FI119692B - Koostumuksia ja menetelmä sialyylitransferaasien identifioimiseksi ja syntetoimiseksi - Google Patents

Description

Koostumuksia ja menetelmiä sialyylitransferaasien identifioi miseksi ja syntetoimiseksi - Kompositioner och förfaranden för identifiering och syntetisering av sialyltransferaser 5 Tämä keksintö liittyy sialyylitransferaasigeeniperheeseen, ryhmään glykosyylitransferaaseja, jotka saavat aikaan hiili-hydraattiryhmien terminaalisialylaation glykoproteiineilla, glykolipideillä ja oligosakkarideilla ja jotka sisältävät 10 konservoitaneen homologia-alueen katalyyttisellä domeenilla. Galpl,3-GalNAc-a2,3-sialyylitransferääsi ja Gall,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferääsi ovat sialyylitransferaasigeeniper-heen jäseniä. Keksintö liittyy myös niiden uusiin muotoihin ja koostumuksiin, ja erityisesti tapoihin ja menetelmiin, 15 joilla identifioidaan ja tuotetaan sialyylitransferaasi-geeniperheen jäseniä homogeenisuuteen merkittävän käyttökelpoisina määrinä. Tämä keksintö liittyy myös sialyylitransfe-raasituotantoa koodaavan eristetyn deoksiribonukleiinihapon (DNA) valmistamiseen, menetelmiin aikaansaada DNA-molekyyle-20 jä, jotka koodaavat sialyylitransferaaseja, ihmisen ja muiden nisäkkäiden sialyylitransferaasien ekspressoimiseen tällaista : DNA: ta käyttämällä samoin kuin uusiin yhdisteisiin, joita • · · :***j ovat uudet sialyylitransf eraase ja tai niiden fragmentteja • · koodaavat uudet nukleiinihapot. Tämä keksintö kohdistuu myös • m 25 sialyylitransferääsi-johdannaisiin, erityisesti sellaisiin johdannaisiin, joilta puuttuu proteiinin sytoplasminen ja/tai transmembraaninen osa, sekä niiden tuottamiseen yhdistelmä- • · · * * DNA-tekniikoin.

30 Sialyylitransferaasit ovat entsyymiperhe, jonka jäsenet kata- • · · :...· lysoivat sialihapon (SA) siirtymistä glykolipidien ja oligo- .·.: sakkaridien hiilihydraattiryhmien terminaaliosiin yleisreak- • · · .···. tiolla: • · • · · • · *.*.· 35 Sytididiini-5-monofosfaatti-sialihappo (CMP-SA) + HO-akseptori—^CMP + SA-O-akseptori (Beyer T.A. et Adv. Enzynol. 52:23-175, 1981) 2

Sialyylitransferaaseja esiintyy pääasiallisesti solujen Golgin laitteessa, jossa ne osallistuvat post-translatio-naalisiin glykosylaatioreitteihin (Fleischer, B.J. Cell Biol. 89:246-255, 1981). Niitä esiintyy myös ruumiinnesteissä, esi-5 merkiksi rintamaidossa, kolostrumissa ja veressä. Tarvitaan vähintään 10-12 erilaista sialyylitransferaasia syntetoimaan kaikki tunnetut sialyylioligosakkaridisekvenssit. Kaikista niistä täytyy entsymaattisesti erottaa spesifisyys akseptori-oligosakkaridisekvenssille ja anomeerinen sidos sialihapon ja 10 sokerin välillä, johon se on liittynyt. Neljä sialyylitrans-feraasia on puhdistettu. (Beyer et ai, ibid; Weinstein J. et ai, J. Biol. Chem. 257:13835-13844, 1982; Miagi T. and Tsuiki S., Eur. J. Biochem. 125:253-261, 1982; Joziasse, D.H. et ai, J. Biol. Chem. 260:4941-4951, 1985). Tarkemmin sanoen on 15 puhdistettu rotan maksan membraaneista Galpl,4GlcNAc a2-6-sialyylitransferaasia ja Galpl,3-(4)GlcNAc-a2-3-sialyyli-transferaasia (Wein-stein et ai, ibid).

Muita glykosyylitransferaaseja on eristetty liukoisina 20 entsyymeinä seerumista, maidosta tai kolostrumista, muun muassa sialyyli-, fukosyyli-, galaktosyyli-, N-asetyyli- : glukosaminyyli- ja N-asetyyligalaktosaminyylitransferaaseja • · · ·*·*. (Beyer et ai, ibid) . Naudan ja ihmisen R-N-asetyyligluko- • · ^ samidi βΐ, 4-galaktosyylitransferaasia on eristetty (Narimatsu 25 H. et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 83:4720-4724, 1986, *'*! Shaper N. L. et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 83:1573-1577, • · · **" 1986; Appert H.E. et ai. Biochem. Biophys. Res. Common • · · ’·’ 139:163-168, 1986; Humphreys-Beyer M.G. et ai, Proc. Nat.

Acad. Sei. USA 83:8918-8922, 1986). Nämä puhdistetut glyko- 30 syylitranseferaasit ovat erikokoisia, mikä saattaa johtua • · · *...ί siitä, että on poistettu proteiinien osia, jotka eivät ole .·. : ratkaisevan tärkeitä aktiivisuudelle, esimerkiksi membraanin • · · .··.) kattavat domeenit (membrane spanning domains) .

• · • · · • · *.·.· 35 Verrattaessa aminohapposekvenssejä, jotka on johdettu cDNA- • · · Σ,,.ϊ klooneista, jotka koodaavat glykosyylitransf eraaseja, mukaan lukien galaktosyylitransferääsit, sialyylitransferääsi, fuko-syylitransferääsi ja N-asetyyligalaktosaminyylitransferääsi, 3 paljastuu, että näillä entsyymeillä ei ole käytännöllisesti katsoen lainkaan sekvenssihomologiaa. Jonkinlaista selvitystä siitä, kuinka tämä glykosyylitransferaasiperhe saattaisi rakenteellisesti olla sukua keskenään on tullut esiin 5 tuoreessa kloonattujen sialyylitransferaasien primaariraken-teiden analyysissä (Weinstein J. et ai, ibid). Joka tapauksessa niillä kaikilla on lyhyt NH2-terminaalin sytoplasminen häntä, 16-20 aminohapon signaali/kiinnittymisdomeeni (signal-anchor domain) sekä pitkä runkoalue, jota seuraa laaja COOH-10 terminaalikatalyyttinen domeeni (Weinstein et ai, J. Biol. Chem. 262:17735-17743, 1987; Paulson J.C. et ai, J. Biol.

Chem. 264:17615-17618, 1989). Signaali/kiinnit tyrni sdomeenit toimivat sekä pilkkoutumattornina signaalipeptideinä että membraania kattavina alueina ja ohjaavat näiden glykosyy-15 litransferaasien katalyyttisiä domeeneja Golgin laitteen ontelossa. Glykosyylitransferaasien perheistä, joilla on samat akseptori- tai donorisubstraatit voisi odottaa yhteisiä aminohapposekvenssejä, mutta glykosyylitransferaasien katalyyttisiltä domeeneilta on löytynyt yllättävän harvoja homo-20 logia-alueita, eikä merkittävää sekvenssihomologiaa ole havaittu minkään muun GenBank-proteiinin kanssa (Shaper N.L.

: et ai, J. Biol. Chem. 216:10420-10428, 1988; D'Agostaso G. et ··· ·1·1: ai, Eur. J. Biochem 183:211-217, 1989; Weinstein J. et ai, J.

• ·

Biol. Chem. 263:17735-17743, 1987). Tämä on erityisen yllät- 25 tävää Gal al,3-GT:n ja GlcNAc- pl,4-GT:n, kahden galakto- syylitransferaasin kohdalla. Vaikka näillä galaktosyylitrans- ‘HI feraaseilla ei olekaan yleistä homologiaa, on olemassa yhtei- • · · *** nen heksapeptidi KDKKND Gal al,3-GT:llä (naudan, 304-309) ja RDKKNE GlcNAc El,4-GT:llä (naudan, ihmisen, hiiren aminohapot 30 346-351). (Joziasse et ai, J. Biol. Chem 264:14290-14297, O 1989.) • · • · · • · · • · .···. Sialihapot ovat päätesokereita glykoproteiineissa ja glykoli- • · 11 pideissä läsnä olevissa hiilihydraattiryhmissä, ja ne ovat • · 35 laajalti jakautuneina eläinkudoksissa (Momol T. et ai, J. :...· Biol. Chem. 261:16270-16273, 1986). Sialihapoilla on tärkeä osuus hiilihydraattirakenteiden biologisissa funktioissa pää-tyasemansa johdosta. Sialihappo toimii esimerkiksi ligandina 4 influenssaviruksen sitoutumisessa isäntäsoluun (Paulson J.C., The Receptors, Voi. 2, Conn P.M., Ed, pp. 131-219, Academic Press, 1985). Muutos sialihapon liitoksessa riittää muuttamaan isäntäspesifisyyttä (Roger G.N. et ai, Nature 304:76-78, 5 1983). Hermosoluadheesiomolekyyli (NCAM) on kohteena kehitys- säädellyssä polysialylaatiossa, jonka uskotaan moduloivan NCAM-välitteistä soluadheesiota hermoston kehityksen aikana (Rutishauser U. et ai, Science 240:53-37, 1988 ja Rutishauer U., Adv. Exp. Med. Biol. 265:197-18, 1990). Äskettäin erään 10 hiilihydraattirakenteen, sialyyli Lewis X:n (SLex) on osoitettu toimivan ligandina endoteeliselle leukosyyttiadheesio-molekyylille ("E-Selectin"), joka välittää neutrofiilien sitoutumista aktivoituihin endoteelisoluihin (Lowe et ai, 1990; Phillips et ai, 1990; Goelz et ai, 1990; Waltz et ai, 15 1990; Brandley et ai, 1990). Myös p-selektiinin (verihiutale- aktivaatioriippuvainen jyvänen eksternaalimembraaniproteii-nille; CD62), selektiiniperheen erään toisen jäsenen (Stool-man L.M., Cell 56:907-910, 1989), on osoitettu tunnistavan monosyyteissä ja PMN:ssa läsnä olevan SLex:n (Larsen et ai, 20 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6674-6678, 1990; Momol et ai, J. Biol. Chem. 261:16270-16273, 1986, Polley et ai, Proc.

: Natl. Acad. Sei. USA 88:6224-6228, 1991; Chan K.F.J., J.

• · · ·*.*. Biol. Chem. 263:568-574, 1988; Beyer T.A. et ai, Adv.

• ·

Enzymol. 52:23-175, 1981). Molemmissa tapauksissa sialihappo • · 25 on avainkomponentti hiilihydraattirakenteen ligandina toimi- *’*! miselle. Paitsi osallistuvan soluadheesioon sialihappoa si- • · · ***· sältävien hiilihydraattirakenteiden on implisoitu vaikuttavan • · · suoraan erilaistumiseen. Hematopoieettinen solulinja HL-60 voidaan indusoida erilaistumaan glykolipidi GM3 -käsittelyllä. 30 Myös gangliosidien on oletettu osallistuvan kasvutekijäprote- • · · iinikinaasiaktiivisuuksien muunteluun ja solusyklin sääte- : lyyn.

• · · • · • · · • · • φ *!* Eräs tällainen sialyylitransf erääsi on puhdistettu kuten ·,·.* 35 kuvaa US-patentti 5047335. Vaikka "puhdistettuja" sialyyli- • · · i<>#: transferaaseja onkin ollut jonkin verran saatavilla, niitä on saatavilla erittäin pieniä määriä osaksi siksi, että ne ovat endoplasmakalvoston ja Golgin laitteen kalvosidonnaisia pro- 5 teiineja. Näiden sialyylitransferaasien puhdistukseen liittyvät huomattavat vaatimukset, niin taloudelliset kuin työtä koskevat, ovat syy, jonka vuoksi ne ovat harvinaista materiaalia. Esillä olevan keksinnön eräs kohde on eristää sialyy-5 litransferaasia koodaavaa DNA:ta ja tuottaa käyttökelpoisia määriä nisäkkään, erityisesti ihmisen sialyylitransferaasia käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita. Kohteena on myös tapa aikaansaada muita sialyylitransferaasigeeniperheen jäseniä koodaavaa DNA:ta eri kudoksista samoin kuin eri lajeilta. 10 Esillä olevan keksinnön kohteena on myös valmistaa uusia sialyylitransferaasimuotoja. Lisäksi eräs kohde on aikaansaada entistä parempi väline katalysoida sialihapon siirtyminen päätyasemaan tietyillä hiilihydraattiryhmillä. Nämä ja muita tämän keksinnön kohteita selviää selityksistä kokonaisuu-15 dessaan.

Tämän keksinnön kohteet on saatu menetelmin, joissa: identifioidaan ja kloonataan geenejä, jotka koodaavat nisäkkään sialyylitransferaaseja (määritetty jäljempänä), joista niihin 20 rajoittumatta voidaan mainita sian Galpl,3GalNAc-a2,3- sialyylitransferääsi ja rotan Gall,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyyli- : transferaasi (muu kuin rotan GalEl, 4GlcNAc-a2,6-sialyyli- ··· ·*·*. transferaasi, viedään tämä geeni yhdistelmä-DNA-vektoriin, • · transformoidaan sopiva isäntä tämän geenin sisältävällä 25 vektorilla, ekspressoidaan nisäkkään sialyylitransferaasi- **" geenejä tällaisessa isännässä ja otetaan muodostunut nisäk- *”* kään sialyylitransferaasi talteen. Vaihtoehtoisesti voidaan • · · ·* * käyttää useita muitakin yhdistelmä-DNA-tekniikoita sialyyli transf eraasiekspression aikaansaamiseksi. Esillä olevan kek- • · « 30 sinnön avulla on mahdollista myös tuottaa nisäkkään sialyyli- • · · •...J transferaasia ja/tai sen johdannaisia yhdistelmä-DNA-teknii- .·. : koin samoin kuin antaa käyttöön tapa tuottaa tällaisia si- • · · * · .···. alyylitransf eraasej a. Sialyylitransf erääsi t ovat pieninä • · pitoisuuksina esiintyviä proteiineja ja niitä on vaikea puh- • · *.·.· 35 distaa. Sialyylitransferaasigeenien eristäminen ja identifi- • · · ϊ.,.ϊ ointi oli äärimmäisen vaikeaa. mRNA oli harvinaista, eikä solulinjoja tai muita runsaan mRNA:n lähteitä ollut saatavilla. Tämä keksintö tuo ensimmäistä kertaa esiin sialyyli- 6 transferaasigeeniperheen, jolle on ominaista konservoitunut homologia-alue entsyymien katalyyttisellä domeenilla.

Tämä keksintö kohdistuu koostumuksiin ja menetelmiin tuottaa 5 nisäkkään sialyylitransferaaseja yhdistelmä-DNA-tekniikoin vaiheina: 1) entsyymin koko DNA-sekvenssin ja sitä sivuavan 5’-alueen löytäminen ja tunnistus, 2) kloonien ja mainitun DNA-sekvenssin sisältävien ekspressiokuljettimien kokoaminen mahdollistaen tämän nisäkkään sialyylitransferaasiproteiinin 10 ekspressoitumisen sekä niiden fuusio- tai signaali-N-termi-naalikonjugaatit sekä 3) elinkelpoiset soluviljelmät ja muut ekspressiosysteemit, jotka ovat geneettisesti muuntuneita tällaisia vektoreita sisältäessään ja pystyvät tuottamaan nisäkkään sialyylitransferaasia. Tämä keksintö kohdistuu lisäk-15 si koostumuksiin ja menetelmiin tuottaa DNA:ta, joka koodaa nisäkään sialyylitransferaasin tuottamista soluissa. Vielä eräs tämän keksinnön kohde ovat uudet yhdisteet, mu-kaan-lukien deoksiribinukleotidit ja ribonukleotidit, joita käytetään valmistettaessa klooneja, jotka pystyvät ekspressoimaan 20 sialyylitransferaasia. Vielä eräs esillä olevan keksinnön kohde on sialyylitransferääsi, joka ei olennaisesti lainkaan : sisällä luonnossa esiintyviä aineita, joiden kanssa se tyy- • · · pillisesti esiintyy veressä ja/tai kudoksissa, ts. rekombi- • · nanttimenetelmin tuotettu sialyylitransf erääsi ei sisällä • · 25 kontaminantteja, joita tyypillisesti esiintyy sen fysiologi- **'* sessa ympäristössä in vivo. Lisäksi, valmistusmenetelmän • · · •”j mukaan, sialyylitransferääsi voi sisältää siihen liittynyttä • · · *·’ ’ glykosylaatiota enemmän tai vähemmän kuin materiaali, joka on saatu sen fysiologisesta ympäristöstä in vivo, ts. verestä 30 ja/tai kudoksesta. Tämä keksintö liittyy edelleen uusiin • · · sialyylitransf erääsi johdannaisiin, erityisesti johdannaisiin, .·[ ; jotka eivät sisällä sialyylitransferaasiaminoterminaalitäh- • · · !..* teitä, ts. johdannaisia, joissa ei ole lyhyttä NH2-sytoplas- • · *·* madomeenia tai hydrofobista N-terminaalisignaali/kiinnitty- • · 35 mis-sekvenssiä, joka muodostaa sialyylitransferaasitransmemb- : raani-domeenin ja runkoalueen.

• · · 7 Tämän keksinnön mukainen nisäkkään sialyylitransferääsi ja sen johdannaiset ovat käyttökelpoisia sialihappojen lisäämisessä glykoproteiineissa ja glykolipideissä läsnä oleviin hiilihydraattiryhmiin. Lisäksi sialyylitransferääsi ja sen 5 johdannai-set ovat entsymaattisesti käyttökelpoisia lisättäessä sialihappo sokeriketjuihin tuotettaessa hiilihydraatteja, jotka toimivat determinantteina biologisessa tunnistuksessa. Tällaisia sialyylitransferaasientsyymejä voidaan käyttää monientsyymisysteemeissä syntetoitaessa oligosakkari-10 deja ja johdannaisia (Ichikawa et ai, J. Am. Chem. Soc. 113:4698, 1991 ja Ichikawa et ai, J. Am. Chem. Soc. 113:6300, 1991). Viimeiseksi tuotakoon esiin, että DNA, erityisesti katalyyttisen domeenin konservoitunut homologia-alue, joka koodaa tämän keksinnön mukaista sialyylitransferaasigeeniper-15 hettä, on käyttökelpoinen antamaan käyttöön välineen kloonata geeni, joka koodaa muita sialyylitransferaasigeeniperheen jäseniä. Muunlaisetkin tavat käyttää sialyylitransferaasia ja sialyylitransferaasia koodaavaa DNA:ta ovat itsestään selviä alan ammattimiehelle.

20

Kuvio 1 on sian GalSl,3GalNAc-a2,3-sialyylitransferaasin j ("a2,3-0") nukleotidi- ja aminohapposekvenssi. Sian a2,3-0 - • · · mRNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin suorittamalla kahdel- • · le limittäiselle kloonille, ASTI ja AST2, DNA-sekvenssi- • · 25 analyysi. Ennustetut a2,3-0 -polypeptidin aminohapot on esi- ”1! tetty DNA-sekvenssin yläpuolella ja ne on numeroitu analogi- • · · **** sen puhdistetun proteiinin N-terminaalin ensimmäisestä täh- • · · ·’ teestä. Oletettu signaali/kiinnittyrnissekvenssi on osoitettu (vaalea kehys). Mahdolliset glykosylaatiokohdat, sekvenssi 30 Asn-X-THR, on merkitty asteriskilla (1). Sekvenssi vastaa • · · a2,3-sialyylitransf eraasin pitkää muotoa, jota koodaavat li- .·. : mittäiset kloonit ASTI ja AST2, * · · • · · · • · • · *11 kuvio 2 on rotan Galpl, 3 (4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransf eraasin • · 35 ("a2,3-N") nukleotidi- ja aminohapposekvenssi. Rotan a2,3-N- • · t mRNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin DNA-sekvenssianalyy-sin avulla. Ennustetut sialyylitransferaasipolypeptidin aminohapot on esitetty DNA-sekvenssin yläpuolella ja ne on nume- 8 roitu kyp-sän proteiinin ensimmäisestä tähteestä N-terminaa-liproteiini-sekvensoinnilla määritettynä, kuvio 3 tuo esiin a2,3-0 sialyylitransferaasin puhdistamisen 5 CDP-heksanolamiiniagaroosin avulla (KCl-eluointi). Sian maksasta valmistettu 2 kg homogenaatti pantiin CDP-heksanolamii-niagaroosipylvääseen ja eluoitiin lineaarisella KCl-gradien-tilla (katso kohtaa Koemenetelmät). Proteiinipitoisuus ja sialyylitransferaasiaktiviivisuus laktoosi akseptorisubst-10 raattina määritettiin yksittäisten fraktioiden osalta. Kaksi entsyymiaktiivisuushuippua erotettiin yhdistelmiksi A ja B, kuvio 4 tuo esiin a2,3-0 sialyylitransferaasin puhdistamisen CDP-heksanolamiiniagaroosilla (pylväs III, CDP-eluointi). 15 Entsyymiaktiivisuudet määritettiin käyttämällä spesifistä ak-septorisubstraattia, jäätymistä estävää glykoproteiinia (AFGP). Pylväissä A ja B entsyymiaktiivisuuden eluointi korreloi vallitsevasti 48 kDA:n ja 45 kDa:n proteiinilajien kanssa (katso liite, SDS-PAGE). Näiden a2,3-sialyylitransfe-20 raasin kahden lajin, muodon A ja muodon B, spesifinen aktii visuus oli 8-10 yksikköä/mg proteiinia. 48 kDa:n ja 45 kDa:n lajit siirrettiin PVDF-membraanille ja analysoitiin NH2-ter- ·*·*: minaalisekvensoinnin avulla, • · ♦ · 25 kuviossa 5 tuodaan esiin a2,3-0 sialyylitransferaasinpepti- dien 48 kDa:n ja 45 kDa:n NH2-terminaaliaminohapposekvenssit. Lähellä 48 kDa:n peptidin NH,-terminaalia olevat 16 hydrofo- • bista aminohappoa, jotka käsittävät oletetun signaali/kiin-nittymis-domeenin, on alleviivattu, 30 • · · ·...· kuviossa 6 verrataan kahden sialyylitransferaasin domeeni- .\J rakententeita ja homologia-alueita. A: Asetettaessa vierek- ,···. käin cx2,6 sialyylitransferaasin ja a2,3-0 sialyylitransferaa- • · ’·* sin primaari-sekvenssit ilmenee 45 aminohapon alue, jolla • · *.·.· 35 sekvenssi-identtisyys on 64 % ja sekvenssisamankaltaisuus • ·· 84 %. B: Homologi domeeni kattaa liittymäalueen a2,6-sialyyli-transferaasin eksonien 2 ja 3 välillä ja sijoittuu molempien entsyymien katalyyttisille domeeneille, 9 kuviossa 7 on kahden α2,3-0 sialyylitransferaasin cDNA-kloo-nin restriktiokartta ja sevensointistrategia, 5 kuvio 8 tuo esiin liukenevan, katalyyttisesti aktiivisen a2,3-0-sialyylitransferaasin ekspression. A: Koottiin a2,3-0-sialyylitransferaasin liukenevan muodon ekspressoitumista ohjaava cDNA, sp-ST, korvaamalla villin tyypin sialyylitransferaasin sytoplasminen domeeni ja signaali/kiinnittyrnisdomeeni 10 insuliinisignaalipeptidillä; sp-ST:n predikoitiin isäntäso-luihin transfektoituneena koodaavan 38 kDa:n erittyvää prote-iinilajia. B: sp-ST insertoitiin ekspressiovektoriin pSVL ja transfektoitiin COS-1 soluihin; 48 tuntia transfektoinnin jälkeen soluja pulssileimattiin 2 tunnin ajan väliaineessa, 15 joka sisälsi Tran-35S-leimaa, sen jälkeen seurasi 5 tunnin jakso leimattomassa väliaineessa. Väliaine otettiin talteen, konsentroitiin 15-kertaiseksi ja analysoitiin SDS-PAGE/fluo-rografian avulla. Analysoitiin kaksoisnäytteet sp-ST- ja va-letransfektoitua soluväliainetta. C: COS-1 soluihin transfek-20 toitiin lipofektiiniä (+ sp-ST) tai pelkkää lipofektiiniä (vale-) aivan samaan tapaan kuin kohdassa 7B; 48 tuntia : transfektoinnin jälkeen väliaine koottiin, konsentroitiin 15- • · · ·*·*: kertaiseksi ja siitä tut-kittiin sialyylitransferaasiaktiivi- • · suus spesifisellä akseptorisubstraatilla AFGP (Sadler, J.E. 25 et ai, J. Biol. Chem. 254, 4434-4443, 1979), • · · · • · · ’”* kuviossa 9 on Gal a.2,3-N-sialyylitransf erääsi entsyymin pisim- • · · * * män sekvensoidun tryptisen peptidin CID-spektri. Peptidisek- venssi on Leu-Thr-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-His-Cys*-Arg, • · · + * 30 MH =1283,6. Cys edustaa karboksimetyylikysteiiniä. Ioneja, • · · ·...· joilla on varausretentio N-terminaalissa on merkitty ioneiksi .*.^5 a, b ja c, ja C-terminaali-ionit on merkittu fragmenteiksi x, .···. y ja z (Biemann, K, Meth. Enzymol. 193:886-887, 1990). Ensim- • · *1’ mäiset ionit (a, x) on saatu pilkkomalla α-hiili ja karbonyy- • · *.*.* 35 liryhmä. Ionit y ja b ovat muodostuneet peptidisidoksen pilk- • · · koutuessa. Ioneja c ja z on läsnä aminoryhmän ja a-hiilen pilkkoutumisen jäljiltä. Näiden fragmenttien numerointi on aina aloitettu vataavasta terminaalista. Sivuketjufragmentoi- 10 tumista esiintyy aminohappojen β- ja λ-hiilien välillä, tuloksena niin kutsutut d (N-terminaali) ja w (C-terminaali) -ionit. Taulukkoon on otettu mukaan havaitut fragmentit. Samaan ionisarjaan kuuluvat ionit on lueteltu riveittäin, 5 kuvio 10 on Gal a2,3-N-sialyylitransferaasientsyymin karbamy-loidun tryptisen peptidin CID-spektri. Peptidisekvenssi on Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys, MH+=771,5. Fragmentointi osoittaa selvästi muuntumista N-terminaalissa, ei lysiinitähteen 10 ε-aminoryhmässä. Runsas ioni kohdassa m/z 669 (w7) vahvistaa, että tässä peptidissä on läsnä N-terminaalileusiini. Asteriskilla merkityt ionit ovat taustaioneihin liittyvää matriisia (Falick et ai, Rapid Coiranun. Mass Spectrom. 4:318, 1990).

Taulukkoon on otettu mukaan havaitut fragmentti-ionit. Samaan 15 ionisarjaan kuuluvat ionit on lueteltu riveittäin, kuviossa 11 Galpl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferaasista (ST3N) johdetut peptidit 1 ja 11 on asetettu rinnakkain aiemmin kloonattujen sialyylitransferaasien kanssa.

20 Galpl,4GlcNAc-a2,6-sialyylitransferääsi (ST6N) ja

Galpl,3GalNAc-a2,3-sialyylitransferääsi (ST30) on esitetty : avoimina palkkeina. Väritetyt kehikot tarkoittavat signaali/- • · · ·*·*· kiinnittymissekvenssiä. Viivoitetut kehikot tarkoittavat kah- • · den sialyylitransferaasin välillä havaittua homologia-aluet- • · 25 ta, • · · · • · · **** kuviossa 12 nähdään kolmen kloonatun sialyylitransf eraasin • · · • * yhteinen konservoitunut alue. Kloonatut kolme sialyylitrans- feraasia ovat rotan Galpl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferaa-30 si (ST3N) , sian Galpl, 3GalNAc-a2,3-sialyylitransf erääsi ··♦ ί.,.ϊ (ST30) ja rotan Galpl, 4GlcNAc-a2,6-sialyylitransf erääsi .·] : (ST6N) . Alue koostuu 55 aminohaposta, Galpl, 3 (4) GlcNAc-a2,3- .···] sialyylitransf eraasin (ST3N) tähteestä 156 tähteeseen 210.

• · *!* Aminohappoidenttisyydet on osoitettu kehikoin, »·« kuviossa 13 on monistetun fragmentin, SMl, ennustettu aminohapposekvenssi ja vertailu aiemmin karakterisoituun konser-voituneeseen homologia-alueeseen. Konsensuskonservoitunut 35 11 homologia-alue luotiin vertailemalla kloonattjen ja karakterisoitujen sialyylitransferaasien ja monistetun SMl-fragmen-tin konservoituneita homologia-alueita. Muuttumattomat aminohapot on merkitty isoilla kirjaimilla, ja aminohapot, joita 5 on läsnä yli 50 % konservoituneella homologia-alueella on merkitty pienillä kirjaimilla. Kohdat, joissa esiintyy r tai q on merkitty b:llä ja kohdat, joissa esiintyy joko i tai v on merkitty x:llä. Alleviivatut aminohapot esittävät alueita, joita käytettiin degeneraattialukkeiden kokoamisessa. Monis-10 tetussa fragmentissa esiintyvät muutokset aiemmin muuttumattomissa aminohapoissa on merkitty asteriskein, kuviossa 14 on STXl:n nukleotidi- ja ennustetut aminohappo-sekvenssit. Pisimmän avoimen lukukehyksen ennustettu amino-15 happosekvenssi koodaa konservoitunutta SMl:n homologia-aluet- ta (aminohapot 154-208), joka näkyy varjostettuna kehikkona. Oletettu signaali/kiinnittyrnissekvenssi (aminohapot 8-23) on kehystetty ja potentiaaliset N-sitoutuneet glykosylaatiokoh-dat on alleviivattu.

20 Tässä käytettynä sialyylitransferaasilla tai sialyylitransfe- . raasijohdannaisilla tarkoitetaan muita sialyylitransferaasi- • · · entsyymejä kuin rotan Galpl, 4GlcNAc-a2,6-sialyylitransferaa-siä, jotka sisältävät konservoituneen homologia-alueen kata- • · . 25 lyyttisellä domeenilla ja jotka ovat entsymaattisesti aktii- • · · **” visia sialihapon siirrossa glykoproteiinien, glykolipidien, • · · ···· oligosakkaridien ja vastaavien sokeriketjujen päätyasemaan.

• · · *·' * Esimerkkejä entsymaattisesti funktionaalisista sialyylitrans- feraaseista ovat sellaiset, jotka pystyvät siirtämään siali-30 hapon CMP-sialihaposta akseptorioligosakkaridiin oligosak- * * * ϊ : kandiakseptorin vaihdellessa nimenomaisen sialyylitransfe- .* . raasin mukaan.

• · · • · · • · • · · • · ·;*’ " Konservoi tuneella homologia-alueella" tarkoitetaan sialyy- • · ϊ#ϊ#: 35 litransferaasin aminohapposarjaa, joka on olennaisesti ident- :***: tinen toisen sialyylitransferaasientsyymin saman aminohappo- • · · sarjan kanssa kun näiden kahden entsyymin sekvenssit on asetettu rinnakkain. Tämän keksinnön mukaisessa sialyylitransfe- 12 raasigeeniperheessä konservoitunut homologia-alue sijaitsee katalyyttisellä domeenilla ja kattaa vähintään 7 peräkkäistä aminohappoa, edullisesti vähintään noin 20 aminohappoa ja edullisimmin vähintään noin 55 aminohappoa, joilla on kuvion 5 2 aminohappotähteet 156-210 tai kuvion 1 tähteet 142-196. Kun konservoitunut homologia-alue on tunnistettu voidaan konser-voituneesta alueesta valmistaa aminohapposekvenssimuunnelmia, ne kuuluvat yhteen tai useampaan kolmesta luokasta: substi- tuoimalla, insertoimalla ja deletoimalla tehdyt muunnelmat. 10 Tavallisesti nämä muunnelmat valmistetaan suunnatuilla muta-geneesinukleotideillä DNA:ssa, joka koodaa sialyylitransfe-raasia, ja tuo-tetaan näin sialyylitransferaasia koodaavaa DNA:ta, joka sisältää konservoituneen homologia-alueen muunnelman .

15

Sialyylitransferaaseihin luetaan myös esimerkiksi rotan Galpl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferaasi (tästä eteenpäin sen nimitys on "a2,3-N"), joka muodostaa

NeuNAca2,3Galpl,3GlcNAc ja NeuAca2,3Galpl,4GlcNAc -sekvens-20 sit, jotka usein päättävät kompleksiset N-sitoutuneet oligosakkaridit. Eräs toinen esimerkki sialyylitransferaaseihin : kuuluvista entsyymeistä on sian Galpl,3GalNAc-a2,3-sialyyli- ·*.*· transferaasi (tästä eteenpäin sen nimitys on "a2,3-0"), joka • · muodostaa NeuAca2,3Galpl, 3GalNAc :n, jota esiintyy treoniiniin 25 tai seriiniin O-sitoutuneissa sokeriketjuissa samoin kuin *’*! terminaalisekvenssinä eräissä gangliosideissä.

···· ··« • · · • · · • Sialyylitransferaaseihin luetaan tässä myös sialyylitrans-feraasit, joissa on natiivi glykosylaatio ja kuvion 1 tai 2 • · · 30 mukaiset rotan tai sian sialyylitransf eraasin aminosek- ··· ·...· venssit, muiden eläinlajien analogiset sialyylitransferaasit .·. : kuten naudan, ihmisen tai vastaavien, samoin kuin muista • ·♦ • · .···. kudoksista saadut, tällaisten sialyylitransf eraasien degly- • · “* kosyloidut eli glykosyloimattomat johdannaiset, sialyyli- • ♦ 35 transferaasien amino-happosekvenssimuunnelmat samoin kuin in • · · ’...ί vitro luodut kovalenttiset sialyylitransf erääsi johdannaiset.

Kaikki nämä sialyylitransferaasimuodot sisältävät konservoi-tuneen homologia-alueen ja ovat entsymaattisesti aktiivisia 13 tai, elleivät, niillä on vähintään yksi immuuniepitooppi, joka on yhteneväinen entsymaattisesti aktiivisen sialyyli-transferaasin kanssa.

5 Sialyylitransferaasien aminohapposekvenssimuunnelmat kuuluvat yhteen tai useampaa kolmen ryhmästä: substituutio-, insertio-tai deleetiomuunnelmat. Tavallisesti nämä muunnelmat valmistetaan nukelotidien suunnatulla mutageneesillä sialyyli-transferaasia koodaavassa DNArssa, jolloin muodostuu muunnel-10 maa koodaavaa DNA:ta, ja ekspressoidaan sitten tätä DNA:ta rekombinanttisoluviljelmässä. Enimmillään 100-150 tähdettä sisältäviä sialyylitransferaasifragmenttimuunnelmia voidaan kyllä helposti valmistaa in vitro -synteesin avulla. Amino-happosekvenssimuunnelmille on ominaista, että niiden variaa-15 tioluonne on ennalta määrätty. Tämä piirre erottaa ne luonnossa esiintyvistä alleelisista tai lajien välisistä sialyylitransf eraasiaminohapposekvenssien muunnelmista. Konservoitaneen homologia-alueen muunnelmat ekspressoivat tavallisesti samaa kvalitatiivista aktiivisuutta kuin niiden luonnossa 20 esiintyvä analogi.

ϊ%ϊ ! Vaikka aminohapposekvenssimuunnelman sisäänviemiskohta voikin olla olla ennaltamäärätty, mutaation per se ei välttämättä • · tarvitse sitä olla. Kun esimerkiksi halutaan optimoida mutaa-25 tion tapahtuminen annetussa kohdassa satunnaismutageneesiä ···· .j. voidaan ohjata kohdekodonissa tai kohdealuella, ja ekspres- soituneet sialyylitransferaasimuunnelmat seulotaan optimaa- • · · ’ lista halutun aktiivisuuden yhdistelmää ajatellen. Tekniikat, joilla tehdään substituutiomutaatioita ennalta määrätyissä • · « *·:.* 30 DNA: n koh-dissa, joiden sekvenssit tunnetaan, ovat tunnet- • ·· *...· tuja, esimerkiksi Ml3-alukemutageneesi tai PCR-pohjainen mu- : tageneesi .

• · ··· • · • · ]·* Aminohapposubstituutiot koskevat tyypillisesti yhtä tähdettä, • · · *.·.* 35 insertoinneissa luokka on noin 1-10 aminohappotähdettä ja de- • · · leetioissa noin 1-30 tähdettä. Deleetiot tai insertiot on edullista tehdä vierekkäisin parein, ts. deletoida 2 tähdettä tai insertoida 2 tähdettä. Substituutioita, deleetioita, 14 insertointeja tai mitä tahansa niiden yhdistelmiä voidaan yhdistellä lopulliseen rakenteeseen pääsemiseksi. On selvää, etteivät muunnelmasialyylitransferaasia koodaavaan DNA:hän tehtävät mutaatiot saa sijoittaa sekvenssiä lukukehyksen 5 ulkopuolelle, ja edullisesti myöskään luoda komplementaarisia alueita, jotka saattaisivat tuottaa sekundaarisen mRNA-rakenteen (EP-75444A).

Substituutiomuunnelmia ovat sellaiset, joissa vähintään yksi 10 kuvion 1 tai 2 sekvenssin tähde on poistettu ja sen paikalle on insertoitu eri tähde. Tällaiset substituutiot tehdään tavallisesti taulukon 1 mukaan silloin kun halutaan tarkkaan moduloida sialyylitransferaasin ominaispiirteitä.

15 TAULUKKO 1

Alkuperä!sj äännös Es imerkki substituutio

Ala ser

Arg lys 20 Asn gin;his

Asp glu

Cys ser

Gin asn

Glu asp 25 Gly pro ·*·*; His asn; gin * Ile leu;val *·*“ Leu i le; vai

Lys arg; gin; glu ♦··· 30 Met leu;ile ··· Phe met; leu; tyr

Ser thr ·.· : Thr ser

Trp tyr 35 Tyr trp; phe : Vai ile; leu ··« • · ♦ « t·· ♦ · ♦ ♦ ♦ *·^* Toimintaan tai immunologiseen identiteettiin tehtävät olen- • · *···* 40 naiset muutokset tehdään valitsemalla substituutiot, jotka ovat vähemmän konservatiivisia kuin taulukossa 1 esiin tuo- • · .***. dut, ts. valitsemalla tähteitä, jotka ovat huomattavan eri- ··« laisia vaikutuksissaan ylläpitää a) polypeptidirungon rakennetta substituutioalueella, esimerkiksi levy- tai heliksimuo- 15 dossa, b) molekyylin varaus tai hydrofobisuus kohdepaikassa tai c) sivuketjukokonaisuus. Substituutiot, joiden tavallisesti odotetaan tuottavan suurimmat muutokset sialyylitrans-feraasiominaisuuksiin ovat sellaiset, joissa a) hydrofiilinen 5 tähde, esim. seryyli tai treonyyli korvataan (tai korvautuu) hydrofobisella tähteellä, esim. leusyylillä, isoleusyylillä, fenyylialanyylillä, valyylillä tai alanyylillä, b) kysteiini tai proliini korvataan (tai korvautuu) millä tahansa muulla tähteellä, c) tähde, jolla on elektropositiivinen sivuketju, 10 esim. lysl, arginyyli tai histidyyli korvataan (tai korvautuu) elektronegatiivisella tähteellä, esim. glutamyylillä tai aspartyylillä tai d) tähde, jolla on suuri sivuketju, esim. fenyylialaniini, korvataan (tai korvautuu) sivuketjuttomalla, esim. glysiinillä.

15

Eräs suuri substituutio- tai deleetiomuunnelmien ryhmä ovat sellaiset, joissa on mukana sialyylitransferaasin transmemb- raanisia ja/tai sytoplasmisia alueita. Sialyylitransferaasin sytoplasminen domeeni on aminohappotähdesekvenssi, joka alkaa 20 kuvioiden 1 ja 2 esiin tuomista lähtökodoneista ja jatkuu noin 11 lisätähteen verran. Rotan ja sian tähteiden 10-28 ja : vastaavasti 12-27 uskotaan toimivan siirtymistä estävänä ··# sekvenssinä. Konformaatiokaarteet, joita tähteet Phe-Val-Arg- • ·

Asn ja Pro-Met-Arg-Lys-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys rotalla ja vastaa- • · 25 vasti sialla, sekä näiden tähteiden elektropositiivinen luon- ***I ne yhdessä jäljempänä kuvattavan transmembraanisen alueen • · · **” kanssa estävät sialyylitransferaasin siirtymistä solukalvon : läpi.

30 Sialyylitransferaasin transmembraaninen alue sijaitsee sian ·»« sekvenssissä suurin piirtein tähteiden 12-27 kohdalla (jossa .·] : Ala on +1 kuten kuvio 2 tuo esiin) ja rotan sekvenssissä • · · I..* analogisella kohdalla. Tämä alue on on voimakkaan hydrofobi- • · *** nen domeeni, joka on sopivan kokoinen kattamaan solukalvon • · 35 lipidimolekyylikerroksen muodostaman kaksoiskelmun. Sen usko- • · · : : taan toi-mivan yhdessä sytoplasmisten domeenien kanssa ja ankkuroivan sialyylitransferaasin Golgin laitteeseen tai endoplasmakalvostoon sen kanssa.

16

Sytoplasmisen tai transmenibraanisen domeenin tai molempien deleetio tai substituutio helpottaa rekombinantti-sialyyli-transferaasien talteen ottamista vähentäessään solu- tai kal-5 volipidiaffiniteettia ja parantaessaan sen vesiliukoisuutta, niin ettei tarvita pinta-aktiivisia aineita sialyylitransfe-raasin pitämiseksi vesiliuoksessa. (Katso esimerkiksi oheen liitetty US-5032519, joka kuvaa liukoisen β-galaktosidi a2, G-sialyylitransferaasin tuottamista). Deletoitaessa pelkkä 10 sytoplasminen domeeni samalla kun transmembraaninen sekvenssi säilytetään muodostuu sialyylitransferääsi, joka täytyisi saattaa liukoiseksi pinta-aktiivisella aineella. Sialyylitransf erääsi , josta on deletoitu sytoplasminen domeeni inser-toituu todennäköisemmin kalvoihin mahdollistaen näin sen 15 entsymaattisen aktiivisuuden kohdistamisen. Edullisesti sytoplasma- ja transmembraanidomeenit deletoidaan mieluummin kuin substituoidaan (esimerkiksi aminohapot 1-33 rotan a2,3-N-sialyylitransferaasilla päätysiirtosekvenssi liukoisen sialyylitransferaasin tuottamiseksi).

20

Sytoplasma ja/tai transmembraani (C-T) -deletoidut tai -subs- : tituoidut s ialyyli trans f erääsi t voidaan syntetoida suoraan • · · ·*·*; rekombinanttisoluviljelmissä tai fuusiolla signaali sekvens- • · siin, edullisesti isäntähomologiseen signaaliin. Esimerkiksi 25 koottaessa prokaryoottinen ekspressiovektori C-T-domeenit ’*'1 deletoi-daan, niin että tilalle tulee bakteerialkaliinifosfa- ··· **“ taasi, lpp tai lämpöstabiili endotoksiini II johto-osa, ja • · · *·* * hiivoilla domeenit substituoidaan hiivainvertaasilla, alfa- faktorilla tai happofosfataasijohto-osilla. Nisäkkään solu-30 ekspressiossa C-T-domeenit substituoidaan nisääkkään solun ··· viruseritys johto-osalla, esimerkiksi herpex simplex gD -sig- : naalilla. Kun isäntä "tunnistaa" eritys johto-osan isäntäsig- .···, naalipeptidaasi pystyy pilkkomaan C-terminaalistaan C-T -de- • · *!* letoituun sialyylitransferaasiin fuusioituneen johto-osapoly- • · *.·.· 35 peptidin fuusion. C-T-deletoidun sialyylitransf eraasin etuna ··· on, että se voi erittyä viljelyväliaineeseen. Tämä muunnelma on vesiliukoinen, eikä sillä ole olennaista affiniteettia solukalvolipideihin, mikä siis huomattavasti yksinkertaistaa sen talteen ottamista rekombinanttisoluviljelmästä.

17

Lisäämällä pinta-aktiivista ainetta, esimerkiksi ionitonta pinta-aktiivista ainetta, voidaan liuottaa, stabiloida ja/tai 5 edistää membraanikiinnittymissekvenssin sisältävien proteiinien biologista aktiivisuutta. Esimerkiksi deoksikoolihappo on suo-siteltava pinta-aktiivinen aine, ja voidaan käyttää myös Tween NP-40:tä ja Triton X-100:aa samoin kuin muitakin pinta-aktiivisia aineita. Pinta-aktiivisen aineen valinnan 10 tekee harkintansa mukaan käyttäjä erityisten ympäröivien olosuhteiden ja käytettävän (käytettävien) polypeptidin (poly-peptidien) mukaan.

Substituutio- tai deleetiomutageneesiä käytetään poistamaan 15 N- tai O-sitoutuneita glykosylaatiokohtia. Vaihtoehtoisesti glykosyloimaton sialyylitransferääsi voidaan valmistaa rekom-binanttiprokaryoottisoluviljelmässä. Kysteiinin tai muiden labiilien tähteiden deleetiot saattavat nekin olla toivottavia, esimerkiksi haluttaessa lisätä sialyylitransferaasin 20 oksidatiivista stabiilisuutta. Potentiaalisten proteolyysi- kohtien deleetiot tai substituutiot, esim. kaksiemäksiset : tähteet kuten Arg Arg, toteutetaan deletoimalla toinen emäs- ·· · tähde tai substituoimalla toinen glutaminyyli- tai histidyy- • « litähteellä.

• · • 25 • · · ^ *’1I Sialyylitransf eraasin insertioaminohapposekvenssimuunnelmia • · · **” ovat sellaiset, joissa yksi tai useampi aminohappotähde • · · *·1 1 insertoidaan ennalta määrättyyn kohtaan kohdesialyylitrans- feraasissa. Tavallisimmin insertiomuunnelmat ovat heterolo-30 gisten proteiinien tai polypeptidien liittämisiä sialyyli- • · · transferaasin amino- tai karboksyylipäätyyn.

· • · · • · · #...1 Sialyylitransferaasia koodaava DNA saadaan muista lähteistä • · *!1 kuin rotalta tai sialta a) saataessa cDNA-kir jasto tietyn • · ·.·.· 35 eläimen eri kudoksista, esimerkiksi maksasta tai leuanalus- • · · sylkirauhasista, b) suorittamalla hybridisaatioanalyysi leimatulla DNA:11a, joka koodaa sialyylitransferaasin tai sen fragmenttien konservoitunutta homologia-aluetta (tavallisesti 18 30 emäsparia suurempi), niin että löydetään klooneja homolo-giasekvenssejä sisältävästä cDNA-kirjastosta, ja c) analysoimalla kloonit re-striktioentsyymianalyysin ja nukleiinihappo-sekvensoinnin avulla täysimittaisten kloonien identifiointi -5 seksi. Jos kirjastosta ei löydy täysimittaisia klooneja, sopivia fragmentteja voidaan koota eri klooneista ja ligatoi-da klooneille yhteisiin restriktiokohtiin täysimittaisen kloonin kokoamiseksi.

10 "Joka olennaisesti ei sisällä" tai "olennaisesti puhtaalla" keksinnön mukaisesti valmistetun sialyylitransferaasin tilan kuvaamisessa tarkoitetaan, ettei sialyylitransferääsi sisällä proteiineja tai muita materiaaleja, jotka normaalisti liittyvät sialyylitransferaasiin sen luonnossa esiintyvässä fysio- 15 logisessa ympäristössä in vivo, esimerkiksi kun sialyyli-transferaasi saadaan verestä ja/tai kudoksista uuttamalla ja puhdistamalla. Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuotettua sialyylitransferaasia oli yli tai tasan 95 paino-% kokonais-proteiinista, se muodostuu yhdestä tyydyttyneestä vyöhykkees- 20 tä (Coomassie-sinivärjäys) polyakryyliamidigeelielektroforee-sissa, ja sen spesifinen aktiivisuus on vähintään noin 500 ϊ#:]: nmol/mg proteiinia/min.

·· · • · · • · • · Tässä termeillä "olennaisesti samanlainen" tai "olennaisesti • · 25 identtinen" tarkoitetaan tässä polypeptidisekvenssin tai nukleiinihapposekvenssin ominaispiirrettä, jonka mukaan poly-peptidisekvenssi on vähintään 70-prosenttisesti identtinen • · · • · · • referenssisekvenssin kanssa 3a nukleiinihapposekvenssin sek- venssi-identtisyys on vähintään 80 % referenssisekvenssiin • · · 30 verrattuna. Sekvenssi-identtisyyden prosenttimäärä lasketaan ··· ottamatta mukaan pieniä deleetioita tai lisäyksiä, joiden : määrä on alle 35 % referenssisekvenssistä. Referenssisekvens- • ·· • · .···. si voi olla suuremman sekvenssin ala joukko kuten kuvioissa 1 • · 19

Tavallisesti käytetään prokaryootteja kloonattaessa DNA-sek-venssejä tässä keksinnössä käyttökelpoisten vektoreiden kokoamisessa. Erityisen käyttökelpoinen on esimerkiksi E. coli K12 kanta 294 (ATCC n:o 31446). Muita käytettäväksi sopivia 5 mikrobikantoja ovat E. coli B ja E. coli X177 6 (ATCC n: o 31537). Nämä esimerkit ovat lähinnä kuvaavia, eivät rajoittavia .

Prokaryootteja käytetään myös ekspressointiin. Voidaan käyt-10 tää edellä mainittuja kantoja samoin kuin E. colia W3110 (F" K, prototrofinen, ATCC n:o 27325), sellaisia basilleja kuin Bacillus subtilus tai muita enterobakteereja kuten Salmonella typhimurium tai Serratia marcescans samoin kuin useita eri Pseudomonas-laj ej a.

15 Näissä isännissä käytetään tavallisesti plasmidivektoreita, jotka sisältävät promoottoreita ja säätelysekvenssejä, jotka johdetaan isäntäsolun kanssa yhteensopivista lajeista. Yleensä vektorissa on replikoitumiskohta samoin kuin markkerisek-20 venssit, jotka pystyvät aikaansaamaan fenotyyppiselektion transformoiduissa soluissa. Esimerkiksi E. coli transformoi- : daan hyvin usein käyttämällä pBR322:ta, plasmidia, joka on • · · johdettu E. coli -lajeista (Bolivar et ai, Gene 2:95, 1977).

• · pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasykliiniresis- • · 25 tenssiä varten ja muodostaa näin ollen helpon tavan identifi-oida transformoituneita soluja. Plasmidin pBR322 tai muun • · · ·*·· mikrobiplasmidin täytyy sisältää myös tai se täytyy modifioi- • · · *·* * da sisältämään promoottoreita ja muita säätelyelementtejä, joita yleisesti käytetään yhdistelmä-DNA-konstruktioissa.

\:V 30 • · ·

Promoottoreista, jotka sopivat käytettäväksi prokaryootti- .·] : isäntien kanssa voidaan esimerkkeinä mainita β-laktamaasi- ja I./ laktoosipromoottorisysteemit (Chang et ai, Nature 275:615, *“ 1976; Goeddel et ai, Nature 281:544, 1979), alkaliinifosfa- • · V.! 35 taasi, tryptofaani (trp) -promoottorisysteemi (Goeddel, D.

Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980) ja hybridipromoottorit kuten tac-promoottori (de Boer, H, PNAS, (USA) 80:21-25, 1983).

Voidaan käyttää muitakin funktionaalisia bakteeripromootto- 20 reita. Niiden nukleotidisekvenssit ovat yleisesti tunnettuja, ja näin ollen alan asiantuntija pystyy toiminnallisesti ligatoimaan ne sialyylitransferaasia koodaavaan DNA:hän (Siebenlist et ai, Cell 2, 1980) käyttämällä linkkereitä tai 5 adaptoreita ja näin saada kaikenlaisia tarvittavia restrik-tiokohtia. Bakteerisysteemeissä käytettävät promoottorit sisältävät myös Shine-Dalgarno (SD) -sekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty sialyylitransferaasia koodaavaan DNA:hän.

10

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää myös eukaryoottisia mikrobeja kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae eli tavallinen hiiva on tavallisimmin käytetty eukaryoottinen mikro-organismi, vaikka yleisesti on saatavilla useita muita- 15 kin kantoja. Saccharomyces-ekspressioon käytetään yleisesti esimerkiksi plasmidia YRp7 (Stinchomb et ai, Nature 282:39, 1979; Kingsman et ai, Gene 7:141, 1979; Tschemper et ai, Gene 10:157, 1980). Tämä plasmidi sisältää jo trpl-geenin, josta saadaan selektiomarkkeri hiivamutanttikannalle, joka ei pysty 20 kasvamaan tryptofaanissa, esimerkiksi ATCC n: o 44076 eli PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12, 1977). Hiivaisäntäsolugeno- ; missä ominaispiirteenä oleva trpl-leesio antaa siis tehokkaan • · · ympäristön havaita transformaatio tryptofaanittomassa kasva- • · tuksessa.

• · 25 • · · *’** Hiivaisännissä käytettäväksi sopivia promoottorisekvenssejä • · · •**j ovat esimerkiksi 3-fosfoglyseraattikinaasi (Hitzeman et ai, *** J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) tai muut glykolyyttiset entsyymit (Hess et ai, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; 30 Holland, Biochemistry 17:4900, 1978) kuten enolaasi, glyser- • · · : aldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaatti- .·) ; dekarboksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti- • · · isomeraasi, 3-f osfoglyseraattimutaasi, pyruvaattikinaasi, • · • · *;* triosefosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja glu- • · ϊ.ϊ.ϊ 35 kokinaasi.

• · · • · • · • · ·

Muita mahdollisia hiivapromoottoreita, joilla on se lisäetu, että transkriptiota voidaan säädellä kasvuolosuhteilla, ovat 21 promoottorialueet alkoholidehydrogenaasilla 2, isosytokro-milla C, happofosfataasilla, typpimetaboliaan liittyvillä degradatiivisilla entsyymeillä, metallotioneiineilla, glyse-raldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasilla ja entsyymeillä, jotka 5 vastaavat maltoosin ja galaktoosin käytöstä. Hiivaekspres-siossa käytettäväksi sopivia vektoreita ja promoottoreita kuvaavat tarkemmin R. Hitzeman et ai, EP-73657A. Hiivapro-moottoreiden kanssa on myös edullista käyttää hiivatehos-timia.

10 "Säätelyalueella" tarkoitetaan eukaryoottigeenien 5'- ja 3'-päädyissä sijaitsevia spesifisiä sekvenssejä, jotka voivat osallistua joko transkription tai translaation säätelyyn. Käytännöllisesti katsoen kaikilla eukaryoottigeeneillä on AT-15 rikas alue, joka sijaitsee noin 25-30 emästä ylävirtaan kohdasta, josta transkriptio alkaa. Toinen sekvenssi, joka on 70-80 emästä ylävirtaan useiden geenien transkriptioaloitus-kohdasta on CXCAAT-alue, jossa X voi olla mikä tahansa nukleotidi . Useimpien eukaryoottigeenien 31-päässä on AATAAA-20 sekvenssi, joka voi olla signaali poly A -hännän lisäämiselle transkriptoidun mRNA:n 3'-päätyyn.

• · · • · · • · ·

Edullisia promoottoreita, jotka säätelevät transkriptiota • · • « nisäkäsisäntäsoluvektoreista voidaan saada erilaisista läh- • · 25 teistä, esimerkiksi joidenkin virusten genomeista. Esimerk- *’** keinä voidaan mainita polyoma, Simian Virus 40 (SV40) -virus, • · · •••j adeno-virus, retrovirus, hepatitis-p-virus ja edullisimmin • · · *·* * sytomegalovirus tai heterologisiset nisäkäspromoottorit, esim. beeta-aktiinipromoottori. SV40-viruksen aikaiset ja 30 myöhäiset promoottorit saadaan helposti SV40-restriktiofrag- menttina, joka sisältää myös SV40-virusreplikaatioalun (Fiers · et ai, Nature 273:113, 1978). Ihmisen sytomegaloviruksen • · ·

!..* välitön aikainen promoottori saadaan helposti Hindlll E

• · *" -restriktiofragmenttina (Greenaway P.J. et ai, Gene 18:355- • · '·/·/· 35 360, 1982). Luonnollisesti käyttökelpoisia ovat myös isäntä- solun tai läheisen lajin promoottorit.

• · · 22

Korkeammilla eukaryooteilla enkefalinaasia koodaavan DNA: n transkriptiota voidaan lisätä insertoimalla vektoriin tehostinsekvenssi. Tehostimet (enhancers) ovat cis-vaikutta-via DNA:n osia, yleensä noin 10-300 bp, jotka vaikuttavat 5 promoottoriin sen transkriptiota lisäävästi. Tehostimet ovat suhteellisen orientaatio- ja positioriippuvaisia, niitä on löydetty 5'- (Laimins et ai, PNAS 78:993, 1981) ja 3'-suuntaan (Lusky M.L. et ai, Mol. Cell Bio. 3:1108, 1983) transkriptioyksiköstä, intronin sisältä (Banerji J.L. et ai, 10 Cell 33:729, 1983) samoin kuin itse koodaussekvenssin sisältä (Osborne T.F. et ai. Mol. Cell Bio. 4:1293, 1984) . Nisäk käiden geeneistä tunnetaan useita tehostinsekvenssejä (glo-biibi, elastaasi, albumiini, α-fetoproteiini ja insuliini). Tavallisinta on kuitenkin käyttää eukaryoottisoluviruksen 15 tehostinta. Esimerkkeinä voidaan mainita SV40-tehostin repli-kaatioalun myöhäisemmältä puolelta (bp 100-270), sytomegalo-viruksen aikainen promoottoritehostin, replikaatioalun myö-häisemmän puolen polyomatehostin ja adenovirustehostimet.

20 Eukaryootti-isäntäsoluissa (hiiva-, sieni-, hyönteis-, kasvi-, eläin-, ihmissolu tai nukleoidut solut muista moni-: soluisista organismeista) käytettävät ekspressiovektorit si- sältävät myös transkription lopettamiseen tarvittavia sek- • · venssejä, jotka saattavat vaikuttaa mRNA-ekspressioon. Nämä 25 alueet transkriptoi tuvat polyadenyloituina segmentteinä *"*) sialyylitransferaasia koodaavan mRNA:n translator tumattomassa • · « •**| osassa. 31-translatoitumattomat alueet sisältävät myös • · · *** * transkriptiolopetuskohdat.

30 Ekspressiovektorit voivat sisältää selektiogeenin, josta käy- * · · tetään myös nimitystä selektiomarkkeri (selectable marker).

.·[ : Esimerkkejä nisäkässoluille sopivista selektiomarkkereista • · · I..* ovat dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) , ornitiinidekarboksy- • · • · *“ laasi, multippelin lääkeresistenssin biokemiallinen markkeri, • · ί.ϊ.! 35 adeno-siinideaminaasi, asparagiinisyntetaasi, glutamiinisyn- : tetaasi, tymidiinidinaasi ja neomysiini. Kun tällainen selek- ·· · tiomarkkeri onnistuneesti siirretään nisäkäsisäntäsoluun, transformoitu nisäkäsisäntäsolu pysyy elossa selektiiviselle 23 paineelle altistettaessa. On olemassa kaksi laajalti käytettyä selektiotavan luokkaa. Ensimmäinen luokka perustuu solun metaboliaan ja siihen, että käytetään mutanttisolulinjaa, joka ei pysty kasvamaan ilman täydennettyä, supplementoitua, 5 väliainetta. Kaksi esimerkkiä ovat CHO-DHFR-solut ja hiiren LTK-solut. Nämä solut eivät pysty kasvamaan ilman, että lisätään sellaisia ravinto-aineita kuin tymidiini ja hypoksan-tiini. Koska näillä soluilla ei ole tiettyjä geenejä, jotka tarvitaan täydelliseen nukleotidisynteesireittiin ne eivät 10 pysy elossa ellei puuttuvaa nukleotidisynteesireittiä tarjota niille supplementoidussa väliaineessa. Vaihtoehtoinen tapa supplementoida väliaine on viedä koskematon DHFR- tai TK-gee-ni soluihin, joilta nämä vastaavat solut puuttuvat, ja muuttaa näin niiden kasvuvaatimuksia. Yksittäiset solut, joita ei 15 transformoida DHFR- tai TK-geenillä eivät pysy elossa supple-mentoimattomassa väliaineessa.

Toinen luokka on dominanttiselektio, jolla tarkoitetaan se- lektiokaaviota, jota voidaan käyttää mille tahansa solutyy- 20 piile ja joka ei vaadi mutanttisolulinjan käyttöä. Yleensä näissä kaa-vioissa käytetään lääkeainetta, jolla isäntäsolun : kasvu keskeytetään. Solut, joilla on uusi geeni ekspressoivat • · · ·*·*. lääkeresistenssiä osoittavaa proteiinia ja kestävät selektion • · elossa. Esimerkkeinä dominanttiselektiossa käytettävistä lää- • · 25 keaineista voidaan mainita neomysiini (Southern P. and Berg P., J. Molec. Appi. Genet. 1:327, 1982), mykofenolihappo **" (Mulligan R.C. and Berg P., Science 209:1422, 1980) ja • · · • ’ hygromysiini (Sudgen B. et ai. Mol. Cell Biol. 5:410-413, 1985). Näissä yllä annetuissa esimerkeissä käytetään baktee-30 rigeenejä eukaryoottisäätelyssä antamaan resistenssi kysei- ··· selle lääkeaineelle G418 eli neomysiinille (gentisiini), : xgpt:lle (mykofenolihappo) eli hygromysiini lie.

♦ ·· • · ··« • · • · "Monistamisella" tai "laajentamisella" tarkoitetaan eristetyn • · 35 alueen lisäämistä eli replikointia solun kromosomaalisessa • · · DNA:ssa. Monistaminen toteutetaan käyttämällä selektioai-netta, esim. metotreksaattia (MTX), joka inaktivoi DHFR:n. Kun monistetaan eli lisätään DHFR-geenin kopioita saadaan 24 tuotettua suurempia määriä DHFR:ää huolimatta suuremmista MTX-määristä. Monistuspainetta käytetään huolimatta endogee-nisen DHFR:n läsnäolosta, lisäämällä väliaineeseen vielä suurempi määriä MTX:ää. Halutun geenin monistaminen voidaan 5 aikaansaada kotransfektoimalla nisäkäsisäntäsolu plasmidilla, jossa on haluttua proteiinia koodaava DNA ja kointegroitua DHFR- eli amplifikaatiogeeniä kutsutaan koamplifikaatioksi. Varmistutaan, että solu tavitsee lisää DHFR:ää, ja tarpeeseen vastataan selektio-geenireplikaatiolla, valikoimalla vain 10 soluja, jotka pystyvät kasvamaan yhä suuremmissa MTX-pitoi-suuksissa. Niin kauan kuin haluttua heterologista proteiinia koodaava geeni on kointegroitunut selektiogeeniin tämän geenin replikoituminen usein saa aikaan haluttua proteiinia koodaavan geenin repikoitumista. Tuloksena on, että yhä 15 useampi kopio geenistä, ts. monistetusta geenistä, joka koodaa haluttua heterologista proteiinia ekspressoi haluttua heterologista proteiinia enemmän.

Edullisia sopivia isäntäsoluja tämän keksinnön sialyyli-20 transferaasia korkeammissa eukaryooteissa koodavien vektoreiden ekspressioon ovat muun muassa: apinanmunuais-CVl-linja : muunneltuna SV40:llä (COS-7, ATCC CRL 1651), ihmisen alkio- ·«· munuaislinja (293) (Graham F.L. et ai, J. Gen. Virol. 36:59, • · 1977), hamsterinpoikasmunuaissolut (BHK, ATCC CCL 10), • · 25 kiinanhamsterin munasolu-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, PNAS, **'! (USA) 77:4216, 1980), hiiren sertolisolut (TM4, Mather J.P., • · ·

**“ Biol, Reprod. 23:243-251, 1980), apinanmunuaissolut (CVl ATCC

• · ·

*·1 2 1 CCL 70) , vervettiapinan munuaissolut (VERO-76, ATCC CRL

1587), ihmisen servikaalikarsinoomasolut (HELA, ATCC CCL 2), 30 koiran munuaissolut (MDCK, ATCC CCL 34) , puhvelirotan ϊ.,.ϊ maksasolut (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ihmisen keuhkosolut ; (W138, ATCC CCL 75), ihmisen maksasolut (Hep G2, HB 8065), « ·· l./ hiiren nisätuumori- (MMT 060562, ATCC CCL51) ja TRI-solut 11 (Mather J.P. et ai, Annals, N.Y. Acad. Sei. 383:44-46, 1982) • · *.1.· 35 ja bakulovirussolut.

• · · • · • « 2 · "Transformaatio" tarkoittaa DNA:n viemistä organismiin niin että DNA on replikoituva, joko solunulkoisena elementtinä tai 25 kromosomi-integraation avulla. Ellei muuta mainita, tässä transformaatioon käytettävä menetelmä on menetelmä, jota ovat kuvanneet Graham, F. ja Van der Eb, A., Virology 52:456-457, 1973) . On kuitenkin mahdollista käyttää muitakin menetelmiä 5 DNA:n viemiseksi soluihin, esimerkiksi tumasisällytystä tai protoplastifuusiota. Jos käytetään prokaryoottisoluja tai soluja, jotka sisältävät huomattavia soluseinämärakenteita suositeltavin transfektiomenetelmä on kalsiumkäsittely käyttämällä kalsiumkloridia tavalla, jota ovat kuvanneet Cohen, 10 F.N. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110, 1972.

Suoritettaessa analyysi, jolla vahvistetaan oikeat sekvenssit kootuissa plasmideissa käytetään ligaatioseoksia transformoimaan E. coli K12 kanta 294 (ATCC 31446) ja onnistuneet 15 transformantit valitaan ampisilliini- tai tetrasykliini- resisitenssin avulla silloin kun se on mahdollista. Plasmidit transformanteista valmistetaan, analysoidaan restriktiolla ja/tai sekvensoinnilla menetelmällä, jota ovat kuvanneet Messing et ai, Nucleic Acids Res. 9: 309, 1981, tai mene- 20 telmällä, jota ovat kuvanneet Maxam et ai, Methods in

Enzymology 65:449, 1980.

• · · • · · • · · ·*·*· Isäntäsolut voidaan transformoida tämän keksinnön mukaisilla • · • · ekspressiovektoreilla ja viljellä tavallisessa ravinneväli- • · 25 aineessa, joka on modifioitu tavalla, joka sopii promoottori- ’**1 indusointiin, transformanttiselektioon tai geenimonistukseen.

• · · **” Viljelyolosuhteet kuten lämpötila, pH ja vastaavat, ovat sa- • · · ·* * manlaiset kuin aiemmin on käytetty ekspressioon valitulla isäntäsolulla, ja ne ovat alan ammattimiehelle itsestään sei-30 viä.

• · · • · • · • · · .·. : "Transfektiolla" tarkoitetaan isäntäsolun ekspressiovektorin • · · ottamista, ekspressoi tuvatpa koodaussekvenssit tosiaan tai • · eivät. Alan ammattimies tuntee lukemattomia transfektointi- • · ·.*.· 35 menetelmiä, esimerkkejä niistä ovat CaP04 ja elektroporaatio.

• · · ί I Transfektoinnin onnistumisen merkkinä on tavallisesti mikä ·· · tahansa indikaatio tämän vektorin toiminnasta isäntäsolussa.

26

Seuraavien esimerkkien ymmärtämisen helpottamiseksi kuvaamme joitain yleisiä menetelmiä ja/tai termejä.

"Plasmidi" merkitään pienellä p-kirjaimella, jota ennen 5 ja/tai sen jälkeen on suuria kirjaimia ja/tai numeroita. Läh-töplasmidit ovat tässä joko kaupallisesti saatavilla olevia, rajoittamattomasti julkisesti saatavilla olevia tai ne voidaan koota saatavilla olevista plasmideista julkaistujen menettelytapojen mukaan. Lisäksi nyt kuvattuja plasmideja vas-10 taavia plasmideja tunnetaan alalla ja ne ovat alan ammattimiehelle itsestään selviä.

DNA:n "hajottamisella" tarkoitetaan DNA:n katalyyttistä pilkkomista restriktioentsyymillä, joka vaikuttaa vain tiettyihin 15 DNA-sekvensseihin. Tässä yhteydessä käytetyt eri restrik-tioentsyymit olivat kaupallisesti saatavilla olevia ja reaktio-olosuhteet, kofaktorit ja muut vaatimukset olivat alan ammattimiehen tunteman tekniikan mukaisia. Analyyseissä käytetään yleisesti 1 pg plasmidia tai DNA-fragmenttia yhdessä 20 noin 2 entsyymiyksikön kanssa noin 20 piissä puskuriliuosta. Eristettäessä DNA-fragmentteja plasmidin kokoamista varten : tavallisesti hajotetaan 5-50 pg DNA: ta yhdessä 20-250 entsyy- ·*·*: mi yksikön kanssa suuremmassa tilavuudessa. Valmistajat ovat • · määritelleet tietyille restriktioentsyymeille sopivat pusku- 25 riaineet ja substraattimäärät. Tavallisesti käytetään noin 1 ***! tunnin inkubointiaikaa 37 oCissa, mutta tämä saattaa vaihdel- ··· la toimittajan ohjeiden mukaan. Hajottamisen jälkeen reaktio • · · • * elekroforesoi-daan suoraan polyakryyliamidigeelille halutun fragmentin eristämiseksi.

• ♦ · 30 ·♦·

Pilkottujen fragmenttien kokolajittelu suoritetaan käyttämän : 8 % polyakryyliamidigeeliä, jota ovat kuvanneet Goeddel D. et • ·· ,···[ ai, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980.

• « ··· • m 35 "Defosforylaatiolla" tarkoitetaan 5 ' -päätyfosfaattien poista- • · · :...ί mistä bakteerialkaliinifosfataasin (BAP) avulla. Tällä menet telytavalla estetään DNA-fragmentin kahden restriktiopilkotun pään "ympyröityminen" eli suljetun silmukan muodostumisen, 27 joka estäisi toisen DNA-fragmentin lisäyksen restriktiokoh-taan. Defosforylaatiomenetelmiä ja -reagensseja tunnetaan yleisesti (Maniatis T. et ai, Molecular Cloning pp. 133-134, 1982). Reaktiot, joissa käytetään BAP:tä toteutetaan 50 5 mM:lla Trisiä lämpötilan ollessa 68 °C, jotta saadaan supp-ressoitua mahdollinen eksonukleaasiaktiivisuus, jota saattaa olla läsnä entsyymivalmisteissa. Reaktioiden annetaan jatkua 1 tunnin ajan. Reaktion jälkeen DNA-fragmentti geelipuhdiste-taan.

10 "Oligonukleotidi" tarkoittaa joko yksisäikeistä polydeoksi-nukleotidiä tai kahta komplementaarista polydeoksinukleotidi-säiettä, jotka voivat olla kemiallisesti syntetoituja. Tällaisilla synteettisillä oligonukleotideillä ei ole 5'-fos-15 faattia, ja näin ne eivät ligatoidu toiseen oligonukleotidiin ilman, että lisätään fosfaatti ATP:n kanssa kinaasin läsnäollessa. Synteettinen oligonukleotidi ligatoituu fragmenttiin, jota ei ole defosforyloitu.

20 "Ligaatio" taroittaa prosessia, jolla muodostetaan fosfodi- esterisidoksia kahden kaksisäikeisen nukleiinihappofragmentin : välille (Maniatis et ai, id. p.146). Ellei muuten, ligaatio • · · jV. voidaan toteuttaa käyttämällä tunnettuja puskureita ja • · olosuhteita ja 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia ("ligaasi") per • · 25 0,5 pg noin ekvimolaarisia määriä ligatoitavia DNA-fragment- ***! teja. Halutut koodaus- ja säätelysekvenssit sisältävät vekto- • · · ···· rit voidaan koota käyttämällä standardiligaatiotekniikoita.

• · · *·* * Eristetyt plasmidit tai DNA-f ragment it pilkotaan, yhdistel lään ja uudelleenligatoidaan haluttuun muotoon tarvittavien * :.i.: 30 plasmidien muodostamiseksi.

• · · • · • · ··· .·. : "Täyttäminen" tai "päätyjen tai päiden tasaaminen" viittaa • · · l.." menettelytapoihin, joissa yksisäikeinen pää restriktioentsyy- • · millä pilkotun nukleiinihapon kohesiivisessa päässä konver- • · ·.·.· 35 toituu kaksoissäikeeksi. Tämä eliminoi kohesiiviset päädyt ja • · · : : muodostaa tasaisen terminaalin. Tämä menetelmä on joustava • · · tapa konvertoida mahdollisesti kohesiivinen restriktioleikat-tu pääty päillä, jotka on luotu vain yhdellä tai muutamalla 28 muulla restriktioentsyymillä terminaaliksi, joka on yhteensopiva minkä tahansa tasapäistävän restriktioendonukleaasin tai muun täytetyn kohesiivisen terminaalin kanssa. Tavallisesti päätyjen tasaaminen suoritetaan inkuboimalla 2-15 μ kohde-5 DNA:ta seoksessa, joka sisältää 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotrei-tolia, 50 mM NaCl ja 10 mM Tris (pH 7,5) puskuria noin 37 °C:ssa kun läsnä on 8 yksikköä DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia ja 250 μΜ jokaista neljää deoksinukleosidi-trifosfaattia. Inkubointi päätetään tavallisesti 30 minuutin 10 jälkeen fenolilla ja suoritetaan kloroformiuutto ja etanoli-saostus .

Polynukleotidejä, jotka vastaavat tai täydentävät patenttivaatimusten kohteena olevien sekvenssien osia voidaan käyttää 15 hybridisaatiokoettimina identifioitaessa ja/tai eristettäessä vastaavia mikrobilinjageenejä. Tällaisia polynukleotidejä voidaan käyttää myös hybridisaatiokoettimina seulottaessa cDNA:ta ja genomikirjastoja eristettäessä cDNA:ta ja geenejä, jotka koodaavat polypeptidejä, jotka ovat rakenteellisesti 20 ja/tai kehityksellisesti sukua keksinnön mukaisille sialyyli-transferaasisekvensseille. Vaihtoehtoisesti tällaisia poly- : :*: nukleotidejä voidaan käyttää myös alukkeina monistettaessa ··· ·*·*. mikrobigeenisekvenssejä tai lähisukuisia sekvenssejä polyme- • ♦ raasiketjureaktion (PCR) avulla.

• ♦ • 25 ··· ^ 9 ***! Hybridisaatiokoettimet, joita käytetään identifioitaessa ja **** eristettäessä uusia sialyylitransferaasi-cDNA-lajeja laadi- • · · taan kuvioiden 1 ja 2 nukleotidi- ja johdettujen aminohappo-sekvenssien perusteella. Hybridisaatiokoettimet, jotka taval-30 lisesti leimataan sisällyttämällä niihin radioisotooppeja, ··* voivat muodostua yhdestä tai useammasta yhdistelmästä degene- .·. : raattioligonukleotidejä, jotka kokonaan tai osittain koodaa- • · · vat konservoitunutta aluetta, joka vastaa 55 tähteen segment- • · *!* tiä, joka kattaa alueen aminohappotähteestä 134 aminohappo- • 9 ·,·.· 35 tähteeseen 189 sian a2,3-O-sialyylitransferaasissa (kuvio 1).

• · ·

Erityisesti heptapeptidiyksikkö -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-on erittäin hyvin konservoitunut, ja hybridisaatiokoettimet, jotka sisältävät tätä yksikköä koodaavia degeneraattioligo- 29 nukleotidejä tai tämän yksikön muunnelmia, joissa yksi tai kaksi aminohappoa on modifoitu niin, että vähintään noin 4 tai 5 heptapeptidin aminohappoa säilyy. Myös degeneraattioli-gonukleotidikoettimet, jotka koodaavat heptapeptidiyksikön 5 yhtä tai kahta aminohapposubstituutiomuunnelmaa ovat käyttökelpoisia läheistä sukua olevien sialyylitransferaasi-cDNA-lajien etsimisessä. Degenraattioligonukleotidien lisäksi myös kloonattuja polynukleotidejä, esimerkiksi kuvioissa 1 ja 2 kuvattujen kaltaisia, voidaan käyttää koettimina. On suosi-10 teltavaa, että tällaiset koettimet kattavat heptapeptidiyksikön ja, silloin kun niin halutaan, yllä kuvatun konservoi tuneen 55 aminohappotähdesegmentin.

Sialyylitransferaaseja koodaavat genomiset tai cDNA-kloonit 15 voidaan eristää kloonikirjastoista käyttämällä hybridisaatio-koettimia, jotka on muodostettu kuvioiden 1 ja 2 kaltaisten sialyylitransferaasinukleotidisekvenssien perusteella. Kun halutaan cDNA-klooni, suositeltavia ovat kloonikirjastot, jotka sisältävät sialyylitransferaasia (sialyylitransferaase-20 ja) ekspressoivista soluista johdettua cDNA:ta.

: Vaihtoehtoisesti synteettiset polynukleotidisekvenssit, jotka ·· · vastaavat kokonaan tai osittain kuvioiden 1 ja 2 sekvenssejä • · voidaan koota kemiallisella oligonukleotidisyntetoinnilla.

• · 25 Myös polymeraasiketjureaktiota (PCR) alukkeilla, jotka perus- ***I tuvat kuvioiden 1 ja 2 sekvenssi tietoihin voidaan käyttää • · · *·” monistamaan DNA-fragmentteja genomisesta DNA:sta, mRNA-yhdis- • · · telmistä tai cDNA-kloonikirjastoista. US-4683195 ja US- 4683202 kuvaavat PCR-menetelmää. Lisäksi voidaan käyttää PCR- ·.·.· 30 menetelmiä, joissa käytetään yhtä aluketta, joka perustuu • · · kuvioiden 1 ja 2 sekvenssitietoihin ja toista aluketta, joka ,·[ : ei perustu mainittuun sekvenssitietoon. Voidaan käyttää • ·· esimerkiksi toista aluketta, joka on homologinen polyadeny- • · Ί* laatiosegmentin kanssa tai on komplementaarinen sille.

:X: 35 : : Alan ammattimiehelle on itsestään selvää, että keksinnön ··· mukaisiin polynukleotideihin voidaan tehdä nukleotidisubsti-tuutioita, -deleetioita ja -lisäyksiä. Tällaiset nukleotidi- 30 substituutiot, -deleetiot ja -lisäykset eivät kuitenkaan saisi olennaisesti häiritä polynukleotidin kykyä hybridisoi-tua toiseen kuvioiden 1 ja 2 kaltaisista polynukleotidisek-vensseistä hybridisaatio-olosuhteissa, jotka ovat riittävän 5 tiukat johtamaan spesifiseen hybridisäätiöön.

Kuvioiden 1 ja 2 nukleotidi- ja aminohapposekvenssien avulla alan ammattimies pystyy tuottamaan polypeptidejä, jotka vastaavat koodattuja polypeptidisekvenssejä kokonaan tai osit-10 tain. Tällaiset polypeptidit voidaan valmistaa prokaryoot- tisissa tai eukaryoottisissa isäntäsoluissa ekspressoimalla polynukleotidejä, jotka koodaavat täysimittaista sialyyli-transferaasia (sialyylitransferaaseja) tai niiden fragmentteja ja analogeja. Vaihtoehtoisesti tällaiset polypeptidit 15 voidaan syntetoida kemiallisin menetelmin tai tuottaa in vitro -translaatiosysteemeillä käyttämällä polynukleotidi-templaattia ohjaamaan translaatiota. Menetelmät, joilla ekspressoidaan heterologisia proteiineja rekombinantti-isän-nissä, syntetoidaan kemiallisesti polypeptidejä ja trans-20 latoidaan in vitro ovat tunnettua tekniikkaa ja niitä kuva

taan lähemmin teoksissa Maniatis et ai, Molecular Cloning: A

: Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y, 1989, ja • · · •V. Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide • · ....: to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc. San • · 25 Diego, CA, 1987.

• · · · »·· ♦ **** Alan ammattimies osaa valmistaa sialyylitransf eraasifrag- • · · *·* mentteja. Edullisia fragmenttien tai analogien amino- ja kar- boksiterminaaleja esiintyy lähellä strukturaalisten ja/tai ·.:.· 30 funktionaalisten domeenien rajoja, esimerkiksi lähellä ··· entsyymiaktiivista kohtaa. Fragmentit, jotka sisältävät olen- .·. : naisesti yhden tai useamman funktionaalisen domeenin voidaan • ·· liittää heterologisiin polypeptidisekvensseihin, jolloin • · *!* saatu fuusioproteiini ilmentää fragmentin tarjoamaa funktio- ♦ · V.: 35 naalista ominaisuutta (ominaisuuksia), esimerkiksi entsymaat- ··· tista aktiivisuutta. Vaihtoehtoisesti deleetiopolypeptidit, joissa yksi tai useampi funktionaalinen domeeni on deletoitu 31 voivat ilmentää puuttuvan fragmentin normaalisti tarjoaman ominaisuuden poissaoloa.

Bakuloviruseukaryoottigeeniekspressio on eräs tehokkaimmista 5 tavoista luoda kloonatuista geeneistä suuria määriä funktio-naalisesti aktiivista proteiinia (Summers, M. and Luckow, V., Bio/Technology 6:47, 1988, joka on oheistettu viitteeksi).

Keksinnön mukaiset sialyylitransferaasipolypeptidit voidaan valmistaa kloonatuista polynukleotideistä ekspressiolla baku-10 lovirusekspressiosysteemissä (Invitrogen Corporation, San

Diego, CA).

Tyypillinen sialyylitransferaasi ja sen rekombinantti ekspressiotuote saadaan seuraavaan tapaan: 15 1. Sianmaksasialyylitransferaasi puhdistettiin ilmeisen homogeeniseksi.

2. Määritettiin sian sialyylitransferaasin N-terminaalin 20 aminohapposekvenssi.

: 3. Syntetoitiin lähellä NH2-terminaalisekvenssiä sijaitsevia ··· jV. 18 aminohappoa vastaavat oligonukleotidikoettimet kemialli- • · sesti.

• · 25 *“* 4. Koottiin cDNA-kirjastot Agtl0:ssä käyttämällä a) sian • · · leuanalussylkirauhasista saatua satunnaisalukkeistettua • · · *·* polyA+-rikastettua mRNA:ta, b) rotanmaksasta saatua oligo-dT- alukkeistettua polyA+-rikastettua mRNA:ta ja c) rotan aivois-30 ta saatua oligo-dT-alukkeistettua polyA+-rikastettua mRNA:ta.

• · · • · • · • · · ; 5. Käytettiin alla kuvatun kaltaisia koottuja radioaktiivi- • · · l./ sesti leimattuja synteettisiä deoksioligonukleotidejä, jotka • · olivat komplementaarisia sialyylitransferaasin aminohapposek- • · 35 venssien kodoneille, esimerkiksi: ··· • · • · ··· a) 5’ ACC CTG AAG CTG CGC ACC CTG CTG GTG CTG TTC ATC TTC CTG ACC TCC TTC TT 3’ 32 b) 5' GAC GTC GGG AGC AAG ACC ACC 3' 6. Satunnaisalukkeistettu sian leuanalussylkirauhaskirjasto tutkittiin käyttämällä kemiallisesti syntetoituja oligonuk- 5 leotidin pitkiä ja lyhyitä koettimia, jotka oli leimattu käyttämällä polynukleotidikinaasia ja 32P-ATP:tä. Kaksoisposi-tiiviset täplät puhdistettiin ja insertit sekvensoitiin.

7. Yhdellä 32P-leimatulla insertillä tutkittiin oligo-dT-10 alukkeistetut sian leuanalussylkirauhaskirjastot uudelleen.

8. Täydellinen sian sialyylitransferaasin lukukehys saatiin kahdesta limittäisestä kloonista. Rotan maksan ja aivojen cDNA sisälsi konservoituneen homologia-alueen, joka saatiin 15 määritettyä kloonin DNA-sekvenssianalyysin avulla.

9. Täysimittainen sian sialyylitransferaasia koodaava cDNA koottiin kahdesta limittäisestiä kloonista plasmidissa ja sekvensoitiin. Tarkoituksena on, että kuvioiden 1 ja 2 DNA- 20 sekvenssien avulla on mahdollista valmistaa koettimia sialyy- litransferaasi-cDNA:n konservoituneelta homologia-alueelta ja ;näin huomattavasti yksinkertaistaa ja tehostaa koetin-• · · cDNA:iden tai genomisten kirjastojen valmistamista näistä tai • · • · ....j muista lajeista samoin kuin muista kudoksista näistä tai • · . 25 muista lajeista, niin että on mahdollista jättää pois • · · ***; sialyylitransferaasin puhdistaminen, sekvensointi ja koetin- • · · •”j yhdistelmien valmistaminen.

• · · • · · 10. Sian ja rotan sialyylitransferaasia koodaava täysimit-30 täinen cDNA sijoitettiin sitten ekspressiovektoriin, jota käytettiin transformoimaan sopiva isäntäsolu, jota sitten j kasvatettiin viljelmässä halutun sialyylitransferaasin tuot- • · · I..* tamiseksi.

• · • · • · · • · 35 11. Edellä esitetyn menettelytavan mukaisesti valmistetulla biologisesti aktiivisella kypsällä sialyylitransferaasilla # · · voi olla vaihtoehtoisia muotoja kuten nähdään kuvioista 4 ja 33 5, tuloksena kaksi toteutusmuotoa, jotka ovat molekyylipainoiltaan 45 kDa ja 48 kDa.

Keksinnön mukaisia polynukelotidejä ja rekombinantisti tuo-5 tettuja sialyylitransferaasipolypeptidejä ja niiden fragmentteja tai niiden aminohapposubstituutiomuunnelmia voidaan valmistaa kuvioiden 1, 2, 3, 5, 7 ja 8 sekvenssitietojen pohjalta tai perustuen sekvenssitietoihin, jotka saadaan keksinnön mukaisin menetelmin eristetyistä uusista sialyylitransfe-10 raasi-cDNA:ista. Polynukleotidien ja rekombinantisti tuotettujen sialyylitransferaasipolypeptidien tuottaminen tehdään tunnetuin tekniikoin ja tavoin, joita ovat kuvanneet Maniatis et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y, 1989, ja Berger and Kimmel, Methods in 15 Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1987, jotka on oheistettu viitteeksi. Polynukleotidisekvenssejä voidaan ekspressoida isännissä sen jälkeen kun ne on "toiminnallisesti liitetty" (ts. sijoitettu toiminnan varmistamiseksi) 20 ekspressiosäätelysekvenssiin, niin että polynukleotidisek- venssin transkriptio tapahtuu transkription kannalta sopivis- : sa olosuhteissa.

• · · • · · • · · • · • · "Spesifisellä hybridisaatiolla" tarkoitetaan tässä hybridien • · 25 muodostumista koetinpolynukleotidin (esimerkiksi keksinnön *"* mukainen polynukleotidi, jossa voi olla substituutioita, • · · •'•j deleetiota ja/tai lisäyksiä) ja spesifisen kohdepolynukleo- • · · *·' tidin (esimerkiksi polynukleotidi, jossa on komplementaarinen sekvenssi) kesken, niin että koetin edullisesti hybridisoituu ·.·.· 30 spesifiseen kohteeseen, jolloin voidaan esimerkiksi kohde- • · · RNA:ta sisältävistä eukaryoottisoluista valmistetun RNA:n ,·. ; Norther blotting -analyysissä tunnistaa yksi ainoa vyöhyke • · · !..* ja/tai saadaan yksi ainoa pää-PCR-tuote kun polynukleotidiä • · ”* käytetään PCR-alukkeena. Joskus kohdesekvenssiä voi olla • · :.·,ϊ 35 läsnä useammassa kuin yhdessä kohdepolynukleotidilaj issa : : (esim. tietty kohdesekvenssi voi esiintyä sialyylitransfe- raasigeeni-perheen useammassa jäsenessä tai vaihtoehtopilko-tuissa RNA:issa, jotka on transkriptoitu samasta geenistä).

34

On selvää, että optimaaliset hybridisaatio-olosuhteet riippuvat sekvenssikoostumuksen, yhden tai useamman koettimen ja kohteen pituudesta sekä käyttäjän valitsemasta koemenetelmästä. Sopivien hybridisaatio-olosuhteiden valitsemisessa on 5 käytettävissä useita suuntaviivoja (katso Maniatis et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y, 1989, ja Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1987, jotka 10 on oheistettu viitteeksi).

Seuraavat esimerkit vain kuvaavat parasta tunnettua tapaa toteuttaa esillä oleva keksintö, niiden ei tule katsoa rajoittavan keksintöä. Kaikki kirjallisuusviitteet on varta 15 vasten oheistettu liitteeksi.

Esimerkki 1

Sian sialyylitransferaasin puhdistaminen

Kahden a2,3-O-sialyylitransferaasin muodon puhdistaminen 20 a2,3-O-sialyylitransferaasi puhdistettiin käyttämällä aiemmin : kuvatun kahden menettelytavan yhdistelmää (Sadler J.E. et ai, • · · ·*·*. J. Biol. Chem. 254:4434-4443, 1979, ja Conradt H.S. et ai, • ·

Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German 25 Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds) , pp.

104-105, Verlag Wissenschaft und Bildung, Kiel, 1988).

**** Entsyymi puhdistettiin sianmaksa/Triton X-100 -uutteesta • · · *·’ * af f initeettikromatograf iän avulla kolmessa perättäisessä CDP- heksanolamiiniagaroosipylväässä. Ensimmäisen ja kolmannen 30 puhdistusvaiheen eluutioprofiilit esitetään kuviossa 3 ja 4.

• · ·

Kuvio 3 tuo esiin, että ensimmäisen af f initeettipylvään .·. : eluointiprofiilissa on kaksi sialyylitransferaasiaktiivisuus- • · · #···# huippua. Nämä kaksi huippua erotettiin yhdistämällä indikoi- • · dut fraktiot yhdistelmiksi A ja B, ja myöhemmin näiden yhdis- • · ·.·.· 35 telmien havaittiin sisältävän erittäin runsaasti kahta a2,3- • · · O-sialyylitransferaasin eri molekyylipainomuotoa .

35

Toisella yhdistelmien affiniteettipuhdistuskierroksella saatiin poistettua suurin osa kontaminoivasta a2,6-sialyyli-transferaasista, jota myös on läsnä sianmaksassa (Sadler J.E. et ai, J. Biol. Chem. 254:4434-4443, 1979). Kolmannen affini-5 teettikromatografiakierroksen jälkeen pylväsfraktiot analysoitiin ja eri fraktioiden havaittiin sisältävän erittäin runsaasti a2,3-sialyylitransferaasin joko 48 kilodaltonin (kuvio 4A, fraktiot 4-6) tai 45 kilodaltonin (kuvio 4B, fraktiot 2-6) molekyylipainomuotoja. Nämä kaksi proteiinilajia 10 nimitettiin muodoksi A ja muodoksi B. Molempien pylväiden huippufraktioiden spesifinen aktiivisuus oli 8-10 yksikköä/mg proteiinia. Kuvion 4 fraktiossa 6 näkyvä voimakas vyöhyke (~ 44 kDa) sarakkeessa A ei ole a2,3-sialyylitransferääsi, sillä se edusti yhtä huomattavimmista kontaminanteista sekä yhdis-15 telmässä A että yhdistelmässä B edellisen pylvään jälkeen kun entsymaattista aktiivisuutta ei ollut läsnä lopullisessa affiniteettikromatografiavaiheessa.

Sialyylitransferaasiaktiivisuutta tutkittiin laktoosi ja/tai 20 pienimolekyylipainoinen jäätymisenestoglykoproteiini substraatteina (Sadler J.E. et ai, J. Biol. Chem. 254:4434-4443, : 1979). Entsyymi puhdistettiin sianmaksasta kuvattujen mene- • · · telmien mukaisesti (Sadler J.E. et ai, J. Biol. Chem.

• · 254:4434-4443, 1979 ja Conradt H.S. et ai. Sialic Acids 1988 • · 25 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds), pp. 104-105, Verlag Wissenschaft • · · ·;” und Bildung, Kiel, 1988) pienin muunnelmin. Lyhyesti kuvaten • · · ’·* * homogenoitiin 2 kg sianmaksaa puskuriaineessa ja valmistet tiin membraanit kuvatulla tavalla (Sadler J.E. et ai, J.

* 30 Biol. Chem. 254:4434-4443, 1979). Membraanit uutettiin kol- mesti puskurilla (Conradt H.S. et ai, Sialic Acids 1988 ,·[ ; Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids • · · !..* (Shauer and Yamakawa, eds), pp. 104-105, Verlag Wissenschaft • · • · **· und Bildung, Kiel, 1988), ja uute ajettiin 1,5 1 CDP-heksano- • · V.i 35 lamiiniagaroosipylvään läpi (pylväs 1) (16 umol/ml) . Kun : pylväs oli pesty 3 litralla puskuria B pylväs eluoitiin line- aarigradientilla 0,05-1,0 M KCL (2,5 1 x 2,5 1) puskurissa B. a2,3-sialyylitransferaasia sisältävät fraktiot yhdistettiin 36 kahdeksi yhdistelmäksi, A ja B, jotka edustivat huipun pääosaa ja takareunaa (katso kuvio 3). Yhdistelmät dialysoitiin vasten puskuria B ja niille suoritettiin toinen affiniteet-tikromatografiakierros CDP-heksanolamiiniagaroosilla (pylväät 5 IIA ja IIB). Yhdistelmälle A käytettiin 150 ml:n pylvästä ja yhdistelmälle B 30 ml:n pylvästä. Vaiheessa II panostettiin samaan pylvääseen kaksi pylvään I preparaattia (yhteensä 4 kg:sta maksaa). a2,3-sialyylitransferääsi eluoitiin 0-2,0 mM CTP -gradientilla (750 ml yhdistelmälle A, 150 ml yhdistel-10 mälle B) puskurissa B. cx2,3-sialyylitransf eraasiaktiivisuutta osoittavista fraktioista poistettiin suola G50 Sephadexin avulla, tasapainotettiin puskurilla, ja aktiiviset fraktiot pantiin 1,0 ml CDP-heksanolamiiniagaroosi-pylväisiin (osa III), jotka eluoitiin vaihegradienteilla 0,1-1,0 mM CTP (20 15 vaihetta, 1,0 ml jokainen) puskurissa B (katso kuvio 2). Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja yhteinen saanto molemmista pylväistä oli 2,5 yksikköä spesifisen aktiivisuuden ollessa 8-10 yksikköä/mg proteiinia.

20 48 kDa:n ja 45 kDa:n sialyylitransferaasipeptidit (katso kuvio 4) liuotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleihin (Laemmli : U.K., Nature 227:680-685, 1970), elektroeluoitiin PVDF-memb- ·· · raanille (Immobile Transfer, Millipore) ja värjättiin Coomas- • · sie Brilliant Blue -sinellä (Sigma) . Sialyylitransf erääsi- • · S" 25 vyöhykkeet poistettiin ja sitoutuneille peptideille suoritet- *"** tiin NH -1erminaa 1 iaminohapposekvenssianalyysi Edman-hajotuk- «1« ·**! sen avulla laitteena Applied Biosystems 475A -proteiinisek- • · · *·* ' venaattori.

30 Fraktioille, jotka sisälsivät runsaasti sialyylitransferaasin 48 kDa:n (muoto A) ja 45 kDa:n (muoto B) muotoja, suoritet-.·! · tiin polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE), siirrettiin

• M

!..* PVDF-membraanille ja analysoitiin NH,-terminaalisekvensoin- • · ’** nilla. Kummastakin peptidistä saatiin kahdenkymmenenkahden • · 35 aminohappotähteen sekvenssi (kuvio 5) . Muodon A NH2-termi- naalisekvenssi sisälsi hydrofobisen aminohappopätkän, joka vastasi ennustetta, jonka ovat tehneet Sadler et ai (J. Biol. Chem. 254:4434-4443, 1979) sekä Wescott et ai (J. Biol. Chem.

37 260:13109-13121) ja jonka mukaan pienempi muoto tulee johdetuksi suuremmasta muodosta hydrofobisen peptidin proteolyyt-tisen pilkkoutumisen myötä. Tämä alueen on oletettu vastaavaan muodolle A yksin ominaisista detergentti- ja membraani-5 sitoutumisominaisuuksista.

Esimerkki 2

Sian sialyylitransferaasi-cDNA

Käytettiin PolyA+ -RNA:ta templaattina koottaessa yksisäi- 10 keinen cDNA pakkauksella (kit), jota valmistaa Invetrogen.

cDNA:ta käytettiin templaattina polymeraasiketjureaktio (PCR) -reaktioissa käyttämällä reagenssejä ja toimintatapoja, joita toimittaa Perkin Elmer Cetus. Käytetyt spesifiset olosuhteet

olivat: 92 °C 1 minuutin ajan, 50 °C 2 minuutin ajan, 72 °C

15 kahden minuutin ajan denaturointia, jäähdytystä ja polyme- rointia varten PCR-reaktiot aloitettiin 30 emäsparin oligo- nukleotideillä, jotka vastasivat STl:n 3'-päädyn 120 emäs- parin deleetiota sivuavia sekvenssejä. Monistusreaktiotuot- teet erotettiin 2 % agaroosigeelin avulla; etidiumbromidi- 20 värjäyksessä saatiin tunnistettua kaksi spesifistä 120 emäs- parilla eroavaa vyöhykettä, jotka vastasivat klooneja ST1 ja : ST2. Vyöhykkeet eluoitiin geelistä (Qiaex-kit, Qiagen), sub- ·· · kloonattiin TA-vektoriin (Invitrogen) ja sekvensoitiin kuten • · edellä yksiselitteistä identifiointa varten.

• · 25 • · · RNA-eristys ja cNDA-kirjaston kokoaminen • · e ···· • · · * · · *·* ’ Tuoreita sian leuanalussylkirauhasia (<30 minuuttia, post mortem) jäädytettiin ja vietiin kuivaan jää-EtOH:iin. ·.·,· 30 Kokonais-RNA eristettiin menetelmällä, jonka ovat kehittäneet

Chomczynski ja Sacchi (Anal. Biochem. 162, 156-159, 1987).

.·* j Poly A+ -RNA puhdistettiin oligo-dT-selluloosakromatografiän ♦ · · !..* avulla (Pharmacia) . Kaksisäikeinen cDNA valmistettiin kään- • · • · *1* teistranskriptaasina avulla poly A+ -RNA:sta käyttämällä • · ϊ.ϊ,ϊ 35 satunnaisheksameerejä alukkeina Pharmacian cDNA-syntetointi- voin. EcoRI-adaptorit ligatoitiin EcoRI-hajotettuun Igtl0:hon ja pakattiin in vitro (ProMega). cDNA-kirjasto maljattiin ; **: pakkauksen avulla ja valmistajan suosittelemin toimintata- • · · 38 pakkausseoksella tutkittaessa infektoitumista E. coli C600:11a.

cDNA-kloonien eristäminen ja sekvensointi 5

Kaikissa menettelytavoissa noudatettiin teosta Maniatis et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y, 1982, ellei muuta ole mainittu. 53 emäsparin oligonukleotidikoetin 10 (5'ACCCTGAAGCTGCGCACCCTGCTGGTGCTGTTCATCTTCCTGACCTCCTTCTT3'), joka vastasi puhdistetun 48 kDa:n sialyylitransferaasipep-tidin NH2-terminaalisekvenssiä lähellä olevia 18 aminohappoa (katso kuvio 5) pääteleimattiin 32P:llä spesifiseeen aktiivisuuteen 107 cpm/mol. Tutkittiin 50000 täplää nukleotidi-15 hybridisaation avulla käyttäen seuraavanlaista esihybridisaa-tio/hybridi-saatioliuosta: 5xSSC, 50 mM NaH2P04 pH 6,7, 20 % formamidia, 5x Denhardtin liuosta, 0,1 % SDS, 0,1 mg/ml lo-hensperma-DNA:ta 37°C:ssa (Wood W. , Guide to Molecular Cloning Tecniques Methods in Enzymology, pp. 443). Nitro-20 selluloosasuodattimia (Schlei-cher and Schuell 0,45 m huokos) pestiin, 0,2xSSC, 0,1 % SDS 420:ssä 40 minuutin ajan. Saatiin : yksi voimakkaasti hybridi soi tuva klooni, ASTI, joka sisälsi • · · • V. avoimen lukukehyksen, joka koodasi 48 kDa:n ja 45 kDa:n puh- • · distettuja sialyylitransferaasipeptidejä vastaavia aminohap- • · 25 posekvenssejä. Toinen klooni, AST2, eristettiin nukleotidi- *“J hybridisaation avulla käyttämällä resktriktiofragmenttikoe- **“ tinta ASTI:n 3'-päädystä. Tämä koetin, 0,5 kb:n PvuII-EcoRI- • · · *·* restriktiofragmentti, leimattiin käyttämällä satunnaisaluke- käsittelypakkausta ja [a-32P] dCTP: tä (Amer sham) .

• · · 30 • · · ϊ.,.Σ Fagi-DNA:n cDNA-inserttejä vastaavat EcoRI-restriktiofrag- .·. : mentit subkloonattiin pUC-vektoreihin (Pharmacia). Subkloonit • ** e··/ sekvensoitiin käyttämällä Pharmacian T7-pakkausta. Sekvens- t · *!* sitiedot analysoitiin tietokoneella DNASTAR: in avulla • · 35 (DNASTAR Inc. WI, USA).

• · · • · • · ···

Kokeiltiin useita kloonaustapoja yritettäessä kloonata a2,3-sialyylitransferaasi-cDNA, perustana kuvion 5 esittämät ami- 39 nohapposekvenssitiedot. Ensimmäisessä lähestymistavassa valmistimme polymeraasiketjureaktioalukkeet tarkoituksena luoda koetin, joka kattaisi 48 kDa:n ja 45 kDa:n proteiinilajien NH2-terminaalisekvenssit olettaen, että ne ne olivat peräk-5 käisiä koskemattomassa entsyymissä. Jälkeen päin ajatellen tämä lähestymistapa epäonnistui johtuen epätarkkuuksista aminohapposekvenssissä, joka saatiin 45 kDa:n lajista (katso kuviot 5 ja 6) . Muissa epäonnistuneissa yrityksissä saada positiivinen klooni käytettiin lyhyttä (16-20 emäsparia) 10 degenraattioligonukleotidejä koettimina tutkittaessa sian leuanalussylkirauhas-cDNA:ta. Lähestymistapa, joka lopulta osoittautui onnistuneeksi oli käyttää 53 emäsparin ei-degene-raattioligonukleotidikoetinta, joka oli muodostettu A-muodon NH2-terminaalialueelta saadusta 17 aminohaposta. Tätä 53 15 emäsparin koetinta käytettiin tutkittaessa 500000 täplää

IgtlO sian leuanalussylkirauhas-cDNA-kirjastosta. Saatiin yksi ainoa 1,6 kb:n klooni, IST1, jossa oli konsensus-ATG-aloituskodoni (Kozak M., Cell 49:283-292, 1986 ja Kozak M.,

Nuc. Acids. Res. 12:857-872, 1984), avoin lukukehys, joka 20 koodasi a2,3-sialyylitransferaasin sekä muodon A että muodon B NH2-terminaaliaminohapposekvenssejä eikä kehyksen sisäistä : lopetuskodonia. Tosiasia, että ASTI:n avoimessa lukukehykses- ·· · j*.*. sä oli läsnä a2,3-sialyylitransferaasin molempien muotojen • · ΝΗ,-terminaaliaminohapposekvenssejä osoitti, että ASTl-klooni • m 25 koodasi osaa a2,3-sialyylitransferaasista.

• · · · ··· •**| ASTI:n 3 '-restriktiofragmenttia käytettiin koettimena, jolla • ♦ « saatii toinen, limittäinen klooni, AST2, samasta kirjastosta (kuvio 6). AST2 täydentää ASTl:stä peräisin olevan avoimen 30 lukukehyksen. Yhdessä nämä kaksi cDNA:ta koodaavat yhtä ·♦· avointa lukukehystä (909-1029, katso jäljempänä) , 600 emäspa- : rin 5' translatoitumatonta aluetta ja 1000 emäsparin 3' • · · *..* translatoitumatonta aluetta. Nukelotidisekvenssi samoin kuin • · • · T avoimen lukukehyksen translatoitunut 1029 emäsparin aminohap- • 0 35 posekvenssi on esitetty kuviossa 7. ASTI:n translatoituneen • · · avoimen lukukehyksen johdettu amonihapposekvenssi ja puhdistettujen proteiinien suorasta analyysistä saadut aminohappo-sekvenssit olivat hyvin yhtäpitäviä.

40 XSTl:n ja XST2:n limittäisten alueiden sekvenssit ovat identtiset koko pituudeltaan lukuunottamatta yhtä ainoaa 120 emäsparin aukkoa XSTlrssä. Ainoa avoin lukukehys jatkuu 5 molemmin puolin tätä XSTl:n katkosta (kuvio 6). Tutkittaessa edustiko vain toinen vai molemmat cDNA-muodot todellista mRNArta suoritettiin PCR-analyysi tätä aukkoa sivuavilla alukkeilla cDNA-templaatilla, joka oli johdettu käänteis-transkriptaasin avulla sian leuanalussylkirauhasen poly A+ 10 RNA:sta. XSTl:tä ja XST2:ta vastaavat monistetut PCR-fragmen-tit saatiin selville tätä lähestymistapaa käyttäen (tietoja ei esitetty). PCR-tuotteet subkloonattiin ja sekvensoitiin niiden identiteetin varmistamiseksi, ja molempien havaittiin olevan identtisiä XSTl:n ja XST2:n vastaavien alueiden kans-15 sa. Näin ollen sekä suoran cDNA-kloonauksen että PCR-monis-tuksen tulokset antavat aiheen olettaa, että sian leuanalussylkirauhasen a2,3-sialyylitransferaasilla on kaksi mRNA-lajia, joiden erona on 120 emäsparin insertion läsnäolo tai poissaolo avoimessa lukukehyksessä.

20

Sialyylitransferaasiproteiinin ennustettu koko (1029 emäspa- : rin avoin lukukehys) on 39 kDa neljällä potentiaalisella N- ·· · ·*·*; sitoutuneella glykosylaatiokohdalla (katso kuvio 7) (Bouse, • · E., Biochem. J. 209:331-336, 1983). Käyttämällä 3 näistä • · 25 kohdista saataisiin proteiini, jonka ennustettu koko on

suurin piirtein puhdistetun sialyylitransferaasin muodon A

**” havaittu 48 kDa. Vaikka aminoterminaalisekvenssi sisältää • · · ·* ’ kaksi ATG-kodonia lähekkäin, vain toinen sijaitsee voimak kaassa konsesustranslaatioinitiaatiokohdassa (Kozak, M., Cell 30 49:283-292, 1986 ja Kozak, M., Nuc. Acids. Res. 12:857-872, • · · :...ϊ 1984). Kyte-Doolittle -hydropatia-analyysi (J. Mol. Biol.

: 157:105-132, 1982) paljastaa yhden potentiaalisen membraanin • · · #·./ kattavan alueen muodostuvan 16 hydrofobisesta tähteestä, • · ‘1’ jotka sijaitsevat 11 tähteen pääs-sä aminoterminaalista (ku- • · 35 vio 7). Tämä rakennepiire viittaa siihen, että cx2,3-sialyy- • · · litransferaasi kuten muutkin tutkitut glykosyylitransferaasit on tyypin II membraaniorientoitunut ja että tämä yksittäinen hydrofobinen alue voi toimia ei-pilkkoutuvana aminoterminaa- 41 lisignaali/kiinnittymisdomeenina (Paulson J.C. and Colley K.J., J. Biol. Chem. 264:17615-17618, 1989).

ASTlrn ja AST2:n koodaama avoin lukukehys sisältää kaikki 5 sekä a2,3-0-sialyylitransferaasin muodon A että muodon B NH2-terminaaliaminohapposekvenssit. Kuten kuvio 6 esittää muodon A NH2-terminaalisekvenssi löytyy 8 aminohapon päästä oletetusta avoimen lukukehyksen translaatioaloituskohdasta, ja vastaava muodon B NH2-terminaalisekvenssi löytyy 27 emästäh-10 dettä kauempana proteiinin COOH-terminaalin suuntaan. Koska a2,3-sialyylitransferaasin muoto B on täydellisen katalyytti-sesti aktiivinen (Rearick J.I. et ai, J. Biol. Chem. 254:4444-4451, 1979) proteiinisekvenssiä täysimittaisen entsyymin oletetun initiaattorimetioniinin ja muodon B 15 aminoterminaalin välillä ei oletettavasti tarvita entsymaat-tiseen aktiivisuuteen. Näin ollen a2,3-sialyylitransferaasin proteolyyttisesti herkkä alue signaali/kiinnittyrniskohdan ja katalyyttisen domeenin välillä näyttää olevan runkoaluetta, määritettynä aiemmin tutkittujen glykosyylitransferaasien 20 tapaan (Weinstein J. et ai, J. Biol. Chem. 262:17735-17743 , 1987 ja Paulson J.C. and Colley K. J. , J. Biol Chem. 264, : 17615-17618, 1989) .

·« · ·· · • · · • · • ·

Kaksikymmentä milligrammaa sian tai rotan kudoksista saatua • · 25 kokonais-RNA: ta elektroforesoitiin 1,0 % agaroosigeelillä, ’*’1 joka sisälsi 2,2 M formaldehydiä (26), ja siirrettiin nitro- • · · ·*“ selluloosasuodattimille (Schleicher and Schuell) kuvattuun * · · ’·’ ' tapaan. Nitroselluloosasuodattimet hybridisoitiin 32P-leima- tuilla cDNA-koettimilla ja pestiin samaan tapaan kuin edellä 30 kuvattiin.

• · · • · • · • ·· .·. : Esimerkki 3 • · · !..* Sian liukoisen sialyylitransferaasin ekspressio • · • · · • · ί.ϊ.ί 35 Valmistettiin erittyvä kimeerinen proteiini a2,3-O-sialyyli-transferaasin oletetun katalyyttisen domeenin ja insuliini- signaalisekvenssin välille liittämällä kloonin AST2 890 emäsparin C-terminaali vektorin pGIR-199 N-terminaaliosaan 42 (Hsueh et ai, J. Biol. Chem. 261:4940-4947, 1986) Sacl- kohdassa, joka sijaitsee molempien vektoreiden lukukehyksessä. Tämä kimeera, sp-ST, hajotettiin restriktioentsyy-meillä Nhel ja Smal, 1,0 kb:n fragmentti eristettiin, ja sub-5 kloonattiin pSVL:ään (Pharmacia), joka oli hajotettu Xbal:llä ja Smal:llä, jotka pilkkoutumiskohdat sisältyivät polylink-keriin. Tuloksena oleva rakenne sai nimityksen pSVL-spST ja sitä käytettiin vektorina a2,3-sialyylitransferaasin liukoisen muodon tilapäisekspressioon COS-1 -soluissa. Erittäin 10 kierteinen (supercoiled) DNA, pSVL sp-ST, transfektoitiin COS-1 -soluihin lipofektiiniä käyttäen toimittajan ohjeiden mukaisesti (60 mm viljelymalja, joka sisälsi 50 % konfluent-teja soluja transfektoitiin käyttämällä 5 yg DNA:ta, 20 ml lipofektiinireagenssia). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia trans-15 fektoinnin jälkeen COS-1 -soluväliaine koottiin ja konsentroitiin 15 x Centricon 30 -suodattimilla (Amicon) a2,3-0-sialyylitransferaasin aktiivisuuden tutkimiseksi. a2,3-0-sialyylitransferaasiaktiivisuus määritettiin käyttämällä jää-tymisenestoglykoproteiiniakseptoria jo kuvattuun tapaan 20 (Sadler et ai, J. Biol. Chem. 254:4434-4443, 1979).

: Neljäkymmentäkahdeksan tuntia pSVL-spST-transfektion jälkeen ··· ·1 2 3·1. COS-1 -solut (60 mm viljelymalja) pestiin met-vapaalla väli- • · aineella (DMEM, 5 % vasikansikiöseerumi) (Gibco) ja kasvatet- • · 25 tiin samassa väliaineessa 1 tunnin ajan. Solut pulssileimat- *”j tiin käyttämällä 150 mCi/150 pmol 35S-met-Express -leimaa **** (NEN) 1,5 ml: ssa met-vapaata väliainetta 2 tunnin ajan. Nämä • · · ·1 solut pestiin sitten PBS:lla ja niitä kasvatettiin 5 tuntia väliaineessa, joka ei sisältänyt 35S-met -leimaa. Sitten väli-30 aine, joka sisälsi erittyneitä proteiineja, otettiin talteen, • · · ·...1 konsentroitiin 15 x, suoritettiin SDS-PAGE ja fluorografia- .·. : analyysi.

• ·· • · · ♦ • · • · 2

T Kuten aiemmin mainittiin, a2,3-sialyylitransferaasin muoto B

• · ·.·.· 35 on entsymaattisesti aktiivinen, täysimittaisen membraanisi- 3 donnaisen entsyymin proteolyyttinen pilkkoutumistuote. Sen vuoksi oletimme, että liukoinen kimeerinen proteiini säilyttäisi a2,3-O-sialyylitransferaasiaktiivisuutensa, jos se 43 sisältäisi muodon B koko sekvenssin. Tällaisen liukoisen proteiinin valmistamiseksi valittiin restriktiokohta B-pepti-disekvenssin NH2-terminaalista ylävirtaan kohdaksi, johon fuusioitiin AST2-CDNA insuliinisignaalisekvenssiä koodaavan 5 vektorin pGIR-199 kanssa. Kuten kuvio 9A esittää tämä rakenne koodaa fuusioproteiinia, jolle annoimme nimityksen -ST (sp-ST) , joka muodostuu insuliinisignaalisekvenssistä, jota seuraa pGIR-linkkerin koodaamat 9 aminohappoa sekä a2,3-0-sialyylitransferaasin oletettu katalyyttinen domeeni kokonai-10 suudessaan. sp-ST -rakenteen odotettiin ohjaavan 38 kDa:n, erittyvän proteiinin, syntetoitumista isäntänisäkässoluihin transfektoituna. Samankaltaista strategiaa on onnistuneesti käytetty tuotettaessa glykosyylitransferaasien liukoisia muotoja (Paulson J.C. and Colley K.J., J. Biol Chem. 264, 15 17615-17618, 1989, Colley K.J. et ai, J. Biol Chem. 264, 17619-17622, 1989, Larsen R.D. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6674-6678, 1990).

sp-ST -rakenne sijoitettiin pSVL-ekspressiovektoriin ja 20 transfektoitiin tilapäisesti COS-1 -soluihin. 48 tunnin kuluttua transfektoituja soluja inkuboitiin 2 tunnin ajan : :j väliaineessa, joka sisälsi Trans35S -leimaa ja sen jälkeen 5 :*·*: tunnin kasva tus jakso leimaa sisältämättömässä väliaineessa.

• · Tämä väliaine koottiin, konsentroitiin 15-kertaisesti ja 25 analysoitiin SDS-PAGE/fluorografiän avulla. Kuvio 9 osoittaa, **’I että väliaine sisältää huomattavan 38 kDa:n lajin, odotetun ··» *11* sp-ST -proteiinin kokoa olevan. Rinnakkaistransfektioviljel- • · · ** * missä väliaine koottiin 48 tuntia transfektoinnin jälkeen, konsentroitiin ja siitä tutkittiin a2,3-0-sialyylitransfe-30 raasiaktiivisuus. Kuten kuvio 9C kuvaa sp-ST: llä transfektoi- ··· ·...· tujen solujen väliaine sisälsi milliyksikköjä/ml sialyyli- : transferaasia kun taas valetransfektoitujen solujen väliaine • · · • · .···. ei osoittanut merkittävää aktiivisuutta.

• · ··· ♦ · *.*.* 35 Esimerkki 4 ♦ «« :...Σ Rotan maksan sialyylitransferaasin puhdistaminen ja sekven sointi 44

Kuten muutkin glykosyylitransferääsit, jotka ovat endoplasmi-sessa retikulumissa ja Golgin laitteessa läsnä olevia membraaniproteiineja sialyylitransferääsit ovat vähäisinä määrinä esiintyviä proteiineja, niitä on vaikea puhdistaa, ja 5 tästä perheestä onkin saatu kloonattua vain kaksi jäsentä. Galp-l,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferaasin ("a2,3-N") puhdistivat ensin 800000 kertaisesti rotan maksasta vuonna 1982 Weinstein ym. , saantona noin 10 pg/ng kudosta (Weinstein J. et ai, J. Biol. Chem. 257:13835-13844 , 1982 ja Weinstein J. 10 et ai, J. Biol. Chem. 257:13845-13853, 1982). Vaikka tehtiin useita yrityksiä saada aminohapposekvenssitietoja tai nostattaa vasta-aine entsyymiä vastaan perinteisin menetelmin, ne epäonnistuivat, koska saatavilla olevaa laimennettua proteiinia oli niin vähän. Vaihtoehtona massaspektrometrialla on 15 alkanut olla merkittävä osuus biologisesti tärkeiden makromolekyylien rakenteen selvittämisessä. Uusien ionisointi-menetelmien ja välineistön kehittymisen myötä mahdolliset massakantamat ja detektioherkkyys ovat kasvaneet. Nykyisin High Performance Tandem Mass -spektrometria on muodostunut 20 tehokkaaksi proteiinisekvensontitekniikaksi (Mathews W.R. et ai, J. Biol. Chem. 262:7537-7545, 1987) samoin kuin post- : translaationaalisten ja kemiallisen muunnelmien määrittämi- ·· · ·*.*. seen (Dever T.E. et ai, J. Biol. Chem. 264:20518-20525, 1989, • ·

Settineri C.A et ai, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19:665- • · 25 676, 1990, ja DeWolf Jr. W.E. et ai, Biochem. 27:90993-9101, 1988). Tämän vuoksi käytettiin massaspektrometriaa sialyyli- • · · **” transferaasin aminohapposekvenssin saamiseksi.

• · · • · · • · · • · · ·*· ··· • · • · ··· • · • · · • · · • · ·«· • ♦ • · • · ♦ · · • · ♦ • · ··· • ♦ • « ··· 45

Pelkistys ja karboksimetylaatio

Noin 13 Galpl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferaasia (a2,3N) säilytettiin 350 mlrssa 30 mM natriumkakodylaattia (pH=6,5), 100 mM NaCl 0,1 % Triton CF-54 ja 50 % glyserolia. 5 Lisättiin TrisHCl (pH=8,0), guanidiiniHCl ja ditiotreitolia lopullisiin pitoisuuksiin 0,2 M, 6 M ja 7 mM. Pelkistys suoritettiin 60 °C:ssa argonin alla 1,5 tunnissa. Seokseen lisättiin natriumjodoasetaattia (1,32 mg) 2,5 ml:ssa 0,2 M TrisHCl-puskuria. Alkylointi toteutettiin huoneen lämpötilas-10 sa, argonin alla, pimeässä, 1,5 tunnissa.

Dialyysi

Pelkistetty ja karboksimetyloitu α2,3N dialysoitiin vasten 4 litraa 50 mM N-etyylimorfoliiniasetaattipuskuria (pH=8,l) 15 systeeminä Bethesida Research Labs ("BRL") Microdialysis

System, apuna BRL Prepared Dialysis Membmrane -kalvot, joiden molekyylipainoalue oli 12-14 kDa. Kun dialyysi oli suoritettu dialyysikuoppiin lisättiin 10 % SDS, niin että lopulliseksi SDS-pitoisuudeksi tuli noin 0,1 %. Kuoppien sisällöt koottiin 20 ja kuivattiin laitteena SpeedVac Concentrator (Savant). SDS:n poistamiseksi käytettiin Königsberg-saostusta (Königsberg : W.H., Henderson L. , Methods in Enzymology 91:254-259, 1993).

·· · • · · • · · • · • ·

Tryptinen hajotus • · 25 Saostettu α2,3N liuotettiin hajotuspuskuriin (100 mM TrisHCl **** 2M urea, 1 mM CaC12, pH=8,0), saantona proteiinipitoisuus <<· *·*; noin 2 mg/ml. α2,3N hajotettiin 10 % trypsiinin kanssa (w/w) * · ·

*·* * (Boehringer-Mannheim, sekvensointilaatu, liuotettuna 1 mM

HC1) 37 °C:ssa. 7 hajotustunnin jälkeen seokseen lisättiin 30 toinen trypsiinialikvootti, tuloksena lopullinen trypsiinipi- • · · ϊ.,.ϊ toisuus noin 13 %. Hajottaminen lopetettiin 18 tunnin kulut- : tua. Saatu tryptinen hajoitustuote erotettiin käänteisfaasi- • · ·

t!..| HPLC:n avulla (ABI C18 -pylväs, 1,0 x 100 mm) käyttämällä ABI

• · Ί* 140A -liuotinjakelusysteemiä. Liuotin A oli 0,1 % TFA vedes- • · ·.·.· 35 sä. Liuotin B oli 0,08 % TFA 70 % asetonitriiliä/30 % vettä.

• · ·

Systeemi toimi virtausnopeudella 50 ml/min. Kymmenen minuuttia injektoinnin jälkeen liuottimen B prosentti kasvoi 0 %:sta 50 %:iin yli 90 minuutissa, sitten 100 %:iin 30 46 minuutissa. Peptidit havainnoitiin käyttämällä ABI 783A - absorbanssidetektoria 215 rutussa. Jotkut fraktiot esteröitiin käyttämällä HCl/n-heksanoliseosta.

5 Massaspektrometria LSIMS-kokeet (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) suoritettiin käyttämällä Kratos MS50S -kaksoifokusointi-massaspektrometria, jossa oli LSIMS-lähde ja voimakas kent-tämagneetti. Noin yksi viidesosa kaikista kootuista frakit) tioista käytettiin LSIMS-analyysiin. Nestematriisina käytettiin yhtä mikrolitraa glyseroli:tioglyseroli 1:1 seosta. Näytteet otettiin koettimen kärjestä. Runsaimmin esiintyvät molekyyli-ionit valittiin törmäys- indusoitua hajottamista käyttäen suoritettuun analyysiin (CID). Kokeet suoritettiin 15 Kratos Concept IIHH neljän sektori massaspektrometrillä varustettuna elektro-optisella monikanavamittausjärjestelmä-detektorilla, joka pystyy rekisteröimään sekventiaalisia 4 % segmenttejä massakantamasta samanaikaisesti. Törmäysenergia säädettiin arvoon 4 keV, törmäyskaasu oli helium ja sen paine 20 säädettiin vaimentamaan valitun prekursori-ionin määrä 30 % lähtöarvostaan. Kaikkien näytteiden loppuosat panostettiin ja • ·*· lisättiin 1 ml edellä mainittua matriisia. Suurenergia-CID - ··· iV. tiedot tulkittiin ilman tietokoneanalyysiä.

• · • · 25 Tandem-massaspektrometria on voimakas proteiinisekvensointi- ’*** menetelmä, jolla on etuja perinteisiin Edman-tekniikkoihin ··· ···· verrattuna. Tällä menetelmällä pystytään jopa sekvensoimaan • · · ’·* ekvimolaarisia seoksia. Massaspektrometrianalyysiä varten ensimmäiset muutamat HPLC-fraktiot esteröitiin niiden 30 hydrof obisuuden lisäämiseksi ja parannettiin näin niiden ··· ί><#! sputteroitumistehokkuutta (Falick A.M. and Maltby S.A., Anal.

.·] · Biochem. 182, 165-169, 1989). Kaikkien fraktioiden LSIMS- • · · I..* analyysi toi esiin monentyyppisiä molekyyli-ioneja osoittaen, • · *1* että jokaisessa oli läsnä useampaa peptidiä. Runsaimmin • · S.V 35 esiintyvät 30 molekyyli-ionia valittiin CID-analyysiin.

• · · : : Näissä kokeissa kunnostuksen kohteena olevan ionin 12C- ··· isotooppihuippu valitaan enimmäisessä massaspektrometrissä. Vain tämän lajin fragmentit, jotka muodostuvat törmäyskam- 47 miossa heliumin kanssa törmäyksessä aikaansaadusta hajoamisesta ja jotka sijaitsevat kahden massaspektrometrin välissä, havaitaan toisen massaspektrometrin lopussa. Suurenergia-törmäysindusoidun hajottamisen (CID) analysoinnissa fragmen-5 toituminen tapahtuu pääasiallisesti peptidirunkoa pitkin. On havaittavissa myös multippelia pilkkoutumista, ts. fragmen-toitumista aminohappoketjuissa. Fragmentoituminen peptidiket-jua pitkin johtaa ionisarjoihin, joiden aminohappotähdepainot vaihtelevat, ja näin ollen vastaava aminohapposekvenssi 10 voidaan johtaa. Fragmentointisuurenergiamuodoilla saadaan lisätietoja aminohappoidentiteetistä, ja näin saadaan vahvistettua saadut sekvenssit ja suoritettua isobaarisen Leu/Ile -aminohappoparin erottaminen (Johnson R.S. et ai, Anal. Chem. 59:2621-2625, 1987). Sivuketjufragmentoitumista voidaan 15 havaita useimmiten silloin kun sekvenssissä on emäksinen aminohappo, ts. Arg, Lys tai His (Johnson R.S. et ai, Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 86:137-154, 1988). Tavallisesti preferentiaalinen emäksisten aminohappotähteiden protonointi N-terminaalissa tai lähellä sitä johtaa suositeltavaan 20 varausretentioon molekyylin tässä päädyssä. Peptidit, joissa on emäksisiä aminohappoja C-terminaalissa tai lähellä sitä : osoittavat enimmäkseen C-terminaalifragmentteja. Trypsiini on • · · jV. siis edullinen lähtöhajotukseen. Suurenergia-CID-tietojen • · tulkinnasta saatiin lopuksi 14 sekvenssiä (katso taulukko 2 • · • 25 ja kuvio 9) .

• · · -* ' • · · · • · · **” CID-spektrin analysointi toi esiin, että tryptisen hajotta- • · · *·* * misen aikana tapahtui sivurektioita. Identifioitiin kaksi trypsiiniautolyysituotetta, kohdissa m/z 659,3 ja 1153,6 ·.·.· 30 (kuvio 9). Pitkän inkubointiajan ja sopivan huuhteluaineen • · · puutteessa joidenkin tryptisten peptidien N-terminaalit ; karbamyloituivat. Koska tällaiset sivurektiot saattavat estää • · · !..* Edman-degradaatiota N-terminaalimuunnelmat saattavat olla • · *!’ jopa hyödyllisiä massaspektrometrisekvensoinnissa. Näiden • · V.· 35 muunneltujen peptidien CID-analyysi auttoi vahvistamaan • · · i : joitain yllä mainituista sekvensseistä, eräässä tapauksessa saatiin keino erottaa N-terminaalileusiini ja -isoleusiini (kuvio 10) .

48

Esimerkki 5

Rot axunaksas ialyy 1 i t rans f eraas i Spesifisen cDNA-koettimen PCR-monistaminen 5 a2,3N:stä johdetuista neljästätoista peptidistä yhdentoista aminohapposekvenssin perusteella syntetoitiin kaksikymmentä- kaksi degeneraattioligonukleotidiyhdistelmää sekä sense- että antisense-säikeistä (Genosys). Lähtö-PCR-kokeet laadittiin 10 havainnon perusteella, että peptidi 11 ja peptidi 1 ovat homologisia alueen kanssa, joka sijaitsee lähellä aiemmin kloonatun sialyylitransferaasin, Galpl,4GlcNAc-a2,6-sialyyli- transferaasin (Weinstein J. et ai, J. Biol. Chem. 257:13835- 13844, 1982) ja yllä kuvatun a2,3-0:n keskusta (kuvio 11).

15 Suoritettiin kaksi PCR-koeryhmää käyttämällä joko sense- aluketta peptidille 11 tai antisense-aluketta peptidille 1 sijoitettuna rinnakkain toisten peptidien oligonukleotidi- alukkeiden kanssa ja ensimmäinen cDNA-säie syntetoituna rotanmaksan kokonais-RNA templaattina. Aloitettiin templaa- 20 tinsulatusvaiheella (5 minuuttia 94 °C:ssa), suoritettiin monistaminen GeneAmpTM -DNA-monistusreagenssipakkauksella : AmpliTaqTM DNA-polymeraasin avulla (Perkin Elmer Cetus) , 35 • · · sykliä, 1 minuutti 94 °C:ssa, 1 minuutti 37 °C:ssa ja 2 • · minuuttia 72 °C:ssa, lopuksi lopullinen laajennusvaihe (15 • · 25 minuuttia 72 °C:ssa). Näistä PCR-reaktioista luotiin useita ’*'! cDNA-fragmentteja. Olettaen, että peptidi 11 ja peptidi 1 • · · ’*’* edustivat jatkuvaa aminohappopätkää toteutettiin lisää PCR- • · · *·* * koesarjoja käyttämällä pesäaluke "nested primer strategy" - menetelmää (Mullis K.B. and Faloona F., Methods Enzymol. 30 155:335-350, 1987) spesifisten DNA-fragmenttien identifioimi- • · · :...ί seksi. Tätä lähestymistapaa käyttäen identifioitiin spesifi- : nen cDNA-fragment ti, llsense-14antisense (lls-14as) . Tämä • · · #··/ lls-14as-cDNA-fragmentti subkloonattiin Bluescript-plasmidiin • · *Γ (Stratagene) ja sekvensoitiin käyttämällä universaalialuk- • · 35 keitä (Stratagene) ja Sequenase Version 2.0 kit -pakkausta (USB) .

Sialyylitransferaasin kloonaus 49

Koottiin cDNA-kirjasto rotanmaksa poly A+ RNA:sta käyttämällä Pharmacian cDNA-syntetointipakkausta (Gubler U. and Hoffman 5 B.J., Gene 25:263-269, 1983. Oligo (dT) alukkeistettu cDNA

syntetoitiin ja ligatoitiin EcoRI-Notl-linkkereihin. cDNA:t ligatoitiin sitten EcoRI-pilkottuun IgtlO-DNA:han (Promega). Kun oli suoritettu in vitro -pakkaus DNA-pakkausuutteella (Stratagene) fagit levitettiin isäntäkantaan E. coli C600 10 hfl- (Promega). Tutkittiin noin miljoona täplää tällä lls-14as-cDNA-koettimella (Gubler U. and Hoffman B.J., Gene 25:263-269, 1983). Kahdesta positiivisesta fagista (18-2 ja 9-1) puhdistettiin täplät ja subkloonattiin Bluescript-plasmidivektoriin (Stratagene) sekvensointia varten.

15 cDNA-kloonien eristäminen Käytettiin Dayhoff Protein -tietokantaa tutkittaessa homolo- giaa peptidisekvensseistä tunnettujen proteiinien avulla.

20 Tästä tutkimuksesta saatiin ensimmäiset todisteet a2,3-N:n ja muiden kloonattujen sialyylitransferaasien homologiasta.

: Tässä analyysissä peptidin 11 (taulukko 2) havaittiin olevan • · · homologinen sekvenssien kanssa, joita oli läsnä sekä rotan • · että ihmisen p-galaktosidi-a-2,6-sialyylitransferaaseille 25 (nämä kaksi entsyymiä ovat 88 % konservoituneita; Gu T.J. et ’**1 ai, FEBS 275:83-86, 1990, ja Lance P. et ai, Biochem.

• « · *·*· Biophys. Res. Commun. 164:225-232, 1989). Kun tätä analyysiä • · · *·’ laajennettiin käsittämään myös sian a2,3-0 -sekvenssi vielä erään peptidin, peptidin 1 (taulukko 2) havaittiin olevan ·.·.· 30 homologinen molempien kloonattujen sialyylitransferaasien • · · sekvenssien kanssa. Kun nämä peptidit asetettiin rinnakkain .·* : aiemmin kloonatuissa sialyylitransferaaseissa läsnä olevien • «« I..’ sekvenssien kanssa näytti ilmeiseltä, että nämä kaksi pepti- • · *1* diä edustavat jatkuvaa aminohappopätkää, joka oli pilkkoutu- • · :.V 35 nut arginiinitähteestä trypsiinihajotuksen aikana (kuvio 11).

• · · • · • · • · ·

Galpl,3(4)GlcNAc-a2,3-sialyylitransferaasista johdettujen 50

Taulukko 2 peptidien aminohapposekvenssit 5 _

Peptidi Aminohapposekvenssi Tähteen paikka Gal-a2,3- _STrssä (kuvio 4)_ I LeuAsnSerAlaProValLvs 186-192 10 2 MetAlaAlalleLys 340-344 3 GluProProluIleArg 264-269 4 GlvLvsAspAsnLeuIleLvs 130-136 5 LeuProAlaGluLeuAlaThrLys 69-76 6 AlalleLeuSerValThrLys 137-143 15 7 IleLeuAsnProTyr 270-274 8 LeuThrProAlaLeuAspSerLeuHisCysArg 147-157 9 ValSerAlaSerAspGlyPheTrpLys 247-255 10 VallleThrAspLeuSerSerGlylle 366-374 II IleAspAspTvrAspIleVallleArq 177-185 20 12 GluPheValProProPheGlylleLys 121-129 13 LeuGlyPheLeuLeuLys 59-64 : 14 AspSerLeuPheValLeuAlaGlyPheLys 222-231 • · · • · · • · · • · • ·

Alleviivatut sekvenssit osoittavat homologi suutta muiden • · 25 tunnettujen sialyylitransferaasientsyymien kanssa (25, 26) **** Kursivoitu aminohappo on ainoa ero Gal-a2,3-ST-cNDA-nukleoti- • · · ”” disekvenssistä johdettuun aminohapposekvenssiin nähden.

• · · • · ·

Havainto, että peptidi 11 ja peptidi 1 ilmensivät homologi- φ 30 suutta sekvenssin kanssa, joka on aiemmin identifioitu kon- • · · servoituneeksi homologia-alueeksi kahden muun kloonatun .·. : sialyylitransferaasin keskellä oli perusta kloonausstrate- • · · giallemme (kuvio 11) . Oletimme, että peptidi 11 ja peptidi 1 • · saattaisivat sijaita lähellä proteiinin keskustaa, näin ollen • · ·.·.* 35 PCR-kokeet laadittiin luomaan pitkä cDNA-koetin. PCR-kokeissa • · · syntetoitiin sekä sense- että antisense-degeneraattioligo-nukleotidi-alukkeet neljäntoista sialyylitransferaasipeptidin aminohapposekvenssien perusteella. Näissä kokeissa aluke 11- 51 sense ja 1-antisense sijoitettiin rinnakkain muiden alukkei-den kanssa a2,3-N:n pitkien cDNA-fragmenttien monistamiseksi. Olettaen, että peptidi 11 ja peptidi 1 edustivat jatkuvaa aminohappopätkää aluketta 11 ja aluketta 1 käytettiin sitten 5 "nested primer strategy" -menetelmässä (Mullis K.B. and Faloona F., Methods Enzymol. 155:335-350, 1987) spesifisten DNA-fragmenttien identifioimiseksi. Alukkeita 11-sense ja 1-antisense käyttämällä monistettu fragmentti oli lähes samankokoinen kuin fragmentti, joka monistettiin käyttämällä Ι-ΙΟ sense- ja 14-antisense-alukkeita viitaten siihen, että tuotettu fragmentti oli tulosta alukkeiden spesifisestä lämpökäsittelystä, ei tekotuote.

Kun ll-sense/14 antisense -fragmentti kloonattiin ja karakte-15 risoitiin ilmeni, että peptidit 11 ja 1 ovat tosiaan jatkuvia. Verratessamme cDNA-fragmenttisekvenssiä kahteen kloonattuun sialyylitransferaasiin (Weinstein J. et ai, J. Biol. Chem. 262:17735-17743, 1987) havaitsimme, että homologisuus alkaa peptidistä 1 ja jatkuu kahdeksantoista aminohapon 20 verran. Homologisuuden perusteella uskomme, että lls-14as-cDNA-fragmentti monistui sialyylitransferaasi-mRNA:sta. Sek- : venssi indikoi myös, että cDNA-fragmentti ei ollut • · ·

Galpl, 4GlcNAc-a2,6-sialyylitransf eraasin fragmentti, jota • · esiintyy runsaasti rotan maksassa (Weinstein J. et ai, J.

• · 25 Biol. Chem. 257:13835-13844, 1982).

• · · • · · · • · · **“ ll-sense/14-antisense -fragmenttia käytettiin tutkittaessa • · · oligo-dT-alukkeistettua rotanmaksa-cDNA-kirjastoa, josta saatiin kaksi positiivista kloonia 1 miljoonasta tutkitusta 30 täplästä. Positiivisten kloonien karakterisoinnissa paljas- • · · • ί tui, että klooni ST3N-1 sisälsi 2,1 Kb:n insertin kloonin .·. j ST3N-2 ollessa huomattavasti lyhyempi, pituus vain 1,5 Kb.

• · · I..* Northern-analyysi indikoi, että Gal-a2,3-ST-mRNA oli 2,5 Kb • · • · *** (katso alla) viitaten siihen, että klooni ST3N-1 saattaisi • · 35 sisältää Gal-a2,3-ST:n täydellisen koodaussekvenssin.

··« • · • · • · · ct2# 3-N-sialyylitransferaasin primaarirakenne 52

Sekvenssianalyysi paljasti, että klooni ST3N-1 sisälsi sialyylitransferaasin täydellisen lukukehyksen (kuvio 2) . Se 5 muodostuu 82 emäsparin 5'-translatoitumattomasta alueesta, 1122 emäsparia pitkästä avoimesta lukukehyksestä ja noin 1 Kb:n 3'-translatoitumattomasta alueesta ja poly (A) -hännästä. Kloonin ST3N-1 avoin lukukehys koodaa 374 aminohapon proteiinia, jonka ennustettu molekyylipaino on 42033. Yhden 10 ainoan aminohappo-eron poikkeuksella avoin lukukehys koodaa kaikkia puhdistetun sialyylitransferaasin massaspektrometri-analyysistä saatuja 14 peptidiä. Tämä vahvistaa sen, että kloonin ST3N-1 cDNA on tosiaan sialyylitransferaasin cDNA. Kuten muiden kloonattujen glykosyylitransferaasien kohdalla 15 on havaittu (Paulson J.C. and Colley K.J., J. Biol Chem. 264, 17615-17618, 1989,) a2,3-N:n ennustetaan omaavan lyhyen N- terminaalin sytoplasmisen hännän, noin 20 tähteen signaali/-kiinnittymissekvenssin ja laajan C-terminaalialueen, joka kattaa entsyymin katalyyttisen domeenin.

20

Esimerkki 6 : Rotan liukoisen sialyylitransferaasin ekspressio • · · • · · • · · • · • ·

Tuotettaessa sialyylitransferaasin liukoista muotoa entsyymi- • · 25 karakterisointia varten koottiin entsyymin katalyyttisen ***I domeenin ja insuliinipilkkoutuvan signaali sekvenssin sisältä- • · · *··* vä fuusio-proteiini nisäkäsekspressiovektoriin pSVL (Pharma- • · · ’·’ * cia) . Tarkemmin sanoen sialyylitransferaasin katalyyttinen domeeni PCR-monistettiin käyttämällä 5'-aluketta asemassa 30 +182 (kuvio 11) alavirtaan transmembraanidomeenista, ja 3'- • · · aluketta sijoitettuna 3'UTR ylävirtaan polyadenylaatiokoh- ; dasta. PCR-reaktiot toteutettiin edellä kuvattuun tapaan • · ·

käsittelyllä 55°C:ssa. PCR-tuote subkloonattiin pGIR-199:N

• · “* (lahja K. Drickamerilta) BamHI-EcoRI-kohtiin, ja saatiin • · ·.·.· 35 fuusioitua sialyylitransf eraasisisällytys pGIR-vektorissa • · · ί : läsnäolevaan insuliinisignaalisekvenssiin (Huseh E.C. et ai, J. Biol. Chem. 261:4940-4947, 1986). Saatu fuusioproteiini 53 insertoitiin ekspressiovektorin pSVL Xbal/Smal -kohtiin ja tuloksena oli ekspressioplasmidi pDBl22.

Väliaikaista ekspressiota varten COS-1 -soluissa ekspressio-5 plasmidi pBDl22 (20 mg) transfektoitiin COS-1 -soluihin 100 mm:n maljoissa lipofektiinin avulla valmistajan ohjeiden mukaisesti (BRL). 48 tunnin kuluttua soluviljelyväliaine koottiin ja konsentroitiin käyttämällä Centricon 10 -mikro-konsentraattoria. Konsentroidusta väliaineesta tutkittiin 10 sialyylitransferaasiaktiivisuus käyttämällä oligosakkarideja akseptrosubstraatteina. Sialihapon siirtymistä oligosakkariin seurattiin ioninvaihtokromatografiän avulla (Sadler J.E. et ai, J. Biol. Chem. 254:5934-5941, 1979, Paulson J.C. et ai, J. Biol Chem. 264, 10931-10934, 1989).

15

Osoittaaksemme, että klooni ST3N-1 ei koodaa a2,3-N-sialyyli-transferaasia etenimme ekspressoimalla klooni COS-1 -soluissa. Kloonin ST3N-1 aminohapposekvenssi paljasti, että proteiini sisältää NH2-terminaalin signaali/kiinnittymiskohdan, 20 jonka ennustetaan kiinnittävän entsyymin Golgin laitteeseen solussa (Paulson J.C. and Colley K.J., J. Biol Chem. 264, : 17615-17618, 1989) . Entsyymin funktionaalisen analyysin ··· •***j helpottamiseksi halusimme tuottaa entsyymin liukoisen muodon, • « joka ekspressoituna erittyisi solusta. Koottiin fuusiopro- • ♦ 25 teiini käyttämällä pilkkoutuvaa insuliinisignaalisekvenssiä korvaamaan signaali/kiinnittymissekvenssi sialyylitransfe- **" raasin NH2-terminaalissa. Kun ekspressioplasmidia pBDl22 • · · **’ * ekspressoitiin COS-1 -so-luissa entsyymiä erittyi soluista ja osoitti sialyylitransferaasiaktiivisuutta.

• · · 30 • · · α2,3-N-sialyylitransf eraasin entsymaattiset ominaisuudet .·. : karakterisoitiin ensin puhdistetulla proteiinilla (Weinstein • · · #·./ J. et ai, J. Biol. Chem. 257:13845-13853, 1982). Sialyyli- • · *1* transferaasin havaittiin käyttävän p-galaktosidiakseptoreita, ·.·.· 35 jotka sisälsivät joko Galpl,3GlcNAc tai Galpl,4GlcNAc -sek- venssin, jotka muodostavat NeuAca2,3Galpl,3GlcNAc ja NeuAca2,3Galpl,4-GlcNAc -sekvenssit, joiden usein havaitaan päättävän kompleksityyppisiä N-sitoutuneita oligosakkarideja.

54

Entsyymit, jotka erittyvät soluista, jotka oli transfektoitu ekspressioplasmidilla pBDl22 pystyivät käyttämään β-galaktosidiakseptoreita, jotka sisälsivät joko Galpl,3GlcNAc tai Galpl,4GlcNAc -sekvenssin (taulukko 2). Solut, jotka 5 transfektoitiin parentaalivektorilla eivät erittäneet tällaista sialyylitransferaasiaktiivisuutta. Erittynyt entsyymi pystyy myös sialyloimaan asialo-al-happoglykoproteiinia. Tämä tieto on yhtäpitävä puhdistetun a2,3-N:n entsymaattisten ominaisuuksien kanssa.

10

Esimerkki 7 «2,3-N-sialyylitransferaasin ekspressio bakuloviruksessa

Terminaalitetrasakkaridi sialyyli Lewis* (Slex:SAa2,3-15 Galpl,4GlcNAc[ai,3Fuc]) on identifioitu P-selektiinin ja E-selektiinin ligandiksi, ja Slex -rakenteen sisältävä synteettinen oligosakkaridi on mahdollinen selektiini/ligandi-interaktion estäjä. Täydellinen kemiallinen Slex-synteesi on teknisesti ja taloudellisesti vaikeaa, mutta käyttämällä 20 spesifisiä glykosyylitransferaaseja kiinnittämään terminaali-siaalihappo ja fukoositähteet kemiallisesti syntetoituun : :*j ydinsakkaridiin mahdollistaa vapaan Slex:n syntetoinnin.

• · » a2,3-N-sialyylitransferaasia koodaava geeni kloonattiin ro- • · • · tanmaksa-cDNA-kirjastosta, ja sillä osoitettiin olevan spesi- • · 25 fistä a2,3(Galpl,3/4-GlcNAc)-sialyylitransferaasiaktiivisuut- **** ta kun sitä ekspressoitiin transfektoiduissa COS-1 -soluissa • · · "" (Wen et ai, käsikirjoitus valmisteilla). cDNA-kloonin osa, • · · ’·* * joka koodaa polypeptidin entsymaattista osaa, muttei sisällä hydrofobista signaali/mem-braanikiinnittymisdomeenia liitet- 30 tiin preinsuliinisignaalisekvenssiin muodostamaan cDNA, joka

koodaa liukoista erittyvää a2,3-NST-proteiinia. Tämä cDNA

.·. ; kloonattiin bakulovirus-siirtovektoriin ja käytettiin trans- • · ♦ I./ fektoimaan Sf-9 -hyönteissoluja villin tyypin bakulovirus- • · **· DNA:n läsnäollessa. a2,3-N-sialyylitransferaasi-cDNA:ta si- • · 35 sältävät rekombinanttivirus eristettiin, puhdistettiin ja • · · : ϊ käytettiin Sf-9 -solujen infektointiin. Infektoidut solut erittivät a2,3-NST:tä suuria määriä väliaineeseen, ja tämä proteiini puhdistettiin ioninvaihtokromatografiän avulla.

55

Sf-9 -solut hankittiin ATCCrstä. DNA-vektorit pGIRl99 ja pBlueBac saatiin toisaalta J.C. Paulsonilta ja toisaalta Invitrogeniltä (San Diego, CA) . Sf-9 -soluja kasvatettiin 5 pyörivässä viljelmässä (spinner culture) solutiheyksien ollessa 0,3-1,5 miljoonaa solua millilitraa kohti Graces Insect Media -väliaineessa (johon oli lisätty 0,33 % laktal-bumiinihydrolysaattia ja 0,33 % yeastolate-tuotetta) , joka saatiin Gibcolta (Grand Island, NY), plus 10 % hiiva-inakti-10 voitua vasikansikiö-seerumia (JRH Biosciences, Lenexa, KS) . Tästä väliaineesta käytetään nimitystä GCMS+10%FCS.

a2,3-N-sialyylitransferaasin liukoinen muoto tehtiin seuraa-vaan tapaan. Koko a2,3-N-sialyylitransferaasi-mRNA:ta vastaa-15 vaa cDNArta käytettiin PCR-templaattina käyttämällä kahta oligonukleotidiamplimeeria, jotka hybridisoituivat (5') asemaan juuri C-terminaali yhdistelmässä signaali/kiinnitty-misalue entsyymissä ja (3') ylävirtaan 3’ translatortumattoman alueen poly(A)-lisäyskohdasta. Molemmat oligonukleo-20 tidit koodasivat BamHI-kohtia 5'-päädyissään, mikä mahdollisti PCR-tuotteiden kloonaamisen pGIRl99:n BamHI-kohtaan, : liittyneenä kehykseen preinsuliinisignaalisekvenssin kanssa.

• · · ·*·*; Sivuavia Nhel-kohtia käytettiin vapauttamaan geenifuusio, ja • · tämä cDNA-fragmentti kloonattiin bakulovirus-siirtovektoriin 25 pBluebac bakulovirus-poly-hedriinipromoottorin säätelyssä.

*”1^ Kaikki yhdistelmä-DNA-manipulaatiot suoritettiin olosuhteis- sa, jotka entsyymin valmistajien ohjeiden mukaan olivat • · · *·’ * suositeltavat. pBluebac-vektori sisältää E.coli β-galaktosi- daasigeenin eri bakuloviruspromoottorin säätelyssä, ja viruk-30 set, jotka on yhdistetty ja jotka ovat ottaneet DNA-vektorin • · · sisäänsä voivat konvertoida kromofori X-gal:n siniseksi .·. : tuotteeksi.

• · · • · • · · • · • · Ί* Yhdistelmä-bakuloviruksen luomiseksi käytettiin MaxBAc- • · ·.·.· 35 ekspressiosysteemiä (Invitrogen) seuraamalla tarkasti tuotta- • · · jän suosittelemia menettelytapoja. Lyhyesti sanoen plasmidi ja villin tyypin virus-DNA sekoitettiin ja käytettiin transfektoimaan Sf-9 -soluja kalsiumfosfaattimenetelmällä.

56

Transfektoidut solut tuottivat virusta ja erittivät niitä viljelyvällaineeseen. Yhdistelmävirus identifioitiin täpläko-keissa sinisen värin perusteella, jota tuotti β-galaktosi-daasin vaikutus X-gal:iin, jonka pitoisuus plakkiväliaineessa 5 oli 150 μρ/ιηΐ, ja puhdistettiin villin tyypin viruksista toistuvalla laimennos/täplän-muodostuksella. Puhdistetut virukset levitettiin 500 ml:aan infektoimalla tuoreita Sf-9 -soluja. Useista klooneista tutkittiin niiden kykyä saada erittymään cx2,3-N-sialyylitransferaasia infektoitujen solujen 10 väliaineeseen testaamalla alikvootti väliainetta suoraan alla kuvatulla radioaktiivisen sialyylitransferaasin kokeella.

Kasvatettaessa suuria virusmääriä 3 x 106 Sf-9 -soluja 25 cm2:n kudosviljelyastiässä 5 mlrssa GCMS+10%FCS infektoitiin 15 yhdellä villin tyypin virusta sisältämättömällä sinisellä täplällä ja annettiin kasvaa 5-7 päivää 27 °C:ssa. Saatu 5 ml viruskanta selkeytettiin sentrifugoimalla ja levitettiin vielä. Logaritmisessa kasvuvaiheessa (0,5-1,5x10® solua/ml) olevia Sf-9-so-luja infektoitiin pitoisuudella lxlO7 solua 20 per ml infektoitumiskertoimella (moi) 1 olettaen viruspitoi- suudeksi 5 ml kanta lxlO8 täpliä muodostavaa yksikköä (plaque forming units) (pfu) per millilitra. Solut laimennettiin ·’·*; uudestaan kymmenenkertaiseksi GCMS+10%FCS: ssa ja annettiin • · kasvaa 5-7 päivää 27 °C:ssa. Saatu virus puhdistettiin ja 25 viruspitoisuus määritettiin täpläkokeella, yleensä se oli yli 9 **|j 109 pfu/ml. a2,3-N-sialyylitransf eraasin ekspressoimiseksi ’**! levitettiin 2,5xl09 Sf-9 -soluja logaritmisessa kasvuvaihees- • ♦ · • · · * saan Ten Tray Cell Factor -kerroksille (Nunc, Naperville, IL), nimitys CF-10. Jokaisen CF-10:n kokonaiskasvuala oli • · ♦ 2 *.ϊ.* 30 6000 cm ja solut infektoitiin rekombinantti-bakuloviruksella ·...· moi=5 tilavuudessa 300 ml. Kun oli inkuboitu 1 tunti 9 : lisättiin 1 litra Excell-400: aa (JRH Biosciences) , seerumi- • ♦♦ • · .···. tonta väliainetta, ja soluja inkuboitiin 27 °C:ssa 72 tuntia.

• ♦ *·* Väliaine otettiin talteen, selkeytettiin ja suodatettiin 0,2 • · *.·.· 35 pm suoda tusyksikön läpi. Lisättiin tuoretta väliainetta ··· ·...· (Excell 400, johon oli lisätty 2 % vasikansikiöseerumia) , ja soluja inkuboitiin 27 °C:ssa vielä 48 tuntia, sen jälkeen väliaine otettiin talteen, selkeytettiin ja suodatettiin.

57 α2,3-N-sialyylitransferaasiaktiivisuus tutkittiin käyttämällä muunnelmaa julkaistusta koemenetelmästä (Sadler et ai, 1979). 30 μ1:η tilavuudessa sekoitettiin 14 μΐ näytettä, 3,5 μΐ 5 lakto-N-tetraoosia (Galpl,3GlcNAcpl,3Galpl,4Glc) ja 12,5 μΐ alla kuvattua analysointiseosta. Näytteet sekoitettiin nopeasti, pyöritettiin reaktioputken pohjalla ja inkuboitiin 37 °C:ssa 10 minuuttia. Sitten reaktiot laimennettiin välittömästi yhteen millilitraan 5 mM fosfaattipuskuria, pH 6, ja 10 pantiin 0,5 ml:n ioninvaihtopylväseen. Suoritettiin pylvään läpiajo ja yksi ml liuosta koottiin tuikeputkiin ja laskettiin. Yksi yksikkö on entsyymimäärä, joka tarvitaan siirtämään yksi mikromooli sialihappoa akseptoriin minuutissa.

15 Näyte koostui joko pelkästä supernatantista tai supernatan- tista, joka oli laimennettu niin, että reaktiokinetiikka pysyi lineaarirajoissa, noin 100000 cpm pylväsulostuloa.

Analysointiseos valmistettiin kuivaamalla 0,65 ml (50 pCi) [14C] -CMP-sialihappoa (NEN, Boston, MA) ja uudelleensuspendoi- 20 maila 0,65 ml:aan vettä, joka sisälsi 2,3 mg CMP-sialihappoa.

Tähän lisättiin 0,96 IM liuosta natriumkakodylaattipuskuria, : pH 6, 0,48 ml 20 % Triton CF-54:ää, 0,29 ml 50 ml/1 liuosta • · · jV. naudan seerumialbumiinia (kaikki saatuna Sigma-yhtiöltä, St.

♦ ·

Louis, MO), ja vettä kokonaistilavuuteen 8 ml. Analysointi- • · 25 seoksen spesifinen aktiivisuus määritettiin ja seosta säily- **** tettiin -20 °C:ssa. Käytettävä ioninvaihtohartsi oli AG1-X8, ·♦· •••j 200-400 mesh, fosfaattimuoto (Biorad, Richmond, CA) .

♦ ♦ · • · « «2,3-N-sialyylitransferaasin konsentrointi ja puhdistaminen ♦ ; : 30 ♦ ·· '-t ^ : : a2,3-NST:tä sisältävä väliaine (1-3 litraa) suodatettiin ja • · · .·* · konsentroitiin noin 250 ml:aan Amicon CH2PRS -spiraalipanos- • * · systeemillä, jossa oli SlYlO-panos. Yksikköä ajettiin sitten • · *** diasuodatusmuodolla suolan poistamiseksi konsentroidusta ♦ * *.!.· 35 supernatantista kolmella tilavuudella 10 mM kakodyy 1 ihappoa, 25 mM NaCl, 25 % glyserolia, pH 5,3 (puskuri A). Näytteet pantiin sitten puskurilla A tasapainotettuun S-Sepharose Fast Flow -pylvääseen (2,5 x 17 cm) (Pharmacia), virtausnopeus 2 58 ml/min. Kun koko näyte oli pakattu pylvästä pestiin puskurilla A kunnes pylväseffluentin OD280 oli palautunut peruslinjalle (1,6 pylvästilavuutta). a2,3-NST eluoitiin sitten pylväästi käyttämällä 50 mM kakodyylihappoa, 1 M NaCl, 25 % 5 glyserolia, pH 6,5. a2,3-NST:tä sisältävä fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin vasten 1 L 50 mM kakodyylihappoa, 0,5 M NaCl, 50 % glyserolia, pH 6,0, ja säilytettiin sitten - 80 °C:ssa.

10 Esimerkki 8

Rotan «2,3-N-sialyylitransferaasin kudosjakautuminen

Karakterisoitaessa rotan kloonatun a2,3-N-sialyylitransfe-raasin kudosjakautumista eristettiin kokonais-RNA:ta rotan 15 eri kudoksista ja koetinkäsiteltiin 32P-leimatulla sialyyli-transferaasin cDNArlla. Kaikissa testatuissa kudoksissa oli havaittavissa hybridisoituminen noin 2,5 Kb:n mRNA:han. Kahden kloonatun sialyylitransferaasin osalta a2,3-N-sialyy-litransferääsi ilmensi differentiaaliekspressiota rotan 20 kudoksissa. Suurin a2,3-N-sialyylitransferaasi-mRNA -pitoisuus havaittiin aivoissa. Maksa, munuainen, koolon, sydän, :munasarja ja keuhkot ilmensivät keskinkertaisia pitoisuuksia, • · · Γ.'. ja vain pieniä mRNA-pitoisuuksia löydettiin leuanalussylki- • · rauhasesta, pernasta ja ohutsuolesta. Sen sijaan suurin • · 25 Galpl,4GlcNAc-a2,6-sialyylitransferaasi mRNA -pitoisuus (4,7 '*’! ja 4,3 Kb, 41, 46) oli havaittavissa rotan maksassa ja leuan- • · · “** alussylkirauhasessa ja pieniä mRNA-pitoisuuksia sydämessä, • · · *·* munasarjassa ja aivoissa.

3 0 Esimerkki 9 • · ·

Konservoitunut homolgia-alue katalyyttisellä domeenilla .·* ; Sialyylitransferaasiperheen konservoitunut alue • · · • · • · · • · • · *** Kolmen kloonatun sialyylitransferaasin primaarirakenteen • · ϊ.ί.ϊ 35 vertailussa ilmeni laaja homologia-alue (kuvio 12) . tämä alue koostuu 55 aminohaposta tähteestä 156 tähteeseen 210 a2,3-N- • · · sialyylitransferaasissa, aminohappoidenttisyys oli 42 % ja kaikissa kolmessa entsyymissä konservoituneita aminohappoja 59 oli 58 %. Näiden kolmen sialyylitransferaasin sekvensseissä ei ilmennyt huomattavaa homologisuutta tämän alueen ulkopuolella. Koska tämä homologia-alue sijaitsee lähellä entsyymien katalyyttisen domeenin keskustaa tämä alue saattaa edustaa 5 näiden sialyylitransferaasin entsymaattiselle aktiivisuudelle tarpeellisia konservoituneista rakenteita.

Kolme glykosyylitransferaasiperheen sialyylitransferaasi-jäsentä on kloonattu. Vaikka 85 %:lla kaikkien kolmen kloona-10 tun sialyylitransferaasin sekvensseistä ei ole huomattavaa homologisuutta, 55 aminohapon alue keskellä jokaista molekyyliä on erittäin konservoitunut ja viittaa sialyylitransfe-raasiperheen proteiiniyksikköön. Proteiiniyksikkö on hyvin säilynyt aminohapporyhmä spesifisellä alueella. Muut amino-15 happotähteet tämän alueen ulkopuolella ovat tavallisesti huonosti säilyneitä, eli saman yksikön sisältävien proteiinien kokonaishomologisuus on pieni. Tämän määrityksen mukaan näiden kolmen kloonatun sialyylitransferaasin primaariraken-teiden konservoitunut alue on sialyylitransferaasiperheessä 20 ilmenevä yksikkö.

: Proteiiniyksiköt ovat usein osallisia katalyysissä ja • · · ligandi-sitoutumisessa (Hodgman T.C., Comput. Applic. Biosci.

• · 5:1-13, 1989, Bairoch A., Prosite: A Dictionary of Protein • · 25 Sites and Patterns, 5th edn., University of Geneva, 1990, ja Sternberg M.J.E., Nature 349:111, 1991). Kaikki kolme kloo- • · · ··** nattua sialyylitransferaasia katalysoivat sialihapon siirty- • · · *·* ' mistä CMP-NeuAc: sta terminaaligalaktoosin a2,3 tai a2,6- sidokseen muodostamaan seuraavat sekvenssit: \:V 30

NeuAcg2,3Galpl, 3 (4)GlcNAc- (ST3N) ; NeuAca2,3Galpl, 3GlcNAc- (ST30) *:./ NeuAca2,3Galpl, 4GlcNAc- (ST6N) • · • · · :X: 35 : *: Kaikilla kolmella entsyymillä on yhteinen funktio. Yli 50 % • · · konservoituneen alueen tähteistä on joko varautuneita tai polaarisia aminohappoja, jotka yhdenmukaisesti sijaitsevat 60 entsyymien pinnalla. Kuusi tämän alueen varautuneista tähteistä on identtistä kaikissa kolmessa sialyylitransfe-raasissa. On huomiota herättävää, että konservoituneeen alueen yhdessä pätkässä on seitsemän aminohappotähdettä, 5 jotka ovat identtisiä kaikilla kolmella kloonatulla sialyy-litransferaasilla -Asp.Vai.Gly.Ser.Lys.Thr.Thr (kuvio 12).

Esimerkki 10

Uuden sialyylitransferaasin kloonaaminen käyttämällä konser-10 voitunutta homologia-aluetta Käytettiin konservoitunutta homologia-aluetta kloonattaessa vielä eräs sialyylitransferaasigeeniperheen jäsen.

15 PCR-kloonaus degeneraattinukleotidein

Syntetoitiin (Genosys) kaksi degeneraattioligonukleotidiä, jotka vastasivat konservoituneen homologia-alueen 5' ja 3'-päätyjä (kuvio 13). 5'- ja 3'-alukkeiden sekvenssit olivat 20 51GGAAGCTTTGSCRNMGSTGYRYCRTCGT ja : 51CCGGATCCGGTGRGTYTTNSNSCCACRTC (N=A+G+T+C, s=g+c, r=a+g, • · » j’·*. M=A+C, Y=C+T) . PCR-kokeet suoritettiin käyttämällä 100 pmol • · jokaista aluketta ja ensimmäinen cDNA-säie valmistettiin • · 25 vastasyntyneen rotan aivoista templaatiksi. Monistaminen “Ί toteutettiin 30 syklillä, 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, • · « *“* 37 °C:ssa 1 minuutin ajan ja 72 °C:ssa 2 minuutin ajan. PCR- • · · *·* tuotteet hajotettiin BamHI:llä ja HindIII:lla ja subkloo- nattiin näihin Bluescript KS -kohtiin (Stratagene, 11099 30 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) . Subkloonit • ♦ · karakterisoitiin sekvensoimalla T3-alukkeella. Monistettua » .·. : fragmenttia yhdestä näistä subklooneista, SM1, käytettiin ♦ ·· alla olevaan tapaan tutkittaessa sialyylitransferaasia • · 'V koodaavaa SMl:n sisältävää geeniä.

• · • · · r- • · * 35 • « -7 s ··· SMl:n sisältävän geenin kloonaus 61

Satunnaisalukkeistettua vastasyntyneen rotan aivon cDNArta ligatoitiin EcoRI-Notl-linkkereihin ja sen jälkeen EcoRI-hajotettuun AgtlO:een. Saatu kirjasto pakattiin käyttämällä Stratagene Gigapack II -pakkausuutetta ja maljättiin E. coli 5 C600 hfl -alustalle. Kloonatulla SMl-PCR-fragmentilla tutkit tiin noin 106 plakkia. Neljä kloonia, STXl-4, puhdistettiin ja subkloonattiin Bluescriptin (Stratagene) Notl-kohtaan tarkempaa analysointia varten.

10 Northern-analyysi

Rotan kudoksista saatu kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä aiemmin kuvattua happofeno1imenetelmää (Chomoznsyi P. et ai, Anal. Biochem. 162:136-159, 1987). Vastasyntyneiden RNA-

15 näytteitä eristettiin rotanpoikasista neljän päivän sisällä syntymästä. RNA elektroforesoitiin 1 % agaroosigeelissä, joka sisälsi formaldehydiä, siirrettiin nitroselluloosalle ja hybridisoitiin standardimenetelmin (Kriegler M. , Gene transfer and expression, Stockton Press, N.Y., N.Y., 1990). Nort-20 hern blot -tulokset tutkittiin STXl:stä eristetyn geelipuh-distetun, radioaktiivisesti leimatun 900 emäsparin EcoRI

: -fragmentin avulla.

• · · • · · • · · • · • ·

Liukoisen STX-muodon kokoaminen • · 25 STX:n katkaistu muoto, jossa ei ollut pen-lukukehyksen **** ensimmäisiä 31 aminohappoa, valmistettiin PCR-monistuksen « · · *·“ avulla 5'-alukkeella, jossa oli kehyksensisäinen BanHI-kohta • · · *·* ’ ja 3' -aluke 50 emäsparia alavirtaan lopetuskodonista.

Monistamiseen käytettiin 30 sykliä, 1 minuutti 94 °C:ssa, 1 30 minuutti 45 °C:ssa ja 2 minuuttia 72 °C:ssa. Fuusiovektori pGIR201-protA koottiin insertoimalla BcII/BamHI-fragmentti, ; joka oli eristetty pRlT5: stä (Pharmacia LKB Biotech, Inc.

• «· !..* 1025 Atlantic Avenue, Suite 101, Alameda, CA 94501) ja joka * · • · koodasi proteiini A IgG -sitoutumisdomeenia pGIR201:n • · 35 (lahjoitus Dr. K. Drickamerilta, Columbia University) BamHI- • · · : : kohtaan. Monistettu fragmentti subkloo-nattiin pGIR201protA:n • · ·

BamHI-kohtaan ja tuloksena oli STX:n fuusioituminen insulii-nisignaalisekvenssiin ja vektorissa läsnäolevaan proteiiniin 62 A. Fuusioproteiinin sisältävä Nhe-fragmentti subkloonattiin plasmidiin pSVL ja saatiin ekspressioplasmidi AX78.

STXsxi liukoisen muodon ekspressio 5

Ekspressioplasmidi AX78 (lOug) transfektoitiin COS-1 -soluihin 10 cm maljoissa. Kaksi päivää transfektoinnin jälkeen viljelyväliaine koottiin ja inkuboitiin IgG-Sepharosen avulla (Pharmacia) 1 tunti huoneen lämpötilassa. Helmistä tutkittiin 10 sialyylitransferaasiaktiivisuutta käyttämällä oligisakkari- deja, jäätymisenestoglykoproteiinia, sekagangliosideja ja neuraminidaasi-käsiteltyjä vastasyntyneen rotan aivojen membraaneja akseptorisubstraatteina. Sialihapon siirtymistä näihin akseptoreihin mitattiin ioninvaihdolla (Weinstein J. 15 et ai, J. Biol. Chem. 257:13835-13844, 1987), kokoekskluu- siolla (Id.) ja laskevaa paperikromatografiaa (descending paper chromatography) (McCoy R.D. et ai, J. Biol. Chem. 260:12695-12699, 1985).

20 Identtiset transfektiot suoritettiin pulssiajoleimauskokein (pulse-chase labeling) 36 tunnin ekspressioajan jälkeen : maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa 2,5 ml DMEM-metioniinin kanssa.

• · · ·’·*· Yhden tunnin jälkeen lisättiin 25uCi35S-translabel -leimaa • · (Amersham, 2636 S. Clairebrook, Arlington Heights, IL 60005) • · 2 5 ja maljoja inkuboitiin vielä 3 tuntia. Tämän ajan kuluttua ”*! maljat pestiin ja niitä inkuboitiin yli yön täydellisen *”* DMEM:in kanssa. Leimattu fuusioproteiini eristettiin inkuboi- • · · *·’ ’ maila IgG-Sepharosen avulla (Pharmacia) . Sitomisen jälkeen helmet pestiin, keitettiin Laemalli-näytepuskurissa ja vapau-30 tuneet proteiinit analysoitiin SDS-PAGE/fluorografiän avulla.

• · · • · • · • · · : Karakterisoiduista sialyylitransferaaseista löydetyille • · · .•••I konservoituneille homologia-alueille sukua olevien alueiden • · *Γ PCR-monistus • · • · · -S f— W 35 • · ·

Karakterisoitujen sialyylitransf eraasien konservoi tuneilla homologia-alueilla läsnä olevista aminohapoista noin 70 % on konservoituneita, mutta suurimmat jatkuvat konservoituneet 63 alueet löytyvät konservoituneen homologia-alueen päätyjen aminohapposekvensseistä (kuvio 13). Konservoituneen homologia-alueen C-terminaalipäätyä lähellä sijaitsevan aminohappo-sekvenssin on havaittu sisältävän jatkuvan seitsemän muuttu-5 mattoman tähteen pätkän. Tämän aminohapposekvenssin voimakkaan konservoitumisen ansiosta pystyttiin laatimaan suhteellisen vähän kompleksinen oligonukleotidi 256-kertaisella degeneraatiolla, joka kattoi kaikki havaitut muunnelmat kodo-nin käytössä. Konservoituneen homologia-alueen N-terminaa-10 lipäätyä vastaavan oligonukleotidin kokoaminen oli vaikeampaa. Tällä alueella läsnä olevat aminohapot ovat helpommin muuntuvia kuin konservoituneen homologia-alueen vastakkaisella puolella sijaitsevat. Oligonukleotidin valmistamista haittasi myös aminohappojen suuri kodonrunsaus. Näiden teki-15 joiden kompensoimiseksi konservoituneen homologia-alueen 5'-päädyn oligonukleotidi syntetoitiin 1026-kertaisella degeneraatiolla. Tämän asteen kompleksisuus on lähellä PCRE-kokeissa mahdollisten degeneraatioiden rajaa, mutta saatu aluke kattoi kaikki nukleotidisekvenssit, joiden havaittiin 20 koodaavan tätä konservoitunutta homologia-aluetta.

::: Hermojen kehittyminen on monimutkainen tapahtumasrja, jonka ·’·*: aikana glykosyylitransferaasit ovat dynaamisen säätelyn • · alaisia kuten selvästi ilmenee solupinnan hiilihydraat- 25 tiekspressiossa havaittavista suurista muutoksista. Tämän vuoksi valittiin vastasyntyneen rotan aivot lähteeksi yritet- “II täessä eristää uusia sialyylitransferaaseja. Kun käytettiin • · · » · · * vastasyntyneen rotan aivon cDNArta templaattina PCR-kokeissa degeneraattialukkeilla saatiin monistettua 150 emäsparin vyö, • · · *·Σ·* 30 joka oli yhdenmukainen konservoi tuneen homologia-alueen • · · ·...♦ tunnetun koon kanssa. Subkloonaus ja sekvensointi paljasti, : että vyö oli seos kahta DNA-fragmenttia. Kolmestakymmenestä • · karakterisoidusta isolaatista 56 % koodasi a konservoitunutta • ♦ ’!* homologia-aluetta, loppukloonit koodasivat uniikkia konser- • · *.·.* 35 voitunutta homologia-aluetta, SMl:tä. Hieman yllättäen SM1 ··· ·...· sisältää viisi muutosta aminohapoissa, joiden havaittiin olevan muuttumattomia kolmessa aiemmin kloonatussa sialyyli-transferaasissa. Nämä muutokset vähensivät muuttumattomien 64 tähteiden kokonaismäärää, mutta SMl:n karakterisoinnista saatavat uudet sekvenssitiedot nostavat konsensussekvenssin kokonaiskonservoitumista.

5 SMl:n ennustettu aminohapposekvenssi ei osoita taipumusta mihinkään yksittäiseen konservoituneeseen homologia-aluee-seen. Joissain kohdissa (aminohapot 1, 2, 53, 54) SM1 on samanlainen kuin a2,6-konservoitunut homologia-alue, joissain toisissa kohdissa (aminohapot 8, 9, 54, 55) SMl heijastaa 10 a2,3-konservoituneelta homologia-alueelta löydettäviä sekvenssejä. Tämä konservoitunut homologia-alue on 85-prosentti-sesti konservoitunut, mutta samankaltaisuustaseen mukaan SMl on noin 45-prosenttisesti homologinen muiden sialyyli-transferaasigeeniperheen jäsenten kanssa.

15 SM!:n sisältävän geenin primaarirakenne

Kun suoritettiin sekvenssianalyysi 1,5 Kb:n STXl-kloonille saatii identifioitua jatkuva 375 aminohapon avoin lukukehys, 20 joka koodasi SMl:n konservoitunutta homologia-aluetta, joka oli karakterisoitu aiemmissa PCR-kokeissa (kuvio 14) . STX:n : johdettu aminohapposekvenssi viittaa siihen, että tämä on ·· · ·*.*. tyypin II transmembraaniproteiini kuten aiemmin on havaittu • · kaikkien muiden kloonattujen glykosyylitramsferaasien kohdal- • · 25 la. STXl:n ennnustettu aminohapposekvenssi indikoi hydrofobi- ***! sen alueen läsnäoloa kahdeksan aminohapon päässä proteiinin ·»» **** aminoterminaalista, joka voi toimia signaali/kiinnittymis- • · · *·* * domeenina. Konservoi tunut homologia-alue sijaitsee lähellä proteiinin keskustaa. STX-proteiinin kokonaiskoko ja hydrofo-30 bisen alueen ja konservoituneen homologia-alueen suhteellinen • · · sijainti muistuttaa kloonattujen sialyylitransferaaseille : ominaisia primaarisekvenssejä läheisesti. Vaikka STX ei • · · #··/ ilmennä homologisuutta kloonatuille sialyylitransferaaseille • · *1* kuin konservoituneilie homologia-alueille näiden geenien • · ·.·.* 35 korostuneet rakenteelliset samankaltaisuudet ovat selvä ··· merkki siitä, että STX on uusin tämän geeniperheen jäsen.

STX:n entsymaattlnen karakterisointi 65

Luonnossa esiintyviä sialyylitransferaasien liukoisia muotoja löytyy erilaisista eritteistä ja ruuminnesteistä (Paulson J.C. et ai, J. Biol. Chem. 252:2356-2367, 1977, Hudgin R.L.

5 et ai, Can. J. Biochem. 49:829-837, 1971). Nämä liukoiset muodot ovat tulosta proteolyyttisestä hajotuksesta, joka pilkkoo sialyylitransferaasin runkoalueen vapauttaen katalyyttisen domeenin transmembraanisesta kiinnittyrniskohdas-taan. Liukoisia sialyylitransferaaseja voidaan koota rekombi-10 nantisti korvaamalla endogeenin signaali/kiinnittymisdomeeni pilkkoutuvalla signaalisekvenssillä (Colley K.J. et ai, J. Biol. Chem. 264:17619-17622, 1989). STX:n funktionaalisen analyysin edesauttamiseksi luotiin proteiinin liukoinen muoto korvaamalla ensimmäiset 31 aminohappoa pilkkoutuvalla insu-15 liinisignaalisekvenssillä ja proteiini A IgG -sitoutumisdo-meenilla. IgG-sitoutumisdomeeni lisättiin rakenteeseen auttamaan liukoisen STX-proteiinin havaitsemista. Samanlaiset fuusiot ST3N:n kanssa erittyvät ekspressoituvista soluista aktiivisesti, niitä sitoo IgG-Sepharose ja ne ovat entsymaat-20 tisesti aktiivisia. Kun proteiinin A/STX-fuusion (AX78) sisältävä plasmidi ekspressoitiin COS-1 -soluissa saatiin : eristettyä 85 kd:n proteiini. Fuusioproteiini on kooltaan • · · ·*·*; noin 15 kd suurempi kuin ennustetun polypeptidin paino, mikä • · viittaa siihen, että joukkoa STX-potentiaalisia N-sitoutu- • · .j. 25 neita glykosylaatiokohtia on käytössä.

• · · · • ♦ ·

Sitoutuneesta fuusioproteiinista tutkittiin sialyylitransfe- • · · ’·* * raasiaktiivisuutta käyttämällä erilaisia akseptorisubstraat- teja. Aktiivisuutta ei havaittu kun käytettiin β-galakto-30 sidiakseptoreita, jotka sisälsivät Galpl, 3 (4) GlcNac-sekvens- • · · sejä, eikä myöskään havaittu sialihapon siirtymistä jäätymi- .·.: senestoglykoproteiinien O-sitoutuneisiin oligosakkarideihin.

• · · #·./ STX:n ekspressoituminen aivokudoksessa viittasi siihen, että • · *1* geeni saattaisi olla osallisena glykolipidibiosynteesissä.

• · 35 Täysikasvuisen naudan aivosta eristetyt sekagangliosidit • · · eivät kuitenkaan toimineet akseptorisubstraattina. Neuroami-naasikäsitellyt vastasyntyneen aivojen membraanit olivat ainoa substraatti, joka ilmensi edes marginaalista kykyä toi- 66 mia akseptorina. STX-fuusioprotiininlla käsilteltyjä membraa-neja inkuboitaees tuloksena oli 50 % lisäys aktiivisuudessa taustaan nähden.

5 STXsn kehityksellinen ja kudosspesifinen ekspressio Määritettäessä STX-geenin ekspressiomallia ja sanoman kokoa koetinkäsiteltiin Norhern blots -tuloksia STXl:stä eristetyllä 900 emäsparin EcoRI-fragmentilla. Kaikista tutkituista 10 eri kudoksista 5,5 kb:n sanoman hybridisoituminen oli havaittavissa vain vastasyntyneen rotan aivojen RNA:ssa. Ristiinhybridisoitumista sukua oleviin konservoituneisiin homologia-alueisiin ei havaittu. STX:n rajoittunut ekspres-soituminen poikkeaa karakterisoiduissa sialyylitransferaa-15 seissa havaittavasta ekspressiosta. Kaikki nämä geenit ovat toisistaan riippumattomasti säädeltyjä, ja tuloksena on erilaisia kudosspesifisten ekspressoitumisten malleja, mutta yleensä jokainen sialyylitransferääsi ekspressoituu vaihtelevasti eri kudoksissa (Paulson J.C. et ai, J. Biol. Chem. 20 264:10931-10934, 1989). Sen sijaan STX ekspressoituu vain vastasyntyneen aivoissa, eikä ekspressoituminen näytä olevan : yleistettävä alkioilmiö, sillä sanomaa ei ollut havaittavissa ·· · ·1·1: vastasyntyneen munuaisessa.

• · • · • · · ···· • · · • · · · • · · • « · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · ··· · • · · * · · • · • · · • · • · • · ·

Claims (7)

67

1. DNA-molekyyli, joka koodaa rekombinanttista polypeptidi-entSYYmiä, jolla on sialyylitransferaasin entsymaattista aktiivisuutta, mainitun polypeptidin käsittäessä katalyytti-5 sen domeenin, tunnettu siitä, että mainittu katalyyttinen domeeni käsittää konservoituneen homologia-alueen, joka käsittää aminohapposekvenssin valittuna ryhmästä, joka koostuu: Cys-Arg-Arg-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Asn-Leu-Lys-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Gln-Ile-Asp-Ser-His-Asp-Phe-10 Val-Leu-Arg-Met-Asn-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu-Gly-Phe-Glu-Ala-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-His-His-Phe-Val-Tyr-Pro-Glu; Cys-Arg-Arg-Cys-Ile-Ile-Val-Gly-Asn-Gly-Gly-Val-Leu-Ala-Asn-Lys-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Ile-Asp-Asp-Tyr-Asp-Ile-Val-Leu-Arg-Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys-Gly-Phe-Glu-Lys-15 Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-Leu-Arg-Ile-Thr-Tyr-Pro-Glu; ja Phe-Gln-Thr-Cys-Ala-Ile-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Val-Leu- Leu-Asn-Ser-Gly-Cys-Gly-Gln-Glu-Ile-Asp-Thr-His-Ser-Phe- Val-Ile-Arg-Cys-Asn-Leu-Ala-Pro-Val-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg- *.:!1 2 0 Asp-Val-Gly-Leu-Lys-Thr-Asp-Leu-Val-Thr-Met-Asn-Pro-Ser; ·· « • i « • · ja niiden varianteista, jolloin mainituilla varianteilla on • · vähintään 70 %:n sekvenssi-identtisyys mainitun rekombinant- • · · ··” tisen polypeptidientsyymin kanssa. • · · ···· ;'j1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu 25 siitä, että se koodaa sialyylitransferaasia, jolla on kuvion . 14 mukainen aminohapposekvenssi . * t

· ··· ··· :...· 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu : siitä, että mainittu rekombinanttinen polypeptidientsyymi • · .···. käsittää transmembraanisen domeenin. • · ·♦·

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu • · .·**. siitä, että mainittu rekombinanttinen polypeptidientsyymi • · 1 käsittää sytoplasmisen domeenin. 68

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että mainittu rekombinanttinen polypeptidientsyymi on oleellisesti vapaa aineista, joita löydetään in vivo fysiologisesta ympäristöstä, ja käsittää kuvion 14 mukaisen amino- 5 happosekvenssin.

6. Yhdistelmäekspressiovektori, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen DNA-molekyylin.

7. Koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patentti-10 vaatimuksen 6 mukaisella yhdistelmäekspressiovektorilla transformoidun solun. • · · • · i • · · ·· ♦ • · · • · • ♦ • ♦ ··· ··♦· ··· ··· • · · • · · • « · • · · ··· ·♦· • · • · ·♦· • « • · · • ·♦ • · ··· • · • · ··· • · • · · • · · • · 1 · • · 69