikroorganismy, i když jsou běsně dostupné i jiné kmeny. Pro expresi v Saocharomycos

netics 85, 12/1977//. Přítomnost trpí loze jako charakte-

přítemnosti tryptofanu.

Vhodné promotující sekvence pro použití s kvasinkovými hostiteli zahrnují -3-fosf onoglyoerát man a kol., J.Biol.Chem. 255, 2073/1920// kinásu /Hitzenebo jiné glykolytické enzymy /Hess a kol., J.Adv.Enzyme Reg.7, 149 /1958/ a Holland, Biochemistry 17, 4900/1978//, jako je anolása, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenása, hexokinása, pyruvát dakarboxylása, fosfofruktokinása, glukosa-Gfosfát isomerása, 3-fosfoglycerát mutása, pyruvát kinása, triosefosfát isomerása, fosfoglukosa isomerása a glukokinásy.

Jiné kvasinkové promotory, které jsou redukovatelnými promotory, majícími další výhodu transkripce řízené kontrolované růstovými podmínkami, jsou promotorové regiony pro alkohol dehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatásu, degradativní enzymy spojené s metabolismem dusíku, metallothionein, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenása a enzymy odpovědné za využití maltosy a galaktosy. Vhodné vektory a promotory pro použití v kvasinkové expresi jsou dále popsány v práci R.Hitzemana a kol., evropská patentová publikace č. 73557Ά. S kvasinkovými promotory jsou také výhodně používány kvasinkové enhancery.

-23Kontrolní oblast/region/' označuje specifické sekvence na 5'a 3' koncích eukaryotických genu, které mohou být zahrnuty v kontrola buč transkripce nebo translace. Pravděpodobně všechny eukaryotické geny mají AT-bohatou oblast umístěnou přibližně ve 25 až 30 bázích proti směru exprese genu, kde začíná transkripce. Jiná sekvence nalezená 70 až 80 bází proti směru od startu transkripce mnoha genů je CXAAT oblast, kde X může být jakýkoliv nukleotid. Na 3' konci většiny eukaryotických genů je AATAAA sekvence, která může být signálem pro adici póly A prodloužení ke 3'konci transkribované mRNA.

Preferované promotory kontrolující transkripci z vektorů v savčích hostitelských buňkách mohou být získány z různých zdrojů, například genomů virů jako je: polyoma, Simian Virus 40/SV40/, adenovirus, retroviry, hepatitis-β virus a nejvýhodněji cytomegalovirus, nebo z heterologních savčích promotorů, např. beta aktin promotor, časné a pozdní promotory SV40 viru jsou obvykle získány jako SV40 restrikční fragment, který také obsahuje SV40 virový zdroj replikace /Fiers a kol., Nátuře 273, 112 //1578//. Bezprostřední časný promotor lidského cytomegaloviru je obvykle získán jako Hindlll Ξ restrikční fragment /Greenaway P.J. a kol., GEne 18, 355-360/1982//. Samozřejmě vhodné jsou zde také promotory z hostitelské buňky nebo odvozených druhů.

Transkripce DNA kódující enkefalinásu vyššími eukaryoty je zvýšena inzertováním zesilovačové sekvence do vektoru. Zesilovače jsou cis-působící prvky DNA, obvykle asi 10 až 300 bp, které působí na promotor pro zvýšení jeho transkripce. Zesilovače jsou relativní orientace a poziční závislost byla nalezena na 5'/Laimins L. a kol., PNAS 78, 993/1981// a 3'/Lusky M.L. a kol.. Mol.Cell Bio. 3, 1108/1983// ke transkripční jednotce, v intronu /Banerji J.L. a kol..,

CE11 33, 729/1983// jakož i v kódující sekvenci samotné /Osborne T.F. a kol., Mol.Cell Bio. 4, 1293/1984//.

-23MNoho zesilovacích sekvencí je nyní znáno ze savčích

I genů /globin, elastása, albumin, alfa-fetoorctein a i4nzulin/. Typicky však může být použit zesilovač z eukaryotické buňky viru. Příklady zahrnují SV40 zesilovač na pozdní straně replikačního počástku /bp 100270/zesilovač časného promotoru cytomegaloviru, polyoma zesilovač na pozdní straně replikačního počátku a adenovirové zesilovače.

Expresní vektory použité v eukaryotických hostitelských buňkách /kvasinky, houbové, hmyzí, rostlinné, živočišné, lidské nebo jaderné buňky z jiných multibuněčných organismů/ budou také obsahovat sekvence nezbytné pro terminaci transkripce, která může ovlivnit mRNA expresi Tyto regiony jsou transkribovány jako oolyadenylované segmenty v netranslatovaném podílu mRNA kódující sialyltransferásu. 3' natranslatova-né regiony také zahrnují transkripční terminační místa.

EXpresní vektory mohou obsahovat selekční gen, také nazývaný selektující markér. Příklady vhodných selektujících markérů pro savčí buňky jsou dihydrofolát reduktása/DHFR/, ornithin dekarboxylása, biochemický markér násobné lékové rezistence, adenosin deaminasa, asparagin synthetasa, glutamin synthetasa, thymidin kinasa nebo neomycin. Jestliže jsou selektující markéry úspěšně transferovány do savčí hostitelské buňky, transformovaná savčí hostitelská buňka může přežít, je-li umístěna pod selektivním tlakem. Existují dvě v širokém rozsahu používané rozdílné kategorie selektivních režimů. První kategorie je založena na buněčném metabolismu a použití mutantní buněčné linie, která postrádá schopnost růst nezávisle na doplněném mediu. Dvěma příklady jsou CHO DHFR-buňky a myší LTK-buŇky. Tyto buňky postrádají schopnost růst bez přídavku takových živin jako ja thymidin nebo hypoxanthin. Protože tyto buňky postrádal určité geny nezbytné pro kompletní dráhu nukleotidové sek vence, nemohou tyto přežít bez chybějící dráhy nukleotidové sekvence, jsou poskytnuty v doplněnén mediu. Alternativní k doplňku media je zavedení intaktního DHFR nebo Til genu do buněk, postrádajících příslušné geny, což mění jejich růstovové požadavky. Jednotlivé buňky, které nejsou transformovány DHFR nebo TX genem nebudou schopny přežití v nedoplněném mediu.

Druhou kategorií je dominantní selekce, která se týká selekčního schéma použitého v jakémkoliv buněčném typu a nevyžaduje použití mutantní buněčné linie. Tato schémata typicky používají léčivo k zabránění růstu hostitelské buňky. Tyto buňky, které mají nový gen by mohly exorimovat protein transportující léčivovou rezistenci a moly by přežít selekci. Příklady takové' dominantní selekce^!použív léčiva neomycin /Southern P. a Berg P., J.řlolec.

Appl. Genet, 1, 327 /1982//, kyselinu mykofenolovou /Mulligan R,C. a Berg.P., Science 209, 1422 /1980// nebo hygrcmycin /Sugden B. a kol., ílol .Cell .Eiol. 5, 410-413/1985//.

Tři výše uvedené příklady bakteriální geny pod eukaryotickou kontrolou k transportu rezistence ke vhodnému léčivu G413 nebo neomycinu/genticin/, xgpt /kyselina mykofenolová/ nebo hygromycinu.

Amplifikace označuje zvýšení nebo replikaci izolované oblasti v buněčné chromosomální DNA. Amplifikace se dosáhne za použití selekčního činidla např. methotrexátu /MTX/, které inaktivuje DHFR. Amplifikace nebo akumulace násobných kopií DHFR genu vede k větším množstvím produkovaného DHFR v přítomnosti větších množství HTX. Amplifikaění tlak se aplikuje bez ohledu na přítomnost endogenního DHFR, přídavkem i větších množství MTX do media. Amplifi-. -25*· kace požadovaného genu může být dosaženo kotransíekcí savčí hostitelská buňky s plasnidem, majícím DUA kódující požadovaný protein a DHFR nebo amplifikace genu kointegrací je také označována jako koamplifikace. Buňka vyžaduje více DHFR a tento požadavek se splněn replikací selekčního genu, při selekci pouze buněk, které mohou růst za přítomnosti i větší TZ koncentrace. Pokud byl gen, kódující požadovaný heterologní protein kointegrován se selekčním genem, replikace tohoto genu poskytne často zvýšení replikace genu, kódujícího požadovaný protein. Výsled kem je, že se zvýší kopie genu,tj. amolif ikcwaný gen, kódující požadovaný heterologní protein exprimuje více požadovaného heterologního proteinu.

Výhodné hostitelské buňky pro expresi vektorů podle tohoto vynálezu kódujících sialyltransferásu ve vyšších cukaryotách zahrnují: opičí ledvinovou CVl linii transfor movanou 3V40 /COS-7, ATCC CRL 1651/, lidskou emryonickou ledvinovou linii /293/ /Graham F.L a kol., J.Gen.Virol. 36,59/1977/, buňky ledvin mláaat křečků /BHK, ATCC CCL 10/, buňky vaječníků čínských křečků-DII?R/CHO, URlaub a Chasin, PIIAS/U3A/ 77, 4216/1930//, myší sertoli buňky /TII4, ílather, J.P., Biol.Reprod.23, 243-251/1980//, buňky opičích ledvin /CVl ATCC CCL 70/, buňky afrických zelených opic /VERO76, ATCC CRL 1587/, buňky karcinomu lidského cervixu /HELA, ATCC CCL 2/, buňky psích ledvin /I1DCK, ATCC CCL 34/, jaterní buňky krys buffalo /BRL 3A, ATCC CRL 1442/, buňky lidských plic /V7138, ATCC CCL 75/, buňky lidských játar /Hep G2, HB 8065/, myší nádorové buňky mléčné žlázy /MMT 0S0562, ATCC CCL51/ a TRI buňky /Hather J.P. a kol.,

Annals N.Y. Acad.Sci. 333, 44-45/1982//, bakulovirus buňky.

Transformace znamená zavedení DNA do organismu takže

DUA je replikovatelná, buň jako extrachromosomální ele-27ment nebo chromosomální integrací. Pokud není uvedeno jinak je metodou zde použitou pro transformaci hostitelské buňky metoda GRahama F. a Van der Eba A., Virology 52, 456457 //1273//. Nicméně mohou také být použity jiné metody pro zavedení DNA do buněk jako je nukleární injekce nebo protoplastová fúze. Jestliže orokaryotické buňky, které obsahují podstatné buněčná stěnové konstrukce jsou použity, je preferovanou metodou transfekce vápníkové ošetření za použití chloridu vápenatého jak je popsáno Cohenem F.N. a tol., Proč.Nati.Acad.Sci. USA, 62, 2110/1972/.

Pro analýzu k potvrzení správných sekvencí v konstruovaných plasmidech se použijí ligační směsi pro transformaci E.coli K12 kmene 294/ATCC 31446/ a úspěšné transformanty se selektují ampicilinovou nebo tetracyklinovou rezistencí, je-li to vhodné. Plasmidy z transformantů se připraví, analyzují restrikcí a/nebo sekvenují metodou íiessinga a kol., Nuc^eic Acids Res. 2, 309/1981/ nebo metodou podle ilaxama a kol., Ilethods in Enzymology 65,

442 /1980/.

Hostitelské buňky mohou být transformovány expresními vektory podle vynálezu a kultivovány v obvyklém živném mediu modifikovaném jak je to vhodné pro indukci promotorů, selekčních transformantů nebo amplifikovaných genů. Kultivační podmínky jako je teplota, pH a podobně byly dříve použity u hostitelských buněk vybraných pro expresi a budou odborníkům v oboru zřejmé.

Transfekcí je označen příjem expresního vektoru hostitelskou bu&ou ař už je nebo není jakákoliv kódující sekvence ve skutečnosti exprimována. Odborníkům v oboru jsou známy mnohé metody transfekce, například CaPO^ a elektroporace. Útěšná transfekce se obecně rozpozná, jestliže se v hostitelské buňce objeví jakýkoliv náznak zapracování tohoto vektoru.

Za účelem usnadnění pochopení následujících příkladů budou dále popsány některé často se vyskytující metody a/nebo výrazy.

Plasmidy jsou označovány malým p před a/nebo po velkých písmenech a/nebo číslech. Výchozí plasmidy zda jsou bud komerčně dostupné, veřejně dostupné na neomezené bázi nebo mohou být konstruovány z dostupných plasmidů podle publikovaných postupů. Navíc plasmidy ekvivalentní těmto jsou v oboru známy a budou zřejmé odborníkům v oboru.

Štěpení” DMA označuje katalytické štěpení DMA restrikčními enzymy, které působí pouze na některých sekvencích DMA. Používané restrikční enzymy jsou známé a komerčně dostupné a jejich reakční podmínky, kofaktory a jiné požadavky byly použity jak je známo odborníkům. Pro analytické účely se typicky použije 1 ^ug plasmidů nebo DMA fragmentu s asi 2 jednotkami enzymu v asi 20 ^ul pufrového roztoku.

Pro účely izolace DMA fragmentů pro konstrukci plasmidů se typicky 5 až 10 ^ug DMA štěpí 20 až 250 jednotkami enzymu ve větším objemu. Vhodné pufry a množství substrátu pro jednotlivé restrikční enzymy jsou specifikovány výrobcem. Inkubační doby asi 1 hodina při 37 °C jsou obvykle použity, ale mohou se měnit podle dodavatelových instrukcí. Po štěpení se reakce elektroforezuje přímo na polyakrylamidový gel pro izolaci požadovaného fragmentu.

Separace štěpených fragmentů se provede podle velikosti za použití 8 procent polyakrylamidového gelu jak je popsáno v práci Goeddela D. a kol., Mucleic Acids Res., 8, 4057/1980/.

Defosforylace označuje odstranění terminálních 5'fosfátů zpracováním s bakteriální alkalickou fosfar.ásou /BA?/. Tento postup brání dva rsstricšnč štěpené konce DNA fragmentu před cirkularizací nebo tvorbou uzavřené smyčky, které by mohla zahrnout inzerci jiného DN?. fragmentu na restrikční místo. Postupy a činidla pro defosforyláci jsou obvyklé /Maniatis T. a kol., ilolecular Cloning str.

133 až 134/1S32//. Reakce za použití RAP se provádějí v 50 mM Iris při 52 C pro potlačení aktivity jakáchkcliv exonukleás, které mohou být přítomny v enzymových přípravcích. Reakce se provádí 1 h. Po reakci se DNA fragment čistí na g· lu.

Oligonukleotidy označují bua jednořetězccvé polydsoxynukleotidy nebo dva komplementární polydeoxynukleotidové řetězce, které mohou být chemicky syntetizovány. Takové syntetické oligonukleotidy nemají 5'fosfát a nemohou tak být ligovány k jinému oligonukleotiéu bez přídavku fosfátu s AT? za přítomnosti kinásy. Syntetický oligonuklectid bude ligovat k fragmentu, který nebyl defosforylován.

Ligace označuje proces tvorby fosfodiesterových vazeb mezi dvěma fragmenty dvoujřetězcové nukleové kyseliny /Maniatis T. a kol., Id., str.146/. Pokud není uvedeno jinak může být ligace provedena za použití známých pufrů a podmínek s 10 jednotkami T4 DNA ligasy /ligasa/ na 0,5^ug přibližně ekvimolárních množství DNA fragmentů, které se ligu jí. Konstrukce vhodných vektorů, obsahujících požadované kódující a kontrolní sekvence využívá standardních ligačních technik. Izolované plasmidy nebo DNA fragmenty se štěpí, spojují a religují ve formě potřebné pro vytvoření požadovaného plasmidu.

Doplnění nebo tupé zakončení označuje postupy, kteými se jednořetězcový konec v kohezivním konci restrikčním enzymem štěpené nukleové kyseliny převede na dvojitý řetězec. Toto eliminuje kohezivní konec a vytváří tupý konec. Tento proces je variabilním řešením pro provedení restrikč-30ního řezu konce.

ktarý musí být kohezivní 3 konci vytvořenými pouze jedním nebo málo jinými restrikčními enzymy v konci kompatibilním s jakoukoliv tupě-řezající restrikční endonukleásou nebo jinak doplněnými kohesivními konci. Typicky se tupé zakončení provede inkubací 2-15/Ug cílové DNA v 10 mil MgCL_?, 1 mil dithiothreitolu, 50 mí·! NaCl, mi! Tris /pH 7,5/ pufru pri asi 37 C za přítomnosti 8 jednotek Nlenowova fragmentu DUA polymerásy I a 250 ^ug každého ze čtyř deoxynukleosid trifosfátu. Inkubace se obecně zakončí po 30 minutách fenolovou a chloroformovou extrakcí a srážením ethenolem.

Polynukleotidy odpovídají nebo komplementární s částmi popsaných sekvencí mohou být použity jako hybridizační sondy pro identifikaci a/nebo izolaci zárodečných genů. Takové polynukleotidy mohou být také· použity jako hybridizační sondy k prohledání cDNA a genomových knihoven pro izolaci cDHA a genů, kódujících polypeptidy, které jsou strukturně a/nebo vývojově vztaženy k sialyltransf erásovým sekvencím podle vynálezu. Alternativně mohou takové polynukleotidy sloužit jako priméry pro amplifikaci zárodečných genových sekvencí polymerásovou řetězovou reakcí /PCR/.

Hybridizační sondy použité pro identiofikaci a izolaci dalších druhů sialyltransferásové DNA jsou formovány na bázi nukleotidu a dedukované aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obr. 1 a 2. Hybridizační sondy, které jsou typicky značeny inkorporací radioizotopu, mohou obsahovat jeden nebo více poolů degenerovaných oligonukleotidů, které kódují celý nebo část konzervovaného regionu, odpovídajícího 55 zbytkovému segmentu od aminokyselinového zbytku 134 do aminokyselinového zbytku 189 ve vepřové 2,3-0 sialyltransferáse /obr.l/. Zejména je heptapeptidový motiv -Asp-Val-Gly-Sar-Lys -Thr-Thr- je vysoce konzervován a hybridizační sondy, obsahující degenerované oligonukleotidy, kódující tento motiv, nebo varianty tohoto motivu, kde jsou jedna nebo dvě aminokyseliny modifikovány tak, že alespoň 4 nebo 5 amino-31kyselin heptaoeotidu sa tidové sondy, kódující záchov?. Degenerované oligonukleoy jedni nebo dvojité arniko^- kyselinová substituce heotapeptidováho motivu jsou také vhodné pro screening příbuzných druhů sialyltransferásových cDNA. Navíc k degenerování oligonukleotidů, fragmenty klonovaných polynukleotidů, jako jsou ty, která jsou znázorněny na obr.l a 2, mohou být použity jako sondy, je vy hodné, že tyto sondy zahrnují heptapeptidový motiv a tam, kde je to žádoucí, segment konzervovaného 55 aminokyselinovéh zbytku popsaný výše.

Genomové nebo cDNA klony kódující sialyltransferásy mohou být izolovány z klenových knihoven za použití hybridizačních sond tvarovaných na bázi sialyltransferásových nukleotidových sekvencí jako jsou ty, které jsou uvedeny na obr. 1 a 2. Tam, kde je požadován cDNA klon jsou preferovány klonové knihovny, obsahující cDNA odvozené z buňky, exprimující sialyltransferásu/y/.

Alternativně, syntetické polynukleotidové sekvence,odpovídající všem nebfe. části sekvencí uvedených na obr.l a 2 nohou být konstruovány chemickou syntézou oligonukleotidů. Navíc polymerásová řetězová reakce /PCN/ za použití primerů na bázi sekvenčních dat popsaných na obr.l a 2 může být použita pro amplifikaci DNA fragmentů z genomové DNA, mRNA poolů nebo cDNA klonových knihoven. USA patenty 4683195 a 4683202 popisují PCN metodu. Navíc, PCR metody používajíc jeden primer na bázi sekvenčních dat popsaných na obr. 1 a 2 a druhý primer, který není založen na těchto sekvenčních datech, mohou být použity. Například může být použit druhý primer, který je homologní k nebo komplementární k polyadenylačnímu segmentu.

HH'

Pro odborníky v oboru bude zřejmé, že do polynukleotidů

-32podl-e vynálezu mohou být zabudovány nukleotidové substituce, delece a adice. Nicméně takové nukleotidové substi tuce, delece a adice by podstatně neměly narušit schopnost polynukleotidu hybridizovat k jedné z polynukleotidovýca sekvencí uvedených na obr. 1 a 2 za hybrigdizačnich podmínek, které jsou dostatečně silně pro dosažení specifické

I hybqdizace.

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 a 2 usnadní odborníkům v oboru produkovat polypeptidy, odpovídající všem nebo části kódovaných polypeptidových sekvencí;Takové polypeptidy mohou byt produkovány y prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách expresí polynukleotidu, kódujících plnou délfci sialyltransferásy/ás/ nebo jejich fragmentů a analogů. Alternativně mohou být takové polypeptidy syntetizovány chemickými metodami nebo produkovány in vitro translačními systémy za použití polynukleotidového templátu k přímé translaci.

Metody pro expresi heterologních proteinů v rekombinantních hostitelích, chemické syntézy polypeptidů a in vitro translace jsou dobře známé v oboru a jsou blíže popsány v práci Maniatise a kol., Molecular Clonong: A Laboratory Manual /1983/ 2.vyd., Cold Spring Harbor, N.Y. a Bergera.a Ximmela Methods in Enzymology, vol.152, Guide to Molecular Cloning Technigues /1987/, Academie Press, Inc.San Diego, CA.

Fragmenty sialyltransferás mohou být připraveny odborníky v oboru. Preferovaná zakončení fragmentů nebo analogů se objevují blízko vazeb strukturních a/nebo funkčních domén, například blízko enzymového aktivníhom místa. Fragmenty, obsahující v podstatě jednu nebo více funkčních domén mohou být fúzovány k heterologním polypeptidovýev sekvencím, kde výsledný fúzní protein vykazuje funkční vlastnost/ijž, jako je enzymatická aktivita, udělená fragmentem. Alternativně delece polypeptidů, kde byla jedna nebo více funkčních domén vypuštěno, vykazuje ztrátu vlastnosti normálně

33udílané chybějícím fragmentem.

eukaryotIckého genu je jedním z o generování velkých množství klonovaných genů./Summers M. a

Exprese bakulovirověho mnoha účinných prostředků pr funkčně aktivního proteinu z

Luckow V. /1938/ Eio/technology 5: 47, zahrnuto jako odkaz/. Sialyltransferáscvč polypeptidy podle vynálezu mohou být produkovány z klonovaných polynukleotidů expresí v bakulovirovém expresním systému /Invitrogen Corporation, SAN Diego,CA/.

Typická sialyltransferása a její rekombinantní expresní produkt se získá podle následujícíhoprotokolu:

1. Vepřová jaterní sialyltransferása se čistí do zjevné homogenity.

2. Stanoví se N-terminální aminokyselinová sekvence vepřové sialyltransferásy.

3. Oligonukleotidové sondy, odpovídající 18 aminokyselinám blízkým NH₂ terminální sekvenci se chemicky syntetizují.

4. cDNA knihovny byly konstruovány v gtlO za použití a/ náhodně primované polyA+ obohacené mRNA z vepřových submaxilárních žláz, b/ oligo di¹ primované polyA+ obohacené mRNA z krysích jater a c/ oligo dT primované polyA+ obohacené mRNA z krysího mozku.

5. Pool radioaktivně značených deoxyoligonukleotidů komplementárních ke kodonům pro aminokyselinové sekvence sialyltransferás byly použity, jak je dále popsáno, jako je:

a/ 5'ACC CTG AAG CTG CGC ACC CTG CTG GTG CTG TTC ATC TTC CTG ACC TCC TTC TTC TT 3 * b/ 5'GAC GTC GGG AGC AAG ACC ACC 3'

-’FLláhodnš primovaná vepřová stflimaxlliární knihovna byla prohledána za použití chemicky syntetizovaných oligonuk lootidových dlouhvch a krátkých sond značených za použití polynukleotidove kinásy a ‘ρ-ΑΤΡ. Zdvojeno pozitivní plaky byly čištěny a inzerty sekvencvány.

•3?

P značený inzert byl použit k rescreenování oligo d? primovaných vepřových submaxiliárních knihoven.

8, Kompletní čtecí rámeček z vepřové sialyltransferásy byl získán ze dvou přesahujících klonů. cDNA z krysích jater a mozku obsahuje konzervovaný region homologie jak je stanoveno DNA sekvenčních klonů, které byly získány.

Plná délka cDNA kódující vepřovou sialyltransferásu byla konstruována ze dvou přesahujícíúklonů v olasmidu a sekvenována.Je třeba ocenit, že popis DNA sekvencí na obr. 1 a 2 umožňuje připravit sondy z konzj vcvaného regionu homologie sialyltransfarásové cDNA, čímž se zjednoduší a zvýší účinnost sondování cDNA nebo genomických knihoven z těchto nebo jiných druhů jakož ijiných tkání z těchto nebo jiných druhů, což umožní obejit se bez čištění sialyltransferásy, sekvenování a přípravu soudových poolů.

10. Plná délka CDNA kódující vepřovou a krysí sialyltransferásu byly pakspojeny v expresním vehikulu, které byly použito k transformování vhodná hostitelské buňky, která kultivovány pro produkci požadované sialyltransferásy.

11. Biologicky aktivní zralá sialyltransferása produkovaná podle uvedeného postupu může mít al^ttrnativní formy jak je uvedeno n obr.4 a 5,které vznikají ve dvou provedeních se 45 kDa a 48 kDA molekulovou hmotností.

Polynuk.l.eotidy podle vyynálezu a rekombinantně produkované sialyltransferásové polyp-eptidy a jejich fragmenty nebo varianty s nahrazenými aminokyselinami mohou být připraveny na bázi sekvenčních údajů uvedených na obr. 1,2, 3,5,7 a 8 nebo na hází sekvenčních dat získaných z nových sialyltransferásových cDNA izolovaných metodami oodle vynálezu. Produkce polynukleotidů a rekombinantně produkovaných sialyltransf erásových polypeptidů se provede m-edotami známými v oboru a popsanými Maniatisem a kol., Molecular Cloning: A Laboratory říanual, 2.vyd. /1989/, Cold Spring Harbor, N.Y. a Bergerem a Ximmelem, Methods in Enzymology, Vol.152, Guide to MOlecular Cloning YEchniques /1987/, Academie Press, lne. San Diego, CA, kteréžto práce zde jsou zahrnuty jako re^Srence.. Polvnukleotidové sekvence mohou být exprimovány v hostitelích peté, co sekvence byly operativně připojeny k /tj. umístěny tak, aby byly funkční/ expresní kontrolní sekvenci, takže se za vhodných podmínek pro transkripci tato objevuje.

Specifická hybridizace/' je zde definována jako tvorba hybridů mezi sondovým polynukleotidem /např. polynukleotid podle vynálezu, který může zahrnovat substituce, deleci a/ nebo adice/ a specifickým cílovým polynukleotidem /např. polynukleotid, mající komplementární sekvenci/, přičemž sonda výhodně hybridizuja ke specifickému cíli, takže například, může být identifikován jediný pruh na Northern blot RNA připravené z eukaryotických buněk, který obsahuje cílovou RNA a/nebo se získá jediný hlavní PCR produkt, jestliže se polynukleotidová sonda použije jako PCR primer.

V některých případech může být cílová sekvence přítomna ve více než jednom cílovém polynukleotidovém druhu /např.. jednotlivá cílová sekvence se může objevit v mnoha členech

-3«rodiny sialyltransferásovych genů nebo v alternativně střižených RNA transkribovaných z některého genu/. Je zřejmé, že optimální hybridizační podmínky se budou měnit v závislosti na složení sekvence a délce sondy a cíle, a experimentální metodě vybrané výzxumníxem. Pro volbu, vhodných hybriditačních podmínek je možno zvolit různé návody /viz. Maniatis a kol., Molecular Clonin: A Laboratory Mannal /1939/ 2. vyd., Cold Spring Harbor, N.Y. a Berger a Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Technigues /1987/, Academie Press, lne. San Diego, CA, kteréžto práce jsou zde zahrnuty jako reference.

Polynukleotidy antimediátorové -(antisense) jsou polynukleotidy, které: 1/ jsou komplementární ke všem nebo části sekvencí uvedených na obr. 1 a 2 a/nebo sekvencím získaným z nových cDNA izolovaných metodami podle vynálezu a 2/ které specificky hybridizují ke komplementární cílové sekvenci. Takové komplementární antisense polynukleotidy zahrnují nukleotidová substituce, adice, delece nebo transpozice v takovém rozsahu, pokud je ještě zachována specifická hybridizace k relevantní cílové sevenci /např. odpovídající obr. 1 nebo 2/ jako funkční vlastnost polynukleotidu. Komplementární antisense polynukleotidy obsahují rozpustné antisense RNA nebo DNA oligonukleotidy, které mohou hybridizovat specificky k jednotivým sialyltransferásovým mRNA druhům nebo k mnoha členům rodiny sialyltransferásových mRNA a zabraňují transkripci mRNA druhů a/nebo translaci kódovaných peptidů /Ching a kol., Proč.Nati.Acad.Sci,USA 876:10006-10010/1989/,

Broder a kol., Ann.Int.Med. 113:604-618/1990/, LOreau a kol.,FEBS Letters 274:53-56/1990/, Holcenberg a kol., WO91/11535, USSN 07/530165 /New human CRIPTO gene/, WO91/ 09865, NO91/04753, WO90/13641 a EP 386563, z nichž je zde každý zahrnut jako reference/. Antisense polynukleotidy

-37tak inhibují produkci kódovaných polypeptidu. 7, tohoto hlediska antisense polynukleotidy, které inhibují transkripci a/nebo translaci jedné nebo více sialyltransferás mohou ínčnit kapacitu a/nebo specifičnost buňky glykosylovat polypetidy.

Antisense polynukleotidy mohou být produkovány z heterologní expresní kazety v fcafisceKtantovtí: buňce nebo transgenní buňce, jako je 'trantgěhtíí oluriootentní hematopoietická kmenová buňka použitá pro rekonstituci celé nebo části populace hernatopoietických kmenových buněk jednotlivce. Alternativně, mohou antisense polynukleotidy obsanovat rozpustné oligonukleotidy, které jsou podávány do vnějšího prostředí, bua v kultivačním mediu in vitro nebo do oběhového systému nebo intersticiální kapaliny in vivp. Rozpustné antisense polynukleotidy přítomné -jí ve vnějším prostředí byly zjištěny jako vstupující do cytoplasmy a inhibující - translaci specifických mRNA druhů.

V některých provedeních antisense polynukleotidy obsahují methylfosfonátové skupiny, alternativně fosforothioláty nebo O-methylribonukleotidy mohou být použity a mohou být také použity chimérní oligonukleotidy /Dagle a kol., /1990/ Nucleic Acids Res. 13:4751/. Pro stéjné .aplikace mohou ahtisense oligonukleotidy obsahovat polyamidové nukleové kyseliny /Nielsen a kol., /1991/ Science 254: 1497/. Obecné metody týkající se antisense polynukleotidů vis: Antisesnse RNA and DNA/1988/, D.A. Melton vyd.,Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbos, NY/.

Antisense polynukleotidy komplementární k jedné nebo více sekvencím se používají pro inhibici translace příbuzných mRNA druhů a tím působí redukci v množství příslušného kódovaného polypeptidu. Takové antisense polynukleotidy mohou poskytnout terapeutickou funkci inhibici tvorby jedné nebo více sialyltransfarás in vivo.

-Ρΰxransge.ii živočichové nesoucí jednu nebo více integrovaných kopií sialyltransferásového transgcnu mohou být konstruováni. Sialyltransferáscvé transgeny jsou golynukleotidy, obsahující pclynukleotidovou sekvenci, která kóduje sialyltransferásový protein nebo fragment operativně připojený k funkčnímu promotoru a připojený k selektující markerové sekvenci jako je G-413 gen rezistence.

Je možné za použití genetické manipulace vyvinout transgenní modelové systémy a/nebc celé buněčné systémy obsahující sialyltransferásový transgen pro použití, naříklad, jako modelové systémy pro screening léčiv a hodnocení účinnosti léčiv. Navíc takové modelové systémy poskytují prostředek pro definování příslušné biochemie metabolismu sialyltransferásY, čímž se získá základ pro racionální sestavení léčiva a experimentální testování.

Jedni z řešení vytváření transgenních živočichů je cílení mutace k požadovanému genu homologní rekombinací v embryonická kmenová /ES/ buněčné linii in vitro s následující mikroinjskci modifikovaná ES buněčné linie do hostitelova blastocytu a následnou inkubací v pěstounovi /viz Frohman a Martin /1989/ CE11 55:145/. Alternativně může být použita technika mikroinjekce mutovaného genu nebo jeho části do buňky emrya s následující inkubací v pěstounovi. Použita mohou být různá transgenní zvířata, zejména transgenní živočichové, kteří exprimují přirozeně se vyskytující sialyltransferásový protein, nebo jeho fragment. Alternativně, transgenní živočichové nesoucí transgeny, které kódují mutačně změněný/é/ /např. mutagenizované/ sialyltransferásový/éú protein/y/, které mají nebo nemají enzymatickou aktivitu, mohou být konstruováni jak je to žádoucí. Další metody pro produkci transgenních živočichů jsou známy v oboru.

_Τΰ_

Λ1tornativně může couri fa cílená mutageaese a/nabo genová konverze k .mutaci in vivo allely sialyltransf erásového genu, bu3 andofenní nebo transfekfované, jako je mutovaná allela kočující variantu sialyltransferásy.

Alternativně muže být použita homologní rekombinace pro inzertování sialyltra.nsferásové sekvence do hostitelova genomuna specifickém místě, například na lokusu odpoví dající hostitelovy sialyltransferásy. V jednom tvou homologní rekombinace se nahradí ječná nebo více hostitelových sekvencí, například hostitelova sialyltransferásová allela se /nebo její část/ nahradí mutovanou sialyltransf erásovou sekvencí /nebo její částí/. Navíc k takovým genovým substitučním metodán může být použita homologní rekombinace k cílovému polynukleotidu, kódujícímu sialyltransferásu /nebo její fragment/ ka specifickému místu jinému než je lokus hostitelovy sialyltransferásy. Homologní rekombinace může být použita pro produkci transganních na-humánních živočichů a/nsbo buněk, která inkorporují mutované sialyltransferásové allely. Geové cílení může být použito pro přerušení a inaktivaci jednoho nebo více endogenních sialyltransferásových genů. Tak zvaní, knock-out transgenní živočichové byly popsáni v oboru pro jiné geny /WO91/10741, Kuhn a kol. /1991/ Science 708: 707/.

Následující příklady jsou míněny spíše jako ilustrativní pro lepší osvětlení praktického provedení vynálezu a neměly by nijak vynález omezovat. Vsechy zde uváděny literární citace jsou míněny jako reference.

Příklady převedení vynálezu

kolonách 2D?-hexanolamin agnrosv. Eluční profil ze stupně prvního a třetího čištění je uveden na obr. 3 a obr.4.

Obr.3 představuje dva které byly pozorovány kolony. Tyto dva píky píky sialyl. transf erásové aktivity, v elučním profilu z první afinitní byly spojením indikovaných frakcí do poolu A a 13, tato dva pooly byly posléze shledány jako obohacené dvěma formami <^2,3-0 sialyltransčerásy o rozdílných molekulových hmotnostech.

je také přítomna ve vepřových játrech /Sadler J.E. a kol.

nitni chromatografie byly kolonové frakce analyzovány a jednotlivé frakce byly shledány obohacenými ve 43 kDa /obr.4A, frakce 4-6/ nebo 45 kDA/obr.4B, frakce 2-6/ molekulové hmotnosti ^/2,3-sialyltransferásy. Tyto dva druhy proteinu byly označeny jako forma A a forma B. Specifická aktivita pákových frakcí z obou kolon byla 8-10 jednotek/mg proteinu. Silný pás /asi 44 kDa/ viditelný ve frakci o obr. 4 sloupec A není ¢^2,3-sialyltransferása, pro tože představuje jeden z hlavních kontaminantů v obou oooůech \ a 2 oo oředchozí koloně, nrotože enzymati aktivita nebyl přítomna v koneěn fie.

stupni afinitní círonatnaraSialyltcansfarasová aktivita byla zkoušena s lakkosou a/nebo nízkomolokutámím nemrznoucím jlyknorotčinem jako substráty /Sadler J.S.a kol., j.Biol.Chem. 254, 4424-4442/1979//. Enzym b/1 čištěn x vepřových jater oodle ocosaaých metod /Sadler J.E.a kol., J.Bicl.Chem. 254, 4424-4443/1979/ a Gon radt H.S. a kel., v Sialic Acids 1988 Proceedings cf the Japanese-German Symposium on SialicAcids /Schauer a Yamakawa vyd./ str. 104-105, Verlag Wissenschaft ano Bildung, Kiel /1SG3// s některými modifikacemi. Struční - 2 kg jater se homogenizují v op-truj a cřioraví se membrány jak je popsáno /Sadler J.E. a kol., J.Eiol.Chem. 254, 4434-4443 /1979//. Membrány se extrahují třikrát oufrem /Ccnradt H.S. a kol., v Sialic A.cids 1988, Proceedings of the Japanese-German SYmoosium on Sialic Ycids /Schauer a Yamakavza vyd.,/str. 104-105, Verlag eis senschaf t and Bildung,

Kiel /1988/ a extrakt byl ponechán projít přes 1,5 1 CDP-hexanolamin agarosovou kolonu /kolona 1//15 ^umol/ml/.

?o promytí kolony 3 1 oufru E se kolona eluuje lineárním gradientem 0,05 až 1,0 H KCl /2,5 1 x 2,5 1/ v oufru B.

Frakce, obsahující *\2,3 sialyltransferásu se spojí do dvou poolů A a B, představujících hlavní část a táhnoucí se konec píku /viz obr. 3/. Pooly se dialyxzují proti pufru B a podrobí dalšímu běhu afinitní chromatografie na CDP-hexanolamin agarose /kolony ΙΙΛ a lib/. 150ml kolona se použije pro pool Ά a 30 ml kolona se ooužijr pro pool B, dva přípravky z kolony I /z celkem 4 kg jater/ se vloží na stejnou kolonu ve stupni II. 2,3-sialyltransferása se eluuje gradientem 0-2,0 mM CY? /750 ml, oool A, 150 ml pool B/. v oufru B. Frakce s aktivitou t/,2,3-sialyltransferásy se odsolí na G50 SEphadexu, ekvjřlibrují v oufru a aktivní frakce se aplikují na 1,0 ml CDP-hexanolamin agarosové koleny /část III/, které se elu.ují stupňovými gradienty

0,1 2Ž 1,0 ·<: CT? /20 Stup /viz obr. 2/. Aktivní frakc tššak z obou kolon byl 2,3 tivitč 0 až 10 jednotek/ :n , 1,0 mí kaž 3-/ v rufru A 33 soojí a secjený výadnotak oři soacifické akoroteinu.

kDa a 45 kDa sialyltransfarásové pegtidv /viz. obr. 4/ 30 štěoí na 3DS-oolyakrylamidovvch moloch /Loaaali U.X., ilature 227, .500-525/1270//, alektro-aluui.í na ?7DR .mambránu /InmobiIon íransfor, Miliocra/ a vybarví Coomasie Erilliaat Dlue /'Sigma/. Sialyltransforásové pruhy sa vyříznou a navázané oaatidy ss podrobí iílí_n-t-er-ninální • · · ' z.

aminokyselinové sekvenční, analýze Fčmanovou degradací za použití Applied líiosystorno 4 75Ά proteinového sakvenátoru.

Frakce, obohacená formami sialyltransferá foréze /PAGE/, blokují n i n á i n i m sekvanováním, nových zbytku z každá a ΠΠ₀-terminální sekvence část aminokyselin v sou biol.Cham. 254, 4424-4442/1972// a Tes Eiol.Chám. 250, 12109-12121/, že menší z větší formy proteolvtickýn štěpením tidu. Tento region byl vyhodnocen jako membránu vázající vlastnosti unikátní kDa /forma ~:J a 45 kDa /forma 3/ sy sa podrobí oclvakrylnnid-gelová elakt k PVDF membráně a analyzují

Získá sa dvacet dva aminokysaliakvanoa každého z paptidů /obr.5/.

formy .A obsahuje hydrofobní ladu s ařadoovodí Sadíara a kol., /J.

cotta a kol. /J. forma byla odvozena hydroíosního peonesoucí. detergent a pro formu A.

ro

Příklad 2

Vepřová sialyltransferásová cDUA

Póly A+ RNA byla použita jako templát pro konstrukci jednořetězcové cDUA za použití kitu dodávaného od fy Invitrogen. cDLIA slouží jako templát v polymerásové/řetezové reakci /PCR/ za použití činiel a protokolů dodaných od

Perkin Elmer Cetus. Použité specifické podmínky byly 22 ° po 1 minutu, 50 po 2 min, a 72 po 2 min pro denaturaci teplotní hybridizaci a polymerační stupeň. PCR reakce byly primovány 30bp oligonukleoiidy, odpovídajícími sekvencím lemujícím 120bp daleci na 3' konci STÍ. Produkty am pifikaění reakce byly odděleny na 2¾ agarosovém gelu. Vybarvením ethidiniumbromidam byly zjištěny dva specifické pruhy, ůišící se 120 bp, odpovídající STÍ a 3T2 klonům. Tyto pruhy byly eluovánv z gelu /Qiaex kit, Oiagen/, subklonovány do TA vektoru /Invitrogen/ a sekvenovány jako výše, pro jednoznačnou identifikaci.

RNA izolace a konstrukce cDN.A knihovny

Čerstvé eepřové submaxilární žlázy / 30 min, post mortem/ byly zmrazený a transportovány v suchém ledu-EtOH. Celková RNA byla izolována podle postupu Chomczynski-ho a Sacchi-ho /Anal.Biochem. 152, 155-159/1937// Póly A+

RNA byla čištěna oligo dT-celulosa chromatografií /Pharmacia/. Dvojřetězcová cDNA byla syntetizována reverzní transkripcí póly A+ RNA za použití náhodných hexamerů jako primerů s Pharmacia cDNA syntézním kitem a postupů doporučených výrobcem. EcoRI adaptéry byly ligovány k EcoRI štěpeného IgtlO a pakážovány in vitro /ProMega/. cDNA knihovna byla umístěna na plotnu pro sereening infekce E.coli CSOO s pakážovanou směsí.

Izolace a sskvenování cDNA klonů

Všechny postupy byly provedeny podle Maniatise a kol. /v Molecular CloningzA Eaboratory Manual, Cold Spring Barbor Laboratcry, Cold Spring Karbor, Π.Υ./1982// pokud není uvedeno jinak. 53bp oligonukleotidová sonda /5 'ACCCTGAAGCTGCGCACCCTGCTGGTGCTGTTCATCTTCCTGACCTCCTTCTT3'/, odoovídající 18 aminokyselinám v blízkosti NHj-terminální sekvence čištěného 48 kDa sialyltransferásového pepti32 ...

du /viz obr. 5/ byla na konci označena P na soecitickou scresnovrno

póry/ se promyjí v 0,2x33C, 0,1% SDS při 420 po 40 min/. Je-

rikční fragment, byla značena za použití náhodného primova-

fágových DNA byly subklonovány do pUC vektorů /Pharmacia/. Subklony byly sekvenovány za použití T7 kitu od Pharmacia. Sekvenční data byla analyzována počítačem za použití DNASTAR /DNASTAR Inc.,WI, US/.

Byly vyzkoušeny některé klonovací strategie za účelem klonování cDNA pro 2,3sialyltransferásu,, založené na informaci o aminokyselinových sekvencích uvedených na obři 5. V prvním řešení, byly připraveny primery pro polymerasovou řetězovou reakci, v pokusu generovat sondu, rozkládající se přes Nl^-terminální sekvence 48 a 45 kDa proteinových druhů za předpokladu, že spolu sousedí v intaktním enzymu. Zpětně bylo toto řešení chybné díky nepřesnostem v aminokyselinové sekvenci získané pro 45 kDa druhy /viz obr.5 a 6/. Jiné chybné řešení pro získání pozitivního klonu využívají krátké /16-20 bp/ degenerované oligonukleotidy jako sondy pro prohledávání cDNA vepřových submaxilárních žláz. Řešení, které bylo nejpřesnější bylo použití nedegenerováných 53 bp oligonukleotidových sond

-45tvarovaných ze 17 aminokyselinového regionu ΜΗ,-konce A formy 53 bp sonda byla použita k prohledání 500000 plaků Igt.10 nov;

cDUA knihovny vepřových submaxilárních slinných žláz.

Jediný 1,5 kb klon byl získán, I3T1, který měl konsensus ATG start kodo.nu /Kozák II. Cell 49, 283-292/1935/ a Kozák ii. íluc.Acids Res. 12, 357-872/1934//, otevřený čtecí rámeček kódující IIHj-terminální aminokyselinové sekvence jak formy A formy Β Ά 2,3sialyltransferásy a stop-kodon mimo rámeček. Skutečnost, že terminální aminokyselisekvence z obou forem 2,3sialyltransferásy byly přítomné v translatovaném otevřeném čtecím rámečku STÍ, což indikuje, že STÍ klon kóduje část 2,3sialyltransferásy.

2' restrikční fragment STÍ byl použit jako sonda pro získání druhého, přesahu jícího klonu, ΛεΤ2, ze stejné knihovny /obr. 5/. ΞΤ2 kompletuje otevřený čtecí rámeček pocházející z J\STl. Spolu tyto dvě cDMA kódují jediný otevřený čtecí rámeček /909-1029, viz dále/, 500 bp 5'netraslatovaný region, a 1000 bp 3'netranslatovaný region. NUkleotidová sekvence jakož i translatovaná aminokyselinová sekvence pro 1029 bp otevřený čtecí rámeček je uvedena na obr. 7. Byla zde dobrá shoda mezi dedukovanou aminokyselinovou sekvencí v otevřeném čtecím rámečku ^STl a aminokyselinovou sekvencí získanou přímou analýzou čištěných proteinů.

Sekvence přesahujících regionů STÍ a \ ST2 jsou idetické ve svých délkách s výjimkou jediného 120 bp gap v^\STl. Unikátní otevřený čtecí rámeček pokračuje na obou stranách tohoto přerušení v?^STl /obr.5/. Pro stanovení, zda

-45jedna nebo obě cDNA formy představují správnou RNA byla provoděna PCR analýza za použití primerů lemujících tento gap na cDBA templátu získaném reverzní transkripcí póly A + RKA z vepřových slinných žláz. Amplifikované PCR fragmenty, odpovídající STÍ a ΛST2 byly detegovány při tomto řešení /data neuvedena/. PCR produkty byly subklonovány a sekvcnovány pro ověření jejich identity a oba byly shledány identickými s odpovídajícími regiony v Λ STÍ a /^ST2. Jak přímé cDNA klonování a PCR amplifikace svými výsledky potvrzují, že zde jsou dvá mRIIA druhy pro 2,3sialyltransferásu ve vepřových slinných žlázách, které se liší přítomností nebo nepřítomností 120 bp inzerce v otevřeném čtecím rámečku.

Předpověděná velikost sialyltransferágoyého otevřeného čtecího rámečku/ / proteinu je 39 kDa, se 4 potenciálními glykosylačními místy /viz obr. 7//Bouse E.,Eiochem.

J. 209, 331-335/1983//.-Použití 3 těchto míst by mohlo vést k proteinu, s předpověděnou velikostí přibližně 48 kDa pozorovanou pro formu A čištěné sialyltransferásy.Ačkoliv aminoterminální sekvence obsahuje dvA ATG kodony v těsné blíž kosti, pouze první je v silném konsensu s translačním iniciačním místem /Kozák Cell 49, 283-292/1986/ a Kozák M.,Nuc.Acids Res. 12, 357-872 /1984//. Kyte-Doolittle hydropatická analýza /J.Mol.Biol.157,105-132/1982// odhaluje jeden potenciální membránový region, obsahující 16 hydrofobních zbytků, umístěný 11 zbytků od amino-konce /obr.

7/. Tento strukturní rys potvrzuje, že ,Χ, 2,3sialyltransferása, podobně jako jiné glykosyltransferásy, které byly studovány, má typ II membránové orientace a by tento jediný hydrofobní region mohl sloužit jako neštěpitelná, amino-koncová signální/kotevní sekvence /Paulson J.C. a Colley K.J., J.Biol.Chem. 264, 17615-17518/1939//.

Otevřený čtecí rámeček kódovaný STÍ a ST2

-47obsahuje celé NK^-koncové aminokyselinové sekvence získané jak z formy A tak formy B z / 2,3-0 sialyltransferásy. Jak je uvedeno na obr.S, Nl^-koncová sekvence formy A je zjištěna 8 aminokyselin od domnělého startovacího mísa translace otevřeného čtecího rámečku a odpovídající NK^-koncová sekvence formy B je nalezsna 27 aminokyselinových zbytků dále k COOH-konci proteinu. Protože forma B 2,3 sialyltransferásy je plně katalyticky aktivní /Rearick J.I. a kol., J.Biol.Chem. 254, 4444-4451 /1979//, proteinová sekvence mezi domnělým iniciátorem methioninem z plné délky enzymu a aminokonec formy B není pravděpodobně vyžadován pro enzymatickou aktivitu. Takto proteolyticky citlivý region (Λ 2,3-0 sialyltransferásy, který leží mezi signál-kotevní doménou a katalytická doména, jevící se v kmenovém regionu, jak je definováno pro dříve studované glykosyltransferásy /?7einstein J.a kol., J.Biol.Chem. 262, 17735-17743/1987/ a Paulson J.C. a Colley X.J.,J.Biol.Chem. 264, 17615-17618/1989//.

Dvacet mg celkové RNA z vepřové nebo krysí tkáně bylo elektroforézováno na 1,0% agaroscvém gelu, obsahujícím 2,2 M formaldehydu /26/ a transferováno na nitrocelulosové filtry /Schleicher a Schuell/ jak je popsáno. Nitrocelulozové filtry byly hybridizovány se³²P-značenými cDNA sondami a promyty jak bylo dříve popsáno.

Příklad 3

Exprese rozpustné vepřové sialyltransferásy

Sekretovatelný chimerní protein byl připraven mezi domnělou katalytickou doménou /^2,3-0 sialyltransferásy a inzulínovou signální sekvencí fúzováním C-koncový'6'ň 890 bp klonu Ά.5Τ2 k N-koncové části vektořu pGIR-199

-4 3/Hsueh a kol., J.Biol.Chem. 261, 4940-4947/1985// na Sac I místě obsaženém ve čtecím rámečku obou vektorů. Tato chiméra, sp-ST, byla štěpena restrikčními enzymy Nhe I a Srna I, byl izolován 1,0 kb fragment a subklonován do pSVL/Pharmacia/ štěpeného Xba I a Srna I s místy štěpení obsaženými polylinkeru. Výsledný konstrukt byl nazván pSVL-spST a byl použit jako vektor pro přechodnou expresi rozpustné formy ^2,3-0 sialyltransferásy v COS-1 buňkách. Suoerspletená DNA, pSVL sp-ST, byla transfektována do COS-1 buněk za použití lipofektinu podle postupu doporučeného dodavatelem. /60 mm kultivační misky, obsahující 50 % slévajících se buněk byly transfektovány 5 ^ug DNA, 20 ml lipofektinového činidla/. Čtyřicet hodin po transfekci byla media COS-1 buněk oddělena a zahuštěna 15x na Centricon 30 filtrech /Amicon/ pro zkoušku aktivity 2,3-0 sialyltransferásy. Aktivita 2,3-0 sialyltransferásy byla stanovena za použití nemrznoucího glykoproteinového akceptoru jak je popsáno dříve /Sadler a kol., J.Biol.Chem. 254, 4434-4443/1979//.

Čtyřicet hodin po transfekci pSVL-spST byly COS buňky /60mm misková kultura/ promyty met-prostým mediem /DUEM, 5 % fetálního telecího séra//Gibco/ a kultivovány v tomtéž mediu 1 h. Buňky byly pulzně označeny 150 mCi/ 150 pmol S-met Expres label /NEN/ v l,5ml met-prostého media po 2 hodiny. Buňky byly pak promyty PBS a udržovány 35 h v mediu bez S-met značení. Medium, obsahující sekretované proteiny bylo pak odděleno, zahuštěno 15x a podrobeno SDS-PAGE a analyzováno fluorografií.

Jak bylo dříve uvedeno, forma B /2,3-0 sialyltransferásy je enzymaticky aktivní, proteolyticky štěpítelný produkt plné délky membránově navázaného enzymu. Proto bylo předpokládáno, že rozpustný, chimerní protein by si mihl udržovat ¢(2,3-0 sialyltransferásovou aktivitu, jestliže bude zahrnut v celé sekvenci B formy. X vytvoření takového rozpustného proteinu bylo zvoleno restrikční místo ve směru od NH₂~konce B-peptidové sekvence jako místo pro fúzi A ST2 cDNA s vektorem, kódujícím inzulínovou signální

-( o_ sekvenci pGIR-199. Jak je ilustrováno na obr.9a, tento konstrukt kóduje fuzní protein, který byl nazván signální peptid- ST /sp-ST/, který obsahuje inzulínovou signální sekvenci následovanou 9 aminokyselinami, kočovanými pGIR linkerem a celou domnělou katalytickou doménu 2,3-0 sialyltransferásy. sp-ST konstrukt byl očekáván jako přímo 38 kDa sekretující protein, když byl transfektován do hostitelských savčích buněk. Podobná strategie pro produkci rozpustných forem glykosyltransferás byla úspěšně použita /Paulson J.C. a Colley K.J., J.Biol.Chem. 264, 17515-17618/1989/, Colley K.J. a kol., J.Biol.Chem. 264, 17619-17522/1939/, Larsen R.D. a kol., Proč.Nati.Acad.

Sci. USA, 6674-5673/1990//.

sp-ST konstrukt byl umístěn do pSVL expresního vektoru a přechodně transfektován do COS-1 buněk. Po 48 hodinách byly transfektované buňky inkubovány po 2 hodiny v mediu, obsahujícím Trans 3-znaěkovač a potom následovala 5h perioda v mediu bez značení. Toto medium bylo shromážděno, koncentrováno 15x a analyzováno SDS-PAGE/fluo rografií. Obr.9b ukazuje, že medium obsahuje prominentní 38 kDa druhy, očekávanou velikost sp-ST proteinu. V paralelně transfektovaných kulturách bylo medium sklizeno 48 hodin po transfekci, koncentrováno a studováno na aktivitu 2,3-Osialyltransferásy. Jak je ilustrováno na obr. 9c, medium z buněk, transfektovaných s sp-ST obsahuje milijednotky/ ml sialyltransferásy, zatímco medium z simulované transfektovaných buněk nemělo žádnou významnou aktivitu.

Příklad 4

Čištění a sekvenování sialyltransferásy z krysích jater

Podobně jako jiné glykosyltransferásy, které jsou membránovými proteiny , . endoplasmatického re-50tikula a Golgiho aparátu, jsou sialyltransferásy málo se vyskytují proteiny a je nesnadné je čistit, jestliže byly klonovány pouze dva členové této rodiny. GalBl,3(4)Glc NAc οζ, 2,3-sialyltransferása / <^2,3-1’/ byla nejprve čištěna 300000 násobně z krysích jater v roce 1932 Teinsteinem a kol., což poskytlo asi 10 ^ug/ng tkáně /Ueinstein J. a kol., J.Biol.Chám. 257, 13835-13044/1982/ a Weinstein J. a kol. J.Biol.Chem. 13345-13853 /1982//. I když byla provedena určitá opatření pro získání informace o aminokyselinové sekvenci nebo zvýšení protilátky proti enzymu za použití konvenčních metod, jsou tato chybná, protože tak mohla být získána jen malá množství zředěného proteinu. Hmotová spektrometrie hrála úlohu v hodnocení biologicky důležitých makromolekul. Vývoj nových ionizačních metod a přístrojů zasáhl odpovídající rozmezí hmotnosti a citlivost detekce.Vysokoúčinná hmotová, spektrometrie je nyní uznávána jako účinná technika pro sekvenování proteinu /Mathews W.R. a kol., J.Biol.Chem. 262, 7537-7545/1987//, jakož i pro stanovení posttranslačních a chemických modifikací /Dever T.E. a kol., J.Biol.Chem. 264, 2051820525/1989/, Settineri C.A. a kol., Biomed.Environ.Kass Spectrom.lS, 665-676/1990/ a DeWolf Jr.W.E. a kol., Biochem.27, 90993-9101/1988//. Proto byla hmotová spektrometrie použita pro poskytnutí aminokyselinové sekvence sialyltransferásy.

Redukce a karboxymethylace

Přibližně 13 /Ug Gal81,3(4)GlcNAc <2,3-sialyltransferása ( i(.2,3N) bylo uchováváno ve 350 ml 30 mM caodylátu sodného /pH=6,5/,100 mM NaCl 0,1% Triton CF-54 a 50% glycerolu. TrisHCl /pH=8,0/guanidin.HCl a dithithreitol se přidají na konečné koncentrace 0,2 Μ, δ M a 7 mí-I. Reduk ce se povede při 60°C pod argonem po 1,5 hodiny. Přidá se jodacetát sodný /1,32 mg/ ve 2,5 ml 0,2M TrisHCl pufru ke směsi.Alkylace se provede při teplotě místnosti, pod

-51argonem po 1,5 h. Přidá sa jodacetát sodný /1,22 mg/ ve

2,5 ml 0,2 M Tris ECl pufru ke směsi. Alkylace se provede při teplotě místnosti, pod argonem ve tmě, po l_z5 h.

Dialýza

Redukovaná a karboxymethylovaná ^2,3N se dialyzuje proti 4 litrům 50 mM N-ethyl-morfolin acetátového pufru /pH=8,l/ za použití Eethesda Research Labs /SRL/ Microdialysis System s BRL preparovanými dialyzačními membránami s rozdělovači schopností pro molekulovou hmotnost 12-14 kDa. Když byla dialýza úplná, přidá se k dialyzačním jamkám 10% SDS, což vede ke konečné SDS koncentraci přibližně 0,1 %. Obsahy jamek se spojí a suší za použití SpeedVac Concentrátoru /Savaně/. Pro odstranění SDS se provede Konigsbergovo srážení /Xonigsberg W.H., HendersonL. Methods in Enzymology 91, 254-259/1993//.

Tryptické štěpení

Vysrážená ú(2,3N se rozpustí v pufru pro štěpení /100 mM TrisHCl 21-1 močovina, 1 mři CaC.^, pH=8,0/ a získá se koncentrace proteinu přibližně 2 mg/ml. iX. 2,3N se štěpí 10% trypsinem /hmotn./hmotn./ /Boehringer-Mannheim, sekvenční čistota, rozpuštěn v 1 mř-1 HC1/ při 37 °C. Po 7 h štěpení se přidá další podíl trypsinu ke směsi a vznikne konečná koncentrace trypsinu přibližně 13 %. Štěpení se ukončí přibližně po 18 h. Produkty tryptického štěpení se oddělí HPLC s reverzní fází /ABI C18 kolona, 1,0 x 1.00 mm/ za použití ABI 140A rozpouštčdlového systému. Rozpouštědlem A byl 0,1% TFA ve vodě. Rozpouštědlem B byl 0,08% TFA v 70 % acetonitrilu/30 % vody. Systém pracoval při průtokové rychlosti 50 ml/min. Deset minut po injekci byla procenta rozpouštědla B zvýšena z 0 % na 50 % během

-5290 minut, potom až na .100 % během 30 ninut. dstegovány za použití ABI 783.A absorbcaíhe C. cujícího při 215 nm. Některé z těchto frakcí, fikovány za použití HCl/n-he::anolovč směsi.

Peptidy byly etektoru, prabyly esteriHmotova spektrometrie

Kapalinová sekundární iontová hmotová spektrometrie /úiguid Secondary Ion Mass Spectrometry LSItíS/ byla provedena za použití hmotového dvojohniskového spektrometru Kratos I1S50S, opatřeného LMIMS zdrojem a magnetem s vysokou intenzitou pole. Přibližně jedna pětina každé odebrané frakce byla použita pro LSIUS analýzu. Jako kapalná matrice byl použit jeden mikrolitr směsi 1:1 glycerol:thioglycerol okyselené 1¾ T7A. Vzorky byly znovu shromážděny υ špičky soncly. Ionty nejpříbuznější ch molekul byly zvoleny pro kolizí indukovanou disociační /CID/ analýzu. Tyto pokusy byly provedeny na Kratos Concept IIHH čtyřsektorovém hmotovém spektrometru, opatřeném elektrooptickým vícekanálnovým detektorem, který zaznamenává postupně 4% segmentů z hmotnostního rozsahu současně. Kolizní energie byla 4 keV, kolizní plyn bylo helium a jeho tlak byl upraven pro zeslabení množství zvoleného prakurzorového iontu na 30 % jeho počáteční hodnoty. Zbývající každý vzorek byl nanesen a byl přidán 1 ml výše uvedené matrice. Údaje vysokoenergetické CID byly interpretovány bez použití počítačové analýzy.

Tandemová hmotová spektrometrie je účinnou metodou pro sekvenování proteinů a vykazuje výhody proti konvenčním Edmanovým technikám. Touto metodou je možné i sekvenování ekvimolárních směsí. U analýzy hmotovou spektrometrií se nejprve malé frakce peptidu z HPLC esterifikují pro zvýšení jejich hydrofobicity a tím zlepšení jejich rozprašovací účinnosti /Falick Ά.Μ. a í-laltby D.A., Anal.Biochem.

182, 165-169/1989//. LMSIMS analýzy každé frakce uvolňují více molekulových iontů,indikujících v každé frakci přítomnost víe než jednoho peptidu. 30 nejvíce se vyskytujících molekulových iontů bylo zvoleno pro CID analýzu. V těchto pokusech je 12C isotopový pík zkoumaného iontu zvolen v prvním hmotovém spektrometru. Pouze fragmenty tohoto druhu, vznikající z dimezi dvěma hmotovými spektrometry, jsou detepovány na konci druhého hmotového spektrometru. Vysokoenergetická kolize indukuje disociační /CID/ analytickou fragmentaci, objevující se hlavněpodélK-peptidového řetězce. Násobné štěpení, tj. fragmentace v aminokyselinových postranních řetězcích jsou také pozorována. Fragmentace podél peptidovčho řetězce poskytuje iontové serie, které se liší hmotnostmi aminokyselinových zbytků, takže mohou být dedukovány odpovídající aminokyselinové sekvence. Vysokoenergetická způsoby fragmentace poskytují další informaci o identitěaminokyselin, čímž potvrzují získané sekvence a umožňují diferenciaci mezi isobarickým Leu/Ile aminokyselinovým párem /Johnson R.S. a kol., Anal.Cham. 53, 2521-2525 /1387//. Fragmentace postranních řetězců může být také pozorována, většinou tam, kde se jedná o bazickou aminokyselinu, tj. Arg, Lys nebo His, v sekvenci /Johnson R.S. a kol., Int.J.fSass Spectrom.Ion Proč. 86, 137-154/1988//.Obvykle preferenční protonizace bazických aminokyselinových zbytků v nebo blízko N-konce vede k preferovanému zadržení náboje na tomto konci molekuly. Peptidy, obsahující bazické aminokyseliny na nebo blízko C-konce budou vykazovat většinou C-koncové fragmenty. Tak trypsin je výhodný pro počáteční štěpení. Interpretace vysoko energetických CID dat eventuálně poskytne 14 sekvencí /viz tabulka 2 a obr.9/.

Analýza CID spektra prozrazuje, že se některé reakce postranních řetězců objevují během tryptického štěpení.

Dva produkty trypsinové autolýzy byly identifikovány při m/z 659,3 a 1153,6 /obr. 9/. Protože dlouhá doba inkubace a nepřítomnost vhodného zachycovače, byly některá tryptické peptidy karbamylovány na svém N-konci. Zatímco takové vedlejší reakce b^, vyloučeny Edmanovou degradací, mohou být N-koncové modifikace i vhodné v sekvenování hmotovou spektrometrií.

Ve skutečnosti CID analýza těchto modifikovaných peptidů byla nápomocná v potvrzení některých výše uvedených sekvencí, v jednom případě poskytnutím prostředků pro diferenciaci mezi N-koncovýra leucinem nebo isoleucinem /obr. 10/.

-s<~

Příklad 5

Sialyltransferása z krysích jater

PCR amplifikace specifické cDMA sondy

Bylo syntetizováno dvacet dva degenetovaných oligonukleotidových poolu obou řetězců- negativního i pozitivního /Genosys// na bázi aminokyselinových sekvencí jedenácti ze čtrnácti peptidů získaných z 2,311. Počáteční PCR experimenty byly prováděny na základě zjištění, že peptid 11 a peptid 1 jsou homologní k regionu umístěnému blízko centra dříve klonované sialyltransf erásy, GalBl, 4Glcl'TAc ^2,6-sialyltransferásy /Ueinstein J. a kol., J.Biol.Chem.

257, 13835-13844/1982// a ^2,3-0 popsané výše /obr. 11/.

Dvě skupiny PCR experimentů byly provedeny za použití bud záporného primeru k peptidu 11 nebo kladného primeru k pepti- du 1 párovaného s nukleotidovými primery k jiným peptidům a orvnímu řetězci cDMA syntetizované z celkové RMA krysích jater jako templátu. Začíná se se stupněm tání templátu /5 min při 94 °C/, provede se amplifikace za použití GeneAmpTM DMA amplifikačního kitu činidel s AmpliTaqTM DMA polymerásou /Perkin Flmer Cetus/, se 35 násobným cyklizovánim, 1 min při 94 °C, 1 min při 37 °C a 2 min při 72 °C a zakončí se finálním orodlužovacím stupněm /15 min oři 72 °C/. Některé cDMA fragmenty byly generovány z těchto PCR reakcí. Za předpokladu, že peptid 11 a 1 představuje kontinuální prodloužení aminokyselin, byly provedeny další sety PCR experimentů za použití strategie usazení primeru /Mullis

K.B. a Faloona F., Methods Enzymol. 155, 335-350/1987// za účelem identifikace specifických cDNA fragmentů. Za použití tohoto přiblížení byl identifikován specifický cDMA fragment, llzáporný-14kladný /lls-14as/.lls-14as cDNA frag ment byl subklonován do Bluescript plasmidu /Stratagene/ a sekvenován za použití universálních primeru /Stratagene/ a _

-55Sequenase Version 2,0 kitu /USB/.

Klonování sialyltransferásy cDUA knihovna byla konstruována z ooly/A/+RIIA z krysích jater za použití cDNA syntézního kitu od Pharmacia /Gubler U. a Hoffman 3.J. Gene, 263-269/1233//. Oligo/dT/ primovaná cDNA byla syntetizována a ligovína do EcoRI-Notl linkerů. cDNA byly pak ligovány do EcoRI štěpené OgtlO DNA/Promega/.

Po in vitro pakážování s DNA pakážovacím extraktem /Stratagene/ byly fágy umístěny na plotnu v hostitelském kmenu E. coli C600 hf1-/Prcmega/. Přibližně jeden milion plaků byl prohledán lls-14s cDNA sondou /Gubler U. a Hoffman 3.J. Gene 25, 263-269 /1983//. Dva pozitivní fágy /13-1 a 9-1/ byly plaky čištěné a subklonované do Cluescript plasmidového vektoru /Stratagene/ pro sekvenování.

Izolace cDNA klonů

Dayhoff Protein databáze byla použita pro prohledání peptidových sekvencí na homologii se známými proteiny.

Tento průzkum poskytl první zjištění homologie mezi_;^2,3-N a jinými klonovanými sialyltransferásami. Z této analýza byl peptid 11 /tabulka 2/ zjištěn jako homologní k sekvencím přítomným jak v krysí tak lidské B-galaktosid a-2,6-sialyltransferásách /tyto dva enzymy jsou z 88 % konzervovány, Gu T.J. a kol., FEBS 275, 83-85/1990/ a Laňce P. a kol., Biochem. Biophys.Res.Gommun. 164, 225-232/1989//.Při rozšíření této analýzy tak, aby zahrnovala sekvenci^ 2,3-0 byl nalezen další peptid, peptid 1 /tabulka 2/ jako homologní k sekvencím v obou klonovaných sialyltransferásách. Shoda těchto peptidů se sekvencemi přítomnými v předem klonovaných sialyltranbsferásách potvrzuje, že tyto dva peptidy představuji kontinuální rozpětí aminokyselin, které byly štepeny u argininového zbytku během trypsinového štěpení /obr.11/.

-56β jo o

I o

Ad tr •rl

Cm

E« w

I ci

CM e

Tabulka 2

Aminokyselinové sekvence peptidů odvozených od Gal01,3(4)GlcNAc α2,3-sialyltransferásy >

Ad +->

f>*

A3 o

Λ

o.

r-l

O* cu

Φ o

β φ

s>

Ad

Φ

OJ

5>

O β

•rl r-l

Φ co >»

Ad

O β

•rl a

a

Π •rl

P cu

ca

*ř

σι

co

Cl

tn

<·

in

Ol

r-l

σ\

«s·

co

o

ΊΤ

ir>

in

>

o

CM

Cl

r-4

m

CM

rl

CO

rU

CM

rl

CM

Cl

r-l

r-l

Ί*

CM

1

1

1

r-

|

1

1

1

1

1

»

CO

1

<£>

o

ΊΤ

o

1

o

r~

t

CO

rH

1

CM

CO

xf

co

Cl

σι

Cl

c-

ΊΤ

Ί·

co

r-

CM

cn

CM

r4

Cl

CM

r-l

CO

rl

CM

r-C

CM

Cl

r1

i-l

in

CM

CM Cl in \o t co σι o (0 •b Φ r4 W >1 rl O φ £ o β CM o β o* ml « «

>

φ r-l

Ht

O

CO <

β >

ES[ *

O

CO <u

AS cm (—1 o

(0 rl

CO β

3 (0 >

Φ

Λ

CM a

ω Λ a, >1 β rl Φ O to a cu

S

CM Cl

	o
		Ad
		a
		•a
a		φ
«2		53
a
>»		Φ
ta		0
β		β
«		0
		>
a
		Φ
>		01
o
m		Ό)
XB		>
β		O
φ		β
		•rl
01		r-1
β		Φ
CD		CO
β		>9
•P		X
rd		O
>>		β
H		•rl
ffi		a
•rl		co
'CO		Ό
a		O	•
'b		a	<
a		5ζ
		φ	a
β		rl	0
63		'-I
a		Ό	Em
	N	(0
'b		O	1
β		β	Cl
•rl
•o		a	CM
		'b	0
Atf		β •rl	rl
•rl		Ό	<0
•rl		<3>	o
to
o
H		Φ·
O		63
a		3
o		O
Λ		CU
M		Φ
•>~3		•n
3
N		OJ
CO		β	Φ
Ad		XU	o
>9		β	β
>		63	Φ
		Φ	>
Φ		β	Ad
0	v	*>»	Φ
β		>	01
Φ		63
>			Ό
X		α	►
Φ		β	O
co		•rl	Ό
		rl	•rl
'Φ		Φ	+>
β		(0	O
Φ	•	>»	Φ
*3		X	H
β	CO	O	Ad
-P	CM	β	3
Ό	«	•H	β
O	in	a
CM	CM	<	63

-57Zjištění, že peptid 11 a peptid 1 vykazují homologii k sekvenci dříve identifikované jako konzervovaný region homologie v centru dvou jiných klonovaných sialyltransferás poskytlo základ pro strategii klonování podle vynálezu /obr.11/. Za předpokladu, že oeptid 11 a peptid 1 by mohly být blízko centra proteinu, bvl.y tyto PCR experimenty provedeny tak, že vzniká dlouhá cDNA sonda. Na bázi aminokyselinové sekvence 14 sialyltransferásových peptidů byly syntetizovány degenerované oligonukleotidové primery jak záporné tak kladné pro použití v PCR experimentech. V těchto experimentech byly primer 11 záporný a 1 kladný párovány s jinými primery za účelem amplifikovat dlouhé cDNA fragmenty^ 2,3-N. Některé cDNA fragmenty byly amplifikovány v těchto pokusech. Za předpokladu, že peptid 11 a peptid 1 představují kontinuální rozsah aminokyselin, byly pak primer 11 ajprimer 1 použity ve strategii usazení primeru /ílullis X.B. a Faloona F., Methods Enzymol. 155, 335-350/1987// k identifikaci specifických cDNA fragmentů. Fragment amplifikovaný za použití primerů 11 záporného a 14 kladného byl téměř téže velikosti jako fragment amplifikovaný za použití 1 záporného a 14 kladného primeru, což potvrzuje, že fragment, který je produkován, je výsledkem specifického zesílení primery a ne artefakt.

Xlonování a charakterizace 11 záporný-14 kladný fragmentu bylo zjištěno, že peptid 11 a 1 jsou skutečně kontinuální. Porovnáním sekvence cDNA fragmentu se dvěma klonovanými sialyltransferásami /Weinstein J. a kol., J.Biol.Chem. 262, 17735-17743/1987// bylo nalezeno, že homologie přesahuje z peptidu 1 a pokračuje po osmnáct aminokyselin. Protože homologie existuje, bylo očekáváno, že lls-14as cDNA fragment

-53byl amplifikován ze sialyltransf arásové mRNA.

Sekvenca také indikuje, ža cDNA fragment nabyl fragment Galbl,4GlcNAc 2,6-sialyltransferásy, který se vyskytuje v krysích játrech /ííeinstein J. a kol., J.Eiol.

Chem. 257, 13335-13844/1982//.

llzáporný-14 kladný fragment byl použit k prohledání oligo dT primovaná cDNA knihovny krysích jater, ze kterho byly získány dva pozitivní klony z 1 milionu plaků, které byly prohledány. Charakterizace pozitivních klonů naznačuje, že klon ST3N-1 obsahuje 2,1 Kb inzert zatímco klon ST3N-2 je kfcatší, pouze délky 1,5 Kb. Northarn analýza indikuje, že Gal ^2,3-ST mRNA byla 2,5 Kb /viz dále/, což potvrzuje, že klon ST3N-1 by měl obsahovat kompletní kódující sekvenci Gal ^2,3-ST.

Primární struktura ^2,3-N sialyltransferásy

Sekvenční analýza ukazuje, ža klon ST3N-1 obsahuje kompletní otevřený čtecí rámeček sialyltransferásy /obr.

2/. Obsahuje 32 bp 5'-netranslatovanou oblast, otevřený čtecí rámeček délky 1122 bp, 3'-netranslatovanou oblast přibližně 1 Kb a póly(A)prodloužení /chvost/. Otevřený Čtecí rámeček klonu ST3N-1 kóduje 374 aminokyselinový protein s předpověděnou molekulovou hmotností 42,033. S výjimkou rozdílu v jedné aminokyselině, kóduje otevřený čtecí rámeček všechny ze 14 peptidových sekvencí získaných z hmotově spektrometrické analýzy čištěné sialyltransferásy. Toto potvrzuje, že cDNA klonu ST3N-1 je skutečně sialyltransferásová. Podle pozorování pro jiné klonované glykosyltransferásy /Paulson J.C. a Colley K.J., J.Biol.Chem.

264, 17615-17618/1989//, je<X2,3-N předpověděna jako mající krátký N-terminální cytoplasmatický chvost, signální kotevní sekvenci přibližně 20 zbytků a velkou C-koncovou oblast, která obsahuje katalytickou doménu enzymu.

-59Příklad S

Exprese rozpustné krysí sialyltransferásy

Za účelem produkce rozpustné formy sialyltransferásy pro enzymatickou charakterizaci, byl konstruován fuzní protein, obsahující katalytickou doménu enzymu a inzulínovou štěpítelnou signální sekvenci, v savčím expresním vektoru pSVL/Pharmacia/. Specificky, katalytická doména sialyltransferásy byla amplifikována PCR za použití 5'primeru při poloze +182 /obr. 11/, proti směru transmembránové domény a 3' primeru umístěného 3'UTR ve směru od polyadenylaěního místa. PCR reakce byly provedeny jak je popsáno výše s teplotou zpracování 55 °C. PCR produkt byl subklonován do BamHI-EcoRI míst pGIR-199 /dar od K.Drickamera/, což vede k fúzi sialyltransferásového rámečku do inzulínové signální sekvence přítomné v pGIR vektoru /Husej E.C. a kol., J.Biol.Chem. 261, 4940-4947/1986//. Výsledný fuzní protein byl inzertován do Xba I-Sma I míst expresního vektoru pSVL za získání expresního plasmidů pBDl22.

Pro dočasnou expresi v COS-1 buňkách, byl expresní plasmid pBDl22 /20 mg/ transfektován do COS-1 buněk na 100 mm plotnách za použití lipofektinu podle doporučení výrobce /BRL/. Po 48 hodinách bylo medium buněčné kultury shromážděno a zahuštěno za použití centricon 10 mikrokoncentrátoru. Koncentrovaná media byla studována na aktivitu sialyltransferásy za použití oligosacharidú jako akceptorových substrátů. Transfer sialové kyseliny k oligosacharidú byl sledován za použití iontovýměnné chromatografie /Sadler J.E. a kol., J.Biol.Chem. 254, 5934-5941/1979/ a Paulson J.C. a kol., J.Biol.Chem. 264, 10931-10934 /1989//.

-60Za účelem demonstrování, že klon ST3K-.1 kóduje 2,3-N sialyltransferásu, byl učiněn pokus exprimovat klon v COS-1 buňkách. Aminokyselinová sekvence klonu ST3N-1 uvádí,, že protein obsahuje NH^-koncovou signál-kotevní sekvenci, která je předpověděna jako kotvící enzym ke Golgiho aparátu v buňce /Paulson J.C. a Colley K.J., J.Biol.Chem. 264, 1751517618/1989//. Pro usnadnění funkční analýzy enzymu, bylo přáním získat rozpustnou formu enzymu, který- je-li exprimován, by měl být sekretován z buňky. Fuzní protein byl konstruován za použití stepitelné inzulínové sekvence pro nahrazení signál-kotevní sekvence na Nř^-konci sialyltransferásy. Jestliže expresní plasmid OBD122 byl exprimován v COS-1 buňkách, byl enzym sekretován z buněk a vykazoval sialyltransf erásovou aktivitu.

Enzymatické vlastnosti ¢( 2,3-W sialyltransferásy byly nejprve charakterizovány s čištěným proteinem /Weinstein J. a kol., J.Biol.Chem. 257, 13845-13853/1982//. Sialyltransferása byla shledána jako využívající B-galaktoSid akceptory, obsahující bud GalBl,SGlcNAc nebo GalBl, 4GlcI4Ac sekvence, tvořící lleuAc í^2,3GalBl, 3GlcNAc a NeuAco/2,3GalBl >

GlcNAc sekvence často nacházené jako zakončující komplex typu N-spojených oligosacharidů. Enzymy sekretované z buněk které byly transfektovány expresním plasmidem pBDl22 byly schopny využít B-galaktosid akceptory, obsahující bud GalBl,3GlcNAc nebo GalBl,4GlcNAc sekvence /tabulka 2/.

Buňky transfektované rodičovským vektorem sekretují žádnou takovou sialyltransferásovou aktivitu. Sekretovaný enzym je také schopen sialylace asialo- 1 kyselého glykoproteinu. Tyto údaje jsou v souladu s enzymatickými vlastnostmi čištěné ρζ 2,3-M.

-“61Příklad 7

Exprese ρζ 2,3-N sialyltransferásy v bakuloviru

Terminální tetrasacharidova sialyl Lewis. /31e' :

SA Of 2,3Gal / 1,4GlcNAc | otl, 3Fuc |/byla identifikována jako ligand prc P-selektin a E-selektin a syntetický oligosacharid, obsahující SLe strukturu je kandidátem pro blokování interakcí selektin-ligand. KOmpjbetní chemická syntéza 31e^x je technicky a ekonomicky obtížná, ale použití specifických glykosyltransferás pro připojení terminální sialové kyseliny a fukosových zbytků k chemicky syntetizovanému jádru sacharidu usnadní syntésu volného SLe . Gen, kódující 2,3-N sialyltransferásu byl klonován z knihovny cDNA krysích jater a byl shledán majícím specifickou ^2_f2 (GlaBl, 3/4GlcNAc) sialyl transf erásovou aktivitu, je-li exprimován v transfektovaných COS-1 buňkách ,/Wen a kol., návod k přípravě/. Část cDNA klonu, kódující enzymatickou část polypeptidu, ale postrádající hydrofobní signál/merabránová kotva doménu, byla fúzována k pre-inzulinové signální sekvenci za vzniku cDNA kódující rozpustný, sekretovaný 2,3 NST protein. Tato cDNA byla klonována do Bakulovirus transfer vektoru a použita k transfektování Sf-9 hmyzích buněk za přítomnosti standardní bakulovirové DNA. Byl izolován rekombinantní virus, obsahující c( 2,3-N sialyltransferásovou CDNA a čištěn a použit k infikování Sf-9 buněk. Infikované buňky sekretují oý. 2,3 NST ve velkých množstvích do media a tento protein byl čištěn iontovýměnnou chromatografií.

Sf-9 buňky byly získány z ATCC. DNA vektory pGIRl99 a pBlueBac byly získány od J.C.Paulsona a Invitrogen ,/San Diego, CA/. Sf-9 buňky rostly v rotační kultuře při buněčných hustotách mezi 0,3 a 1,5 milionů buněk na mililitr v Graces Insect Mediích /doplněných 0,33 % laktalbuminového hydrolyzátu a 0,33 % yeastolatu/ získaných od Gibco /Grand Island, NY/, plus 10 % tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra /JRH Biosciences, Lenexa, KS/. Toto medium bylo označ 2íio

ÍS+10%?CS.

Rozpustná forma (λ 2,3-d sialyltransferásy byla připravena následujícím způsobem. cDNA, představující celou

2,3-Hsialyltransferásovou m.RZň byla použita jako templát pro PCR použitím jako amplimery dvou oligonvkleotidů, které nybridizují /5'/ na pozici přesně C-konce kombinační signál/kotva oblasti a /3'/ proti směru poly/A/adice místa ve 3'netraslatované oblasti.Oba oligonukleotidy kódují BamHI místa na svých 5'koncích, což umožňuje aby PCR produkty byly klonovány na BamHI místo oGIRl99, fúzované v rámečku s pre-inzulinovou signální sekvencí. Lemující Uhel místa byla použita pro zpomalení genová fúze a tento cDNA klon byl klonován do bakulovirus transfer vektoru pBluebac, pod kontrolou bakulovirovým polyhedrinovým promotorem. Všechny rekombinantní DUA manipulace byly provedeny za podmínek doporučených výrobcem enzymu v návodu. pBluebac vektor obsahuje S.coli β-galaktosid/ascvý gen pod kontrolou různých bakulovirových promotorů a viry, které prošly rekombinací a přijaly DNA vektor mohly konvertovat ohromofor X-gal na modrý produkt.

Vytvoření rakombinantního bakuioviru bylo umožněno použitím MaxBac expresního systému /Invitrogen/ podle přesných protokolů doporučených výrobcem. Stručně, plasmid a standardní typ virové DNA byly smíseny a použity pro transfektování Sf-9 buněk metodou fosforečnanu vápenatého. Virus byl produkován transfektovanými buňkami a přecházel do kultivačního media. Rekombinantní virus byl identifikován plakovou zkouškou modrou barvou produkovanou při působení β-galaktosidásy na X-gal zahrnutý v plakovém mediu v koncentraci 150 ^ug/ml, a čištěn ze standardního typu viru opakováním ředění/tvorby plaků. Čištěný virus byl rozšířen na 500 ml infekcí čertvých Sf-9 buněk. Některé klony byly analyzovány na jejich schopnost působit sekreci οζ 2,3-sialyltransferásy do infikovaného buněčného media při testování podílu media přímo v dále popsané radioaktivní

-53sialyltransferásové zkoušce

10%FCS infikováno jediným modrým olakem prostým standardního typu viru a ponechány růst 5-7 dnů při 27 °C. Výsledných 5 ml virového zásobního roztoku bylo vyčiřeno odstředěním a dále expandováno. Sf-3 buňky ve fázi logaritmického růstu /0,5-1,5x10 buněk/ml/ byly infikovány v koncentraci 1x10⁷ buněk na ml mnohonásobnou infekcí /moi/ 1, pro dosažení titru viru v 5 ml zásobního roztoku 1x10 plakotvornýcn jednotek /pfu/ na mililitr. Buňky byly zředěny desetinásobně v GCMS+10%FCS a ponechány růst 5-7 dnů při 27 °C. Výsledný virus byl vyěeřen a virový titr byl stanoven plakovou zkouš-

mickěho růstu umístěno na plotnu na každou vrstvu Ten Tray Cell Faotor /Hune, IJaperville, IL/, označené CF-10. Každý CF-10 , měl celkovou plochu růstu 5000 cm a buňky byly infikovány rekombinantním bakulovirem na mci=5 v objemu 300 ml. Po inkubaci po jednu hodinu byl přidá 1 litr Excell-400 /JRH Biosciences/ séra prostého media a buňky byly inkubovány při 27 °C po 72 hodin. Medium bylu sklizeno, vyčiřeno a filtrováno přes 0,2 ^ura filtrovou jednotku. Čerstvé medium /Excell 400 doplněné 2% fetálního telecího séra/ bylo přidáno a buňky byly inkubovány při 27 °C po dalších 48 hodin, potom bylo medium sklizeno, vyčiřeno a odfiltrováno.

\^_2,3-N sialyltransferásová aktivita byla zkoušena za použití modifikace popsané zkoušky /Sadler a kol., 1979/.

Ve 30 /Ul objemu bylo 14 ^ul vzorku smíseno se 3,5 ^ul laktoN-tetraosy /GalBl, 3GlclJAcBl, 3GalBl,4Glc/ a 12,5 ^ul zkoušené směsi jak je popsáno dále. Vzorky byly krátce promíseny, otáčením kolem dna reakční zkumavky a inkubovány při 37 °C po 10 minut. Reakce pak byly ihned zředěny v jednom ml 5 mM fosfátového pufru, pH 5 a aplikovány na 0,5ml iontovýměnnou kolonu. Podíl prošlý kolonou a 1 ml promývací podíl byly shromážděny vo scintilačních zkumavkách a spočteny. Jednotka je dafinovčlna jako množství enzymu požadované pro transfer jednoho mikromolu sialové kyseliny k akoeptoru za minutu.

Vzorek obsahuje bue žist-J supernatant nebo supernatant zředěný tak, že kinetiky reakce byly udržovány v lineárním rozsahu, přibližně 10C00 cpm vystup z kolony. Zkoušená směs byla připravena sušením 0,65 ml (50 ^uCi) | 'c | -CilPsialové kyseliny /NYN, Boston, HA/ a resuspendováním v 0,65 ml vody, obsahující 2,3 mg CMP-sialové kyseliny.

X tomu byly přidány 0,96 ml 1 II roztoku pufru kakodylátu sodného, pH 6, 0,4-3 ml 20¾ Tritonu CF-54, 0,29 ml 50 mg na ml roztoku hovězího sérového albuminu /všechny získány od Sigma, St.Louis, 110/ a voda do celkového objemu 3 ml. Specifická aktivita této zkoušené směsi byla stanovena a její podíl byl uchováván při -20 °C. Použitou iontovýměnnou pryskyřicí je AG1-X8, 200-400 mesh, fosfátová forma /Biorad, Richmond, CA/.

Koncentrace a čištění ¢( 2,3-11 sialyltransf erásy.

?edia /1-3 litry/, obsahující X2,3 ilST byla filtrov£'.na a zakoncantrována na přibližně 250 ml v Araicon CH2PR.3 spirálovém nábojnicovém systému opatřeném S1Y10 nábojnicí. Jednotka pak pracovala diafiltračním způsobem pro odsolení koncentrovaného supernatantu se třemi objemy 10 mil kyseliny kakodylové, 25 mM NaCl, 25 % glycerolu, pH 5,3 /pufr A/. Vzorky se pak aplikují na kolonu /2,5 x 17 cm/ S-Sepharose Fast Flow /Pharmacia/ ekvilibrovanou pufrem A při průtokové rychlosti 2 ml/min. Po vložení všech vzorků byla kolona promyta pufrem A až do návratu 0^250 eluantu z kolony na základní hodnotu /1,6 objemu kolony/, of 2,3 NST se pak eluuje z kolony 50 mM kyselinou kakodylovou, ÍM NaCl, 25% glycerolem pH 6,5. Frakce, obsahující 2,3 NST se spojí a dialyzují přes

Příklad

sialyltransferásy. Hybridizace k mRLÍA přibližně 2,5 Xb byla pozorována ve všech testovaných tkáních. Jak bylo pozorováno u dvou klonovaných sialyltransferás, vykazuje

gována v mozku. Játra, ledviny, kolon, srdce, vaječník

MAc \ 2,6-sialyltransferásové mRMA /4,7 a 4,3 Xb, 41,46/ bylv detegovány v krysích játrech a oodčelistních zatímco nízké hladiny mRNA byly nalezeny v srdci, žlázách vaječniku a mozku.

Příklad 9

Konzervovaná oblast homologie v katalytické doméně.

Konzervovaná oblast sialyltransferásové rodiny

Porovnání primárních struktur tří klonovaných sialyltransferás naznačuje region intenzivní homologie /obr. 12/. Tento region obsahuje 55 aminokyselin od zbytku 156 do zbytku 210 \ 2,3-N sialyltransferásy se 42 % aminokyselin identických a 58 % aminokyselin konzervovaných mezi všemi třemi enzymy. Sekvence všech tří sialyltransferás neměla významnou homologii mimo tuto oblast /region/. Protože tato oblast homologie je umístěna blízko centra katalytické domény enzymů, může tato oblast představovat konzervovanou

-56strukturu nezbytnou pro enzymatickou aktivitu, těchto sialyltransferás.

Tři čleiové sialyltransferásové rodiny glykosyltransferás byli klonováni. Ačkoliv 35 % z těchto sekvencí všech tří klonovaných sialyltransferás nemělo významnou.'homologii, oblast 55 aminokyselin ·/ centru každé molekuly je vysoce konzervována a naznačuje proteinový motiv v sialyltransferásové rodině. Froteinový motiv je dobře konzervovaná skupina aminokyselin ve specifické oblasti. Jiné aminokyselinové zbytky mimo tuto oblast jsou obvykle špatně konzervovány takže je malá celková homologie v proteinech, obsahujících stejný motiv. V této definici je konzervovaná oblast definovaná primárními strukturami tří klonovaných sialyltransferás motiv v sialyltransferásové rodině.

Proteinové motivy jscu často zahrnuty v katalýze a ligandové vazbě /Hodgman T.C., Comput.Applic. Biosci. 5, 1-13/1989/, Bairoch A,Prošité: A Dictionary of Protein Sites and Patterns, 5.vyd., University of Geneva /1290/ a Sternberg M.J.E., Nátuře 349, 111 /1921//. Všechny tři klonované sialyltransferásy katalyzují přenos sialové kyseliny z CtIP-UeuAc do <2,3 nebo ¢(2,6 spojení koncové galaktosy za vzniku následujících sekvancí:

NeuAc<2,3 GalBl, 3 (4 )GlctiAc NeuAc <2,3 GalBl, 3GlcNAcNeuAc <2,3 GalBl,4GlcNAc/ST3N/ /ST3O/ /ST6N/

Všechny tři enzymy konají obvyklou funkci. Více než 50 % ze zbytků v konzervované oblasti je bud nabito nebo to jsou polární aminokyseliny konzistentní s těmi,které jsou na povrchu enzymů. Šest nabitých zbytků v této oblasti je identických ve všech třech sialyltransferásách. Je velmi nápadné, že zde je sedm aminokyselinových zbytků v jednom rozsahu v konzervované oblasti identických mezi všemi třemi klonovanými sialyltransferásami _ Aso.Val.Gly.Ser.Lys.Thr.

-67Thr /obr. 12/.

Příklad 10

Klonování nové sialyltransferásy za použití konzervovaná oblasti homologie

Konzervovaná oblast homologie byla použita pro klonování dalšího člena rodiny sialyltransferásových genů.

PCR klonování s degenerovanými oligonukleotidy

Dva degenerované oligonukleotidy odpovídající 5*’ a 3' konzervované oblasti homologie /obr.13/ byly syntetizovány /Genosys/. SEkvence 5' a 3'primerů byly ^ČGAAGCYTTOSCRNMGSTGYRYCRTCGT a

5’ČCGGATCCGGTRGTYTTNSNSCCACRTC /1I=A+G+T+C, 3=G+C, R=A+G,

M=A+C, Y=C-i-T/. PCR experimenty byly provedeny za použití 100 pmol každého primeru a první řetězec cDIIA syntetizován z mozků kryssíoh novorozenců jako templátu. Amplifikace byla provedena ve 30 cyklech při 94 °C po 1 minutu, 37 °C po 1 minutu a 72 °C po 2 minuty. PCR produkty byly štěpeny Dam HI a Hind III a subklonovány do těchto míst Bluescriptu KS /Stratagene, 11099 North Torrav Pines Road,

La Jolla, CA 92037/. Subklony byly charakterizovány sekvenováním s T3 primerem. Amplifikovaný fragment z jednoho z těchto subklonů, SMI, byl dále použit pro prohledání na SMlobsahující gen, který kóduje sialyltransferásu.

Klonování SMI obsAHUJ9C9HO GENU

Náhodně primovaná cDNA z mozků novorozených krys byla ligována s EcoRI-Notl linkery a pak následovně ligována do EcoRI štěpeného «AgtlO. Výsledná knihovna byla pakážována za použití Stragene Gigapack II pakážovacího extraktu a umístěna na plotnu s E.coli C600 hfl. Přibližně 10^ť plaků bylo prohledáno klonovaným Sílí PCR fragmentem. Čtyři klony, STX-4, byly čištěny a subklonovány do Notl místa Bluescriptu /STratagene/ pro další analýzu.

Northern analýza

Celková RNA z krysích tkání byla připravena za použití kyselého fenolového postupu jak bylo popsáno dříve /Chomoznsyi P. a kol., Anal.Biochem. 162, 136159/1987//. Vzorky RNA novorozenců byly elektroforezovány v 1% agarosovém gelu, obsahujícím formaldahyd, přeneseny na nitrocalulosu a hybridizovány podle standardních postuoů /Kriegler M. Gene transfer and expression, Stockton Press, N.Y. N.Y./1990//. Northern bloty byly sondovány s 900 bp Eco RI fragmentem izolovaným z STX1, čištenvm na gelu a radiaktivně značeným.

Konstrukce rozpustné formy STX

Zeslabená forma STX, postrádající prvních 31 aminokyselin otevřeného čtecího rámečku, byla připravena PCR amplifikací s 5'primerem, obsahujícím v rámečku 3an HI místo a 3' primer umístěný 50 bp proti směru od stop kodonu. Amplifikace se provádí ve 30 cyklech při 94 °C po 1 minutu, °C po 1 minutu a 72 °C po 2 minuty. Fuzní vektor pGIR201 protA byl konstruván inzertováním BcII/3am HI fragmentu, izolovaného z pRIT5 /Pharmacia LKE Biotech, Inc.,1025 Atlantic Avenue, Suitě 101, Alameóa, CA 94501/, kódujícím protein A IgG vazebnou doménu do 3am HI místa pGIR201 /dar od Dr.X.Drickamera, Columbia University/. Amplifikovaný fragment byl subkloncván do Ba/n HI místa pGIR201protA což vede k fúzi STX do .inzulínové signální sekvence a protenu A přítomnému ve vektoru. Nhe fragment, obsahující fuzní protein byl subklcnován do plasmidu pSVL a vznikne expresní plasmid AX78.

Exprese rozpustné formy STX

Expresní plasmid AX78/10 ug/ byl transfektován do CO5-1 buněk na 10 cm plotnách. Dva dny po transfekci bylo odděleno kultivační medium a inkubováno 3 IgG sepharosou /Pharmacia/ po 1 hodinu při teplotě místnosti. Kuličky byly sledovány na aktivitu sialyltransferásy za použití oligosacharidů, nemrznoucího clykoproteinu, směsných gangliosidů a neuraminidásou zpracovaných membrán mozků novorozených krys jako akceptor substráty. Transfer kyseliny sialové k těmto akceptorům byly měřeny za použití iontovýměnné /“einstein J. a kol., J.Biol.Chem.257, 13235-13844/1982//, dělením podle velikost.! /Id./ a descendentní papírovou chromatografií /IlcCoy R.D., a kol., J.Biol.Chem. 260 1269512699/1935//.

Stejné transfekce byly provedeny pro pulzně značené pokusy. Po 36 hodinách expresní periody byly plotny inkubovány při 37 °C se 2,5 ml DMEM-methion. Pc 1 hodině.se přidá •3 5

250 uCI' 5-translabel /Amersham, 2536 S.Clairebrook, Arlmgton Haights, IL 50005/ k mediu a plotny se inkubují po další 3 hodiny. Ka konci této doby se plotny promyjí a inkubují přes noc ’s kompletním DMEM. Značený fuzní protein se izoluje inkubací s IgG sefarosou /Pharmacia/. Po navázání se kuličky promyjí, vaří v Laemalli vzorkovém pufru a uvolněé pcoteiny se analyzují SDS-PAGE/fluorografií.

PCR amplifikace konzervované oblasti homologie podobné té, která byla nalezena v charakterizovaných sialyltransferásách Protože přibližně 70 % aminokyselin přítomných v konzervováno^ oblasti homologie charakterizovaných sialyltransferás je konzervováno, největší kontinuální oblasti se nacházejí v aminokyselinových sekvencích na koncích konzervované oblasti homologie /obr.11/. Aminokyselinová sekvence blízká C-terninálnímu konci konzervované oblasti homologie byla nalezena jako rozkládající se kontinuálně přes sedm neměnných zbytků. Silná konzervace této aminokyselinové sekvence umožňuje tvarovat relativně nízko komplexované oligonukleoti— dy s 256násobnou degenerací, které zahrnují všechny zjištěné variace v kodonovém obvyklém uspořádání. Dezén oligonukleo-70tidu, odocvídajjícího Π-terminálnínu konci konzervované oblasti homologie byl obtížnější. Aminokyseliny přítomné v této obasti vykazují větší variabilitu než ty, které byly nalezeny na opačném konci konzervovaná oblasti homologie. Oligonukleotidový dezén byl dále komplikován vysokou kodonovou nadbytečností aminokyselin. 2a účelem kompenzace těcto oligonukleotid z 5' konce konzervované oblasti homologie byl syntetizován s 1025násobnou degenerací. Zatímco tento stupeň komplexity je blízký prahové hodnotě degenerace dostupné v PCR experimentech byl výsledný primer považován pro všechny nukleotidové sekvence za kódující tuto oblast konzervované oblasti homologie.

Neurální vývoj je komplexní proces,ve kterém jsou glykosyltransferásy podrobeny dynamické regulaci jak je zřejmé ze značných změn zjištěných v expresi buněčného povrchového karbohydrátu. Pro tento rys byly mozky krysích novorozených mláďat zvoleny jako zdroj pro dosažení izolace nových sialyltransferás; Za použití cDNA mozků novorozených krys jako templátu vedly PCR experimenty s degenerovanými primery k amplifikaci 150 bp pruhu, ve shodě se známou velikostí konzervované oblasti homologie. Subklonování a sekvenování naznačuje, že pruh je směs dvou DNA fragmentů.

Ze třiceti izolátů je 55 % kóduje^- Λ konzervovanou oblast homologie, Sílí. S překvapením Slil obsahuje pět změn v aminokyselinách, které byly nalezeny jako invariantní ve třech dříve klonovaných sialyltransferásách. Zatímco tyto změny snižují celkový počet neměnících se zbytků, nová informace o sekvenci poskytnutá charakterizací SMI zvyšuje celkovou konzervaci shody sekvencí.

Předpověděná aminokyselinová sekvence SMI nevykazuje dispozici k jakékoliv konzervované oblasti homologie. V některých polohách /aminokyseliny 1,2,53,54/SMl je podobný

2,6 konzervované oblasti homologie; v jiných polohách /aminokyseliny 8,9,54,55/ SMI odráží sekvence nalezené v ^,.2,3 konzervované oblasti homologie. I když konzervovaná

-71oblast homologie je z 35% konzervována,tato rovnováha podobností vede v SMI k přibližně 45%homologii k jiným členům rodiny sialyltransferásových genu.

Primární struktura SMI obsahujícího genu

Sekvenční analýza 1,5 kb klonu STXl identifikující kontinuální 375 aminokyselinový otevřený čtecí rámeček, který kóduje SMI konzervovanou oblast homologie charakterizovanou v dřívějších PCR experimentech /obr. 14/. Dedukovaná aminoyselinová sekvence STXl potvrzuje, že tento protein je typ II transmembránového proteinu jaký byl pozorován u každé z jiných klonovaných glykosyltransferás. Předpověděná aminokyselinová sekvence STXl indikuje přítomnost hydrofobní oblasti osmi zbytků z aminokonce proteinu, které by mohly sloužit jako signál kotevní doména. Konzervovaná oblast homologie je umístěna blízko centra proteinu. Celková velikost STX proteinu a-relativní polohy jak hydrofobní oblasti tak konzervované oblasti homologie zřetelně připomínají charakteristiky primární sekvence klonovaných sialyltransf erás. Ačkoliv STX nevykazuje žádnou homologii ke klonovaným sialyltransferásám jinou než ke konzervované oblasti homologie vyložené strukturní podobnosti těchto genů jasně znamenají, že STX představuje nejnovějšího člena téro genové rodiny.

Enzymatická charakterizace STX

Přirozeně se vyskytující rozpustné formy sialyltransferás mohou být nalezeny v různých sekrecích a tělních tekutinách /Paulson J.C., a kol., J.Biol. Chem. 252 23562367/1977/ a Hudgin R.L., a kol., Can.J.Biochem.49 829837/1971//. Tyto rozpustné formy vznikají z proteolytického

-72štěpení štěpením stem oblasti sialyltransferásy uvolněním katalytické domény z transmembránové kotvy. Rozpustné sialyltransferásy monou být konstruovány rekombinantne nahrazením endogenní domény signál-kotva štšpitelnou signillní sekvencí /Colley X.J. a kol., J.Biol.Chem., 264 17619-17622/1989//. Za účelem usnadnění funkční analýzy STX byla generována rozpustná forma proteinu nahrazením prvních 31 aminokyselin štěpitelnou inzulínovou signální sekvencí a protein A IgG va zebnou doménou. IgG vazebná doména byla zahrnuta do konstrukce za účelem usnadnění detekce rozpustného STX proteinu.

Podobné fuze s ST2U jsou selektivně sekretovány z exprimujících buněk, navázány IgG sepharosou a jsou enzymaticky aktivní .Jestliže byl expresní plasmid, obsahující fúzi protein A/STX /AX73/ exprimován v COS-1 buňkách, byl izolován 85 kd protein. Velikost fuzního proteinu je přibližně o 15 kd větší než předpověděná molekulová hmotnost peptidu, což potvrzuje, že je zda využíváno mnoho STX potenciálních X-napojených glykosylačních míst.

Vymezený fuzní protein byl zkoušen na sialyltransferásovou aktivitu za použití mnoha akceptor substrátů. Aktivita nebyla detsgována za použití β-galaktosidových akceptorů, obsahujících GalBl,3/4/GlcNAc sekvence; podobně nebyl detegován žádný transfer sialové kyseliny k O-napojeným oligosacharidům nemrznoucího glykoproteinu. Exprese STX v mezkové tkáni potvrzuje, že gen bude zahrnut v biosyntézs glykolipidů. Nicméně směsné gangliosidy izolované zmezků hovězích dospělců slouží špatně jako akceptor substrát. Neuroamidasou ošetřené membrány mozků novorozenců byly pouze substrátem k vykázání i marginální schopnosti sloužit jako akceptor. Inkubace ošetřených membrán s STX fuzním proteinem vede k 50% zvýšení aktivity vůči základu.

-73Vývoj a tkáňově specifická exprese

Za účelem stanovení typu exprese a STX genu byly Northern bloty sondovány fragmentem izolovaným z STXi. Z různých ných hybriáizací s 5,5kb přenašečem byla pozorována v RHA mozků .novorozených krys velikosti přenosu s 900 bp EcoRI tkání zkoušehybri.dizace pouze . Nebyla pozorován saana říčová hybridizace ořisluěn konzervované oblasti homologie. Omezená exprese STX je odchylkou od rozdílné tkáňové specifické exorese nalezené v charakterizovaných závisle ťh-v — sialyltransferásách. I když je každý z těchto genů ne regulován v důsledku různých typů výstupu specifické prese, je obecně každá sialvltransfarása variabilně ex na v mnoha rozdílných tkáních /Paulson J.C. a kol., primováJ.

3iol.Chem. 254 10931-10934/1989//. na rozdíl od toho je ΞΤΧ pouze exprimována v mozku novorozence; exprese se nejeví být zobecněným emryonickým fanomenem, protože přenašeč nebyl detegován v ledvinách novorozence.

Claims (34)

1. Sialyltransferása v podstatě prostá substancí, nacházejících se v in vivo fyziologickém prostředí s tou podmínkou, že sialyltransferása je jiná než krysí

GalBl, ÓGlcIIAc 0^2,6 sialyltransferása.

2. Sialyltransferása podle nároku 1, která je rozpustná ve vodě.

3. Sialyltransferása podle nároku 1 ve které je předem stanovený aminokyselinový zbytek nahrazen, inzertován nebo vypuštěn.

4. Sialyltransferása podle nároku 3, ve které je aminokoncová transmembránově doména vypuštěna.

5. Sialyltransferása podle nároku 3, kde je aminokoncová cytoplasraatická doména vypuštěna.

6. Sialyltransferása podle nároku 3, kde jsou aminokoncové transmembránově, cytoplasmatické a stem regionové domény vypuštěny.

7. Sialyltransferása podle nároku 1 nedoprovázená nativní glykosylací s tou podmínkou, že sialyltransferása je jiná než krysí GalBl, 4GlcIIAc ¢/2,6 sialyltransferása.

8. DNA izolát kódující sialyltransferásu s tou podmínkou, že uvedený DNA izolát je jiný než krysí Gal Bl,4GlcNAc X.2,6 sialyltransferása.

-758. Izolát podle nároku 3 prosty sialyltransferá sových intronů.

10. Izolát podle nároku 8, který je prostý genomickó DMA kódující jiný polypeptid,kde DNA je ze stejného druhu jako DNA izolát.

11. Izolát podle nároku 3, kde DNA kóduje sialyltransferásu, obsahující konzervovaný region hornologie alespoň 20 aminokyselin.

12. Izolát podle nároku 8, kde DNA. kódující sialyltransferásu obsahuje sialyltransferásovou konzervovanou oblast hornologie alespoň 5 aminokyselin z heptapeptidu -Asp-Val-Gly-Sar-Lys-Thr—Thr.

13. Izolát podle nároku 12, kde konzervovaná oblast alespoň asi heptapeptidový motiv vybraný z aminokyselinových zbytků 155-210 aminokyselinové sekvence z obr. 2.

14. Izolát podle nároku 13, kde heptapeptidovým motivem je -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr.

15. Izolát podle nároku 12, kde konzervovaná oblast je alespoň asi heptapeptidový motiv vybraný z aminokyselinových zbytků 142-1SS aminokyselinové sekvence z obr. 1.

15. Izolát podle nároku 15, kde heptapeptidovým motivem je -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr.

17. Izolát podle nároku 3, kde DMA sialyltransferásy obsahuje konzervovanou oblast hornologie alespoň asi 48 aminokyselin.

13.

Izolát podle nároku 17, kde konzervovaná oblast homologie alespoň asi 55 aminokyselin je vybrána z aminokyselinových zbytků 155-210 aminokyselinové sekvence z » obr.2.

i 19. Rekombinantní expresní vektor, obsahující DNA kódující sialyltransferásu s tou podmínkou, že uvedenou sialyltransferásou není krysí Galů-1,4GlcN.Ac ¢(2,5 sialyltransferása.

20. Přípravek, obsahující buňku transformovanou rekombinantním expresním vektorem podle nároku 19.

21. Přípravek podle nároku 20, kde buňkou je eukaryotická buňka.

22. Způsob produkce sialyltransferásy,v yznačují c í se tím ,že zahrnuje konstruování vektoru, majícího DNA kódující sialyltransferásu, transformování hostitelské buňky vektorem a kultivaci transformované buňky s tou podmínkou, že uvedenou sialyltransferásou nejití

GalBl,4GlcNAc <2,5 sialyltransfarása.

23. Způsob podle nároku 22,vyznaču⁴ jící se tím, že dále zahrnuje stupeň získání uvedené sialyltransfarása.

24. Způsob podle nároku 23,v yznačující se tím, že hostitelskou buňkou je eukaryotická buňka.

25. Způsob podle nároku 24,vyznačující se t í m ,že eukaryotickou buňkou je CCS buněčná linie.

-7C

26. Způsob podle nároku 24,v yznačující tím, že eukaryotickou buňkou je buněčná linie ledvin lidského embrya.

27. DNA izolšt kódující polypeptid, mající aminosekvenci uvedenou na obr.l nebo obr. 2.

28.

Způsob produkce DNA, kočující sialyltransferásu, vyznačující tím, že zahrnuje

a. přípravu oligcaukleotidových sond, odpovídajících sialyltransf erásové konzervované oblasti homologie,

b. prohledání hybridizací DNA knihovny za použití oligonukleotidových sond,

c. detekci hybridizace ze stupně b a

d. získání produktu ze stupně c.

29. Způsob podle nároku 28,vyznačující se tím, že oligonukleotidová sonda má nukleotidovou sekvenci, kódující Asp-Val-Gly-Ser-Lys-'rhr-Thr nebo její varianty.

30. Způsob získání DNA, kódující sialyltransferásu,v yznačující se tím ,že zahrnuje a/ konstrukci nukleokyselinové knihovny, obsahující gen, kódující sialyltransferásu, b/ amplifikaci DNA kódující sialyltransferásu použitím polymerásové řetězové reakce /PCR/ použitím primeru, který se váže k bázovým párům, kódujícím alespoň asi 5 aminokyselin z heptapeptidu v konzervované oblasti homologie, c/ subklonování PCR produktů do vhodného vektoru, d/sekvenování individuálních PCR klonů pro identifikování klonu s konzervovanou oblastí homologie , e/ prohledání nukleokyselinové knihovny za použiti produktu ze stupně D/ a f/ získání produktu ze stupně e/.

7ί·

31. Izolát oodle nároku -i, kde alespoň 17 aminokyselin

48 aminokyselin sekvence 156 — 210 na obr.2 je konzervováno.

32. Izolát podle nároku za 48 aminokvselin sekvence

2, kde alespoň 17 aminokyselin 142-125 na obr. 1 je konzervováno .

33. Sialyltransferása podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci jako na obr.14·.

34. DNA izolát podle nároku 3, mající nukleotidovcu sekvenci jak je uvedena na obr. 14.

35.

uveaena

REkombinantní expresní vektor podle nároku 13, kde DNA má nukleotidcvou sekvenci jak je uvedena na obr.

14 .

35. Přípravek, obsahující, buňku transformovanou rekombinantním expresním vektore?! podle nároku 35.

37. Způsob podle nároku 22,vyznačuj ící se t í m ,že uvedená DNA má nukleotidovou sekvenci jak je uvedena na obr.14.

38. DNA fragment, kódující konzervovanou oblast homologie.

39. DNA fragment podle nároku 33, mající nukleotidovou sekvenci jak je uvedena na obr. 13.