BG99100A - Състави и методи за идентифициране и синтез на сиалилтрансферази - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до днк-изолати, кодиращи сиалилтрансферази, съдържащи консервативен участъкна хомоложност, и методи за получаване на такива днк, както и до експресионни системи за рекомбинантно получаване на сиалилтрансфераза.

Description

_ж Настоящото изобретение се отнася до сиалилтрансферазна генна фамилия, група гликозилтрансферази отговорни за крайното сиалилиране на въглехидатните групи на гликопротеини, гликолипиди и олигозахариди, които съдържат консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен. Членове на сиалилтрансферазната генна фамилия са Galpl, 3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза и GalI,3(4)GlcNAc α2,3 сиалилтрансфераза. Изобретението се отнася още до нови форми и състави от същите и по-специално до средства и методи за идентифициране и продукция на членове на сиалилтрансферазната генна фамилия до хомогенност в значителни полезни количества. Изобретението се отнася също до приготвяне на изолирана деоксирибонуклеинова киселина (ДНК) кодираща продукция на сиалилтрансферази, до методи за получаване на молекули ДНК, които кодират сиалилтрансферази, до експресия на човешки и бозайникови сиалилтрансферази като се използва такава ДНК, както и до нови съединения, включително нови нуклеинови киселини кодиращи сиалилтрансферази или фрагменти от тях. Настоящото изобретение се отнася също до производни на сиалилтрансфераза, по-специално производни , у които липсват цитоплазмената и/или трансмембранната части на протеина и тяхната продукция посредством рекомбинантни ДНК техники.

Сиалилтрансферазите са ензимна фамилия, която катализира преноса на сиалова киселина (SA) до крайните части на въглехидратните групи на гликолипиди и олигозахариди по следната най-обща реакция:

Цитидин 5 монофосфат - сиалова киселина (CMP - SA) + НО-акцептор->СМР -I- SA-О-акцептор (Веуег,Т.А. et. Adv. Enzymol. 52, 23-175 {1981]). Сиалилтрансферазите най-напред <з-а намерени в клетъчния апарат на Golgi, където те участвуват в посттранслационния път на гликозилиране. (Fleischer, B.J. Cell Biol. 89, 246-255 [1981]) . Намерени са също в телесни течности като мляко от гърдата, колострума и кръвта. Наймалко 10-12 различни сиалилтрансферази са необходими, за да се синтезират всички известни сиалилолигозахаридни последователности. Всяка от тях се различава по специфичността си спрямо последователността на олигозахаридния акцептор и аномерната връзка образувана между сиаловата киселина и захарта, с която е свързана. Пречистни са четири сиалилIbid., Weinstein,

J. и сътр., J.

Biol. Chem. 257, 13835-13844 and Tsuiki, S.

Eur. J. Biochem. 125, 253-261

J. Biol.

Chem. 260, 4941-4951 [1985]). По-специално, пречистенй са

Gaip 1,4GlcNAc a2-6 сиалилтрансфераза и Galpl,3(4)

GlcNAc α2-3 сиалилтрансфераза, от чернодробни мембрани на плъхове. (Weinstein и сътр. Ibid.).

Други гликозилтрансферази са изолирани като разтворими сиалил-, ензими в серум, мляко или колострум, включително фукозил-, галактозил-, N-ацетилглюкозаминил- и N ацетилгалактозаминилтрансферази. (Веуег и сътр. Ibid.). Изолирана е говежда и човешка β-Ν-ацетилглюкозамид β1,4галактозилтрансфераза (Narimatsu, Н. и сътр. Proc. Nat.Acad. Sci. USA 83, 4720-4724 [1986], Shaper, N.L. и сътр.Proc.Nat. Acad.Sci. USA 83, 1573-1577 [ 1 986],Appert, H.E. и сътр., Biochem. Biophys.Res.Common 139, 163-168 [1986 и HumphreysBeyer, M.G. и сътр. Proc.Nat.Acad.Sci. USA 83, 8918-8922 [1986]). Тези пречистени гликозилтрансферази се различават по размер, което може да се дължи на отстраняване на части от протеина, които не са съществени за неговата активност като домените на мембранно свързване.

Сравнението с установените аминокиселинни последователности на сДНК клонове кодиращи гликозилтрансферазите включително галактозилтрансферази, сиалилтрансфераза, фукозилтрансфераза и N-ацетилгалактозаминилтрансфераза, показват, че тези ензими нямат в същност никаква хомоложна последователност. Някои схващания относ но структурното сходство на тази фамилия гликозилтранс ферази се основават на извършени напоследък анализи на първичните структури на клонирани сиалилтрансферази (Weinstein, J. и сътр. , Ibid.). Все пак, всички те притежават къса НН2-Цитоплазмена опашка, сигнално контактен домен от

16-20 аминокиселини и разгънат стем участък и след това голяма СООН-крайна каталитичен домен Weinstein, J. и сътр., J.Biol.Chem. 262, 17735-17743 [1987], Paulson, J.C. и сътр. , J.Biol. Chem. 264, 17615-17618 [1989]. Сигнално контактните домени действуват и като неразцепващи се сигнални пептиди и като мембранносвсвързващи участъци и ориентират каталитичните домени на тези гликозилтрансферази в лумена на апарата на Golgi. Вътре във фамилиите гликозилтрансферази трябва да се очакват обикновени аминокиселинни последователности, които разделят подобни акцепторни или донорни субстрати. Все пак, изненадващо малко хомоложни участъци са намерени в каталитичните домени на гликозилтрансферазите и не е намерена никаква значителна хомоложна последователност при някой друг протеин в GenBank (Shaper, N.L. и сътр., J.Biol.Chem. 216, 10420-10428 [1988], D'Agostaso, G· и сътр., Eur.J.Biochem. 183, 211-217 [1989] и Weinstein, J. и сътр., J.Biol.Chem. 263, 17735-17743 [1987]). Това специално е изненадващо за Gal al,3 GTh GlcNAc pi,4-GT, две галактозилтрансферази. Обаче, докато тези галактозилтрансферази изобщо не показват хомоложност, има общ хексапептид KDKKND за Gal al,3-GT (говежди, 304-309) и RDK.K.NE за GlcNAc pi,4-GT (говежди, човешки, миши аминокиселини 346-351). (Joziasse и сътр.,

J.Biol.Chem. 264, 14290-14297 [1989]).

Сиаловите киселини са крайни захари от въгле хидратните групи намиращи се у гликопротеините и гликолипидите и са широко разпространени в животинските тъкани (Momol, Т. и сътр., J. Biol. Chem. 261. 16270-16273 [1986]). Сиаловите киселини играят важна роля в биологичните функции на въглехидратните структури поради тяхната крайна позиция. Например, сиаловата киселина функционира като лиганда за свързването на вируса на инфлуенцата с клетката гостоприемник (Paulson, J.C., The Receptors, vol. 2, Conn, P.M., ed., p. 131-219, Academic Press [1985]). Дори промяната в свързването на сиаловата киселина е достатъчна да измени специфичността на гостоприемника (Roger,

G.N. и сътр.Nature 304, 76-78 [1983]). Невралната клетъчна адхезионна молекула (NCAM) е предмет на регулирано с развитието полисиалилиране, за което се приема, че модулира NCAm медиирана клетъчна адхезия през време на развитието на нервната система (Rutishauser, U. и сътр., Science 240. 5357 [1988] и Rutishauser, U. , Adv.Exp.Med.Biol. 265, 179-180 [1990]). Напоследък, за карбохидратната структура сиалил люисова X (SLe*) е показано, че функционира като лиганда за ендотелиалната левкоцитна адхезионна молекула (ЕSelectin), която посредничи в свързването на неутрофилите с активираните ендотелиални клетки (Lowe и сътр., 1990, Phillips и сътр.,1990, Goelz и сътр.,1990, Walz и сътр., 1990, Brandley и сътр., 1990). Р-селектинът (зависещ от активираната гранула протеин на външната мембрана , CD62)3a друг член на селектиновата фамилия (Stoolman, L.M., Cell 56., 907910 [1989]), също е показано, че разпознава SLe* намиращи се в моноцитите и PMNs (Larsen и сътр., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 87, 6674-6678 [1990], Momol и сътр., J.Biol.Chem. 261,

16270-16273 [1986]], Polley и сътр., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88., 6224-6228 [1991], Chan, K,F,J., J.Biol.Chem. 263, 568-574 [1988], Beyer, T.A. и сътр., Adv. Enzymol., 52, 23-175 [1981]). В двата примера сиаловата киселина е ключов компонент във въглехидратната структура, за да функционира като лиганда. В допълнение към ролята при клетъчната адхезия, сиаловата киселина съдържаща въглехидратни структури е установено, че играе роля пряко в диференциацията. Хематопоетичната клетъчна линия HL-60 може да бъде индуцирана към диференциация чрез третиране с гликолипида G143. За ганглиозидите също се смята, че участвуват в модулацията на растежния фактор - протеин киназната активност и в контрола на клетъчния цикъл.

Една такава сиалилтрансфераза е пречистена както е описано в САЩ патент 5 047 335. Доколкото са достъпни известни количества от пречистена сиалилтрансфераза, те са достъпни в много малки количества отчасти и поради това, че са мембранно свързани протеини на едноплазмения ретикулум и на апарата на Golgi. Значителната цена, както икономическа така и трудностите за пречистване на тези сиалилтрансферази ги прави оскъден материал.Предмет на настоящото изобретение е да се изолира ДНК кодираща сиалилтрансфераза и да се произведат полезни количества от бозайникова, по-специално човешка сиалилтрансфераза като се използват рекомбинантни ДНК техники. Друг предмет на изобретението е да се създаде средство за получаване на ДНК кодираща други членове на сиалилтрансферазната генна фамилия от различни тъкани както и от други видове. Друг предмет на изобретението е да се получат нови форми на сиалилтрансферази. Друг предмет на изобретението е да се създаде подобрено средство за катализиране на преноса на сиаловата киселина към крайните позиции при някои въглехидратни групи. Тези и други задачи на настоящото изобретение ще станат ясни от описанието като цяло.

Резюме на изобретението

Поставените с настоящото изобретение задачи се осъществяват с метод състоящ се в: идентифициране и клониране на гени, които кодират бозайникови сиалилтрансферази (дефинирани по-долу) включително, но не ограничено само до свинска Gaip 1,3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза и Gal βΐ ,3(4)GlcNAc α2,3 сиалилтрансфераза от плъх (различна от Gaip 1,4GlcNAc <х2,6 сиалилтрансфераза от плъх), вмъкване на този ген в рекомбинантен ДНК вектор, трансформиране на подходящ гостоприемник с вектора включващ този ген, експресия на бозайниковите сиалилтрансферазни гени в такъв гостоприемник и събиране на така получената бозайникова сиалилтрансфераза. Алтернативно може да се използва разнообразие от други рекомбинантни техники, за да се получи експресия на сиалилтрансфераза. Подобно, съгласно настоящото изобретение е възможно да се произведе бозайникова сиалилтрансфераза и/или производни на същата , пасредством рекомбинантни техники, както и да се осигури средство за продуциране на такива сиалилтрансферази. Сиалилтрансферазите са слабо разпространени протеини и трудни за пречистване. Изолирането и идентифицирането на сиалилтрансферазни гени е изключително трудно. тРНК са редки и клетъчни линии или други източници на големи количества тРНК са недостъпни. Настоящото изобретение за първи път установява сиалилтрансферазна генна фамилия дефинирана чрез консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен на ензимите.

Настоящото изобретение се отнася до състави и методи за получаване на бозайникова сиалилтрансфераза по пътя на рекомбинантна ДНК технология включваща: 1) откриване и идентифициране на цялостната ДНК последователност на ензимите и на 5'-граничещата област на същите,

2) конструиране на клониращ и експресионен носител съдържащ казаната ДНК последователност позволяващ експресията на бозайниковия сиалилтрансферазен протеин, както и за сливане или на сигнални N- крайни техни конюгати и

3) жизнеспособни клетъчни култури и други системи за експресия, генетически изменени по силата на това, че съдържат такива носители и са способни да продуцират бозайникова сиалилтрансфераза. Настоящото изобретение по-нататък се отнася до състави и методи за продукция на ДНК кодираща клетъчно продуциране на бозайникова сиалилтрансфераза. Друг аспект на настоящото изобретение са нови съединения, вклюително деоксирибонуклеотиди и рибонуклеотиди, които се използват за получаване на клонове способни да експресират сиалилтрансфераза. Друг аспект на настоящото изобретение е сиалилтрансфераза по същество чиста от всички природно срещащи се субстанции, с които тя обикновено се среща в кръвта и/или тъканите, например сиалилтрансфераза продуцирана по рекомбинантен път би била освободена от такива онечиствания обикновено срещащи се в тяхната in vivo физиологична среда. В допълнение, като се има предвид методът за получаване, сиалилтрансферазата може да съдържа асоциирани гликозилати с по-голямо или по-малко разклонение в зависимост от материала изолиран от неговата in vivo физиологична среда, напр. кръв и/или тъкан. Настоящото изобретение по-нататък се отнася до нови производни на сиалилтрансфераза, по-специално производни без сиалилтрансферазни крайни аминоостатъци, т.е. производни без късия NH2 цитоплазмен домен или хидрофобната N-крайна сигнално контактна последователност, която съставя сиалилтрансферазния трансмембранен домен и стем участък.

Бозайниковата сиалилтрансфераза и нейните производни съгласно настоящото изобретение са полезни за добавянето на сиалови киселини към въглехидратните групи налични при гликопротеини и гликолипиди. В допълнение, сиалилтрансферазата и нейните производни са ензимно полезни при прибавяне на сиалова киселина към захарна верига, за да се продуцират въглехидрати, които функционират като определящ фактор в биологичното ©характеризиране. Такива сиалилтрансферазни ензими могат да се прилагат в мултиензимни системи за синтез на олигозахариди и производни (Ichikawa и сътр., J.Am.Chem.Soc. 113, 4.698 [1991] и Ichikawa и сътр., J.Am.Chem.Soc. 113 . 6300 [1991]). Накрая, ДНК, особено консервативният участък на хомоложност в каталитичния домен кодиращ сиалилтрансферазна генна фамилия съгласно изобретението е полезен за осигуряване средство за клониране на гена кодиращ други членове на сиалилтрансферазната генна фамилия. Друго използване на сиалилтрансферазата и ДНК кодираща сиалилтрансфераза са видни за специалистите от областта.

Описание на приложените фигури

Фиг. 1 Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на Galp 1,3GalNAc <х2,3 сиалилтрансфераза(а2,3-О) от свиня.Нуклеотидната последователност на α2,3-Ο тРНК от свиня е определена посредством анализ на ДНК последователност на два препокриващи се клона XSTl и XST2. Очакваните аминокиселини на а2,3-О полипептида са показани над ДНК последователността и са номерирани от първия остатък на N-края на аналогичния пречистен протеин. Предложената сигнално контатна послдователност е отбелязана с празно квадратче. Потенциалните гликозилирани части с телността Asn-X-Thr са отбелязани със звездичка дователността съответствува на дългата форма на последова (*). Послеа2,3 сиалилтрансфераза, кодирана от препокриващите се клонове

XST1 и XST2.

Фиг. 2 Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на Gaip 1,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (α2,3Ν) от плъх. Нуклеотидната последователност на a2,3-N тРНК от плъх е определена с анализ на ДНК последователност. Очакваните аминокиселини на сиалилтрансферазния полипептид са посочени над ДНК последователността и са номерирани от първия остатък на зрелия протеин както е определен от N-крайната протеинова последователност.

Фиг. 3 Пречистване на а2,3-О сиалилтрансфераза върху CDP-хексаноламин агароза (елуиране с КС1). Хомогенат от 2 кд свински черен дроб се зарежда върху колона CDPхексаноламин агароза и се елуира с линеен градиент КС1 (виж примерните изпълнение). Концентрацията на протеина и активността на сиалилтрансферазата като се използва лактоза като акцепторен субстрат ,се определят от отделните фрак11 ции. Двата пика ензимна активност са отделени като обединение А и В както е посочено.

Фиг. 4 Пречистване на а2,3-О сиалилтрансфераза върху CDP-хексаноламин агароза (колона III, CDP елуиране). Ензимните активности се определят като се използва специфичен ензимен акцепторен субстрат антифризен гликопротеин (AFGP). В колони А и В елуирането на ензимната активност корелира предимно с 48 KDa и 45 KDa видове протеин съответно (виж SDS-PAGE). Тези два вида, форма А и

А форма В на а2,3-О-сиалилтрансферазата, имат специфична активност от 8-10 единици/mg протеин. 48 kDA и 45 kDA видовете се пренасят върху PVDF мембрана и се анализират посредством ДНК крайната последователност.

Фиг. 5 NH2 -крайна аминокиселинна последователност на 48 kDa и 45 kDa α2,3-Ο сиалилтрансферазен пептид. Шестнадесетте хидрофобни аминокиселини в близост до NH2 края на 48 kDa пептида съдържащи се в сигнално контактния домен са подчертани.

Фиг. 6 Рестрикционна карта и стратегия на последователността на два а2,3-О сиалилтрансферазни сДНК клона.

Фиг. 7 Сравнение на структурите на домените и хомоложните участъци на две сиалилтрансферази. А, хоризонтална проекция на първичната последователност на а2,6 сиалилтрансфераза и α2,3-Ο сиалилтрансфераза показваща участък от 45 аминокиселини с 64% идентична последователност и 84% подобна последователност.

В, хомоложният домен обхващащ свързването между екзони и 3 на а2,6 сиалилтрансфераза и лежащ между катали тичните домени на двата ензима.

Фиг. 8 Експресия на разтворима каталитично активна а2,3-О сиалилтрансфераза. А: сДНК управляваща експресията на разтворима форма на а2,3-О сиалилтрансфераза, sp-ST, се конструира посредством заместване на див тип сиалилтрансферазен цитоплазмен домен и сигнално контактен домен с инсулин сигнален пептид. Предполага се, че sp-ST кодира 38 kDa, секретирайки протеинови видове, когато се трансфектират в клетките гостоприемници. В: sp-ST се включва в експресионния вектор pSVL и се трансфектира в COS-ί клетки. 48 посттрансфектиране клетките се бележат пулсационно в продължение на два часа в среда съдържаща Trans35S-6eAer и след това 5 часа в среда без белег. Тази среда се събира, концентрира се 15-кратно и се анализира посредством SDS-PAGE/флуорография. Анализират се допълнителни проби sp-ST и моделно трансфектираната клетъчна среда се анализира. С: COS-1 клетки се трансфектират с липофектин (+sp-ST) или липофектин като такъв (контрола) по идентичен начин като 7В.След 48 часа трансфектиране средата се събира, концентрира се 15-кратно и се изследва за сиалилтрансферазна активност със специфичен акцепторен субстрат AFGP (Sadler, J.E. и сътр. J.Biol.Chem. 254, 4434-4443 [1979]).

Фиг.9 CID спектър на трипсинов пептид от Gal α2,3N сиалилтрансферазен ензим.Пептидната последователност е Leu-Thr-Pio-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-His-Cys*-Aig, МН+ = 1283,6. Cys* означава карбоксиметилцистеин. Йони със запазен товар при N- края са отбелязани като a, b и с йони, а С-крайните йони са означени като х,у и ζ фрагменти (Biemann, К. (1990) Meth.Enzymol. 193: 886-887). Първите йони (а,х) са продукти на скъсване между а въглерода и карбонилната група. Йоните у и Ь се формират, когато пептидната връзка се скъса. Йоните с и z се появяват, когато настъпи скъсване между аминогрупата и а въглерода. Количеството на тези фрагменти винаги се иницира при съответните краища.Фрагментирането на страничната верига се среща между β и γ въглеродите на аминокиселините, като се получават така наречените d (N-крайни) и w (С-крайни) йони. Наблюдаваните фрагментни йони са включени в таблицата. Йоните г

принадлежащи към същата йонна серия са изброени в редове.

Фиг. 10 CID спектър на карбамилирани трипсинови пептиди от Gal α2,3-Ν сиалилтрансферазен ензим. Пептидната последователност е Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys, МН⁺ =771,4. Фрагментирането ясно показва модифициране при Nкрайната, а не при ε-аминогрупата на лизиновия остатък. Изобилен йон при N-крайния левцин в този пептид. Йоните отбелязани със звездичка са свързани с матрицата йони от та Bepnra(Falick и сътр. (1990) Rapid Commun.Mass Spectrom. 4: 318).Наблюдаваните фрагментни йони са включени в таблицата. Йоните принадлежащи към същата йонна серия са изброени в редове.

Фиг. 11 Хоризонтална проекция на пептиди 1 и 11 получени от Gaip 1,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (ST3N) с предварително клонирана сиалилтрансфераза. Gaipi,4GlcNAc а2,6-сиалилтрансфераза (ST6N) и Gaipi,3GalNAc α2,3сиалилтрансфераза (ST3O) са показани като отворени линии. Запълненият квадрат показва сигнално контактната последователност. Защрихованият квадрат показва участъка на хомоложност установен между двете сиалилтрансферази.

Фиг. 12 Консервативен участък разделен от трите клона сиалилтрансферази. Трите клона сиалилтрансферази са Gaipi,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (ST3N) от плъх, свинска Gaip 1,3GalNАс а2,3-сиалилтрансфераза (ST3O) и Gaip l,4GlcNAc а2,6-сиалилтрансфераза (ST6N) от плъх. Участъкът се състои от 55 аминокиселини от остатък 156 до остатък 210 на Gaip 1,3(4)GlcNАс а2,3-сиалилтрансфераза (ST3N). Аминокиселинната идентичност е посочена чрез ограждане в квадрат.

Фиг. 13 Очаквана аминокиселинна последователност на усилващите фрагменти SM1 и сравнение с предварително охарактеризирания консервативен участък на хомоложност. Консенсусът консервативен участък на хомоложност се поражда от сравнението на консервативния участък на хомоложност на клонираната и охарактеризирана сиалилтрансфераза и усилващия фрагмент SM1. Инвариантните аминокиселини са отбелязани с букви отгоре, докато присъствуващите аминокиселини повече от 50% в консервативния участък на хомоложност са с букви отдолу. Местата, където се намират г или q са означени с Ь, местата където се намира или i или ν са означени с х. Подчертаните аминокиселини означават участъците, които се използват при конструиране на изродени праймери. Промените в по-рано получените инваринтни аминокиселини намерени в усилващия фрагмент са отбелязани със звездичка.

Фиг. 14 Нуклеотидна и очаквана аминокиселинна последователност на STX1. Очакваната аминокиселинна последователност на най-дългата отворена рамка на разчитане кодираща консервативния участък на хомоложност SM1 (аминокиселини 154-208), са означени със заграждане.Предложената сигнално контактна последователност (аминокиселини 8-23) са оградени в квадрат и потенциално N-свързаните гликозилирани места са подчертани.

Подробно описание

Както е използвана тук, сиалилтрансфераза или производни на сиалилтрансфераза се отнася до сиалилтрансферазни ензими, освен Gaip 1,4GlcNAc α2,6 сиалилтрансфераза от плъх, които съдържат консервативен участък на хомоложс~ност в каталитичния домен и са ензимно активни при пренасяне на сиалова киселина към крайните позиции на захарните вериги на гликопротеини, гликолипиди, олигозахариди и подобни. Примери за ензимно функционални сиалилтрансферази са тези, способни да пренасят сиалова киселина от СМР-сиалова киселина към олигозахаридния акцептор, където олигозахаридният акцептор варира в зависимост от конкретната сиалилтрансфераза.

Консервативен участък на хомоложност се отнася до серия аминокиселини в една сиалилтрансфераза, която е по същество идентична на същата серия аминокиселини в друг сиалилтрансферазен ензим щом като са били подредени последователностите на двата ензима. В сиалилтрансферазната генна фамилия съгласно настоящото изобретение консервативният участък на хомоложност е в каталитичния домен и се простира върху най-малко около 7 свързани аминокиселини, за предпочитане при най-малко около 20 аминокиселини и най-вече върху най-малко 55 аминокиселини с аминокиселинна последователност на остатъците 156-210 от фиг.2 или остатъците 142-196 от фиг. 1. Веднъж идентифици16 ран консервативният участък на хомоложност, могат да се направят варианти на аминокиселинна последователност на консервативния усатък попадащи в един или повече от три класа: варианти получени чрез заменяне, чрез включване или чрез изпускане (делеция). Тези варианти обикновено се получават чрез мутагенеза на специфично място в нуклеотидите в ДНК кодираща сиалилтрансфераза, при което продуцираната ДНК кодираща сиалилтрансфераза съдържа вариант на консервативния участък на хомоложност.

г

В обхвата на сиалилтрансферазата се включват например Galp 1,3(4)GlcNAc α2,3 сиалилтрансфераза от плъх (тук означена като ''α2,3-Ν), която формира NeuNAc a2,3Gaip l,3GlcNAc и NeuAc<x2,3Galp 1,4GlcNAc последователности, които често завършват комплекса N-свързани олигозахариди. Други примери включени в обхвата на сиалилтрансфераза са свинска Ga Ιβί ,3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза (тук означена като (а2,3-О), която формира NeuAca2,3Galpl,3GalNAc намерена в захарни вериги О-свързани към треонин или серии както и като крайни секвенции на определени ганглиозиди.

В обхвата на сиалилтрансфераза както е използван тук терминът, са включени сиалилтрансферазата с нативно гликозилиране и аминопоследователностите на сиалилтрансфераза от плъх и свинска сиалилтрансфераза както е изложено на фиг. 1 или 2, аналогична сиалилтрансфераза от други животински видове като говежда, човешка и подобни, както и от други тъкани, дегликозилирани или негликозилирани производни на такива сиалилтрансферази, варианти на аминокиселинна последователност и in vitroпородени ковалентни производни на сиалилтрансферази.

Всички тези форми на сиалилтрансфераза съдържат консервативния участък на хомоложност и са ензимно активни или ако не са, те носят поне един имунен епитоп заедно с ензимно активната сиалилтрансфераза.

Вариантите на аминокиселинна последователност на сиалилтрансферазата попадат в един или повече от трите класа: варианти получени чрез заместване, чрез включване и чрез делеция. Тези варианти обикновено се приготвят чрез специфична по място мутагенеза на нуклеотиди в ДНК кодираща сиалилтрансфераза, като се продуцира ДНК кодираща варианта и след това експресиране на ДНК в рекомбинантна клетъчна култура. Все пак, вариантни сиалилтрансферазни фрагменти с до около 100-150 остатъка могат да се получат обикновено като се използва in vitro синтеза. Вариантите на аминокиселинна последователност се охарактеризират посредством предварително определяне на природата на варианта, характеристика, която ги отделя от природносрещащи се алелни или междувидови вариации на аминокиселинна последователност на сиалилтрансфераза. Вариантите в консервативния участък на хомоложност типично показват същата качествена биологична активност както природносрещащия се аналог.

Тъй като мястото на въвеждане на варианта аминокиселинна последователност е определено по-рано, мутацията per se не се нуждае от предварително определяне. Например, с оглед да се оптимизира извършването на мутация на дадено място,може да се проведе ненасочена мутагенеза при кодона мишена или участъка и експресираните варианти на сиалилтрансфераза се отсяват за оптималната комби18 нация на желана активност. Техниките за провеждане на мутации чрез заместване при по-рано определените места в ДНК имащи позната последователност са добре известни, например М13 иницирана мутагенеза или PCR базирана мутагенеза.

Аминокиселинните субституции обикновено са с прости остатъци, включванията са от порядъка на около 1 до 10 аминокиселинни остатъци и делецията е от порядъка на 1 до 30 остатъка. Делецията и включванията за предпочитане се извършват в съседни двойки, т.е. изпускане на 2 остатъка или включване на 2 остатъка. Заменяне, включване и делеция или каквато и да е комбинация от тях могат да се комбинират, за да се достигне крайната структура. Очевидно, мутацията, която ще се извърши в ДНК кодираща варианта сиалилтрансфераза, не трябва да измества секвенцията извън рамката на разчитане и за предпочитане не трябва да създава допълнителни участъци, които биха могли да продуцират вторична тРНК структура (ЕР 75.444А).

Варианти получени чрез заменяне са тези, в които най-малко един остатък от фиг.1 или 2 последователности е отстранен и на негово място е вмъкнат различен остатък. Такива заменяния най-общо се правят съгласно следващата таблица 1, когато това се желае за крайно модулиране характеристиката на сиалилтрансферазата.

ТАБЛИЦА 1

Оригинален остатък	Примерно заместване
Ala	Ser
Arg	Lys
As η	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
lie	Leu, Vai
Leu	He, Vai
Lys	Arg, Gin,Glu
Met	Leu, lie
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phee
Vai	lie, Leu

Съществени промени във функцията или имунологичната идентичност се правят чрез подбиране на заменянията, които да са по-малко консервативни от тези в таблица 1, т.е. като се избират остатъци, които се различават по-значително по техния ефект на запазване (а) структурата на полипептидния скелет в областта на заместването, например листова или спирална конформация, б) натоварването или хидрофобността на молекулата на мястото на мишената или

в) големината на страничната верига. Заменянията, които найобщо се очаква да предизвикат най-големите промени в свойствата на сиалилтрансферазата са тези, при които:

а) хидрофилен остатък, напр. серил или треонил се замества с (или от) хидрофобен остатък напр. левцил, изолевцил, фенилаланил, валил или аланил, б) цистеин или пролин се замества с (или от) всеки друг остатък, в) остатък притежаващ електроположителна странична верига напр. лизил, аргинил или хистидил, се замества с (или от) електроотрицателен остатък напр. глутамил или аспартил или г) остатък притежаващ обемиста странична верига напр. фенилаланин се замества с (или от) такъв, който няма странична верига напр. глицин.

Главен клас варианти получени чрез заменяне или делеция са тези, които включват трансмембранен и/или цитоплаазмен участъци на сиалилтрансфераза. Цитоплазменият домен на сиалилтрансфераза е последователността от аминокиселинни остатъци започваща от стартовите кодони показани на фиг. 1 и 2 и продължаваща приблизително 11 допълнителни остатъци. Остатъците 10-28 и 12-27 съответно, от плъх и свиня се счита че служат като последователност спираща преноса. Конформационните извивки въведени чрез Phe-Val-Arg-Asn и Pro-Met-Arg-Lys-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys остатъците от плъх и свиня, съответно, и електрополжителният характер на тези остатъци действува заедно с трансмембранния остатък описан по-долу, препятствуващо преноса на сиалилтрансфераза през клетъчната мембрана.

Трансмембранният участък на сиалилтрансферазата е разположен в последователността отделена от свиня при остатъците 12-27 (където Ala е + 1 както е показано на фиг. 2) и в последователността получена от плъх в аналогично местоположение. Този участък е силно хидрофобен домен, който със свойствения си размер обхваща липидния двоен слой на клетъчната мембрана.Счита се, че функционира в съгласие с цитоплазмения домен за контакт на сиалилтрансфераза в апарата на Golgi или в едноплазмения ретикулум.

Делеция или заменяне на който и да е или на двата, цитоплазмения и трансмембранния домени улеснява събирането на рекомбинантна сиалилтрансфераза чрез намаляване на нейния клетъчен или мембранен липиден афинитет и подобряване на нейната разтворимост във вода така че да не са необходими детергенти, за да се поддържа сиалилтрансферазата във воден разтвор. (Виж напр. САЩ патент № 5 032 519 описващ производството на разтворима β-галактозид а2,С-сиалилтрансфераза, която тук е специално включена за сравнение). Делеция само на цитоплазмения домен като в същото време се запазва трансмембранната последователност води до продуциране на сиалилтрансфераза, която се солюбилизира с детергент. Сиалилтрансфераза с отпаднал цитоплазмен домен е по-подходяща да се вмъкне в мембрани, като при това се създава възможност да се насочи нейната ензимна активност. За предпочитане е цитоплазмените или трансмембранните домени да се изпускат, отколкото да се заменят (напр.аминокиселини 1-33 при α2,3-Ν сиалилтрансфераза от плъх, за да се спре трансфера на секвенция за продуциране на разтворима сиалилтрансфераза).

Цитоплазмената и/или трансмембранна (С-Т) сиалилтрансфераза получена чрез делеция или заменяне може да се синтезира директно в рекомбинантна клетъчна култура или като сливане със сигнална последователност за предпочитане сигнал хомоложен на гостоприемника. Например,при конструиране на прокариотен експресионен вектор С-Т домените се изпускат с помощта на бактериална алкална фосфатаза 1рр или топлинно устойчиви ентеротоксин II лидери,а за дрожди домените се заместват с дрождена инвертаза, алфа фактор или киселофосфатазни лидери. При бозайникова клетъчна експресия С-Т домените се заместват с бозайникови клетъчни вирусни секреторни лидери например herpes simplex gD сигнал. Когато секреторният лидер е разпознат от гостоприемника, сигналната пептидаза на гостоприемника е способна да скъса свързването на лидерния полипептид свързан при нейния С-край до С-Т изпусната сиалилтрансфераза. Предимството на С-Т изпуснатата сиалилтрасфераза е, че тя може да бъде секретирана в културална среда. Този вариант е водоразтворим и няма оценим афинитет към клетъчномембранните липиди като по такъв начин значително се опростява събирането му от рекомбинантната клетъчна култура.

Прибавянето на детергент, като напр. нейонен детергент, може да се използва за солюбилизиране, стабилизиране и/или за засилване биологичната активност на протеините, които съдържат мембранната контактна последователност. Например, предпочитан детергент е дезоксихоловата киселина, но може да се използват и Tween, NP-40 и Triton Х-100, както и други детергенти. Изборът на детер23 гент се определя по усмотрение на използващия го специалист като се базира на специфичните условия на средата и природата на включения полипептид(и).

Мутагенеза посредством заменяне или делеция се използва, за да се елиминират N- или О-свързани гликозилирани места. Алтернативно, негликозилирана сиалилтрансфераза се получава в рекомбинантна прокариотна клетъчна култура. Делеция на цистеин или друг лабилен остатък също може да бъде желано, например за увеличаване на окислителната стабилност на сиалилтрансферазата. Делеция или заменяне на потенциални протеолитични места, напр. дибазични остатъци като ArgArg, се извършват посредством делеция на единия от базичните остатъци или заменянето на единия от тях с глутаминилов или хистидилов остатък.

Варианти на включване на аминокиселинна последователност на сиалилтрансферазата са тези, при които един или повече аминокиселинни остатъци са въведени на предварително определено място в мишената сиалилтрансфераза . Обичайно, вариантите с включване са сливане на хетероложни протеини или полипептиди с амино или карбоксилния край на сиалилтрансферазата.

ДНК кодираща сиалилтрансфераза се получава от други източници освен от плъх или свиня чрез а) получаване на сДНК банка от различни тъкани като черен дроб или подчелюстни слюнчени жлези от даденото животно, б) провеждане на хибридизационен анализ с белязана ДНК кодираща консервативния участък на хомоложност на сиалилтрансфераза или фрагменти от същата (обикновено по-големи от 30 Ьр) с оглед да се открият клонове в сДНК банката съдържаща хомоложни последователности и в) анализиране на клоновете посредством рестрикционен ензимен анализ и секвениране на нуклеиновата киселина, за да се идентифицира пълната дължина на клона. Ако в банката не присъствуват клонове с пълна дължина, тогава подходящи фрагменти могат да се събират от различни клонове и свържат при рестрикционните места общи за клоновете, за да се съчлени клон с пълна дължина.

По същество несъдържаща или по същество чиста, когато се описва състоянието на сиалилтрансфераза продуцирана съгласно изобретението, означава свободна от протеини или други материали нормално свързани със сиалилтрансферазата в нейната природно срещана in vivo физиологична среда, като например когато сиалилтрансферазата се получава от кръв и/или тъкан посредством екстракция и пречистване. Сиалилтрансферазата получена по метода съгласно настоящото изобретение е повече от или равна на 95 тегловни % сиалилтрансфераза от общия протеин, съдържа проста наситена връзка (чрез синьо оцветяване п.о Coomasie) при електрофореза на полиакриламиден гел и има специфична активност най-малко около 500 nmole/mg протеин/мин.

С термина по същество подобна или по същество идентична както е използван тук се отбелязва характеристиката на полипептидната последователност или последователността на нуклеиновата киселина, където полипептидната последователност има най-малко 70% идентичност на последователността сравнена с контролна последователност , а последователността на нуклеиновите киселини е с най-малко

80% идентичност сравнена с контролна последователност. Процентът на идентичност на последователността е изчислен като се изключват малките отделяния или прибавяния, които общо са по-малко от 35% от контролната последователност. Контролната последователност може да бъде подклас от поголяма последователност като тези показани на фиг.1 и 2, като все пак контролната последователност е дълга най-малко 18 нуклеотида в случая на полинуклеотиди и дълга поне 6 аминоостатъка в случая на полипептиди.

i** Най-общо, прокариотите се използват за клониране на ДНК последователности при конструиране на векторите полезни съгласно изобретението. Например, Е.coli К12 щам 294(АТСС № 31446) е особено полезен. Други микробни щамове, които могат да бъдат използвани са Е.coli В и Е.coli Х1776 (ATCC № 31537). Тези примери са илюстриращи, но не ограничаващи.

Прокариотите се използват също и за експресия. Могат да се използват гореспоменатите щамове, както и Е.coli W3110 (F‘X‘, прототрофен, ATCC № 27325), бацили като '“w*’

Bacillus subtilis и други ентеробактерии като Salmonella typhimurium или Serratia marcescans и различни видове Pseudomonas.

Най-общо, плазмидни вектори съдържащи промотори и контролни последователности, които са получени от видове съвместими с клетката гостоприемник се използват с тези гостоприемници. Векторът обикновено носи мястото на репликация, както и маркираната последователност, които могат да осигурят фенотипна селекция в трансформираните клетки. Например, Е.coli обикновено се трансформира като се използва pBR322, плазмид получен от Е.coli видове (Bolivar и сътр., Gene 2, 95 [1977]). pBR322 съдържа гени за амплицилинова и тетрациклинова резистентност и по такъв начин осигуряват лесно средства за идентифициране на трансформираните клетки. pBR322 плазмидът или друг микробен плазмид трябва също да съдържа или да се модифицира щото да съдържа промотори и други контролни елементи обичайно използвани при конструирането на рекомбинантна ДНК.

За илюстрация, промотори подходящи за използване с прокариотни гостоприемници включват β-лактамазна и лактозна промоторна система.(Chang и сътр., Nature, 275. 615 [1976] и Goeddel и сътр., Nature. 281 , 544 [1979]), алкална фосфатазна, триптофанова (trp) промоторна система (Goeddel, D., Nucleic acids Res. 8, 4057 [ 1980() и хибридни промотори като tac-промотор (de Boer, Н., PNAS (USA) 80, 21-25 [1983]). Подходящи са, обаче, и други функционални бактериални промотори. Техните нуклеотидни последователности са известни, което дава възможност на специалистите операторно да ги свързват към ДНК кодираща сиалилтрансфераза (Siebenlist и сътр.,.-Cell 2 [1980]) като се използват линкери или адаптори, за да се осигурят изискваните места за рестрикция. Промоторите използвани в бактериални системи могат да съдържат също последователност на Shine-Dalgarno (S.D.) операторко свързана с ДНК кодираща сиалилтрансфераза.

В допълнение към прокариотите, могат да се използват също еукариотни микроби като дрождени култури. Най-общоизвестният еукариотен микроорганизъм е Saccharomyces cerevisiae или мая за хляб, въпреки че са достъпни много други щамове. За експресия в Saccharomyces, общоизползван е например плазмидът YRp7, (Stinchomb и сътр., Nature 282.39 (1979], Kingsman и сътр., Gene 7. , 141 [1979], Tschemper и сътр., Gene 10, 157(1980]). Този плазмид предварително съдържа trpl ген, който осигурява селекционен маркер за мутантен щам от дрожди, на който липсва възможността да расте в триптофан, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics 8.5., 12 (1977]). Наличието на trpl лезия като характеристика на геном от дрождена клетка гостоприемник осигурява в ефективна околна среда откриване трансформация чрез растеж в отсъствие на триптофан.

Подходящи промоторни последователности за употреба с дрожден гостоприемник са промотори за 3-фосфоглицераткиназа (Hitzeman и сътр., J.Biol.Chem. 225, 2073 [1980]) или други гликолитични ензими (Hess и сътр., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 [1968] и Holland, Biochemistry 17, 4900 [1978]), като енолаза, глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназа, хексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозефосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.

Други дрождени промотори, които са индуциращи промотори с допълнителното предимство на транскрипция контролирана от растежните условия, са промоторните участъци за алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензими свързани с азотния метаболизъм, металотионеин, глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназа и ензими отговорни за малтозното и галактозно оползотворяване. Подходящи вектори и промотори използва28 ни при дрождена експресия са описани от R.Hitzemdn и сътр., ЕР № 73.657А. Дрождени усилватели се използват също изгодно с дрождени промотори.

Контролен участък се отнася за специфични последователности при 5' и 3' краищата на еукариотните гени, които могат да се включат в контрола на транскрипцията или транслацията. В същност всички еукариотни гени притежават богат на АТ участък, разположен приблизително 25 до 30 бази обратно от мястото, където запова транскрипцията. Друга последователност, установена 70 до 80 бази обратно от старта на транскрипцията на много гени е СХСААТ участъка, където X може да бъде всеки нуклеотид. При 3' края на повечето еукариотни гени е ААТААА последователността, която може да бъде сигнална за прибавяне на на poly А опашка към 3’ края на транскрибираната тРНК.

Предпочитани промотори, контролиращи транскрипцията от вектори в гостоприемник от бозайникови клетки могат да се получат от различни източници, например геномите на вируси като: полиома, Simian virus (SV40), аденовирус, ретровируси, хепатит-β вирус и цитомегаловирус или от хетероложни бозайникови промотори, напр. бета актинови промотор. Ранните и късните промотори на SV40 вируса се получават обикновено като SV40 рестрикционен фрагмент, който също съдържа SV40 вирусното начало на репликация (Fiers и сътр., Nature, 273, 113 [1978]). Непосредствения ранен вирус на чошешки цитомегаловирус обичайно се получава като Hindlll Е рестрикционен фрагмент (Greenaway, P.J. и сътр., Gene 18 355-360 [1982]). Разбира се промотори от клетките гостоприемник или родствени видове тук също са полезни.

Транскрипцията на ДНК кодираща енкефалиназа от по-висши еукариоти се усилва чрез включване на усилваща секвенция във вектора. Усилвателите са cis-действуващи елементи на ДНК, обикновено от около Ю-ЗОООЬр, които действуват върху промотора така че увеличават неговата транскрипция. Усилвателите са независими относно ориентация и позиция и са намерени 5' (Laimins, L. и сътр., PNAS 78, 993 [1981]) и 3' (Lusky, M.L. и сътр., Mol.Cell Bio.3., 1108 [1983]) спрямо транскрипционната единица, в интрона (banerij, J.L. и сътр.,, Cell 33, 729 [1983]) както и в самата кодираща последователност (Osborne, T.F. и сътр.,Mol. Cell Bio. 4, 1293 11984]). Понастоящем са известни много усилващи последователности от бозайникови гени (глобин, еластаза, албумин, α-фетопротеин и инсулин). Обикновено, обаче, се използва усилвател от еукариотен клетъчен вирус. Примери са SV40 усилвател на последната част на началото на репликацията (Ьр 100-270), уселвател на ранния промотор на цитомегаловируса, усилвател от полиома на последната част на началото на репликацията и аденовирусни усилватели.

Експресионните вектори използвани в еукариотни клетки гостоприемници (дрождени, фунгални, насекомни, растителни, животински, човешки или нуклеотидни клетки от други многоклетъчни организми) също съдържат последователности необходими за завършването на транскрипцията, която може да засегне експресията на тРНК . Тези участъци се транскрибират като полиаденилатни сегменти в нетранслираната част на тРНК кодираща сиалилтрансфераза.

3' нетранслираните участъци също включват места за завърш30

ване на транскрипцията.

Експресионните вектори могат да съдържат ген от селекцията, също завършващ с избираем маркер. Примери за подходящи избираеми маркери за животински клетки са дихидрофолатредуктаза(ОНРК), орнитиндекарбоксилаза, биохимичен маркер за резистентност на много лекарства, аденозиндеаминаза, аспарагинсинтетаза, глутаминсинтетаза, тримидинки-наза или неомицин. Когато такива избираеми маркери се прехвърлят успешно в животинската клетка гостоприемник,трансформираната бозайникова клетка гостоприемник може да оживее ако се постави под избрано налягане. Има две широко използвани различни категории на селективни режими. Първата категория се базира на клетъчния метаболизъм и на използването на мутантна клетъчна линия, която няма способността да расте независима от добавената среда. Два примера са СНО DHFR-клетки и миши LTK-клетки.Тези клетки растат без прибавяне на такива хранителни вещества като тимидин или хипоксантин. Понеже на тези клетки им липсват известни гени необходими за пълния нуклеотиден път на синтеза, те не могат да преживеят, освен ако липсващият нуклеотиден синтезен път се осигури в допълнителна среда. Алтернатива на добавянето на хранителна среда е да се въведе интактна DHFR или ТК ген в клетките, на които им липсват съответните гени, като по такъв начин се изменят изисквнията за растежа им. Индивидуални клетки, които не са трансформирани с DHFR или ТК ген не са способни да преживяват в среди без добавки.

Втората категория е доминантна селекция, която съответствува на селекционната схема използвана при всеки клетъчен тип и не изисква използването на мутантна клетъчна линия. При тези схеми обикновено се използва лекарство, за да се прекрати растежът на клетката гостоприемник. Онези клетки, които имат нов ген ще експресират протеин, който носи резистентност към лекарството и преживява селекцията. Примери за такава доминантна селекция са лекарствата неомицин (Southern, Р. , Berg,P., J.Molec.Appl.Genet, £, 327 [1982]), микофенолна киселина (Mulligan, R.C., Berg,P., Science 209, [1980]) или хидромицин (Sugden, В. и сътр., Mol. Cell Biol. 5. 410-413 [1985]). При трите примера дадени по-горе се използват бактериални гени под еукариотен контрол, за да се придаде резистентност към подходящото лекарство G418 или неомицин (гентицин), xgpt (микофенолна киселина) или хигромицин, съответно.

Амплификация отговаря на увеличението или репликацията на изолиран участък в клетъчната хромозомна ДНК. Амплификацията се постига като се използва селекционно средство, напр. метотрексат (МТХ), който инактивира DHFR. Амплификацията или акумулацията на многобройни копия от DHFR ген има за резултат по-големи количества DHFR продуцирана въпреки по-големите количества МТХ. Амплификационен натиск се прилага без да се препятствува присъствието на ендогенна DHFR, чрез прибавяне на все поголеми количества МТХ към средата. Амплификация на желания ген може да бъде постигната чрез конрансфекция на бозайникова клетка гостоприемник с плазмид имащ ДНК кодираща желания протеин hDHFR или амплификационен ген чрез коинтеграция се отнася като коамплификация. Веднъж дадена възможност на клетката да изисква повече DHFR, това изискване се удовлетворява чрез репликация на селекционен ген, чрез селекциониране само на клетки, които могат да растат в присъствието на все по-големи концентрации МТХ. Доколкото генът кодиращ желания хетероложен протеин се контегрира със селекционния ген, репликацията на този ген често поражда репликация на гена кодиращ желания протеин. Резултатът е, че увеличените копия на гена, напр. амплифицирания ген, кодиращ експресията на желания хетероложен протеин, експресира повече от желания хетероложен протеин.

Предпочитани подходящи клетки гостоприемници за експресия на вектори съгласно настоящото изобретение кодиращи сиалилтрансфераза в по-висши еукариоти са: CV1 линия от маймунски бъбреци трансформирана чрез SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651), клетъчна линия от човешки бъбрек в ембрион (293) (Graham, F.L. и сътр., J.Gen.Virol. 36. 59 [1977]), бъбречни клетки от хамстерчета кърмачета (ВНК, АТСС CCL 10), овариални клетки DHFR от китайски хамстер (СНО, Urlaub and Chasin, PNAS (USA) 77. 4216 [1980J), сертолиеви клетки от мишка (ТМ4, Mather, J.P., Biol.Reprod. 23, 243-251 [1980]), бъбречни клетки от маймуна (CV1 АТСС CCL 70), бъбречни клетки от африканска зелена маймуна (VERO-76 АТСС CRL 1587), клетки от човешка цервикална карцинома (HELA АТСС CCL 2), бъбречни клетки от куче (MDCK АТСС CCL 34), чернодробни клетки от биволски плъх (BRL ЗА, АТСС CCL 75), човешки белодробни клетки (W138, АТСС CCL 75, човешки чернодробни клетки (Hep G2,HB 8065), миши тумор на гръдната жлеза (ММТ 060562, АТСС CCL 51) и TRI клетки (Mather, J.P. и сътр., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-46 [1982j), бакуловирусни клетки.

Трансформация означава въвеждане на ДНК в организма така че ДНК се рециплира или като извънхромозомен елемент или като хромозомна интеграция. Освен ако не е посочено друго, използваният тук метод за трансформация на клетките на гостоприемника е методът на Graham, F. и Van der Eb, A., Virology 52, 456-457 [1973]). Обаче, могат да се използват и методи за вкарване на ДНК в клетките, например чрез ядрено инжектиране или чрез сливане на протопласти. Ако се използват прокариотни клетки или клетки, които съдържат здрава клетъчна стена, предпочитаният метод на трансформация е третиране с калций, като се използва калциев хлорид както е описано от Cohen, F.N. и сътр., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972].

За анализ, за да се потвърдят правилните последователности в конструирания плазмид, се използват лигирани смеси за трансформиране на E.coli К12 294 щам 294 (АТСС 31446) като подходящи са успешно трансформираните избрани по ампицилинова или тетрациклинова резистентност. Приготвят се плазмиди от тези трансформанти, анализират се чрез рестрикция и/или се секвенират по метода на Messing и сътр., Nucleic Acids Res. 9 , 309 (1981] или по метода на Махат и сътр.. Methods in Enzymology 65, 449 [1980].

Клетките на гостоприемника могат да се трансформират с експресионни вектори съгласно настоящото изобретение и се култивират в обичайна хранителна среда, модифицирана за инициране на промоторите като се избират трансформантите или амплифицираните гени. Условията на култивиране като температура, pH и подобни са тези използвани по-рано при клетките гостоприемници избрани за екс34 пресия и са добре познати.

Трансфекция се отнася до поемането на експресионен вектор от клетката гостоприемник без значение дали в действителност се експресира някаква кодираща последователност. На специалистите са познати многобройни методи за трансфекция, например, СаРС>4 и електропорация. Успешната трансформация най-общо се разпознава когато в клетката гостоприемник настъпи някаква индикация за операциите на този вектор.

С оглед да се улесни разбирането на следващите примери тук се описват някои често срещащи се методи и/или термини.

Плазмиди са означени с малка буква р, като преди нея и/или след нея има главни букви и/или цифри. Изходните плазмиди тук са или търговско достъпни, неограничено публично достъпни , или могат да се конструират от достъпни плазмиди съгласно публикувани методи. Освен това, в областта са известни еквивалентни на описаните плазмиди и те са ясни за обикновените специалисти.

Смилане на ДНК означава каталитично отцепване на ДНК с помощта на рестрикционен ензим, който действува само в определени последователности в ДНК. Различните рестрикционни ензими използвани тук са търговско достъпни и реакционните условия за тях, кофактори и други изисквания се използват както са известни на специалистите. За аналитични цели обикновено 1 pg плазмид или ДНК фрагмент се използва с около 2 единици ензим в около 20 μΐ буферен разтвор.

С цел изолиране на ДНК фрагменти за конструиране на плазмид, обикновено 5 до 50 pg ДНК се смила с 20 до 250 единици ензим в по-голям обем. Подходящи буфери и субстратни количества за конкретните рестрикционни ензими са уточнени от производителя.Обикновено се използва време за инкубиране от около 1 час при 37°С, но може да се варира съгласно инструкциите на доставчика. След смилането реакционната смес се подлага на електрофореза директно върху полиакриламиден гел, за да се изолира желаният фрагмент.

Разделянето на фрагментите по размер се осъществява като се използва 8 процентен полиакриламиден гел описан от Goeddel, D. и сътр., Nuleic Acids Res., 8, 4057 (1980].

Дефосфорилиране означава отстраняване на крайните 5'-фосфати посредством третиране с бактериална алкална фосфатаза (ВАР). Тази процедура предпазва двата рестрикционно разделени края на ДНК фрагмента от циркуларизирания или образуващия затворена бримка, което налага включване на друг ДНК фрагмент на мястото на рестрикция. Процедурите и реактивите за дефосфорилиране са конвенционални (Maniatis, Т. и сътр., Molecular Cloning ρ.

- 133-134 (1982]) Реакциите с използване на ВАР се извършват в 50 mM Tris при 68°С, за да се потисне активността на която и да е екзонуклеаза, която може да присъствува в ензимния препарат. Реакцията протича за един час. След реакцията ДНК фрагментът се пречиства.

Олигонуклеотиди се отнася или до едноверижни полидеоксинуклеотиди или до две комплементарни полидеоксинуклеотидни вериги, които могат да се синтезират химически. Такива синтетични олигонуклеотиди имат 5'фосфат и затова не се лигират с друг олигонуклеотид без прибавяне на фосфат с АТЗ в присъствието на киназа. Синтетичният олигонуклеотид се лигира с фрагмент, който не е бил дефосфорилиран.

Лигиране се отнася до процеса на образуване на фосфодиестерни връзки между два двойноверижни фрагмента от нуклеинова киселина (Maniatis, Т. и сътр., Id., р. 146) . Ако не е посочено друго, лигирането може да се осъществи като се използват известни буфери и условия с 10 единици Т4 ДНК лигаза за 0,5 pg от приблизително еквимоларни количества ДНК фрагменти за лигиране. За конструиране на подходящи вектори съдържащи желаната кодираща и контролна последователност се използват стандартни техники за лигиране.Изолираните плазмиди или ДНК фрагменти се прилепват, зашиват или лигират отново във форма желана на формата на искания плазмид.

Запълнени или тъпи краища се отнася до процедури, при които едноверижният край в лепливия край на отстранената с рестрикционен ензим нуклеинова киселина се превръща в двойна верига. Това елиминира лепливите краища и образува тъп край. Този процес , обратно, е инструмент за превръщане на рестрикционно срязания край, който може да бъде леплив с края създаден само с един или няколко други рестрикционни ензима, в край съвместим с всяка тъпо-срязваща рестрикционна ендонуклеаза или друг запълнен леплив край. Обикновено завършването с тъп край се извършва посредством инкубиране на 2-15 pg от ДНК мишената в ЮшМ MgC12, 1 тМ дитиотреитол, 50 mM NaCl, 10 тМ Tris (pH 7,5) буфер при около 37°С в присъствие на 8 единици фрагмент на ДНК полимераза I на Klenow и 250 μΜ от всяка от четирите деоксинуклеозидтрифосфат. Инкубацията обикновено завършва след 30 минути чрез фенолна или хлороформена екстракция и утаяване с етанол.

Полинуклеозидите съответствуващи на или комплементарни на части от описаните последователности могат да се използват като хибридазиционни проби, за да се идентифицират и/или да се изолират съответните последователности на зародишни гени. Такива полинуклеотиди могат да се използват като хибридизационни проби за отсяване на сДНК и геномни банки за изолиране на сДНК-и и гени кодиращи полипептиди, които са структурно и/или еволюционно свързани със сиалилтрансферазната последователност съгласно изобретението. Алтернативно, такива полинуклеотиди могат да послужат като праймери за амплификация на гениите последователности от зародишната линия или родствени последователности посредством полимеразна верижна реакция (PCR).

Хибридизационните проби използвани за идентифициране на допълнителни сДНК видове сиалилтрансфераза са описани на база нуклеотида и очакваните аминокиселинни последователности са показани на фиг. 1 и 2. Хибридизационните проби, които обичайно са маркирани чрез включване на радиоизотопи, могат да се състоят от един или повече обединения на изродени олигонуклеотиди , които кодират изцяло или част от консервативния участък съответствуващ на 55 сегментни остатъка простиращи се от аминокиселинния остатък 134 до аминокиселинния остатък 189 у а2,3-О сиалилтрансфераза от свиня (фиг.1). В частност, хептапептидният мотив -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr- е високо консервативен и хибридизационните проби съдържащи изродените олигонуклеотиди кодиращи този мотив, или варианти на този мотив, където една или две аминокиселини се модифицират така, че да останат най-малко около 4 или 5 аминокиселини от хептапептида. Проби от изродени олигонуклеотиди кодиращи варианти на хептапептидния мотив посредством единично или двойно аминокиселинно заменяне, също са полезни за отсяване на родствени сДНК видове сиалилтрансфераза. В допълнение към изродените олигонуклеотиди, като проби могат да се използват фрагменти от клонирани полинуклеотиди като тези посочени на фиг. 1 и 2. Предпочита се такава проба да обхваща хептапептидния мотив и ако се желае и консервативните 55 аминокиселинни сегментни остатъка описани по-горе.

Геномни или сДНК клонове кодиращи сиалилтрансфераза могат да се изолират от клонове банка като се използват хибридизационни проби създадени на база сиалилтрансферазна нуклеотидна последователност като тази посочена на фиг. 1 и 2. Където се желае сДНК клон, се предпочита клонът банка съдържащ сДНК получена от клетка експресираща сиалилтрансфераза(и). Алтернативно, синтетични полинуклеотидни последователности съответствуващи на всички или на част от последователностите показани на фиг. 1 и 2 могат да се конструират посредством химически синтези на олигонуклеотиди. Освен това могат да се използват полимеразни верижни реакции (PCR) като се използват праймери базирани на данните за последователността описани на фиг. 1 и 2, за да се амплифицират ДНК фрагменти от геномна ДНК, тРНК обединявания или от сДНК клон от банка.САЩ патент 4 683 195 и 4 683 202 описва PCR метода. В допълнение, могат да се използват PCR методите използващи един праймер който се базира на данните за последователността описани на фиг. 1 и 2 и втори праймер, който не се базира на данните за тази последователност. Например, може да се използва втори праймер, който е хомоложен на или комплементарен на полиаденилирания сегмент.

За специалистите от областта е очевидно, че съгласно изобретението в полинуклеотидите могат да се включат нуклеотидните замени, делеция и включване. Обаче тези нуклеотидни замени, делеция и включване не трябва съществено да нарушават способността на полинуклеотида да хибридизира до една от полинуклеотидните последователности показани на фиг. 1 и 2 при условията на хибридизация, които са достатъчно строги, за да се достигне до специфична хибридизация.

Нуклеотидната и аминокиселинна последователности показани на фиг. 1 и 2 позволяват на специалистите да произвеждат полипептиди съответствуващи изцяло или отчасти на кодираните полипептидни последователности. Такива полипептиди могат да се продуцират в прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници чрез експресия на полинуклеотиди кодиращи пълната дължина на сиалилтрансферазата(те) или фрагменти или техни аналози. Алтернативно, такива полипептиди могат да се синтезират посредством химически методи или да се продуцират посредством in vivo транслационни системи като се използва полинуклеотидна матрица за директна транслация. Методите за експресия на хетероложни протеини в рекомбинантни гостоприемници, химична синтеза на полипептида и in vivo транслацията са добре известни на специалистите в областта и са описани поподробно от Maniatis и сътр. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y. и Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, V. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA.

От специалистите могат да се получат фрагменти на сиалилтрансфераза. Предпочитани амино- и карбокси-краища на фрагменти или аналози се срещат близо до границите на структурни и/или функционални домени, например, близо до ензимноактивно място, фрагменти съдържащи по същество един или повече функционални домени могат да се сливат с хетероложни полипептидни последователности, като в резултат се получава слят протеин показващ функционални свойства, като ензимна активност, придадена му от фрагмента. Алтернативно, полипептиди от делеция, където един или повече функционални домени са били изпуснати, показват загуба ва свойството нормално придавано му от липсващия фрагмент.

Бакуловирусната еукариотна генна експресия е едно от най-ефикасните средства за създаване на големи количества функционално активен протеин от клонирани гени (Summers, М. и Lucov, V. (1988) Bio/Technology 6: 47, който е вмъкнат тук за сравнение). Сиалилтрансферазните полипептиди съгласно изобретението могат да се произведат от клонирани полинуклеотиди чрез експресия в бакувирусна експресионна система (Invitrogen Corporation, San Diego, СА).

Типична сиалилтрансфераза и нейният рекомбинантен експресионен продукт се получава съгласно следния протокол:

1. Сиалилтрансфераза от свински черен дроб се пречиства до видима хомогенност.

2. Определя се N-крайната аминокиселинна последователност на сиалилтрансферазата от свиня.

3. Химически се синтезират олигонуклеотидни проби отговарящи на 18 аминокиселини близо до NH2 крайната последователност.

4. Конструират се сДНК банки в XgtlO, като се използва а) произволно иницирана poly А⁺ обогатена тРНК от свинска подчелюстна жлеза, б) oligo dT иницирана poly А ⁺ обогатена тРНК от дроб на плъх и в) oligo dT poly А ⁺ обогатено тРНК от мозък на плъх.

5. Използват се обединени радиобелязани синтетични деоксиолигонуклеотиди комплементарни на кодоните за аминокиселинните последователности на сиалилтрансфераза, описани по-долу, като:

а) 5' ACC CTG AAG CTG CGC ACC CTG CTG GTG CTG ТТС АТС ТТС CTG ACC ТСС ТТС ТТ 3'

б) 5' GAC GTC GGG AGC AAG ACC АСС 3*

6. Произволно иницирана банка от свинска подчелюстна жлеза се отсява като се използват химически синтезираните дълги и къси маркирани проби олигонуклеотид с помощта на полинуклеотидкиназа и ^^р-АТР. Двойно положителните плаки се пречистват и секвенират чрез вмъкване.

7. Използва се едно 32р маркирано вмъкване за повторно смилане на oligo dT иницирани банки от свинска подчелюстна жлеза.

8. Пълната рамка на разчитане за свинска сиалилтрансфераза се получава от два препокриващи се клона сДНК от черен дроб и мозък на плъх съдържа консервативната област на хомоложност както е определена чрез анализ на ДНК последователността на получения клон.

9. сДНК с пълна дължина кодираща кодираща свинска сиалилтрансфераза се конструира от два препокриващи се клона в плазмида и се секвенират.Трябва да се оцени, че описанието на ДНК последователностите на фиг. 1 и 2 позволява да се приготвят проби от консервативната област на хомоложност на сиалилтрансферазната сДНК, като с това значително се опростява и увеличава ефективността на приготвяне на проби сДНК или геномни банки от тези или други видове както и други тъкани от тези или други видове, при което има възможност да се мине без пречистване, секвениране и приготване на пробни набори за сиалилтрансхфераза.

10. Пълната дължина на сДНК кодираща сиалилтрансфраза от свиня и плъх след това се зашива върху експресионен преносител, който се използва за трансформиране на подходяща клетка гостоприемник,която след това се отглежда в култура продуцираща желаната сиалилтрансфераза.

11. Биологичноактивната зряла сиалилтрансфераза произведена съгласно горните процедури може да има алтернативни форми както е показано на фиг. 4 и 5, получени в две изпълнения с 45 kDa и 48kDa молекулно тегло.

Полинуклеотидите съгласно изобретението и рекомбинантно получените сиалилтрансферазни полипептиди и фрагменти или варианти на същите със заменени аминокиселини могат да се получат на база данните на фиг. 1,2,3,5,7 и 8 или на база данните за последователността получена от нови сиалилтрансферазни сДНК-и изолирани по методите съгласно изобретението.Продукциата на полинуклеотиди и рекомбинантно получени сиалилтрансферазни полипептиди се осъществява по известни в областта методи описани от Maniatis и сътр., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. и Berger и Kimmel, Methods in Enzymology, V. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, които са включени тук за сравнение. Полинуклеотидните послдователности могат да се експресират в гостоприемника след като последователността е била операторно свързана към (т.е. поставена на място да осигури функционирането на) експресионна контролна последователност, така че транскрипцията на полинуклеотидната последователност да настъпи при подходящи условия за транскрипция.

Специфична хибридизация както е дефинирана тук в описанието се отнася до формиране на хибриди между проба полинуклеотид (напр. полинуклеотид съгласно изобретението, който може да включва заменяне, изпускане и/или включване) и специфичен полинуклеотид мишена (напр. полинуклеотид с комплементарна последователност), при което пробата за предпочитане хибридизира със специфичната мишена, така че, например, може да се идентифицира единична ивица по метода Nothern-блот на РНК получена от еукориотни клетки, които съдържат РНК мишена и/или единичен главен PCR продукт получен, когато пробата нуклеотид се използва като PCR праймер. В някои случаи последователността мишена може да се намира в повече от един вид полинуклеотид мишена (напр. специфична последователност мишена може да се среща в много членове на сиалилтрансферазната генна фамилия или в алтернативно снадени РНК-и транскрибирани от същия ген). Очевидно е, че оптималните условия на хибридизация ще варират в зависимост от състава на последователността и дължината(те) на пробата(е) и мишената(те) и избрания експериментален метод от практикуващия специалист. Могат да се използват различни принципи, за да се изберат подходящи условия за хибридизация (виж.МаптаПБ и сътр., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. и Berger и Kimmel, Methods in Enzymology, V. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, СА,които са включени тук за сравнение.

Безсмислени полинуклеотиди са полинуклеотиди, които са 1) комплементарни на всички или на част от последователностите показани на фиг. 1 и 2, и/или последователностите получени от нови сиалилтрансферазни сДНК-и изолати по методи съгласно изобретението и 2) които специфично хибридизират с комплементарна последователност мишена. Такива комплементарни безсмислени полинуклеотиди могат да включват нуклеотидно заменяне, включване, делеция, или транспозициониране, стига да се запази специфичната хибридизация със съответната последователност мишена(напр. съответствуващи на фиг. 1 и 2) като функционално свойство на полинуклеотида.Комплементарни безсмислени полинуклеотиди са разтворими безсмислени РНК или ДНК олигонуклеотиди, които могат да хибридизират специфично с индивидуални сиалилтрансферазни тРНК видове или с много членове на сиалилтрансферазната тРНК фамилия и предотвратява транскрипцията на тРНК видове и/или транслацията на кодирания полипептид (Cling и сътр.,, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 10006-10010 1989), Broder и сътр., Ann. Int. Med. 113:604-618 (1990), Loreau и сътр., FEBS Letters 274: 53-56 (1990), Holzenberg и сътр., WO91/11535, U.S.S.N. 07/530,165(New human CRIPTO gene), WO91/09865, WO91/04753, WO90/13641 и EP 386563, всеки от които е включен тук за сравнение). Безсмислените полинуклеотиди следователно инхибират продукцията на кодирания полипептид(и). В това отношение безсмислените полинуклеотиди, които инхибират транскрипцията и/или транслацията на една или повече сиалилтрансферази може да промени капацитета и/или специфичността на клетката към гликозилатни полипепти.

Безсмислените полинуклеотиди могат да се получат от хетероложна експресионна касета в трансфектантна клетка или трансгенна клетка като трансгенна плурипотентна хематопоетична стеум клетка използвана за реконструиране на цялата или част от хематопоетичната клетъчна популация на индивида. Алтернативно, безсмислените полинуклеотиди могат да бъдат разтворими олигонуклеотиди, които се разпределят към външната среда, или в културалната среда in vitro или в циркулаторната система или интерстициална течност in vivo. За разтворимите безсмислени полинуклеотиди намиращи се във външната среда е показано, че получават достъп до цитоплазмата и инхибират транслацията на специфичните тРНК видове. В някои изпълнения,

безсмислени полинуклеотиди съдържат метилфосфонатни остатъци, алтернативно могат да се използват фосфоротиолати или О-метилрибонуклеотиди, а могат да се използват също и химерни олигонуклеотиди (Dagle и сътр.(1990) Nucleic Acids Res. 18: 4751). За някои приложения безсмислените олигонуклеотиди могат да съдържат полиамид нуклеинови киселини (Nielsen и сътр., (1991) Science 254: 1497). За най-общите методи относно безсмислените полинуклеотиди виж Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Безсмислените полинуклеотиди комплементарни на една или повече последователности се използват за инхибиране транслацията на близки тРНК. видове като с това да се извърши намаляване на количеството съответно кодирания полипептид. Такива безсмислени полинуклеотиди могат да осигурят терапевтична функция чрез инхибиране формирането на една или повече сиалилтрансферази in vivo.

Могат да се конструират трансгенни животни притежаващи едно или повече интегрирани копия на сиалилтрансферазни трансгени .Сиалилтрансферазните трансгени са полинуклеотиди съдържащи полинуклеотидна последователност, която кодира сиалилтрансферазен протеин или фрагмент, операторно свързан с функционален промотор и свързан с избрана маркирана последователност като G-418 резистентен ген.

Възможно е, като се използва генетична манипулация да се развие трансгенна моделна система и/или цяла клетъчна система съдържаща сиалилтрансферазен трансген за употреба, например като моделна система за скрининг

	за лекарства и оценка на ефективността на лекарства. Освен това такава моделна система осигурява инструмент за определяне на неизяснената биохимия на сиалилтрансферазния метаболизъм,и с това се осигурява база за рационален лекарствен дизайн и експериментално изпитване. Един подход за създаване на трансгенни животни е да се насочи мутацията към желания ген чрез хомоложна рекомбинация в ембрионална стем клетъчна линия (ES)
φ	in vitro, последвано от микроинжектиране на модифицирана ES клетъчна линия в гостоприемника бластоцист и след това инкубация в приемник (виж Frohman и Martin (1989) Cell 56: 145) Алтернативно, може да се използва техниката на микроинжектирането на мутирания ген или на части от него в едноклетъчен ембрион с последваща инкубация в използвания приемник . Могат да се прилагат различни начини за използване на трансгенни животни, по-специално трансгенни животни, които експесират природносрещащ се сиалилтрансферазен протеин или фрагменти от него. Алтерна-
.Ji;·	тивно, по желание могат да се конструират трансгенни животни съдържащи трансгени, които кодират променен чрез мутация (напр. мутагенизиран) сиалилтрансферазен протеин(и), който може или не може да има ензимна активност. Методите за произвеждане на трансгенни животни са известни на специалистите. Алтернативно, насочена по място мутагенеза и/или генна конверсия, могат да се използват, за да се мутира in vivo сиалилтрансферазен генен алел, било ендогенен или трансфектиран, така че мутираният алел кодира вариантна сиалилтрансфераза.

fl.

W·*’'

Алтернативно, може да се използва хомоложна рекомбинация, за да се вмъкне сиалилтрансферазна последователност в геном гостоприемник на специфично място, например на съответния локус на сиалилтрансферазен гостоприемник. При един тип на хомоложна рекомбинация се заменят една или повече последователности например сиалилтрансферазен алел гостоприемник (или част от него) се заменя с мутирана сиалилтрансферазна последователност (или части от нея). Освен това, към такива методи на генно заместване, може да се използва хомоложна рекомбинация, за да се насочи полинуклеотид кодиращ сиалилтрансфераза (или фрагменти от нея) към специфично място, различно от локуса на сиалилтрансферазата гостоприемник. Хомоложна рекомбинация може да се използва, за да се произведе трансгенно не-човешко животно и/или клетки, които включвяат в себе си мутирани сиалилтрансферазни алели. Може да се използва генно насочване, за да се разруши и инактивира един или повече сиалилтрансферазни гени. Тези така наречени трансгенати нокаут са описани в литературата за други гени (WO91/107.41, Kuhn и сътр.(1991) Science 708: 707).

Следващите примери илюстрират най-добрия познат досега начин за практикуване на изобретението, без да го ограничават. Всички литературни цитати са вмъкнати тук за справка.

ПРИМЕР 1

Пречистване на сиалилтрансфераза от свиня Пречистване на две форми на <х2,3-О сиалилтрансфераза а2,3-О сиалилтрансферазата се пречиства като се използва комбинация от две процедури описани по-рано (Sadler J.Е. и сътр., J.Biol.Chem. 254. 4434-4443 [1979] и Conradt H.S. и сътр., Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds.) p. 104-105, Verlag Wissenschaft and Bilding, Kiel [1988]). Ензимът се пречиства из екстракт от свински черен дроб направен с Triton Х-100, чрез афинитетна хроматография на три последователни колони от CDPхексаноламин агароза.Профилът на елуиране от първия и Г третия етапи на пречистване е показан на фиг. 3 и 4, съответно. Фиг. 3 показва, че се наблюдават два пика сиалилтрансферазна активност в профила на елуиране от първата афинитетна колона. Тези два пика се разделят посредством обединяване на посочените фракции в обединения А и В, като тези две обединения са обогатени на две форми на а2,3-О силилтрансфераза ,с различни молекулни тегла.

Вторият етап на афинитетно пречистване на всяко обединение има за резултат отстраняване на по-голямата част от онечистванията от <х2,6 сиалилтрансфераза, които също се k намират в свински черен дроб (Sadler, J.E. и сътр., J.Biol.

Chem.254, 4434-4443 [1979]). След третия етап на афинитетна хроматография, фракциите от колоната се анализират и за отделни фракции се установява, че са обогатени с форми а2,3 сиалилтрансфераза с молекулно тегло 48 kDa (Фиг.4А, фракции 4-6) или на 45 kDa (фиг. 4В, фракции 2-6). Тези два протеина се означават респективно като форма А и форма В. Специфичната активност за пиковите фракции от двете колони е 8-10 единици/mg протеин. Силната ивица (~44 kDa) видима при фракции 6 фиг.4 колона А не е <х2,3 сиалилтрансфераза, а представлява едно от главните онечиствания в двете обединени части А и В след предходната колона, тъй като липсва ензимна активност в крайния етап на афинитетната хроматография.

Сиалилтрансферазната активност се изпитва с лактоза и/или антифризен гликопротеин с ниско молекулно тегло като субстрат.(Sadler, J.E. и сътр., J.Biol.Chem.254, 44344443 [1979]). Ензимът от свински черен дроб се пречиства като се следват описаните методи (Sadler, J.E. и сътр., J.Biol. Chem.254, 4434-4443 [1979] и Conradt H.S. и сътр., Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds.) p. 104-105, Verlag Wissenschaft and Bilding, Kiel [1988]) c някои модификации. Накратко, 2 kg черен дроб се хомогенизира в буфер и мембраните се приготвят както е описано (Sadler, J.E. и сътр., J.Biol.Chem.254, 4434-4443 [1979]). Мембраните се екстрахират три пъти с буфер Conradt H.S. и сътр., Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds.) p. 104-105, Verlag Wissenschaft and Bilding, Kiel [1988] и екстрактът се пропуска през 1,5 1 колона CDP-хексаноламинагароза (колона 1) (16 umol/ml). След промиване на колоната с 3L буфер В, колоната се елуира с линеен градиент 0,05 до 1,0 М КС1 (2,5 1 х 2,5 1) в буфер В. Фракциите съдържащи а2,3 сиалилтрансфераза се обединяват в две обединения А и В, представляващи главната част и провлачения край на пика, съответно (виж фиг. 3). Обединените фракции се диализират спрямо буфер В и се подлагат на друг етап афинитетна хроматография на CDP-хексаноламинагароза (колони ПА ги ИВ). 150 ml колона се използва за обединените фракции А и 30 ml колона за обединените фракции В. Двата препарата получени от колона I (от общо 4 kg черен дроб) се зареждат на същата колона в етап II. Елуирането на а2,3 сиалилтрансферазата се осъществява с градиент 0-2,0 тМ СТР (750 ml, обединени фракции А, 150 ml обединени фракции В) в буфер В. Фракциите с а2,3 сиалилтрансферазна активност се обезсоляват на G50 Sephadex, еквилибриран в буфер и активните фракции се нанасят на1,0 ml колони с CDP-хексаноламинагароза (част III), като се елуират с градиентна стъпка от 0,1 до 1,0 тМ СТР (20 стъпки, 1,0 ml всяка) в буфер В (виж фиг.2). Активните фракции се обединяват и общият добив от двете колони е 2,5 единици при специфична активност 8-10 единици/mg протеин.

Сиалилтрансферазните пептиди 48kDa и 45kDa (виж фиг. 4) се разделят повторно на SDS-полиакриламиден гел (Leammli, U.K., Nature 227, 680-685 [1970]), електроелуират се на PVDF мембрана (Immobilon Transfer, Millipore) и се оцветяват с Coomasie брилянтно синьо (Sigma). Ивиците сиалилтрансфераза се изрязват и свързаните пептиди се анализират за NH2- крайна аминокиселинна последователност посредством разпадане по Edman като се използва Applied Biosystems 475А прибор за определяне последователността на аминокиселините.

Фракциите обогатени на формите 48 kDa ( форма А) и 45· kDa (форма В) сиалилтрансфераза, се подлагат на електрофореза върху полиакриламиден гел (PAGE) , пренасят се към PVDF мембрана и се анализират чрез секвениране на ИНз-края. Двадесет и две аминокиселинни остатъка се получават от всяка секвенция за всеки от пептидите (фиг. 5). NH2- крайната последователност на форма А съдържа хидрофобен интервал от аминокиселини, който съвпада с очакваното от (Sadler, J.E. и сътр., J.Biol.Chem.254, 4434-4443 [1979]) и Wescott и сътр..iJ.Biol.Chem.260, 13109-13121), че по-малката форма произлиза от по-голямата форма чрез протеолитично разцепване на хидрофобен пептид. За този участък се предполага, че има значение за свойствата на детергентно и мембранно свързване уникални за форма А.

ПРИМЕР 2 сДНК сиалилтрансфераза от свиня

Poly А⁺РНК се използва като матрица за конструиране на едноверижна сДНК като се използва набор доставен от Invitrogen. сДНК служи като матрица за полимеразната верижна реакция (PCR) като се използват реактиви и протоколи доставени от Perkin Elmer Cetus . Използваните специфични условия са 92°С за 1 минута, 50°С за 2 минути и 72°С за 2 минути за стадия денатуриране, хибридизация и полимеризация. PCR реакциите започват с 30 Ьр, олигонуклеотидите съответствуващи на последователности граничещи с 120 Ьр, делеция при 3' края на ST1. Продуктите от реакцията на амплификация се разделят върху 2% агарозен гел. Двете специфични ивици различаващи се при 120 Ьр, съответствуващи на ST1 и ST2 клонове се идентифицират чрез оцветяване с брометан. Ивиците се елуират от гела (Qiaex набор, Qiagen), субклонират се до ТА вектор (Invitrogen) и се секвенират както по-горе за недвусмислено идентифициране.

Изолиране на РНК и конструиране на сДНК банка

Пресни подчелюстни слюнчени жлези от свиня (<30 минути след смърта) се замразяват и транспортират в сух лед- EtOH.Общото количество РНК се изолира като се следва процедурата на Chomczynski и Sacchi (Ansl.Bichem. 162, 156-159 [1987]). Poly А + РНК се пречиства посредством oligo dT-целулозна хроматография (Pharmacia). Двойноверижна сДНК се синтезира посредством обратна транскрипция на poly А⁺РНК като се използват произволни хексамери като праймери с набор Pharmacia за синтез на сДНК и и методиката препоръчана от доставчика. EcoRl адаптери се лигират с EcoRl смлени IgtlO и се опаковат in vitro (ProMega). сДНК банката се нанася на плака за отсяване чрез инфектиране с E.coli С600 с опакованата смес.

Изолиране и секвениране на сДНК клоновете

Всички процедури се извършват съгласно Maniatis и сътр. (в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. [1982]) освен ако не е посочено друго. 53 Ьр олигонуклеотидна проба (5'ACCCTGAAGCTGCGCACCCTGCTGGTGCTGTTCATCTTCCTGA ССТССТТСТТЗ¹), отговаряща на 18 аминокиселини близо до ИН2-крайната последователност на пречистения 48 kDa сиалилтрасферазен пептид (виж фиг.5), се бележи в края с θ2ρ д_О специфична активност 10? cpm/pmol. 500,00 плаки се отсяват чрез нуклеотидна хибридизация в следния предхибридизационен/хибридизационен разтвор: 5xSSC, 50 шМ NaH2PC>4 pH 6,7, 20% формамид, 5х разтвор на Denhardtq 0,1% mg/ml ДНК от сперма на сьомга при 37°С (Wood, W. , Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, p. 443). Нитроцелулозните филтри (Schleicher и Schuel 0,45 m пори) се промиват в 0,2xSSC, 0,1% SDS при 420 за 40 минути. Получава се един силно хибридизиран клон

XST1, който съдържа отворена рамка на разчитане, която кодира аминокиселинна последователност съответствуваща на 48 kDa и 45kDa пречистени сиалилтрансферазни пептиди. Втори клон, XST2, се изолира чрез нуклеотидна хибридизация като се използва проба от 3' края на XST1 като рестрикционен фрагмент. Тази проба, 0,5 kb Pvu П-EcoRI рестрикционен фрагмент се маркира като се използва набор за произволно инициране и [a-^2p]dCTP (Amersham).

EcoRI рестрикционните фрагменти съответствуващи на сДНК включвания на фагови ДНК-и се субклонират в pUC вектори (Pharmacia). Субклоновете се секвенират като се използва Т7 набор от Pharmacia. Данните за последователността се анализират на компютър като се използва DNASTAR (DNASTAR Inc., WI,USA).

Изпробвани са няколко стратегии на клониране с оглед да се клонира сДНК за а2,3 сиалилтрансфераза на база информацията за аминокиселинна последователност представена на фиг. 5. При първия подход се приготвят праймери за полимеразна верижна реакция, за да се извърши изследване обхващащо NH2 крайните последователности на видовете 48 и 45 kDa протеин, приемайки, че те са съседни в интактния ензим. В ретроспекция този подход е неуспешен поради неточност в аминокиселинната последователност получена за 45 kDa видовете (виж фиг.5 и 6). Други неуспешни опити да се получи положителен клон са свързани с използване на къси (16-20 Ьр) изродени олигозахаридни като проби за отсяване на сДНК от свинска подчелюстна слюнчена жлеза. Успешен е подходът при използване на неизроден 53 Ьр олигонуклеотид кон55 струиран от 17 аминокиселини участък на NH2- края на форма А. 53 Ьр пробата се използва за отсяване на 500,000 плаки на Igt 10 от свинска подчелюстна слюнчена жлеза сДНК банка. Получава се единичен 1,6 kb клон, IST1, който има консенсус ATG стартов кодон (Kozak, М., Cell 49, 283-292 [1986] и Kozak, М., Nuc.AcidsRes. 12, 857-872 {1984]), отворена рамка на разчитане кодираща НН2-крайните аминокиселинни последователности на двете форми А и В на <х2,3 сиалилтрансфераза и без стоп кодон в рамката. Фактът, че ч- ИН2-крайните аминокиселинни последователности от двете форми на а2,3 сиалилтрансфераза се намират в транслираната отворена рамка на разчитане на XST1 означава, че XST1 клонът кодира част от а2,3 сиалилтрансферазата.

3' рестрикционният фрагмент на XSTl се използва като проба за получаване на втори препокриващ клон, XST2, от същата банка (фиг.б)· XST2 допълва отворената рамка на разчитане произлизаща от XSTl. Заедно, тези две сДНК-и кодират проста отворена рамка на разчитане (909-1029, виж по-долу), 600 Ьр 5’ нетранслиран участък и ЮООЬр 3' нетраслиран участък. Нуклеотидната последователност, както и транслираната аминокиселинна последователност за 1029Ьр отворената рамка на разчитане е показана на фиг. 7. Има добро съгласуване между очакваната аминокиселинна последователност в транслираната отворена рамка на разчитане на XST1 и аминокиселинната последователност получена чрез директен анализ на пречистените протеини.

Последователностите на препокриващите се участъци на XST1 и XST2 са идентични по целите им дължини с изключение на 120 Ьр празнина в XST1. Уникалната

_|#Ж».

w отворена рамка на разчитане продължава от двете страни на това прекъсване в XST1 (фиг. 6). За да се определи дали едната или и двете от двете сДНК форми представляват истинската тРНК, се извършва PCR анализ като се използват праймери граничещи с тази празнина върху сДНК матрица получена чрез обратна транскрипция на poly А⁺ РНК от свински слюнчени жлези. Разширените PCR фрагменти съответствуващи на XST1 и XST2 се откриват при този подход (данните не са показани). PCR продуктите се субклонират и секвенират, за да се потвърди тяхната идентичност, като е намерено, че и двата са идентични на съответните участъци в XST1 и XST2. По такъв начин резултатите и от директното сДНК клониране и PCR амплификацията навеждат на мисълта, че има две тРНК спецификации за сс2,3 сиалилтрансфераза в свинска подчелюстна слюнчена жлеза, които се различават по присъствието или отсъствието на 120 Ьр включване в отворената рамка на разчитане.

Очакваната галемина на сиалилтрансферазния (1029Ьр отворена рамка на разчитане) протеин е 39 kDa, с 4 възможни N-,свързани гликозилирани места (виж фиг. 7) (Bouse, Е., Biochem.J. 209, 331-336 (1983]). Използването на 3 от тези места води до получаване на протеин с очакван размер от прблизително 48 kDa наблюдаван за форма А на пречистена сиалилтрансфераза. Макар че крайната аминопоследователност съдържа два ATG кодона в непосредствена близост, само първият е в строг консенсус с мястото на започване на транслацията (Uozak, М. Cell 49, 283-292 [1986] и Koozak.M., Nuc.Acids Res. 12, 857-872 [1984]). Kyte-Doolittle хидропатичен анализ (J. Mol. Biool. 157, 105-132 (1982J) показва един потенциално мембранно свързан участък, който се състои от 16 хидрофобни остатъка, разположени на 11 остатъка от амино-края (фиг.7). Тази структурна характеристика подсказва, че <х2,3 сиалилтрансфераза като други гликозилтрансферази, които са изследвани има тип II мембранна ориентация и че този единичен хидрофобен участък може да служи като неразцепващ се амино-краен сигнално контактен домен (Paulsoon, J.C. and Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 (1989]).

> Отворената рамка на разчитане кодирана чрез XST1 и XST2 съдържа цялостната ИН^-крайна аминокиселинна последователност получена и от форма А и от форма В на а2,3-О сиалилтрансфераза. Както е показано на фиг. 6,в NH2 крайната секвенция на форма А са намерени 8 аминокиселини от предполагаемото стартово място на транслацията на отворената рамка на разчитане, а съответната Ь1Н2-крайна последователност на форма В е намерена 27 аминокиселинни остатъка по-нататък към СООН-края на протеина. Тъй като форма В на а2,3-сиалилтрансферазата е изцяло каталитично активна (Rearick, J.I. и сътр., J.Bil. Chem.254, 4444-4451 (1979]), протеиновата последователност между предполагаемия инициатор метионин на ензима с пълна дължина и амино-края на форма В, вероятно не се изисква за ензимна активност. Така участъкът на протеолитична чувствителност на <х2,3-О сиалилтрансфераза, който е между сигнално контактния домен и каталитичния домен изглежда че е стем участък, както е дефиниран за по-рано изследваните гликозилтрансферази (Weinstein, J. и сътр., J.Biol.Chem. 262, 17735-17743 (1987] и Paulson, J.C. и Coolley.K.J., J. Biol.Chem.

264, 17615-17618 [1989]).

Двадесет mg от общата РНК от тъкан на свиня или плъх се подлага на елекрофореза на 1,0 % агарозен гел съдържащ 2,2 М формалдехид (26) и се прехвърля на нитроцелулозни филтри (Schleicher и Schuell) както е описано. Нитроцелулозните филтри се хибридизират с 32р. маркирани сДНК проби и се промиват както е описано порано.

ПРИМЕР 3

Експресия на разтворима сиалилтрансфераза от свиня

Секретеруем химерен протеин се приготвя между предполагаемия каталитичен домен на а2,3-О сиалилтрансфераза и инсулинова сигнална последователност чрез сливане на С-крайния 890Ьр на клон XST2 с N-крайната част на вектора pGIR-199 (Hsueh и сътр., J.Biol.Chem. 261, 4940-4947 [1986]) при Sac I място съдържащ в рамката на разчитане и двата вектора. Химерната sp-ST, се смила с рестрикционните ензими Nhe I и Sma I, изолира се фрагментът 1,0 kb и се субклонира в pSVL (Pharmacia) и смила с Nba I и Sma I като слепва местата съдържащи се в полилинкера. Получената конструкция се нарича pSVL-spST и се използва като вектор за преходна експресия на разтворима форма на а2,3-О сиалилтрансфераза в COS-1 клетки. Суперспиралната ДНК, pSVL sp-ST, се трансфектира в COS-1 клетки като се използва липофектин съгласно процедурата препоръчана от доставчика. (60 mm културални блюда съдържащи 50% слети клетки се трансфектират с 5 pg ДНК, 20 ml липофектин). След четиридесет и осем часа трансфекция

COS-1 клетъчната среда се събира и концентрира 15 кратно на Centricn 30 филтри (Amicon) и се анализира за а2,3-О сиалилтрансферазна активност. а2,3-О сиалилтрансферазната активност се определя като се използва антифризен гликопротеинов акцептор както е описано по-рано (Sadler и сътр., J.Bioool.Chem 254.4434-4443 [1979]).

След четиридесет и осем часа трансфекция с pSVLspST COS-1 клетките (60 mm културални блюда) се промиват със met несъдържаща среда (DMEM, 5% серум от телешки зародиш) (Gibco) и се култивира в същата среда в продължение на 1 час. Клетките се маркират пулсационно с 150 mCi/150 pmol $5 s-met Express маркер, ( NEN) в 1,5 ml met несъдържаща среда в проължение на 2 часа. Тези клетки след това се промиват с PBS и престояват в продължение на 5 часа в среда без 35g._met белег. Средата съдържаща секретираните протеини, след това се събира, конценрира се 15 кратно и се подлага на SDS-PAGE и анализира посредством флуорография.

Както е посочено по-горе, форма В на а2,3-О сиалилтрансфераза е ензимноактивен протеолитично отцепен продукт от цялата дължина, мембранно-свързан ензим. Поради това може да се очаква, че разтворим, химерен протеин трябва да съдържа а2,3-О сиалилтрансферазна активност, ако той включва цялата последователност на В формата. За да се създаде такъв разтворим протеин, рестикционната част обратна на 1ЧН2-края на пептидната последователност се избира като място за сливане на XST2 сДНК с вектора кодиращ сигналната инсулинова последователност pGIR-199.

Както е илюстрирано на фиг. 9а, тази

Шг' конструкция кодира слетия протеин, тук наречен сигнален пептид - ST (sp-ST), който се състои от инсулинова сигнална последователност последвана от 9 аминокиселини кодирани посредством pGIR линкер и целия предпологаем каталитичен домен на а2,3-О сиалилтрансфераза. Очаква се sp-ST конструкцията да насочи синтезата към 38 kDa, секретируем протеин, когато се трасфектира в бозайникови клетки гостоприемник. Подобна стратегия за продукция на разтворими форми на гликозилтрансферази е успешно използвана (Paulson, J.C. и Colley, K.J., J.Biol.Chem. 264, 17615-17618 [1989], Larsen, R.D. и сътр.,, Proc.Natl.Acad.Sci.USA87. 66746678 [1990]).

sp-ST конструкцията се премества в pSVL експресионен вектор и се трансфектира преходно в COS-1 клетки. След 48 часа трансфектираните клетки се инкубират в продължение на 2 часа в среда съдържаща Trans^^S-маркер и след това престояват 5 часа в среда без маркер. Тази среда се събира, концентрира се 15 кратно и се анализира посредством SDS-PAGE/флуорография. Фиг.9Ь показва, че средата съдържаща главно 38kDa видове, очаквания размер ,на sp-ST протеина. При паралелни трансфектирани култури, средата се събира след 48 часа трасфекция, концентрира се и се изследва за а2,3-О сиалилтрансферазна активност. Както е илюстрирано на фиг. 9с, средата от клетки трансфектирани с sp-ST съдържа милиединици/ml сиалилтрансфераза, докато средата от контролните трансфектирани клетки нямат никаква съществена активност.

ПРИМЕР 4

Пречистване и секвениране на сиалилтрансфераза от черен дроб на плъх

Подобно на други гликозилтрансферази, които са налични в мембранни протеини на ендоплазмения ретикулум и на Golgi апарата, сиалилтрансферазите са слабо разпространени протеини и трудни за пречистване, което обяснява защо само два члена на тази фамилия са клонирани. Gaip l,3(4)GlcNAc сс2,3 сиалилтрансфераза (α2,3Ν) е първата пречистена 800,000 кратно от черен дроб на плъх в 1982 от Weinstein и сътр., получена от около 10 pg/ng тъкан Weinstein и сътр.J.Biol.Chem. 257. 13835-13844 [1982] и Weinstein и сътр. J.Biol.Chem. 13845-13853 [1982]). Макар че са направени няколко опита за получаване на аминокиселинна последователност информационна или произвеждаща антитяло срещу ензима като се използват общоприети методи, те пропадат, поради малките количества разреден протеин, който би могъл да се получи. Като алтернатива масспектрометрията има засилена роля за структурното изясняване на биологично важни макромолекули. Развитието на нови йонизационни методи и инструменти разширяват достъпната граница на масата и чувствителността на откриване. Висо-ко разрешителна тандемна масспектрометрия сега е установена като мощна техника за секвениране на протеини (Methews, W.R. и сътр., J.Biol.Chem. 262, 7537-7545 [1987]), както и за определяне на пост-транслационни и химически модификации (Dever, Т.Е. и сътр., J.Biol.Chem.264. 20518-20525 [1989], Settineri, С.А. и сътр..Biomed. Environ.Mass Spectrom. 19. 665676 [1990] и DeWolf Jr., W.E. и сътр. Biochem. 27, 90993-9101 [1988]). Поради това масспектрометрията се използва за установяване на аминокиселинната последователност на сиа62 лилтрансферазa.

Редукция и карбоксиметилиране

Приблизително 13 pg Gaip 1,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (α2,3-Ν) се съхранява в 350 ml 30 тМ натриев какодилат (рН = 6,5), ЮОтМ натриев хлорид , 0,1% Triton CF-54 и 50% глицерол. ТрисНС1 (рН = 8,0), гуанидинНС1 и дитиотреитол се прибавят към крайни концентрации 0,2 М и 7 тМ, съответно. Редукцията се провежда при 60°С, под аргон, в продължение на 1,5 часа. Към сместа се прибавя натриев йодоацетат (1,32 mg) в 2,5 ml 0,2 М ТрисНС1 буфер. Алкилирането се провежда при стайна температура, под аргон, на тъмно, в продължение на 1,5 часа.

Диализа. Редуцираната и карбоксиметилирана α2,3Ν се диабизира срещу 4 литра 50 тМ буфер N-етилморфолинацетат (рН = 8,1) като се използва Bathesda Research Labs (BRL) микродиализна система с BRL диализна мембрана с молекулно тегло до 12-14 kDa. Когато завърши диализата, се прибавя 10% SDS към диализирания продукт, получен с крайна SDS концентрация приблизително 0,1%. Съдържанието на диализирания продукт се събир-а и суши като се използва SpeedVac Concentrator (Savant). За да се отстрани SDS, се провежда утаяване по Konigsberg (Konigsberg, W.H., Henderson, L., Methods in Enzymology 91. 254-259 [1993]).

Смилане c трипсин. Утаената <x2,3N се разтваря в буфер за смилане (100 тМ Трие НС12М карбамид, 1 тМ СаС12, рН = 8,0), като се получава протеин с концентрация приблизително 2 mg/ml. α2,3Ν се смила с 10% трипсин (т/т) (Boehringer-Mannheim, степен на секвенция, разтворен в 1 тМ НС1) при 37°С. След 7 часа смилане към сместа се прибавя друга аликвотна част трипсин до получаване на крайна трипсинова концентрация приблизително 13%. Смилането завършва след 18 часа. Полученият смлян с трипсин продукт се отделя посредством HPLC с обърната фаза (ABI С18 колона, 1,0 х 100 mm) като се използва ABI 140А подаваща разтворител система. Разтворител А е 0,1% TFA във вода. Разтворител В е 0,08%TFA в 70% ацетонитрил/30% вода. Системата работи при скорост на изтичане 50 ml/минута. Десет минути след инжектирането, процентното съдържание на разтворител В се увеличава от 0% до 50% за 90 минути, след това до 100% за 30 минути. Пептидите се откриват като се използва ABI 783А абсорбционен детектор, работещ при 215 nm. Някои от фракциите се естерифицират като се използва смес от НС1/н-хексанол.

Масспектрометрия. Експерименти с течна вторична йонна масспектрометрия (LSIMS) се провеждат като се използва Kratos MS50S двойно фокусиран масспектрометър, снабден с LSIMS източник и високо магнитно поле. Приблизително една пета от всяка събрана фракция се зарежда за LSIMS анализи. Като течна матрица се използва един микролитър смес от глицерол-тиоглицерол 1:1 подкислен с 1% TFA. Образците се събират повторно от крайната проба. Найразпространените молекулни йони се избират за анализ посредством колизионна индуцирана дисоциация (CID). Тези експерименти се осъществяват на Kratos Concept IIHH четирисекторен масспектрометър, снабден с елекрооптична многоканална система детектор, който мож да запише едновременно 4%секвентни сегменти в масовата бласт.Колизионната енергия започва при 4 кеУ, колизионният газ е хелий и неговото

налягане се наглася за намаляване изобилието на избрания йон предшественик до 30% от неговата начална стойност. Остатъците от всички проби се събират и се прибавя 1 ml от гореспоменатата матрица. Данните от високо енергетичната CID се интерпретират без помощта на компютърен анализ.

Тандемната масспектрометрия е мощен метод за протеиново секвениране, с предимства пред общоприетата техника на Edman. По този метод е възможно секвениране дори на еквимоларни смеси. За масспектрометричен анализ първите няколко пептидни фракции от HPLC се естерифицират, за да се увеличи тяхната хидрофобност, като по този начин се подобрява тяхното резултатно разпръскване (Falick, А.М. и Maltby, D.A., Anal. Biochem. 182, 165- 69 [1989]). LSIMS анализът на всяка фракция показваща многобройни молекулни йони, посочва присъствието на повече от един пептид във всяка. Най-разпространените 30 молекулни йони се избират за CID анализ. В тези експерименти, 12С изотопният пик на интересуващия ни йон се избира в първия масспектрометър. Само фрагментите от тези видове получени от дисоциацията причинена от колизията с хелия в колизионната клетка, разположена между двата масспектрометъра, се регистрират в края на втория масспектрометър. Фрагментирането чрез анализ посредством високо енергетична колизионно индуцирана дисоциация (CID) се случва главно по продължението на пептидния скелет. Наблюдават се също многобройни скъсвания, т.е. фрагментиране на аминокиселинните вериги. Фрагментирането по продължение на пептидната верига води до получаване на йонна серия, която се различава по теглото на аминокиселинните остатъци, така че може да се очаква съответната аминокиселинна последователност. Високоенергетичният начин на фрагментиране осигурява допълнителна информация за аминокиселинната идентичност, потвърждавайки по този начин получените посредователности и позволявайки диференциацията между изобарната Leu/Ue аминокиселинна двойка

(Johnson, R.S. и сътр., Annal. Chem.59.2621-2625 [1987]). Фрагментирането на странична верига може да се наблюдава главно, където има базична аминокиселина, т.е. Arg, Lys или His, в последователността (Johnson, R.S. и сътр., Int.J.Mass

Spectrom. Ion Proc. 86, 137-154 [1988]). Най-общо, изгодно протониране на базични аминокиселинни остатъци при или близо до N-края води до получаване на предпочитано задържане на товар в този край на молекулата. Пептиди съдържащи базични аминокиселини при или близо до С-края ще показват главно С-крайни фрагменти. Така трипсинът има предимство за начално смилане. Интерпретиране на данните от високо енергетичната CID накрая дават 14 последователности (виж таблица 2 и фиг. 9).

Анализът на CID спектъра показва, че по време на смилането с трипсин настъпват някои странични реакции. Два трипсинови автолизни продукта са идентифицирани при m/z 659,3 и 1153,6 (фиг, 9). Поради дългото време на инкубация и липсата на собствен акцептор, някои трипсинови пептиди се карбамилират при техните N-краища. Тъй като такива странични реакции биха направили невъзможно разграждането по Edman, N-крайните модификации могат дори да бъдат полезни при секвениране с помощта на масспектрометрия. Фактически, CID анализът на тези

модифицирани пептиди е полезен за потвърждаване на някои от горепосочените последователности, наведнъж осигуряващ начини за диференцииране между N-крайния левцин или изолевцин (фиг. 10).

ПРИМЕР 5

Сиалилтрансфераза от черен дроб на плъх PCR развиване на специфична сДНК проба.

Като се имат предвид аминокиселинните последователности на единадесет от четиринадесетте пептиди получени от α2,3Ν, са синтезирани двадесет и два олигонуклеотидни изродени сбора от смислени и безсмислени вериги (Genosys). Първоначалните PCR експерименти се основават на наблюдението, че пептид 11 и пептид 1 са хомоложни на участъка .разположен близо до центъра на по-рано клонираната сиалилтрансфераза, Gaipi,4GlcNAc α2,6сиалилтрансфераза (Weinstein, J. и сътр., J.Biol.Chem. 257, 13835-13844 [1982]) и α2,3-Ο описана по-горе (фиг. 11). Осъществяват се две групи PCR експерименти като се използва или смислен праймер за пептид 11 или безсмислен праймер за пептид 1 сдвоени с олигонуклеотидни праймери с другите пептиди и първата верига сДНК синтезирана от черен дроб на плъх цялостна РНК като матрица.

Започвайки с етапа на стапяне на матрицата (5 минути при 94°С), развиването се провежда като се използва GeneAmpTM ДНК набор реагинт за развиване с AmpliTagTM ДНК полимераза (Perkin Elmer Cetus), посредством 35 пъти повтаряне на цикъла, 1 минута при 94°С, 1 минута при 37°С и 2 минути при 72°С и завършва с етап на крайно продължаване (15 минути при 72°С).Различни сДНК фрагменти се пораждат от тези PCR реакции. Допускайки, че пептид 11 и 1 представлява непрекъснат интервал от аминокиселини, допълнителна серия PCR експерименти се провеждат като се използва стратегията на гнездов праймер (Mullis, К.В. и Falooona, F., Methods Enzymool. 155, 335-350 [1987]), за да се идентифицират специфични сДНК фрагменти. Като се използва този подход се идентифицира специфичен сДНК фрагмент, 11 смислен-14безсмислен (lls-14as). 1 ls-14as сДНК фрагментът се субклонира в Bluescript плазмид (Stratagene) и се секвенира като се използват универсални праймери (Stratagene) и 2,0 набор Sequenase Version (USB).

Клониране на сиалилтрансфераза сДНК банка се конструира от poly (А) ⁺ РНК от черен дроб на плъх като се използва сДНК синтезен набор от Parmacia (Gubler, U. и Hoffman, В.J. Gene 25, 263-269 [1983]). Олиго (dT) иницираната сДНК се синтезира и лигира към EcoRI-Notl линкери. След това сДНК-ите се лигира в EcoRI слепена IgtlO ДНК (Promega). След опаковане in vitro с ДНК „ пакетиращ екстракт (Stratagene), с фагите се покрива в блюда гостоприемника E.coli С600 hfl-(Promega). Отсяват се приблизително един милион плаки с lls-14as сДНК проба ( (Gubler, U. и Hoffman, B.J. Gene 25, 263-269 [1983]). Два положителни фага (18-1 и 9-1) се пречистват и субклонират в Bluescript плазмиден вектор (Stratagene) за секвениране.

Изолиране на сДНК клонове

За скриниране на пептидините секвенции за хомоложност с известни протеини се използва база данни Dayhoff Protein. Това търсене осигурява първото доказателство за хомоложност между <x2,3-N и други клонирани сиалилтрансферази. От този анализ е намерено, че пептидът 11 (таблица 2) е хомоложен на наличната последователност на β-галактозид а2,6-сиалилтрансферази както от плъх, така и от човек (тези два ензима са 88% консервативни, Gu,T.J. и cbTp.,FEBS 275, 83-86 [1990] и Lance, Р. и сътр., Biochem. Biophis.Res.Commun. 164, 225-232 [1989]). Когато в този анализ се включи и последователността а2,3-О от свиня, друг пептид, пептид 1 (таблица 2) е хомоложен на последователността в двете клонирани сиалилтрансферази. Сравняването на тези пептиди с наличните секвенции в по-рано клонираните сиалилтрансферази показва, че тези два пептида притежават непрекъсната верига аминокиселини, които се късат при аргининовия остатък по време на трипсиновото смилане (фиг. 11).

ТАБЛИЦА 2

Аминокисеелинна последователност на пептиди получени от Gaip 1,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза

Пептид Аминокиселинна

Място на остатъка

1	последователност в Gal Leu Asn Ser Al a Pro Vai Lvs	ot2,3-ST (Фиг.4) 186-192
2	MetAlaAlalleLys	340-344
3	GluProProGlu lie Arg	264-269
4	Gly Lys.Asp Asn Leu lie Lys	130-136
5	LeuProAlaGluLeuAlaThr Lys	69-76
6	AlalleLeuSerValThrLys	137-143
7	IleLeuAsnProTyr	270-274
8	LeuThr Pro Al a Leu Asp Ser Leu His Cys Arg	147-157
9	Vai Ser Ala Ser Asp Gly PheTrp Lys	247-255
10	VallleThrAspLeuSerSerGlylle	366-374
11	IleAsDAsDTvrAsDlleVallleAra	177-185
12	GluPheValProProPheGlylleLys	121-129
13	LeuGlyPheLeuLeuLys	59-64
14	- AspSerLeuPheValLeuAlaGlyPheLys	222-231

Подчертаните последователности показват хомоложност с други известни сиалилтрансферазни ензими (25,26)

Аминокиселината в курсив е единствената разлика от аминокиселинната последователност очаквана от нуклео тидната последователност на Gal a2,3-ST сДНК.

Знанието, че пептид 11 и пептид 1 показват хомология спрямо последователността по-рано идентифицирана като консервативен участък на хомоложност в центъра на две други клонирани сиалилтрансферази е основата на стратегията за клониране съгласно изобретението (фиг. 11). Допуска се, че пептид 11 и пептид 1 трябва да бъдат близо до центъра на протеина, по такъв начин PCR експериментите са предназначени да произвеждат дълга сДНК проба.На база аминокиселинните последователности на 14 сиалилтрансферазни пептиди, изродените олигонуклеотидни праймери както смислени така и безсмислени се синтезират за употреба в PCR експериментите. В тези експерименти, смисленият праймер 1 1 и безсмисленият 1 се сдвояват с други праймери в опит да се развият дълги сДНК фрагменти на α2,3-Ν. Някои сДНК фрагменти се амплифицират при тези експерименти. Допускайки, че пептид 11 и пептид 1 представляват непрекъсната верига аминокиселини, праймер 11 и праймер 1 след това се използват в стратегията на гнездовия праймер (Millis, К.В. и Faloona, F., Methoods Enzymool. 155, 335-350 [1987]), за да се идентифицират специфични сДНК фрагменти. Фрагментът се амплифицира като се използват смислен праймер 11 и безсмислен 14 са близо до същото място както амплифицираният фрагмент като се използва смислен праймер 1 и безсмислен праймер 14, което показва, че полученият фрагмент е в резултат на с специфична осъществена хибридизация посредством праймери и не е артефакт.

Клонирането и характеризирането на Исмислен14безсмислен фрагмент показва, че пептид 11 и 1 наистина са непрекъснати. Сравнението на последователността на сДНК фрагмента с двете клонирани сиалилтрансферази (Weinstein,J. и сътр..J.Biol.Chem. 262. 17735-17743 (1987]), показва, че хомоложността произтича от пептид 1 и продължава с осемнадесет аминокиселини. Поради хомоложността вероятно 11 смислен-14безсмислен фрагмент се амплифицира от сиалилтрансферазна тРНК. Последователността също показва, че сДНК фрагментът не е фрагмент на Gaip 1,4GlcNAc а2,6-сиалилтрансфераза, която е изобилна в черен дроб от плъх (Weinstein,J. и сътр-.J.Biol.Chem.257, 13835-13844 [1982]).

Фрагментът 11смеслен-14безсмислен се използва за отсяване на oligo dT иницираната сДНК банка от черен дроб на плъх, чиито два положителни клона са получени от 1 милион отсети плаки . Охарактеризирането на положителните клонове показва, че клон ST3N-1 съдържа 2,1 КЬ включване, докато клон ST3N-2 е значително по-къс, само 1,5 КЬ на дължина. Northern анализът показва, че Gal a2,3-ST mPHK е

2,5 Kb (виж по-долу), като се предполага, че клон ST3N-1 може да съдържа цялата кодираща последователност на Gal a2,3-ST.

Първична структура на a2,3N сиалилтрансфераза

Анализът на секвенциите показва, че клон ST3N-1 съдържа пълната отворена рамка на разчитане на сиалилтрансферазата (фиг.2). Тя се състои от 82 Ьр 5'-нетранслиран участък, отворена рамка на разчитане 1122 Ьр по дължина, 3'нетранслиран учъстък от приблизително 1 КЬ и poly (А) опашка. Отворената рамка на разчитане на клон ST3N-1 кодира протеин с 374 аминокиселини с очаквано молекулно тегло от 42,033. С изключение на разлика от една аминокиселина, отворената рамка на разчитане кодира всички 14 пептидни последователности получени от масспектрометричния анализ на пречистената сиалилтрансфераза. Това потвърждава, че сДНК на клона ST3N-1 е действително е тази на сиалилтрансферазата. Както се наблюдава за други клонирани сиалилтрансферази (Paulson, J.C. и Colley, K.J., J.Biol. Chem. 264, 17615-17618 [1989]), очаквано е α2,3-Ν да има къса N-крайна цитоплазмена опашка, единствена сигнална контактна последователност приблизително от 20 остатъка и дълъг С-краен участък, който съдържа каталитичния домен на ензима.

ПРИМЕР 6

Експресия на разтворима сиалилтрансфераза от плъх За да се произведе разтворима форма на сиалилтрансфераза за ензимно охарактеризиране, слят протеин съдържащ каталитичния домен на ензима и способна да се отцепи инсулинова сигнална последователност, се конструират в бозайников експресионен вектор pSVL (Pharmacia). Поспециално, каталитичният домен на сиалилтрансферазата се амплифицира чрез PCR като се използва 5' праймер при позиция +182 (фиг.11), в посока на трансмембранния домен и 3' праймер разположен в 3'UTR в обратна посока на мястото за полиаденилиране. PCR реакциите се провеждат както е описано по-горе при температура на осъществяване на хибридизация при 55°С. PCR продуктът се субклонира в BamHI-EcoRI сайтовете на pGIR-199 (подарък на K.Drickamer) като се получава сливане на сиалилтрансферазата в рамка с наличната инсулинова сигнална последователност в pGIR вектора (Huseh.E.C. и сътр., J.Biool.Chem.261, 4940-4947 [1986]). Полученият слят протеин се включва в Xba I-Sma I сайтовете на експресионния вектор pSVL като се получава експресионен плазмид pBD122.

За преходна експресия в COS-1 клетки, експресионният плазмид pBD122 (20 mg) се трансфектира в COS-1 клетки върху 100 mm блюда като се използва липофектин както се препоръчва от производителя (BRL). След 48 часа клетъчната културална среда се събира и концентрира като се използва Centricon 10 микроконцентратор. Концентрираната среда се анализира за сиалилтрансферазна активност като се използват олигозахариди като акцепторни субстрати. Преминаването на сиаловата киселина към олигозахарида се регистрира като се използва йонообменна хроматография (Sadler, J.E. и сътр., J.Biol.Chem.254.5934-5941 J1979] и Paulson

J. C. и сътр., J.Biol.Chem.264, 10931-10934 [1989]]).

За демонстрация на това, че клонът ST3N-1 трябва да кодира α2,3-Ν сиалилтрансфераза, клонът се експресира в COS-1 клетки. Аминокиселинната последователност на клона ST3N-1 показва, че протеинът съдържа МН₂-крайна сигнално контактна последователност, която се очаква да закрепи ензима за апарата на Golgi в клетката (Paulson, J.C. и Colley,

K. J., J.Biol.Chem. 264, 17615-17618 [1989]). За улесняване на функционалния анализ на ензима, се произвежда разтворимата форма на ензима, която когато се експресира би била секретирана от клетката. Слят протеин се конструира като се използва способна да се отцепи инсулинова сигнална последователност, която да смени сигнално контактната последователност при NH₂ -края на сиалилтрансферазата. Когато експресионният плазмид pBD122 се експресира в COS-1 клетките, ензимът се секретира от клетките и показва сиалилтрансферазна активност.

Ензимните свойства на <x2,3-N сиалилтрансфераза първо се характеризират с пречистен протеин (Weinstein, J. и сътр., J.Biol.Chem. 257, 13845-13853 [1982]). Намерено е, че сиалилтрансферазата използва β-галактозидни акцептори съдържащи или Ωβΐβ 1,3GlcNAc или Gaip 1,4GlcNAc последователности формиращи NeuAca2,3Ga^l,3GlcNAc и NeuAca2,3 Gaip 1,4GlcNAc последователности често срещани да завършват комплекса от типа N-свързани олигозахариди. Ензимът секретиран от клетките, които са трансфектирани с експресионния плазмид pBD122 е способен да използва β-галактозидни акцептори съдържащи или Gaip 1,3GlcNAc или Gaip 1,4GlcNАс последователности (таблица 2). Клетки трансфектирани с родителския вектор не секретират такава сиалилтрансферазна активност. Секретираният ензим е способен също така да сиалилира asialo-al кисел гликопротеин. Тези данни са в съгласие с ензимните свойства на пречистения a2,3-N.

ПРИМЕР 7

Експресия на <x2,3-N сиалилтрансфераза в Baculoovirus

Крайният тетразахарид сиалил Аюис* (SLe*: SAa2,3Galp l,4GlcNAc[al,3Fuc]) се идентифицира като лиганда на Р-селектин и Е-селектин и синтетичен олигозахарид съдържащ SLe* структурата е кандидат за блокиране взаимодействията на селектиновата лиганда. Пълната химическа синтеза на SLe* е технически и икономически трудна, но използване на специфични гликозилтрансферази за прикрепване на крайна сиалова киселина и фукозни остатъци към химически синтезирано ядро на захарида, ще направи синтезата на свободна SLe* осъществима. Генът кодиращ <x2,3N сиалилтрансфераза се клонира от сДНК банка от черен дроб на плъх и показва специфична <х2,3 (Gaip 1,3/4GlcNAc) сиалилтрансферазна активност когато се експресира в трансфектирани COS-1 клетки (Wen и сътр., ръкопис в подготовка) . Част от сДНК клона кодиращ ензимната част на полипептида, но с липсващ хидрофобен сигнал/мембранно контактен домен, се слива с пре-инсулинова сигнална последователност, за да се формира сДНК кодираща разтворим, секретиран а2,3 NST протеин. Тази сДНК се клонира в Baculovirus пренасящ вектор и се използва за трансфекция на Sf-9 клетки от инсекти в присъствие на див тип Baculovirus ДНК.

Рекомбинантен вирус съдържащ α2,3-Ν сиалилтрансферазна сДНК се изолира и пречиства и се използва за инфектиране на Sf-9 клетки. Инфектираните клетки секретират а2,3 NST в големи количества в средата и този протеин се пречиства чрез йонообменна хроматография.

Sf-9 клетките са закупени от АТСС. ДНК векторите pGIR199 и pBlueBac са получени от J.C.Paulson and Invitrogeen (San Diego, СА), съответно. Sf-9 клетките се отглеждат на клетъчна култура при клетъчна плътност между 0,3 и 1,5 милиона клетки на милилитьр в среда за инсекти на Graces (допълнена с 0,33% лакталбуминов хидролизат и 0,33% дрожден екстракт), получен от Gibco (Grand Island, NY), плюс 10% топлинно инактивиран серум от телешки зародиш (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Тази среда е означена като GCMS + 10%FCS.

Разтворима форма на α2,3-Ν сиалилтрансфераза се приготвя по следния начин. сДНК представляваща цяла α2,3-Ν сиалилтрансферазна mPHK се използва като матрица за PCR при използване на два олигонуклеотиди като усилватели, които хибридизират (5') точно при С-крайната позиция на комбинацията сигнал/контакт участък на ензима и (3') в посока обратна на poly(A) допълнителна част в 3' нетраслирания участък. Двата олигонуклеотида кодират BamHl местата при техните 5' краища, давайки възможност на PCR продуктите да бъдат клонирани при BamHl сайта на pGIR199, слети в рамка с пре-инсулинова сигнална последователност. Граничещите с Nhel места се използват да се освободи генното сливане и този сДНК фрагмент се клонира н Baculovirus пренасящ вектор pBluebac, под контрола на Baculovirus полихедринов промотор. Всички рекомбинантни ДНК манипулации се осъществяват при условията препоръчани за ензима от производителя. Векторът pBluebac съдържа E.coli β-галактозидазен ген под контрола на различен Baculovirus промотор и вируси, които са били подложени на рекомбинация и уловеният ДНК вектор може да превърне хромофора X-gal в син продукт.

Създаването на рекомбинантен Baculovirus е осъществено като се използва МахВас експресионна система (Invitrogen) като се следват точно протоколите препоръчани от производителя. Накратко, плазмид и див тип вирус ДНК се смесват и се използват за трансфекция на Sf-9 клетки по калциевофосфатния метод. Вирусът се произвежда посредством трансфектирани клетки и разпръскване в културалната среда. Рекомбинантният вирус се идентифицира при изследване на плаките посредством синьо оцветен продукт получен под действието на β-галактозидаза върху X77 gal включен в плаковата среда при концентрация 150 pg/ml, и пречистен от дивия тип вирус посредством повтаряно разреждане/плакообразуване. Пречистеният вирус се амплифицира в 500 ml чрез инфектиране на пресни Sf-9 клетки. Някои клонове се анализират за способност да причиняват секреция на а2,3-Ь1сиалилтрансфераза в инфектираната клетъчна среда чрез тестиране на аликвотна част от средата директно в радиоактивния сиалилтрансферазен анализ описан по-долу.

За да се отгледа голямо количество вируси, 3 х 10® Sf-9 клетки в 25 ст^ колба за тъканна култура в 5 ml GCMS + 10%FCS се инфектират с единична синя плака свободна от див тип вирус и оставена да расте в продължение на 5-7 дни при 27°С. Получените 5 ml вирусен щок се избистря чрез центрофугиране и следващо амплифициране. Sf-9 клетките в логаритмичната растежна фаза (0,5-1,5x10® клетки/ml) се инфектират при концентрация от 1x10? клетки за ml при мултиплициране на инфекцията (moi) на 1, като се допуска, че вирусният титър в 5 ml щок е ΙχΙΟθ плакообразуващи единици (pfu) за милилитър. Клетките се разреждат обратно десеткратно в GCMS+ 10%FCS и се оставят да нарастнат в продължение на 5-7 дни при 27°С. Полученият вирус се избистря и вирусният титър се определя чрез плаков анализ и общо е по-висок от 10$ pfu/ml. За експресиране на α2,3-Ν сиалилтрансфераза, 2,5x10$ Sf-9 клетки в логаритмична фаза на растеж се поставят в блюда върху всички пластове на Ten Try Cell Factor (Nunc, Naperville, IL), означени CF-10.Всеки CF-10 има общо растежно пространство 6000 cm^ и клетките се инфектират с рекомбинантен Baculoovirus при moi = 5 в обем от 300 ml.След инкубация в продължение на един час, се прибавя 1 литър

Excell-400 (JRH Biosciences), свободна от серум среда и клетките се инкубират при 27°С в продължение на 72 часа. Средата се събира, избистря и филтрира през 0,2 pm филтър. Прибавя се прясна среда (Excell-400 заедно с 2% серум от телешки зародиш) и клетките се инкубират при 27°С в продължение на още 48 часа, и тогава средата се събира, избистря и филтрира.

α2,3-Ν сиалилтрансферазната активност се анализира като се използва модификация на публикуван анализ (Sadler и сътр., 1979). В 30 μΐ обем, 14 μΐ проби се смесват с

3.5 μΐ лакто-Ь1-тетраоза (Galp 1,3GlcNАср 1,3Gaip 1,4Glc) и

12.5 μΐ анализна смес описана по-долу. Пробите се размесват за кратко, центрофугира се на дъното на реакционната епруветка и се инкубира при 37°С в продължение на 10 минути. Реакционната смес след това незабавно се разрежда в 1 ml 5 гоМ фосфатен буфер, рН 6 и се нанася на 0,5 ml йонообменна колона. Колоната се пуска и се събира 1 ml елуат в сцинтилационна епруветка и се извършва преброяване. Единицата се дефинира като количество ензим необходимо за преминаване на 1 микромол сиалова киселина към акцептора за минута.

Пробата се състои или от чиста супернатанта или от супернатанта разредена така, че кинетиката на реакцията се запазва в линеен порядък, приблизинелно 10000 срт продукция от колоната. Анализната смес се получава чрез сушене на 0,65 ml (50 pCi) [ ^С]-СМР-сиалова киселина (NEN, Boston, МА) и ресуспендиране в 0,65 ml вода съдържаща 2,3 mg СРМ-сиалова киселина. Към полученото се прибавя 0,96 1М разтвор на натриев какодилатен буфер, рН 6, 0,48 ml 20%

Triton CF-54, 0,29 ml 50 mg за милилитър разтвор на говежди серумен албумин (всичко получено от Sigma, St.Louis,МО) и вода до общ обем 8 ml. Определя се специфичната активност на анализната смес и се разделя на аликвотни части и се съхранява при -20°С. Използваната йонообменна смола е AGIХ8, 200-400 меша фосфатна форма (Biorad, Richmond.CA).

Концентриране и пречистване на α2,3-Ν сиалилтрансфераза

Среди (1-3 литра) съдържащи a2,3-NST се филтрират и концентрират до приблизително 250 ml в Amicon CH2PRS спирална патронна система снабдена с S1Y10 патрони. Комплектът се подлага на диафилтрация, за да се обезсоли концентрираната супернатанта с три обема 10 тМ какодилова киселина, 25 тМ натриев хлорид, 25% глицерол, pH 5,3 (буфер А). Пробите след това се пропускат през колона (2,5 х 17 cm) S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) еквилибрирана c буфер A при скорост на изтичане 2 ml/min. След като всички проби се пропуснат, колоната с промива с буфер А докато OD28O изтичащия поток от колоната се върне на изходния (1,6 обема на колоната). а2,3 NST след това се елуира от колоната с 50 тМ какодилова киселина, 1 М натриев хлорид, 25% глицерол, pH 6,5. Фракциите съдържащи a2,3-NST се обединяват и диализират една нощ срещу 1 L 50 тМ какодилова киселина, 0,5 М натриев хлорид, 50% глицерол, pH 6,0 и след това се съхраняват при -80°С.

ПРИМЕР 8

Тъканно разпределение на a2,3-N сиалилтрансфераза от плъх

За да се охарактеризира тъканното разпределение на клонирана α2,3-Ν сиалилтрансфераза от плъх, се изолира общата РНК от различни тъкани на плъх и се приготвят проби с 32р_б_{елязана с}днк на сиалилтрансферазата. Хибридизирането до тРНК от ~2,5 КЬ се наблюдава във всички изпитвани тъкани. Както се наблюдава за двете клонирани сиалилтрансферази, α2,3-Ν сиалилтрансферазата показва диференцирана експресия в тъканите на плъх. Най-високото ниво на α2,3-Ν сиалилтрансферазна тРНК се открива в мозъка.Черният дроб, бъбреците, дебелото черво, сърцето,

ЯЩГ яйчниците и белият дроб експресират междинни нива, докато в подчелюстната слюнчена жлеза, далака и тънките черва се откриват ниски нива на тРНК. Обратно, най-високо ниво на Gaip 1,4GlcNАс а2,6-сиалилтрансферазна тРНК (4,7 и 4,3 Kb, 41,46) се открива в черен дроб на плъх и подчелюстна слюнчена жлеза, докато ниски нива на mPHK-та се откриват в сърцето , яйчниците и мозъка.

ПРИМЕР 9

Консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен

Консервативният участък на сиалилтрансферазнатафамилия - сравнение на първичните структури на трите клонирани сиалилтрансферази показва участък на обширна хомоложност (фиг.12). Този участък се състои от 55 аминокиселини от остатък 156 до остатък 210 на α2,3-Ν сиалилтрансфераза с 42% идентични аминокиселини и 58% консервативни аминокиселини между всичките три ензима.Последователностите на трите сиалилтрансферази нямат никаква значителна хомоложност извън този участък. Тъй като този участък на хомоложност е разположен близо до центъра на каталитичния домен на ензимите, този участък може да представлява консервативна структура необходима за ензимната активност на тези сиалилтрансферази.

Клонирани са три члена на сиалилтрансферазната фамилия на гликозилтрансферази. Макар че 85% от последователностите на всичките три клонирани сиалилтрансферази нямат никаква значителна хомоложност, участъкът от 55 аминокиселини в центъра на всяка молекула е много силно консервативен предлагайки протеинов мотив в сиалил-

трансферазната фамилия. Протеиновият мотив е силно консервативна група от аминокиселини в специфичния участък. Други аминокиселинни остатъци вън от този участък са обикновено слабо консервативни, така че има ниска хомоложност в протеините съдържащи същия мотив. С тази дефиниция консервативният участък дефиниран посредством първичните структури на трите клонирани сиалилтрансферази е мотив в сиалилтрансферазната фамилия.

Протеиновите мотиви често се включват в катализа и лигандното свързване (Hodgman,T.C.,Comput.Applic.Biosci.

5,1-13 [ 1989[, Bairoch.A. Prosite: A Dictionary of Protein Sites and Patterns, 5th edn., University of Geneva [1990] и Sternberg, M.J.E., Nature 349, 111 [1991 ]).Трите клона на сиалилтрансферазата катализират преминаването на сиаловата киселина от CMP-NeuAc в а2,3 или а2,6 свързването на крайна галактоза като се формират следните последователности:

NeuAca2,3

Gaip 1,3(4)GlcNAc(ST3N)

NeuAc<x2,3

Galp 1,3GlcNAc(ST3O)

NeuAca2,3

Gaipi,4GlcNAc(ST6N)

И трите ензима участват с обща функция. Повече от

50% от остатъците в консервативния участък са или натоварени или полярни аминокиселини в съответствие с намирането им на повърхността на ензимите. Шест от натоварените остатъци в този участък са идентични и в трите сиалилтрансферази. Удивително е, че има седем аминокиселинниостатъка в един интервал на консервативния участък идентични в трите клона на сиалилтрансферазата - Dsp.Val.Gly.Ser.Lys.Thr.Thr. (фиг. 12).

ПРИМЕР 10

Клониране на нова сиалилтрансфераза като се използва консервативният участък на хомоложност

Консервативният участък на хомоложност се използва, за да се клонират други членове на сиалилтрансферазната генна фамилия.

PCR клониране с изродени олигонуклеотиди Синтезират се два изродени олигонуклеотида съответствуващи на 5' и 3' краищата на консервативния участък на хомоложност (фиг.13) (Genosys). Последователността на 5' и 3' праймерите е

5GGAAGCTTTGSCRNMG5TGYRYCRTCGT и 5CCGGATCCGGTRGTYTTNSNSCCACRTC (N = A + G + T+C, S = G + C, R = A + G, М = А+С, Υ = С + Т) съответно. Провеждат се PCR експерименти като се използва 100 pmol от всеки праймер и първата верига сДНК се синтезира от мозък на новороден плъх като матрица. Амплификацията се извършва на 30 цикъла при 94°С в продължение на 1 минута, 37°С в продължение на 1 минута и 72°С в продължение на 2 минути. PCR продуктите се смилат с BamHI и Hind III и на тези места на Bluescript KS се субклонират (Stratagene, 11099

North Torrey Pines Road, La Jollia, CA 92037). Субклоновете се охарактеризират чрез секвениране с ТЗ праймер. Амплифицираният фрагмент от един от тези субклонове, SM1, се използва по-долу ,за да се отсее SM1 съдържащия ген, който кодира сиалилтрансфераза.

Клониране на SM1 съдържащ ген

Произволно иницирана сДНК от мозък на новороден плъх се лигира с EcoRI-Notl линкери, след което се лигира с EcoRI смлян XgtlO. Получената банка се опакова като се използва Stratagene Gigapack II опаковащ екстракт и се поставя върху блюда с Е.coli С600 hfl. Отсяват се приблизително 10θ плаки с клонирания SMI PCR фрагмент. Четири клона, STX1-4, се пречистват и субклонират в Notl мястото на Bluescript (Stratagene) за по-нататъшен анализ.

Northern анализ.Общата РНК от тъкани на плъх се получава като се използва киселинно фенолна процедура както е описано по-рано (Chomoznsyi, Р. и сътр., Anal.Biochem 162, 136-159 [1987].РНК проби от новородени се изолират от плъхчета на четири дни от раждането.РНК се подлага на електрофореза в 1% агарозен гел съдържащ формалдехид, премества се в нитроцелулоза и се хибридизира като се следват стандартните процедури (Kriegler, М. Gene transfer and expression, Stockton Press, N.Y., N.Y. [1990]). Northernблотовете се изследват c пречистен c гел, радиобелязан 900bp EcoRI фрагмент изолиран от STX1.

Конструкция на разтворима форма на STX

Пресечена форма на STX, на която липсват първите аминокиселини на затворената рамка на разчитане, се получава посредством PCR развиване с 5' праймер съдържащ

в рамката Ban HI част и 3* праймер разположен 50Ьр по посока на stp кодона. Амплифицирането се извършва на 30 цикъла при 94°С в продължение на 1 минута, 45®С в продължение на 1 минута и 72°С в продължение на 2 минути. Векторът за сливане pGIR201 се конструира чрез включване на BcII/Bam HI фрагмент, изолиран от pRIT5 (Pharmacia LKB Biotech, Inc., 1025 Atlantic Avenue, Suite 101, Alsmeda, CA 94501), кодиращ протеин A IgG свързващ домен c Bam HI сайта на pGIR201 (подарък от Dr. K. Drickamer, Columbia University). Амплифицираният фрагмент се субклонира в Bam HI сайта на pGIR201protA, при което STX се слива с инсулин сигналната последователност и протеин А присъстващ във вектора. Nhe фрагментът съдържащ слятия протеин се субклонира в плазмид pSVL като се получава експресионен плазмид АХ78.

Експресия на разтворима форма на STX Експресионният плазмид АХ78 (10ug) се трансфектира в COS-1 клетки в 10 cm блюда. Два дни след трансфекцията културалната среда се събира и инкубира с IgG сефароза ^Pharmacia) в продължение на 1 час при стайна температура. Топчетата се изследват за сиалилтрансферазна активност като се използват олигозахариди, антифризен гликопротеин, смесени ганглиозиди и третирани с нераминидаза мозъчни мембрани от новороден плъх като акцепторни субстрати. Преминаването на сиалова киселина към тези акцептори се измерва като се използва йонообменна (Weinstein, J. и сътр., J.Biol.Chem 257, 13835-13844 [1982]) , изключване по размер (Id.) и низходяща хартиена хроматография (McCoy, R.D. и сътр., J.Biol.Chem. 260, 12695-12699 [1985]).

Идентични трансфекции се осъществяват при опити с пулсационно маркиране . След 36 часа период на експресия, блюдата се инкубират при 37°С с 2,5 ml DMEM-метион. След 1 час към средата се прибавя 250иС1^^8-трансмаркер (Amersham, 2636 S. Clairebrook, Arlington Heights, IL 60005) и блюдата се инкубират в продължение на още 3 часа. В края на това време блюдата се промиват и инкубират една нощ с DMEM. Белязаният слят протеин се изолира чрез инкубиране с IgG сефароза (Pharmacia). След свързването зърната се dP промиват, кипят се в буфер Laemalli и освободе-ният протеин се анализира чрез SDS-PAGЕ/флуорография.

PCR развитие на консервативния участък на хомоложност родствен на този намерен в охарактеризираните сиалилтрансферази

Докато 70% от аминокиселините на консервативния участък на хомоложност на охарактеризираните сиалилтрансферази са консервативни, най-дългите непрекъснати участъци на консервативност са намерени в аминокиселинната последователност в краищата на консервативния участък на хомо- ожност (фиг. 13). Аминокиселинната последователност близо до С-края на консервативния участък на хомоложност е намерено че съдържа непрекъснат интервал от седем инвариантни остатъка. Строгата консервативност на тази аминокиселинна последователност е взета под внимание при конструирането на съответния несложен олигонуклеотид с 256 кратна изроденост, като са обхванати всички наблюдавани вариации в употребата на кодона. Консрукцията на олигонуклеотида съответстващ на N-края на консервативния участък на хомоложност е по-трудна. Аминокиселините в този участък проявяват повече вариабилност отколкото тези намерени при обратния край на консервативния участък на хомоложност. Конструкцията на олигонуклеотида след това се затруднява от големия кодонен свръхизлишък на аминокиселини. За да се преодолеят тези фактори, олигонуклеотидът от 5' края на консервативния участък на хомоложност се синтезира с 1026 кратна изроденост. Когато тази степен на сложност е близо до прага на изроденост позволена в PCR експериментите, получените праймери обясняват всички нуклеотидни последователности г

< намерени че кодират този участък от консервативния участък на хомоложност.

Невралното развитие е сложен процес, през време на който гликозилтрансферазата се подлага на динамична регулация, което е видно от драматичните промени намерени в клетъчната повърхност на експресирания карбохидрат. На това основание мозък на новороден плъх се избира като суровина за изолиране на нови сиалилтрансферази. Като се използва сДНК от мозък на новороден плъх като матрица за PCR опитите с изродените праймери получени в амплификацията на 150Ьр ивица, съвместим с известния размер на консервативния участък на хомоложност. Субклонирането и секвенирането показва, че ивицата е смес от два ДНК фрагмента. На тридесет изолата се охарактеризира 56% кодиран ос консервативен участък на хомоложност.Останалите клонове обхващат уникалния консервативен участък на хомоложност, SM1. Малко неочаквано SM1 съдържа пет изменения в аминокиселините, които са намерени че са инвариантни в трите по-рано клонирани сиалилтрансферази. Докато тези изменения намаляват общия брой на инвариантните остатъци, новата информационна последователност осигурена от ©характеризирането на SM1 повишава общата консервативност на консенсусната последователност.

Очакваната аминокиселинна последователност на SM1 не показва склонност към някакъв индивидуален консервативен участък на хомоложност. На същите места (аминокиселини 1, 2, 53, 54) SM1 е подобен на х2,6 консервативния участък на хомоложност. В други позиции (аминокиселини 8, 9, 54, 55) SM1 отразява последователностите намерени в «2,3 консервативен участък на хомоложност. Тъй като консервативният участък на хомоложност е 85% консервативен, този баланс на подобие има за резултат, че SM1 има приблизително 45% хомоложност спрямо другите членове на сиалилтрансферазната генна фамилия.

Първична структура на SM1 съдържащия ген

Анализът на секвенциите на l,5kb клон STX1 показва непрекъсната отворена рамка на разчитане от 375 аминокиселини, които кодират SM1 консервативния участък на хомоложност, охарактеризиран в по-ранните PCR експерименти (фиг. 14). Очакваната аминокиселинна последователност на STX1 предполага че този протеин е от тип II трансмембранен протеин както се наблюдава за всеки от другите клонирани гликозилтрансферази. Очакваната аминокиселинна последователност на STX1 показва наличие на хидрофобен участък от осем остатъка от аминокрая на протеина, който служи като сигнално контактен домен. Консервативният участък на хомоложност е локализиран близо до центъра на протеина. Целият размер на STX протеина и съответните позиции на двата хидрофобни участъка и консервативния участък на хомоложност строго наподобява характеристиките на първичната последователност на клонираните сиалилтрансферази. Макар че STX не показва никаква хомоложност към клонирани сиалилтрансферази освен консервативния участък на хомоложност, обявеното структурно сходство на тези гени изяснява, че STX представлява най-новия член на тази генна фамилия.

Ензимно охарактеризиране на STX

Природно срещащи се разтворими форми на сиалилтрансферази могат да се намерят в различни секреции и телесни течности (Paulson, J.C. и сътр., J.Biol.Chem.252, 2356-2367 [1977] и Hudgin, R.L. и сътр., Can. J. Biochem. 49, 829-837 [1971]). Тези разтворими форми получени при протеолитично смилане късат стем участъка на сиалилтрансферазата освобождавайки каталитичния домен от трансмембрания контакт. Разтворимите сиалилтрансферази могат да се конструират рекомбинантно чрез заместване на ендогенния сигнално контактен домен с отцепваща се сигнална последователност (Colley, K.J. и сътр., J.Biol.Chem. 264 1761917622 [1989]). С оглед да се улесни функционалният анализ на STX, разтворима форма на протеина се произвежда, чрез заместване на първите 31 аминокиселини с отцепваща се инсулин сигнална последователност и протеин A IgG свързващ домен. IgG свързващият домен се включва в конструкцията, за да подпомогне откриването на разтворимия STX протеин. Подобни сливания с ST3N активно секретират от експресионните клетки, свързани с IgG сефароза и са ензимно активни. Когато експресионният плазмид съдържащ протеин А/STX сливане (АХ78) се експресира в COS-1 клет89

ките, се изолира 85kd протеин. Големината на слятия протеин е приблизително 15kd по-голяма отколкото очакваното молекулно тегло на полипептида, което предполага,че част от STX потенциалните N-свързани гликозилирани части са били използвани.

Свързаният слят протеин се изследва за сиалилтрансферазна активност като се използват различни акцепторни субстрати. Активността не се открива като се използва β-галактозиден акцептор съдържащ Ga^ 1,3(4)GlcNAc последователности. Подобно, не се открива преминаване на сиалова киселина към О-свързаните олигозахариди на антифризния гликопротеин. Експресията на STX в мозъчна тъкан предполага, че генът може да се включи в гликолипидната биосинтеза. Обаче, смесени ганглиозиди изолирани от мозък на възрастно говедо не успяват да послужат като акцепторен субстрат. Мозъчни мемрани от новородено третирани с неуроамидаза са единственият субстрат показващ дори несигурна способност да послужи като акцептор. Инкубирането на третираните мембрани с STX слят протеин води до получаване на 50% увеличение на активността спрямо фона.

Растежна и тъканна специфична експресия на STX С оглед да се определи характера на експресията и сигналния размер на STX гена, Northern блотове се изследват с 900bp EcoRl фрагмент изолиран от STX1. От различни изследвани тъкани хибридизация на 5,5 kb сигнал се наблюдава само в РНК от мозък на новороден плъх. Не се наблюдава никаква кръстосана хибридизация на съответния консервативен участък на хомоложност. Ограничителната експресия на STX е отклонение от диференцираните тъканно специфични експресии намерени с охарактеризирани сиалилтрансферази. Тъй като всеки от тези гени е независимо регулиран, което води до различен характер на специфична експресия, общо, всяка сиалилтрансфераза се експресира различно в различните тъкани (Paulson, J.C. и сътр., J.Biol.Chem. 264, 10931-10934 (1989]). Обратно, STX се експресира само в мозък на новородено. Експресията не е генерализиран ембрионен феномен тъй като сигнал не е открит в бъбреци на новородено.

Claims (39)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Сиалилтрансфераза по същество свободна от компоненти срещащи се в in vivo физиологичната среда, с ограничението, че сиалилтрансферазата е различна от Galp 1,4GlcNAc α2,6 сиалилтрансфераза от плъх.
2. 2. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че е водоразтворима.
3. 3. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че определен аминокиселинен остатък е заменен, включен или отпаднал.
4. 4. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че трансмембранният домен от амино края е отпаднал .
5. 5. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че е отпаднал цитоплазменият домен от амино края.
6. 6. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че са отпаднали трансмембранен домен, цитоплазмен домен и стем участък.
7. 7. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че не е съпроводена от нативно гликозилиране, с ограничението, че сиалилтрансферазата е различна от Galp 1,4GlcNAc <х2,6 сиалилтрансфераза от плъх.
8. 8. ДНК изолат кодиращ сиалилтрансфераза, с ограничението, че този ДНК изолат е различен от Gaip l,4GlcNAc <х2,6 сиалилтрансфераза от плъх.
9. 9. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че е свободен от сиалилтрансферазни интрони.
10. 10. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че е свободен от геномна ДНК кодираща друг полипептид, чиято ДНК е от същите видове както ДНК на изолата.
11. 11. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че ДНК кодира сиалилтрансфераза съдържаща консервативен участък на хомоложност от най-малко 20 аминокиселини.
12. 12. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че ДНК кодираща сиалилтрансфераза се състои от сиалилтрансферазен консервативен участък на хомоложност от най-малко пет аминокиселини от хептапептида -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr.
13. 13. Изолат съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че консервативният участък от най-малко хептапептиден мотив е избран от аминокиселинните остатъци 156-210 на аминокиселинната последователност от фиг.2.
14. 14. Изолат съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че хептапептидният мотив е -Asp-Val-Gly-Ser-LysThr-Thr.
15. 15. Изолат съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че консервативният участък от най-малко хептапептиден мотив от избран от аминокиселинните остатъци 142-196 на аминокиселинната последователност от фиг. 1.
16. 16. Изолат съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че хептапептидният мотив е -Asp-Val-Gly-Ser-LysThr-Thr.
17. 17. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че ДНК сиалилтрансфераза се състои от консервативен участък на хомоложност от най-малко 48 аминокиселини.
18. 18. Изолат съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че консервативният участък на хомоложност от най-малко 55 аминокиселини е избран от остатъци 156-210 на аминокиселинната последователност от фиг. 2.
19. 19. Рекомбинантен експресионен вектор съдържащ ДНК кодираща сиалилтрансфераза с ограничението, че тази сиалилтрансфераза е различна от Gaipi,4GlcNAc <х2,6сиалилтрансфераза от плъх.
20. 20. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа клетка трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 19.
21. 21. Състав съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че клетката е еукариотна клетка.
22. 22. Метод за продукция на сиалилтрансфераза, характеризиращ се с това, че се конструира вектор имащ ДНК кодираща сиалилтрансфераза, трансформира се клетка госто;приемник с вектора и трансформиланата клетка се култивира, с ограничението, че казаната сиалилтрансфераза е различна от Gaip l,4GlcNAc <х2,6 сиалилтрансфераза.
23. 23. Метод съгласно претгенция 22, характеризиращ се с това, че съдържа и етап на извличане на казаната сиалилтрансфераза.
24. 24. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че клитката гостоприемник е еукариотна клетка.
25. 25. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че еукариотната клетка е COS клетъчна линия.
26. 26. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че еукариотната клетка е клетъчна линия от бъбреците на човешки ембрион.
27. 27. ДНК изолат коддиращ полипептид с аминопо- следователност показана на фиг. 1 или фиг. 2
28. 28. Метод за проддукция на ДНК коддираща сиалилтрансфераза, характеризиращ се с това, че а) се приготвят олигонуклеотидни проби съответствуващи на сиалилтрансферазен консервативен участък на хомоложност,

    б) отсяване чрез хибридизация на ДНК банка като се използват олигонуклеотидните проби, в) откриване хибриди зацията от етап б) и г) извличане на продукта от етап в).
29. 29. Метод съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че олигонуклеотидната проба има нуклеотидна последователност кодираща Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr или нейни варианти.
30. 30. Метод за извличане на ДНК кодираща сиалилтрансфераза, характеризиращ се с това, че а) се конструира банка нуклеинова киселина съдържаща ген кодиращ сиалилтрансфразата, б) амплифициране на ДНК кодираща сиалилтрансфераза като се използва полимеразна верижна реакция (PCR) посредством праймер, който се свързва с базичните двойки, кодиращ най-малко пет аминокиселини от хептапептида в консервативния участък на хомоложност,

    в) субклониране на PCR продукти в подходящ вектор, г) секвениране на отделните PCR клонове, за да се идентифицират клоновете съдържащи консервативен участък на хомоложност, д) отсяване на банката нуклеинова киселина като се използва продуктът от етап г) и е) извличане на продукта от етап д).
31. 31. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че най-малко 17 аминокиселини от 48-те аминокиселини на последователността 156-210 от фиг. 2 са консервативни.
32. 32. Изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че най-малко 17 аминокиселини от 48-те аминокиселини на последователността 142-196 от фиг. 1 са консервативни.
33. 33. Сиалилтрансфераза съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че аминокиселинната последователност е както е показана на фиг. 14.
34. 34. ДНК изолат съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че нуклеотидната последдователност е както е показана на фиг. 14
35. 35. Рекомбинантен експресионен вектор съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че казаната ДНК има нуклеотидната последователност както е показана на фиг.

    14.
36. 36. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа клетки трансформирани с експресионен вектор съгласно претенция 35.
37. 37. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че казаната ДНК има нуклеотидна последователност както е показана на фиг. 14.
38. 38. ДНК фрагмент кодиращ консервативен участък на хомоложност.
39. 39. ДНК фрагмент съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че има нуклеотидна последователност както е показана на фиг. 13.